BRPI0920840B1 - Inibidor de quinase mapk p38 - Google Patents

Abstract

INIBIDOR DE QUINASE MAPK P38. A presente invenção refere-se a um composto da fórmula (I) (I) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros, composições que compreendem o mesmo, uso do dito composto e composições para o tratamento, particularmente para o tratamento de asma e COPD, e processos para a preparação do dito composto.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos que são inibidores de enzimas de proteína quinase ativadas por mitógenos p38 (aqui referidos como inibidores de quinase MAPK p38), particularmente os seus subtipos alfa e gama quinase, e seu uso em terapia, especialmente no tratamento de doenças inflamatórias, incluindo doenças inflamatórias do pulmão.

Antecedentes da Invenção

Quatro isoformas de MAPK p38 (alfa, beta, gama e delta, respectivamente) foram identificadas, cada uma apresentando um padrão de expressão de tecido. As isoformas alfa e beta de MAPK p38 são expressadas de forma ubíqua no corpo inteiro e são encontradas em muitos tipos diferentes de células. As isoformas alfa e beta de MAPK p38 são inibidas por certas moléculas pequenas inibidoras de MAPK p38 conhecidas. As primeiras gerações de compostos eram altamente tóxicas devido ao padrão de expressão ubíquo destas isoformas e aos efeitos fora do alvo dos compos-tos. Os inibidores mais recentes foram aperfeiçoados para serem altamente seletivos pelas isoformas alfa e beta de MAPK p38 e têm uma margem de segurança mais ampla. Pouco se sabe sobre as isoformas gama e delta de MAPK p38. Estas isoformas são expressadas em tecidos/células específicos (diferentemente das isoformas p38 alfa e p38 beta). A isoforma delta de MAPK p38 é expressada mais no pâncreas, testículos, pulmão, intestino delgado e rim. Ela é abundante também em macrófagos (Smith, S.J. (2006) Br. J. Pharmacol. 149:393-404) e detectável em neutrófilos, células T CD4+ e células en- doteliais (www.qenecard.org, Karin, K. (1999) J. Immunol.). Muito pouco se sabe sobre a expressão de MAPK p38 gama, mas ela é expressada mais no cérebro, músculo esquelético e coração, bem como em linfócitos e macrófagos (www.qenecard.org).

Moléculas pequenas inibidoras seletivas de MAPK p38 gama e delta são agora atualmente disponíveis, mas um inibidor existente tem ações inibitórias pan-isoformas. BIRB 796 inibe todas isoformas, mas inibe p38 gama e p38 delta em concentrações mais altas do que aqueles que inibem p38 alfa e p38 beta (Kuma, Y. (2005) J. Biol. Chem. 280:19472-19479). BIRB 796 também diminui a fosforilação de MAPKs p38 ou JNKs pela quina- se MKK6 ou MKK4 a montante. Os autores discutiram a possibilidade de que a mudança conformacional causada pela ligação do inibidor à MARK pode afetar a estrutura do seu sítio de fosforilação e também o sítio de atracação para o ativador a montante, e portanto diminuindo a fosforilação de MAPKs p38 ou JNKs.

Acredita-se que a quinase MAP p38 desempenha um papel fun-damental em muitas vias de sinalização que estão envolvidas na iniciação e manutenção de inflamação crônica persistente em doença humana, por exemplo, asma severa e COPD. Existe agora uma literatura abundante que demonstra que a quinase MAP p38 é ativada por uma série de citocinas pró- inflamatórias e que sua ativação resulta na elaboração e liberação de outras citocinas pró-inflamatórias. Realmente, dados de alguns estudos clínicos demonstram mudanças benéficas na atividade de doenças em pacientes durante o tratamento com inibidores de quinase MAP p38. Por exemplo, Smith, S. J. (2006) Br. J. Pharmacol. 149:393-404 descreve o efeito inibitório de inibidores de quinase MAP p38 MAP sobre a liberação de citocinas a partir de macrófagos humanos. O uso de inibidores de quinase MAP p38 no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é proposto. Moléculas pequenas inibidoras assestadas para MAPK p38 α/β demonstraram ser eficazes em reduzir vários parâmetros de inflamação em células e tecidos, obtidos de pacientes com COPD que são geralmente insensíveis a cor- ticosteroides (Smith, S. J. (2006) Br. J. Pharmacol. 149:393-404) e modelos animais in vivo (Underwood, D. C. et al. (2000) 279:895-902; Nath, P. et al. (2006) Eur. J. Pharmacol. 544:160-167). Irusen e outos também sugeriram a possibilidade de envolvimento de MAPK p38 α/β sobre a insensibilidade a corticosteroides por intermédio da redução da afinidade de ligação de receptor de glicocorticoides (GR) nos núcleos (Irusen, E. et al., (2002) J. Allergy Clin. Immunol., 109:649-657). Experiências clínicas com uma série de inibi- dores de quinase MAP p38, incluindo AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 . e SCIO323 estão descritas em Lee et al. (2005) Current Med. Chem. 12/2979-2994.

COPD é uma condição na qual a inflamação subjacente foi rela- 5 tada como sendo substancialmente resistente aos efeitos anti-inflamatórios de corticosteroides inalados. Consequentemente, uma estratégia eficaz para tratar COPD pode certamente ser o desenvolvimento de uma intervenção que tem efeitos anti-inflamatórios inerentes e também é capaz de aumentar a sensibilidade de tecidos pulmonares de pacientes com COPD a corticoste- 10 roides inalados. A recente publicação de Mercado et al. (2007; American - Thoracic Society Abstract A56) demonstra que o silenciamento de gama p38 tem o potencial para restaurar a sensibilidade a corticosteroides.

Entretanto, o principal obstáculo que impede a definição e explo-ração das utilidades potenciais de inibidores de quinase MAP p38 no trata- 15 mento de doenças inflamatórias crônicas humanas tem sido a toxicidade observada em pacientes. Isto foi suficientemente grave para resultar no cancelamento do desenvolvimento clínico de muitos dos compostos desenvolvidos.

Os compostos desenvolvidos até agora eram tipicamente inten- 20 cionados para administração oral. Esta estratégia envolve otimizar compostos que atingiram sua duração de ação por um perfil farmacocinético apropriado. Isto assegura que haja uma concentração suficiente do fármaco estabelecida e mantida depois e entre doses para produzir um benefício clínico. A consequência inevitável desta abordagem é que todos os tecidos do 25 corpo, especialmente do fígado e intestino, possivelmente ficam expostos a concentrações terapeuticamente ativas do fármaco, estejam eles ou não afetados adversamente pela doença que está sendo tratada. Uma estratégia alternativa é desenhar abordagens de tratamento nas quais o fármaco é dosado diretamente para o órgão inflamado (tera- 30 pia tópica). Embora esta abordagem não seja apropriada para tratar todas as doenças inflamatórias crônicas, ela tem sido explorada extensivamente em doenças pulmonares (asma, COPD), doenças da pele (dermatite atópica e II psoríase), doenças nasais (finite alérgica) e doenças gastrointestinais (colite ulcerativa). Na terapia tópica, a eficácia (i) assegurando que o fármaco tenha uma duração de ação prolongada e fique retido no órgão relevante para minimizar os riscos de toxicidade sistêmica, ou (ii) produzindo uma formula-ção que gera um "reservatório" do fármaco ativo que fica disponível para prolongar os efeitos desejados do fármaco. A abordagem (i) é exemplificada pelo fármaco anticolinérgico tiotrópio (Spiriva), que é administrado por via tópica ao pulmão como um tratamento para COPD, e que tem uma afinidade excepcionalmente alta pelo seu receptor-alvo, resultando em uma taxa de exceção muito lenta e uma consequente duração de ação prolongada. Permanece existindo uma necessidade de identificar e desen-volver novos compostos que são inibidores de quinase MAP p38, que têm melhor potencial terapêutico, e particularmente, que são mais eficazes, atu-am por um tempo mais longo e/ou são menos tóxicos. Um objetivo da pre-sente invenção é fornecer compostos que inibem a quinase MAP p38 com certa especificidade de subtipo, e que apresentam bom potencial anti- inflamatório.

Sumário da Invenção

De acordo com a invenção, fornece-se um composto da fórmula (I) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 ilustra o tempo pré-dose contra o número de neutrófi- los no BALF para o composto da fórmula (I) no teste de acumulação de neu- trófilos induzida por LPS.

A figura 2 ilustra o tempo pré-dose contra % de inibição de neu-trófilos para o composto da fórmula (I) no teste de acumulação de neutrófilos induzida por LPS.

A figura 3 ilustra os efeitos da dose para o composto da fórmula (I) sobre os números de macrófagos ativados no BAL de camundongos ex-postos à fumaça de cigarro.

A figura 4 ilustra os efeitos da dose para o composto da fórmula (I) sobre os números de neutrófilos no BAL de camundongos expostos à fu-maça de cigarro.

A figura 5 ilustra o efeito do composto da fórmula (I) sobre a fun-ção pulmonar de porquinhos-da-índia inoculados com parainfluenza sensibi-lizados com ovalbumina desafiados com ovalbumina.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos de sais do composto (I) incluem sais de adição de ácidos de ácidos minerais fortes tais como os sais de HCI e HBr e sais de adição de ácidos de ácidos orgânicos fortes, tal como o sal do ácido meta- nossulfôníco.

A estende-se também a solvatos dos compostos da fórmula (I). Os exemplos de solvatos incluem hidratos.

A descrição estende-se também a compostos da fórmula (I) nos quais o átomo especificado na fórmula é um isótopo de ocorrência natural ou que não é de ocorrência natural. Em uma modalidade, o isótopo é um isóto-po estável. Assim sendo, os compostos da invenção incluem, por exemplo, compostos que contêm deutério, e similares.

Um processo para preparar um composto da fórmula (I) compre-ende a reação de um composto da fórmula (II): com um composto da fórmula (III): em que LG, representa um grupo de saída (por exemplo, cloro),

A reação é conduzida adequadamente na presença de uma base (por exemplo, di-isopropiletilamina), A reação é conduzida adequadamen- te em um solvente aprótico ou mistura de solventes, por exemplo, DCM e DMF.

Um composto da fórmula (II) pode ser preparado pela reação de um composto da fórmula (IV): com um composto da fórmula (V): e um composto da fórmula (VI): em que LG2 e LG3 representam, cada um, independentemente, grupos de saída (por exemplo, LG2 e LG3 representam ambos imidazolila). A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico (por exemplo, diclorometano).

Um composto da fórmula (V) pode ser preparado pela redução de um composto da fórmula (VII): por exemplo, por hidrogenação na presença de um catalisador, tal como pla-tina sobre suporte de carvão.

A reação é conduzida adequadamente em um solvente prótico polar (por exemplo, metanol e ácido acético, 1:1). Um composto da fórmula (VII) pode ser preparado pela reação de um composto da fórmula (VIII): com um composto da fórmula (IX): sob condições de Mitsunobu, tal como na presença de trifenilfosfina e azodi- carboxilato de di-isopropila. A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico polar (por exemplo, tetra-hidrofurano). Alternativamente, um composto da fórmula (I) pode ser prepara- 15 do pela reação de um composto da fórmula (X): com um composto da fórmula (IV) definido acima e um composto da fórmula (XI): em que LG4 e LG5 representam, cada um, independentemente, grupos de saída (por exemplo, LG4 e LG5 representam ambos imidazolila). A reação é conduzida adequadamente em um solvente aprótico polar.

Um composto da fórmula (X) pode ser preparado pela redução de um composto da fórmula (XII): por exemplo, por hidrogenação na presença de um catalisador, tal como pla- 10 tina sobre suporte de carvão. Um composto da fórmula (XII) pode ser preparado pela reação de um composto da fórmula (XIII): em queLGe representa um grupo de saída (por exemplo, cloro) e um composto da fórmula (VII) definido acima. A reação é conduzida adequadamente na presença de uma ba se (por exemplo, diisipropiletilamína). A reação é conduzida adequadamente em um solvente polar, por exemplo, uma mistura de DCM e DMF. Os compostos das fórmulas (III), (IV), (VI), (VIII), (IX), (XI) e (XIII) estão disponíveis no mercado ou são conhecidos e podem ser preparados por métodos convencionais. Vide, por exemplo, Regan, J. et al., J. Med. Chem., 2003, 46:4676-4686, WO00/043384, W02007/087448 e W02007/089512.

Caso desejado ou necessário, os compostos intermediários po-dem ser protegidos pelo uso de grupos protetores convencionais. Os grupos protetores e os meios para sua remoção estão descritos em "Protective Groups in Organic Synthesis", por Theodora W. Greene e Peter G.M. Wuts, publicado por John Wiley & Sons, Inc; 4- Edição Revista, 2006, ISBN-10: 0471697540. Os intermediários inusitados são reivindicados como um aspecto da invenção.

Além disso, a presente invenção fornece uma composição far-macêutica que compreende um composto da fórmula (I) opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Os diluentes e veículos podem incluir aqueles apropriados para administração parenteral, oral, tópica, pela mucosa e retal.

Como mencionado acima, tais composições podem ser prepara-das, por exemplo, para administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular ou periarticular, particularmente na forma de solu-ções ou suspensões líquidas; para administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; para administração tópica, por exemplo, pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis, e administração transdérmica; para administração pela mucosa, por exemplo, bucal, sublingual ou mucosa vaginal, e para administração retal, por exemplo na forma de um supositório. As composições podem ser administradas convenientemente em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem-conhecidos na ciência farmacêutica, por exemplo, como descrito em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17â edição, Mack Publishing Com-pany, Easton, PA, (1985). As formulações para administração parenteral po-dem conter como excipientes água ou solução salina esterilizada, alquileno- glicóis tais como propilenoglicol, polialquilenoglicóis tais como polietilenogli- col, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e similares. As formu-lações para administração nasal podem ser sólidas e podem conter excipien-tes, por exemplo, lactose ou dextrano, ou podem ser soluções aquosas ou oleosas para uso na forma de gotas nasais ou spray dosado. Para adminis-tração bucal, os excipientes típicos incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado, e similares.

As composições administráveis por via oral podem compreender um ou mais veículos e/ou excipientes fisiologicamente compatíveis, e podem estar na forma sólida ou líquida. Os comprimidos e cápsulas podem ser pre-parados com agentes aglutinantes, por exemplo, melaço, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou poli(vinil-pirrolidona); cargas, tais como lactose, saca-rose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol, ou glicina; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol, ou sílica; e tensoativo, tal como lauril-sulfato de sódio. As composições líquidas podem conter aditi-vos convencionais tais como agentes auxiliares de suspensão, por exemplo, xarope de sorbitol, metil-celulose, melado de açúcar, gelatina, carbóxi-metil- celulose, ou gorduras comestíveis; agentes emulsificantes tais como lecitina, ou acácia; óleos vegetais tais como óleo de amêndoa, óleo de coco, óleo de fígado de bacalhau, ou óleo de amendoim; conservantes tais como hidroxia- nisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). As composições líquidas podem ser encapsuladas, por exemplo, em gelatina, para produzir uma forma de dosagem unitária.

As formas de dosagem sólidas orais incluem comprimidos, cáp-sulas bipartidas com casca dura e cápsulas de gelatina mole elástica (SEG).

Uma formulação de casca seca compreende tipicamente uma concentração de cerca de 40% a 60% de gelatina, uma concentração de cerca de 20% a 30% de plastificante (tal como glicerina, sorbitol ou propile- noglicol) e uma concentração de cerca de 30% a 40% de água. Outros mate-riais tais como conservantes, corantes, opacificantes, e sabores também podem estar presentes. O material de enchimento líquido compreende um fármaco sólido que foi dissolvido, solubilizado ou dispersado (com agentes auxiliares de suspensão tais como cera de abelhas, óleo de mamona hidro- genado ou polietilenoglicol 4000) ou um fármaco líquido em veículos ou combinações de veículos tais como óleo mineral, óleos vegetais, triglicerí- deos, glicóis, polióis e agentes tensoativos.

Adequadamente, o composto da fórmula (I) é administrado por via tópica sobre o pulmão. Assim sendo, fornece-se acordo com a invenção uma composição farmacêutica que compreende um composto da fórmula (I) opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos topi-camente aceitáveis. A administração tópica ao pulmão pode ser realizada pelo uso de uma formulação de aerossol. As formulações de aerossóis com-preendem tipicamente o ingrediente ativo em suspensão ou dissolvido em um propelente de aerossol apropriado, tal como clorofluorcarbonetos (CFC) ou a hidrofluorcarboneto (HFC). Os propelentes CFC apropriados incluem tricloromonofluormetano (propelente 11), diclorotetrafluormetano (propelente 114), e diclorodifluormetano (propelente 12). Os propelentes HFC apropria-dos incluem tetrafluoretano (HFC-134a) e heptafluorpropano (HFC-227). O propelente compreende tipicamente 40% a 99,5%, por exemplo, 40% a 90% em peso da composição de inalação total. A formulação pode compreender excipientes, incluindo cosolventes (por exemplo, etanol) e tensoativo (por exemplo, lecitina, trioleato de sorbitano e similares). As formulações de ae-rossóis são embaladas em tubos, e uma dose apropriada é distribuída por meio de uma válvula dosadora (por exemplo, como fornecida pela Bespak, Valois ou 3M).

A administração tópica ao pulmão pode ser realizada também por uma formulação não pressurizada, tal como uma solução ou suspensão aquosa. Isto pode ser administrado por meio de um nebulizador. A adminis-tração tópica ao pulmão pode ser realizada também pelo uso de uma formu-lação de pó seco. Uma formulação de pó seco deve conter o composto da formula (I) na forma finamente dividida, tipicamente com um diâmetro médio de massa (MMAD) de 1-10 microns. A formulação deve conter tipicamente um composto topicamente aceitável tal como lactose, usualmente com ta-manho médio de partícula grande, por exemplo, um diâmetro médio de mas-sa (MMAD) de 100 um ou mais. Os sistemas de distribuição de pó exemplifi- cativos incluem SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS e CLICKHALER.

Os compostos da fórmula (I) são intencionados para ter atividade terapêutica. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um composto da fórmula (I) para uso como um medicamento.

Espera-se que os compostos da fórmula (I) sejam úteis no tra-tamento de distúrbios respiratórios incluindo COPD (incluindo bronquite crô-nica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgica, rinite, sinusite especialmente asma, bronquite crônica e COPD.

Espera-se também que os compostos da fórmula (I) sejam úteis no tratamento de certas condições que podem ser tratadas por terapia tópica ou local, incluindo conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, der-matite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secun-dária a artrite reumatoide ou osteoartrite.

Espera-se também que os compostos da fórmula (I) sejam úteis no tratamento de certas outras condições incluindo artrite reumatoide, pan-creatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores, incluindo carcinoma pulmonar de células nãopequenas, carcinoma mamário, carci-noma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno.

Assim sendo, em outro aspecto, a presente invenção fornece um composto da fórmula (I) para uso no tratamento das condições mencionadas acima, por exemplo, administrando uma quantidade terapeuticamente acei-tável do dito composto a um paciente necessitado dele.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um composto da fórmula (I) para a fabricação de um medicamento para o trata-mento das condições mencionadas acima.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento das condições mencionadas acima, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um composto da fórmula (I) ou uma sua composição farmacêutica.

A invenção estende-se também ao uso de composições/formu- lações farmacêuticas no tratamento de uma ou mais das ditas condições.

O termo "tratamento" pretende englobar profilaxia, bem como tratamento terapêutico.

Um composto da fórmula (I) pode ser administrado também em combinação com um ou mais outros ingredientes ativos, por exemplo, ingre-dientes ativos apropriados para tratar as condições mencionadas acima. Por exemplo, as combinações possíveis para o tratamento de distúrbios respira-tórios incluem combinações com esteroides (por exemplo, budesonida, di-propionato de beclometasona, propionato de fluticasona, furoato de mome- tasona, furoato de fluticasona), beta-agonistas (por exemplo, terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol) e/ou xantinas (por exemplo, teofilina). Exemplos Exemplo 1: /V-(4-({4-f3-(3-t-butil-1-p-tolil-1 H-pirazol-5-il)ureído]naftalen-1- ilóxi}metil)piridin-2-in-2-metóxi-acetamida (1) 2-Amino-4-((4-nítronaftalen-1-ilóxi)metil]-piridina (3)

Adicionou-se azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD) (8,07 ml_, 41,0 mmols) sob a forma de gotas a uma solução de 4-nitronaftol (5,17 g, 27,3 mmols), trifenilfosfina (10,75 g, 41,0 mmols) e 2-aminopiridino-4- metanol (2) (5,09 g, 41,0 mmols) em THF (50 ml_), a -15°C. A mistura foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente e os voláteis foram então removidos sob vácuo. O produto bruto foi triturado em EtOAc (150 mL), removido por filtração e lavado com EtOAc (100 mL). Uma segunda tritura- ção em MeOH (100 mL) deu 2-amino-4-[(4-nitronaftalen-1-ilóxi)metil]-piridina (3) (4,54 g, 56%) como um sólido amarelo: m/z 296 (M+H)+ (ES+). 2-Amino-4-[(4-aminoπaftaleπ-1 -il0xi)metil]-piridina (4)

Uma solução de 2-amino-4-[(4-nitronaftalen-1-ilóxi)metil]-piridina (3) (4,50 g, 15,24 mmols) em metanol (200 mL) e ácido acético glacial (200 mL) foi passada através de um reator de fluxo Thales 'H-cube' (2 mL min'1, 40°C, 55 mm 10% Pt/C Cat-Cart®, cheio de H2) e os voláteis foram então removidos sob vácuo. O produto bruto foi submetido a uma captura por SCX e liberado eluindo com solução a 1% de amónia em MeOH e o solvente foi removido sob vácuo para dar 2-amino-4-[(4-aminonaftalen-1-ilóxi)metil]- piridina (4) (3,82g, 94%) como um sólido malva: m/z 266 (M+H)+ (ES+). 1-{4-[(2-Aminopiridin-4-il)metóxi1naftalen-1-il}-3-(3-f-butil-1-p-tolil-1/7-pirazol- 5-il)-ureia (5)

Adicionou-se na forma de gotas uma solução de 3-t-butil-1-p- 15 tolil-1H-pirazol-5-amina (6) (5,91 g, 25,80 mmols) em DCM (15 mL) a uma solução de 1,T-carbonildi-imidazol (CDI) (4,18 g, 25,80 mmols) em DCM (15 mL), sob nitrogênio, durante 40 min. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma hora e depois adicionada sob a forma de gotas, sob nitrogênio, a uma solução de 2-amino-4-[(4-aminonaftalen-1-ilóxi)metil]- piridina (4) (3,80 g, 12.89 mmols). A mistura foi agitada durante a noite inteira e os voláteis foram então removidos sob vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia rápida(Biotage 120 g); eluindo com 0 a 6% de MeOH em DCM para dar 1-{4-[(2-aminopiridin-4-il)metóxi]naftalen-1 -il}-3-(3-t-butil-1 - 5 p-tolil-1 H-pirazol-5-il)-ureia (5) (4,27 g, 63%): m/z 521 (M+H)+ (ES+). /V-[4-({4-[3-(3-/-Butil-1 -p-tolil-1 H-pirazol-5-il)ureído]naftalen-1 -ilóxifmetil) piri- din-2-il]-2-metóxi-acetamida (1)

Adicionou-se cloreto de metóxi-acetila (92 μL, 1,01 mmol) a uma solução de 1 -{4-[(2-aminopiridin-4-il)metóxi]naftalen-1 -il}-3-(3-f-butil-1-p-tolil- 10 1/7-pirazol-5-il)-ureia (5) (526 mg, 0,96 mmol) e DIPEA (184 μL, 1,06 mmol) em uma mistura de DCM e DMF (10:1, 11 ml_) sob agitação. Depois de uma hora à temperatura ambiente, mais frações de DIPEA (184 pL, 1,06 mmol) e cloreto de metóxi-acetila (92 pL, 1,01 mmol) foram adicionadas sequencial-mente e a agitação foi continuada por uma hora. Uma solução de 1% de 15 amónia em MeOH (40 ml_), foi adicionada e a mistura foi agitada por 15 mi-nutos e depois concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia com coluna rápida (Biotage 40 g); eluindo com 0 a 6% de MeOH em DCM para produzir /V-[4-({4-[3-(3-f-butil-1-p-tolil-1/-/-pirazol-5- il)ureído]natalen-1-ilóxÍ}metil)piridin-2-il]-2-metóxi-acetamida (1) (286 mg, 20 49%). m/z 593 (M+H)+ (ES+).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1..27 (9 H, s), 2,39 (3 H, s), 3,32 (3 H, s), 4,08 (2H, s), 5,39 (2H, s), 6,36 (1H, s), 7,03 (1H, d), 7,28 (1H, dd), 7,36 (2H, m), 7,44 (2H, m), 7,56-7,64 (3H, m), 7,93 (1H, m), 8,30-8,35 (3H, m), 8,58 (1H, s), 8,79 (1H, s) e 1002 (1H, s). Teste Biológico Teste in vitro *1: ensaio baseado em células para MAPK alfa p38 por detecção da fosfori-lação de MAPKAP-K2 5 *2: nenhum efeito tóxico significativo observado no ensaio MTT Uma descrição destes ensaios é a seguinte:

Ensaio de Inibição de enzima

A atividade inibitória de enzima pelo composto foi determinada por transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) usan- do peptídeos sintéticos marcados com fluoróforos doadores e aceptores (Z- LYTE, Invitrogen). Resumidamente, MAPK p38 gama fosforilada recombi- nante (MAPK12 .Millipore) foi diluída em tampão HEPES, misturada com o composto nas concentrações finais desejadas e incubada por duas horas à temperatura ambiente. O peptídeo FRET (2 uM) e ATP (100 uM) foram, a seguir, adicionados à mistura enzima/composto e incubado por uma hora. Reagente de revelação (protease) foi adicionado por uma hora antes da de-tecção em uma leitora de microplacas de fluorescência. A protease especifica de sítio cliva apenas peptídeo nãofosforilado e elimina o sinal de FRET. Os níveis de fosforilação de cada reação foram calculados usando a relação da emissão de cumarina (doador) sobre a emissão de fluoresceína (aceptor), sendo que altas razões indicam alta fosforilação e baixas razões, baixos ní-veis de fosforilação. A inibição percentual de cada reação foi calculada em relação ao controle nãoinibido, e a concentração inibitória de 50% (valor de Cl5o) foi então calculada a partir da curva de resposta à concentração. No caso de MAPK p38 alfa (MAPK14: Invitrogen), a atividade da enzima foi avaliada indiretamente determinando a ativação/fosforilação da molécula a jusante, MAPKAP-K2. A proteína MAPK p38-a foi misturada com seu alvo inativo MAPKAP-K2 (Invitrogen) e o composto por duas horas à temperatura ambiente. O peptídeo FRET (2 uM), que é um alvo da fosforila- ção para MAPKAP-K2, e ATP (10 uM) foram então adicionados à mistura enzimas/composto e incubados por uma hora. O reagente de revelação foi então adicionado e a mistura foi incubada por uma hora antes da detecção por fluorescência completar o protocolo do ensaio.

Liberação de TNF-alfa induzida por LPS: potência

Células U937, uma linhagem de células monocíticas humanas, foram diferenciadas para células do tipo macrófagos por incubação com mi- ristato-acetato de forbol (PMA; 100 ng/ml) por 48 a 72 horas. Quando apro-priado, as células foram pré-incubadas com concentrações finais do com-posto por duas horas. As células foram então estimuladas com 0,1 ug/mL de LPS (a partir de E.Coli: O111:B4, Sigma) por 4 horas, e o sobrenadante foi coletado para determinação da concentração de TNFa por ELISA de sandu-íche (Duo-set, R&D Systems). THP-1, uma linhagem de células monocíticas humanas, também foi usada para este ensaio. As células THP-1 foram esti-muladas com 1 ug/mL de LPS (a partir de E.Coli: O111:B4, Sigma) por 4 horas, e o sobrenadante foi coletado para determinação da concentração de TNFa. A inibição percentual da produção de TNFa foi calculada em cada concentração do composto em teste por comparação com o controle de veí-culo, e o valor da concentração inibitória de 50% (Cl5o) foi determinado a partir de curva de resposta à concentração resultante.

Ensaio MTT

As células U937 diferenciadas foram pré-incubadas com com-posto por 4 horas em 5% de FCS ou 10% de FCS por 24 horas e 72 horas. O sobrenadante foi substituído por 200 uL de meio fresco e 10 uL de solução de estoque de MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço. Depois de uma hora de incubação, os meios foram removidos, 200 uL de DMSO foram adicionados a cada poço e as placas foram sacudidas ligeiramente por uma hora antes de ler a absorvância a 550 nm.

A perda percentual da viabilidade das células foi calculada para cada poço em relação ao tratamento com veículo (0,5% de DMSO). Conse-quentemente, um aumento aparente na viabilidade celular para o tratamento com fármaco em relação ao veículo é tabulado como uma porcentagem ne-gativa.

Teste in vivo Neutrófilos induzidos por LPS no camundongo

Camundongos não jejuados foram dosados pela via íntratraqueal com veículo ou substância em teste nos mesmos pontos nos tempos ("pré- dose") indicados com relação ao início do tratamento com LPS. No T = 0, s camundongos foram colocados dentro de uma câmara de exposição e ex-postos a LPS. 8 horas depois do desafio com LPS, os animais foram aneste-siados, a traqueia foi canulada e o BALF foi extraído infundindo e retirando 1 mL de PBS dentro dos pulmões por intermédio de um cateter traqueal. As contagens totais e diferenciais de leucócitos nas amostras do BALF foram medidas usando um hemocitômetro Neubaur. Esfregaços de citocentrifuga- ção (cytospiri) das amostras do BALF foram preparados por centrifugação a 200 rpm por 5 minutos à temperatura ambiente e corados usando o sistema corante DiffQuik (Dade Behring). As células foram contadas usando um mi-croscópio de imersão em óleo.

Os resultados estão ilustrados nas figuras 1 e 2. Os dados para números de neutrófilos são relatados como número total e diferencial (subs-tância em teste em relação ao veículo) de células por mililitro de BALF, média ± S.E.M. (n = 8).

Modelo de Fumaça de Cigarro

Camundongos A/J (machos, 5 semanas de idade) foram expostos à fumaça de cigarro (4% de fumaça de cigarro diluídos com ar comprimido) por 30 min/dia por 11 dias usando um Sistema de Experimento de Inalação de Fumaça de Tabaco para animais pequenos (Modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tóquio, Japão). As substâncias em teste foram dadas por via intranasal (35 μL de solução em 50% de DMSO/PBS) e terapeutica- mente duas vêzes ao dia por 3 dias depois da exposição final à fumaça de cigarro. Doze horas depois da última dosagem, os animais foram anestesia-dos, a traqueia foi canulada e o líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado. Os números de macrófagos e neutrófilos alveolares foram determi-nados por análise FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA) usando anticorpo anti-camundongo de MOMA2 (macrófago) ou anticorpo anti-camundongo 7/4 (neutrófilo).

Os resultados estão ilustrados na figura 3 para macrófagos alve-olares ativados e na figura 4 para neutrófilos. Os dados para números de células estão indicados como média ± SEM. O modelo de fumaça de cigarro usado para este estudo relatado como um sistema refratário a corticosteroi-des (Medicherla S. et al., (2008); J. Pharmacol. Exp. Then 324(3):921-9) e confirmou-se que o propionato de fluticasona não inibiu a acumulação de neutrófilos ou macrófagos dentro das vias aéreas a 50 μg/mL (35μl, duas vezes ao dia (b.i.d.), in), a mesma dose que produziu >80% de inibição da acumulação de neutrófilos induzida por LPS. Na figura 3: ^Diferença significativa entre exposição ao ar e exposição ao cigarro. * **P<0,001 versus Controle com fumaça de cigarro (CS) (AN- NOVA, múltipla comparação de Dunnett), n = 6-11 Na figura 4: * ##Diferença significativa entre exposição ao ar e exposição à fumaça de cigarro. * P<0,05 ou ***P<0,001 versus Controle com fumaça de cigarro (CS) (ANNOVA, múltipla comparação de Dunnett), n = 6-11

Modelo de desafio com ovalbumina / infecção com parainfluenza (modelo in vivo para resistência a esteroides) Porquinhos-da-índia Dunkin-Hartley machos (300-350 g, n = 6/grupo) foram sensibilizados com 100 μg de ovalubumina (OVA) + 100 mg AI2(OH)3 em 1 mL de solução salina normal (intraperitoneal) nos Dias 2 e 6.

Vírus parainfluenza (PIV-3; 106 unidades infecciosas) ou meio sem vírus foi instilado por via nasal nos Dias 11 e 12. Os animais foram tratados com pro-pionate de fluticasona nebulizado em uma dose de 1,5 mg por dia. Estudos iniciais estabeleceram que esta dose de propionato de fluticasona inibia mu-danças da função pulmonar mediadas por ovalbumina em animais sensibili-zados tratados com meio PIV3. O Exemplo 1 (4,5 mg por dia) ou o veículo (DMSO:etanol:solução salina, 30:30:40%) a partir dos Dias 10-15. Todos os animais foram desafiados por uma hora com OVA nebulizada (10 μg/mL) no Dia 15, e medições repetidas da condutância específica das vias aéreas (sGaw) foram feitas durante um período de 24 horas usando pletismografia de corpo inteiro. As medições de sGaw depois do desafio com OVA são plo- tadas como % de mudança a partir da linha basal. Vide figura 5. figura 5 Dados estão indicados como a média de 6 observações; (•) PIV3 + tratamento com veículo; (■) PIV3 + tratamento com propionato de fluticasona; (A) PIV3 + tratamento com Exemplo 1 Sinopse

Os estudos biológicos in vitro demonstram que o composto da fórmula (I) é um inibidor potente dos subtipos alfa e gama de quinase MAP p38 com boa eficácia em um modelo in vitro de atividade anti-inflamatória (liberação de TNF-alfa induzida por LPS a partir de células U937 diferenciadas e células THP-1). Pelos resultados de MTT pode-se concluir que o composto não apresenta toxicidade celular manifesta nas concentrações usadas.

Os estudos biológicos in vivo demonstram que o composto da fórmula (I) é eficaz em inibir a acumulação de neutrófilos induzida por LPS em um modelo animal, com uma longa duração do efeito, como indicado pela inibição significativa mesmo em 12 ou mais horas de pré-dosagem. Além disso, o composto da fórmula (I) demonstrou ser eficaz em dois modelos in vivo de inflamação resistente a esteroides.

Neste relatório descritivo inteiro e nas reivindicações que se se-gue, a menos que o contexto requeira o contrário, o termo "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", deve ser entendido como inferindo a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros, ou grupo de etapas, assinalados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros, ou grupo de etapas Todas patentes e pedidos de patente aqui referidas são incorpo- radas como referência em sua totalidade. 0 pedido de patente do qual este relatório descritivo e as reivin- dicações fazem parte pode ser usado como uma base para prioridade em relação a qualquer pedido de patente subsequente. As reivindicações desse pedido de patente subsequente podem ser direcionadas para qualquer ca-racterística ou combinação de características aqui descritas. Elas podem tomar a forma de reivindicações de produto, composição, processo, ou uso e podem incluir, a titulo exemplificative e sem limitações, as reivindicações. Abreviaturas Ac acila ATP 5'-trifosfato de adenosina BALF Líquido da lavagem broncoalveolar BSA CatCart® albumina de soro bovino cartucho catalítico (marca registrada) CDI carbonildi-imidazol DCM diclorometano DIAD azodicarboxilato de di-isopropila DMF dimetilformamida DMSO sulfóxido de dimetila COPD doença pulmonar obstrutiva crônica DIAD azodicarboxilato de di-isopropila DIBAL-H hidreto de di-isobutil-alumínio DIPEA /V-etil-/V-isopropilpropan-2-amina Et etila FCS soro fetal vitelínico h hora(s) HRP peroxidase de rábano-silvestre JNK quinase c-Jun do terminal N MAPK proteína quinase ativada por mitógenos Me metila PBS solução salina tamponada com fosfato PPh3 trifenilfosfina RT temperatura ambiente SCX troca catiônica sobre suporte sólido SDS dodecil-sulfato de sódio TFA ácido triflúor-acético THF tetra-hidrofurano TN Fee fator de necrose tumoral alfa TMB 3.3', 5.5'-tetrametilbenzidina MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

Claims (6)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1, em combinação com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

3. Composto da fórmula (I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

4. Processo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um composto da fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros, compreendendo a reação de um 15 composto da fórmula (II): com um composto da fórmula (III): em que LG1 representa um grupo de saída.

5. Processo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um composto da fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, incluindo todos os seus tautômeros, compreendendo a reação de um composto da fórmula (X): com um composto da fórmula (IV): e um composto da fórmula (XI): em que LG4 e LG5 representam, cada um, independentemente, grupos de saída.

6. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (X): ou um seu derivado protegido, ou um seu sal.