JPH06502300A - 遺伝子発現の抑制のための化合物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９９０年８月３日に出願された米国特許出願第０７１５６２、１８ ０号、１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願第０７１５８２、２８７ 号、　１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願第５８２．４５６号：及 び１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願第０７１５８２．４５７号の 一部継続出願である。

技術分野 本発明は、遺伝子発現（ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を抑制するための化 合物、組成物及び方法に関する。本発明の化合物は、１）３原子ヌクレオシド間 結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列または２）一方ま たは両方の末端にジオールを有する約９〜２００個の塩基のオリゴヌクレオチド 配列を含んでなる。

発明の背景 アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）化合物は、核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡ中の ヌクレオチド配列に結合するかまたはそれとハイブリッド形成して、該核酸の機 能または合成を抑制する化合物である。アンチセンス化合物は、ＲＮＡ及びＤＮ Ａの両者とハイブリッド形成できるため、転写、ＲＮＡプロセシング（ｐｒｏｃ ｅｓｓ　ｉｎｇ）または翻訳のレベルにおいて遺伝子発現を妨害することができ る。

アンチセンス分子は、ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成し、且っＲＮＡポリメラ ーゼの作用を直接的にまたは間接的に抑制することによって、ｍＲＮＡへ特殊な 遺伝子の転写を防ぐように設計及び合成できる。

ＤＮＡを標的とする利点は、治療効果の達成にごく少量のアンチセンス化合物し か必要とされないことである。あるいは、アンチセンス化合物は、ＲＮＡとハイ ブリッド形成して後転写修飾（ＲＮＡプロセシング）またはタンパク合成（翻訳 ）メカニズムを抑制するように設計及び合成できる。典型的な標的ＲＮＡはメツ センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスフｙ−ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リポソー ムＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などである。プロセシング及び翻訳メカニズムの例として は、イントロンを除くためのプレーｍＲＮＡのスプライシング、ｍＲＮＡの５′ 末端のキャッピング、ハイブリッド形成停止及びヌクレアーゼ媒介ｍＲＮＡ加水 分解か挙げられる。

しかしなから、現在のところ、アンチセンス技術の、実施の役に立つ化学及び治 療における適用の開発は、多数の技術的問題によって妨げられている。Ｋｌａｕ ｓｎｅｒ、　Ａ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）、８ 巻、３０３〜３０４頁（１９９０年）。合成アンチセンス分子は、標的細胞中に 存在するヌクレアーゼによって急速な分解を受けやすい。アンチセンスＤＮＡま たはＲＮＡのオリゴヌクレオシド配列は、たとえば、核酸の５′または３″末端 において作用するエキソヌクレアーゼによって破壊される。さらに、エンドヌク レアーゼは個々のヌクレオシド間の内部ホスホジエステル結合においてＤＮＡま たはＲＮＡを開裂させることかできる。このような開裂の結果、投与されるアン チセンス化合物の前動半減期は非常に短く、多量の、短い間隔て投与される投与 量の使用を必要とする。

別の問題は、入手可能な半自動ＤＮＡ合成装置を用いたアンチセンスＤＮＡまた はＲＮＡの製造のコストが極めて高いことである。最近、１ｇのアンチセンスＤ ＮＡを製造するコストは約＄　ｔｏｏ、０００であると１９９０年３月５日８９ ページ。

さらに別の問題は、身体及び細胞内の目的とする標的にアンチセンス薬剤を送出 することに関する。ゲノムＤＮＡを標的とするアンチセンス薬剤は、核に近づく 権利を得なければならない（すなわち、薬剤は原形質膜及び核膜を透過しなけれ ばならない）。増大された膜透過性（増大された疎水性）の必要性は、しかしな がら、細胞質及び細胞サイドシルのような体液コンパートメントにおいて水溶性 （増大された親水性）の必要性とつり合わせられなければならない。

さらに別の問題は、身体の内部において遊離していても、または標的核酸にハイ ブリッド形成されていても、アンチセンス薬剤の安定性に関する。アンチセンス ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチド配列はキラール燐中心の回りにおいて立体再 配置を受け易い。

アンチセンス薬剤による遺伝子標的化は、人の治療において避けられない次のス テップである。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、上記、８８ページ。アンチセンス技術の病 気の治療への満足すべき適用には、しかしなから、前記問題の解決法を見い出す ことが必要である。

安定であり、ヌクレアーゼ抵抗性であり、製造するのが安価であって、しかも、 身体のすみからずみまで核酸標的に送出され且つそれとハイブリッド形成するこ とができるアンチセンス化合物を製造する１つのアプローチは、通常のホスフェ ート−糖バックボーン構造中に修飾を存するオリゴヌクレオシド配列を合成する ことである。

一般に、修飾されたバックボーンを存する２つの型のオリゴヌクレオシド配列か 報告されている。第１の型は、通常のヌクレオシド間ホスホジエステル結合への 修飾を含む。第２の型はホスホジエステル結合を非小スフエートヌクレオシド間 結合と置き換えることを含むａ　ＵＦＩＩ［ｌ１ａｎｎ、巳、及びＰｅｙｍａｎ 、　Ａ、、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　（ケミカルレビュー）　、　 ９　（４）巻＝５４４〜５８４頁（１９９０年）。

現在までに報告されている修飾されたホスホジエステル結合は、ホスホロチオエ ート、アルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート及びアルキルホスホア ミデート（又はアルキルホスホルアミデート）である。

ホスホロチオエート修飾ホスホジエステル結合は、架橋酸素原子の１個またはそ れ以上が硫黄で置き換えられたホスホジエステル結合を指す。このような結合は 、しかしながら、アンチセンス化合物に使用するのに適当でない。キラール燐中 心の保持は、モノチオエートの立体変化を生じる。さらに、モノ−及びジチオエ ートは共に、配列特異的ハイブリッド形成を欠き、両者とも細胞質から急速に取 り除かれる。ホスホロチオエートのガラス及びプラスチックに対する高い親和性 はこれらの化合物の合成を困難で且つ非能率なものとする。

メチル−及びエチルホスホトリエステルは、ホスホジエステル結合オリゴヌクレ オシドを無水メタノールまたはエタノールと反応させることによって製造されて いる。Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、ら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓａｃ、、　９３巻：　６６５７〜６６６５頁（１９７１年）。

オリゴデオキシリボヌクレオチドエチルホスホトリエステル中のトリエステル結 合は、通常の生理的ｐＨ条件下において安定であるが、強酸または塩基によって 加水分解され得る。メチルホスホトリエステルは中性のＩＩＨにおいては、トリ エステルメチル基の溶剤による咳置換か起こり得るためにエチル−及び他のアル キルホスホトリエステルよりも安定でない。オリゴデオキシリボヌクレオチドエ チルホスホトリエステルは、エキソヌクレアーゼによる加水分解に対しては完全 に抵抗性であるようであり、ウシ胎児血清またはヒト血清中に見い出されるヌク レアーゼまたはエステラーゼによって加水分解されない。Ｕｈｌｍａｎｎ、上記 。

メチルホスホネートは、不良な水溶性、キラール燐中心、高収率立体選択的合成 を制御できないこと、速い血漿クリアランス及び尿排泄を含む治療可能性に関し ていくつかの大きな欠点を有する。

オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホアミデートは窒素−溝結合を含むヌクレ オシド間結合を有する。これらの核酸瀬似物は、ホスホアミダイト（又はホスホ ルアミダイト）中間体からまたは第１もしくは第２アミンの存在下においてＨ− ホスホネート中間体の酸化によって製造できる。Ｈ−ホスホネート類似体の製造 及び酸化反応は市販のＤＮＡ合成装置中で容易に実施できる。

非ホスフェートヌクレオシド間結合、たとえば、カーボネート、アセテート、カ ルバメート及びジアルキル−またはジアリールシリル−誘導体を含む種々の非イ オンオリゴヌクレオシド配列が合成され、報告されている。

カーボネート結合は酸による加水分解に対して抵抗性であるが、塩基によっては かなり容易に開裂され、従って、合成の末端の保護基の除去には特別な注意が必 要である。カルボキシメチルヌクレオチド結合を含むポリ（ｄＡ）類似体とポリ （Ｕ）類似体との間には安定なデユーブレックス（ｄｕｐｌｅｘ）が観察された が、他の塩基は研究されていない。従って、他の塩基とのデユーブレックス形成 の正確さかカーボネート結合によって混乱させられるか否かは知られていない。

ヌクレオシド間カルバメートは他のヌクレオシド橋よりも水溶性であることが報 告されている。しかしながら、チミンカルバメートは相補ＤＮＡとハイブリッド 形成せず、一方、シトシンカルバメートはハイブリッド形成してグアニンオリゴ マーとならないので、カルバメート結合の存用性は限定される。

カルバメート結合は、カーボネート結合のように、生理的条件下で安定である。

しかしながら、カーボネートとは異なり、カルバメート結合は塩基による加水分 解に対して安定であり、その性質かこの結合を含むオリゴマーの合成を簡易化す る。カルバメート結合はヌクレアーゼ加水分解に対して抵抗性である。

カーボネート及びアセテート結合のように、カルバメート結合はホスホジエステ ルヌクレオチド間結合の形状に似ていない。しかしながら、分子モデルは、カル バメート結合か、オリゴマーに相補核酸との水素結合複合体を形成させるであろ う配座をオリゴマーに取らせるべきであることを示唆している。カルバメートオ リゴマー及び相補核酸によって形成されるデユーブレックスの安定性に対しては 相反する報告がある。６個のチミジン単位を含むカルバメート結合オリゴマーは 、Ａ（ｐＡ）５またはｄＡ（ｐＡ）ｓと複合体を形成しない。他方、６個のデオ キシシトシン単位を含むカルバメート結合オリゴマーはｄ−（ｐＧ）、及びポリ （ｄＧ）と安定な複合体を形成する。

ジアルキル−またはジフェニルシリルオリゴマー類似体のヌクレオシド間結合は 、通常のホスホジエステルヌクレオチド間結合の四面体配置によく似ている。オ リゴマーは、無水ピリジン中において適当に保護されたヌクレオシド−３′　− 〇−ジアルキルーもしくはジフェニルシリルクロリドまたはトリフルオロメタン スルホニル誘導体を３°　−保護ヌクレオシドと適当に反応させることによって 溶液中で製造される。前者は、５’　−０４リチルヌクレオシドとジアルキル− またはジフェニルジクロロシランとのまたはビス（トリプルオロメタンスルホニ ル）ジイソプロピルシランとの反応によって製造できる。

ジアルキル−及びジフェニルシリル結合は酸による加水分解に対して感受性であ るので、合成のための保護基を選択する場合に注意をしなければならない。シロ キサンヌクレオシド間結合を育するヌクレオチドニ量体及び六量体ならびにこの ようなポリマーの合成方法は、Ｏｇｉ　１ｙｉｅ及びＣｏｒｍｉ　ｅｒによって 報告されている。たとえば、０ｇ１ｌｖｉｅ、　Ｋ、に、及びＣｏｒｍｉｅｒ、 　Ｊ、Ｆ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２６（３５）巻： 　４１５９〜４１６２頁（１９８５年）　；　Ｃｏｒｍｉｅｒ　Ｊ、Ｆ、及び０ ｇ１ｌｖｉｅ、　Ｋ。

Ｋ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１６　（１０）巻 ：　４５８３〜４５９４頁（１９８８年）参照。

カーボネート、カルバメート及びシリル結合オリゴヌクレオシド配列は、それら をアンチセンス試薬として魅力的な候補とするのに必要なヌクレアーゼ抵抗性を 有するが、それらがこの能力において作用できることはまだ報告されていない。

さらに、これらのオリゴマーが培養において細胞によって吸収され得ることも報 告されていない。これらのすリボマーに関する潜在的な欠点は、それらの報告さ れた、水溶液中への低溶解性である。生物学的実験におけるそれらの前動な使用 のために充分な濃度が得られるか否かは明白ではないか、溶解性はおそらく、分 子中への親水性基の導入によって増大され得るであろう。

本発明は、オリゴヌクレオチド類似化合物、このような化合物を含んでなる組成 物、このような化合物を製造するための中間体、ならびにこのような新規の、安 定性、ヌクレアーゼ抵抗性、標的特異的、脂質溶解性オリゴヌクレオチド類似体 を合成するための方法を提供する。

発明の要約 本発明は、３原子ヌクレオシド間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌ クレオシド配列を含んでなるヌクレオチド類似化合物を提供する。このようなオ リゴヌクレオシド配列の３原子ヌクレオシド間結合は式： −Ｄ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各りは独立してＣＨＲ１酸素またはＮＲ＠（式中、Ｒは独立して、水素 、ＯＨ，ＳＨまたはＳＨ２であり、Ｒ＠は水素またはＣ，−Ｃ２アルキルである ）であるか、Ｄは１個だけか酸素またはＮＲ’である〕を有する。

好ましい一実施態様において、オリゴヌクレオシド配列は、アデニン、シトシン 、グアニン、ウラシル、チミン及びそれらの変性物からなる群から選ばれた塩基 を含んでなる。

さらに詳しくは、本発明の化合物は式■：〔式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、 各りは独立してＣＨＲ１酸素またはＮＲ’　（式中、Ｒは独立して水素、ＯＨ， ＳＨまたはＳＨ２てあり、Ｒ６は水素またはＣ，−Ｃ２アルキルである）である が、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ’であり： 各Ｗ′は独立してＷまたは 各Ｒ１は独立して、ＯＨ，ＳＨ，ＮＲ２Ｒ’　（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して 水素またはＣ，−Ｃ，アルキルである）またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ４はＣ，− Ｃ，、アシルである）であり：各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形物であり； ｊは１〜約２００の整数であり： にはＯまたは１〜約１９７の整数であり：そしてｑは０または１〜約１９７の整 数であるが、ｊ＋］（＋ｑの合計は約４〜約２００である〕 のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる。

本発明の化合物は、場合によっては一方または両方の末端にジオールを有するオ リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシド配列を含んでなる。

好ましいジオールは１，２−ジオール（グリコール）である。代表的なグリコー ルはポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールまたはポリ プロピレングリコールである。好ましいグリコールはテトラエチレングリコール 及びヘキサエチレングリコールである。適当なジオールとしては、２個を除いて 全てのヒドロキシルがブロックされているポリオールも挙げられる。

本発明の化合物は一方または両方の末端にジオールを有するオリゴヌクレオシド 配列であるが、本発明の化合物は式］Ｉ：〔式中、各Ｚは独立して、Ｒ′　また は各Ｒ１は独立して、ＯＨ，５ＨＳＮＨＲ”ｌ？’　（式中、尺２及びＲ２は独 立して、水素またはＣ，−Ｃ，アルキルである）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ ４はＣＩ　ＣＩｌアシルである）であり。

各Ｒ″は独立して、水素またはＣ＋　−ＣＩ２アルキルてあり：Ｗ、Ｗ’、Ｙ、 Ｂ、ｊ、におよびｑは各々、前に定義した通りであり： 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるか、ｅ及びｆの少なくとも一方は少な（ とも１であり。

各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり、そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕 を有する。

好ましい一実施態様において、ｊ＋に＋ｑの合計は塩基約９〜５０個、より好ま しくは約１２〜２５個、最も好ましくは約１５〜１８個である。

この実施態様において、本発明の化合物は式：〔式中、ＲはＯＨ，ＳＨ，ＮＲ” Ｒ’　（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、水素またはＣ，−Ｃ，アルキルである ）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ４はＣ，−Ｃ，２アシルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり。

ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜２００個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌク レオチド配列であり； 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なく とも】であり； 各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり：そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる。

好ましい一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホモポリマーまたはヘテ ロポリマー配列中に、ｄＡ、　ｄＣ，ｄＧ、　Ｔの任意の組合せを含む。

グリコールかポリエチレングリコールである場合には、この実施態様の化合物は 式。

〔式中、ＲはＯＨ，ＳＨ，ＮＲ”Ｒ’　（式中、Ｒ２及びＲ２は独立して、水素 またはＣ，−Ｃ，アルキルである）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ１はＣ，−Ｃ ，、アシルである）であり： ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜５０個の塩基のオリゴヌクレオチド配列であり。

ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるか、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なくと もｌであり： ｍ及びｎは独立して、０〜２００であるが、ｍ及びｎの少な（とも一方は１〜２ ００である〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、それらか本発明の−Ｄ−Ｄ−Ｄ−結合基及び／ または本発明のジオール末端基を有効量含むという条件で、ホスホジエステル、 シリル及び他の公知の結合基のような公知のヌクレオシド間結合基を含むことか できる。

本発明はまた、下記式のヌクレオシドニ量体に関する：（式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ− Ｄ−Ｃ式中、各りは独立して、ＣＨＲ１酸素またはＮＲ’　（式中、Ｒは独立し て、水素、ＯＨ，ＳＨまたはＮＨ，であり、Ｒ“は水素またはＣ，−Ｃ，アルキ ルである）であるが、Ｄは１個だけか酸素またはＮＲ’である〕であり：各Ｂは 独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれらの変 形物であり； Ｒ７はＯＨ，ｔ−ブチルジメチルシリルオキシまたはホスホアミダイトであり、 そして Ｒ”はＯＨ１保護基またはｔ−ブチルジメチルシリルオキシである）。

本発明はさらに、オリゴヌクレオシド配列を含んでなる化合物のヌクレアーゼ分 解を抑制する方法を提供する。この方法は、該化合物の５°末端、３′末端また は両末端にジオールを結合させることを含んでなる。ジオールは、オリゴヌクレ オチド化合物をアルコキシトリチルジオールシアノホスフィン、好ましくはジメ トキシトリチルグリコールシアノホスフィンまたはモノメトキシトリチルグリコ ールシアノホスフィンと反応させることによって５′及び／または３°末端に結 合させる。

本発明はさらに、本明細書中で定義した式−Ｄ−Ｄ−Ｄ−を存する３原子ヌクレ オシド間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を製造す ることを含んでなる、天然のまたは修飾されたヌクレオチド化合物のヌクレアー ゼ分解を抑制する方法を提供する。

本発明の方法はまた、本明細書中て定義した３原子ヌクレオシド間結合を有する 約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化合物ならびに生 理的に許容され得る担体を含んでなる、遺伝子発現の抑制に有用な組成物を提供 する。

本発明はさらに、本明細書中に定義した３原子ヌクレオシド間結合を育する約６ 〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化合物の有効量を、遺 伝子発現の抑制のような治療か必要である唾乳頚に投与することを含んでなる、 遺伝子発現を抑制する方法を提供する。化合物はまた、一方または両方の末端に ジオールを有することかできる。好ましいジオールはポリエテリエングリコール である。

図面の簡単な説明 第１ａｌｌＪは、ヌクレオシドアルデヒド（化合物Ｉ）を製造するための合成経 路を示す。

第１ｂ図は、ホスホニウムヨーソトヌクレオシド（化合物ＩＩ）を製造するため の合成経路を示す。

第２図は、各々、第１ａ図及び第１ｂ図のアルデヒドヌクレオシド及びホスホニ ウムヨージドヌクレオシドを使用して、３炭素ヌクレオシド間結合によって連結 されたヌクレオシトニ量体を製造するための合成経路を示す。

第３図は、チミジンアルデヒド及びボスホニウムヨージドチミジン（各々、化合 物■及びＩＩ）を使用して、チミジンニ量体を製造するための合成経路を示す。

第４図は、３’　−Ｃ−Ｃ−Ｎ−５’型の２炭素−１窒素原子ヌクレオシド間結 合によって連結されたヌクレオシドニ量体を製造するための合成経路を示す。二 量体は、還元的条件下において、アルデヒド（ＣＦ（０）を含むヌクレオシドを 、アミン官能基（ＮＨ２）を含むヌクレオシドと反応させることによって合成さ れる。

第５図は、３’−Ｎ−Ｃ−Ｃ−５’型の２炭素−１窒素原子ヌクレオシド間結合 によって連結されたヌクレオシドニ量体を製造するための合成経路を示す。二量 体は還元的条件下において、アルデヒドを含むヌクレオシド及びアミン官能基を 有するヌクレオシドを反応させることによって合成される。

第６図は、３’−Ｃ−Ｃ−Ｎ−５’型の２炭素−１窒素Ｎ子ヌクレオシド間結合 によって連結されたチミジンニ量体を製造するための合成経路を示す。二量体は 、還元的条件下において、アルデヒド（ＣＨＯ）を含むチミジンを、アミン官能 基（Ｎｆ（２）を含むチミジンと反応させることによって合成される。

第７図は、３°−Ｎ−Ｃ−Ｃ−５’型の２炭素−１窒素原子ヌクレオシド間結合 Ｉこよって連結されたチミジンニ量体を製造するための合成経路を示す。二量体 は還元的条件下において、アルデヒドを含むチミジン及びアミン官能基を含むチ ミジンを反応させることによって合成される。

発明の詳細な説明 本発明の化合物は一般に、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であるオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオシド配列である。

本明細書中で使用する「ヌクレオシドは、プリンまたはピリミジン塩基と五炭糖 （ペントース）との組合せを指す。

本明ｍｙ中で使用する「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの燐酸エステルを指す 。

本明細書中で使用する［オリゴヌクレオチド」はホスホジエステルヌクレオシド 間結合のみを存するポリヌクレオチド、たとえば、「天然Ｊ　ＤＮＡまたはＲＮ Ａを指す。

典型的なヌクレオシドは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ ）、ウリジン（Ｕ）、デオキシアデノシン（ｄＡ）　、デオキシグアノシン（ｄ Ｇ）　、デオキシシチジン（ｄＣ）及びチミジン（Ｔ）である。

本発明の化合物は、ホスホジエステルまたは３原子ヌクレ才シド間結合を有する 約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる。３原子ヌクレオ シド間結合（−Ｄ−Ｄ−Ｄ−）はｌ）３個の炭素原子、２）２個の炭素原子と１ 個の酸素原子または３）２個の炭素原子と１個の窒素原子を含む。

オリゴヌクレオシド配列は天然または修飾されたヌクレオシドの配列である。本 明細書中で使用する句［ヌクレオシド間結合」とは、１個の天然または修飾され たヌクレオシドの３位の糖部分炭素原子と、隣接したこのようなヌクレオシドの ５位の糖部分炭素原子との間に架橋を形成する原子及び分子を指す。糖部分はリ ボースもしくはデオキシリボース部分またはそれらの類似体であることかできる 。

従って、ヌクレオシドとしては、Ａ、　Ｃ，Ｇ、　Ｕ、　ｄＡ、　ｄＣ，ｄＧ、 　Ｔまたはそれらの変形、たとえば、５−ブロモまたは５−ヨードウラシル、５ −メチルシトシン、イソントシン（２−アミノ−４−オキソピリミジン）、イソ グアニン（２−才キソー６−アミノプリン）、イノシシ（６−オキソプリン）、 ５−ビニルウラシル及び５−ビニルシトシンか挙げられる。

３原子ヌクレオシド間結合は下記式を有するニーＤ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各りは独立して、ＣＨＲ１酸素またはＮＲ’　（式中、Ｒは独立して、 水素、ＯＨ，ＳＨまたはＮＨ２、酸素であり、Ｒ６は水素またはＣｌ−Ｃ２アル キルである）であるか、Ｄは１個だけか酸素またはＮＲ６である〕。

本発明の化合物は式■のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる：〔式中、Ｗは− Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各りは独立してＣ１（Ｒ１酸素またはＮＲ’　（式中、Ｒ は独立して水素、ＯＨ，ＳＨまたはｌ’ｌＨ２てあり、Ｒ傳は水素またはＣ，− Ｃ，アルキルである）であるが、Ｄは１個だけ各Ｗ゛は独立してＷまたは 各Ｒ１は独立して、ＯＨ，ＳＨ，ＮＲ”Ｒ”　（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して 水素またはＣ，−Ｃ，アルキルである）またはＮＨＲ’　（式中、ＲｏはＣ，− Ｃ，、アシルである）であり：各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり。

ｊは１〜約２００の整数であり； には０または１〜約１９７の整数であり：そしてｑは０または１〜約１９７の整 数であるか、但し、ｊ＋に＋ｑの合計は約４〜約２００である〕。

好ましい一実施態様において、ｊ＋に＋ｑの合計は約９〜約５０である。より好 ましい実施態様において、ｊ＋に＋ｑの合計は約１２〜約２５であり、より好ま しくは約１５〜約１８である。

本発明の化合物は、一方または両方の末端にジオールを存する二とかできる。好 ましいジオールは、隣接する炭素上に２個のヒドロキシル基を含む、１，２−ジ オールとしても知られるグリコールである。好ましいグリコールはポリアルキレ ングリコールである。ここで使用する用語「アルキレン」は、場合によっては、 ここで定義されたようにして置換されることかできる、炭素数２〜４の直鎖及び 分枝鎖基を指す。このような基の代表例は、エチレン、プロピレン、イソブチレ ンなとである、好ましいポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール、 たとえば、ヘキサエチレングリコール及びテトラエチレングリコールである。適 当なジオールとしてはまた、２個以外の全てのヒドロキシルかブロックされてい るポリオールか挙げられる。

ジオールは、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオシド５°末端、３′ 末端または両末端に結合する。一実施態様においては、ジオールはオリゴヌクレ オシドの１つの末端のみに結合する。

末端ジオールは、ヒドロキシル（０）１）　、スルフヒドリル（５）Ｉ）、アミ ノ（ＮＨ２）　、アルキルアミノ（ＮＨ−アルキル）、ジアルキルアミノ（Ｎ　 （アルキル〕、）及びアミド（Ｎ！−１１ニアシル〕）からなる群から選ばれた 部分に結合する。

グリコールが一方または両方の末端に存在する場合には、本発明の化合物は式１ ｆのオリゴヌクレオシド配列を含んでなる：〔式中、各Ｚは独立して、Ｒｏ　ま たは各Ｒ１は独立して、ＯＨ，ＳＨ，Ｎ）ＩＲ”Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独 立して、水素またはＣ１Ｃ＊アルキルである）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ４ はＣｌ　Ｃ３−アシルである）であり：各Ｒ５は独立して、水素またはＣ，−Ｃ ，□アルキルてあり；Ｗ、Ｗ’、Ｙ、Ｂ、Ｌ　ｋ及びｑは各々、前に定義した通 りであり；各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一 方は少なくともｌであり； 各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり；そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕。

好ましい一実施態様において、ｍ及びｎは独立して、１〜６であり、ｊ＋に＋ｑ の合計は約９〜５０である。より好ましい実施態様において、ｊ＋に＋ｑの合計 は約１２〜２５、より好ましくは約１５〜１８である。

別の好ましい実施態様において、本発明の化合物は一方または両方の末端にジオ ールを有する約９〜２００個の塩基のオリゴヌクレオチド配列を含んでなる。さ らに別の好ましい実施態様において、本発明の化合物は、本発明の（−Ｄ−Ｄ− Ｄ−）結合を育する約９〜２００個の塩基のオリゴヌクレオチド配列を含んでな る。

好ましいジオールは、隣接炭素原子上に２個のヒドロキシル基を含む、Ｉ、２− ジオールとしても知られるグリコールである。好ましいグリコールはポリアルキ レングリコールである。ここで使用される用語［アルキレン」は、場合によって はここで定義されたようにして置換されることができる、炭素数２〜４の直鎖及 び分枝鎖基を指す。このような基の代表例は、エチレン、プロピレン、ブチレン などである。好ましいポリアルキレングリコールはポリエチレングリコールであ る。より好ましいのはテトラエチレングリコール及びヘキサエチレングリコール である。

ジオールはホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチドの５′末端、３゛ 末端または両末端に結合する。一実施態様において、ジオールはオリゴヌクレオ チド配列の一方の末端のみに結合する。

末端ジオールは、ヒドロキシル（ＯＨ）　、スルフヒドリル（ＳＨ）、アミノ（ ＮＨ２）　、アルキルアミノ（ＮＨ−アルキル）、ジアルキルアミノ（Ｎ（アル キル〕２）及びアミド（ＮＨ（アシル〕）からなる群から選ばれた部分に結合す る。ここで使用する「アルキル」は、場合によってはここで定義されたようにし て置換されることができる、炭素数１−１２の直鎖または分枝鎖基を指す。代表 的なアルキル−及びジアルキルアミノ基としては、メチル−、エチル−、プロピ ル−、ブチル−、ベンチルー、ヘキシル−、ジメチル−、ジエチル−、ジプロピ ル−、ジブチル−、ジペンチルー及びジアキルアミノなどが挙げられる。ここで 使用するｒＮＨ（アシル）」またはｒアミド」は末端０＝ＣＮＨ２基を有する炭 素数ｌ〜１２の直鎖または分枝鎖基を指す。代表的なアミド基としては、メタン アミド、エタンアミドプロパンアミド、ブタンアミド、ペンタンアミド、ヘキサ ンアミド、ヘプタンアミド、オクタンアミド、ノナンアミド、デカンアミド、ウ ンデカンアミド及びドデカンアミドが挙げられる。

一実施態様において、本発明の化合物は下記式のオリゴヌクレオチドを含んでな る： Ｃ式中、ＲはＯ）Ｉ、　ＳＨ，ＮＩ？’ｌ？’　（式中、Ｒ２及びＲ３は独立し て、水素またはＣ，−Ｃ，アルキルである）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ４は Ｃ，−Ｃ，、アシルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ，−Ｃ，、アルキルであり；ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜２０ ０個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌクレオチド配列であり： 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であり：各ｍ及びｎは独立して、１〜２００で あり；そして各ｐは独立して、２〜４である〕。

オリゴヌクレオチド配列は好ましくは、ｄＡ、　ｄＣ，ｄＧ、　Ｔまたはそれら の類似体の任意の組合せを含むホモポリマーまたはヘテロポリマー配列である。

好ましい一実施態様において、ｍ及びｎは独立して１〜８であり、より好ましく はｍ及びｎは共に４である。好ましいオリゴヌクレオチド配列は約９〜５０個、 より好ましくは約１２〜２５個、最も好ましくは約１５〜１８個の塩基を含む。

より好ましい一実施態様において、アンチセンス化合物は５゛及び３゛の両末端 にポリエチアルキレングリコールを有し、且つ下記式を有する。

〔式中、ＲはＯＨ，ＳＨ，ＮＲ”Ｒ’　（式中、Ｒ２及びＲ２は独立して、水素 またはＣ，−Ｃ，アルキルである）、またはＮＨＲ’　（式中、Ｒ４はＣ，−Ｃ ，２アシルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ，−Ｃ，、アルキルであり：ｏ１ｉｇｏ（Ｎ）は約９〜２０ ０個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌクレオチド配列であり： 各ｅ及びｆは独立して、１〜５０てあり。

各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり；そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕。

グリコールがポリエチレングリコールである場合には、この実施態様の化合物は 下記式のオリゴヌクレオチドを含んでなる：〔式中、ＲはＯＨ，ＳＨ，ＮＲ”Ｒ ’　（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、水素またはＣＩ　Ｃ１アルキルである） 、またはＮＨＲ”　（式中、Ｒ４はＣＩ　−Ｃ＋ｚアシルである）であり：オリ ゴＮは約９〜５０個の塩基のオリゴヌクレオチド配列てあり：そして 各ｅ、ｆ、ｍ及びｎは各々、独立して１〜５０である〕。

好ましい一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホモポリマーまたはヘテ ロポリマー配列中にｄＡ、　ｄＣＳｄＧＳＴの任意の組合せを含む。

他の好ましい実施態様において、ポリエチレングリコールはテトラエチレングリ コール（ＴＥＧ）であり、ｍ及びｎは共に４であるか、またはへキサエチレング リコールであり、ｍ及びｎか共に６である。

本発明の化合物はアンチセンス薬剤として有用である。アンチセンス薬剤は標的 核酸中の相補的ヌクレオチド配列とハイブリッド形成して、該標的核酸の翻訳ま たは転写機能を阻害する。標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。

本発明のアンチセンス化合物は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（ Ｇ）ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）及びこれらの塩基の変形からなる群から選ば れた塩基を含んでなるホモポリマーまたはヘテロポリマー配列を育する約６〜２ ００個の塩基のオリゴヌクレオシドを含んでなる。特定の配列は、それらの目的 とする標的に基づいて選択される。選択された配列は標的核酸とハイブリッド形 成する。標的の例としては、ＭＹＣ腫瘍遺伝子、ＲＡＳＩＩｉ瘍遺伝子及びウィ ルス核酸が挙げられる。

本発明の化合物は以下の方法によって製造できる。

Ａ、３炭素ヌクレオシド間結合を育する化合物３炭素ヌクレオシド間結合によっ て連結されたオリゴヌクレオシドを、各々３′及び６゛位にアルデヒド及びイリ ド官能基を育するヌクレオシドをウィティヒ（Ｗｉｔｔｉｇ）条件下で反応させ ることによって合成する。

市販の化合物からのヌクレオシドアルデヒド及びホスホニウムヨーシトヌクレオ シドの合成は各々、第１ａ図及び第１ｂ図に示される。アルデヒド（第１ａ図か らの化合物Ｉ）は、公知の３′−了りルー３゛−デオキシ−５’−０−ｔｅｒｔ −ブチルジメチルシリル−３゛−チミジン（化合物Ａ、第１［Ｎ）から合成され る。アリル化合物は、触媒量の四酸化オスミウム及び共酸化剤としてのＮ〜メチ ルモルホリンオキシドによって部分選択的に（ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｖｃｔｉｖｅ ｌｙ）酸化される。得られたジオール（化合物Ｂ、第１ａ図）は過ヨウ素酸ナト リウムによって開裂されて、はとんど定量的収率でアルデヒドを生じる。

ホスホニウムヨーシトヌクレオシド（化合物１１．第１ｂ図）の合成は市販の５ ゛−トリチル化ヌクレオシド（化合物Ｃ１第１ｂ図）である。トリチル化ヌクレ オシドは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドによって３゛位がシリル化 され、トリチル基は酸性条件下で高効率で除去される。得られた第一ヒドロキシ ル（化合物Ｅ、第１ｂ図）はズワーン（Ｓｗｅｒｎ）条件下で酸化されてアルデ ヒド（化合物Ｆ、第１ｂ図）を生じる。粗製アルデヒドは直ちに、メチルトリフ ェニルホスホニウムプロミドから誘導されたイリドと反応して４゛−ビニル−４ ′−デオキシ−３’　−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルヌクレオシドを良好な 収率で生じる。ビニル化合物は部分選択的にヒドロ硼酸化されて（ｈｙｄｒｏｂ ｏｒａｔｅｄ）　、第一アルコール（化合物Ｇ。

第１ｂ図）を良好な収率て生じる。第一アルコールは次に、イミダゾールの存在 下においてトリフェニルホスフィン−ヨウ素を用いて非常によい収率で対応する ヨウ化物（化合物Ｈ１第１ｂ図）に転化される。最後に、ヨウ化物はアセトニト リル中トリフェニルポスフィンを用いて目的ホスホニウムヨーシトヌクレオシド に変換される。

イリド（ｙｌｉｄｅ）は塩基としてカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを用いてホス ホニウムヨーシトヌクレオシドから製造され、直ちにアルデヒドと反応して良好 な収率でウィティヒ生成物（化合物１．第２図）か生成される。ウィティヒ生成 物は大気圧において水素と共に炭素上１０％パラジウム（１０％　Ｐｄ−Ｃ）を 用いて定量的収率で部分選択的に水素添加されて、結合の二重結合が飽和される 。飽和された化合物（化合物２．第２図）はテトラブチルアンモニウムフルオリ ドによって脱シリル化されてジオール（化合物３．第２図）を生じる。

次いで、ジオールの５′　−第一ヒドロキシルはジメチルオキシトリチルクロリ ドで部分選択的に保護され、得られた３゛　−ヒドロキシル（化合物４．第２図 ）は２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイト（化 合物５．第２図）に転化される。

トリアルキルシリルオキシ保護基を有するヌクレオシドニ量体またはそれ以上の オリゴマーが結合されて任意の所望の長さのオリゴヌクレオチドを形成する。連 鎖延長の完了時に、オリゴマーは標準法によって脱保護される（ｄ６ｐｒｏｔｅ ｃｔｅｄ）。オリゴマーがホスフェート結合によって連結される固相合成装置中 においてさらに鎖長延長するためには、オリゴマーの末端５゛　−及び３゛−ヒ ドロキシル基は各々、ジメトキシトリチルクロリド及びホスホアミダイトのよう なトリチル化試薬によって適当に官能化される。

８、　２炭素−１酸素原子ヌクレオシド間結合を有する化合物２炭素−１酸素原 子ヌクレオシド間結合を育するオリゴヌクレオシド配列は、３°−シリル化、５ ′−トルエンスルホニルヌクレオシドを５゛　−保護ヌクレオシドと反応させる ことによって合成される。

３゛−アセチル−５′−アルデヒドヌクレオシドは、当業者に公知の標準法を用 いて市販３°　−アセチル−ヌクレオシドから製造される。次いで、３゛−アセ チル−５″　−アルデヒドヌクレオシドは、修正されたウィティヒ反応を用いて ３゛−アセチル−５′　−カルボメトキシメチレンヌクレオシドに転化される。

５′−メチレンｌ１ｊｌｆｆ鎖は、アルコール、好ましくはイソプロパツール中 において水素化硼素ナトリウムで還元され、次いで、アルコール、好ましくはメ タノール中でナトリウムメトキシドによって３′−アセチル基か脱保護される。

次に、３゛　−ヒドロキシがシリル基で保護される。好ましい一実施態様におい て、シリル基はｔ−ブチルジメチルシリル基である。

次いて、３゛−シリル−５゛−カルボメトキシメチルヌクレオシドが、テトラヒ ドロフラン（ＴＨＦ）中においてジイソブチルアルミニウムハイドライド（ＤＩ ＢＡＬ）によってヌクレオシドの３’　−０−シリル−５°　−デオキシ−３° 　−（２−一エタノール）誘導体に還元される。５゛　−エタノール基はピリジ ン中ｐ−トルエンスルホニルクロリドによってｐ−１ルエンスルホニル基に転化 される。５゛−ｐ−トルエンスルホニルヌクレオシドの塩基部分の環外アミノ基 は場合によっては、当業者には容易にわかる公知の方法によって保護される。ア デニン及びシトシンの環外アミノ基に対する好ましい保護基はベンゾイル部分で ある。グアニンの環外アミノ基に対する好ましい保護基はイソブチル部分である 。グアニンはまた、０＠位において保護されることができる。

次いで、３′−〇−シリルー５’　−ｏ−ｐ−トルエンスルホニルヌクレオシド は５゛−保護ヌクレオシドと反応されて、２炭素−１酸素原子ヌクレオシド間結 合を有する３゛−〇−シリルー５゛　−保護ヌクレオチドニ量体を形成する。５ ′−〇−保護基は好ましくはトリチルであり、より好ましくはジメトキシトリチ ルである。３′−〇−シリルー５゛　−〇−保護ヌクレオシドは場合によっては ヌクレオシド塩基部分の環外アミノ基において保護される。

ヌクレオチドニ量体は、連鎖延長のホスホアミダイト固相合成法に使用されるシ アノホスフィン試薬、好ましくは２−シアノエトキシジイソプロピルアミノホス フィンによって３′　−炭素原子位において脱保護及び再誘導体化される（ｒｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）　ｏ　Ｇａ１ｔ、上記。

トリアルキルシリルオキシ保護基を有するヌクレオシドニ量体またはそれ以上の すリボマーが結合されて、任意の所望の長さのオリゴヌクレオシドか形成される 。連鎖延長の完了時に、オリゴマーは標準法によって脱保護される（ｄｅｐｒｏ ｔｅｃｔｅｄ）。オリゴマーがホスフェート結合によって連結される固相合成装 置中においてさらに鎖長延長するためには、オリゴマーの末端５′−及び３′− ヒドロキシル基は各々、ジメトキシトリチルクロリド及びホスホアミダイトのよ うなトリチル化試薬によって適当に官能化される。

Ｃ，２炭素−１窒素原子ヌクレオシド間結合を有する化合物Ｃ−Ｃ−Ｎ型の２炭 素−１窒素原子ヌクレオシド間結合によって連結されたオリゴヌクレオシド配列 は、第４図に説明されるようにして、アルデヒドを含むヌクレオシドを、アミン 官能基を含むヌクレオシドと還元的条件下において反応させることによって合成 されアルデヒド及びアミン化合物は市販の化合物から製造される。アルデヒドは ３゛−アリル−３′−デオキシ−５’−０−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルチ ミジンから製造される。アリル化合物は共酸化剤としてのＮ−メチルモルホリン 、Ｎ−オキシドの存在下において触媒量の四酸化オスミウムによって部分選択的 に酸化されてジオールを生成する。ジオールは次に、過ヨウ素酸ナトリウムによ って酸化されて、はとんど定量的な収率でアルデヒドを生成する。

アミン化合物は市販ヌクレオシドから合成される。代表的な方法において、ヌク レオシドの第一ヒドロキシル基は、ｐ−トルエンスルホニルクロリドによってト シレート基に部分選択的に変換され、次いで、ヨウ化物に転化される。ヨウ化物 中間体の３′　−ヒドロキシはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドで保護 され、アジ化ナトリウムと反応させることによってアジド基か導入される。アジ ド官能基は、水素雰囲気下において炭素上１０％パラジウムを用いてまたはラネ ーニッケル還元条件を用いて還元によって必要とされるアミンに効率よく転化さ れる。

アミン及びアルデヒドは緩衝化条件下、ナトリウムシアノホロハイドライドの存 在下において結合される（還元的アミノ化）。Ｃ−Ｃ−Ｎヌクレオシド間結合を 存するオリゴヌクレオシド配列体が良好な収率で形成される。オリゴヌクレオシ ドは無水トリフルオロ酢酸−トリエチルアミンと反応して、第二脂肪族窒素を保 護する。保護されたオリゴヌクレオシドはテトラブチルアンモニウムフルオリド によって脱シリル化され、得られたジオールの第一ヒドロキシル基かジメトキシ トリチルクロリドで選択的に保護される。残りの第二ヒドロキシルは、２−シア ノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイトと反応させることに よって必要とされるホスホアミダイトに変換される。

Ｎ−Ｃ−Ｃ型の２炭素−１窒素原子ヌクレオシド間結合によって連結されるオリ ゴヌクレオシドは、第５図に示されるようにして、還元的条件下において、各々 ３゛及び５゛位にアルデヒド及びアミン官能基を育するヌクレオシドを反応させ ることによって合成される。

アミン及びアルデヒド成分は市販化合物から合成される。アミンは３−アジド− ３−デオキシチミジン（ＡＺＴ）から合成される。ＡＺＴは第一ヒドロキシル基 はジメトキシトリチルクロリドによって保護され、得られたアジ化物は、水素雰 囲気下において炭素上１０％パラジウムを用いてまたはラネーニッケルを用いて 必要とされるアミンに部分選択的に変換される。

アルデヒドは市販５゛−０−ジメトキシトリチルチミジンから合成される。トリ チル化チミジンはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドによってシリル化さ れ、トリチル基か酸性条件下で除去される。

得られた第一ヒドロキシル基はズワーン条件下で酸化されてアルデヒドを生成す る。アルデヒドは単離されずに、直ちに（カルベトキシメチレン）トリフェニル ホスホランと反応させて不飽和エステルを生成する。不飽和エステルは、炭素上 １０％パラジウムで部分選択的に水素添加されて、飽和エステルを定量的収率で 生成する。飽和エステルは次に、ジイソブチルアルミニウムハイドライド（ＤＩ ＢＡＬ−Ｈ）によって必要とされるアルデヒドに極めて選択的に転化される。

アミン及びアルデヒドは緩衝化された還元的アミノ化条件下においてナトリウム シアノポロハイドライドの存在下において結合される。Ｎ−Ｃ−Ｃヌクレオシド 間詰合は良好な収率て得られる。オリゴヌクレオシドの第二脂肪族窒素は無水ト リフルオロ酢酸及びトリエチルアミンによって保護される。保護された二量体ま たはそれ以上のオリゴヌクレオシド配列は脱シリル化され、得られたヒドロキシ ルは２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−クロロホスホアミダイトに よってホスホアミダイトに転化される。

トリアルキルシロキンル保護基を存するヌクレオシド結合体またはそれ以上のす リボマーが結合されて、任意の所望の長さのオリゴヌクレオシドを形成する。連 鎖延長の完了時に、オリゴマーは標準法によって脱シリル化される。オリゴマー がホスフェート結合によって連結される固相合成装置中においてさらに鎖長延長 するためには、オリゴマーの末端５゛　−及び３゛−ヒドロキシル基は各々、ジ メトキシトリチルクロリド及びホスホアミダイトのようなトリチル化試薬によっ て適当に官能化される。

Ｄ、一方または両方の末端にジオールを有する化合物所望ならば、固相ホスホア ミダイト法の変法によって一方または両方の末端にジオールが結合される。Ｏｌ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔ編、３５〜８１ページ、　ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，（１９８４年）。

本発明の固相法の変法に従って、ジオールをアルコキシトリチル化合物と反応さ せてトリチル化ジオールを形成する方法によって、オリゴヌクレオチドの一方ま たは両方の末端にジオールを導入する。

ジオールは好ましくはグリコール、より好ましくはポリアルキレングリコールで ある。アルコキシトリチル試薬は好ましくはモノメトキシトリチルクロリドまた はジメトキシトリチルクロリド、最も好ましくはジメトキシトリチルクロリドで ある。次いで、トリチル化ジオールをシアノホスフィン試薬と反応させてトリチ ルジオールンアノホスフィン化合物か形成され、その化合物は本発明の化合物の 固相合成においてホスホアミダイト試薬（以下においてｒジオールホスホアミダ イト試薬」と称する）として使用される。

固相合成における最初の工程はヌクレオシドの固体支持体、好ましくは調整（ｃ ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）気孔ガラス（ＣＰＧ）支持体への結合である。

ヌクレオシドは好ましくは、ヌクレオシドの３′　−ヒドロキシル位においてス クシネート結合によってＣＰＧに結合される。ヌクレオシドを固体支持体に結合 させる他の手段は公知であり、オリゴヌクレオチド合成技術に熟練した者には容 易にわかる。あるいは、３″末端にジオールを導入するために、第１のヌクレオ シドの転化の前にジオールホスホアミダイト試薬を固体支持体に結合させること ができる。ジオールホスホアミダイト試薬は、ヌクレオシド結合に使用される方 法に類似した方法でスクシネートまたは他の結合を用いて固体支持体に結合され る。ジオールホスホアミダイト試薬を用いて使用されるこのような方法を修正す る手段は、当業者には容易にわかるであろう。第一のヌクレオシドの添加の前に 、任意の数のジオールを固体支持体上に置くことができる。好ましくは１〜約５ ０個のジオールが使用される。ジオールを５′末端にのみ結合させる場合には、 固体支持体上にジオールは置かない。

第１のヌクレオシドまたはジオールを固体支持体に結合した後、５°−ヒドロキ シル保護基（官能化トリチル基）を除去し、ホスホアミダイト試薬、すなわち、 ５゛　−トリチルヌクレオシド、３′−ホスホアミダイトの存在下において５° 　−ヒドロキシル基を活性化し、未反応ヌクレオシドをキャッピングし、そして 含燐（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）結合を酸化する逐次工程によって連鎖延長か起 こる。

結合されたヌクレオシドの５′−ヒドロキシル位における保護基は酸、好ましく はトリクロロ酢酸によって除去される。

この方法に従って使用できる活性化試薬は、当業者にはよく知られている。好ま しい活性化試薬はテトラゾール及び活性化剤金である　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ ５ｔｒ、Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、Ｃａ）　。

活性化工程は、添加されたヌクレオシドホスホアミダイト試薬またはジオールホ スホアミダイト試薬の存在下において起こり、後者の試薬は、ポリヌクレオチド の末端にジオールを添加する場合に従来の合成法のヌクレオシドホスホアミダイ ト試薬に取って代わる。

未反応鎖は停止させられるか、または無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールのよ うなキャッピング試薬でキャッピングされる。

不安定な３価燐結合は、好ましくはヨウ素によって、オリゴヌクレオチドの安定 な５価ホスホジエステル結合に酸化される。

目的とするオリゴヌクレオチド鎖の組立か完成した後、ホスフェート保護基は除 去され、鎖は固体支持体から分離されて、そして塩基保護基が常法によって除去 される。Ｇａ１ｔｓ、上記、６７〜７０ベージ。

当業者ならば、オリゴヌクレオチドを合成する他の手段かジオールを末端基とす るアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために同様にして修正できること がわかるであろう。

本発明の化合物は、遺伝的疾患または変化された遺伝子発現メカニズムと関係か ある疾患を有する哺乳須の治療に有用である。現在、ＨＩＶ、サイトメガロウィ ルス、単純ヘルペス、Ｂ型肝炎、乳頭腫ウィルス及びピコルナウィルスのような ウィルス感染：肺、結腸、頚、乳房及び卵巣の癌；炎症性疾患；ならびに免疫系 の疾患、たとえば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）　、血液学的新生物（ｎ ｅｏｐｌａｓｍａ）及び増殖過剰疾患（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ 　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療に使用するためのアンチセンス療法を開発しよう とする試みが進行中である。

ＡｒｍＳｔｒＯｎｇ、上記、８９ページ；　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、上記、　３０３ ．３０４ページ。

遺伝子発現の抑制に有用な本発明の組成物は、生理的に許容され得る担体及び１ ）場合によっては一方または両方の末端にジオールを育する、ここで定義された 式−Ｄ−Ｄ−Ｄ−のヌクレオシド間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴ ヌクレオチド配列を含んてなる化合物または２）一方または両方の末端にジオー ルを有する約９〜２００個の塩基のオリゴヌクレオチド配列を含んでなる化合物 を含んでなる。

遺伝子発現の抑制に有用な本発明の化合物は、本明細書中において、非経口注射 用、固体または液体の形態での経口投与用、直腸または局所投与用なとの担体と して集合的に担体と称される１種またはそれ以上の無毒性の生理的に許容され得 る担体、補助薬または賦形剤と共に組成物中に配合された１種またはそれ以上の 本発明の化合物を含む。

組成物はヒト及び動物に、経口的に、直腸から、非経口的に（静脈内、筋肉内ま たは皮下に）、槽内に、腟内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤またはドロ ップ）、または頬もしくは鼻の噴霧剤として投与できる。

非経口的注射に適当な組成物は、生理的に許容され得る滅菌水溶液もしくは非水 溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、及び滅菌注射用溶液もしくは分散液に再形 成するための滅菌粉末を含んアなることかできる。適当な水性及び非水性担体、 希釈剤、溶剤または賦形剤の例としては水、エタノール、ポリオール（プロピレ ングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなと）、それらの適当な 混合物、植物油（たとえば、オリーブ油）及び注射可能な有機エステル、たとえ ば、オレイン酸エチルが挙げられる。適当な流動性は、たとえば、レシチンのよ うなコーチングを使用することによって、分散液の場合には必要とされる粒度の 保持によって及び界面活性剤の使用によって保持できる。

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分配剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）のような補助薬を含むことかできる。微生物の作用の防止は、種 々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール 、ソルビン酸などによって保証され得る。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリ ウムなどを含むことも望ましいであろう。注射可能な形態の長期吸収は、吸収を 遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用 によってもたらされる。

所望ならば、そしてより効率的な分配のために、化合物は、徐放山系または標的 送出系、たとえば、ポリマーマトリックス、リポソーム、及び微小球中に取り入 れることができる。それらは、たとえば、細菌保持フ４ルターを通す濾過によっ て、または使用の直前に滅菌水またはいくつかの他の滅菌注射用媒体に溶解でき る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を混和することによって滅菌できる。

経口投与用の固体投与形態としては、カプセル剤、錠剤、乳剤、散剤及び顆粒剤 が挙げられる。このような固体投与形態においては、活性化合物は少なくとも１ 種の不活性な通常の賦形剤（または担体）、たとえば、クエン酸ナトリウムもし くは燐酸二カルシウム、または（ａ）充填剤または増量剤、たとえば、澱粉、ラ クトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び珪酸、（ｂ）結合剤、た とえば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピ ロリドン、スクロース及びアラビアゴム、（Ｃ）保湿剤、たとえば、グリセロー ル、（ｄ）崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯またはタピオカ澱 粉、アルギン酸、ある種の複合珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、 たとえば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、たとえば、第四アンモニウム化合物 、（ｇ）　湿Ｇ剤、たとえば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロ ール、（ｈ）吸着剤、たとえば、カオリン及びヘントナイト、ならびに（ｉ）滑 沢剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム 、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物 と混合される。カプセル剤、錠剤及び乳剤の場合には、投与形態はさらに緩衝剤 を含むことかできる。

同様な型の固体組成物はまた、ラクトース、すなわち、乳糖ならびに高分子量ポ リエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて軟及び硬−充填ゼラチンカプ セル剤中に充填剤として使用できる。

皮膜及びシェル、たとえば、腸溶性皮膜及び当業界で公知の他のものを有する、 錠剤、糖剤、乳剤及び顆粒剤のような固体投与形態か調製できる。それらは不透 明剤を含むことができ、また、腸管のある部分において遅延された方法で活性化 合物を放出するような組成物であることかできる。使用できる埋蔵組成物の例は 高分子物質及びロウである。

活性化合物は、適当であるならば、１種またはそれ以上の前記賦形剤と共にマイ クロカプセル化された形態であることかできる。

経口投与用の液体投与形態としては、生理的に許容され得る乳剤、液剤、懸濁剤 、シロップ剤及びエリキシル剤が挙げられる。活性化合物の他に、液体投与形態 は、当業界において常用される不活性希釈剤、たとえば、水もしくは他の溶剤、 可溶化剤及び乳化剤、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、 炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレン グリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に、 綿実油、グラウンドナツツ・オイル、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ 油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレ ングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステルまたはこれらの物質の混合物など を含むことかできる。

このような不活性希釈剤の他に、組成物はまた、補助薬、たとえば、湿潤剤、乳 化剤及び沈澱防止剤、甘味料、矯味剤及び矯臭剤を含むことができる。

懸濁剤は、活性化合物の他に、沈澱防止剤、たとえば、エトキシル化イソステア リルアルコール、ボリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微 品質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラ ガカントまたはこれらの物質の混合物などを含むことができる。

結腸投与用組成物は好ましくは、本発明の化合物を適当な非刺激性賦形剤または 担体、たとえば、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは座剤ロウと混合する ことによって製造できる座剤であり、それらは常温では固体であるが体温では液 体であり、従って、結腸または膣腔において融けて活性成分を放出する。

本発明の化合物の局所投与用投与形態としては、軟膏剤、散剤、噴霧剤及び吸入 剤か挙げられる。活性成分は、必要とされる場合には、生理的に許容され得る担 体及び任意の必要とされる保存剤、緩衝剤または噴射剤と滅菌条件下において混 合される。眼用製剤、眼軟膏剤、散剤、点眼剤も本発明の範囲内であると考えら れる。

本発明の化合物はリポソームの形成て投与されることもてきる。

当業界で知られる通り、リポソームは一般に、燐脂質または他の脂質物質から誘 導される。リポソームは、水性媒体中に分散された単または多層板状水和液晶に よって形成される。リポソームを形成できる、任意の無毒性であって、生理的に 許容されることができ且つ代謝可能な脂質を使用できる。リポソーム型の本発明 の組成物は、本発明のりボキシゲナーゼ抑制化合物の他に、安定剤、保存剤、賦 形剤などを含むことかできる。好ましい脂質は燐脂質及びホスファチジルコリン （レシチン）（天然及び合成の両方）である。

リポソームを形成するための方法は公知である。たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｐｒｅｓｃｏｔｔ！、ＸｒＶ巻、　Ａｃａｄ ｅ＋ｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、、　３３頁以降（１９７６年）参照。

本発明の組成物中の活性成分の実際の投与量は、特定の組成物及び投与方法に関 して、目的とする治療的反応を得るのに前動な量の活性成分か得られるように変 化させることができる。選択される投〉　４量は、従って、目的とする治療効果 、投与経路、目的とする治療持続時間及び他の要因に依存する。

（単一用量または分割用量で宿主に投与される本発明の化合物の終日用量は、た とえば、体重ｋｇ当り約１ナノモル〜約５ナノモルの量であることができる。投 与単位組成物はこのような量または日用量を作るのに使用され得るようなそれら の約量を含むことができる。

しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的な用量レベルは、体重、全身健 康状態、性、食事、投与時間及び経路、吸収及び排泄速度、他の薬物との組合せ 、ならびに治療される疾患の重さに依存することが理解されよう。

以下の例はさらに、本発明を実施する最善の態様を説明するが、明細書及び請求 の範囲を限定するものと解してはならない。

例１：５−０’−ジメトキリトリチル−３−０’−ｔ−ブチルジメチルシリルチ ミジンの製造 ジメトキシトリチルチミジン（５，０ｇ　、９．２ミリモル）及びイミダゾール （１，２ｇ、　１８．４ミリモル）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５ ｍｌ中に溶解させ、そしてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１，７ｇ 、１１．５ミリモル）に添加した。

反応混合物を室温において４時間攪拌し、酢酸メチルで希釈し、そして水、飽和 塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥させた。定量的収量の表 題化合物が得られた。

例２：３’　−〇−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンの製造例Ｉの方法に従っ て製造された５′　−〇−ジメトキシー３°　−０−１−ブチルジメチルシリル チミジンを室温において１時間、塩化メチレン中３％トリクロロ酢酸溶液１３ｍ １で処理した。次いで、反応混合物を５％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム溶液で 中和した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。表題化合物を、塩化メチレン中 酢酸エチルの０〜３０％の勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって 精製した。反応の収率は８５％であった。

−７８°Ｃにおいて乾燥塩化メチレンのよく攪拌された溶液に、塩化オキ＋ｊ　 ＩＪ　ル（３３，Ｏミ’Ｊ　モル、　２．８８＋＋＋１）を添加し、次イテ、Ｄ ＭＳＯ（３，１２ｍ１．　４．４ミリモル）を滴加した。１０分後、　ＣＨ２Ｃ Ｉｚ　２０．０ｍｌ中の、例２の方法に従って調製されたアルコール（５，６ｇ 、　１５．７ミ’Ｊ％ル）　ヲ２分間にわたって滴加し、４５分間、攪拌を続け た。ＥｈＮ　（８，１ｍｌ。

５８、１　ミリモル）を添加し、攪拌をさらに４５分間続けた。次いで、反応混 合物を室温にし、次に、水（２Ｘ　ｌ０ｍ１）　、次いで、ブライン（ｌｈ＋Ｉ ）で洗浄し、そして乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。この粗製アルデヒドを次の工 程に用いた。

例４：５′−ビニルー５゛−デオキシ−３′−ｔ−ブチルジメチルシリルデオキ シチミジンの製造 ０°Ｃにおいて乾燥テトラヒドロフラン（ＴＩ（Ｆ）中メチルトリフェニルホス ホニウムプロミド（０，７ミリモル）の溶液にナトリウムビス（トリメチルシリ ルアミド）（０，６ミリモル）の溶液を滴加した。３０分後、対応する４′　− アルデヒドのＴＨＦ中溶液を窒素下において滴加した。反応混合物を２時間攪拌 し、酢酸エチルで希釈し、水で、次いでプラインで洗浄し、そして乾燥させた（ Ｎａ２ＳＯ４）。表題化合物を、２０％酢酸エチル−へキサンを用いてフラッシ ュクロマトグラフィーによって精製した。収率は５５〜６０％であった。

例５　：　３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′　−デオキシ−５′− ヒドロキシメチルチミジンの製造０°Ｃの無水ＴＨＦ　３ｍｌ中２Ｍの２−メチ ル−２−ブテン（１，６ｅｑ。

１．５ｍｌ、３ミリモル）の溶液に１Ｍボラン−テトラヒドロフラン複合体（３ ｍｌ、２ミリモル）　１．６ｅｑをＮ２下で徐々に加えた。

この溶液を１０分間攪拌し、次いで、無水ＴＨＦ　Ｓｍｌ中の、例４の方法に従 って製造されたビニルチミジン（０，７ｇ、１．９ミリモル）を添加した。反応 混合物を４５分間攪拌し、冷蔵庫に２日間入れた。

２Ｍ水酸化ナトリウム３１ｅｑ及び３０％過酸化水素３．　Ｉｅｑを含んでなる 水溶液を用いて処理を行った（好ましくは０℃において水酸化ナトリウム水溶液 に過酸化水素を滴加し、１０分間攪拌する）。ｏ′ｃにおいて添加用漏斗から反 応混合物に溶液を徐々に添加し、１時間攪拌し、水浴から取り除き、酢酸エチル で希釈し、水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナトリウムによって乾 燥させた。表題化合物を、ヘキサン中酢酸エチルの２０〜８０％の勾配を用いて フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率は６２％であった。

乾燥アセトニトリル（５ｍｌ）及びエーテル（３，４［＋１１）中の、例５の方 法に従って製造された３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５゛−デオキシ −５′−ヒドロキシメチルチミジン（０，３ｇ、０．９ミリモル）の溶液にトリ フェニルホスフィン３ｅＱ（０，７ｇ、２．８ミリモル）、イミダゾール４ｅｑ （０，３ｇ、３．７ミリモル）及びヨウ素２，２ｅｑ　（０，５ｇ。

２．８ミリモル）を加えた。反応混合物を４５分間攪拌し、溶媒を蒸発させた。

酢酸エチルを残渣に加え、残渣を水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸 ナトリウムによって乾燥した。表題化合物を、ヘキサン中酢酸エチルの３０〜５ ０％の勾配を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率は９ ０％であった。

例７　：　３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５゛−デオキシ−５゛−チ ミジルメチルホスホニウムヨージドの製造例６の方法に従って製造された５′− ヨードメチル−５゛−デオキシ−３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジ ンの攪拌された溶液に乾燥ＣＨコＣＮ（５ｍｌ）中ヨウ化物（４８０ｍｇ、１ミ リモル）及びトリフェニルホスフィン（１，５７ｇ、６ミリモル）を加え、そし て混合物を９０″Ｃにおいて１２時間、還流させた。反応を冷却させ、そして溶 媒を除去した。表題化合物を、ＣＨｔＣ１ｔ中５％ＭｅＯＨを用いてフラッシュ クロマトグラフィーによって精製した。生成物は９５〜９６％の収率で得られた 。

例８：５°−ｔ−ブチルジメチルシリル−３′−デオキシ−３゛−（１”、２′ ′−ジヒドロキシ−３°′−プロピル）チミジンのら）に記載された方法に従っ て製造された３’　−（２”−プロペニル）−３°　−デオキシ−５’　−０− ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（１８３ｍｇ、０．５　ミリモル）及び４− メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（５３ｍｇ、　０．４５ミリモル）の無水ＴＨ Ｆ　５．０ｍｌ中の攪拌された混合物に、ブタノール中四酸化オスミウム（Ｏｓ ０４８４滴、２．５ｗ／ｖ％）を加えた。次いで、反応混合物を１０％ピロ亜硫 酸ナトリウム水溶液（２，０ｍｌ　）で冷却し、２０分子ｖｉ攪拌し、シリカの パッド上で濾過し、そして酢酸エチル（２５，０ｍ１）で希釈した。有機相を水 （５，０ｍ１）及びブラインで洗浄し、次いてＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒 を蒸発させ、そして表題化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。

例９　：　５’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−３′　〜デオキシーチ過ヨ ウ素酸ナトリウム（２１４ｍｇ、１ミリモル）を、ＴＨＦ−）１２０（比４１、 　５．０ｍ１）中の、例２の方法によって製造されたチミジンジオール（２００ ｍｇ、０．５　ミリモル）の攪拌された溶液に加えた。１時間後、反応混合物を 酢酸エチル（２５ｍｌ）で希釈し、Ｉ（，０（２Ｘ　５　ｍｌ）　、ブラインで 洗浄し、そして乾燥させた。表題化合物を、ヘキサン中７０％酢酸エチルを用い てフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

例１０：３炭素ヌクレオシド結合を有するチミジンニ量体の製造例１０ａ−１０ ｅの方法は第３図に示す。

１０ａ、乾燥ＴＨＦ　（２，０ｍｌ）中の、例７の方法に従って製造されたホス ホニウムヨーシト化合物（２４１ｍｇ、０．３２６　ミリモル）の攪拌された懸 濁液に、窒素下で一７８℃においてカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０，６２ｍ １．　ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液、０．６２ミリモル）を加えた。２０分後、例９の 方法に従って製造された３″−アセトアルデヒド化合物（８０ｍｇ、　０．２２ ミリモル）を加えた。６０分後、反応混合物を酢酸エチル（３０ｍｌ）で希釈し 、水（２ｘ５ｍｌ）及びブライン（５ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた（Ｎａ ２ＳＯ４）。溶媒を蒸発させ、そしてオレフィン生成物（化合物ｌ）を、ヘキサ ン中７０％酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製した 。収率は５５〜６０％の範囲であった。

１０ｂ、　２５°Ｃ及び１気圧の水素において、メタノール（５，０ｍ１）中の 化合物１　（１０９ｍｇ）の攪拌された溶液に１０％　Ｐｄ　−Ｃ（２０ｍｇ） を加えた。

４時間後、触媒をセライトのパッド上に濾過し、そして溶媒を蒸発させた。こう して化合物２を回収し、次いで、ヘキサン中８０％酢酸エチル中におけるフラッ シュクロマトグラフィーによって精製した。

１０　ｃ　、ＴＨＦ　５．０ｍｌ中の化合物２　（３５０ｍｇ）の攪拌された溶 液に、０°Ｃのテトラブチルアンモニウムフルオリド約２．８当量を加えた。３ 時間後、溶媒を蒸発させ、そして化合物３を、ＣＨ２Ｃｌ　２中１０９６メタノ ールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

１０ｄ、乾燥ピリジン（４，０ｍ１）中の化合物３　（０，６ミリモル）の攪拌 された溶液に、４−ジメチルアミノピリジン約０．０５当量、トリエチルアミン １．４当量及び４．４′−ジメトキシトリチルクロリド１．２当量を加えた。２ 時間後、反応混合物を水２．０ｍｌで冷却し、次いて、酢酸エチル２．０ｍｌで 希釈した。有機相を分離し、ブラインで洗浄し、そして乾燥させた。化合物４を 、塩化メチレン中５９６メタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによ って精製した。

１０ｅ、化合物４（０，５ミリモル）の攪拌された溶液に、ジイソプロピルエチ ルアミン約２．０当量及び乾燥ジクロロメタン（ＣＨｉＣｌｚ）　１．０ｍｌを 加えた。３０分後、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルクロロボスホア ミダイト０．７５当量を１ｍずつ２０分間にわたって加え、さらに１時間攪拌を 続けた。次いて、溶媒を蒸発させ、そして化合物５を、窒素雰囲気下において酢 酸エチル（１％トリエチルアミンを含む）フラッシュクロマトグラフィーによっ て精製した。

前記工程ａ−ｄの方法を用いて、３個の炭素か全て、式−ＣＨ，−を育する３炭 素ヌクレオシド間結合を育する二量体を生成する。

炭素のいずれかまたは全てか場合によっては、以下の第３図において示される方 法を修正することによって、ヒドロキシル化されることかできる。０°Ｃのｔ− ブタノール中四酸化オスミウムの２．５％（ｗ／ｖ）溶液１滴を、Ｔ）ＩＰｏ、 　８ｍｌ中の化合物ｌ及び４−メチルモルホリンＮ−オキシド（９，１ｍｇ）の 攪拌された溶液に加えた。反応混合物を２４時間、０℃に保持し、ピロ亜硫酸ナ トリウムの水溶液で冷却し、酢酸エチルで希釈し、そして水及びブラインで洗浄 した。溶媒を蒸発させ、そして得られたヒドロキシル化二量体を溶離剤として酢 酸エチルを謂いて薄層クロマトグラフィーによって生成した。次いで、ヒドロキ シル化二量体を保護し、そして前記の工程ｂ−ｄのようにして５°及び３′末端 を修飾した。

例１１：ヒドロキモ 工程ａ　−ｄによって生成されたチミジンー二量体ホスホアミダイト化合物を、 修正された固相ホスホアミダイト合成法に使用して、表１のオリゴヌクレオシド 配列を生成した。

オリゴデオキシヌクレオチドは３′末端から５′末端に合成した。

５’　ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ［ＴｃＴ］ｐＴｐＴｐＴｐＴｐｙｐｙｐＴ　ｓ／　 １５’　ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ［ＴｃＴ］ｐＴｐＴｐｙｐｙｐＴ　３’ 　２５’　ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ［ＴｃＴ］ｐｙｐＴ　３’　３Ｃ ＝　−ＣＨ，−・ＣＨ２−ＣＨ２− Ｙ＝　テトラエチレングリコール 合成は、修正されたホスホアミダイト法に従って進行した。結合されたチミジン の５゛　−ヒドロキシル基をトリクロロ酢酸と反応させて、５′−ヒドロキシル 基を脱保護した。この脱保護工程に続いて、結合されたチミジンは活性化剤、テ トラゾール及びジメトキントリチルテトラエチレングリコールシアノホスフィン を含んでなるホスホアミダイト試薬と反応させた。活性化工程の次に、未反応の ５″　−ヒドロキシル基の無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールによるキャッピ ングが行われた。次いで、燐結合が標準法に従ってヨウ素で酸化された。２佃の テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）残基を含む配列ｌ及び２において、脱保護 、活性化、キャッピング及び酸化工程は前述のようにして繰り返された。

次いで、脱保護、活性化、キャッピング及び酸化の標準逐次工程（活性化工程の 間に所望ならば鎖中の、例１〜９の方法に従って製造された３炭素結合チミジン ニ量体が添加されるという修正がされた）を経て連鎖延長が進行した。

鎖の組立の最後において、濃水酸化アンモニウムによってＣＰＧ支持体からチミ ジンオリゴマーが除去された。次いで、溶液をさらに５５°Ｃにおいて８〜１５ 時間処理して、塩基の環外アミン上の保護基を全て除去した。

３′−〇−アセチルー５′　−力ルポメトキシメチレン−５′−デオキシチミジ ン３．１７ｇのイソプロパツール９５ｍ１中の、冷たい（水浴）攪拌された混合 物に水素化硼素ナトリウム約０．３９ｇを加えた。混合物を窒素雰囲気下、０℃ において半時間攪拌し、次いで室温でさらに４時間半、攪拌した。

冷却した混合物をメタノール２０ｍ１で、次いて、３０分してから蒸留水２００ ｍ１で冷却し、次いで、酢酸エチルで数回に分けて抽出した。

合した有機抽出物をブラインで処理し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥させ た。乾燥剤を濾去し、溶媒を蒸発させて、表題化合物を２．７ｇの残留ガラスと して生成した。

ナトリウムメトキシドの２５％（Ｗ／　Ｖ　）メタノール溶液約１０滴を、乾燥 （中性アルミナのベッドを通過させた）メタノール約３ＱＯｍｌ中の、例１２の 方”法に従って製造された、３′−〇−アセチルー６′　−カルボメトキシメチ ル−５゛　−デオキシチミジン２．２２　ｇの冷たい、攪拌された溶液に加えた 。混合物を窒素雰囲気下において、水浴を補充することなく、約２０時間攪拌し た。

少量の陽イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＡＧ　５０ＷＸ８）を加え、混合物 を３０分間、攪拌した。減圧下において溶媒を除去し、残留ガラス２．１ｇを生 成し、それを温トルエンで処理し、冷却後、濾過し、そしてシクロヘキサンです すいで、粗製生成物を白色固体１．６４ｇとして生成した。

シリカゲル上のクロマトグラフィー（酢酸エチルで溶離）、次いで酢酸エチル／ ヘキサンからの再結晶によって表題化合物をさらに精製して少量の出発原料を除 いて、白色結晶を生成した。

窒素雰囲気下において、無水ＴＨＦ４０ｍｌ中３’　−０−ｔ−ブチルジメチル シリル−５′−カルボエトキシメチル−５゛−デオキシチミジン１．８８　ｇの 冷たい（−４０℃〜−３０℃）、攪拌された溶液に、テトラヒドロフラン（ＴＨ Ｆ）中ＩＭジイソブチルアルミニウムハイドライド約１９ｍ１を添加した。次い で、反応温度を一２０℃に徐々に上昇させた。

混合物をメタノール約３．５＋ｎｌで冷却し、そして反応温度を−１０”Ｃに上 昇させた。この温混合物にＴＨＦ３６ｍｌ中水約１８ｍ１を加え、そして温度を さらに１０℃に上昇させた。減圧によってＴＨＦのほとんどを除去し、そして残 渣を約２倍容量の水で希釈した。水相を酢酸エチル／クロロホルムで数回抽出し た。合した抽出物を冷２Ｎ塩酸及びブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで 乾燥させ、そして濾過した。溶媒を減圧によって濾液から除去して、表題化合物 （約１．６ｇ）を生成した。

例１５：３’−〇−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−（２°゛−ヨードエチル ）−５′　−デオキシチミジンの製造無水ピリジン２５〜３０ｍ１中の、例１４ の方法に従って製造された３′−０−１−ブチルジメチルシリル−５″−（２° ′−ヒドロキシエチル）−５°　−デオキシチミジンＩｇの溶液にｐ−トルエン スルホニルクロリド約１ｇを加え、混合物を約５°Ｃにおいて約１９時間、栓を して保持した。

混合物を氷水約２００ｍ１に添加し、エーテルで数回抽出した。合した有機抽出 物を冷２Ｎ塩酸、水及びブラインで洗浄した。洗浄された抽出物を無水硫酸ナト リウムで乾燥させて、濾過した。濾液から減圧によって溶媒を除去して、ｐ−） ルエンスルホニル誘導体１．２４ｇの残留ガラスを生じた。

ｐ−トルエンスルホニル誘導体約０．５４　ｇ及びヨウ化ナトリウム０、３８　 ｇを３日間、乾燥（モレキュラーシーブ　４Ａ）アセトン５５ｍ１中に溶解させ 、次いで、最終日に攪拌しなからヨウ化ナトリウム０．１９ｇをさらに添加した 。

反応混合物を濾過し、そして溶媒を蒸発させて粗製生成物を生じた。

粗製生成物をシリカゲル８５ｇ上のクロマトグラフィー（ヘキサン２５％酢酸エ チルで溶離）によって精製した。溶媒を蒸発させて、目的とする３’　−０−ｔ −ブチルジメチルシリル−５’　（２”−ヨードエチル）−５′　−デオキシチ ミジン０．４ｇを生成した。

乾燥メタノール（中性アルミナ床を通過させた）１５０ｍｌ中の３°　−０−ア セチル−５′−カルボメトキシメチレン−５′−デオキシチミジン１．５ｇの攪 拌された溶液に、メタノール中２５％ナトリウムメトキシド約ＩＯ滴を加えた。

混合物を窒素雰囲気下、室温においてさらに６時間攪拌した。

１０分間攪拌しながらこの混合物に少量の陽イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　 ＡＧ−５０Ｗ−Ｘ８）を加えた。溶媒を減圧下において除去して、１．３ｇの白 色固体残渣を生成した。残渣を温トルエンで２回こね、次いで、熱エタノール中 に吸収させ、濾過し、そして冷却して、乾燥後、表題化合物を白色結晶生成物と して生成した（０．８５　ｇ　）。

無水ジメチルホルムアミド１ｍｌ中のイミダゾール２０５ｍｇ及びｔ−ブチルジ メチルシリルクロリド２２７Ｈの冷たい（氷水浴）、攪拌された溶液に窒素雰囲 気下において５゛　−カルベトキシメチレン−５゜−デオキシチミジン２９６ｍ ｇの溶液を滴加した。添加完了後、混合物を氷から取り出し、周囲温度において ２時間、次いで３５°Ｃにおいてさらに２時間、最後に４０°Ｃにおいて３０分 間、攪拌を続けた。

次いで、混合物をメタノール２ｍｌで、次に２〜３倍容量の水で冷却した。水相 を酢酸エチルで数回抽出した。合した有機抽出物を水、飽和炭酸水素塩溶液及び ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濾過した。濾液か ら減圧によって溶媒を除去して、３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリリルー５ ′−カルボメトキシメチレン−５′　−デオキシチミジン０．４０ｇを生成した 。

−３０°Ｃ未満の温度において無水テトラヒドロフラン１０ｍ１中に溶解された ３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′カルボメトキシメチレン−５′　 −デオキシチミジン０．３７ｇの一３０°Ｃ〜−３５°Ｃの冷却溶液に、テトラ ヒドロフラン中ジイソブチルアルミニウムハイドライドのＩＭ溶液約４ｍｌを滴 加した。添加完了後、内部温度を約−３０〜約−２０°Ｃの範囲に保持しながら 、反応を窒素雰囲気下においてさらに２時間攪拌した。

反応混合物にメタノール約０．８ｍｌを加え、次いで、テトラヒドロフラン８ｍ ｌ中水４山１の溶液を添加した。減圧下において、比較的揮発性のテトラヒドロ フランのほとんどを除去した。水性残渣をその容量の約２倍の水で希釈し、酢酸 エチルで数回抽出した。合した有機抽出物を冷ＩＮ塩酸及びブラインで洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濾過した。濾液をストリッピングして 、残留表題化合物０．２６７ｇを生成した。

この材料の一部分を、シリカゲル上のクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ ヘキサンで溶離）によって分析純度まで精製した。

例１８：２炭素−１窒素原子（３°−０−Ｃ−Ｃ−３’−）ヌクレオシド間結合 を含むチミジンニ量体の製造１８ａ、５’−０−）リチルチミジンの攪拌された 溶液に、０℃において塩基及び３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’　 −（２°゛−ヨードエチル）−５′−デオキシチミジンを各々、等モル量加える 。反応の経過を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって監視する。

反応の完了後、目的二量体を単離し、フラッシュクロマトグラフィーによって精 製する。

１８ｂ、約−５°Ｃの温度に保持された３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル −５’−（２°°−ヒドロキシエチル）−５′　−デオキシチミジンの攪拌され た溶液に、２当量の塩基を加え、そして溶媒を蒸発乾固させる。残渣をＤＭＦ中 に再溶解させ、そして１当量の５゛−ジメトキシトリチル−２’、３’　−シク ロチミジンを加える。反応混合物を約４０°Ｃに加熱し、そして目的二量体の形 成をＴＬＣによって監視する。反応の完了後、目的二量体を単離し、フラッシュ クロマトグラフィーによって精製する。

例１９：例１８の二量体の３′末端の脱保護０°Ｃにおいて例１８の二量体のＴ ＨＦ溶液を２．８当量のテトラブチルアンモニウムフルオリドで処理することに よって、保護された二量体の３′　−ｔ−ブチルジメチルシリル保護基をを除去 する。反応の完了後（一般に約３時間後）、溶媒を蒸発させ、目的二量体を単離 し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製する。

例２吐自動化合成に適当な官能化二量体単位の製造例１９の二量体生成物をジク ロロメタンに溶解させ、そして２当量のジイソプロピルエチルアミンを加える。

混合物を３０分間攪拌し、次いで、約２０分間にわたって０．７５当量の２−シ アノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイトを滴加する。攪 拌をさらに１時間続け、溶媒を蒸発させ、そして得られた官能化二量体を単離し 、不活性雰囲気下において酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーカ ラム上でｔｒｉｌｌする。

例２１：５’−ｔ−ブチルジメチルシリル−３′−デオキシ−３°−（１”、２ ”−ジヒドロキシ−３′′−プロピル）チミジンの製造 ０℃において乾燥ＴＨＦ５．０＋ｎＩ中の、文献方法に従って製造された３′− （２”−プロペニル）−３′−デオキシ−５’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリ ルチミジン（１８３ｍｇ、０．５ミリモル）及び４−メチルモルホリン−Ｎ−オ キシド（５３ｍｇ、　０．４５ミリモル）の攪拌された混合物に、ブタノール中 四酸化オスミウム（Ｏｓ０４）（４ｍ、２．５％　Ｗ／Ｖ）を加えた。次いで、 反応混合物を１０％ピロ亜硫酸ナトリウム水溶液（２，０ｍ１）で冷却し、２０ 分間攪拌し、シリカのパッド上で濾過し、そして酢酸エチル（２５，０ｍ１）で 希釈した。有機相を水（５，０ｍ１）及びブラインで洗浄し、そしてＮａ＊ＳＯ ｔで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、そして表題化合物をフラッシュクロマトグラ フィーによって精製した。

例２２：３−デ才キシーチミジ−３−イル−アセトアルデヒド−５′−０−ｔ− ブチルジメチルシリルチミジンの製造ＴＨＦ−８，０（比４　：　１．　５．０ ｍ１）中において例２１（２００ｍｇ、０．５ミリモル）の方法によって製造さ れたチミジンジオールの攪拌された溶液に過ヨウ素酸ナトリウム（２１４ｍｇ、 １　ミリモル）を加えた。１時間後、反応混合物を酢酸エチル（２５，０ｍ１） で希釈し、Ｈ２Ｏ（２ｘ　５．０ｍ１）及びブラインで洗浄し、そして乾燥させ た。表題化合物をヘキサン中７０％酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラ フィーによって精製した。

例２３：　５’　−ｏ　−（ｐ−トルエンスルホニル）チミジンの製造乾燥ピリ ジン（２００ｍｌ）中チミジン（２０ｇ、　８２．６ミリモル）の攪拌された溶 液に窒素雰囲気下、０°Ｃにおいてｐ−トルエンスルホニルクロリド（４７，２ ｇ　、２４７．６ミリモル）を加えた。３時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、そ して酢酸エチルで抽出した。溶媒を蒸発させ、そして生成物を酢酸エチルとメタ ノールとの混合物から結晶化させた。表題化合物は白色結晶固体であり、７０〜 ７５％の収率で得られた。

例２４：５’　−ヨード−５°　−デオキシチミジンの製造乾燥アセトン（７５ ｍｌ）中の、例２３の方法に従って製造されたチミジントシレート（１０，６５ ｇ　＋’　２６．９ミリモル）の撹拌された溶液に、ヨウ化ナトリウム（１０ｇ 、　６６．７ミリモル）を加え、そして混合物を１６時間還流させた。溶媒を蒸 発させ、酢酸エチルで希釈した。有機相を水（２Ｘ　２０ｆｆｌｌ）及びブライ ン（１０ｍｌ）で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥させた。表題化合物をメ タノールから白色結晶固体として９０〜９５％の収率で結晶化した。

例２５：　３’　−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５゛　−ヨード−５′乾燥 ＤＭＦ中の、例２４の方法に従って製造されたヨウ化チミジン（８，０ｇ、　２ ４．７ミリモル）の攪拌された溶液にイミダゾール（４，２ｇ。

６１．７ミリモル）を加えた。５分後、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリ ド（４，４７ｇ、２９．６４ミリモル）を加え、そして混合物を４時間攪拌した 。次いで、反応混合物を酢酸エチル（２５０ｏ＋１）で希釈し、水（２ｘ　１０ ０ｎ＋１）及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、次に、硫酸ナトリウムで乾燥さ せた。ヘキサン中６０％酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーによ って表題化合物を精製した（収率９２％）。

乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ）中の、例２５の方法に従って製造された３’　−０− ｔ−ブチルジメチルシリル−５°−ヨード−５′−デオキシチミジン（１０，８ ｇ、　２０ミリモル）の攪拌された溶液に、アジ化ナトリウム（３，９ｇ、　６ ０Ｅリモル）を加え、そして混合物を０℃において１２時間加熱した。次いで、 反応混合物を酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈し、水（２Ｘ　５０ｍ１）及びブ ライン（５０ｍｌ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。ヘキサン中 ５０％酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって表題化合物を 精製した（収率９０％）。

メタノール中の、例２６の方法に従って製造されたアジ化チミジン（５，０ｇ、 　１３．１ミリモル）の攪拌された溶液に窒素雰囲気下において１０％　Ｐｄ− Ｃ２００ｍｇを加えた。次いで、窒素を排気し、水素で置換した。排気及び置換 操作を２回繰り返し、そして１気圧の水素下で１２時間攪拌を続けた。水素を除 去し、そして触媒をセライトのパッド上で濾過し、溶媒を真空下で除去した。Ｃ ＬＣ１ａ中５〜１０％メタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによっ て精製して、表題化合物を８５〜８７％の収率で生成した。

乾燥ピリジン（５０ｍｌ）中の３′−アジド−３゛−デオキシチミジン（２，６ ７ｇ、　１０ミリモル）の攪拌された溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（６ １ｍｇ、０．５ミリモル）、トリエチルアミン（１，９ｍ１．１４ミリモル）及 び４，４′　−ジメトキシトリチルクロリド（４，１ｇ、　１２ミリモル）を順 次加えた。３時間後、水（３０ｍｌ）を加え、そして酢酸エチル（２５０ｍｌ） で抽出した。有機相を分離し、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、そして硫酸ナト リウムで乾燥させた。塩化メチレン中５％メタノールを用いてフラッシュクロマ トグラフィーによって表題化合物を精製した（収率８０〜８５％）。

例２９：３’　−アミノ−３゛−デオキシ−５′−〇−ジメトキシトリチルチミ ジンの製造 メタノール中の、例２８の方法に従って製造されたアジ化チミジン除去し、そし て水素を入れた。この操作を２回繰り返し、そして１気圧の水素圧下において１ ２時間攪拌を続けた。次いで、水素を除去し、触媒をセライトのパッド上で濾過 し、そして溶媒を真空下で除去した。塩化メチレン中５９６メタノールを用いて フラッシュクロマトグラフィーによって粗製生成物を精製して、表題化合物を９ ０〜９３％の収率で生じた。

’ＨＮＭＲ（３００Ｍ）ｌｚ、　ＣＤＣｌ５）δ７，６１（Ｓ、　Ｉ　Ｈ）、　 ７．６０−７．２１（ｍ、　Ｉ　Ｈ）６．８３−６．８７（ｍ、　３　Ｈ）、　 ６．８５（ｔ、　Ｊ＝８．５　Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ）、　３．８０（Ｓ、　６　Ｈ） 、　３．８１−３．７３（ｍ、２　Ｈ）、３．５３−３．４９（ｍ、Ｉ　Ｈ）、 ３．３８−３．３３（ｍ、Ｉ　Ｈ）、２．３６−２．３３（ｍ、ｌ　Ｈ）、２． ２５−２．２０（ｍ、Ｉ　Ｈ）、１．５１（ｓ、３　Ｈ）；　［Ｒｎｅａｔ　ν ｍａｘ３０２０、　２９６２．　１６９７．　１６０５．　＋５１２．　１２４ ６．　１０３０　ｃｍ　−’。

ジメトキシトリチルチミジン（５，０ｇ、９．２ミリモル）及びイミダゾール（ １，２ｇ、　１８．４ミリモル）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５ｍ ｌ中に溶解させ、そしてｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１，７ｇ、 　１１．５ミリモル）に添加した。反応混合物を室温で４時１！Ｉｆ？１拝し、 酢酸エチルで希釈し、そして水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナト リウムで乾燥させた。定量的収率で表題化合物が得られた。

例３１：３’−０−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンの製造例３０の方法に従 って製造された５′−〇−ジメトキシトリチルー３’　−０−ｔ−ブチルジメチ ルシリルチミジン（０，７ｇ、１．１ミリモル）を室温において１時間、塩化メ チレン中トリクロロ酢酸の３％溶液１３ｍ１で処理した。次いで、反応混合物を ５％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム溶液で中和した。有機層を硫酸ナトリウムで 乾燥させた。塩化メチレン中酢酸エチルの０〜３０％の勾配を眉いてフラッシュ クロマトグラフィーによって表題化合物を精製した。反応の収率は８５％であっ た。

例３２：３°−０−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′−力ルベトキシメチレン− ５′−デオキシチミジンの製造−７８℃の乾燥塩化メチレンのよく攪拌された溶 液に、塩化オキリル（３３，０ミリモル、　２．８８［ＤＩ）を加え、次いで、 ＤＭＳＯ（３，１２ｍ１．４４ミリモル）を滴加した。】０分後、ＣＨ２ＨＩ、 　２０ｍ１中の、例３１の方法に従って製造されたチミジンアルコール（５，６ ｇ、　１５．７ミリモル）を２分間にわたって滴加し、そして攪拌を４５分間続 けた。ＥｔｚＮ　（８，１ｍｌ。

５８、１　ミリモル）を加え、そして攪拌をさらに３０分間続けた。次いで、反 応混合物を３０分間にわたって一２３″Ｃにした。次に、カルベトキシメチレン トリフェニルホスホラン（１０，９４ｇ、　３１．４ミリモル）を加え、そして 反応混合物を室温で１２時間攪拌した。次いで、反応混合物を水（２Ｘ　１２５ ｍ１）及びブライン（５０ｍｌ）で希釈し、そして乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ２） 。２０％酢酸エチル−ヘキサン→４０％酢酸エチル−へ午サンを用いてフラッシ ュクロマトグラフィーによって粗製生成物を精製して、表題化合物のトランス及 びシス異性体を３＝１の比で生成した。合した収率は約７２〜７６％であった。

トランス化合物のデータ。　ＩＲ（ｎｅａｔ）　ｖｔｎａｘ　３２０５．３１８ ０．２９８２゜２９６４、１６９８．１４９０．１２７４　ｃｍ−’；　’ＨＮ ＭＲ（３００ＭＨｌ、　ＣＤＣＩＩ）６７、０４＜ｓ。

Ｉ　Ｈ）、　６．８７（ｄｄ、　Ｊ＝１５．６　ａｎｄ　５．４　Ｈｚ、　Ｉ　 Ｈ）、　６．２３（ｔ、　Ｊ＝６．７　Ｈｚ、　ＩＨ）、　６．０３（ｄｄ、　 Ｊ＝１５．６　ａｎｄ　１．６　Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ）、　４．３３−４．２８（ｍ 、　Ｉ　Ｈ）、　４．＋４（ｑ、　Ｊ＝７１　Ｈｚ　２　）１）　４．１６−４ ．１２（ｍ、　Ｉ　Ｈ）　２．２８−２．１９（ｍ、Ｉ　Ｈ）、　２．０９−１ ．９８（ｍ、ｌ　Ｈ）　１．８７（ｓ、　３　Ｈ）、　１．２３（ｔ、　Ｊ＝７ ．Ｉ　Ｈｚ、　３　Ｈ）、　０．８１（Ｓ、　９Ｈ）　０．０１（ｓ、　６　Ｈ ）；　ＣｘｏＨｚｔＯａＮｚＳｉに関する計算値；　Ｃ，５６，５８；　ｌ（。

７．６０：Ｎ、　６．６０；実測値：　Ｃ，５６，３６；　Ｈ，７，３０，Ｎ、 　６．６０゜例３３コ３°−０−１−ブチルジメチルシリル−５′−カルベトキ シメチル−５°−デオキシチミジンの製造酢酸エチル中の、例３２の方法に従っ て製造された不飽和チミジンエステル（４，２４ｇ、　ＩＯミリモル）の攪拌さ れた溶液に、窒素雰囲気下において１０％　Ｐｄ−Ｃ２００ｍｇを加えた。窒素 ガスを真空によって除去し、水素を入れた。この操作を２回繰り返し、攪拌を１ 気圧の水素下で１６時間続けた。次いで、触媒をセライトのパッド上で濾過し、 そして溶媒を真空下で除去した。生成物をヘキサンと酢酸エチルとの混合物から 結晶化した。表題化合物が９５％の収率で得られた。

ＩＲ（ｎｅａｔ）νｍａｘ　３１８０．　２９２５．　２９５０．　１６９６． 　１４８６．　１２６０．　１２４０　ｃｍ−’；’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、 ＣＤＣ１，）δ７．２０（ｓ、ｌ　）ｌ）、６．１１（ｔ、６．６＝Ｈｚ、Ｉ　 Ｈ）４．０７（ｑ、Ｊ＝７．１　Ｈｚ、２　Ｈ）、４．０３−３．９８（ｍ、Ｉ 　Ｈ）、３．７３−７．６９（ｍ、Ｉ　Ｈ）。

２．５１−２．３２（ｍ、２１（）、２．２４−２．１５（（ｔｎ、Ｉ　Ｈ）　 １．１８（ｔ、Ｊ＝７．１　Ｈｚ、３　Ｈ）。

０．８１（ｓ、９　Ｈ）、０．０１（Ｓ、６１（）。

分析：Ｃ３゜ＨｓａＯ＊ＮｔＳｉに関する計算値：　Ｃ，５６，３１；　Ｈ，８ ，０３；　Ｎ、　６．５７実測値：　Ｃ，５５，９１；　Ｈ，７，７４，Ｎ、　 ６．５０゜−７８℃の乾燥ＣＨ，Ｃ１，６０１０１中の、例３３の方法に従って 製造された、チミジンエステル（３，４１ｇ、８ミリモル）の攪拌された溶液に 、３分間にわたってＤｉＢＡＬ（１６，４石ｌ、ヘキサン中１．０Ｍ溶液、１６ ．４ミリモル）を滴加した。２０分後、反応混合物を酢酸エチル３００ｍ１で希 釈し、そして飽和酒石酸カリウムナトリウム溶液５０ｍ１で２回洗浄した。有機 相をブライン（’２５ｍ１）で洗浄し、そして乾燥させたｃＮａｚｓｏ＜）。

５０％〜７０％の酢酸エチル−へキサンを用いてフラッシュクロマトグラフィー によって表題化合物を生成した（収率８５〜８７％）。

３５ａ、エタノール５００１１及び緩衝剤水溶液（ｐＨ＝　５．５．　ＮａＨｔ Ｐ　０４−Ｎａ０Ｈ）　１０ｍ１中の、例２７からのチミジンアミン（１，０７ ｇ、３ミリモル）及び例２２のチミジンアルデヒド（１，３８ｇ、３．６ミリモ ル）の攪拌された溶液に、５℃において１時間にわたってＴＨＦ中Ｎ中ＣＮＢ） Ｉ！の溶液（１２ｍＬ、　ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液、　１２ミリモル）を滴加した 。反応混合物をさらに４時間攪拌し、酢酸エチル２．５０１１１１で希釈した。

反応混合物を水（２Ｘ　４０ｍ１）及びブライン（２５ｍｌ）で洗浄し、そして 乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。化合物ｌ　（第６図）をフラッシュクロマトグラ フィ−（最初に酢酸エチルで溶離し、次いで、５→８％　ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ ２で溶離）によって精製した（収率６２〜６４％）。

’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、　ＣＤＣ１＊）６７．６０（ｓ、　Ｉ　Ｈ）、　７ ．１９（ｓ、　Ｉ　Ｈ）、　６．１８（ｔ。

Ｊ＝６．６　Ｈｚ、　１　）１）、　６．０８（ｔ、　Ｊ＝３．９　Ｈｚ、　Ｉ 　Ｈ）、　４．２９−４．２３（ｒｎ、　Ｉ　Ｈ）。

４．１５−３．９８（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、　３．９１−１．８５（ｍ、　Ｉ　Ｈ） 　３．７０−３．７８（ｍ、　２　Ｈ）、　２．９５−２．８７（ｍ、　Ｉ　Ｈ ）、　２．８４−２．６６（ｍ、　３　Ｈ）、　２．３５−２．０５（ｍ、　５ 　Ｈ）、　１．９４（ｓ。

３　Ｈ）、　１．９３（ｓ、　３　Ｈ）、　１．８０−１．６３（ｍ、　Ｉ　Ｈ ）、　１．５５−１．４５（ｍ、　Ｉ　Ｈ）。

０．９３（ｓ、　９　Ｈ）、　０．６９（ｓ、　９　Ｈ）、　０．１１（ｓ、　 ６　Ｈ）、　０．０７（ｓ、　６　Ｈ）。

３５ｂ、　ＣＨｚＣｌｔ（５，０ｍ１）中の無水トリフルオロ酢酸（０，３２ｍ １．　２．３ミリモル）及びトリエチルアミン（０，６４ｍ１．　４．６ミリモ ル）の攪拌された溶液に、化合物ｌ（第６図）　（１６６ｍｇ、　０．２３ミリ モル）を加えた。２時間後、反応混合物を水性ＮａＨＣＯｓ　（５，０ｍｌ　） で冷却し、そして酢酸エチル（２５ｍｌ）で希釈した。有機相を水（２Ｘ　１０ ｍ１）　、ブライン（５ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた（ＮａｌＳＯ４）　 、　ＣＨ２Ｃｌ２中７％メタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによ って化合物２（第６図）を精製した（収率９Ｉ〜９３％）。

３５Ｃ，ＴＨＦ（４，０［ＤＩ）中の化合物２　（１６４ａ＋ｇ、０．２ミリモ ル）の攪拌された溶液に０℃においてテトラブチルアンモニウムフルオリト（０ ，８ミリモル）を加えた。２時間後、溶媒を蒸発させ、そしてＣＨｔＣ１ｔ中５ ％〜８％メタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって化合物３（ 第６図）を精製した（収率９０％）。

３５ｄ、乾燥ピリジン（３，０ｍ１）中化合物３（１５１ｍｇ、　０．２６ミリ モル）の攪拌された溶液に４，４−ジメチルアミノピリジン（１，６ｍｇ。

０、０１２８　ミＩＪ　モル）及びトリエチルアミン（０，０５７ｍ１．０．４ ２ミリモル）を加えた。５分後、ジメトキシトリチルクロリド（１２１ｍｇ、０ ．３５８ミリモル）を加え、攪拌を続けた。２時間後、反応混合物を酢酸エチル （２５ｍｌ）で希釈し、水（２Ｘ　ｌ０ｍ１）　、ブライン（５ｍｌ）で洗浄し 、そして乾燥させた（ＮａｌＳＯ４）。ＣＨＩＣｌ、中７％メタノールを用いて フラッシュクロマトグラフィーによって粗製生成物を精製して、化合物４（第３ 図）を８５〜８７％の収率で生成した。

３５ｅ、化合物４　（１５０ｍｇ、０．１６８ミリモル）に乾燥ジイソプロピル エチルアミン（０，１５ｍ１．０．ロアミリモル）を加え、次いで、乾燥ＣＨ， Ｃ１，（０，５ｍ１）を加えた。次いで、フラスコを振盪してアルコールを溶解 させ、そして２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイ ト（０，０５６ｍＬ、　０．２５ミリモル）を２０秒間にわたって加えた。４５ 分後、反応混合物をＣＨＪＨ（１，０ｍ１）で冷却し、酢酸エチル（５０ｍｌ） 及びトリエチルアミン（１，０Ｑ１１）で希釈し、１０％に、ＣＯ。

水溶液（２Ｘ　２．０ｍ１）、次いで、ブライン（５，０［１１１）で洗浄し、 そして乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグ ラフィーによって粗製生成物を精製して、化合物５（第６図）を７０〜７５％の 収率で生成した。

３６ａ、エタノール５０ｍ１及び緩衝剤水溶液（ｐＨ＝　５．５．　ＮａＨｚＰ 　０４−Ｎａ０Ｈ）　１０ｍ１中の例２９のアミン（２，７２ｇ、５ミリモル） 及び例３４のアルデヒド（２，２９ｇ、６　ミリモル）の攪拌された溶液に５℃ において１時間にわたって、ＴＨＦ中Ｎ中ＣＮＢＨｓの溶液（１２ｍ１．　ＴＨ Ｆ中１．０Ｍ溶液、１２ミリモル）を滴加した。反応混合物をさらに４時間攪拌 し、次いで、酢酸エチル２５０ｍ１で希釈した。反応混合物を水（２Ｘ　６０ｍ １）及びブラインで洗浄し、そして乾燥させた（ＮａｌＳＯ４）。フラッシュク ロマトグラフィー（最初に酢酸エチルで溶離し、次いで５％メタノール−ＣＨｚ Ｃｌｔで溶離）によって化合物ｌ（第７図）を精製した。

化合物ｌ　（第７図）が７２〜７４％の収率で得られた。

’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、　ＣＤＣ１ｚ）６７．５６（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、　７ ．３６−７．３４（ｍ、　２　Ｈ）。

７．２９−７．１５（ｍ、　８　Ｈ）、　７．０３（ｓ、　１　）１）、　６． ７７（＋ｎ、　３　Ｈ）、　６．２０（ｔ、　Ｊ＝６、ＯＨｚ、　ｌ　Ｈ）、　 ６．０８（ｔ、　Ｊ＝６．７　Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ）、　４．０１−３．９７（ｎ＋ 、　２　Ｈ）、　３．８４−３．７２（［［ｌ、　Ｉ　Ｈ）、　３．７２（Ｓ、 　６　Ｈ）、　３．７１−３．６３（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、　３．４８−３．３２（ ｍ。

２　Ｈ）、　３．３０−３．２２（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、　３．４８−３．３２（ｍ 、　２　Ｈ）、　３．３０−３．２２（ｍ、　Ｉ　Ｈ）。

７．５２（ｍ、　２　Ｈ）、　２．２７−２．１４（ｍ、　３　Ｈ）、　２．０ ８−１．９７（ｍ、　１　）１）、　１．８３（ｓ。

３　Ｈ）、　１．６７−１．４８（ｍ、　３　Ｈ）、　１．４３（ｓ、　３　） １）、　１．２２−１．１５（ｍ、　Ｉ　Ｈ）。

０．８２（ｓ、　９　Ｈ）、　０．０１（ｓ、　６　Ｈ）。

３６ｂ、　ＣＨｚＣｌｔ（５，０ｍ１）中の無水トリフルオロ酢酸（０，３２ｍ １．　２．３ミリモル）及びトリエチルアミン（０，６４ｍ１．　４．６ミリモ ル）の攪拌された溶液に化合物ｌ（第７図）　（２１０ｍｇ、　０．２３ミリモ ル）を加えた。

２時間後、反応をＮａＨＣＯ，水溶液（５，０ｍ１）で冷却し、そして酢酸エチ ル（２５山１）で希釈した。有機相を水（２ｘ　１０ｍ１）　、ブライン（５ｍ ｌ）で洗浄し、そして乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。ＣＨ２Ｃｌ、中７％メタノ ールを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって化合物２（第７図）を精製 した。化合物２が８９〜９１％の収率で得られた。

３６ｃ、　ＴＨＦ　（４，０ｍ１）中化合物２　（１８０ｍｇ、０．２ミリモル ）の攪拌された溶液に、０°Ｃにおいてテトラブチルアンモニウムフルオリド（ ０，４ｍｌ、ＴＨＦＩＩＰｌ、０Ｍ溶液、０．４ミリモル）を加えた。２時間後 、溶媒を蒸発させ、そしてしだいに増大する極性（ＣＨｚＣ１ｚ中５→８％メタ ノール）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製して、化 合物３（第７図）を８９％の収率で生成した。

３６ｄ、乾燥ジイソプロピルエチルアミン（０，１５ｍ１．０．ロアミリモル） を化合物３　（１５０ｍｇ、０．１６８ミリモル）に加え、次いで乾燥ＣＨ２Ｃ ｌ！（０，５０１１）を加えた。次いで、フラスコを振盪してアルコールを溶解 させ、そして２０秒間にわたって２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル クロロホスホアミダイト（０，０５６ｍ１．０．２５ミリモル）を加えた。４５ 分後、反応混合物をＣＨ，ＯＨ（０，ＩＱｌｌ）で冷却し、酢酸エチル（５０［ ［１１）及びトリエチルアミン（１，０＋ｎｌ）で希釈し、ｌＯ％ＫｔＣ（ｈ水 溶液（２Ｘ　５．０ｍ１）及びブライン（５，０［Ｄｌ）で洗浄し、そして乾燥 させた（ＮａｚＳＯ＜）。酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに よって生成物を精製して化合物４を７０〜７５％の収率で生成した。

前記工程ａ−ｄで生成されたチミジンー二量体ホスホアミダイト化合物を、修正 された固相ホスホアミダイト合成法において使用して、表２のオリゴヌクレオシ ド配列を作った。

５’　ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ［ＴｎＴ）ｐＴ　３’　４５’　Ｔｐ ＴｐＴｐＴｐＴｐ［ＴｎＴ］ｐＴｐＴｐＴｐＴ　ｓ／　５５’　［ＴｎＴ］ｐＴ ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ　３’　６オリゴデオキシヌクレオシド配列 は３゛末端から５′末端に合成した。

最初の工程は、３゛−スクシネート結合による、５°　−ジメトキシトリチルデ オキシチミジンのＣＰＧ支持体への結合であった。結合されたチミジンの５′− 〇−ジメトキシトリチル基はトリクロロ酢酸と反応して、５′　−ヒドロキシル 基を脱保護した。

次いで、連鎖延長が、脱保護、活性化、キャッピング及び酸化の標準逐次工程に よって進行した（例３０〜３７の方法に従って製造された−Ｎ−Ｃ−Ｃ−結合チ ミジンニ量体を、必要とされる場合に活性化工程の間に鎖中に加えるという修正 がなされた）。

鎖の組立の最後において、チミジンオリゴマーを濃水酸化ナトリウムによってＣ ＰＧ支持体から除去した。次いで、溶液を５５°Ｃにおいて８〜１５時間さらに 処理して、塩基の環外アミン上の保護基を全て除去した。

３８ａ、ジメトキシトリチルテトラエチレングリコール（ＤＭＴＴＥＧ）の製造 過剰のテトラエチレングリコールＴＥＧ（約１００ｍ１）を、丸底フラスコ中に おいてヒュニツヒ（Ｈｕｎｉｇ）の塩基約７　ｍｌ（５，１ｇ　；　４０ミリモ ル）と混合した。ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣＩ）約３．０８ｇ　（ １０ミリモル）をＴＥＧ混合物に加え、そしてＤＭＴＣＩ　−ＴＥＧ混合物を約 ８〜１２時間、絶えず攪拌しながら室温（約２５°Ｃ）に保持してＤＭＴＴＥＧ を形成した。

３８ｂ、ジメトキシトリチルテトラエチレン−グリコールシアノホスフィン（Ｄ ＭＴＴＥＧＣＰ）の製造。

工程（ａ）からのＤＭＴＴＥＧ　６　ｇを乾燥ジクロロメタン２０ｍ１と混合し た。この混合物にヒュニッヒの塩基約６．２ｍｌを加え、次いで、クロロホスフ ィン混合物を液加してＤＭＴＴＥＧＣＰを形成した。２−シアノエチルＮ、Ｎ− ジイソプロピルクロロホスホアミダイト１．６７ｇを乾燥ジクロロメタン５ｍｌ 中に溶解させることによって、クロロホスフィン混合物を製造した。

３８　ｃ　、ＴＥＧを末端基とする抗ＲＡＳ腫瘍遺伝子ＤＮＡの製造。

修正された固相ホスホアミダイト法に従って表３のオリゴデオキシヌクレオチド を製造した。ＧＡＩＴ、上記。オリゴデオキシヌクレオチドを３゛末端から５′ 末端に合成した。

５’　Ｘ　ＧＧＡ　ＧＯＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＡ　Ｘ　（Ａ）　３’　７５’ 　ＸＸ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＡ　ＸＸ　（Ａ）　３’　８５’ 　Ｘ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　Ｘ　（Ａ）　３’　９５’　 ＸＸ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＸＸ　（Ａ）　３’　１０５ ’　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　３’　１１ＸはＴＥＧである。

Ａ、Ｃ，ＣＡＴは各々、デオキシヌクレオチドアデニル酸、シチジル酸、グアニ ジル酸及びチミジル酸を表す。

ヌクレオシドアデノシン（７，８，９，１０）またはチミジン（１１）をスクシ ネート結合を用いてＣＰＧ固体支持体に結合させた。ＧＡＩＴ、上記。１１の合 成は標準固相ホスホアミダイト法に従って進行した。

配列７．８．９及び１０において、合成は、修正されたホスホアミダイト法に従 って進行した。結合されたアデノシンヌクレオシドの５′ヒドロキシル基をトリ クロロ酢酸と反応させて５′　ヒドロキシル基を脱保護した。この脱保護工程の 後、結合されたアデノシンヌクレオシドを活性化剤、テトラゾールならびに前記 工程ａ及びｂの方法によって製造されたＤＭＴＴＥＧＣＰを含んでなるホスホア ミダイト試薬と反応させた。活性化工程に続いて、未反応の５′　ヒドロキシル 基を無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールでキャッピングした。次いで、溝結合 を標準法に従ってヨウ素で酸化した。

２個のＴＥＧ残基を含む配列８及び１０において、脱保護、活性化、キャッピン グ及び酸化工程を前記のようにして繰り返した。連鎖延長が、前記のような脱保 護、活性化、キャッピング及び酸化の逐次工程（活性化工程の間にＤＭＴＴＥＧ ＣＰの代わりに所望のヌクレオシドホスホアミダイトを用いる修正がされた）に よって進行した。最後の所望のヌクレオシドの結合の後、３′末端におけるＴＥ Ｇの結合と同様にして１個または２個のＴＥＧ残基を５″末端において結合させ た。

鎖の組立の最後に、濃水酸化ナトリウムによってＣＰＧ支持体からＤＮＡストラ ンドを除去した。次いで、溶液をさらに、５５°Ｃにおいて８〜１５時間処理し て、塩基の環外アミン上の保護基を全て除去した。

とする抗−ＲＡＳ腫瘍遺伝子ＤＮＡを例３８の方法に従って製造した。

ＨＥＧをＤＭＴＣｌと反応させてＤＭＴＩ（ＥＧを形成した。次いで、ＤＭＴ） ＩＥＧをシアノホスフィン化合物と反応させて、ＤＭＴｆ（ＥＧＣＰを形成し、 それを例３８（ｃ）の修正固相ホスホアミダイト合成法において使用して、ＨＥ Ｇを末端基とする抗−ＲＡＳ腫瘍遺伝子ＤＮＡを形成した。これらのオリゴヌク レオチドの配列を以下の表４に記載する。

５’　Ｘ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＡ　Ｘ　（Ａ）　３’５’　Ｘ Ｘ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＡ　ＸＸ　（Ａ）　３’５’　Ｘ　Ｃ ＣＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　Ｘ　（Ａ）　３’５’　ＸＸ　ＣＣＴ 　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＸＸ　（Ａ）　３’５’　ＣＣＴ　ＣＧＡ 　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　３’ＸはＨＥＧである。

Ａ、Ｃ，ＣＡＴは各々、デオキシヌクレオチドアデニル酸、シチジル酸、グアニ ジル酸及びチミジル酸を表す。

例４０：ＴＥＧを末端基とする抗−ＲＡＳ腫瘍遺伝子ＤＮＡのヌクレアーゼ表４ のオリゴヌクレオチドを水に溶解させた。次いで、サンプルの吸光度を２６０ｎ ｍにおいて測定しく！ｉｆ囲室温においてパーキンエルマーラムダ　４Ｃ分光光 度計上で）且つ計算された吸光係数を用いてＤＮＡ８度をめた（Ｃａｎｔｏｒ及 びＷａｒｓａｗの方法、　ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１巻　ＣＲＣＰ ｒｅｓｓ、　５８９頁（１９７５年）〕。

ＲＰＭ１１６４０　；　Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’　−（ ２−エタンスルホン酸）、Ｊ）Ｈ７，４；及び１０％牛脂児血清（ＦＣＳ）（Ｇ ４ＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）を 含む細胞培養培地中において総ストランド濃度６または７μＭで３７°Ｃにおい て２時間、オリゴヌクレオチドをインキュベートした。ＦＣＳは使用前に５６° Ｃにおいて０．５時間、熱不活性化した。次いで、サンプルを氷上に置き、そし て２４：１クロロホルム：イソアミルアルコールによる５回の抽出を用いて除タ ンパクした。サンプルは一２０°Ｃにおいて凍結して貯蔵するか、または直ちに 冷蔵（４°Ｃ）　ＷＩＳＰ　（Ｗａｔｅｒｓ）　ＨＰＬＣオートインジェクター に装填した。

オリゴヌクレオシド加水分解を、出発化合物の消失の量を測定することによって 定量した。固定波長検出器（２６０ｎｍ）及び記録積分器を装着したＬＫＢウル トラクロム（Ｕｌｔｒａｃｈｒｏｍｅ）　ＧＴｉニボンプクロマトグラフィー系 上で、バッファーＡ　（Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　１５ｍＭ燐酸ナトリウム、　 ｐＨ８，５）中で平衡させられたＧｅｎＰａｋ　ＦＡＸ　（Ｗａｔｅｒｓ）陰イ オン交換カラムを用いて、オリゴヌクレオチド（反応混合物から）を分離した。

ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）カラムオーブンを使用してカラム温度を６０°Ｃ に保持した。５０μｍのサンプル注入容量を使用した。０％〜１００％のバッフ ァーＢ　（０，５Ｍ　ＮａＣ１を含むバッファーＡ）の直線勾配を用いて６０分 間にわたってオリゴヌクレオチドを溶離した。緩衝液の流速は１　ｍＬ／分であ った。

牛胎児血清−会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）エキソヌクレアーゼの存在下におけ るインキュベージコン（２時間）の後、化合物７または１０の分解は観察されな かった（表５．主ピークの％分解を参照）。同様なインキュベーション期間の間 に、９及び８の各々、８７．０％及び８２．１％が残った。これに比べて、オリ ゴマー１１は、同様なインキュベーション期間後に２４．７％しか残らなかった 。

７　０、２３２５　０．３６６３　０．０９　０、３７４４　０．３２５８　１ １０８　０、２＋６４　０．１７７７　１７．９＋０　０．３６４２　０．３６ ９７　０．　ＯｆＩ　１．２８６１　０．３１７７　７５．３４個のＴＥＧ−才 リゴマ−は全て、ＦＣＳ−会合エキソヌクレアーゼによる加水分解に対して抵抗 性であった。ビスージＴＥＧ−オリゴマ−（７及び１０）は加水分解に対して完 全に抵抗性であるようであった。ＴＥＧ−由来（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）オリ ゴデオキシヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ加水分解に対する抵抗性に間し て未修飾化合物に比べて著しい改良を示した。

ｃ　−ｍｙｃ　１！！瘍遺伝子の開始暗号領域に関する未修飾アンチセンスオリ ゴヌクレオチドが、ＰＨＡ刺激末梢血リンパ球（ＰＢＬ）においてＣ−［１ｌＶ Ｃタンパクの発現を抑制し、細胞の、細胞周期の３期への進行を妨害できること は、他の人たち（Ｈｅｉｋｋｉｌａ、　Ｒ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ。

３２８：　４４５〜４４９頁、　１９８７年）によって証明されている。ｃ−Ｂ ｃに関するアンチセンスＤＮＡもまた、イン・ビトロにおいてＨＬ−６０ヒト赤 白血病細胞の増殖を抑制することが示されていた（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ、　Ｅ。

Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５巻、１ ０２８〜１０３２頁　１９８８年）。

表６に示された配列を例４１ａ及び４１ｂの方法によって製造及び評価した。

表６ ５’　ＡＡＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　３’５’　ＸＸ　ＡＡＣＧＴＴ 　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＸＸ　Ａ　３’（Ｘ＝ＴＥＧ） ４１ａ、ＰＨＡ刺激ＰＢＬの細胞周期の３期への進行に対する修飾（ＴＥＧを含 む）及び非修飾Ｃ−ＭＹＣアンチセンスＤＮＡの効果の比較ヒトＰＢＬを、表６ のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の存在下または不存在下においてＰＨＡ で４８時間刺激した。未処理対照と比較した、細胞周期の３期にある、各処理群 の細胞の集団の百分率を標準流動血球計算法（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ 　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いて測定した。結果を表７に示す。

データは、３°及び５°両末端におけるＴＥＧの存在はアンチセンスＤＮＡの抑 制効果を変化させないことを示す。

４１ｂ、　ＭＯＬＴ−４ヒトＴ細胞性白血病細胞におけるＣ−ＭＭＣタンパク発 現に対する修飾（ＴＥＧを含む）及び非修飾Ｃ−ＭＹＣアンチセンスＤＮＡの比 較 指数関数的に増殖する非同調性Ｍｏ１ｔ−４細胞を、ｃ−ｍｙｃに関するアンチ センスＤＮＡ　６０ａＭの存在下または不存在下において８時間インキュベート した。次いで、細胞を、Ｓ　３５−メチオニンの存在下において４５分間インキ ュベートし、ｃ−ｍｙｃ抗体による同位元素標識免疫沈降（ｒａｄｉｏｉｍｍｕ ｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いてｃ−ｃｍｃタンパクの含有量を定量 した。結果を表８に示す。

５’　ＡＡＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　３’　６０　６１．０±２．６ ５’　ＸＸ　ＡＡＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＸＸ　Ａ　３’　６０　 ６７、９＋０．７ＴＥＧ含有アンチセンスＤＮＡは未修飾アンチセンスＤＮＡよ りもわずかに強力であった。

４１ｃ、インビトロにおける、ヒトＣＣＲＦ−ＣＥＭ　Ｔ細胞性白血病細胞の増 殖を抑制する修飾（ＴＥＧを含む）及び未修飾Ｃ−ＭＹＣアンチセンスＤＮＡの 効果の比較 指数関数的に増殖する非同調ＣＣＲＦ　−ＣＥＭ細胞を、アンチセンスＤＮＡの 存在下または不存在下において４８時間インキュベートし、次いで、細胞数を各 治療群において測定した。次に、細胞増殖を５０％抑制するのに必要なアンチセ ンスＤＮＡの濃度を測定した（ＩＣｓ。）。

表５の修飾された及び修飾されていないアンチセンスＤＮＡは共に、４０ａＭの 概ね同等の（ＩＣ，。）濃度を示した。

これらのデータは、アンチセンスＤＮＡの３′及び５′末端におけるＴＥＧの存 在が、標的核酸とハイブリッド形成し且つその機能を抑制するこのようなアンチ センスＤＮＡの能力に影響を及ぼさないことを証明する。

例４２：他のエキソヌクレアーゼ安定性オリゴヌクレオチド表９に示したエキソ ヌクレアーゼ安定性ジゴヌクレオチドは、例３８の方法に従って製造した。

５’　ＸＸ　Ａ−ＡＣＧ−ＴＴＧ−ＡＧＧ−ＧＧＣ−ＡＴＸ−ＸＡ　３’ＸＸ　 ＧＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＣ−ＧＧＴ−ＣＣＣ−ＣＧＣ−ＣＣＸ−ＸＡＸＸ　ＧＧＧ 　ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧＸ　ＸＡＸＸ　ＧＧ Ｇ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＧＧＡ−ＧＧＧ−ＧＡＧ−ＧＧＡ−ＸＸＡＸＸ　ＧＧＧ− ＧＡＧ−ＧＴＧ−ＧＧＴ−ＧＧＧ−ＧＡＧ−ＧＧＴ−ＸＸＡＡＡＧ　ＧＴＴ　Ｇ ＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＸＸＡＸ　ＡＡ−ＣＧＴ−ＴＧＡ−ＧＧＧ−ＧＣＡ−Ｔ ＴＸ−ＡＸＸ　ＴＴＣ−ＧＣＴ−ＴＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＴ＝ＸＸＡＸＸ　ＧＣＧ −ＧＧＡ−ＧＧＣ−ＴＧＣ−ＴＧＧ−ＸＸＡＸＸ　ＧＧＡ−ＧＧＣ−ＴＧＣ−Ｔ ＧＧ−ＡＧＣ−ＸＸＡＸＸ　ＣＡＡ−ＧＴＴ−ＣＡＴ−ＡＧＧ−ＴＧＡ−ＴＴＧ −ＣＴＣ−ＸＸＡＡＬ−ＣＡＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＡＧＣ−ＡＡＧ−ＸＸＡＡＬ −ＧＡＡ−ＣＧＡ−ＴＴＴ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−ＸＸＡＸＸ　ＣＴＣ−ＡＣＴ−Ｇ ＣＣ−ＧＣＧ−ＣＡＴ−ＸＸＡＸＸ　ＧＧＧ−ＴＣＴ−ＴＣＧ−ＧＧＣ−ＣＡＴ −ＸＸＡＸＸ　ＧＴＣ−ＧＡＣ−ＣＧＧ−ＴＴＣ−ＣＡＴ−ＸＸＡＸＸ　ＴＧＴ −ＡＡＣ−ＴＧＣ−ＴＡＴ−ＡＡＡ−ＸＸＡＸＸ　ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−Ｃ ＴＴ−ＴＡＡ−ＸＸＡＸＸ　ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＴＴ−ＡＴＡ−ＴＴＣ−ＸＸＡ ＸＸ　ＴＡＣ−ＴＧＡ−ＣＴＴ−ＡＴＡ−ＴＴＴ−ＸＸＡＸＸ　ＴＴＴ−ＡＴＡ −ＴＴＣ−ＡＧＴ−ＣＡＴ−ＸＸＡＸＸ　ＴＧＧ−ＧＧＡ−ＧＧＧ−ＴＧＧ−Ｇ ＧＡ−ＧＧＧ−ＴＧＧ−ＧＧＡ−ＡＧＧ−ＸＸＡＸＸ　ＣＴＴ−ＡＴＡ−ＴＴＣ −ＣＧＴ−ＣＡＴ−ＸＸＡＸＸ　ＴＡＡ−ＣＧＣ−ＣＴＡ−ＴＴＣ−ＴＧＣ−Ｘ ＸＡＸＸ　ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＣＧＣ−ＡＡＴ−ＸＸＡＸＸ　ＴＴＧ−Ｃ ＴＣ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＧＴＣ−ＸＸＡＸＸ　ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＣＣＴ−ＣＴＣ −ＧＴＴ−ＸＸＡＸＸ　ＡＴＣ−ＴＡＣ−ＴＧＧ−ＣＴＣ−ＣＡＴ−ＸＸＡＸＸ 　ＴＡＣ−ＣＴＣ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＣＴＡ−ＸＸＡＸＸ　ＡＣＡ−ＣＣＣ−Ａ ＡＴ−ＴＣＴ−ＧＡＡ−ＡＴＧ−ＧＸＸ−ＡＸＸ　ＧＧＴ−ＡＡＡ−ＧＴＣ−Ｔ ＴＡ−ＡＣＣ−ＣＡＣ−ＡＸＸ−ＡＸＸ　ＴＡＣ−ＧＧＧ−ＧＡＧ−ＴＴＧ−Ｃ ＡＡ−ＸＸＡＸはＴＥＧである。

当業者には明白であるように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多 くの変更及び修正が可能であることはいうまでもない。

】！ ｂ ＦＩＧＬＪＲＥＩ ＦＩＧＵＲ）：２ ＦＩＧＬＪＲＥ３ ＦＩＧＵＲＪＥ　６ ＦＩＧＵＲＥ　７ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年２月３日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．式： −Ｄ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各Ｄは独立して、ＣＨＲ、酸素またはＮＲ６（式中、Ｒは独立して、水 素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素またはＣ１−Ｃ２アルキルであ る）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ８である〕の３原子ヌクレオシド 間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化 合物。
2. ２．一方または両方の末端にジオールを有する、請求の範囲第１項に係る化合物 。
3. ３．前記ジオールがテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール である請求の範囲第１項に係る化合物。
4. ４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各Ｄは独立してＣＨＲ、酸素またはＮＲ６ （式中、Ｒは独立して水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素または Ｃ１−Ｃ２アルキルである）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６であり ； 各Ｗ′は独立してＷまたは ▲数式、化学式、表等があります▼であり；各Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｎ Ｒ２Ｒ２（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである ）またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２アシルである）であり； 各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり； ｊは１〜約２００の整数であり； ｋは０または１〜約１９７の整数であり；そしてｑは０または１〜約１９７の整 数であるが、ｊ＋ｋ＋ｑの合計は約４〜２００である〕 のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化合物。
5. ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、各Ｚは独立して、Ｒ′または ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、 Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各Ｄは独立してＣＨＲ、酸素またはＮＲ６（式中、 Ｒは独立して水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素またはＣ１−Ｃ ２アルキルである）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６であり； 各Ｗ′は独立してＷまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、 各Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して 、水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである）、またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１ −Ｃ１２アルキルである）であり；各Ｒ５は独立して、水素またはＣ１−Ｃ１２ アルキルであり；各ｙは独立してＨまたはＣＨであり： 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり； 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０の整数であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は 少なくとも１であり； ｊは１〜約２００の整数であり； ｋは０または１〜約１９７の整数であり；そして各ｍ及びｎは独立して、１〜２ ００の整数であり；各ｐは独立して、２〜４であり；そしてｑは０または１〜約 １９７の整数であるが、ｊ＋ｋ＋ｑの合計は約４〜約２００である〕 を有する約６〜２０Ｇ個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化合物。
6. ６．一方または両方の末端にジオールを有する約９〜約２００個の塩基のオリゴ ヌクレオチド配列を含んでなるヌクレアーゼ抵抗性化合物。
7. ７．前記ジオールがヘキサエチレングリコールまたはテトラエチレングリコール である請求の範囲第６項に係る化合物。
8. ８．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲはＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、水素ま たはＣ１−Ｃ６アルキルである）、またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２ アシルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜約２ ００個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌクレオチド配列であり； 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なく とも１であり； 各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり；そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる化合物。
9. ９．式； ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲはＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ２（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、水素ま たはＣ１−Ｃ６アルキルである）、またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２ アシルである）であり； ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜５０個の塩基のオリゴヌクレオチド配列であり；各ｅ 及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なくとも １であり； ｍ及びｎは独立して、１〜２００であるが、ｍ及びｎの少なくとも一方は１〜２ ００である〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる化合物。
10. １０．式： −Ｄ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各Ｄは独立して、ＣＨＲ、酸素またはＮＲ６（式中、Ｒは独立して、水 素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素またはＣ１−Ｃ２アルキルであ る）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６である〕の３原子ヌクレオシド 間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を製造すること を含んでなる化合物のヌクレアーゼ分解を抑制する方法。
11. １１．前記オリゴヌクレオシド配列が式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各Ｄは独立してＣＨＲ、酸素またはＮＲ６ （式中、Ｒは独立して水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素または Ｃ１−Ｃ２アルキルである）であるが、１個はＤだけが酸素またはＮＲ６であり ； 各Ｗ′は独立してＷまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ であり； 各Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して水 素またはＣ１−Ｃ６アルキルである）またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１ ２アシルである）であり； 各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり； ｊは１〜約２００の整数であり； ｋは０または１〜約１９７の整数であり；そしてｑは０または１〜約１９７の整 数であるが、ｊ＋ｋ＋ｑの合計は約４〜２００である〕 を有する請求の範囲第１０項に係る方法。
12. １２．前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシド配列の一方または両方の末端 にジオールを結合させることを含んでなるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシ ド配列の安定化方法。
13. １３．トリチルジオールシアノホスフィンを、前記化合物の５′末端の保護に使 用する請求の範囲第１２項に係る方法。
14. １４．生理的に許容され得る担体及び式：−Ｄ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各Ｄは独立して、ＣＨＲ、酸素またはＮＲ６（式中、Ｒは独立して、水 素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素またはＣ１−Ｃ２アルキルであ る）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６である〕の非ホスフェート含有 ３原子ヌクレオシド間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド 配列を含んでなる化合物を含んでなる遺伝子発現の抑制用組成物。
15. １５．前記オリゴヌクレオシド配列が式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各Ｄは独立してＣＨＲ、酸素またはＮＲ６ （式中、Ｒは独立して水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素または Ｃ１−Ｃ２アルキルである）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６であり ； 各Ｗ′は独立してＷまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ であり； 各Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びびＲ３は独立して 水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである）またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ １２アシルである）であり；各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり； ｊは１〜約２００の整数であり； ｋは０または１〜約１９７の整数であり；そしてｑは０または１〜約１９７の整 数であるが、ｊ＋ｋ＋ｑの合計は約４〜２００である〕 を有する請求の範囲第１４項に係る組成物。
16. １６．一方または両方の末端に約９〜２００個の塩基のオリゴヌクレオチド配列 を含んでなるヌクレアーゼ抵抗性化合物及び生理的に許容され得る担体を含んで なる遺伝子発現の抑制用組成物。
17. １７．前記ジオールがヘキサエチレングリコールまたはテトラエチレングリコー ルである請求の範囲第１６項に係る組成物。
18. １８．前記化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲはＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ２（式中Ｒ２及びＲ３は独立して、水素また はＣ１−Ｃ６アルキルである）、またはｎＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２ア シルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜２０ ０個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌクレオチド配列であり； 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なく とも１であり； 各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり；そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる請求の範囲第１６項に係る組成物。
19. １９．遺伝子発現抑制の治療と必要とする哺乳類における遺伝子発現の抑制方法 であって、式： −Ｄ−Ｄ−Ｄ− 〔式中、各Ｄは独立して、ＣＨＲ、酸素またはＮＲ６（式中、Ｒは独立して、水 素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素またはＣ１−Ｃ２アルキルであ る）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６である〕の３原子ヌクレオシド 間結合を有する約６〜２００個の塩基のオリゴヌクレオシド配列を含んでなる化 合物の有効量を該哺乳類に投与することを含んでなる方法。
20. ２０．前記オリゴヌクレオチド配列が式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｗは、−Ｄ−Ｄ−Ｄ−であり、各Ｄは独立してＣＨＲ、酸素またはＮＲ ６（式中、Ｒは独立して水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素また はＣ１−Ｃ２アルキルである）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮＲ６であ り； 各Ｗ′は独立してＷまたは ▲数式、化学式、表等があります▼ であり； −各Ｒ１は独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して 水素またはＣ１−Ｃ６アルキルである）またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ １２アシルである）であり； 各ｙは独立してＨまたはＯＨであり； 各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはそれ らの変形であり； ｊは１〜約２００の整数であり； ｋは０または１〜約１９７の整数であり；そしてｑは１〜約１９７の整数である が、ｊ＋ｋ＋ｑの合計は約４〜２００である〕 を有する請求の範囲第１９項に係る方法。
21. ２１．前記化合物が一方または両方の端末にジオールを有する請求の範囲第２０ 項に係る方法。
22. ２２．前記化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲはＯＨ、ＳＨ、ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、水素ま たはＣ１−Ｃ６アルキルである）、またはＮＨＲ４（式中、Ｒ４はＣ１−Ｃ１２ アシルである）であり； Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；ｏｌｉｇｏ（Ｎ）は約９〜約２ ００個の塩基の天然のまたは修飾されたオリゴヌクレオチド配列であり； 各ｅ及びｆは独立して、０〜５０であるが、ｅ及びｆの少なくとも一方は少なく とも１であり； 各ｍ及びｎは独立して、１〜２００であり；そして各ｐは独立して、２〜４であ る〕 のオリゴヌクレオチドを含んでなる請求の範囲第１９項に係る方法。
23. ２３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛式中、Ｗは−Ｄ−Ｄ−Ｄ−〔式中、各Ｄは独立して、ＣＨＲ、酸素またはＮＲ ６（式中、Ｒは独立して、水素、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２であり、Ｒ６は水素ま たはＣ１−Ｃ２アルキルである）であるが、Ｄは１個だけが酸素またはＮ６であ る〕であり；各Ｂは独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシ ルまたはそれらの変形であり； Ｒ７はＯＨ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシまたはホスホアミダイトであり、 そして Ｒ１はＯＨ、保護基またはｔ−ブチルジメチルシリルオキシである｝のヌクレオ シド二量体を含んでなる化合物。
24. ２４．式： 【配列があります】 〔式中、Ｘはテトラエチレングリコールであり；且つｎは１または２である〕 の化合物。