BRPI0920840A2 - inibidor de quinase mapk p38 - Google Patents

Abstract

INIBIDOR DE QUINASE MAPK P38. A presente invenção refere-se a um composto da fórmula (I) (I) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros, composições que compreendem o mesmo, uso do dito composto e composições para o tratamento, particularmente para o tratamento de asma e COPD, e processos para a preparação do dito composto.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIDOR DE - QUINASE MAPK P38". Campo da Invenção A presente invenção refere-se a compostos que são inibidores de enzimas de proteína quinase ativadas por mitógenos p38 (aqui referidos como inibidores de quinase MAPK p38), particularmente os seus subtipos alfa e gama quinase, e seu uso em terapia, especialmente no tratamento de doenças inflamatórias, incluindo doenças inflamatórias do pulmão.

Antecedentes da Invenção Quatro isoformas de MAPK p38 (alfa, beta, gama e delta, res- . pectivamente) foram identificadas, cada uma apresentando um padrão de expressão de tecido.

As isoformas alfa e beta de MAPK p38 são expressa- ' das de forma ubíqua no corpo inteiro e são encontradas em muitos tipos di- ferentes de células.

As isoformas alfa e beta de MAPK p38 são inibidas por certas moléculas pequenas inibidoras de MAPK p38 conhecidas.

As primei- ras gerações de compostos eram altamente tóxicas devido ao padrão de expressão ubíquo destas isoformas e aos efeitos fora do alvo dos compos- tos.

Os inibidores mais recentes foram aperfeiçoados para serem altamente seletivos pelas isoformas alfa e beta de MAPK p38 e têm uma margem de segurança mais ampla.

Pouco se sabe sobre as isoformas gama e delta de MAPK p38. Estas isoformas são expressadas em tecidos/células específicos (diferente- mente das isoformas p38 alfa e p38 beta). A isoforma delta de MAPK p38 é expressada mais no pâncreas, testículos, pulmão, intestino delgado e rim.

Elaé abundante também em macrófagos (Smith, S.J. (2006) Br.

J.

Pharma- col. 149:393-404) e detectável em neutrófilos, células T CD4+ e células en- doteliais (www.genecard.org, Karin, K. (1999) J.

Immunol.). Muito pouco se sabe sobre a expressão de MAPK p38 gama, mas ela é expressada mais no cérebro, músculo esquelético e coração, bem como em linfócitos e macrófa- gos (www.genecard.org). Moléculas pequenas inibidoras seletivas de MAPK p38 gama e delta são agora atualmente disponíveis, mas um inibidor existente tem ações inibitórias pan-isoformas.

BIRB 796 inibe todas isoformas, mas inibe p38 . gama e p38 delta em concentrações mais altas do que aqueles que inibem p38 alfa e p38 beta (Kuma, Y. (2005) J.

Biol.

Chem. 280:19472-19479). BIRB 796 também diminui a fosforilação de MAPKs p38 ou JNKs pela quina- seMKK6ouMKK4 a montante.

Os autores discutiram a possibilidade de que a mudança conformacional causada pela ligação do inibidor à MAPK pode afetar a estrutura do seu sítio de fosforilação e também o sitio de atracação para o ativador a montante, e portanto diminuíndo a fosforilação de MAPKs p38 ou JNKs.

Acredita-se que a quinase MAP p38 desempenha um papel fun- - damental em muitas vias de sinalização que estão envolvidas na iniciação e manutenção de inflamação crônica persistente em doença humana, por e- ' xemplo, asma severa e COPD.

Existe agora uma literatura abundante que demonstra que a quinase MAP p38 é ativada por uma série de citocinas pró- inflamatórias e que sua ativação resulta na elaboração e liberação de outras citocinas pró-inflamatórias.

Realmente, dados de alguns estudos clínicos demonstram mudanças benéficas na atividade de doenças em pacientes durante o tratamento com inibidores de quinase MAP p38. Por exemplo, Smith, S.

J. (2006) Br.

J.

Pharmacol. 149:393-404 descreve o efeito inibitório deinibidores de quinase MAP p38 MAP sobre a liberação de citocinas a par- tir de macrófagos humanos.

O uso de inibidores de quinase MAP p38 no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é proposto.

Mo- léculas pequenas inibidoras assestadas para MAPK p38 o/B demonstraram ser eficazes em reduzir vários parâmetros de inflamação em células e teci- dos, obtidos de pacientes com COPD que são geralmente insensíveis a cor- ticosteroides (Smith, S.

J. (2006) Br.

J.

Pharmacol. 149:393-404) e modelos animais in vivo (Undenvood, D.

C. et al. (2000) 279:895-902; Nath, P. et al. (2006) Eur.

J.

Pharmacol. 544:160-167). Irusen e outos também sugeriram a possibilidade de envolvimento de MAPK p38 o/B sobre a insensibilidade a corticosteroides por intermédio da redução da afinidade de ligação de recep- tor de glicocorticoides (GR) nos núcleos (Irusen, E. et al., (2002) J.

Alleray Clin.

Immunol., 109:649-657). Experiências clínicas com uma série de inibi-

dores de quinase MAP p38, incluindo AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 - e SCIO323 estão descritas em Lee et al. (2005) Current Med.

Chem. 12,:2979-2994. COPD é uma condição na qual a inflamação subjacente foi rela- tada como sendo substancialmente resistente aos efeitos anti-inflamatórios de corticosteroides inalados.

Consequentemente, uma estratégia eficaz para tratar COPD pode certamente ser o desenvolvimento de uma intervenção que tem efeitos anti-inflamatórios inerentes e também é capaz de aumentar a sensibilidade de tecidos pulmonares de pacientes com COPD a corticoste- roides inalados.

A recente publicação de Mercado et a/. (2007; American - Thoracic Society Abstract A56) demonstra que o silenciamento de gama p38 tem o potencial para restaurar a sensibilidade a corticosteroides. ' Entretanto, o principal obstáculo que impede a definição e explo- ração das utilidades potenciais de inibidores de quinase MAP p38 no trata- mento de doenças inflamatórias crônicas humanas tem sido a toxicidade observada em pacientes.

Isto foi suficientemente grave para resultar no cancelamento do desenvolvimento clínico de muitos dos compostos desen- volvidos.

Os compostos desenvolvidos até agora eram tipicamente inten- cionados para administração oral.

Esta estratégia envolve otimizar compos- tos que atingiram sua duração de ação por um perfil farmacocinético apro- priado.

Isto assegura que haja uma concentração suficiente do fármaco es- tabelecida e mantida depois e entre doses para produzir um benefício clíni- co.

A consequência inevitável desta abordagem é que todos os tecidos do corpo, especialmente do fígado e intestino, possivelmente ficam expostos a concentrações terapeuticamente ativas do fármaco, estejam eles ou não afe- tados adversamente pela doença que está sendo tratada.

Uma estratégia alternativa é desenhar abordagens de tratamen- to nas quais o fármaco é dosado diretamente para o órgão inflamado (tera- piatópica) Embora esta abordagem não seja apropriada para tratar todas as doenças inflamatórias crônicas, ela tem sido explorada extensivamente em doenças pulmonares (asma, COPD), doenças da pele (dermatite atópica e psoríase), doenças nasais (rinite alérgica) e doenças gastrointestinais (colite - ulcerativa). Na terapia tópica, a eficácia (i) assegurando que o fármaco te- nha uma duração de ação prolongada e fique retido no órgão relevante para minimizar os riscos de toxicidade sistêmica, ou (ii) produzindo uma formula- ção que gera um "reservatório" do fármaco ativo que fica disponível para prolongar os efeitos desejados do fármaco. A abordagem (i) é exemplificada pelo fármaco anticolinérgico tiotrópio (Spiriva), que é administrado por via tópica ao pulmão como um tratamento para COPD, e que tem uma afinidade excepcionalmente alta pelo seu receptor-alvo, resultando em uma taxa de - exceção muito lenta e uma consequente duração de ação prolongada. Permanece existindo uma necessidade de identificar e desen- ' volver novos compostos que são inibidores de quinase MAP p38, que têm melhor potencial terapêutico, e particularmente, que são mais eficazes, atu- ampor um tempo mais longo e/ou são menos tóxicos. Um objetivo da pre- sente invenção é fornecer compostos que inibem a quinase MAP p38 com certa especificidade de subtipo, e que apresentam bom potencial anti- inflamatório. Sumário da Invenção De acordo com a invenção, fornece-se um composto da fórmula (1)

SO ES HA | am

TIO ÁS O OMe Me (1) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros. Breve Descrição das Figuras A figura 1 ilustra o tempo pré-dose contra o número de neutrófi- losnoBALF para o composto da fórmula (1) no teste de acumulação de neu- trófilos induzida por LPS.

A figura 2 ilustra o tempo pré-dose contra % de inibição de neu- - trófilos para o composto da fórmula (1) no teste de acumulação de neutrófilos induzida por LPS. A figura 3 ilustra os efeitos da dose para o composto da fórmula (1) sobreos números de macrófagos ativados no BAL de camundongos ex- postos à fumaça de cigarro. A figura 4 ilustra os efeitos da dose para o composto da fórmula (1) sobre os números de neutrófilos no BAL de camundongos expostos à fu- maça de cigarro. A figura 5 ilustra o efeito do composto da fórmula (1) sobre a fun- - ção pulmonar de porquinhos-da-índia inoculados com parainfluenza sensibi- lizados com ovalbumina desafiados com ovalbumina. ' Descrição Detalhada da Invenção Os exemplos de sais do composto (1) incluem sais de adição de ácidos de ácidos minerais fortes tais como os sais de HCl e HBr e sais de adição de ácidos de ácidos orgânicos fortes, tal como o sal do ácido meta- nossulfônico.

A estende-se também a solvatos dos compostos da fórmula (1). Os exemplos de solvatos incluem hidratos.

A descrição estende-se também a compostos da fórmula (1) nos quais o átomo especificado na fórmula é um isótopo de ocorrência natural ou que não é de ocorrência natural. Em uma modalidade, o isótopo é um isóto- po estável. Assim sendo, os compostos da invenção incluem, por exemplo, compostos que contêm deutério, e similares.

Um processo para preparar um composto da fórmula (1) compre- ende a reação de um composto da fórmula (Il):

ÁN Bu o O. O,

DIO

Õ NO Me (1)

com um composto da fórmula (Il): o ] Meo. À, (11) em que LG; representa um grupo de saída (por exemplo, cloro). A reação é conduzida adequadamente na presença de uma ba- se (por exemplo, di-isopropiletilamina). A reação é conduzida adequadamen- teem um solvente aprótico ou mistura de solventes, por exemplo, DCM e DMF. Um composto da fórmula (II) pode ser preparado pela reação de : um composto da fórmula (IV): Bu

DF Me (1) com um composto da fórmula (V):

O | o.

O * O (V) e um composto da fórmula (VI): o tehie, (V)) em que LG, e LG; representam, cada um, independentemente, grupos de saída (por exemplo, LG, e LG; representam ambos imidazolila). A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico (por exemplo, diclorometano).

Um composto da fórmula (V) pode ser preparado pela redução . de um composto da fórmula (VII):

LI )

CT “O (VI) por exemplo, por hidrogenação na presença de um catalisador, tal como pla- tina sobre suporte de carvão. ' 5 A reação é conduzida adequadamente em um solvente prótico polar (por exemplo, metanol e ácido acético, 1:1). - Um composto da fórmula (VII) pode ser preparado pela reação de um composto da fórmula (VIII): HO.

O NÓ NH, (VII) com um composto da fórmula (IX): oH NO, (IX) sob condições de Mitsunobu, tal como na presença de trifenilfosfina e azodi- carboxilato de di-isopropila. A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico polar (por exemplo, tetra-hidrofurano). Alternativamente, um composto da fórmula (1) pode ser prepara- dopelareação de um composto da fórmula (X):

LO | . O DAS NH HaN O Me x) com um composto da fórmula (IV) definido acima e um composto da fórmula (XI): o 166, (X)) i em que LG, e LG; representam, cada um, independentemente, grupos - de saída (por exemplo, LG, e LG;s representam ambos imidazolila). A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico polar. Um composto da fórmula (X) pode ser preparado pela redução de um composto da fórmula (XII):

SI |

OX

ON A Me (XI) por exemplo, por hidrogenação na presença de um catalisador, tal como pla- tina sobre suporte de carvão. Um composto da fórmula (XII) pode ser preparado pela reação de um composto da fórmula (XIII): o meo À LG; (XI) em queLG; representa um grupo de saída (por exemplo, cloro) e um composto da fórmula (VII) definido acima. A reação é conduzida adequadamente na presença de uma ba-

se (por exemplo, diisipropiletilamina). A reação é conduzida adequadamente . em um solvente polar, por exemplo, uma mistura de DCM e DMF.

Os compostos das fórmulas (III), (IV), (VI), (VIII), (IX), (XI) e (XIII) estão disponíveis no mercado ou são conhecidos e podem ser preparados por métodos convencionais. Vide, por exemplo, Regan, J. et al., J. Med. Chem., 2003, 46:4676-4686, WO00/043384, WOZ2Z007/08/448 e WOZ2007/089512.

Caso desejado ou necessário, os compostos intermediários po- dem ser protegidos pelo uso de grupos protetores convencionais. Os grupos protetores e os meios para sua remoção estão descritos em "Protective - Groups in Organic Synthesis", por Theodora W. Greene e Peter G.M. Wuts, publicado por John Wiley & Sons, Inc; 4º Edição Revista, 2006, ISBN-10: Ú 0471697540. Os intermediários inusitados são reivindicados como um aspecto dainvenção.

Além disso, a presente invenção fornece uma composição far- macêutica que compreende um composto da fórmula (1) opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

Os diluentes e veículos podem incluir aqueles apropriados para administração parenteral, oral, tópica, pela mucosa e retal.

Como mencionado acima, tais composições podem ser prepara- das, por exemplo, para administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular ou periarticular, particularmente na forma de solu- ções ou suspensões líquidas; para administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; para administração tópica, por exemplo, pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis, e administração transdérmica; para administração pela mucosa, por exemplo, bucal, sublingual ou mucosa vaginal, e para administração re- tal, por exemplo na forma de um supositório.

As composições podem ser administradas convenientemente em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos

' bem-conhecidos na ciência farmacêutica, por exemplo, como descrito em ” "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17º edição, Mack Publishing Com- pany, Easton, PA, (1985). As formulações para administração parenteral po- dem conter como excipientes água ou solução salina esterilizada, alquileno- glicóistais como propilenoglicol, polialquilenoglicóis tais como polietilenogli- col, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e similares.

As formu- lações para administração nasal podem ser sólidas e podem conter excipien- tes, por exemplo, lactose ou dextrano, ou podem ser soluções aquosas ou oleosas para uso na forma de gotas nasais ou spray dosado.

Para adminis- tração bucal, os excipientes típicos incluem açúcares, estearato de cálcio, - estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado, e similares.

As composições administráveis por via oral podem compreender ' um ou mais veículos e/ou excipientes fisiologicamente compatíveis, e podem estar na forma sólida ou líquida.

Os comprimidos e cápsulas podem ser pre- parados com agentes aglutinantes, por exemplo, melaço, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou poli(vinil-pirrolidona); cargas, tais como lactose, saca- rose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol, ou glicina; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol, ou sílica; e tensoativo, tal como lauril-sulfato de sódio.

As composições líquidas podem conter aditi- vos convencionais tais como agentes auxiliares de suspensão, por exemplo, xarope de sorbitol, metil-celulose, melado de açúcar, gelatina, carbóxi-metil- celulose, ou gorduras comestíveis; agentes emulsificantes tais como lecitina, Ou acácia; óleos vegetais tais como óleo de amêndoa, óleo de coco, óleo de fígado de bacalhau, ou óleo de amendoim; conservantes tais como hidroxia- —nisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). As composições líqui- das podem ser encapsuladas, por exemplo, em gelatina, para produzir uma forma de dosagem unitária.

As formas de dosagem sólidas orais incluem comprimidos, cáp- sulas bipartidas com casca dura e cápsulas de gelatina mole elástica (SEG). Uma formulação de casca seca compreende tipicamente uma concentração de cerca de 40% a 60% de gelatina, uma concentração de cerca de 20% a 30% de plastificante (tal como glicerina, sorbitol ou propile-

noglicol) e uma concentração de cerca de 30% a 40% de água. Outros mate- - riais tais como conservantes, corantes, opacificantes, e sabores também podem estar presentes. O material de enchimento líquido compreende um fármaco sólido que foi dissolvido, solubilizado ou dispersado (com agentes auxiliares de suspensão tais como cera de abelhas, óleo de mamona hidro- genado ou polietilenoglicol 4000) ou um fármaco líquido em veículos ou combinações de veículos tais como óleo mineral, óleos vegetais, trigliceri- deos, glicóis, polióis e agentes tensoativos. Adequadamente, o composto da fórmula (1) é administrado por viatópica sobre o pulmão. Assim sendo, fornece-se acordo com a invenção - uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (1) opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos topi- Ú camente aceitáveis. A administração tópica ao pulmão pode ser realizada pelo uso de uma formulação de aerossol. As formulações de aerossóis com- preendem tipicamente o ingrediente ativo em suspensão ou dissolvido em um propelente de aerossol apropriado, tal como clorofluorcarbonetos (CFC) ou a hidrofluorcarboneto (HFC). Os propelentes CFC apropriados incluem tricloromonofluormetano (propelente 11), diclorotetrafluormetano (propelente 114), e diclorodifluormetano (propelente 12). Os propelentes HFC apropria- dos incluem tetrafluoretano (HFC-134a) e heptafluorpropano (HFC-227). O propelente compreende tipicamente 40% a 99,5%, por exemplo, 40% a 90% em peso da composição de inalação total. A formulação pode compreender excipientes, incluindo cosolventes (por exemplo, etanol) e tensoativo (por exemplo, lecitina, trioleato de sorbitano e similares). As formulações de ae- rossóis são embaladas em tubos, e uma dose apropriada é distribuída por meio de uma válvula dosadora (por exemplo, como fornecida pela Bespak, Valois ou 3M).

A administração tópica ao pulmão pode ser realizada também por uma formulação não pressurizada, tal como uma solução ou suspensão aquosa. lsto pode ser administrado por meio de um nebulizador. A adminis- tração tópica ao pulmão pode ser realizada também pelo uso de uma formu- lação de pó seco. Uma formulação de pó seco deve conter o composto da formula (1) na forma finamente dividida, tipicamente com um diâmetro médio . de massa (MMAD) de 1-10 mícrons. A formulação deve conter tipicamente um composto topicamente aceitável tal como lactose, usualmente com ta- manho médio de partícula grande, por exemplo, um diâmetro médio de mas- —sa(MMAD)de 100 um ou mais. Os sistemas de distribuição de pó exemplifi- cativos incluem SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS e CLICKHALER.

Os compostos da fórmula (1) são intencionados para ter ativida- de terapêutica. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um composto dafórmula(l) para uso como um medicamento. - Espera-se que os compostos da fórmula (1) sejam úteis no tra- tamento de distúrbios respiratórios incluindo COPD (incluindo bronquite crô- : nica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgica, rinite, sinusite especialmente asma, bronquite crônica e COPD.

Espera-se também que os compostos da fórmula (1) sejam úteis no tratamento de certas condições que podem ser tratadas por terapia tópica ou local, incluindo conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, der- matite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secun- dáriaaartrite reumatoide ou osteoartrite.

Espera-se também que os compostos da fórmula (1) sejam úteis no tratamento de certas outras condições incluindo artrite reumatoide, pan- creatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores, incluin- do carcinoma pulmonar de células nãopequenas, carcinoma mamário, carci- noma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno.

Assim sendo, em outro aspecto, a presente invenção fornece um composto da fórmula (1) para uso no tratamento das condições mencionadas acima, por exemplo, administrando uma quantidade terapeuticamente acei- tável do dito composto a um paciente necessitado dele.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um composto da fórmula (1) para a fabricação de um medicamento para o trata- mento das condições mencionadas acima.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de + tratamento das condições mencionadas acima, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um composto da fórmula (1) ou uma sua composição farmacêutica. A invenção estende-se também ao uso de composições/formu- lações farmacêuticas no tratamento de uma ou mais das ditas condições. O termo "tratamento" pretende englobar profilaxia, bem como tratamento terapêutico. Um composto da fórmula (1) pode ser administrado também em combinação com um ou mais outros ingredientes ativos, por exemplo, ingre- - dientes ativos apropriados para tratar as condições mencionadas acima. Por exemplo, as combinações possíveis para o tratamento de distúrbios respira- Ú tórios incluem combinações com esteroides (por exemplo, budesonida, di- propionato de beclometasona, propionato de fluticasona, furoato de mome- tasona, furoato de fluticasona), beta-agonistas (por exemplo, terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol) e/ou xantinas (por exemplo, teofilina). Exemplos Exemplo 1: N-[4-(f4-[3-(3-t-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-S-il)ureido]naftalen-1- ilóxivnetil)piridin-2-i1)-2-metóxi-acetamida (1) 2-Amino4-l(4-nitronaftalen-1-ilóxi)metil]-piridina (3) no 4-Nitronaftol, O PPh,, DIAD Hz

ATO N H, 2 3 Adicionou-se azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD) (8,07 mL, 41,0 mmols) sob a forma de gotas a uma solução de 4-nitronaftol (5,17 9, 27,3 mmois), trifenilfosfina (10,75 g, 41,0 mmols) e 2-aminopiridino-4- metanol (2) (5,08 g, 41,0 mmols) em THF (50 mL), a -15ºC. A mistura foi agi- tadade um dia para o outro à temperatura ambiente e os voláteis foram en- tão removidos sob vácuo. O produto bruto foi triturado em EtOAc (150 mL), removido por filtração e lavado com EtOAc (100 mL). Uma segunda tritura-

ção em MeOH (100 mL) deu 2-amino-4-[(4-nitronaftalen-1-ilóxi)metil]-piridina - (3) (4,54 g, 56%) como um sólido amarelo: m/z 296 (M+H)* (ES*). 2-Amino4-[l(4-aminonaftalen-1-ilóxi)Metil]-piridina (4) de: O O NA NH aidindad O LA, se “O 3 4 Uma solução de 2-amino-4-[(4-nitronaftalen-1-ilóxi)metil)-piridina * 5 (3)(4,50g,15,24mmols)em metanol (200 mL) e ácido acético glacial (200 mL) foi passada através de um reator de fluxo Thales 'H-cube' (2 mL min”, ' 40ºC, 55 mm 10% PUC Cat-Cartl?, cheio de H2) e os voláteis foram então removidos sob vácuo.

O produto bruto foi submetido a uma captura por SCX e liberado eluindo com solução a 1% de amônia em MeOH e o solvente foi removido sob vácuo para dar 2-amino-4-[(4-aminonaftalen-1-ilóxi)|mMetil]- piridina (4) (3,82g, 94%) como um sólido malva: m/z 266 (M+H)* (ES*). 1-f4-[(2-Aminopiridin-4-i)metóxilnaftalen-1-i1)-3-(3-t-butil-1-p-tolil-1H-pirazol- S-il)-ureia (5) “ PÓ ]N x O O. d A. co " *w Oo HaN' =— 4 cor O 5 Me Adicionou-se na forma de gotas uma solução de 3-fbutil-1-p- toli-1H-pirazol-S-amina (6) (5,91 g, 25,80 mmoIs) em DCM (15 mL) a uma solução de 1,1'-carbonildi-imidazol (CDI) (4,18 9, 25,80 mmois) em DCM (15 mL), sob nitrogênio, durante 40 min.

A solução resultante foi agitada à tem- peratura ambiente por uma hora e depois adicionada sob a forma de gotas, sob nitrogênio, a uma solução de 2-amino-4-[(4-aminonaftalen-1-ilóxi)metil]-

' piridina (4) (3,80 g, 12,89 mmols). A mistura foi agitada durante a noite intei- - ra e os voláteis foram então removidos sob vácuo. O material bruto foi purifi- cado por cromatografia rápida(Biotage 120 g); eluindo com O a 6% de MeOH em DCM para dar 1-[4-[(2-aminopiridin-4-il)netóxilnaftalen-1-i1)-3-(3-t-butil-1- p-toli-1H-pirazol-S-il)-ureia (5) (4,27 g, 63%): m/z 521 (M+H)* (ES*). N-[4-(f4-[3-(3-t-Butil-1-p-tolil-1 H-pirazol-5-il)ureido]naftalen-1-ilóxivmetil) piri- din-2-i1)-2-metóxi-acetamida (1)

N N “o. x es MEQGHICOS! “o. L EST

NOR TA RÔ - O O Ovo - Me 5 Mo 1 Adicionou-se cloreto de metóxi-acetila (92 ul, 1,01 mmol) a uma solução de 1-f4-[(2-aminopiridin4-il) metóxilnaftalen-1-11)-3-(3-t-butil-1-p-tolil- 1H-pirazol-S-il)-ureia (5) (526 mg, 0,96 mmol) e DIPEA (184 uL, 1,06 mmol) em uma mistura de DCM e DMF (10:1, 11 mL) sob agitação. Depois de uma hora à temperatura ambiente, mais frações de DIPEA (184 ul, 1,06 mmol) e cloreto de metóxi-acetila (92 ul, 1,01 mmol) foram adicionadas sequencial- mente e a agitação foi continuada por uma hora. Uma solução de 1% de amônia em MeOH (40 mL), foi adicionada e a mistura foi agitada por 15 mi- nutos e depois concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia com coluna rápida (Biotage 40 g); eluindo com O a 6% de MeOH em DCM para produzir N-[4-((4-[3-(3-t-butil-1-p-tolil-1 H-pirazol-5- i)ureido]natalen-1-ilóxivmetil)piridin-2-i1)-2-metóxi-acetamida (1) (286 mg, 49%): m/z 593 (M+H)* (ES*)'H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 8: 1,27 (9 H, s), 2,39 (3 H, s), 3,32 (3 H, s), 4,08 (2H, s), 5,39 (2H, s), 6,36 (1H, s), 7,03 (1H, d), 7,28 (1H, dd), 7,36 (2H, m), 7,44 (2H, m), 7,56-7,64 (3H, m), 7,93 (1H, m), 8,30-8,35 (3H, m), 8.58 (1H, s), 8.79 (1H, s) e 1002 (1H, s).

Teste Biológico . Teste in vitro Células U937 Diferenciadas Células THP1 Liberação de TNFa induzida | Liberação de TNFa por LPS induzida por LPS sm fm ee [| Em ee alfa gama *1: ensaio baseado em células para MAPK alfa p38 por detecção da fosfori- i lação de MAPKAP-K2 *2:nenhum efeito tóxico significativo observado no ensaio MTT Uma descrição destes ensaios é a seguinte: Ensaio de Inibição de enzima A atividade inibitória de enzima pelo composto foi determinada por transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) usan- do peptídeos sintéticos marcados com fluoróforos doadores e aceptores (Z- LYTE, Invitrogen). Resumidamente, MAPK p38 gama fosforilada recombi- nante (MAPK12 :Millipore) foi diluída em tampão HEPES, misturada com o composto nas concentrações finais desejadas e incubada por duas horas à temperatura ambiente.

O peptídeo FRET (2 uM) e ATP (100 uM) foram, a seguir, adicionados à mistura enzima/composto e incubado por uma hora.

Reagente de revelação (protease) foi adicionado por uma hora antes da de- tecção em uma leitora de microplacas de fluorescência.

A protease especíifi- ca de sítio cliva apenas peptídeo nãofosforilado e elimina o sinal de FRET.

Os níveis de fosforilação de cada reação foram calculados usando a relação daemissãode cumarina (doador) sobre a emissão de fluoresceína (aceptor), sendo que altas razões indicam alta fosforilação e baixas razões, baixos ní- veis de fosforilação.

A inibição percentual de cada reação foi calculada em relação ao controle nãoinibido, e a concentração inibitória de 50% (valor de

Clso) foi então calculada a partir da curva de resposta à concentração.

: No caso de MAPK p38 alfa (MAPK14: Invitrogen), a atividade da enzima foi avaliada indiretamente determinando a ativação/fosforilação da molécula a jusante, MAPKAP-K2. A proteina MAPK p38-a foi misturada com seu alvo inativo MAPKAP-K2 (Invitrogen) e o composto por duas horas à temperatura ambiente. O peptídeo FRET (2 uM), que é um alvo da fosforila- ção para MAPKAP-K2, e ATP (10 uM) foram então adicionados à mistura enzimas/composto e incubados por uma hora. O reagente de revelação foi então adicionado e a mistura foi incubada por uma hora antes da detecção porfluorescência completar o protocolo do ensaio. - Liberação de TNF-alfa induzida por LPS: potência Células U937, uma linhagem de células monocíticas humanas, ] foram diferenciadas para células do tipo macrófagos por incubação com mi- ristato-acetato de forbol (PMA; 100 ng/ml) por 48 a 72 horas. Quando apro- priado, as células foram pré-incubadas com concentrações finais do com- posto por duas horas. As células foram então estimuladas com 0,1 ug/mL de LPS (a partir de E.Coli: 0111:B4, Sigma) por 4 horas, e o sobrenadante foi coletado para determinação da concentração de TNFa por ELISA de sandu- iche (Duo-set, R&D Systems). THP-1, uma linhagem de células monociíticas humanas, também foi usada para este ensaio. As células THP-1 foram esti- muladas com 1 ug/mL de LPS (a partir de E.Coli: 0111:B4, Sigma) por 4 horas, e o sobrenadante foi coletado para determinação da concentração de TNFa. A inibição percentual da produção de TNFa foi calculada em cada concentração do composto em teste por comparação com o controle de veí- culo eo valorda concentração inibitória de 50% (Clso) foi determinado a partir de curva de resposta à concentração resultante. Ensaio MTT As células U937 diferenciadas foram pré-incubadas com com- posto por 4 horas em 5% de FCS ou 10% de FCS por 24 horas e 72 horas. O sobrenadante foi substituído por 200 ul de meio fresco e 10 ul de solução de estoque de MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço. Depois de uma hora de incubação, os meios foram removidos, 200 ul de DMSO foram adicionados a cada poço e as placas foram sacudidas ligeiramente por uma - hora antes de ler a absorvância a 550 nm.

A perda percentual da viabilidade das células foi calculada para cada poço em relação ao tratamento com veículo (0,5% de DMSO). Conse- quentemente, um aumento aparente na viabilidade celular para o tratamento com fármaco em relação ao veículo é tabulado como uma porcentagem ne- gativa.

Teste in vivo Neutrófilos induzidos por LPS no camundongo Camundongos não jejuados foram dosados pela via intratraqueal : com veículo ou substância em teste nos mesmos pontos nos tempos ("pré- dose") indicados com relação ao início do tratamento com LPS.

No T= 0,s : camundongos foram colocados dentro de uma câmara de exposição e ex- postos a LPS. 8 horas depois do desafio com LPS, os animais foram aneste- siados, a traqueia foi canulada e o BALF foi extraído infundindo e retirando 1 mL de PBS dentro dos pulmões por intermédio de um cateter traqueal.

As contagens totais e diferenciais de leucócitos nas amostras do BALF foram medidas usando um hemocitômetro Neubaur.

Esfregaços de citocentrifuga- ção (cytospin) das amostras do BALF foram preparados por centrifugação a 200rpm por 5 minutos à temperatura ambiente e corados usando o sistema corante DiffQuik (Dade Behring). As células foram contadas usando um mi- croscópio de imersão em óleo.

Os resultados estão ilustrados nas figuras 1 e 2. Os dados para números de neutrófilos são relatados como número total e diferencial (subs- tância em teste em relação ao veículo) de células por miílilitro de BALF, mé- dia + SE.M. (n=38). Modelo de Fumaça de Cigarro Camundongos A/J (machos, 5 semanas de idade) foram expos- tos à fumaça de cigarro (4% de fumaça de cigarro diluídos com ar comprimi- do) por30 min/dia por 11 dias usando um Sistema de Experimento de Inala- ção de Fumaça de Tabaco para animais pequenos (Modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tóquio, Japão). As substâncias em teste foram dadas por via intranasal (35 pl de solução em 50% de DMSO/PBS) e terapeutica- - mente duas vêzes ao dia por 3 dias depois da exposição final à fumaça de cigarro.

Doze horas depois da última dosagem, os animais foram anestesia- dos, a traqueia foi canulada e o líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado.

Os números de macrófagos e neutrófilos alveolares foram determi- nados por análise FACS (EPICSº ALTRA 1l, Beckman Coulter, Inc., Fuller- ton, CA, EUA) usando anticorpo anti-camundongo de MOMA2 (macrófago) ou anticorpo anti-camundongo 7/4 (neutrófilo). Os resultados estão ilustrados na figura 3 para macrófagos alve- olares ativados e na figura 4 para neutrófilos.

Os dados para números de - células estão indicados como média + SEM.

O modelo de fumaça de cigarro usado para este estudo relatado como um sistema refratário a corticosteroi- ' des (Medicherla S. et a/., (2008); J.

Pharmacol.

Exp.

Ther. 324(3):921-9) e confirmou-se que o propionato de fluticasona não inibiu a acumulação de neutrófilos ou macrófagos dentro das vias aéreas a 50 ug/mL (354ul, duas vezes ao dia (b.id.), in), a mesma dose que produziu >80% de inibição da acumulação de neutrófilos induzida por LPS.

Na figura 3: **Diferença significativa entre exposição ao ar e exposição ao cigarro. ***P<0,001 versus Controle com fumaça de cigarro (CS) (AN- NOVA, múltipla comparação de Dunnett), n=6-11 Na figura 4: **Diferença significativa entre exposição ao ar e exposição à fumaçade cigarro. *P<0,05 ou ***P<0,001 versus Controle com fumaça de cigarro (CS) (ANNOVA, múltipla comparação de Dunnett), n = 6-11 Modelo de desafio com ovalbumina / infecção com parainfluenza (modelo in vivo para resistência a esteroides) Porquinhos-da-índia Dunkin-Hartley machos (300-350 9, n = 6/grupo) foram sensibilizados com 100 ug de ovalubumina (OVA) + 100 mg ALl(OH); em 1 mL de solução salina normal (intraperitoneal) nos Dias 2€ 6.

Vírus parainfluenza (PIV-3; 10º unidades infecciosas) ou meio sem vírus foi - instilado por via nasal nos Dias 11 e 12. Os animais foram tratados com pro- pionato de fluticasona nebulizado em uma dose de 1,5 mg por dia.

Estudos iniciais estabeleceram que esta dose de propionato de fluticasona inibia mu- danças da função pulmonar mediadas por ovalbumina em animais sensibili- zados tratados com meio PIV3. O Exemplo 1 (4,5 mg por dia) ou o veículo (DMSO:etanol:solução salina, 30:30:40%) a partir dos Dias 10-15. Todos os animais foram desafiados por uma hora com OVA nebulizada (10 ug/mL) no Dia 15, e medições repetidas da condutância específica das vias aéreas (sGay) foram feitas durante um período de 24 horas usando pletismografia - de corpo inteiro.

As medições de sSGay depois do desafio com OVA são plo- tadas como % de mudança a partir da linha basal.

Vide figura 5. Ú figura 5 Dados estão indicados como a média de 6 observa- ções; (e) PIV3 + tratamento com veículo; (=) PIV3 + tratamento com propio- natode fluticasona; (à) PIV3 + tratamento com Exemplo 1 Sinopse Os estudos biológicos in vitro demonstram que o composto da fórmula (1) é um inibidor potente dos subtipos alfa e gama de quinase MAP p38 com boa eficácia em um modelo in vitro de atividade anti-inflamatória (liberação de TNF-alfa induzida por LPS a partir de células U937 diferencia- das e células THP-1). Pelos resultados de MTT pode-se concluir que o com- posto não apresenta toxicidade celular manifesta nas concentrações usadas.

Os estudos biológicos in vivo demonstram que o composto da fórmula (1) é eficaz em inibir a acumulação de neutrófilos induzida por LPS em um modelo animal, com uma longa duração do efeito, como indicado pela inibição significativa mesmo em 12 ou mais horas de pré-dosagem.

A- lém disso, o composto da fórmula (1) demonstrou ser eficaz em dois modelos in vivo de inflamação resistente a esteroides.

Neste relatório descritivo inteiro e nas reivindicações que se se- gue,amenos que o contexto requeira o contrário, o termo "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", deve ser entendido como inferindo a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros, ou grupo de etapas, assinalados, mas não a exclusão de qualquer - outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros, ou grupo de etapas. Todas patentes e pedidos de patente aqui referidas são incorpo- radas como referência em sua totalidade.

O pedido de patente do qual este relatório descritivo e as reivin- dicações fazem parte pode ser usado como uma base para prioridade em relação a qualquer pedido de patente subsequente. As reivindicações desse pedido de patente subsequente podem ser direcionadas para qualquer ca- racterística ou combinação de características aqui descritas. Elas podem tomara forma de reivindicações de produto, composição, processo, ou uso e - podem incluir, a título exemplificativo e sem limitações, as reivindicações. - Abreviaturas ' Ac acila ATP 5"-trifosfato de adenosina BALF Líquido da lavagem broncoalveolar BSA albumina de soro bovino CatCartº cartucho catalítico (marca registrada) CDI carbonildi-imidazol DCM diclorometano DIAD azodicarboxilato de di-isopropila DMF dimetilformamida DMSO sulfóxido de dimetila COPD doença pulmonar obstrutiva crônica DIAD azodicarboxilato de di-isopropila DIBALH hidreto de di-isobutil-alumínio DIPEA N-etil-Nisopropilpropan-2-amina Et etila FCS soro fetal vitelínico h hora(s) HRP peroxidase de rábano-silvestre JNK quinase c-Jun do terminal N MAPK proteína quinase ativada por mitógenos

Me metila

' PBS solução salina tamponada com fosfato PPh;3 trifenilfosfina RT temperatura ambiente

Sscx troca catiônica sobre suporte sólido SDS dodecil-sulfato de sódio TFA ácido trifluor-acético THF tetra-hidrofurano TNFo fator de necrose tumoral alfa TMB 3.3', 5.5-tetrametilbenzidina . MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES - 1. Composto da fórmula (1) a LI
2. DA TA ENO) O OMe Me (1) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros. - 5 2. Composição farmacêutica que compreende um composto co- - mo definido na reivindicação 1, em combinação com um ou mais diluentes : ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
3. 3. Composto da fórmula (1), de acordo com a reivindicação 1, pa- ra uso como um medicamento.
4. 4. Composto da fórmula (1), de acordo com a reivindicação 1, pa- ra uso no tratamento ou prevenção de uma condição selecionada entre: COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pe- diátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgi- ca, rinite, sinusite, conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, dermatite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secundária a artrite reumatoide ou osteoartrite, artrite reumatoide, pancreatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores, incluíndo carcinoma pulmonar de células não-peque- nas,carcinoma mamário, carcinoma gástrico, carcinomas colorretais e mela- noma maligno.
5. 5. Uso de um composto da fórmula (1) como definido na reivindi- cação 1 para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou preven- ção de uma condição selecionada entre COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pe- diátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgi-

   ca, rinite, sinusite, . conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, dermatite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secundária a artrite reumatoide ou osteoartrite, artrite reumatoide, pancreatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores, incluindo carcinoma pulmonar de células não- pequenas, carcinoma mamário, carcinoma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno.
6. 6. Método de tratamento de uma condição selecionada entre: COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pe- - diátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgi- : ca, rinite, sinusite, ] conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, dermatite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secundária a artrite reumatoide ou osteoartrite, artrite reumatoide, pancreatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores, incluindo carcinoma pulmonar de células não- pequenas, carcinoma mamário, carcinoma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno, que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade efi- caz de um composto da fórmula (1) como definido na reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 2, por exemplo, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz a um Paciente ne- cessitado dele.
7. 7. Processo para a preparação de um composto da fórmula (1) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros, compreendendo a reação de um composto da fórmula (Il):

   ÁN su o O, "Na '

   NOR O O (1)

   i com um composto da fórmula (Ill): o Meo. e À, (1) em que LG, representa um grupo de saída.
8. 8. Processo para a preparação de um composto da fórmula (1) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seustautômeros, compreendendo a reação de um composto da fórmula (X): PÁ ]N | (O SA, - HW A - OMe ' (x) com um composto da fórmula (IV): Bu

   DA Me (IV) e um composto da fórmula (XI): o 6/6, (X)) em que LG, e LG; representam, cada um, independentemente, grupos de saída.
9. 9. Composto da fórmula (X):

   SO . O NAO NH A Px OMe (x) ou um seu derivado protegido, ou um seu sal.