BRPI0921150A2 - métodos e composições anti-cxcr1 - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS ANTI-CXCR1. Trata-se de métodos de tratamento de câncer mediante a administração de um inibidor da via de IL8-CXCR1 (por exemplo, um anticorpo anti-CXCR1 ou Repertaxina) sozinho ou em combinação com um agente quimioterápico adicional, de tal modo que as células de câncer não-tumorigênicas e tumorigênicas em um indivíduo sejam exterminadas. A presente invenção também fornece composições e métodos para a detecção da presença de e o isolamento de células tronco de tumor sólido em um paciente (por exemplo, com base na presença de CXCR1 ou FBXO21).

Description

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES ANTI-OXCR1” ] REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS . O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório Nº U.S. 61/113.458, depositado em 11 de Novembro de 2008, incorporado aqui por referência em — suatotalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO

PELO GOVERNO FEDERAL Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob os números de concessão CAG66233, CA101860 e 5 P 30 CA46592, concedidos pelo NIH. O governo tem certos direi- tosnainvenção.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos de tratamento do câncer pela administração de um inibidor da via IL&E-CXCR1 (por exemplo, um anticorpo anti-cCXCR1 ou Repertaxina) sozinho ou em combinação com um agente quimioterapêutico adicional, de tal forma que — células cancerosas não-tumorais e tumorais em um indivíduo são mortas. A presente inven- ção também fornece composições e métodos para detectar a presença e isolar células- » tronco de tumores sólidos em um paciente (por exemplo, com base na presença de CXCR1 ou FBXO21).

7 FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O câncer continua a ser a segunda maior causa de mortalidade neste país, resul- tando em mais de 500.000 mortes por ano. Apesar dos avanços na detecção e no tratamen- to, a mortalidade por câncer permanece alta. Apesar dos notáveis progressos na compreen- são da base molecular do câncer, esse conhecimento ainda não foi traduzido em estratégias terapêuticas eficazes.

Em particular, o câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres norte- americanas, com aproximadamente uma em cada nove mulheres desenvolvendo câncer de mama em sua vida. Infelizmente, o câncer de mama metastático é ainda uma doença incu- rável. A maioria das mulheres com câncer de mama metastático sucumbe à doença.

As formas tradicionais de tratamento (radioterapia, quimioterapia e terapia hormo- nal), apesar de úteis, têm sido limitadas pelo surgimento de células cancerosas resistentes ao tratamento. É evidente que são necessárias novas abordagens para identificar alvos para o tratamento de câncer de mama metastático e câncer em geral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos de tratamento do câncer pela administração de um inibidor da via IL8-CXCR1 (por exemplo, um anticorpo anti-CXCR1 ou Repertaxina) sozinho ou em combinação com um agente quimioterapêutico adicional, de tal forma que células cancerosas não-tumorais e tumorais em um indivíduo são mortas. A presente inven-

. ção também fornece composições e métodos para detectar a presença e isolar células- tronco de tumores sólidos em um paciente (por exemplo, com base na presença de CXCR1 - ou FBXO21). Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos de tratamento do câncer, compreendendo: administração de um antagonista da via IL8-CXCR1 e um agente quimioterápico complementar a um indivíduo. Em certas modalidades a presente invenção fornece métodos para reduzir ou eliminar células-tronco cancerosas e células cancerosas não-tumorais em um indivíduo, compreendendo: a administração de Repertaxina ou deriva- do do mesmo a um indivíduo em condições tais que pelo menos uma parte das células- tronco cancerosas e pelo menos uma parte das células cancerosas não-tumorais são mor- tas. Em outras modalidades, a presente invenção fornece métodos para reduzir ou eliminar células-tronco cancerosas e células cancerosas não-tumorais em um indivíduo, compreen- dendo: a administração de um antagonista da via IL&E-CXCR1 e um agente quimioterápico complementar a um indivíduo em condições tais que pelo menos uma parte das células- tronco cancerosas e pelo menos uma parte das células cancerosas não-tumorais são mor- tas. Em modalidades específicas a presente invenção fornece composições ou kits que in- - cluem um antagonista da via IL&E-CXCR1 e um agente quimioterapêutico adicional. Em certas modalidades o antagonista da via ILG-CXCR1 compreende um agente 7 que bloqueia especificamente a ligação de IL8 com CXCR1. Em algumas modalidades o agente se liga a (é específico para) CXCR1, mas não se liga a CXCR2. Em outras modali- dades o agente se liga a CXCR1. Em modalidades específicas o agente compreende um anticorpo anti-CXCR1t ou fragmento de anticorpo. Em modalidades adicionais o agente compreende Repertaxina ou um derivativo deste. Em modalidades adicionais o agente qui- mioterápico adicional compreende um composto anti-mitótico. Em certas modalidades o composto anti-mitótico é selecionado a partir do grupo que consiste em: docetaxel, doxorru- bicina, paclitaxel, fluoruracil, vincristina, vinblastina, nocodazol, colchicina, podofillotoxina, steganacina e combretastatina. Em outras modalidades o composto anti-mitótico é um alca- lóide catharalthus (por exemplo, vincristina e vinblastina); ou um benzimidazol carbamato, como nocodazol; ou colquicina ou compostos relacionados, como podofillotoxina, steganaci- —naoucombretastatina; ou um taxano, como paclitaxel e docetaxel. Em certas modalidades o agente quimioterápico adicional compreende docetaxel.

Em modalidades específicas o indivíduo tem um tipo de câncer que, quando tratado com quimioterapia, aumentou os níveis da produção de IL-8 (por exemplo, o que provoca um aumento no número de células-tronco cancerosas da motilidade). Em algumas modali- dades o indivíduo tem um tipo de câncer selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de células pequenas e adenocarcinoma de esôfa-

go.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece métodos de detecção de célu- . las-tronco de tumores sólidos, compreendendo: a) fornecimento de: i) uma amostra retirada de um tumor de um indivíduo e ii) um anticorpo ou fragmento de anticorpo (ou outra molécu- lade ligação) específico para a proteina CXCR1 ou a proteína FBXKO21 (ou outra proteína da Tabela 1); e b) por em contato a amostra de tecido com o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo em condições tais que a presença ou a ausência de células-tronco de tumor sólido de CXCR1+ ou FBXO21+ são detectadas.

Em modalidades específicas o anticorpo ou fragmento de anticorpo é conjugado em uma molécula de sinalização.

Em outras modalidades a molécula de sinalização compreen- de uma molécula fluorescente.

Em outras modalidades a molécula de sinalização compre- ende uma enzima que pode catalisar uma reação de produção de cor na presença de um substrato colorimétrico.

Em certas modalidades o método inclui ainda por a amostra em con- tato com um anticorpo secundário ou fragmento de anticorpo secundário específico para o anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Em outras modalidades o anticorpo secundário ou fragmento de anticorpo secundário é composto por uma molécula de sinalização.

Em moda- - lidades específicas nenhuma outra proteína ou ácido nucleico são ensaiados a fim de de- terminar a presença ou a ausência de células-tronco de tumor sólido CXCR1 ou FBXO21+. 7 Em modalidades adicionais o tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em: tumor de câncer de próstata, tumor de câncer de ovário, tumor de câncer de mama, melanoma, tumor de câncer de pulmão de células não-pequenas, tumor de câncer de pulmão de células pequenas e tumor de adenocarcinoma de esôfago.

Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos de enriquecimento para uma população de células-tronco de tumores sólidos, incluindo: a) dissociar um tumor sólido para gerar células dissociadas; b) por as células dissociadas em contato com um rea- gente que se liga a CXCR1 ou FBXO21 (ou outra proteína da Tabela 1); e c) selecionar cé- lulas que se ligam ao reagente em condições tais que uma população enriquecida para célu- las-tronco de tumores sólidos é gerada.

Em certas modalidades nenhum reagente adicional é empregado para gerar a po- pulação enriquecida para células-tronco de tumor sólido.

Em algumas modalidades o tumor selecionado a partir do grupo que consiste em: tumor de câncer de próstata, tumor de cân- cer de ovário, tumor de câncer de mama, melanoma, tumor de câncer de pulmão de células não-pequenas, tumor de câncer de pulmão de células pequenas e tumor de adenocarcino- ma de esôfago.

Em modalidades adicionais o reagente é um anticorpo ou fragmento de an- ticorpo (por exemplo, fragmento Fab). Em outras modalidades o reagente é conjugado em um fluorocromo ou partículas magnéticas.

Em outras modalidades a seleção de células é realizada por citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência, filtra-

ção, separação por coluna de afinidade, ou seleção magnética. ' Em modalidades específicas a presente invenção fornece uma população enrique- E cida de células-tronco de tumores sólidos isoladas pelos métodos descritos aqui.

Em algumas modalidades a presente invenção fornece populações isoladas de cé- —lulas-tronco cancerosas que são: a) tumorigênicas e b) CXCR1+ ou FBXO21+. Em certas modalidades as células-tronco cancerosas são células-tronco cancerosas selecionadas a partir do grupo que consiste em: células-tronco de câncer de próstata, células-tronco de câncer de ovário, células-tronco de câncer de mama, células-tronco de câncer de pele, célu- las-tronco de câncer de pulmão de células não-pequenas, células-tronco de câncer de pul- mão de células pequenas e células-tronco de adenocarcinoma de esôfago.

Em outras mo- dalidades a população compreende pelo menos 60% de células-tronco cancerosas e menos de 40% de células tumorais não-tumorigênicas.

Em outras modalidades as células-tronco cancerosas: são enriquecidas pelo menos duas vezes mais em comparação a células tumo- rais não fracionadas não-tumorigênicas (por exemplo, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 15 ..,10vezes,... 100 vezes, ... 1.000 vezes). Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos para obter, a partir - de um tumor, uma composição celular que compreende células-tronco cancerosas e células tumorais não-tumorigênicas, em que pelo menos 60% são células-tronco tumorigênicas e í 40% ou menos são células tumorais não-tumorigênicas, o método compreendendo: a) obter uma mistura dissociada de células tumorais de um tumor; b) separar a mistura de células tumorais em uma primeira fração, compreendendo pelo menos 60% de células-tronco can- cerosas e 40% ou menos de células tumorais não-tumorigênicas e uma segunda fração de células tumorais empobrecidas de células-tronco cancerosas em que a separação é feita pondo a mistura em contato com um reagente contra CXCR1 ou FBXO21; e c) demonstrar quea primeira fração é tumorigênica através de: i) injeção em série em um primeiro animal hospedeiro e que a segunda fração é não-tumorigênica através de uma injeção em série em um segundo animal hospedeiro.

Em certas modalidades a separação é realizada por citome- tria de fluxo, classificação celular ativada por fluorescência (FACS), filtração, cromatografia por afinidade ou seleção magnética.

Em algumas modalidades a separação é feita por aná- lisecom separadores de células ativadas por fluorescência (FACS). Em modalidades específicas a presente invenção fornece métodos de seleção de um tratamento para um paciente com um tumor sólido, compreendendo: (a) obter uma a- mostra do paciente; (b) identificar a presença de uma célula-tronco de tumor sólido CXCOR1+ ou FBXO21+ na amostra; e (c) selecionar um tratamento para o paciente que direcione célu- las-tronco de tumor sólido CXCR1+ ou FBXO21+ (por exemplo, selecionando o uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-CXCR1). Em certas modalidades as células-tronco de tumor sólido CXCR1+ ou FBXO21+ são células-tronco cancerosas selecionadas a partir do grupo que consiste em: células-tronco cancerosas da próstata, células-tronco cancerosas ] do ovário, células-tronco cancerosas da mama, células-tronco cancerosas da pele, células- - tronco cancerosas de pulmão de células não-pequenas, células-tronco cancerosas de pul- mão de células pequenas e células-tronco de adenocarcinoma de esôfago.

5 Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos para a seleção de um composto, compreendendo: a) expor uma amostra que inclui uma célula-tronco cancero- sa CXCR1+ ou FBXO21+ a um composto anti-neoplásico candidato, em que o composto anti-neoplásico candidato compreende um antagonista de CXCR1 ou FBXO21 ou um anta- gonista da via de sinalização IL8-CXCR1; e b) detectar uma alteração na célula em resposta aocomposto.

Em certas modalidades a amostra compreende uma mamoesfera não aderente. Em outras modalidades o antagonista de CXCR1 ou FBXO21, ou o antagonista da via de sinali- zação IL8-CXCR1 compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas moda- lidades o antagonista de CXCR1 é um derivado de Repartaxina. Em outras modalidades a detecção compreende detectar a morte celular da célula tumorigênica da mama. Em outras modalidades os métodos compreendem ainda a identificação do agente anti-neoplásico - candidato como capaz de matar células tumorigênicas, assim como células cancerosas não- tumorigênicas. 7 Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos para determinar a capacidade de um composto de ensaio em inibir a tumorigênese de células-tronco de tumor sólido que compreendem: a) obter células-tronco de tumor sólido enriquecidas, em que as células-tronco de tumor sólido: i) são enriquecidas pelo menos duas vezes em comparação com células tumorais não fracionadas; e ii) expressam CXCR1 ou FBXO21; b) expor um primeiro conjunto, mas não um segundo conjunto, de células-tronco de tumor sólido a um — composto de teste; c) injetar o primeiro conjunto de células-tronco de tumor sólido em um primeiro animal hospedeiro e injetar o segundo conjunto de células-tronco de tumor sólido em um segundo animal hospedeiro; e d) comparar um tumor, se presente, no primeiro ani- mal com um tumor formado no segundo animal a fim de determinar se o composto de en- saio inibe a formação do tumor. Em modalidades específicas o composto de ensaio é um inibidor de CXCR1 ou FBXO21, ou um inibidor da via ILE-CXCR1.

Em outras modalidades a presente invenção fornece métodos para determinar a capacidade de um composto de ensaio para inibir a tumorigênese de células-tronco de tu- mor sólido que compreende: a) obter uma amostra que compreende pelo menos 60% de células-tronco de tumor sólido, em que as células-tronco de tumor sólido expressam CXCR1 — ouFBXO21;b)injetaras células-tronco de tumor sólido em um primeiro e um segundo ani- mais; c) tratar o primeiro animal hospedeiro com um composto de ensaio, e não tratar o se- gundo animal hospedeiro com o composto de ensaio; e d) comparar um tumor, se presente,

no primeiro animal com um tumor formado no segundo animal, a fim de determinar se o ' composto de ensaio inibe a formação do tumor. Em outras modalidades o composto de en- - saio é um inibidor de CXCR1 ou FBXO21 ou um inibidor da via ILBG-CXCR1.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra que as populações de células ALDEFLUOR-positivas de linha- gens de células de câncer de mama (MDA-MB-453, SUM159) têm propriedades de célula- tronco cancerosa. A-B, G-H. Análise por citometria de fluxo representativa da atividade en- zimática ALDH em células MDA-MB-453 (A-B) e SUM159 (G-H). Um ensaio ALDEFLUOR foi realizado conforme descrito no Exemplo 1 abaixo. (C, 1) A população ALDEFLUOR- positiva foi capaz de gerar tumores em camundongos NOD/SCID que recapitularam a hete- rogeneidade fenotípica do tumor inicial. (F, L) Curvas de crescimento do tumor foram plota- das para números diferentes de células injetadas (para MDA-MB-453: 50.000 células, 5.000 células e 500 células e para SUM159: 100.000 células, 10.000 células e 1.000 células) e para cada população (ALDEFLUOR-positiva, ALDEFLUOR-negativa, não separada). Cinéti- cade crescimento do tumor correlacionada com a latência e o tamanho da formação do tu- mor e o número de células ALDEFLUOR-positivas (F, L). (D, J) marcação H&E do sítio de - injeção de células ALDEFLUOR-positivas, revelando a presença de células tumorais (D: sítio de injeção de céluias ALDEFLUOR-positivas MDA-MB-453, e J: sítio de injeção de cé- lulas ALDEFLUOR-positivas SUM59). (E, K) O sítio de injeção de céluias ALDEFLUOR- positivas continha apenas Matrigel residual, células apoptóticas e tecido de camundongos (E: sítio de injeção de células ALDEFLUOR-negativas MDA-MB-453, e K: sítio de injeção de células ALDEFLUOR-negativas SUM59). Os dados representam a média + SD. A Figura 2 mostra a classificação de populações ALDEFLUOR-positivas e ALDEFLUOR-negativas isoladas de linhagens celulares da mama com base na “assinatura de célula-tronco cancerosa”. Figura 2A. Agrupamento hierárquico de 16 amostras com base em uma assinatura da expressão de 413 genes. Cada linha da matriz de dados representa um gene e cada coluna representa uma amostra. Observe a separação entre as amostras ALDEFLUOR-positivas (nomes sublinhados) e negativas (nomes não-sublinhados) com os 413 genes para 15 das 16 amostras. Alguns genes incluídos na assinatura são referencia- dos por sua sigla HUGO, conforme usada em “Entrez Gene' (Genes reprimidos nas popula- ções ALDEFLUOR-positivas são marcados em verde e genes aumentados nas populações ALDEFLUOR-positivas são marcados em vermelho). Fig. 2B-C. Para confirmar os resulta- dos de expressão gênica, em um conjunto de cinco linhagens de células cancerosas da mama classificadas pelo fenótipo ALDEFLUOR, a expressão de cinco genes discriminado- res super-expressos em populações ALDEFLUOR-positivas (CXKXCR1/ILSW8RA, FBXO21, NFYA, NOTCH2 e RAD51L1) foram medidos por RT-PCR quantitativo. Os níveis de expres- são de RT-PCR quantitativo de CXCR1 e FBXO21 são apresentados nesta figura. Os níveis de expressão gênica medidos por RT-PCR quantitativo confirmam os resultados obtidos utilizando micro-matrizs de DNA com um aumento do nível de RNAm CXCR1 e FBXO21 na . população ALDEFLUOR-positiva em comparação com a população ALDEFLUOR-negativa (p<0,05).

A Figura 3 mostra o papel do eixo IL8/CXCR1 na regulação das células-tronco can- cerosas da mama. A. Células que expressam CXCR1 estão contidas na população ALDEFLUOR-positiva. As populações ALDEFLUOR-positiva e negativa de quatro linhagens celulares da mama diferentes (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453, BrCa-MZ-01) foram iso- ladas por FACS, fixadas e analisados quanto a expressão da proteína CXCR1 por imunoco- loração e análise FACS. Células ALDEFLUOR-positivas foram altamente enriquecidas em células CXCR1-positivas em comparação com a população ALDEFLUOR-negativa. B. Efeito do tratamento com IL8 na formação de tumoroesfera de três linhagens de células diferentes (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453). O tratamento com IL8 aumentou a formação de tumo- roesferas primária e secundária de uma forma dose-dependente. C. Efeito do tratamento —comlIL8na população ALDEFLUOR-positiva de quatro linhagens de células diferentes culti- vadas em condições aderentes. IL8 aumentou a população ALDEFLUOR-positiva de uma - forma dose-dependente da dose em cada uma das quatro linhagens de células analisadas (* p<0,05/ ** p<0,01, diferenças estatisticamente significativas do grupo de controle).

7 A Figura 4 mostra que as células ALDEFLUOR-positivas exibem maior potencial —metastático. A. O eixo IL8G/CXCR1 está envolvido na invasão da célula-tronco cancerosa. O papel do eixo IL8/CXCR1 na invasão foi avaliado por um ensaio de invasão Matrigel usando soro ou IL8 como atrativo para três linhagens de células diferentes (HCC1954, MDA-MB- 453, SUM159). Células ALDEFLUOR-positivas foram de 6 a 20 vezes mais invasivas do que as células ALDEFLUOR-negativas (p<0,01). Ao utilizar IL8 (100 ng/ml) como atrativo, obser- —vou-seque um aumento significativo de células ALDEFLUOR-positivas estavam invadindo o Matrigel em comparação com o soro como atrativo (p<0,05). Em contraste, IL8 não teve e- feito na capacidade invasiva da população ALDEFLUOR-negativa. B-M. A população ALDEFLUOR-positiva apresentou aumento do potencial metastático. B-D. Quantificação do fluxo de fótons normalizado medido em intervalos semanais após a inoculação de 100.000 células infectadas com luciferase de cada grupo (ALDEFLUOR-positiva, ALDEFLUOR- negativa, não separada). E-J Detecção de metástase utilizando o software de imagem por bioluminescência (E, G, |: Camundongos virados para baixo; F, H, J: Camundongos virados para cima). Camundongos inoculados com célutas ALDEFLUOR-positivas desenvolveram várias metástases localizadas em diferentes sítios (osso, músculo, pulmão, tecido mole) e exibiram uma emissão maior de fluxo de fótons do que os camundongos inoculados com células não separadas, que desenvolveram não mais do que uma metástase por camun- dongo. Em contraste, os camundongos inoculados com células ALDEFLUOR-negativas de-

senvolveram apenas uma pequena metástase ocasional, que antes era restrita aos linfono- ' dos. K-M. Confirmação histológica, por marcação H&E, de metástase no osso (K), tecido . mole (L) e músculo (M) resultante da injeção de células ALDEFLUOR-positivas. A Figura 5 mostra o efeito da inibição de CXCR1 na viabilidade de células tumorais (Fig. 5A), bem como na viabilidade de células-tronco cancerosas (Fig. 5B).

A Figura 6 mostra que o tratamento com Repertaxina induz um efeito espectador mediado pela sinalização do FAS-ligante/FAS e, especificamente, mostra que a inibição do crescimento celular induzida pelo tratamento com Repertaxina foi parcialmente resgatada pela adição de um antagonista de FAS e que as células tratadas com um agonista de FAS exibiram uma inibição do crescimento celular semelhante à das células tratadas com Reper- taxina.

A Figura 7 mostra a ativação de FAK, AKT e FOXOA3 sem o tratamento com Re- pertaxina (7A) e na presença de Repertaxina (7B).

A Figura 8 mostra o efeito de Repertaxina, docetaxel, ou a combinação dos mes- mosem uma linhagem de células de câncer de mama (8A, SUM159) e três xenoenxertos de câncer de mama humanos gerados a partir de diferentes pacientes (8B, MC1; 8C, UM2; e - 8D, UM3). A Figura 9 mostra o efeito de Repertaxina, docetaxel, ou do tratamento combinado q na população de células-tronco cancerosas conforme avaliado pelo ensaio ALDEFLUOR em váriaslinhagens celulares, incluindo SUM159 (9A), MC1 (9B), UM2 (9C), UM3 (9D).

A Figura 10 mostra o efeito de Repertaxina, docetaxel, ou a combinação dos mes- mos em diluições em série de tumores primários (10A. SUM159, 10B. MC1, 10C. UM2, 10D. UM3) que foram implantados na gordura mamária de camundongos NOD-SCID secundá- rios.

A Figura 11 mostra que o tratamento com Repertaxina reduz o potencial metastáti- co da linhagem de células SUM159. A Figura 11A mostra uma quantificação do fluxo de fó- tons normalizado medido em intervalos semanais após a inoculação com células SUM 159 administradas por via intracardíaca. A formação de metástase foi monitorada através de imageamento por bioluminescência (11B: Camundongos tratados com solução salina; 11C: Camundongos tratados com Repertaxina).

A Figura 12 mostra representações da sobreposição entre a subpopulação ALDEFLUOR-positiva e a subpopulação CXCR1-positiva (superior) ou subpopulação CXCR2-positiva (inferior) de células SUM159. B-C. Células SUM159 foram cultivadas em condições aderentes e tratadas com repertaxina (100nM) ou dois anticorpos de bloqueio específicos para CXCR1 (10ug/ml) ou CXCR2 (10ug/ml). Depois de três dias, o efeito sobre a população de células-tronco cancerosas foi analisado utilizando o ensaio ALDEFLUOR (B) a viabilidade celular foi avaliada após cinco dias de tratamento utilizando o ensaio MTT (C).

Uma redução significativa da população ALDEFLUOR-positiva e da viabilidade celular foi ' observada após o tratamento com repertaxina ou anticorpo anti-CXCR1. Em contraste, ne- - nhum efeito significativo foi observado com o anticorpo anti-CXCR2. D.

Após 4 dias de tra- | tamento, o número de células apoptóticas foi avaliado utilizando um ensaio TUNEL. 36% das células apoptóticas (marcadas em verde) foram detectadas em células tratadas com repertaxina em comparação com os controles, onde a maioria de células viáveis (marcadas em azul) estavam presentes.

E-F.

Para determinar se a morte celular foi mediada através de um efeito espectador, populações CXCR1-positivas e CXCR1-negativas foram classificadas quanto ao fluxo e cada população tratada com várias concentrações de repertaxina (D). Uma diminuição da viabilidade celular em populações CXCR1-positivas e populações não diferenciadas foi detectada, enquanto nenhum efeito foi observado na população CXCR1- negativa (E). Meio condicionado dialisado (dCM) a partir de células CXCR1-positivas trata- das por três dias com repertaxina foi utilizado para tratar populações CXCR1-positivas, CXCR1-negativas, ou não separadas.

Diluições em série do meio condicionado dialisado foram utilizadas (Controle, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). Após dois dias de tratamento a viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio MTT.

Uma diminuição maciça da viabili- . dade celular foi observada em ambas as populações CXCR1-negativa e não separada, en- quanto nenhum efeito foi observado na população CXCR1-positiva (F). " A Figura 13 mostra a tumorigenicidade das populações celulares ALDEFLUOR- positivas/CXCR1-positivas e ALDEFLUOR-positivas/CXCR1-negativas da linhagem celular SUM159. A.

Curvas de crescimento do tumor foram plotadas para números diferentes de células injetadas (50.000 células, 5.000 células, 1.000 células e 500 células) e para cada população (ALDEFLUOR-positiva/CXCR1-positiva, ALDEFLUOR-positiva/CXCR1-negativa). Ambas as populações de células geraram tumores.

Cinética de crescimento do tumor corre- —lacionada com a latência e o tamanho da formação do tumor e o número de células injeta- das.

B-C.

Tumores gerados pela população ALDEFLUOR-positiva/CXCR1-positiva reconsti- tuíram a heterogeneidade fenotípica do tumor inicial após passagens seriadas, enquanto a população ALDEFLUOR-positiva/CXCR1-negativa deu origem a tumores contendo apenas células ALDEFLUOR-positiva/CXCR1-negativa.

Transplantamos a população de ambas as —célulasportrêspassagens.

A Figura 14 mostra o efeito do bloqueio de CXCR1 na formação da tumoresfera.

Células SUM159 e HCC1954 foram cultivadas em condições aderentes e tratadas por três dias com repertaxina (100nM), um anticorpo de bloqueio anti-CXCR1 (10pug/ml), ou um anti- anticorpo de bloqueio anti-CXCR2 (10ug/ml). Após três dias de tratamento as células foram — destacadas e cultivadasem suspensão.

O número de tumoresferas formadas após 5 dias de cultura foi avaliado.

Resultados similares foram observados para ambas as linhas celulares com uma diminuição significativa na formação de tumoresfera primária e secundária nas condições tratadas com repertaxina e anti-CXCR1 em comparação com os controles. Em contraste, o anticorpo de bloqueio anti-CXCR2 não teve nenhum efeito na formação da tu- - moresfera.

A Figura 15 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na viabilidade celular de linhagens de células SUM159, HCC1954 e MDA-MB-453. Três linhagens de células diferen- tes (SUM159, HCC1954, MDA-MB-453) foram cultivadas em condições aderentes e tratadas com repertaxina (100nM). A viabilidade celular foi avaliada após um, três e cinco dias de tratamento utilizando ensaio MTT. Uma diminuição da viabilidade celular foi observada após três dias de tratamento para as linhagens celulares SUM159 e HCC1954. No entanto, a re- pertaxina não teve efeito na viabilidade de células MDA-MB 453.

A Figura 16 mostra o efeito do bloqueio de CXCR1 na população ALDEFLUOR- positiva in vitro. A-B. Células HCC1954 (A) e MDA-MB-453 (B) foram cultivadas em condi- ções aderentes e tratadas com repertaxina (100nM) ou dois anticorpos de bloqueio especiífi- cos para CXCR1 (10ug/ml) ou CXCR2 (10ug/ml). Após três dias o efeito na população de células-tronco cancerosas foi analisado através de ensaio ALDEFLUOR. Para HCC1954, uma redução significativa da população ALDEFLUOR-posiítiva e da viabilidade celular foi - observada após o tratamento com repertaxina ou anticorpo anti-CXCR1. Em contraste, ne- nhum efeito significativo foi observado com o anticorpo anti-CXCR2 (A). Para MDA-MB-453, ' nenhum efeito na população ALDEFLUOR-positiva foi observado (B).

A Figura 17 mostra que o tratamento com repertaxina induz um efeito espectador mediado pela sinalização FAS/FAS-ligante. A. Para determinar se o efeito mortal espectador induzido pelo tratamento com repertaxina foi mediado pelo FAS-ligante, o nível de FAS- - ligante solúvel no meio foi medido utilizando um ensaio ELISA. Após 4 dias de tratamento, um aumento maior do que de quatro vezes do FAS-ligante solúvel foi detectado no meio de —célulastratadas com repertaxina em comparação aos controles não tratados. B. O nível de RNAm do FAS-ligante foi medido por RT-PCR e confirmou o aumento da produção de FAS- ligante após tratamento com repertaxina. Resultados semelhantes foram observados após 4 dias de tratamento com um agonista de FAS que ativa a sinalização de FAS, com um au- mento de cinco vezes do RNAm do FAS-ligante em comparação ao controle. C. Células SUMI159 foram cultivadas em condições aderentes e tratadas com repertaxina apenas ou em combinação com um ligante anti-FAS. A inibição do crescimento celular induzida pelo tratamento com Repertaxina foi parcialmente resgatada pela adição do ligante anti-FAS. Células tratadas com um agonista de FAS exibiram inibição do crescimento celular seme- lhantes à das células tratadas com repertaxina apenas. D-E. O efeito do tratamento com repertaxina apenas ou em combinação com um ligante anti-FAS e o tratamento de um ago- nista de FAS na população CXCR1-positiva e ALDEFLUOR-positiva foi analisado. A diminu- ição acentuada na população CXCR1-positiva e ALDEFLUOR-positiva induzida pelo trata-

mento com repertaxina não foi resgatada pelo ligante anti-FAS e o tratamento com o agonis- ' ta de FAS produziu aumentos de dez vezes e três vezes no percentual da população . CXCR1-positiva e ALDEFLUOR-positiva, respectivamente.

A Figura 18 mostra o efeito do agonista de FAS em células CXCR1-positivas e CXCR1-negativas.

Populações CXCR1-positivas e CXCR1-negativas foram classificadas quanto ao fluxo e cada população tratada com várias concentrações de agonista de FAS.

Uma diminuição da viabilidade celular em populações CXCR1-negativa e não separada foi detectada, enquanto nenhum efeito foi observado na população CXCR1-positiva.

A Figura 19 mostra a análise da expressão da proteína CXCR1 no tronco da mama —normal/população progenitora e o efeito do tratamento com IL-8 na formação da mamoesfe- ra.

A.

A população ALDEFLUOR-positiva e negativa de células epiteliais normais da mama isoladas de redução de mamoplastias foi isolada por FACS, fixada e analisada quanto a ex- pressão da proteína CXCR1 por imunocoloração e análise por FACS.

Células ALDEFLUOR- positivas foram altamente enriquecidas em células CXCR1-positivas em comparação com a população ALDEFLUOR-negativa.

B-C.

Efeito do tratamento com IL8 na formação da ma- moesfera.

O tratamento com IL8 aumentou a formação das mamoesferas primária (B) e se- - cundária (C) de maneira dose-dependente.

A Figura 20 mostra o efeito do tratamento com repertaxina nas células epiteliais 7 mamárias normais.

A.

Células epiteliais mamárias normais isoladas das mamoplastias de redução foram cultivadas em condição aderente e tratadas com repertaxina (100NM ou 500nM) ou agonista de FAS (500ng/ml). Após cinco dias de tratamento a viabilidade celular foi avaliada utilizando MTT.

O tratamento com repertaxina ou agonista de FAS não teve efei- . to na viabilidade das células epiteliais mamárias normais cultivadas em condições aderen- tes, mesmo quando altas concentrações de repertaxina (500nm) foram utilizadas.

B.

O nível de FAS-ligante solúvel foi avaliado por ELISA no meio de células epiteliais mamárias nor- mais tratadas com repertaxina.

Após 4 dias de tratamento, um aumento do FAS-ligante so- lúvel foi detectado em meio de células tratadas.

C.

Análise da expressão de FAS/CD95 nas células epiteliais mamárias normais por análise FACS.

Nenhuma expressão FAS/CD95 foi detectada nas células epiteliais mamárias normais cultivadas em condição aderente.

D.

Efei- todo tratamento com repertaxina na formação da mamoesfera.

Células epiteliais mamárias normais foram cultivadas em condição aderente e tratadas durante quatro, oito, onze e quin- ze dias com repertaxina (100nM). Após o tratamento com repertaxina as células foram des- tacadas e cultivadas em suspensão.

Uma diminuição significativa de células iniciadoras de mamoesfera foi observada na condição tratada com repertaxina.

A Figura 21 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na ativação de FAK, AKT e FOXO3a.

Para avaliar o efeito do tratamento com repertaxina na sinalização a jusan- te de CXCR1, dois constructos virais diferentes foram utilizados, um derrubando a expres-

são de PTEN através de um siRNA-PTEN e o outro levando á superexpressão de FAK (Ad- FAK). A.

Células de controle SUM159, PTEN-siRNA SUM159 e Ad-FAK SUM159 foram cul- - tivadas em condições aderentes por dois dias na ausência ou presença de 100nM de reper- taxina e a ativação da via FAK/AKT foi avaliada por western blotting.

O tratamento com re- —pertaxina levou a uma diminuição da fosforilação FAK Tyr397 e AKT Ser473, enquanto a supressão de PTEN e a superexpressão de FAK bloquearam o efeito do tratamento com repertaxina na atividade de FAK e AKT.

B.

Utilizando marcação por imunofluorescência em células CXCR1-positivas, constatou-se que o tratamento com repertaxina resulta no desapa- recimento de fosfo-FAK (marcação membranosa em vermelho) e na expressão de fosfo- AKT (marcação citoplasmática em vermelho). A marcação por imunofluorescência com um anti-FOXOSA revelou uma localização citoplasmática de FOXO3a (em vermelho) nas célu- las não tratadas, enquanto o tratamento com repertaxina induziu uma re-localização de FOXOS3A para o núcleo.

Em contraste, as células com supressão de PTEN ou superexpres- são de FAK exibem um alto nível de fosfo-FAK, fosfo-AKT e expressão citoplasmática de FOXO3A em ambas as células tratadas com repertaxina e nas não tratadas.

Em todas as amostras, os núcleos foram contra-marcados com DAPI (em azul). C-D.

Efeito de repertaxi- - na na viabilidade celular de PTEN-SIRNA SUM159 e Ad-FAK SUM159 e na população de célula-tronco cancerosa foi avaliado utilizando ensaios MTT e ALDEFLUOR, respectivamen- ' te.

Após 3 dias de tratamento, células com supressão de PTEN ou superexpressão de FAK desenvolveram resistência a repertaxina (OC). O tratamento com repertaxina não alterou a . proporção de células SUM159 knockdown PTEN ALDEFLUOR-positivas. (D). A Figura 22 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na ativação de FAK/AKT - em linhagens de células HCC1954 e MDA-MB-453. Para avaliar o efeito do tratamento com repertaxina na sinalização a jusante de CXCR1, utilizamos um constructo lentiviral derru- bandoa expressão de PTEN através de um PTEN-siRNA A.

Células HCC1954 de controle e PTEN-siRNA HCC1954 foram cultivadas em condições aderentes por dois dias na ausência ou presença de 100nM de repertaxina e a ativação da via FAK/AKT foi avaliada por western blotting.

O tratamento com repertaxina levou a uma diminuição da fosforilação de FAK T- yr397 e AKT Ser473, enquanto a supressão de PTEN bloqueou o efeito do tratamento com repertaxina na atividade FAK e AKT.

B.

O tratamento com repertaxina não tem nenhum efei- to na viabilidade celular da linhagem celular de MDA-MB-453 que abrigam mutação de PTEN.

Utilizando análise western blot constatou-se que a via FAK/AKT não foi perturbada pelo tratamento com repertaxina.

A Figura 23 mostra o efeito da repertaxina na viabilidade celular de PTEN-SIRNA — HCC1954, avaliada utilizando ensaio MTT.

Após 3 dias de tratamento, as células com su- pressão de PTEN desenvolveram resistência à repertaxina.

A Figura 24 mostra a expressão do FAS-ligante e RNAm de IL-8 após tratamento com docetaxel ou repertaxina medido por RT-PCR quantitativo. A-B. Células SUM159 culti- i vadas em condição aderente foram tratadas com repertaxina (100nM), agonista de FAS - (500 ng/ml) ou docetaxel (10nM). Após três dias de tratamento as células foram coletadas e o RNA extraído. Docetaxel induziu o FAS-ligante (A) e RNAm de IL-8 (B) em células —SUMI159. Um aumento de 4 vezes no nível de RNAm de IL-8 foi detectado após tratamento com agonista de FAS ou docetaxel (B).

A Figura 25 mostra a avaliação da ativação de PTEN/FAK/AKT nos três xenoenxer- tos diferentes do câncer da mama. A análise western blot revelou que ambos os xenoenxer- tos apresentaram uma expressão de PTEN e uma ativação da via FAK/AKT, como mostrado pelafosforilação de FAK Tyr397 e AKT Ser473.

A Figura 26 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na população de células- tronco cancerosas da mama in vivo. A-C. Para avaliar o efeito do tratamento com repertaxi- na no crescimento tumoral e na população de células-tronco cancerosas in vivo uma linha- gem de células cancerosas de mama (SUM159) e três xenoenxertos de câncer de mama humanos gerados a partir de diferentes pacientes (MC1, UM2, UM3) foram utilizados. A. Para cada amostra, 50.000 células foram injetadas na gordura mamária humanizada de ca- - mundongos NOD/SCID e o tamanho do tumor monitorado. Quando os tumores tinham cerca de 4 mm, injeção s.c. de repertaxina (15mg/kg) duas vezes/dia por 28 dias ou uma 7 vez/semana, injeção |.P. de docetaxel (10mg/Kg) ou a combinação (repertaxina/docetaxel) foiiniciada. O gráfico mostra o tamanho do tumor antes e durante o desenrolar de cada tra- . tamento indicado (seta, início do tratamento). Resultados similares foram observados para cada amostra com uma redução estatisticamente significante do tamanho do tumor em gru- - pos tratados com docetaxel isoladamente ou a combinação repertaxina/docetaxel em com- paração com o controle, ao passo em que não houve diferença entre o crescimento dos tu- —mores de controle e os tumores tratados com repertaxina isoladamente. B-C. Avaliação de repertaxina, docetaxel ou do tratamento combinado na população de células-tronco cance- rosas conforme avaliado pelo ensaio ALDEFLUOR (B) e por reimplante em camundongos secundários (C). xenotransplantes tumorais tratados com docetaxel demonstraram percen- tual semelhante ou maior de células ALDEFLUOR-positivas em comparação com o controle, enquantoo tratamento com repertaxina apenas ou em combinação com docetaxel provocou uma diminuição estatisticamente significativa nas células ALDEFLUOR-positivas, com uma redução de 65% a 85% nas células-tronco cancerosas em comparação com o controle (p<0,01) (B). Diluições em série de células obtidas a partir de tumores primários de camun- dongos sem tratamento (controle) e tratados foram implantadas na gordura mamária de ca- —mundongos NOD/SCID secundários que não receberam nenhum tratamento adicional. Tu- mores primários de controle e tratados com docetaxel formaram tumores secundários em todas as diluições, enquanto apenas os números mais altos de células obtidas a partir de tumores primários tratados com repertaxina ou em combinação com docetaxel foram capa- ] zes de formar tumores. Além disso, o crescimento do tumor foi significativamente atrasado e - os tumores resultantes foram significativamente menores em tamanho do que os tumores do controle ou tratados com docetaxel (C). D. Xenotransplantes de cada grupo foram coletados emarcação imuno-histoquímica foi feita para detectar a expressão de fosfo-FAK, fosfo-AKT, FOXO3A e ALDH1. A expressão de fosfo-FAK membranoso e fosfo-AKT citoplasmático (se- ta) foi detectada nos tumores de controle e nos tratados com docetaxel, enquanto nenhuma expressão foi detectada nos tumores tratados com repertaxina apenas ou em combinação com docetaxel. Expressão nuclear FOXO3A (em marrom) foi detectada nas células tratadas com docetaxel ou repertaxina isoladamente ou em combinação. A diminuição da expressão ALDH1 (seta) foi detectada em tumores tratados com repertaxina apenas ou em combina- ção, em comparação com os tumores do controle e os tratados com docetaxel. A Figura 27 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na população de células- tronco cancerosas da mama in vivo. A-C. Para avaliar o efeito do tratamento com repertaxi- nano crescimento tumoral e na população de células-tronco cancerosas in vivo, uma linha- gem de células de câncer da mama (SUM159, A) e três xenoenxertos de câncer de mama - humanos foram gerados a partir de pacientes diferentes.

Para cada amostra, 50.000 células foram injetadas na gordura mamária humaniza- 7 da de camundongos NOD/SCID e o tamanho do tumor monitorado. Quando os tumores ti- nham cerca de 4 mm, injeção s.c. de repertaxina (15mg/kg) duas vezes/dia por 28 dias ou BR uma vez/semana, injeção I.P. de docetaxel (10mg/Kg) ou a combinação (repertaxi- na/docetaxel) foi iniciada. O gráfico mostra o tamanho do tumor antes e durante o desenro- . lar de cada tratamento indicado (seta, início do tratamento). Resultados similares foram ob- servados para cada amostra com uma redução estatisticamente significante do tamanho do tumor em grupos tratados com docetaxel isoladamente ou a combinação repertaxi- na/docetaxel em comparação com o controle, ao passo em que não houve diferença entre o crescimento dos tumores de controle e os tumores tratados com repertaxina isoladamente. Avaliação de repertaxina, docetaxel ou do tratamento combinado na população de células- tronco cancerosas foi realizada pelo ensaio ALDEFLUOR e por reimplante em camundon- gos secundários. Xenotransplantes tumorais tratados com docetaxel demonstraram percen- tua! semelhante ou maior de células ALDEFLUOR-positivas em comparação com o controle, enquanto o tratamento com repertaxina apenas ou em combinação com docetaxel provocou uma diminuição estatisticamente significativa nas céluias ALDEFLUOR-positivas, com uma redução de 65% a 85% nas células-tronco cancerosas em comparação com o controle — (p<0,01). Diluições em série de células obtidas a partir de tumores primários de camundon- gos sem tratamento (controle) e tratados foram implantadas na gordura mamária de camun- dongos NOD/SCID secundários que não receberam nenhum tratamento adicional. Tumores primários de controle e tratados com docetaxel formaram tumores secundários em todas as ' diluições, enquanto apenas os números mais altos de células obtidas a partir de tumores . primários tratados com repertaxina ou em combinação com docetaxel foram capazes de formar tumores. O crescimento do tumor foi significativamente atrasado e os tumores resul- tantes foram significativamente menores em tamanho do que os tumores do controle ou tra- tados com docetaxel.

A Figura 28 mostra o efeito do tratamento com repertaxina na população de células- tronco cancerosas da mama, conforme avaliado pelo fenótipo CD44+/CD24-. A-B. Avaliação de repertaxina, docetaxel, ou do tratamento combinado na população de células-tronco can- —cerosas foi feita pela presença de células CD44+/CD24-. Nos tumores residuais tratados apenas com docetaxel, temos observado de forma consistente um percentual inalterado ou aumentado de células CD44+/CD24-, enquanto o tratamento com repertaxina apenas ou em combinação com docetaxel resultou em uma redução da população de células CDA44+/CD24-. A. A análise do fluxograma para o xenoenxerto UM3 é apresentada. B. Re- —sultados semelhantes foram observados para MC1, UM2 e UM3. Quase todas as células SUM159 são CD44+/CD24- sob todas as condições de tratamento.

- A Figura 29 mostra que o tratamento com repertaxina reduz o desenvolvimento da metástase sistêmica. Para avaliar o efeito do tratamento com repertaxina na formação de 7 metástases, linhagens de céluias HCC1954 (A), SUM159 (B), MDA-MB-453 (C) cancerosas damama foram infectadas com um lentivírus que expressa luciferase e 250.000 células in- . fectadas com luciferase inoculadas em camundongos NOD/SCID através de injeção intra- cardíaca. Os camundongos foram tratados 12 horas após a injeção intracardíaca, com inje- ção s.c. de solução salina ou injeção s.c. de repertaxina (15mg/Kkg), duas vezes por dia du- rante 28 dias. A formação de metástases foi monitorada através de imageamento por biolu- —minescência.A quantificação do fluxo de fótons normalizado medido em intervalos semanais após a inoculação revelou uma diminuição estatisticamente significativa na formação de metástases em repertaxina em comparação com os controles de solução salina para ca- mundongos inoculados com células HCC1954 ou SUM159 (A-B). Em contraste, o tratamen- to com repertaxina não teve nenhum efeito na formação de metástases para os camundon- gos injetados com células MDA-MB-453. (C). Confirmação histológica, por marcação H&E, de metástase no osso e tecido mole, resultante de camundongos não tratados por repertaxi- na (D).

A Figura 30 mostra a sinalização de IL-8/CXCR1 em células-tronco cancerosas tra- tadas com quimioterapia isoladamente ou em combinação com repertaxina. A. Representa- çãoda sinalização celular potencial de IL-8/CXCR1 em células-tronco cancerosas. A ativa- ção de CXCR1 após a ligação com IL-8 induz a fosforilação da quinase de adesão focal (FAK). FAK ativo fosforila AKT e ativa a via WNT, que regula a renovação das células-tronco e FOXO3A que regula a sobrevida celular. A ativação de FAK protege as células-tronco : cancerosas de um efeito espectador mediado pelo FAS-ligante/FAS através da inibição de . FADD, um efetor a jusante da sinalização de FAS. Na presença de quimioterapia, apenas células tumorais em grandes quantidades são sensíveis ao tratamento e liberam um elevado — níveldelL-8e proteinas FAS-ligante durante o processo de apoptose. Células-tronco cance- rosas da mama são estimuladas através de um efeito espetador mediado por IL-8 e são re- sistentes ao efeito espectador mortal mediado pelo FAS-ligante. B. O tratamento com reper- taxina bloqueia a sinalização de IL-8/CXCR1 e inibe a auto-renovação e a sobrevida da cé- lula-tronco cancerosa da mama. Quando o tratamento com repertaxina é combinado com a quimioterapia as células-tronco cancerosas são sensibilizadas para o efeito espectador mor- tal mediado pelo FAS-ligante.

DEFINIÇÕES Para facilitar a compreensão da presente invenção, uma série de termos e frases são definidos abaixo: Conforme utilizados aqui, os termos "agente anti-câncer", "agente anti-câncer con- vencional", ou "fármaco terapêutico contra o câncer" se referem a quaisquer agentes tera- - pêuticos (por exemplo, compostos quimioterápicos e/ou compostos terapêuticos molecula- res), terapias de radiação, ou intervenções cirúrgicas, utilizados no tratamento de câncer E (por exemplo, em mamíferos). Conforme utilizados aqui, os termos "fármaco" e "agente quimioterápico" referem-se : a moléculas farmacologicamente ativas que são usadas para diagnosticar, tratar ou prevenir doenças ou condições patológicas em um sistema fisiológico (por exemplo, um indivíduo, ou . células, tecidos e órgãos in vivo, in vitro, ou ex vivo). Os fármacos agem alterando a fisiolo- gia de um organismo vivo, tecido, célula, ou sistema in vitro ao qual o fármaco foi adminis- —trado. Pretende-se que os termos "fármaco" e "agente quimioterápico" englobem compostos anti-hiperproliferativos e antineoplásicos, bem como outros compostos biologicamente tera- pêuticos.

Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efetuar resultados bené- ficos ou desejáveis. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais adminis- trações.

Conforme utilizado aqui, o termo "administração" se refere ao ato de dar um fárma- co, pró-fármaco, anticorpo ou outro agente, ou tratamento terapêutico para um sistema fisio- lógico (por exemplo, um indivíduo ou células, tecidos e órgãos in vivo, in vitro, ou ex vivo). Vias de administração exemplares para o corpo humano podem ser através dos olhos (of- tálmica), boca (oral), pele (transdérmica), nariz (nasal), pulmões (inalante), mucosa oral (bu- cal), ouvido, por injeção (por exemplo, por via intravenosa, subcutânea, intratumoral, intrape- ritoneal, etc.) e similares.

"Co-administração" se refere à administração de mais de um agente químico ou tra- ] tamento terapêutico (por exemplo, terapia de radiação) a um sistema fisiológico (por exem- . plo, um indivíduo ou células, tecidos e órgãos in vivo, in vitro, ou ex vivo). A "co- administração" dos agentes químicos respectivos (por exemplo, antagonista da via de sinali- zação lL8-CXCR1 e quimioterapia adicional) pode ser simultânea, ou em qualquer ordem temporal ou combinação fisica.

Conforme utilizado aqui, o termo "regressão" se refere ao retorno de um indivíduo, célula, tecido, ou órgão doente a um estado não-patológico, ou menos patológico em rela- ção ao indivíduo, célula, tecido, ou órgão basal não-patogênico exemplar. Por exemplo, a regressão de um tumor inclui uma redução da massa tumoral, bem como o desaparecimen- to completo de um tumor ou tumores.

Conforme utilizado aqui, o termo "in vitro" refere-se a um ambiente artificial e a pro- cessos ou reações que ocorrem dentro de um ambiente artificial. Ambientes in vitro podem consistir em, mas não estão limitados a, tubos de ensaio e culturas de células. O termo "in vivo" serefere ao ambiente natural (por exemplo, um animal ou uma célula) e aos processos Ou reações que ocorrem dentro de um ambiente natural.

- Conforme utilizado aqui, o termo "cultura de células" se refere a qualquer cultura in vitro de células. Incluídos neste termo estão linhagens de células contínuas (por exemplo, ' com um fenótipo imortal), culturas de células primárias, linhagens celulares finitas (por e- —xemplo, células não-transformadas) e qualquer outra população de células mantidas in vitro, . incluindo oócitos e embriões. Conforme utilizado aqui, o termo "indivíduo" ou "paciente" refere-se a organismos a . serem tratados pelos métodos da presente invenção. Tais organismos incluem, mas não estão limitados a, seres humanos e animais veterinários (cães, gatos, equinos, suínos, bovi- nos, ovinos, caprinos e similares). No contexto da invenção, o termo "indivíduo" ou "pacien- te" geralmente se refere a um indivíduo que vai receber ou que tenha recebido tratamento.

O termo "diagnóstico", conforme utilizado aqui, refere-se ao reconhecimento de uma doença pelos seus sinais e sintomas ou análise genética, análise patológica, análise histológica e assim por diante.

Conforme utilizado aqui, o termo "antisense" é usado em referência às sequências de ácido nucleico (por exemplo, RNA, DNA fosforoticato) que são complementares a uma sequência de RNA específica (por exemplo, RNAm). Incluídas nesta definição estão molécu- las naturais ou sintéticas de RNA antisense, incluindo moléculas que regulam a expressão gênica, como RNAs de interferência curtos ou micro RNAs. Um tipo de sequência antisense — que pode serempregado pela presente invenção é o tipo que é específico para o RNAm de CXCR1.

O termo "composto de ensaio" ou "composto candidato" se refere a qualquer enti-

dade química, farmacêutica, fármaco e afins, que pode ser usada para tratar ou prevenir Ú uma doença, enfermidade ou distúrbio das funções corporais, ou alterar o estado fisiológico , ou celular de uma amostra. Compostos de ensaio compreendem tanto os compostos tera- pêuticos conhecidos quanto aqueles em potencial. Um composto de ensaio pode ser deter- minado como terapêutico através do uso dos métodos de triagem da presente invenção. Um "composto terapêutico conhecido" se refere a um composto terapêutico que tem se mostra- do eficaz (por exemplo, através de ensaios em animais ou experiência prévia com adminis- tração a seres humanos) neste tratamento ou prevenção. Em modalidades preferidas os "compostos de ensaio" são agentes anti-câncer. Em modalidades particularmente preferidas os"compostos de ensaio" são agentes anti-câncer que induzem a apoptose em células.

Conforme utilizado aqui, o termo "proteína de ligação ao antígeno" se refere a pro- teinas que se ligam a um antígeno específico. "Proteínas de ligação ao antígeno" incluem, mas não estão limitadas a, imunoglobulinas, incluindo anticorpos policlonais, monocionais, quiméricos de cadeia única e humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e bibliote- casde expressão de Fab. Vários procedimentos conhecidos na técnica são usados para a produção de anticorpos policlonais. Para a produção de anticorpos, vários animais hospe- - deiros podem ser imunizados pela injeção com o peptídeo correspondente ao epítopo dese- jado, incluindo, mas não limitado a, coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, cabras, etc. Em : uma modalidade preferida o peptídeo é conjugado em um carreador imunogênico (por e- xemplo, toxóide diftérico, albumina de soro bovino (BSA), ou hemocianina de lapa california- . na (KLH)). Vários adjuvantes são usados para aumentar a resposta imunológica, dependen- do da espécie de hospedeiro, incluindo, mas não limitados a, géis minerais de Freund (com- - pletos e incompletos), tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões em óleo, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis, como BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que forneça a pro- dução de moléculas de anticorpos por linhagens celulares contínuas em cultura pode ser utilizada (por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor — Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estes incluem, mas não estão limitados à técni- ca de hibridoma originalmente desenvolvida por Kôhler e Milstein (Kóhler e Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridomas humanos de células B (Ver, por exemplo, Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)) e a técnica de hi- bridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al, em Monoclional —Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)).

De acordo com a invenção, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (U.S. 4.946.778; aqui incorporado por referência) podem ser adaptadas para produzir anticorpos específicos de cadeia única conforme desejado. Uma modalidade adi- Ô cional da invenção utiliza os métodos conhecidos na técnica para a construção de bibliote- N cas de expressão de Fab (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos de Fab monoclonal com a especificidade desejada. Fragmentos de anticorpos que contêm o idiotipo (região de ligação ao antígeno) da molécula do anticorpo podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não estão limitados a: fragmento F(ab')2, que pode ser produ- zido pela digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo; fragmentos Fab', que podem ser gerados pela redução das pontes dissulfeto de um fragmento F(ab')2, e fragmentos Fab, que podem ser gerados pelo tratamento de uma molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor.

Os genes que codificam proteínas de ligação ao antígeno podem ser isolados por métodos conhecidos na técnica. Na produção de anticorpos, a triagem do anticorpo deseja- do pode ser conseguida através de técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, radioimu- —noensaio, ELISA (ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas), imunoensaios tipo "san- duíche", ensaios imunorradiométricos, reações de precipitação em gel de difusão, ensaios - de imunodifusão, imunoensaios in situ (utilizando marcadores de ouro coloidal, enzima, ou radioisótopos, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação ' (por exemplo, ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemaglutinação, etc.), ensaios de fixação complementar, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A e ensaios de : imunoeletroforese, etc.), etc.

Conforme utilizado aqui, o termo "modular" se refere à atividade de um composto para atacar (por exemplo, para promover ou retardar) um aspecto da função celular, incluin- do, mas não limitado ao crescimento, proliferação, invasão, angiogênese, apoptose celular e assim pordiante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos de tratamento do câncer pela administração de um inibidor da via ILG-CXCR1 (por exemplo, um anticorpo anti-CXCR1 ou Repertaxina) sozinho ou em combinação com um agente quimioterapêutico adicional, de tal forma que as células cancerosas não-tumorigênicas e tumorigênicas em um indivíduo são mortas. A pre- sente invenção também fornece composições e métodos para tratar e diagnosticar a pre- sença de células-tronco de tumor sólido em um paciente (por exemplo, com base na pre- sença de CXCR1 ou FBXO21).

|. Células cancerosas tumorigênicas, inibição de ALDH, CXCR1 e CXCR1 A evolução de uma célula normal para uma completamente transformada requer a desregulação de vários processos celulares (1, 2). De acordo com os modelos clássicos da carcinogênese, esses eventos podem ocorrer em qualquer célula. Em contraste, a "hipótese da célula-tronco cancerosa" afirma que os alvos preferenciais da transformação oncogênica são células-tronco do tecido ou progenitoras novas que tenham adquirido potencial de auto- & renovação (3-6). Estas "células de iniciação tumoral" ou “células-tronco cancerosas” (CSC), por sua vez, são caracterizadas pela sua habilidade de sofrer auto-renovação, um processo quelevaa tumorigênese diferenciação e que contribui para a heterogeneidade celular do tumor.

Evidências recentes apoiando a hipótese da célula-tronco cancerosa foram geradas utilizando xenoenxertos de tumores humanos primários.

Estes estudos têm sugerido que os tumores são compostos por uma hierarquia celular induzida pelo componente da célula- tronco cancerosa.

Além disso, dados recentes sugerem que linhagens de células imortaliza- das derivadas de tecidos humanos e murinos também podem conter uma população celular que exibe propriedades de célula-tronco.

A maioria desses estudos tem sido baseada em propriedades in vitro, incluindo potencial clonogênico, formação de esfera e potencial de diferenciação de multi-linhagem (7-10). Estudos mais limitados utilizando transplante funcio- nal de linhagens celulares imortalizadas em xenoenxertos também têm sugerido a existência de tal hierarquia.

Estes estudos geralmente têm utilizado exclusão do marcador Hoechst para identificar a chamada "população lateral" (SP) (7, 9, 11). Além disso, marcadores de - superfície celular definidos utilizando xenoenxertos de tumor primário, como CD44 e CD133, também têm sido utilizados para identificar populações semelhantes nas linhagens celulares

T estabelecidas (7, 8). Conforme descrito nos exemplos abaixo, a expressão do marcador de células- & tronco aldeído desidrogenase (ALDH) foi estudada em uma série de 33 linhagens de células derivadas de células de câncer de mama humano e células mamárias não-transformadas. . ALDH é uma enzima desintoxicante responsável pela oxidação de aldeídos intracelulares e imagina-se que este desempenha um papel na diferenciação de células-tronco através do — metabolismo do ácido retinal para retinóico (12, 13). A atividade de ALDH, conforme avalia- da pelo ensaio ALDEFLUOR fluorescente, tem sido utilizada com sucesso para isolar célu- las-tronco cancerosas em mieloma múltiplo e leucemia mielóide aguda (LMA), bem como de tumores cerebrais (14-16). Foi demonstrado recentemente que a atividade de ALDH pode ser utilizada para isolar uma subpopulação de células que exibem propriedades de células- tronco do tecido mamário humano normal e carcinomas de mama (17). A população ALDEFLUOR-positiva isolada do tecido da mamoplastia de redução é capaz de reconstituir estruturas alveolares ductais na gordura mamária de camundongos NOD/SCID humaniza- dos.

Além disso, as células ALDELFUOR-positivas isolados de carcinomas mamários hu- manos têm propriedades de células-tronco, conforme demonstrado pela sua capacidade de reconstituir tumores na passagem seriada em camundongos NOD/SCID, bem como de ge- rar a heterogeneidade fenotípica dos tumores iniciais (17). Nos exemplos abaixo, é demons- trado que a maioria das linhagens de células de câncer de mama contém uma população

ALDEFLUOR-positiva com um perfil molecular distinto que apresenta propriedades de célu- i la-tronco cancerosa.

. Conforme descrito nos exemplos abaixo, trabalho realizado durante o desenvolvi mento de modalidades da presente invenção identificou CXCR1 (que é um receptor para a quimiocina inflamatória IL8) como um marcador de câncer de células-tronco. Apenas as cé- lulas dentro da população Aldefluor-positiva expressaram CXCR1. Além disso, foi demons- trado que esse receptor desempenha um papel funcional na medida em que IL8 recombi- nante é capaz de aumentar a proporção de células-tronco em linhagens celulares, conforme determinado pelos ensaios Aldefluor e de formação de esfera. Embora IL8 tenha sido asso- ciadoa cânceres de mama agressivos e seja maior no soro de mulheres com doença me- tastática, acredita-se que a presente invenção é a primeira a mostrar uma ligação funcional entre IL8 e seu receptor CXCR1 em células-tronco.

Conforme descrito nos exemplos abaixo, foi demonstrado que se pode direcionar seletivamente células-tronco cancerosas bloqueando-se o receptor CXCR1 nessas células.

Em uma abordagem descrita nos exemplos, linhagens de células de câncer de mama foram tratadas com anticorpos monocionais para CXCR1, mas não para o outro receptor de IL8, - CXCR2. Esse tratamento direcionou seletivamente células-tronco cancerosas, conforme demonstrado pela redução das populações Aldefluor-positivas. Surpreendentemente, des- " cobriu-se que apesar de CXCR1 só ser expresso em uma porcentagem muito pequena de células (por exemplo, menos de 1%), o bloqueio do receptor de CXCR1 induziu a morte ce- " lular na maioria das outras células cancerosas, apesar do fato de que elas não têm o recep- tor de CXCR1. A via molecular que medeia os efeitos de IL nas células-tronco cancerosas e f é responsável por este chamado "efeito espectador" de matar outras células foi elucidada. IL8 estimula a auto-renovação de células-tronco ligando ao CXCR1, que por sua vez, ativa a viaFakda quinase de adesão focal. Isto resulta na ativação de Akt, que direciona a auto- renovação de células-tronco. Quando essa via está bloqueada nas células-tronco cancero- sas, a diminuição da sinalização de Akt provoca o sequestro citoplasmático dos fatores de transcrição Foxo, resultando em um aumento da síntese do Fas-ligante. O Fas-ligante é se- cretado das células-tronco cancerosas e induz a morte celular nas células vizinhas que con- têmoreceptor de Fas.

Embora a invenção não se limite a nenhum mecanismo específico, e um entendi- mento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, acredita-se que CXCR1 medeia a auto-renovação da célula-tronco cancerosa através de uma via que envolve Fak e Akt e que o bloqueio desta via induz a morte celular em células-tronco cance- rosas, bem como das células tumorais vizinhas. Assim, em certas modalidades a presente invenção fornece composições e métodos para romper a via ILBG-CXCR1 (por exemplo, com anticorpos anti-CXCR1, anticorpos anti-FAK, ou outros agentes), a fim de tratar o câncer.

Como IL8 é uma quimiocina envolvida na inflamação do tecido, houve um interesse ' prévio no desenvolvimento de inibidores da sinalização de IL8. Um inibidor de molécula pe- . quena, Repartaxina, foi desenvolvido como um agente anti-inflamatório para reduzir poten- cialmente as complicações do infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. A repartaxi- nafoiintroduzida nos ensaios médicos de fase | e Il e mostrou pouca toxicidade. Conforme mostrado nos exemplos abaixo, a repartaxina (como os anticorpos anti-CXCR1) é capaz de direcionar células-tronco cancerosas, bem como induzir uma apoptose mediada por Fas- ligante através do efeito espectador em células vizinhas. Importantemente, em xenoenxertos tumorais a repartaxina potencializa o efeito da quimioterapia. Além disso, diferentemente da quimioterapia, que destrói preferencialmente as células diferenciadas em tumores, poupan- do as células-tronco tumorais, a repartaxina é capaz de direcionar células-tronco tumorais. Como mostrado nos exemplos, isto foi demonstrado por uma diminuição na população Aide- fluor em tumores tratados com repartaxina e pela diminuição da capacidade dessas células tumorais tratadas de formar tumores secundários em camundongos. Também foram testa- dosos efeitos da repartaxina na capacidade de bloquear a metástase. As células tumorais foram marcadas com luciferase e injetadas por via intracardíaca em um modelo experimen- - tal de metástase. Um dia depois das células tumorais serem introduzidas, um grupo de ani- mais foi colocado em tratamento com repartaxina apenas e o outro sem tratamento. A repar- ' taxina reduziu significativamente o desenvolvimento da metástase. A presente invenção identificou o receptor de IL8 CXCR1 como um alvo no trata- Ns mento de células-tronco cancerosas. O inibidor de pequenas moléculas, repartaxina, inibe CXCR1 e CXCR2. Os exemplos demonstraram que CXCR1 é o receptor mais importante - nas células-tronco cancerosas. Além disso, os exemplos indicam que a falha da quimiotera- pia citotóxica em tratar efetivamente cânceres estabelecidos pode ser não só devido à inca- —pacidade desta terapia em direcionar células-tronco cancerosas, mas, além do documenta- do, aumentar a secreção de IL8 no tratamento de quimioterapia citotóxica tumoral. Os pre- sentes exemplos indicam que o uso de inibidores de CXCR1 tem efeitos benéficos ao ser capaz de direcionar especificamente as células-tronco cancerosas, bem como de bloquear o estímulo de IL8 dessas células, induzido por quimioterapia citotóxica.

O direcionamento da via IL&-CXCR1 não se limita ao câncer de mama, mas em vez disso, pode ser utilizado em qualquer tipo de câncer. De preferência, o tipo de câncer trata- do é aquele em que há evidência de aumento na produção de IL8 (por exemplo, em conjun- to com a quimioterapia). Agentes quimioterápicos mostraram regular diretamente a transcri- ção de IL8 em células cancerosas. Paclitaxel aumenta a transcrição e a secreção de IL8 em linhagens de células cancerosas da mama, ovário e puimão (Uslu et al., 2005, Int. J. Gyne- col. Cancer, 15:240-245; e Collins et a/., 2000, Can. Imm. Immuno., 49:78-84, ambos incor- porados aqui por referência). Além disso, a administração de adriamicina e 5-fluoro-2'-

deoxiuridina a células cancerosas da mama (DeLarco et a/l., 2001, Can.

Res. 61:2857-2861, Ú incorporado aqui por referência), a adição de 5-FU nas células do câncer bucal (Tamatani et - al., 2004, Int, J.

Can., 108:912:921, incorporado aqui por referência), a adição de doxorrubi- cina a células de câncer de pulmão de células pequenas (Shibakura et a/., 2003, Int.

J.

Can., 103:380-386, incorporado aqui por referência) e a administração de dacarbazina a células de melanoma (Lev et al., 2003, Mol., Can.

Ther., 2:753-763, incorporado aqui por referên- cia), todos resultaram na expressão aumentada de CXCL8. Como tal, em certas modalida- des a presente invenção fornece agentes para direcionar o IL-CXCR1, em combinação com agentes de quimioterapia (por exemplo aqueles mencionados nas referências acima) para o tratamento de um indivíduo com um tipo de câncer, incluindo, mas não limitado a, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão de células não- pequenas, câncer de pulmão de células pequenas e adenocarcinoma de esôfago.

A presente invenção não se limita ao tipo de câncer tratado e, em vez disso, inclui, mas não está limitada a, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, limfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, - rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, ' adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carci- - noma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, cori- ocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor tes- . ticular, carcinoma de pulmão, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma da be- xiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependi- —moma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma do acústico, oligodendroglioma, meningio- ma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

Il.

Detecção de Marcadores de Câncer de célula-tronco de tumor sólido Em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos para detecção da expressão de marcadores de câncer de células-tronco (por exemplo, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1). Em algumas modalidades a expressão é medida diretamente (por exemplo, no nível de proteína ou RNA). Em algumas modalidades a expressão é detectada em amostras de tecido (por exemplo, tecido de bióp- sia). Em outras modalidades a expressão é detectada em fluidos corporais (por exemplo, incluindo, mas não limitado a, plasma, soro, sangue, muco e urina). A presente invenção fornece ainda painéis e kits para a detecção de marcadores.

Em algumas modalidades a presença de um marcador de câncer de células-tronco é usada para fornecer um prognóstico de um indivíduo.

As informações fornecidas também são usa-

das para direcionar o curso do tratamento. Por exemplo, se um indivíduo tem um marcador ] indicativo de uma célula-tronco de tumor sólido (por exemplo, CXCR1, FBXO21, NFYA, - NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1), terapias complementares (por exemplo, terapias de radiação) podem ser iniciadas em um momento anterior, quando são mais propensas a serem eficazes (por exemplo, antes da metástase). Além disso, se um indivíduo tem um tumor que não responde a uma determinada terapia, o custo e a inconve- niência de tais terapias podem ser evitados.

Em algumas modalidades a presente invenção fornece um painel para a análise de uma pluralidade de marcadores (por exemplo, a combinação de CXCR1 ou FBXO21 e pelo menos um dentre CD44, CD24 e ESA). O painel permite a análise simultânea de múltiplos marcadores, correlacionando com a carcinogênese e/ou metástase. Dependendo do indiví- duo, os painéis podem ser analisados isoladamente ou em combinação, a fim de proporcio- nar o melhor diagnóstico e prognóstico possíveis. Os marcadores para inclusão em um pai- nel são selecionados por triagem quanto ao seu valor preditivo, usando qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado aqueles descritos nos exemplos abaixo.

1.Detecção de RNA - Em algumas modalidades a detecção de marcadores de cancer de célula-tronco de tumor sólido é feita medindo-se a expressão de RNAm correspondente em uma amostra de Í tecido. A expressão de RNAm pode ser medida por qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado aqueles divulgados abaixo. O número de acessão para o ácido nucleico . humano CXCR1 é NM 000634 (incorporado aqui por referência) e o número de acessão para o FBKO21 humano é NM 033624 (incorporado aqui por referência). Essas sequências - podem ser usadas para projetar primers e sondas (assim como sequências de siRNA).

Em algumas modalidades o RNA é detectado por análise Northern blot. A análise Northern blot envolve a separação do RNA e a hibridização de uma sonda marcada com- plementar.

Em outras modalidades o RNA (ou DNAc correspondente) é detectado por hibridi- zação a uma sonda de oligonucleotídeos). Uma variedade de ensaios de hibridização utili- zando diferentes tecnologias para hibridização e detecção está disponível. Por exemplo, em algumas modalidades, ensaio TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; Ver, por exemplo, Patente Nº* U.S. 5.962.233 e 5.538.848, cada umas das quais é incorporada aqui por refe- rência) é utilizado. O ensaio é realizado durante uma reação de PCR. O ensaio TaqMan explora a atividade da 5'-3' exonuclease da polimerase do DNA AMPLITAQ GOLD. Uma sonda consistindo em um oligonucleotídeo com um corante 5'-repórter (por exemplo, um corante fluorescente) e um corante 3'-repressor está incluída na reação de PCR. Durante o PCR, se a sonda estiver ligada ao seu alvo, a atividade nucleolítica da 5'-3' polimerase AMPLITAQ GOLD cliva a sonda entre o repórter e o corante repressor. A separação do co-

rante repórter do corante repressor resulta em um aumento de fluorescência. O sinal se a- ' cumula a cada ciclo de PCR e pode ser monitorado com um fluorímetro. - Em outras modalidades PCR com transcriptase reversa (RT-PCR) é usado para de- tectar a expressão do RNA. No RT-PCR o RNA é enzimaticamente convertido em DNA complementar, ou "DNAC", utilizando uma enzima transcriptase reversa. O DNAc é então usado como um molde para uma reação de PCR. Os produtos de PCR podem ser detecta- dos por qualquer método adequado, incluindo, mas não limitados a eletroforese em gel e marcação com um corante específico de DNA ou hibridização a uma sonda marcada. Em algumas modalidades o método de PCR da transcriptase reversa quantitativa com misturas padronizadas de modelos competitivos descrito nas Patentes U.S. 5.639.606, 5.643.765 e

5.876.978 (cada umas das quais é incorporada aqui por referência) é utilizado.

2.Detecção de Proteína Em outras modalidades uma expressão gênica de marcadores de câncer de célu- las-tronco é detectada medindo-se a expressão da proteína ou polipeptídeo correspondente (por exemplo, CXCR1, FBXKO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1). A expressão da proteína pode ser detectada por qualquer método adequado. Em . algumas modalidades proteínas são detectadas por imuno-histoquímica. Em outras modali- dades as proteínas são detectadas pela sua ligação a um anticorpo feito contra a proteína.

Í O número de acessão para a proteina CXCR1 humana é NP. 000625 (incorporado aqui por referência) e o número de acessão para FBKO21 humano é NP 296373 (incorporado aqui - por referência). A geração de anticorpos é descrita abaixo.

A ligação ao anticorpo é detectada através de métodos conhecidos na técnica (por - exemplo, radioimunoensaio, ELISA (ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas), imu- noensaios tipo "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, reações de precipitação em gel de difusão, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in sítu (utilizando marcadores de ouro co- loidal, enzima, ou radioisótopos, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, en- saios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemaglutina- ção, etc.), ensaios de fixação complementar, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A e ensaios de imunoeletroforese, etc.), etc.

Em uma modalidade a ligação ao anticorpo é detectada através da detecção de um marcador no anticorpo primário. Em outra modalidade o anticorpo primário é detectado atra- vés da detecção da ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Em outra modalidade o anticorpo secundário é marcado. Vários métodos são conhecidos na técnica para a detecção de ligação em um imunoensaio e estão dentro do escopo da pre- senteinvenção.

Em algumas modalidades um ensaio de detecção automática é utilizado. Métodos para a automação de imunoensaios incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. 5.885.530,

4.981.785, 6.159.750 e 5.358.691, cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Em algumas modalidades a análise e a apresentação dos resultados também são automati- - zadas. Por exemplo, em algumas modalidades é utilizado um software que gera um prog- nóstico baseado na presença ou na ausência de uma série de proteínas correspondentes a marcadores do câncer. Em outras modalidades o imunoensaio é o descrito nas Patentes U.S. 5.599.677 e

5.672.480; cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

3. Tecnologia de Micro-matriz de DNAc Micro-matrizs de DNAc são compostos de vários (normalmente milhares) DNAcs di- ferentes marcados (geralmente usando um dispositivo de marcação robótico) em posições conhecidas sobre um suporte sólido, como uma lâmina de vidro de microscópico. Os DNAcs são normalmente obtidos por amplificação por PCR de insertos da biblioteca plasmidial utili- zando primers complementares à parte estrutural do vetor do plasmídeo ou ao próprio gene em si para genes em que a sequência é conhecida. Produtos de PCR adequados para a produção de micro-matrizs estão tipicamente entre 0,5 e 2,5 kB de comprimento. DNAcs de comprimento total, etiqueta de sequência expressa (ESTs), ou DNAcS aleatoriamente esco- - lhidos a partir de qualquer biblioteca de interesse podem ser escolhidos. ESTs são DNAs parcialmente sequenciados, como descrito, por exemplo, em Hillier, et a/., 1996, 6:807-828. í Embora algumas ESTs correspondam a genes conhecidos, por vezes muito pouca ou ne- —nhuma informação sobre qualquer EST em particular está disponível, exceto por uma pe- . quena quantidade de sequência 3' e/ou 5' e, possivelmente, o tecido de origem do RNAm do qual a EST foi derivada. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, em geral os . DNAcs contêm informações de sequência suficientes para identificar exclusivamente um gene no genoma humano. Além disso, em geral os DNAcs são de comprimento suficiente parase hibridizar, seletivamente, especificamente ou exclusivamente, a um DNAc obtido a partir do RNAm derivado de um único gene sob as condições de hibridização do experimen- to. Em um experimento de micro-matriz típico, um micro-matriz é hibridizado com po- pulações de RNA, DNA ou DNAc diferencialmente marcadas, provenientes de duas amos- tras diferentes. Mais comumente, o RNA (RNA total ou RNA poli A+) é isolado de células ou tecidos de interesse e é transcrito de forma reversa para produzir o DNAc. A marcação é geralmente realizada durante a transcrição reversa, incorporando um nucleotídeo marcado na mistura da reação. Apesar de vários marcadores poderem ser usados, mais comumente o nucleotídeo é conjugado com corantes fluorescentes Cy3 ou Cy5. Por exemplo, Cy5-dUTP eCy3-dUTP podem ser usados. DNAc derivado de uma amostra (representando, por exem- plo, um tipo específico de célula, tipo de tecido ou condição de crescimento) é marcado com um fluoróforo enquanto o DNAc derivado de uma segunda amostra (representando, por e-

. xemplo, um tipo de célula diferente, tipo de tecido, ou condição de crescimento) é marcado com o segundo fluoróforo. Quantidades similares de material marcado das duas amostras - são co-hibridizadas ao micro-matriz. No caso de um experimento de micro-matriz em que as amostras são marcadas com Cy5 (que emite fluorescência vermelha) e Cy3 (que emite fluo- —rescência verde), os dados primários (obtidos por imageamento do micro-matriz usando um detector capaz de detectar quantitativamente a intensidade da fluorescência) são razões de intensidade de fluorescência (vermelho/verde, R/G). Essas razões representam as concen- trações relativas de moléculas de DNAc que se hibridizaram aos DNAcs representados no micro-matriz e, portanto, refletem os níveis de expressão relativa do RNAm correspondente acada DNAc/gene representado no micro-matriz.

Cada experimento de micro-matriz pode fornecer dezenas de milhares de pontos de dados, cada um representando a expressão relativa de um gene em particular nas duas amostras. A organização e a análise adequadas dos dados são de fundamental importância, e vários programas de computador que incorporam ferramentas estatísticas padrão foram desenvolvidos para facilitar a análise dos dados. Uma base para organizar os dados de ex- pressão gênica e para agrupar os genes com padrões de expressão similar em clusters. Um - método para a realização da análise de agrupamento hierárquico e visualização de dados provenientes dos experimentos de micro-matriz é descrito em Eisen et a/. 1998, PNAS Í 95:14863-14868. Conforme descrito nele, o agrupamento pode ser combinado com uma representação gráfica dos dados primários, em que cada ponto de dados é representado . com uma cor que representa quantitativamente e qualitativamente esse ponto de dados. Ao converter os dados de uma grande tabela de números em um formato visual, este processo . facilita uma análise intuitiva dos dados. Informações adicionais e detalhes sobre as ferra- mentas matemáticas e/ou a abordagem de agrupamento em si podem ser encontradas, por exemplo, em Sokal & Sneath, Principles of numerícal taxonomy, xvi, 359, W. H. Freeman, San Francisco,1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, New York, 1975; Paull et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92; Weinstein et al. 1992, Science 258:447-51; van Osdol et a/., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9; e Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9.

Mais detalhes sobre os métodos experimentais usados na presente invenção en- contram-se no exemplo abaixo. Informações complementares descrevendo métodos para fabricar e usar os micro-matrizs são encontradas na Pat. U.S. Nº 5.807.522, que é incorpo- rada aqui por referência. Instruções para a construção de hardware de micro-matriz (por exemplo, arrayers e scanners) usando peças comercialmente disponíveis. Discussões adi- cionaisda tecnologia de micro-matrizs e protocolos para o preparo de amostras e realização de experimentos de micrormatriz são encontrados, por exemplo, em DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; Fluorescence-based expression monitoring using microarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; e M.

Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1999. - 4.Análise de Dados Em algumas modalidades um programa de análise baseado em computador é usa- do para traduzir os dados brutos gerados pelo ensaio de detecção (por exemplo, a presen- ça, ausência, ou quantidade de um determinado marcador ou marcadores) em dados de valor preditivo de um médico.

O médico pode acessar os dados preditivos utilizando qual- quer meio adequado.

Assim, em algumas modalidades a presente invenção fornece para benefício do médico, que provavelmente não é treinado em genética e biologia molecular, estenão precisa entender os dados brutos.

Os dados são apresentados diretamente para o médico em sua forma mais útil.

O médico então é capaz de utilizar imediatamente a infor- mação, a fim de otimizar o atendimento ao indivíduo.

A presente invenção contempla qualquer método capaz de receber, processar e transmitir as informações para e a partir dos laboratórios que conduzem os ensaios, infor- —mações fornecidas, pessoal médico e indivíduos.

Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção uma amostra (por exemplo, uma biópsia ou uma amostra de soro ou uri- - na) é obtida de um indivíduo e enviada a um serviço de perfil (por exemplo, laboratório mé- dico no centro médico, empresa de perfil genômico, etc.), localizado em qualquer parte do Í mundo (por exemplo, em um país diferente do país onde o indivíduo reside ou onde a infor- maçãoé, em última análise, utilizada) para gerar dados brutos.

Quando a amostra é consti- - tuída por um tecido ou outra amostra biológica, o indivíduo pode visitar um centro médico para que a amostra seja obtida e enviada para o centro de perfil, ou os indivíduos podem - coletar a amostra por si mesmos e enviá-la diretamente a um centro de perfil.

Quando a amostra é constituída por informação biológica previamente determinada, as informações podem ser enviadas diretamente para o serviço de perfil pelo indivíduo (por exemplo, um cartão de informação contendo as informações pode ser escaneado por um computador e os dados transmitidos para um computador do centro de perfis usando um sistema de co- municação eletrônica). Uma vez recebida pelo serviço de perfil, a amostra é processada e um perfil é produzido (por exemplo, dados de expressão), específico para as informações de — diagnóstico ou prognóstico desejáveis para o indivíduo.

Os dados de perfil são então preparados em um formato adequado para interpreta- ção por um médico.

Por exemplo, em vez de fornecer dados de expressão brutos (por e- xemplo, examinar um número de marcadores), o formato elaborado pode representar um diagnóstico ou avaliação de risco para o indivíduo, juntamente com recomendações para opções de tratamento específico.

Os dados podem ser exibidos ao médico por qualquer mé- todo adequado.

Por exemplo, em algumas modalidades o serviço de perfil gera um relatório que pode ser impresso para o médico (por exemplo, no ponto de atendimento) ou exibido para o médico em um monitor de computador. Em algumas modalidades as informações são primeiro analisadas no ponto de a- - tendimento ou em uma instalação regional. Os dados brutos são então enviados a uma uni- dade central de processamento para posterior análise e/ou para converter os dados brutos em informações úteis para um médico ou paciente. A unidade de processamento central oferece a vantagem da privacidade (todos os dados são armazenados em um local central, com protocolos de segurança uniforme), velocidade e uniformidade de análise de dados. À unidade central de processamento pode então controlar o destino dos dados após o trata- mento do indivíduo. Por exemplo, usando um sistema de comunicação eletrônica, a unidade central pode fornecer dados para o médico, o indivíduo, ou aos pesquisadores.

Em algumas modalidades o indivíduo é capaz de acessar diretamente os dados u- sando o sistema de comunicação eletrônica. O indivíduo pode escolher uma nova interven- ção ou aconselhamento com base nos resultados. Em algumas modalidades os dados são utilizados para fins de pesquisa. Por exemplo, os dados podem ser usados para promover a inclusão a eliminação de marcadores como indicadores úteis de uma determinada condição ou estágio da doença. - S.Kits Em outras modalidades a presente invenção fornece kits para a detecção e caracte- : rização do câncer (por exemplo, para detectar um ou mais dos marcadores, ou para modular aatividadede um peptídeo expresso por um ou mais dos marcadores). Em algumas moda- . lidades os kits contêm anticorpos específicos para um marcador do câncer, além de reagen- tes de detecção e tampões. Em outras modalidades os kits contêm reagentes específicos . para a detecção de RNAm ou DNAc (por exemplo, sondas de oligonucleotídeos ou primers). Em algumas modalidades os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficien- tes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, indicações para en- saios de desempenho e qualquer software necessário para a análise e apresentação dos resultados.

Outra modalidade da presente invenção compreende um kit para testar a presença do polinucleotídeos ou proteínas. O kit pode incluir, por exemplo, um anticorpo para a detec- çãode um bpolipeptídeo ou uma sonda para a detecção de um polinucleotídeo. Além disso, o kit pode incluir uma referência ou amostra de controle; instruções para tratamento das a- mostras, realização do teste e interpretação dos resultados; e tampões e outros reagentes necessários para a realização do teste. Em outras modalidades o kit compreende pares de primers para detectar a expressão de um ou mais dos genes da assinatura genética da célu- la-tronco de tumor sólido. Em outras modalidades o kit é composto por um DNAc ou uma matriz de oligonucleotídeos para detecção da expressão de um ou mais dos genes da assi- natura genética da célula-tronco de tumor sólido.

6.Imageamento in vivo Ú Em algumas modalidades técnicas de imageamento in vivo são utilizadas para vi- . sualizar a expressão de marcadores do câncer em um animal (por exemplo, um mamífero humano ou não-humano). Por exemplo, em algumas modalidades o RNAm do marcador do câncer (por exemplo, RNAm de CXCR1 ou FBXO21) ou proteína (por exemplo, proteína de CXCR1 ou FBXO21) é marcado usando um anticorpo marcado específico para o marcador do câncer.

Um anticorpo especificamente ligado e marcado pode ser detectado em um indi- víduo usando-se um método de imageamento in vivo, incluindo, mas não limitado a cintilo- grafia, tomografia de emissão de pósitrons, tomografia axial computadorizada, método de ressonância magnética ou raios-X, detecção por fluorescência e detecção quimiluminescen- te.

Métodos para gerar anticorpos para os marcadores de câncer da presente invenção são descritos abaixo.

Os métodos de imageamento in vivo da presente invenção são úteis no diagnóstico de cânceres que expressam os marcadores de câncer da célula-tronco de tumor sólido da presente invenção.

O imageamento in vivo é usado para visualizar a presença de um mar- cador indicativo de câncer.

Tais técnicas permitem o diagnóstico sem o desagradável uso de - uma biópsia.

Os métodos de imageamento in vivo da presente invenção também são úteis para fornecer prognósticos para pacientes com câncer.

Por exemplo, a presença de um Í marcador indicativo de células-tronco cancerosas pode ser detectada.

Os métodos de ima- geamento in vivoda presente invenção também podem ser usados para detectar cânceres " metastáticos em outras partes do corpo.

Em algumas modalidades, reagentes (por exemplo, anticorpos) específicos para - CXCR1 ou FBXO21 são marcados com fluorescência.

Os anticorpos marcados são introdu- zidos em um indivíduo (por exemplo, por via oral ou parenteral). Os anticorpos marcados com fluorescência são detectados através de qualquer método adequado (por exemplo, u- sando o aparelho descrito na Patente U.S. 6.198.107, incorporada aqui por referência). Em outras modalidades os anticorpos são marcados radioativamente.

O uso de an- ticorpos para o diagnóstico in vivo é bem conhecido na técnica.

Sumerdon et al., (Nucl.

Med.

Biol 17:247-254 [1990] descreveram e otimizaram um anticorpo-quelante para o imagea- — mento radioimunocintilográfico de tumores usando índio-111 como marcador.

Griffin et al., (J Clin Onc 9:631-640 [1991]) descreveram o uso deste agente na detecção de tumores em pacientes com suspeita de câncer no pâncreas.

O uso de agentes similares com os íons paramagnéticos como marcadores para a ressonância magnética é conhecido na técnica (Lauíffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 [1991]). O marcador utilizado vai de- penderda modalidade de imagem escolhida.

Marcadores radioativos, como índio-111, tec- nécio-99m, ou iodo-131 podem ser usados para varreduras planas ou tomografia computa- dorizada por emissão de fóton único (SPECT). Marcadores que emitem pósitrons, como o

. flúor-19, também podem ser usados para tomografia por emissão de pósitrons (PET). Para a ressonância magnética, íons paramagnéticos, como gadolínio (Ill) ou manganês (II) podem : ser usados.

Metais radioativos com meias-vidas que variam de 1 hora a 3,5 dias estão disponí- veispara conjugação em anticorpos, como o escândio-47 (3,5 dias), gálio-67 (2,8 dias), gá- lio-68 (68 minutos), tecnécio-99m (6 horas) e índio-111 (3,2 dias), dos quais gálio-67, tecné- cio-99m e índio-111 são preferíveis para imageamento por câmera gama, gálio-68 é preferí- vel para tomografia por emissão de pósitrons. Um método útil para marcar anticorpos com estes radiometais é por meio de um agente quelante bifuncional, como o ácido dietilenopentacético (DTPA), conforme descrito, por exemplo, por Khaw et al. (Science 209:295 [1980]) para In-111 e Tc-99m, e por Schein- berg et al. (Science 215:1511 [1982]). Outros agentes quelantes também podem ser usados, mas o 1-(p-carboximetoxibenzilJEDTA e o anidrido carboxicarbônico de DTPA são vantajo- sos, porque seu uso permite a conjugação sem afetar substancialmente a imunorreatividade do anticorpo.

Outro método para o acoplamento de DPTA às proteínas é pelo uso do anidrido cí- . clico de DTPA, como descrito por Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982]) para marcação de albumina com In-111, mas que pode ser adaptado para a marcação de 5 anticorpos. Um método adequado de marcação de anticorpos com Tc-99m que não usa quelaçãocom DPTA é o método de estanhagem Crockford et a/., (Pat. Nº U.S. 4.323.546, . incorporada aqui por referência).

Um método de marcação de imunoglobulinas com Tc-99m é o descrito por Wong et e al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251 [1978]) para proteínas do plasma e recentemente apli- cado com sucesso por Wong et al. (J. Nucl. Med., 23:229 [1981]) para marcar anticorpos.

No caso do radiometais conjugados em um anticorpo específico também é desejá- vel introduzir uma proporção tão elevada do radiomarcador quanto possível na molécula do anticorpo sem destruir a sua imunoespecificidade. Uma melhoria pode ser obtida efetuando radiomarcação na presença do marcador específico do câncer da célula-tronco da presente invenção para garantir que o sítio de ligação ao antígeno no anticorpo seja protegido.

Em outras modalidades o imageamento in vivo biofotônico (Xenogen, Almeda, CA) é utilizado para imageamento in vivo. Este imageamento in vivo em tempo real utiliza lucife- rase. O gene da luciferase é incorporado nas células, microorganismos e animais (por e- xemplo, como uma proteína de fusão com um marcador do câncer da presente invenção). Quando ativa, ela leva a uma reação que emite luz. Una câmera CCD e um software são usados para capturaraimagem e analisá-la.

III. Anticorpos e Fragmentos de Anticorpos A presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de anticorpos isolados contra

. CXCR1, FBXKO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1. O anti- corpo ou fragmento de anticorpo pode ser qualquer anticorpo monoclonal ou policlonal que - reconheça especificamente estas proteínas. Em algumas modalidades a presente invenção fornece anticorpos monoclonais, ou fragmentos dos mesmos, que se ligam especificamente aCXCR1I, FBKO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1. Em algumas modalidades os anticorpos monocionais, ou fragmentos dos mesmos, são anticor- pos quiméricos ou humanizados que se ligam especificamente a essas proteínas. Em outras modalidades os anticorpos monoclonais, ou fragmentos dos mesmos, são anticorpos huma- nos que se ligam especificamente a estas proteínas.

Os anticorpos contra CXCR1, FBXKO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1 encontram uso nos métodos experimentais de diagnóstico e terapêu- ticos aqui descritos. Em certas modalidades os anticorpos da presente invenção são usados para detectar a expressão de uma proteína marcadora da célula-tronco cancerosa em a- mostras biológicas, como, por exemplo, a biópsia do tecido de um paciente, efusão pleural, ouamostrade sangue. As biópsias de tecido podem ser seccionadas e a proteína detectada usando, por exemplo, imunofluorescência ou imuno-histoquímica. Alternativamente, as célu- - las individuais de uma amostra são isoladas e a expressão de proteína detectada em células fixas ou vivas por análise FACS. Além disso, os anticorpos podem ser usados em matrizes Í de proteína para detectar a expressão de um marcador da célula-tronco cancerosa, por e- xemplo, nas células tumorais, em lisados celulares, ou em amostras de outras proteínas. Em o outras modalidades os anticorpos da presente invenção são usados para inibir o crescimen- to de células tumorais pondo os anticorpos em contato com células tumorais, tanto em en- - saios baseados em células in vitro quanto em modelos animais in vivo. Em outras modalida- des os anticorpos são usados para tratar o câncer em um paciente humano através da ad- ministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra um marca- dor da célula-tronco cancerosa (por exemplo, da Tabela 1).

Anticorpos policlonais podem ser preparados por qualquer método conhecido. Anti- corpos policionais podem ser conseguidos por meio da imunização de um animal (por e- xemplo, coelho, rato, camundongo, burro, etc.) por múltiplas injeções por via subcutânea ou intraperitoneal do antígeno relevante (um fragmento de peptídeo purificado, proteína recom- binante de comprimento total, proteína de fusão, etc.) opcionalmente conjugado com hemo- cianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica, etc. diluídos em solução salina estéril e combinadas com um adjuvante (por exemplo, Adjuvante de Freund completo ou incompleto) para formar uma emulsão estável. O anticorpo policlonal é então recuperado do sangue, ascitese semelhantes, de um animal então imunizado. O sangue coletado é coagulado e o soro decantado, clarificado por centrifugação e analisado para a titulação de anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser purificados a partir do soro ou ascite, de acordo com méto-

dos padrão na técnica, incluindo cromatografia por afinidade, cromatografia por troca iônica, Í eletroforese em gel, diálise, etc. ' Os anticorpos monoclonais podem ser preparados através de métodos de hibrido- ma, como os descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Utilizando o método de —hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é imunizado conforme descrito acima para induzir a produção pelos linfócitos de anticorpos que se liga- rão especificamente a um antígeno imunizante.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

Após a imunização os linfócitos são isolados e fundidos com uma linha- gem celular de mieloma adequada, utilizando, por exemplo, polietileno glicol, para formar células de hibridoma que podem depois ser selecionadas a partir de linfócitos não fundidos e células de mieloma.

Hibridomas que produzem os anticorpos monoclionais especificamen- te direcionados contra um antígeno escolhido, como determinado por imunoprecipitação, imunoblotting, ou por um ensaio de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas (ELISA) podem ser reproduzidos tanto em cultura in vitro, usando métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) quanto in vivo, como tumores de ascites em um animal.

Os anticor- - pos monoclonais podem ser então purificados a partir do meio de cultura ou do fluido asciíti- co, conforme descrito acima para os anticorpos policlonais. r Alternativamente, os anticorpos monocionais também podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante, tal como descrito na Patente U.S. 4.816.567. Os polinucleo- Ns tídeos que codificam um anticorpo monoclonal são isolados, como de células B maduras ou células de hibridoma, como por RT-PCR usando primers de oligonucleotídeo que amplificam Fr especificamente os genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo, e sua se- quência é determinada utilizando procedimentos convencionais.

Os polinucleotídeos isola- —dosque codificam das cadeias pesada e leve são depois clonados em vetores de expressão adequados, que, quando transfectados em células hospedeiras, como células de E. coli, células COS de símios, células do ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem proteína da imunoglobulina, anticorpos monoclonais são gerados pelas células do hospedeiro.

Além disso, os anticorpos monoclonais recombinantes, ou fragmen- tosdos mesmos, da espécie desejada podem ser isolados das bibliotecas de exibição de fagos, conforme descrito (McCafferty et a/., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; e Marks et al., 1991, J.

Mol.

Biol., 222:581-597). O(s) polinucleotídeo(s) que codificam um anticorpo monoclonal podem ser modifi- cados adicionalmente em uma série de maneiras diferentes, usando tecnologia de DNA re- —combinante para gerar anticorpos alternativos.

Em uma modalidade os domínios constantes das cadeias leve e pesada de, por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo, po- dem ser substituídos 1) para as regiões de, por exemplo, um anticorpo humano para gerar um anticorpo quimérico ou 2) para um polipeptídeo não-imunoglobulínico para gerar um an- ' ticorpo de fusão. Em outras modalidades as regiões constantes são truncadas ou removidas - para gerar os fragmentos de anticorpos desejados de um anticorpo monoclonal. Além disso, a mutagênese sítio-dirigida ou de alta densidade da região variável pode ser usada para otimizara especificidade, afinidade, etc. de um anticorpo monoclional. Em algumas modalidades da presente invenção o anticorpo monoclonal contra um marcador da célula-tronco cancerosa é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humaniza- dos são anticorpos que contêm sequências mínimas de anticorpos não-humanos (por e- xemplo, murinos) dentro das regiões variáveis. Tais anticorpos são usados terapeuticamente para reduzir a antigenicidade e as respostas a HAMA (anticorpos humanos anti- camundongo) quando administrados a um ser humano. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos com um mínimo de ou nenhuma sequência não- humana. Um anticorpo humano é um anticorpo produzido por um humano ou um anticorpo com uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produzido por um ser humano. Anticorpos humanizados podem ser produzidos usando vários métodos conhecidos - na técnica. Um anticorpo pode ser humanizado substituindo-se a CDR de um anticorpo hu- mano pela de um anticorpo não-humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster, Í etc.) com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas (Jones et a/., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et a/., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, . 239:1534-1536). O anticorpo humanizado pode ser modificado pela substituição do resíduo suplementar, na região da estrutura Fv e/ou dentro dos resíduos não-humanos substituídos - para aperfeiçoar e otimizar a especificidade, afinidade e/ou capacidade do anticorpo. Os anticorpos humanos podem ser diretamente preparados utilizando vários méto- dos conhecidos na técnica. Linfócitos B humanos imortalizados imunizados in vitro ou isola- dos de um indivíduo imunizado que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno- alvo podem ser gerados (Ver, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et a/l., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e Pa- tente U.S. 5.750.373). Além disso, os anticorpos humanos podem ser selecionados a partir de uma biblioteca de fagos, onde esta biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et a/.,, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et a/.,, 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Os anticorpos humanizados também podem ser feitos em camundon- gos transgênicos contendo loci de imunoglobulina humana que são capazes, em imuniza- — ção, de produziro repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Esta abordagem está descrita nas Patentes U.S. 5.545.807;

5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016.

. Esta invenção também engloba anticorpos biespecíficos que reconhecem especifi- camente os marcadores da célula-tronco cancerosa. Anticorpos biespecíficos são anticorpos - que são capazes de reconhecer especificamente e ligar pelo menos dois epítopos diferen- tes. Anticorpos biespecíficos podem ser anticorpos intactos ou fragmentos de anticor- pos. Os métodos de produção de anticorpos biespecíficos são comuns na técnica (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et a/., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et a/., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gru- beretal. 1994, J. Immunol. 152:5368; e Patente U.S. 5.731.168).

Em certas modalidades da invenção pode ser desejável a utilização de fragmentos de anticorpos ao invés de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração do tumor, por exemplo. Várias técnicas são conhecidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos são obtidos através da digestão proteolítica de anticor- pos intactos (por exemplo, Morimoto et a/., 1993, Journal of Biochemical and Biofisical Me- thods 24:107-117 e Brennan et al., 1985, Science, 229:81). No entanto, esses fragmentos - são agora normalmente produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes, tal como descrito acima. Assim, fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem todos ser ex- Í pressos e secretados de E. coli ou outras células do hospedeiro, permitindo assim a produ- çãode grandes quantidades desses fragmentos. Alternativamente, estes fragmentos de an- - ticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpo discutidas acima. O frag- mento de anticorpo anticorpos também podem ser anticorpos lineares, como descrito na - Patente U.S. 5.641.870, por exemplo, e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Ou- tras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos ficará aparente para aquele ver- —sadonatécnica.

Pode ainda ser desejável, especialmente no caso de fragmentos de anticorpos, modificar um anticorpo a fim de aumentar a sua meia-vida sérica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela incorporação de um epítopo de ligação do receptor de salvamento nos fragmentos de anticorpos por mutação na região apropriada no fragmento de anticorpo, ou incorporando o epítopo em uma etiqueta de peptídeo que é então fundida ao fragmento de anticorpo em cada extremidade ou no meio (por exemplo, por síntese de DNA ou peptídeo).

A presente invenção ainda abrange variantes e equivalentes que são substancial- mente homólogas aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, aqui estabelecidos. Estes podem conter, por exemplo, mutações de — substituição conservadora, ou seja, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoá- cidos similares. Por exemplo, a substituição conservadora se refere à substituição de um aminoácido por outro na mesma classe geral, como, por exemplo, um aminoácido por outro

: aminoácido, um aminoácido básico por outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que se pretende pela substituição conservadora do aminoá- - cido é bem conhecido na técnica.

A invenção também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado em um agente citotóxico. Agentes citotóxicos incluem agentes quimioterápicos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de plantas, ou animal, ou fragmentos da mesma), isótopos radioativos (ou seja, um radioconjugado), etc. Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados incluem, por exemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, meifala- no, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes. Toxinas en- zimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usados incluem a cadeia de difteria A, fragmentos ativos não-ligantes da toxina difteria, cadeia da exotoxina A, cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modeccina A, aifa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Fitolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor —damomordica carantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogeli- na, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos - estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados, incluindo 212Bi, 131], 131lh, 90Y e 186Re. Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usando uma íÍ variedade de agentes de ligação da proteína bifuncional, tais como N-succinimidil-3-(2- piridiiditioI)propionato (SPDP) iminotiolano (TI), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (como suberato de disuccinimídil), aldeídos (como glutareideído), compostos bis-azido (como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), deri- . vados de bis-diazônio (como bis(p-diazoniombenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-diflior-2,4- — dinitrobenzeno). Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, como caliqueamicina, maitansinoides, tricoteno e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, também podem ser usados. Em algumas modalidades o anticorpo da invenção contém regiões Fc humanas que são modificadas para aumentar a função efetora, por exemplo, citotoxicidade antígeno- dependente mediada por células (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Isto pode ser conseguido através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidos na região Fc para permitir a formação da ligação dissulfeto inter-cadeia nesta região para melhorar a morte celular mediada por complemento e a citotoxicidade antígeno- — dependente mediada por células (ADCC) (Caron et a/., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922). Anticorpos homodiméricos com atividade anti- tumoral reforçada também podem ser preparados usando ligantes cruzados heterobifuncio-

nais, conforme descrito em Wolff et a/., 1993, Cancer Research 53:2560-2565. Como alter- nativa, pode ser projetad um anticorpo que tem regiões Fc duplas (Stevenson et a/., 1989, + Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

IV. Triagem de Fármacos Em algumas modalidades a presente invenção fornece ensaios de triagem de fár- macos (por exemplo, para selecionar fármacos anti-câncer). Os métodos de triagem da pre- sente invenção utilizam marcadores do câncer da célula-tronco (por exemplo, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP e outras proteínas da Tabela 1) identificados usando os métodos da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades a presen- teinvenção fornece métodos de triagem para compostos que alteram (por exemplo, aumen- tam ou reduzem) a expressão, ou a atividade de CXCR1 ou FBXO21. Em algumas modali- dades compostos candidatos são agentes antisense ou agentes siRNA (por exemplo, oligo- nucleotídeos) direcionados contra marcadores do câncer. Em outras modalidades compos- tos candidatos são anticorpos que se ligam especificamente a um marcador de câncer das células-tronco da presente invenção. Em certas modalidades, bibliotecas de compostos de moléculas pequenas são selecionadas usando os métodos descritos aqui.

- Em um método de triagem os compostos candidatos são avaliados pela sua capa- cidade de alterar a expressão dos marcadores de células-tronco cancerosas pelo contato do É composto com uma célula que expressa um marcador de câncer de células-tronco e, em seguida, avaliando o efeito dos compostos candidatos na expressão. Em algumas modali- a dades o efeito dos compostos candidatos na expressão de um gene do marcador do câncer é analisado através da detecção do nível do RNAm do marcador de câncer expresso pela - célula. A expressão de RNAm pode ser detectada por qualquer método adequado. Em ou- tras modalidades o efeito dos compostos candidatos na expressão de genes dos marcado- res de câncer é analisado através da medição do nível de polipeptídeos codificados pelos marcadores de câncer. O nível de polipeptídeos expressos podem ser medidos utilizando qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado aqueles divulgados aqui. Em algu- mas modalidades outras alterações na biologia celular (apoptose, por exemplo) são detec- tadas.

Especificamente, a presente invenção fornece métodos de triagem para identífica- ção de moduladores, ou seja, compostos candidatos de ensaio ou agentes (por exemplo, proteínas, peptídeos, peptidomiméticos, peptoides, pequenas moléculas ou outros fárma- cos) que se ligam a, ou alteram a sinalização ou função associada a marcadores de câncer da presente invenção, têm um efeito inibitório (ou estimulante) em, por exemplo, expressão do marcador células-tronco cancerosas ou atividade dos marcadores de câncer, ou têm um efeito estimulador ou inibidor, por exemplo, a expressão ou a atividade de um substrato do marcador do câncer. Os compostos assim identificados podem ser usados para modular a atividade dos produtos do gene-alvo (por exemplo, genes de marcadores de células-tronco À cancerosas, como CXCR1 ou FBXO21), direta ou indiretamente em um protocolo terapêuti- - co para elaborar a função biológica do produto do gene-alvo, ou para identificar compostos que rompem as interações normais do gene-alvo. Compostos que inibem a atividade ou ex- pressão de marcadores de câncer são úteis no tratamento de distúrbios proliferativos, por exemplo, câncer, particularmente metastático, ou eliminação ou controle de células-tronco tumorais para prevenir ou reduzir o risco de câncer. Em uma modalidade a invenção fornece ensaios para a triagem de compostos de ensaio ou candidatos que são substratos de uma proteína ou polipeptídeo marcadores de câncer ou uma porção biologicamente ativa da mesma. Em outra modalidade a invenção fornece ensaios para a triagem de compostos de ensaio ou candidatos que se ligam ou mo- dulam a atividade de uma proteína ou polipeptídeo marcadores do câncer ou uma porção biologicamente ativa do mesmo. Os compostos de ensaio da presente invenção podem ser obtidos utilizando qual- —queruma das várias abordagens em métodos de biblioteca combinatória conhecidos na téc- nica, incluindo bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas com - funcionalidades de peptídeos, mas com uma nova estrutura não-peptídica, que são resisten- tes à degradação enzimática, mas que, todavia, permenacem bioativos; ver, por exemplo, R Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]); bibliotecas fase de solução ou fase sólida paralelas espacialmente endereçáveis; métodos de biblioteca sintéticos que requerem . deconvolução; método de biblioteca "uma microesfera um composto"; e métodos de bibliote- ca sintéticos que usam seleção de afinidade cromatográfica. As abordagens de biblioteca . biológica e biblioteca peptoide são preferidas para uso com bibliotecas de peptídeos, en- quanto as outra quatro abordagens são aplicáveis aos oligôêmeros peptídicos não-peptídicos ou bibliotecas de moléculas pequenas de compostos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encon- trados na técnica, por exemplo, em DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 90:6909 [1993]; Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sci. EUA 91:11422 [1994]; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho et al., Science 261:1303 [1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; e Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 [1994]. Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Hou- ghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), ou em microesferas (Lam, Nature 354:82-84 — [1991]), chips (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bactérias ou esporos (Patente Nº U.S.

5.223.409; incorporada aqui por referência), plasmídeos (Cuil et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992]) ou em fagos (Scott e Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin

Science 249:404-406 [1990]; Cwirla et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, i J.

Mol.

Biol. 222:301 [1991]). - Em uma modalidade um ensaio é um ensaio baseado em células no qual uma célu- la que expressa uma proteína marcadora de células-tronco cancerosas ou porção biologi- camente ativa dela é posta em contato com um composto de ensaio, e a capacidade do composto de ensaio para a atividade do marcador do câncer modulado é determinada.

A determinação da capacidade do composto de ensaio para modular a atividade marcadora de células-tronco cancerosas pode ser realizada através do monitoramento, por exemplo, de mudanças na atividade enzimática.

A célula, por exemplo, pode ser originária de mamíferos.

A capacidade do composto de ensaio de modular o marcador do câncer de ligação a um composto, por exemplo, um substrato do marcador de câncer de células-tronco, tam- bém pode ser avaliada.

Isto pode ser conseguido, por exemplo, pelo acoplamento do com- plexo, por exemplo, o substrato, com um radioisótopo ou etiqueta enzimáticas de modo que a ligação do composto, por exemplo, o substrato, a um marcador do câncer possa ser de- terminada através da detecção do composto marcado, por exemplo, substrato, em um com- plexo. - Alternativamente, o marcador de câncer de células-tronco é acoplado com um ra- dioisótopo ou etiqueta enzimática para monitorar a capacidade de um composto de ensaio í de modular o marcador do câncer que se liga a um substrato de marcadores de câncer em um complexo.

Por exemplo, os compostos (por exemplo, substratos) podem ser marcados .. com 1251, 35S, 14C ou 3H, direta ou indiretamente, e o radioisótopo detectado através da contagem direta de radioemissão ou por contagem de cintilação.

Alternativamente, os com- - postos podem ser marcados enzimaticamente com, por exemplo, peroxidase, fosfatase alca- lina, ou luciferase, e a etiqueta enzimática pode ser detectada por determinação de conver- sãodeum substrato adequado ao produto.

A capacidade de um composto (por exemplo, um substrato marcador de câncer de células-tronco) de interagir com um marcador de câncer de células-tronco com ou sem a marcação de qualquer um dos interagentes pode ser avaliada.

Por exemplo, um microfisiô- metro pode ser usado para detectar a interação de um composto com um marcador de cân- cersem a marcação do composto ou do marcador de câncer (McConnell et al.

Science 257:1906-1912 [1992]). Conforme utilizado aqui, um "microfisiômetro" (por exemplo, Cito- sensor) é um instrumento analítico que mede a taxa na qual uma célula acidifica seu ambi- ente usando um sensor de luz endereçável potenciométrica (LAPS). As alterações nesta taxa de acidificação podem ser usadas como um indicador da interação entre um composto eosmarcadores de câncer.

Em outra modalidade um ensaio livre de células é fornecido em que uma proteína marcadora de câncer ou porção biologicamente ativa dela é posta em contato com um com-

: posto de ensaio e a capacidade do composto de ensaio de se ligar à proteína do marcador de células-tronco cancerígenas ou porção biologicamente da mesma será avaliada. Porções - biologicamente ativas de proteínas de marcadores do câncer a serem usadas em ensaios da presente invenção incluem fragmentos que participam das interações com substratos ou outras proteínas, por exemplo, fragmentos com alta pontuação de probabilidade de superfí- cie.

Ensaios livres de células envolvem a preparação de uma mistura de reação da pro- teina do gene-alvo e do composto de ensaio sob condições e por um tempo suficiente para que os dois componentes interajam e se liguem, formando assim um complexo que pode ser removido e/ou detectado.

A interação entre duas moléculas também pode ser detectada, por exemplo, utili- zando transferência de energia de fluorescência (FRET) (ver, por exemplo, Lakowicz et al., Patente Nº U.S. 5.631.169; Stavrianopoulos et a/., Patente Nº U.S. 4.968.103; cada uma das quais é incorporada aqui por referência). Um marcador fluoróforo é selecionado de modo quea energia fluorescente emitida pela molécula de um primeiro doador será absorvida por uma etiqueta fluorescente em uma segunda molécula do "receptor", que por sua vez é ca- - paz de fluorescer devido à energia absorvida. Alternativamente, a molécula da proteína do 'doador' pode simplesmente utilizar a Í energia fluorescente natural dos resíduos de triptofano. São escolhidos marcadores que emitem diferentes comprimentos de onda de luz, de tal forma que a etiqueta da molécula do . "receptor" possa ser diferenciada da do "doador". Uma vez que a eficiência da transferência de energia entre as etiquetas está relacionada com a distância que separa as moléculas, as . relações espaciais entre as moléculas podem ser avaliadas. Em uma situação em que a ligação ocorre entre as moléculas, a emissão fluorescente da etiqueta da molécula do "re- —ceptor"no ensaio deve ser máxima. Um evento de ligação FRET pode ser facilmente medi- do através da detecção fluorométrica padrão, bem conhecida na técnica (por exemplo, u- sando um fluorímetro).

Em outra modalidade a determinação da capacidade da proteína dos marcadores da célula-tronco cancerosa de se ligar a uma molécula-alvo pode ser realizada utilizando a —Análisede Interação Biomolecular em tempo real (BIA) (ver, por exemplo, Sjolander e Urba- niczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 [1991] e Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705

[1995]). "Ressonância de plásmon de superfície" ou "BIA" detecta interações bioespecíficas em tempo real, sem a marcação de nenhum dos interagentes (por exemplo, BlAcore). As alterações na massa na superfície de ligação (indicativas de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração da luz perto da superfície (o fenômeno ótico de resso- nância de plásmon de superfície (SPR)), resultando em um sinal detectável que pode ser usado como uma indicação de reações em tempo real entre as moléculas biológicas.

U Em uma modalidade o produto do gene-alvo ou da substância de ensaio é ancora- do em uma fase sólida. O produto do gene-alvo/composto de ensaio complexo ancorados . na fase sólida pode ser detectado no final da reação. O produto do gene-alvo pode ser an- corado em uma superfície sólida e o composto de ensaio (que não está ancorado) pode ser marcado, quer direta quer indiretamente, com as etiquetas detectáveis aqui discutidas.

Pode ser desejável imobilizar os marcadores de células-tronco cancerosas, um an- ticorpo marcador anti-câncer, ou sua molécula-alvo para facilitar a separação de formas complexadas de formas não complexadas de uma ou de ambas as proteínas, bem como acomodar a automação do ensaio. A ligação de um composto de ensaio a uma proteína do marcador da célula-tronco cancerosa, ou interação de uma proteína do marcador de câncer com uma molécula-alvo na presença e na ausência de um composto candidato pode ser realizada em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos destes re- cipientes incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos de micro-centrífuga. Em uma modalidade uma proteína de fusão pode ser fornecida, o que acrescenta um domínio que permite que uma ou ambas as proteínas se liguem a uma matriz. Por exemplo, as prote- Ínas de fusão do marcador de câncer da glutationa-S-transferase ou as proteínas de fusão - da glutationa-S-transferase/alvo podem ser adsorvidos em microesferas de glutationa sefa- rose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ou placas de microtitulação de glutationa-derivada, r que são então combinadas com o composto de ensaio ou o composto de ensaio e a proteí- —na-alvo não-adsorvida ou a proteína marcador do câncer, e a mistura é incubada em condi- o ções propícias para a formação do complexo (por exemplo, em condições fisiológicas de sal e pH). Após a incubação, as microesferas ou poços de placas de microtitulação são lavadas f para remover quaisquer componentes não ligados, a matriz é imobilizada, no caso das mi- croesferas, o complexo determinado, direta ou indiretamente, por exemplo, como descrito acima Alternativamente, os complexos podem ser dissociados da matriz e o nível de liga- ção ou atividade dos marcadores de câncer determinado por técnicas convencionais. Outras técnicas para imobilizar proteínas de marcadores de câncer ou uma molécula-alvo em ma- trizes incluem o uso de uma conjugação de biotina e estreptavidina. Proteínas do marcador de câncer ou moléculas-alvo biotiniladas podem ser preparadas a partir de biotina-NHS (N- hidroxi-succinimida) utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, kit de biotinila- ção, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e imobilizados em poços de placas revestidas com es- treptavidina de 96 poços (Pierce Chemical).

A fim de realizar o ensaio, o componente não imobilizado é adicionado à superfície revestida que contém o componente ancorado. Após a reação estar completa, os compo- nentes não reagidos são removidos (por exemplo, por lavagem) sob condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na superfície sólida. A detecção dos complexos ancorados na superfície sólida pode ser realizada de várias maneiras. Quando o componente anteriormente não imobilizado é pré-marcado, a detecção da etique- . ta imobilizada na superfície indica que os complexos foram formados. Quando o componen- te anteriormente não imobilizado não é pré-marcado, uma etiqueta indireta pode ser usada para detectar complexos ancorados na superfície; por exemplo, usando um anticorpo mar- cado específico para o componente imobilizado (o anticorpo, por sua vez, pode ser direta- mente ou indiretamente marcado com, por exemplo, um anticorpo marcado anti-IgG).

Este ensaio é realizado utilizando anticorpos reativos com a proteína do marcador de câncer de células-tronco ou moléculas-alvo, mas que não interferem na ligação da prote- ínade marcadores das célula-tronco cancerosas com sua molécula-alvo. Esses anticorpos podem ser derivados em poços da placa, e o alvo não ligado ou proteína dos marcadores de câncer presos nos poços pela conjugação de anticorpos. Métodos para a detecção de tais complexos, além dos descritos acima para os complexos GST-imobilizados, incluem imuno- detecção de complexos utilizando anticorpos reativos com a proteína do marcador de câncer ouuma molécula-alvo, bem como ensaios de enzima ligada que se baseiam na detecção de uma atividade enzimática associada à proteína do marcador de câncer ou uma molécula- - alvo. Alternativamente, os ensaios livres de células podem ser realizados em uma fase É líquida. Neste ensaio, os produtos da reação são separados de componentes que não reagi- ram, por qualquer uma dentre uma série de técnicas padrão, incluindo, mas não limitadas a: . centrifugação diferencial (ver, por exemplo, Rivas e Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7

[1993]); cromatografia (cromatografia por filtração em gel, cromatografia por troca iônica); - eletroforese (ver, por exemplo, Ausubel et a/., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York.); e imunoprecipitação (ver, por exemplo, Ausubel et a/., eds. Cur- rent Protocois in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York). Tais resinas e técnicas cro- matográficas são conhecidas daqueles versados na técnica (Ver, por exemplo, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699:499- 525 [1997]). Além disso, a transferência de energia de fluorescência também pode ser con- venientemente utilizada, como descrito aqui, para detectar ligação sem purificação adicional — do complexo a partir de solução.

O ensaio pode incluir por a proteína dos marcadores de células-tronco cancerosas ou porções biologicamente ativas das mesmas em contato com um composto conhecido que se liga ao marcador de câncer para formar uma mistura de ensaio, por a mistura de en- saio em contato com um composto de ensaio, e determinar a capacidade do composto de ensaiode interagir com uma proteina marcador do câncer, Que in determinar a capacidade do Composto de Ensaio para interagir com uma proteína do marcador de câncer inclui de- terminar a capacidade do composto de ensaio de se ligar preferencialmente a marcadores

' de câncer ou uma porção biologicamente ativa dos mesmos, ou modular a atividade de uma molécula-alvo em comparação com os composto conhecido. - Na medida em que surgem os marcadores de células-tronco cancerosas podem, in vivo, interagir com um ou mais macromoléculas celulares ou extracelulares, tais como prote- ínas,os inibidores de tal interação são úteis. Um ensaio homogêneo pode ser usado para identificar os inibidores.

Por exemplo, um complexo pré-formado do produto do gene-alvo e do produto par- ceiro de ligação celular interativa ou extracelular é preparado de tal forma que os produtos de gene-alvo ou os seus parceiros de ligação são marcados, mas o sinal gerado pela etique- taé extinto devido à formação do complexo (ver, por exemplo, Patente Nº U.S. 4.109.496, incorporada aqui por referência, que utiliza essa abordagem para os imunoensaios). A adi- ção de uma substância de ensaio que compete com e desloca uma das espécies do com- plexo pré-formado vai resultar na geração de um sinal acima do fundo. Desta forma, as substâncias de ensaio que destroem a interação do parceiro de ligação ao produto do gene- alvo podem ser identificadas. Alternativamente, proteínas de marcadores de câncer podem ser usadas como uma "proteína isca" em um ensaio duplo-híbrido, ou ensaio triplo-híbrido - (ver, por exemplo, Patente Nº U.S. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72:223-232 [1993]; Madura et al., J. Biol. Chem. 268.12046-12054 [1993]; Bartel et al., Biotechniques 14:920-924 SJ [1993]; hwabuchi et a/., Oncogene 8:1693-1696 [1993]; e Brent WO 94/10300; cada uma das quais é incorporada aqui por referência), para identificar outras proteínas que se ligam ou " interagem com marcadores de câncer ("proteínas de ligação ao marcador de câncer" ou pl- marcador de câncer") e estão envolvidas na atividade do marcador de câncer. Tais pls- mar- - cador de câncer podem ser ativadoras ou inibidoras de sinais pelas proteínas do marcador de câncer ou alvos, como, por exemplo, elementos a jusante de uma via de sinalização me- —diadapormarcadores de câncer.

Moduladores de expressão de marcadores de câncer também podem ser identifica- dos. Por exemplo, uma mistura de células ou livre de células é posta em contato com um composto de candidato do RNAm do marcador de câncer ou proteína avaliada em relação ao nível de expressão do RNAm de proteína ou marcador de câncer de células-tronco na —ausênciado composto candidato. Quando a expressão do RNAm de proteína ou marcador de câncer é maior na presença do composto candidato do que na sua ausência, o composto candidato é identificado como um estimulador da expressão do RNAm da proteína ou mar- cador de câncer. Alternativamente, quando a expressão do RNAm da proteína ou marcador de câncer é menor (ou seja, significativamente menor, estatisticamente) na presença do — composto candidato do que na sua ausência, o composto candidato é identificado como um inibidor do RNAm da proteína ou marcador de câncer. O nível da expressão do RNAm da proteína ou marcador de câncer pode ser determinado por métodos descritos aqui para a

' detecção de RNAm da proteína ou marcador de câncer.

Esta invenção refere-se ainda a novos agentes identificados pelos testes de triagem - descritos acima (Ver, por exemplo, a descrição abaixo de terapias contra o câncer). Assim, é do escopo desta invenção utilizar ainda um agente identificado conforme descrito aqui (por exemplo, um agente marcador do marcadore de câncer, uma molécula de ácido nucleico do marcador de câncer antisense, uma molécula de siRNA, um anticorpo específico do marca- dor de câncer, ou um parceiro de ligação ao marcador de câncer) em um modelo animal apropriado (como aqueles descritos aqui) para determinar a eficácia, toxicidade, efeitos co- laterais, ou mecanismo de ação do tratamento com um desses agentes.

Além disso, novos agentes identificados pelos ensaios de triagem descritos acima podem ser, por exemplo, usados em tratamentos conforme descrito aqui (por exemplo, para tratar um paciente huma- no que tem câncer). Em certas modalidades a presente invenção emprega mamoesferas não-aderentes para vários procedimentos de triagem, incluindo métodos de triagem de antagonistas da via desinalização CXCR1 ou FBXKO21. Mamoesferas não-aderentes são um sistema de cultura in vitro que permite a propagação de células-tronco epiteliais mamárias humanas primárias - e células progenitoras em um estado indiferenciado, com base na sua capacidade de se proliferar em suspensão como estruturas esféricas.

Mamoesferas não-aderentes foram des- : critas previamente em Dontu et a/ Genes Dev. 2003 May 15;17(10):1253-70, e Dontu et al., Breast Cancer Res. 2004;6(6):R605-15, ambos incorporados aqui por referência.

Essas re- ferências são incorporadas por referência em suas totalidades e especificamente para o ensino da construção e utilização de mamoesferas não-aderentes.

Conforme descrito em - Dontu et a/.,, as mamoesferas foram caracterizadas como sendo compostas por células- tronco e progenitoras capazes de auto-renovação e diferenciação de multi-linhagem.

Dontu etal também descreve que as mamoesferas contêm células capazes de gerar clonalmente estruturas ductal-alveolares funcionais complexas em sistemas de cultura 3-D reconstituídos em Matrigel.

Em certas modalidades, os seguintes métodos de seleção exemplares são empre- gados.

Para estudos in vitro, poderia-se tratar células com construções adenovirais expres- —sando controle ou siRNA candidato de CXCR1 ou FBXO21 (m.o.i. 10 a 100) por três dias ou um candidato de molécula pequena (por exemplo, o derivado PHA665752) (0,1-0,5 uM) por 3 dias e comparar a capacidade de CXCR1+ ou FBXO21 + células para formar as esfe- ras do tumor comparadas em células não tratadas contra tratadas.

Para estudos in vivo, poderia-se infectar células humanas de câncer de mama com um lentivírus expressando luciferase para acompanhar o crescimento do tumor.

Células cancerosas que expressam luciferase poderiam ser injetadas no tecido da mama e tumores de aproximadamente 0,5- 0,7 cm de tamanho poderiam ser estabelecidos, com 5 animais por grupo.

Animais com tu-

. mores estabelecidos poderiam então ser tratados com um inibidor de FBKO21 ou CXCR1 candidato (diariamente i.v. 30mg/kg/dia por 7 dias), ou controle do veículo. Poderiam ser - realizados estudos em paralelo usando infecção com adenovírus expressando controle ou sSIiRNA de CXCR1 ou FBXO21 candidato (m.o.i. 100 ou 500 por 7 dias). Animais poderiam ser visualizados nos dias 7, 14, 21 e 28 para avaliar o tamanho do tumor e, em seguida, serem sacrificados. O tamanho do tumor poderia ser adicionalmente avaliado na autópsia e uma parte do tumor corado para avaliar a histologia do tumor. O restante do tumor poderia ser coletado e classificado para avaliar o percentual de células positivas para CXCR1 ou FBXO21 e negativas para CXCR1 ou FBXO21. Para verificar se a administração de infecção por adenovírus com inibidor candidato de CXCR1 ou FBXO21 e siRNA candidato de CXCR1 ou FBXO21 está inibindo a função de sinalização de CXCR1 ou FBXO21, fosforilação de mediadores a jusante, como Gab-1 e ERK poderia ser examinada (veja, Chistensen et al., Cancer Res., 2003; 63:7345-7355, aqui incorporado como referência). V.Terapias para Câncer Em algumas modalidades, a presente invenção fornece terapias para o câncer. Em algumas modalidades, terapias se direcionam a marcadores de câncer (por exemplo, inclu- - indo mas não limitando a, CXCR1 ou FBXO21 e proteínas na via de sinalização de CXCR1 ou FBXO21). Em algumas modalidades, qualquer terapia para células-tronco cancerosas SÍ conhecida ou posteriormente desenvolvida pode ser usada. Por exemplo, agentes terapêuti- cos para células-tronco cancerosas são descritos nas Pats. US 6.984.522 e 7.115.360 e pedidos WOO03/050502, WO05/074633 e WOO05/005601, aqui incorporados como referência em suas totalidades. - Terapia com Anticorpo Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos que se direcio- nam aos tumores que expressam um marcador canceroso de células-tronco da presente invenção. Qualquer anticorpo adequado (por exemplo, monocional, policlonal, ou sintético) pode ser utilizado nos métodos terapêuticos aqui divulgados. Em algumas modalidades, os anticorpos utilizados para terapia de câncer são anticorpos humanizados. Métodos para a humanização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patentes US

6.180.370, 5.585.089, 6.054.297 e 5.565.332; cada uma das quais é aqui incorporada como referência). Em algumas modalidades, os anticorpos terapêuticos incluem um anticorpo gerado contra um marcador cancerosos de células-tronco da presente invenção, onde o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Nessas modalidades, é gerado um agente terapêutico tumor-específico que não se direciona às células normais, reduzindo assim muitos dos efei- tos colaterais nocivos da quimioterapia tradicional. Para determinadas aplicações, prevê-se que os agentes terapêuticos serão agentes farmacológicos que atuarão como agentes úteis para a fixação de anticorpos, particularmente agentes citotóxicos ou de outra forma anticelu- lares com a capacidade de matar ou suprimir o crescimento ou divisão celular de células - endoteliais. A presente invenção contempla o uso de qualquer agente farmacológico que possa ser conjugado a um anticorpo, e distribuído na forma ativa. Agentes anticelulares e- xemplares incluem agentes quimioterápicos, radioisótopos e citotoxinas. Os anticorpos tera- pêuticos da presente invenção podem incluir uma variedade de moléculas citotóxicas, inclu- indo mas não limitando a, isótopos radioativos (por exemplo, iodo-131, iodo-123, tecnécio- 99m, índio-111, rênio-188, rênio-186, gálio-67, cobre-67, ítrio-290, iodo-125 ou astato-211), hormônios, como um esteroide, antimetabólitos, como citosinas (por exemplo, arabinosídeo, fluoruracil, metotrexato, ou aminopterina; uma antraciclina; mitomicina O), vinca alcaloides (por exemplo, demecolcina; etoposídeo; mitramicina) e agente alquilante antitumoral, como clorambucil e melfalano. Outras modalidades podem incluir agentes como um coagulante, uma citocina, fator de crescimento, endotoxina bacteriana ou a molécula de lipídio de endo- toxina bacteriana. Por exemplo, em algumas modalidades, agentes terapêuticos incluirão toxina derivada de plantas, fungos ou bactérias, como toxinas de cadeia A, uma proteína inativadora de ribossomo, a-sarcina, aspergillina, restrictocina, uma ribonuclease, toxina - diftérica ou exotoxina de pseudomonas, para citar apenas alguns exemplos. Em algumas modalidades, a cadeia A de ricina deglicosilada é utilizada. s De qualquer modo, é proposto que os agentes como esses possam, se desejado, ser conjugados com sucesso a um anticorpo, de forma que permita o seu direcionamento, . internalização, liberação ou apresentação aos componentes sanguíneos no sítio das células tumorais alvo conforme necessário, utilizando-se a tecnologia de conjugação conhecida (ve- - ja, por exemplo, Ghose et al., Methods Enzymol., 93:280 [1983]). Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece imunotoxinas que se direcionam ao marcador canceroso de células-tronco da presente invenção. Imuno- toxinas são conjugados de um agente de direcionamento específico tipicamente um anticor- po ou fragmento direcionado para tumor, com um agente citotóxico, como uma molécula de toxina. O agente de direcionamento dirige a toxina para e, desse modo, elimina seletivamen- te, células portadoras do antígeno alvo. Em algumas modalidades, os anticorpos terapêuti- cosempregam reticuladores que proporcionam alta estabilidade in vivo (Thorpe et a/., Can- cer Res., 48:6396 [1988]).

Em outras modalidades, particularmente aquelas que envolvem o tratamento de tumores sólidos, os anticorpos são projetados para ter um efeito citotóxico ou de oura forma anticelular contra a vasculatura do tumor, suprimindo o crescimento ou a divisão celular das —célulasdo endotélio vascular. Este ataque é destinado a levar a um colapso vascular locali- zado do tumor, privando as células tumorais, particularmente aquelas células tumorais da vasculatura distal, de oxigênio e nutrientes, levando por fim à morte celular e necrose do

' tumor. Em algumas modalidades, a terapêutica baseada em anticorpos é formulada como - composições farmacêuticas, como descrito abaixo. Em algumas modalidades, a administra- ção de uma composição de anticorpo da presente invenção resulta em uma redução mensu- —ráveldo câncer (por exemplo, redução ou eliminação do tumor).

VI.Therapeutic Compositions and Administration Uma composição farmacêutica contendo um regulador de tumorigênese de acordo com a presente invenção pode ser administrada por qualquer método eficaz. Por exemplo, um antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1, ou outro agente terapêutico que atue como um antagonista de proteínas na via de transdução de sinal/resposta de IL8-CXCR1, pode ser administrado por qualquer método eficaz. Em certas modalidades da presente in- venção, o agente terapêutico compreende repertaxina ou seu derivativo.

Em certas modalidades, uma solução adequada fisiologicamente contendo uma concentração eficaz de um antagonista da via de sinalização de IL8&-CXCR1 pode ser admi- nistrada por via tópica, intraocular, parenteral, oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou por qualquer outro meio eficaz. Em particular, o agente antagonista da via de - sinalização de IL8-CXCR1 pode ser injetado diretamente em um câncer ou tumor alvo (por exemplo, no tecido de mama) por uma agulha em quantidades eficazes para tratar as célu- SÍ las tumorais do tecido alvo. Em alternativa, um câncer ou tumor presente em uma cavidade corporal, como no olho, trato gastrointestinal, trato geniturinário (por exemplo, a bexiga uri- a nária), sistema pulmonar e brônquico e similares, pode receber uma composição fisiologi- camente adequada (por exemplo, uma solução como uma salina ou tampão fosfato, uma - suspensão, ou uma emulsão, que é estéril) contendo uma concentração eficaz de um anta- gonista da via de sinalização de IL8-CXCR1 através da injecção direta com uma agulha ou através de um cateter ou outro tubo de distribuição colocado no órgão oco afligido com cân- cer ou tumor. Qualquer dispositivo de imagem eficaz, tais como raios-X, ultrassom, ou sis- tema de visualização por fibra óptica pode ser usado para localizar o tecido-alvo e guiar a agulha ou o tubo do cateter. Em outra alternativa, uma solução fisiologicamente adequada, contendo uma concentração eficaz de um antagonista da via de sinalização de ILB-CXCR1, pode ser administrada por via sistêmica na circulação sanguínea para tratar um câncer ou tumor que não pode ser diretamente atingido ou anatomicamente isolado.

Tais manipulações têm em comum o objetivo de colocar o antagonista da via de si- nalização de ILG-CXCR1 em contato suficiente com o tumor alvo para permitir que o anta- gonista entre em contato, transduza ou transfecte as células tumorais (dependendo da natu- — rezado agente). Em uma modalidade, os tumores sólidos presentes nos revestimentos epi- teliais dos órgãos ocos podem ser tratados através da infusão da suspensão em um órgão oco cheio de fluido, ou por pulverização ou nebulização em um órgão oco cheio de ar. As-

. sim, as células tumorais (tais como células-tronco de tumor sólido) podem estar presentes no ou entre o tecido epitelial no revestimento da árvore brônquica pulmonar, no revestimento . do trato gastrointestinal, no revestimento do trato reprodutor feminino, no trato geniturinário, na vesícula biliar e qualquer outro tecido de órgãos acessível ao contato pelo antagonista da viade sinalização de ILE-CXCR1. Em outra modalidade, o tumor sólido pode estar localiza- do no ou sobre o revestimento do sistema nervoso central, como, por exemplo, a medula espinhal, raízes nervosas ou cérebro, de modo que o antagonista da via de sinalização de ILB-CXCR1 infundido no líquido cefalorraquidiano entre em contato e transduza as células do tumor sólido nesse espaço. Alguém versado na técnica da oncologia pode apreciar que o antagonista pode ser administrado ao tumor sólido por injeção direta no tumor de forma que o antagonista entra em contato e afeta as células tumorais dentro do tumor.

As células tumorigênicas identificadas pela presente invenção também podem ser usadas para aumentar anticorpos anti-células cancerosas. Em uma modalidade, o método envolve a obtenção de uma população enriquecida por células tumorigênicas ou células tu- —morigênicas isoladas, o tratamento da população para evitar a replicação celular (por exem- plo, por irradiação) e a administração das células tratadas a um indivíduo humano ou ani- mal, em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune para células-tronco de tu- mor sólido. Para orientação quanto a uma dose eficaz de células a ser injetada ou adminis- Í trada por via oral; veja, Pat. US Nos. 6.218.166, 6.207.147 e 6.156.305, aqui incorporadas como referência. Em outra modalidade, o método envolve a obtenção de uma população a enriquecida por células-tronco de tumor sólido ou células-tronco de tumor sólido isoladas; a mistura das células-tronco tumorais em uma cultura in vitro com células imunes efetoras (de - acordo com métodos imunológicos conhecidos na técnica) de um ser humano ou animal hospedeiro, no qual o anticorpo é para ser gerado; a remoção das células imunes efetoras da cultura; o transplante das células imunes efetoras em um animal hospedeiro, em uma dose que é eficaz para estimular uma resposta imune no animal.

Em algumas modalidades da presente invenção, os agentes terapêuticos antitumo- rigênicos (por exemplo, antagonistas da via de sinalização de IL8-CXCR1) da presente invenção são co-administrados com outras terapias antineoplásicas. Uma ampla gama de agentes terapêuticos são úteis com a presente invenção. Qualquer agente terapêutico que pode ser co-administrado com os agentes da presente invenção, ou associado aos agentes da presente invenção é adequado para uso nos métodos da presente invenção.

Várias classes de agentes antineoplásicos (p. ex., anticancerígenos) estão previs- tas para uso em certas modalidades da presente invenção. Agentes anticancerígenos ade- —quados parauso coma presente invenção incluem, mas não estão limitados a, agentes que induzem apoptose, agentes que inibem a função da adenosina desaminase, inibem a bios- síntese de pirimidina, inibem a biossíntese do anel de purina, inibem interconversões nu-

' cleotídicas, inibem a ribonucleotídeo redutase, inibem a síntese de timidina monofosfato (TMP), inibem a redução de di-hidrofolato, inibem a síntese de DNA, formam adutos com o - DNA, causam danos ao DNA, inibem o reparo do DNA, se intercalam com o DNA, desami- nam asparaginas, inibem a síntese de RNA, inibem a síntese ou a estabilidade proteica, inibema síntese ou função dos microtúbulos e semelhantes.

Em algumas modalidades, agentes anticancerígenos exemplares adequados para uso em composições e métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: 1) alcaloides, incluindo inibidores de microtúbulos (p. ex., vincristina, vimblastina e vindesi- na, etc.), estabilizadores de microtúbulos (p. ex., paclitaxel (TAXOL) e docetaxel, etc.) e ini- —bidores de função da cromatina, incluindo inibidores da topoisomerase, como epipodofiloto- xinas (p. ex., etoposídeo (VP-16) e teniposídeo (VM-26), etc.) e agentes que têm como alvo a topoisomerase | (p. ex., camptotecina e isirinotecano (CPT-11), etc.); 2) agentes de liga- ção ao DNA covalentes (agentes alquilantes), incluindo mostardas nitrogenadas (p. ex., me- cloretamina, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida e busuifano (MYLERAN), etc.), nitrosou- reias (p. ex., carmustina, lomustina e semustina, etc.) e outros agentes alquilantes (p. ex., dacarbazina, hidroximetilmelamina, tiotepa e mitomíicina, etc.); 3) agentes de ligação ao - DNA não covalentes (antibióticos antitumorais), incluindo inibidores de ácido nucleico (p. ex., dactinomicina (actinomicina D), etc.), antraciclinas (p. ex., daunorrubicina (daunomicina e Í cerrubidina), doxorrubicina (adriamicina) e idarrubicina (idamicina), etc.), antracenodionas (p.ex, análogos de antraciclina, tais como mitoxantrona, etc.), bleomicinas (BLENOXANE), - etc. e plicamicina (mitramicina), etc.; 4) antimetabólitos, incluindo antifolatos (p. ex., metotre- xato, FOLEX e MEXATE, etc.), antimetabólitos de purina (p. ex., 6-mercaptopurina (6-MP, - PURINETHOL), 6-tioguanins (6-TG), azatioprina, aciclovir, ganciclovir, clorodesoxiadenosi- na, 2-clorodesoxiadenosina (CdA) e 2'-desoxicoformicina (pentostatina), etc.), antagonistas de pirimidina (p. ex., fluorpirimidinas (p. ex., 5-fluoruracil (ADRUCIL), 5-fluordesoxiuridina (FdUrd) (floxuridina)) etc.) e citosina arabinosídeos (p. ex., CYTOSAR (ara-C) e fludarabins, etc.); 5) enzimas, incluindo L-asparaginase e hidroxiureia, etc.; 6) hormônios, incluindo gli- cocorticoides, antiestrogênios (p. ex., tamoxifeno, etc.), antiandrogênios não esteroidais (p. ex., flutamida, etc.) e inibidores de aromatase (p. ex., anastrozol (ARIMIDEX), etc.); 7) com- postos de platina (p.ex, cisplatina e carboplatina, etc.); 8) anticorpos monoclonais conjuga- dos com radionuclídeos, toxinas e/ou fármacos anticâncer, etc.; 9) modificadores de respos- ta biológica (p. ex., interferons (p. ex., IFN-a, etc.) e interleucinas ((p. ex., IL-2, etc.) etc.); 10) imunoterapia adotiva; 11) fatores de crescimento hematopoiéticos; 12) agentes que induzem a diferenciação das células tumorais (p. ex., ácido all-trans-retinoico, etc.); 13) técnicas de . terapia gênica; 14) técnicas de terapia antisentido; 15) vacinas tumorais; 16) terapias dire- cionadas contra metástases tumorais (p. ex., batimastat, etc.); 17) inibidores de angiogêne- se; 18) inibidores de proteossomo (p. ex., VELCADE); 19) inibidores de acetilação e/ou meti-

! lação (p. ex., inibidores de HDAC); 20) moduladores de NF-kappa B; 21) inibidores da regu- lação do ciclo celular (p. ex., inibidores de CDK); 22) moduladores da função da proteina . p53 e 23) radiação.

Qualquer agente oncolítico que é rotineiramente usado em um contexto de terapia contrao câncer é útil nas composições e métodos da presente invenção.

Por exemplo, o Food and Drug Administration dos EUA mantém um formulário de agentes oncolíticos apro- vados para uso nos Estados Unidos.

Organismos congêneres internacionais para o USFDA mantêm formulários similares.

A Tabela 3 fornece uma lista de agentes antineoplásicos e- xemplares aprovados para uso nos EUA.

Aqueles versados na técnica irão apreciar que os "rótulos dos produtos" necessários em todos os quimioterápicos aprovados nos EUA des- crevem indicações aprovadas, informações sobre dose, dados relativos à toxicidade e se- melhantes, para os agentes exemplares.

TABELA 3 [Aldesleucina Proleukin — [Chiron Corp., Emeryville, CA ((des-alanil-1, serino-125 interleucina hu-| mana 2) Í Alemtuzumab iCampath Millennium and ILEX Partners, LP, femea enene fam . Alitretinoína Panretin Ligand Pharmaceuticals, Inc., San faso sema O ba í [Alopurino! Zyloprim GlaxoSmithKline, Research Trian B ((sal monossódico de 1,5-di-hidro-4 H -| (gle Park, NC pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona) Altretamina Hexalen US Bioscience, West Consho-| ICN, N,N' N' Nº, Nº,- hexametil-1,3,5-triazino-| hocken, PA 12, 4, 6-triamina) Amifostina Ethyol US Bioscience (etanotiol, 2-[(3-aminopropil)amino]-, = di-| lhidrogeno fosfato (éster)) [Anastrozo| Arimidex [AstraZeneca Pharmaceuticals, LP, ((1,3-Benzenodiacetonitrile, a, a, a, a- Wilmington, DE tetrametil-5-(1H-1,2,4-triazol-1-ilmetil)) |Asparaginase Merck & Co., Inc, Whitehouse| ES a AA

- BCG Viva TICE BCG [Organon Teknika, Corp., Durham, ((preparação liofilizada de uma cepa atenu- NC 7 lada de Mycobacterium bovis (Bacillu: Calmette-Gukin [BCG], subcepa Montreal) ICápsulas de bexaroteno Targretin Ligand Pharmaceuticals (ácido — 4-[1-(5,6,7,8-tetrahidro-3,5,5,8,8- ipentametil-2-naftalenil) etenil] benzoico) Bleomicina Blenoxane |Bristol-Myers Squibb Co., NY, NY (antibiótico de glicopeptídeo citotóxico pro-| iduzido por Streptomyces vertícillus; bleo micina A, e bleomicina B,) Capecitabina Xeloda Roche ((5'-desóxi-5-flúor-N-[(pentilóxi)carbonil]- citidina) - iCarboplatina Paraplatin — [Bristol-Myers Squibb (platina, diamina [11,1 É ciclobutanodicarboxilato(2-)-0, — 0-(SP-4-| 2) - ICarmustina BCNU, Bristol-Myers Squibb sssesreen tamento — fam O : ICarmustina com implante de Polifeprosan|Gliadel Wa-lGuilfford Pharmaceuticals, Inc., Celecoxib iCelebrex — [Searle Pharmaceuticals, England (como 4-[5-(4-metilfenil)-3- (trifluormetil 1H-pirazol-1-il] Ibenzenossulfonamida) (Clorambucil Leukeran — [GlaxoSmithKline (ácido 4 [bis(2cloretil)amino]benzenobutanoico) Cisplatina Bristol-Myers Squibb

EPA MA iCladribina Leustatin, 2-|R.W. Johnson Pharmaceutical

- ((2-6xido — monoidratado — de 2-[bis(2-|Neosar icloroetil)amino] tetraidro-2H-13,2-| ' loxazafosforina) Citarabina ICytosar-U [Pharmacia & Upjohn Company |(1-b-D-Arabinofuranosilcitosina, (CaH13N3Os) citarabine lipossomal DepoCyt Skye Pharmaceuticals, Inc., San o base Dacarbazina IDTIC-Dome |Bayer AG, Leverkusen, Germany [(5-(3,3-dimetil-l-triazeno)-imidazol-4- icarboxamida (DTIC)) Dactinomicina, actinomicina D iCosmegen (actinomicina produzida por Streptomyces) iparvullus, CooHesN12016) Darbepoetina alfa |Aranesp Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA — fomento — [OP [PST CSS Idaunorrubicina lipossomal DanuoXome |Nexstar — Pharmaceuticals, Inc., - ((cloridrcato — de — (8S-cis)-8-acetil-10-[(3-] Boulder, CO lamino-2,3,6-tridesóxi-á-L-lyxo- % Ilhexopiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11- ttri-hidróxi-1-metóxi-5,12-naftacenodiona) Daunorrubicina HCI, daunomicina Cerubidine |Wyeth Ayerst, Madison, NJ (cloridrato de (1 S ,3 S )-3-Acetil 1,2,3,4,6,1 1-hexaidro-3,5,12-tri-hidróxi-10- imetóxi-6,11-dioxo-1-naftacenil — 3-amino- 2,3,6-tridesóxi-(alfa)-L- Iyxo - Ihexopiranosídeo) Denileucina diftitox Ontak iSeragen, Inc., Hopkinton, MA

ESP A MA Dexrazoxano Zinecard Pharmacia & Upjohn Company i ((S)-4,4'-(1-metil-1,2-etanodi-il)bis-2,6- piperazinodiona) Docetaxel ITaxotere — jAventis —Pharmaceuticals, Inc, ((2R,3S)-N-carbóxi-3-fenilisoserino, N-ter: IBridgewater, NJ butil éster, 13-éster com 5b-20-epóxi-

- 12a,4,7b,10b,13a-hexaidroxitax- 11-en-9-| ra amei 2namane virem ' IDoxorrubicina HCI |Adriamycin, |[Pharmacia & Upjohn Company Cloridrato de (8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-|Rubex itridesóxi-a-L-lyxo-hexopiranosil)óxi] -8-| Iglicolil-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11- tri-hidróxi- 1-metóxi-5,12-naftacenodiona) Idoxorrubicina Adriamycin |Pharmacia & Upjohn Company PFS Intra ivenous — in-| jection Idoxorrubician lipossomal iSequus — Pharmaceuticals, Inc, [O fem Propionato de dromostanolona iDromo- Eli Lilly & Company, Indianapolis, 1(17b-Hidróxi-2a-metil-Sa-androstan-3-ona Istanolone [IN BR ipropionato) o fas [romeno | | a ia iSyntex, Corp., Palo Alto, CA Í injection (Solução B de Elliott Eltiott's BJOrphan Medical, Inc

PP Epirrubicina Ellence IPharmacia & Upjohn Company : (cloridrato de (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6- itridesóxi-a-L-arabino- — hexopiranosil)óxi]- 17,8,9,10-tetraidro-6,8,11-tri-hidróxi-8- — (hi Idroxiacetil)-1-metóxi-5,12-naftacenodiona) Epoetina alfa Epogen Amgen, Inc src semente Estramustina Emeyt IPharmacia & Upjohn Company ((estra-1,3,5(10)-trieno-3,17-diol(17(beta))-, 13-[bis(2-cloroetil)carbamato] 17-(di-| lhidrogeno fosfato), sal dissódico, monoi- dratado, ou estradiol 3-[bis(2- (cloroetil)carbamato] 17-(di-hidrogeno fosfa-| to), sal dissódico, monoidratado)

, ((4'-Demetilepipodofilotoxina — 9-[4,6-O-(R)- letilideno-(beta)-D-glicopiranosídeo], 4'-(di-| . Ihidrogeno fosfato)) letoposídeo, VP-16 Vepesid Bristol-Myers Squibb (4'-demetilepipodofilotoxina — 9-[4,6-0-(R)-] letilideno-(beta)-D-glicopiranosídeo]) Exemestano Aromasin — IPharmacia & Upjohn Company fomenerenteme egenes ane [7 Filgrastim Neupogen JAmgen, Inc

EPA MA ffloxuridina (intra-arterial) FUDR Roche fescsonsnee Fludarabina Fludara Berlex Laboratories, Inc., Ceda ((análogo nucleotídico fluorado do agente| Knolls, NJ antiviral vidarabina, 9-b -D-| - Jarabinofuranosiladenina (ara-A)) Fluoruracil, 5-FU [Adrucil ICN Pharmaceuticals, Inc., Huma-| c ferseamanamento O amem Fulvestrant Faslodex IPR Pharmaceuticals, Guayama,) = ((7-alfa-[9-(4,4,5,5,5-penta fluorpentilsulfinil) Puerto Rico inonilJestra-1,3,5-(10)- triene-3,17-beta-diol) ] IGencitabina Gemzar Eli Lilly I(monocloridrato — de — 2'-desóxi-2t, — 2 difluorcitidina (isômero b)) Gemtuzumab Ozogamicina Mylotarg Wyeth Ayerst fone o Acetato de goserelina Zoladex AstraZeneca Pharmaceuticals (sal de acetato de [D-]Implant (Ser(But), Azaly JLHRH; acetato de piro- IGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg- Pro-Azgly-NH2 [CsoHgaN18O 14 *(C2H4O2) Ibritumomab Tiuxetano iZevalin Biogen IDEC, Inc., Cambridge MA ((imunoconjugado resultante de ligação Icovalente de tioureia entre o anticorpo mo-|

R inoclonal Ibritumomab e o ligante-quelante) itiuxetan [N-[2-bis(carboximetil)amino]-3-(p-| f isotiocianatofenil)- propil]-[N-[2-] bis(carboximetil)amino]-2-(metil) - etiljalicina) Idarrubicina Idamycin IPharmacia & Upjohn Company (5, — 12-Naftacenodiona, — 9-acetil-7-[(3- lamino-2,3,6-tridesóxi-(alfa)-L- Iyxo - lhexopiranosil)óxil-7,8,9,10-tetraidro-6,9,11- Itri-hidroxicloridrato, (7S- cis )) Ifosfamida IFEX Bristol-Myers Squibb ((2-óxido de 3-(2-cloroetil)-2-[(2-| Icloroetil)amino]tetraiydro-2H-1,3,2- loxazafosforina) Mesilato de Imatinib Gleevec Novartis AG, Basel, Switzerland I(metanossulfonato de 4-[(4-metil-1- “ piperazinimetil-N-[4-metil-3-[4-(3- - piridinil)-2-pirimidinilJamino]- h Ifenillbenzamida) d Interferon alfa-2a Roferon-A |Hoffmann-La Roche, Inc., Nutley, Ea EO EO r Interferon alfa-2b Intron A (Ly-I|Schering AG, Berlin, Germany ((peptídeo recombinante) iophilized Betaseron) Irinotecano HC] iCamptosar IPharmacia & Upjohn Company ((cloridrato tri-hidratado de (4S)-4,11-dietil- |4-hidróxi-9-[(4- piperi idinopiperidino)carbonilóxi]l-1H-pirano[3', 4: 6,7] indolizino[1,2-b0) — quinolino-3,14(4H, 12H) diona) Letrozol Femara Novartis ((4,4'-(1H-1,2,4 -Triazol-1-ilmetileno) diben-| izonitrile) Leucovorina Wellcovorin, |IImmunex, Corp., Seattle, WA ((ácido L-glutâmico, N[4[[((2amino-5-formil-|Leucovorin 1,4,5,6,7,8 hexaidro40x06-|

. ipteridinil)metilJamino]benzoil], sal de cálcio) mo ] iLevamiso! HC! Janssen Research Foundation, i(monocloridrato de (-)( S)2,3,5, 6 Titusville, NJ tetraidro-6-fenilimidazo [2,1-b] tiazol IC11H12N2S-HCI) Lomustina ICeeNU Bristol-Myers Squibb [roses seno Meciloretamina, mostarda nitrogenada (clo-|Mustargen = |Merck ridrato de 2-cloro-N-(2-cloroetil)-N-| metiletanamina) [Acetato de Megestro| Megace Bristol-Myers Squibb 170( acetilóxi)- 6- metilpregna- 4,6- dieno-| 13,20- diona Meifalano, L-PAM [Alkeran iGlaxoSmithKline — feneacmamemaemem UC Mercaptopurina, 6-MP GlaxoSmithKline . ((1,7-di-hidro-6 H -purino-6-tiona monoidra-| atada) ” Mesna Mesnex [Asta Medica fememmoseme none cosa Metotrexato Meth- iLederie Laboratories (ácido N-[4-[[(2, 4-diamino-6-|otrexate ipteridinil)metil|metilamino]benzoil]-L- glutâmico) Metoxsaleno Uvadex Therakos, Inc., Way Exton, Pa |((9-metóxi-7H-furo[3,2-g9][1]-benzopiran-7- lona) Mitotano Lysodren — |[Bristol-Myers Squibb (1, 1-dicloro-2-(o-clorofenil)-2-(p-clorofenil) letano) Mitoxantrona Novantrone |Immunex Corporation [ocaso te raamaensaenn Lo

- hidroxietil)>amino]JetilJamino]-9,10- esse : Fenpropionato de nandrolona iDurabolin- JOrganon, Inc., West Orange, NJ ee a aval Nofetumomab Verluma Boehringer Ingelheim Pharma KG, o fame o [Oprelvecina Neumega [Genetics Institute, Inc., Alexandria, ur STS ASSS2S0S SS |Oxaliplatina iSanofi Synthelabo, Inc., NY, NY ((cis-[[1R,2R)-1,2-ciclohexanodiamino-N,N'] [oxalato(2-)-O,0'] platina) Paclitaxel ITAXOL Bristol-Myers Squibb (58, 20-Epóxi-1,2a, 4,768 108 13a- hexaidroxitax-11-en-9-ona — 4,10-diacetato)| 12- benzoato 13-éster com (2R, 3 S)- N- - benzoil-3-fenilisoserina) Pamidronato Aredia Novartis . (ácido fosfônico (3-amino-1- lhidroxipropilideno) bis-, sal dissódico, pen-| (e ttaidratado, (APD)) Pegademase Adagen Enzon — Pharmaceuticals, Inc, ' I((monometoxipolietileno glicol succinimidil|(Pegade- — |Bridgewater, NJ 11 - 17 -adenosina desaminase) imase — Bo- vine) Pegaspargase |Oncaspar i(monometoxipolietileno glicol succinimidil| L-asparaginase) Pegfilgrastim Neulasta IAmgen, Inc I(conjugado covalente de G-CSF humano| imetionil recombinante (Filgrastim) e mo: inometoxipolietileno glico!) Pentostatina Parke-Davis Pharmaceutical Co., PO fm

L

, Plicamicina, Mitramicina Pfizer, Inc., NY, NY (antibiótico produzido por Streptomyces) ' (plicatus) iPorfimer sódio Photofrin — [QLT Phototherapeutics, Inc., Van-| (couver, Es Procarbazina Matulane — [Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc, i(monocloridrato de N-isopropil-p-(2-] iGaithersburg, MD imetilidrazino)-p-toluamida) Quinacrina |Atabrine Abbott Labs ((6-cloro-9-( 1 —metil-4-dietil-amino) butila-| mino-2-metoxiacridina) IRasburicase ISanofi-Synthelabo, Inc., om memo — OSS IRituximab iGenentech, Inc., South San Fran-| a SS E SA Sargramostim Immunex Corp é esmas Estreptozocina IZanosar Pharmacia & Upjohn Company - (estreptozocina 2 —desóxi - 2 [[(metilnitrosoamino)carbonilJamino] - a(e b)| Í ) - D - glicopiranose e 220 mg de ácido) (cítrico anidro) Talco (Scleroso|l Bryan, Corp., Woburn, MA

E A MA Tamoxifeno Nolvadex — |AstraZeneca Pharmaceuticals (2) 2-[4-(1,2-difenil-1-butenil) fenóxil-N, N-| dimetiletanamina 2-hidróxi-1,2,3- propano-| itricarboxitato (1:1)) Temozolomida Temodar 1(3,4-di-hidro-3-metil-4-0xo0imidazo([5,1-d]- las-tetrazino-8-carboxamida) iteniposídeo, VM-26 Vumon Bristol-Myers Squibb ((4'-demetilepipodofilotoxin — 9-[4,6-0-(R)-2-] Itenilideno-(beta)-D-glicopiranosídeo])

. Testolactona |Teslac Bristol-Myers Squibb (ácido 13-hidróxi-3-0x0-13,17-] ' isecoandrosta-1,4-dien-17-o0ico — [dgr =| lactona) Tioguanina, 6-TG Thioguanine |GlaxoSmithKline fomos ramamencoumest o Tiotepa Thioplex Immunex Corporation (Aziridina, 1,1 /1"-fosfinotioilidinetris-, ou [Tris (1-aziridinil) fosfino sulfeto) ITopotecano HC] Hycamtin — [GlaxoSmithKline (((S)-10-[(dimetilamino) metil]-4-etil-4,9-| Idihidróxi-1H-pirano[3, 4: 6,7] indolizino [1,2-b] quinolino-3,14-(4H,12H)-diona mo-| inocloridrato) IToremifeno Fareston Roberts — Pharmaceutical Corp., , (citrato de 2-(p-[(2)-4-cloro-1,2-difenil-1 Eatontown, NJ butenil]-fenóxi)-N, N-dimetiletilamina (1:1)) "” ITositumomab, | 131 Tositumomab Bexxar (Corixa Corp., Seattle, WA (anticorpo anti-CD20 de IgG, lambda mo - inoclonal imunoterápico murino recombi- inante (| 131 é um anticorpo radioimunote-| . Irapêutico)) Trastuzumab Herceptin — |Genentech, Inc (anticorpo anti-€HER2 IgG, kappa monoclo-| inal recombinante) Tretinoína, ATRA IVesanoid — |Roche fasso mete Mostarda de Uracila Uracil Mus-|Roberts Labs tad — Cap

ESSO IValrubicina, — N-trifluoracetiladriamicin-14-|Valstar jAnthra --> Medeva Ivalerato ((pentanoato de (2S-cis)-2- [1,2,3,4,6,11-] Ilhexahydro-2,5,12-tri-hidróxi-7 metóxi-6,11-] Idioxo-[[4 2,3,6-tridesóxi-3- [(trifluoracetil).

SS

. lamino-a-L-/yxo-hexopiranosilJoxil]-2- fin | Vinblastina, Leurocristina IVelban El Lilly festas Vincristina (Oncovin Eli Lilly Jeso IVinoreibina Navelbine — [GlaxoSmithKline (3' A4'-didesidro-4'-desóxi-C'- inorvincaleucoblastina [R-(R*,R*)-2,3-di-] lhidroxibutanodioato (1:2)(sal)]) |Zoledronato, Ácido Zoledrônico iZometa Novartis ((ácido (1-Hidróxi-2-imidazol-1-il-fosfonoetil Ifosfônico monoidratado) Agentes terapêuticos antimicrobianos também podem ser utilizados como agentes - terapêuticos na presente invenção. Qualquer agente que possa matar, inibir, ou de outra forma atenuar a função de microrganismos pode ser utilizados, assim como qualquer agente ú contemplado por ter essas atividades. Os agentes antimicrobianos incluem, mas não estão limitados a, antibióticos naturais e sintéticos, anticorpos, proteínas inibidoras (p. ex., defen- - sinas), ácidos nucleicos antissentido, agentes perturbadores de membrana e similares, utili- zados isoladamente ou em combinação. Na verdade, qualquer tipo de antibiótico pode ser - utilizado, incluindo mas não limitando a, agentes antibacterianos, antivirais, agentes antifún- gicos e semelhantes.

Em modalidades ainda adicionais, a presente invenção fornece compostos da pre- sente invenção (e quaisquer outros agentes quimioterápicos) associados com agentes de direcionamento que são capazes de se direcionarem especificamente a tipos celulares parti- Culares (p. ex., células tumorais). Geralmente, o composto terapêutico que está associado com um agente de direcionamento, se direciona às células neoplásicas através da interação do agente de direcionamento com uma molécula de superfície celular que é levada para dentro da célula através de endocitose mediada por receptor.

Qualquer molécula conhecida por estar localizada na superfície de células alvo (p. ex., células tumorais) é útil com a presente invenção. Por exemplo, um anticorpo dirigido contra tal molécula direciona as composições da presente invenção para superfícies celula- res que contêm a molécula. Em alternativa, a molécula de direcionamento pode ser um li- gante dirigido a um receptor presente na superfície celular ou vice-versa. Da mesma forma, as vitaminas também podem ser usadas para direcionar a terapêutica da presente invenção a uma célula em particular.

SS

! Conforme aqui utilizado, o termo "moléculas de direcionamento" refere-se a molé- culas químicas e suas partes úteis para direcionamento de compostos terapêuticos para . células, tecidos e órgãos de interesse. Vários tipos de moléculas de direcionamento estão contemplados para uso com a presente invenção, incluindo mas não limitando a, peptídeos sinais, anticorpos, ácidos nucleicos, toxinas e semelhantes. Moléculas de direcionamento podem adicionalmente promover a ligação dos compostos químicos associados (p. ex., pe- quenas moléculas) ou a entrada dos compostos nas células, tecidos e órgãos alvos. De pre- ferência, moléculas de direcionamento são selecionadas de acordo com sua especificidade, afinidade e eficácia na distribuição seletiva de compostos ligados aos sites alvos em um indivíduo, tecido ou uma célula, incluindo organelas e localizações subcelulares específicas.

Várias questões de eficiência afetam a administração de todos os fármacos - e de fármacos altamente citotóxicos (p. ex., fármacos anticâncer), em particular. Uma questão de particular importância é garantir que os agentes administrados afetem apenas células (p. ex., células cancerosas), tecidos ou órgãos-alvo. A distribuição inespecífica ou não intencio- —nalde agentes altamente citotóxicos para células não-alvo pode causar problemas de toxici- dade grave.

- Numerosas tentativas foram feitas para desenvolver esquemas de direcionamento de fármacos para tratar os problemas associados à distribuição inespecífica de fármacos.

r (Veja, p. ex., K.N. Syrigos and A.A. Epenetos Anticancer Res., 19:606-614 (1999); Y.J. Park etal,J. Controlled Release, 78:67-79 (2002); R.V.J. Chari, Adv. Drug Deliv. Rev., 31:89-104 " (1998); e D. Putnam and J. Kopecek, Adv. Polymer Sci., 122:55-123 (1995)). A conjugação de moléculas de direcionamento, tais como anticorpos e peptídeos ligantes (p. ex, RDG B para células endoteliais), a moléculas de fármaco tem sido usada para aliviar alguns pro- blemasde toxicidade colateral associada a determinados fármacos.

Os compostos e agentes anticancerígenos pode ser administrados em qualquer carreador farmacêutico estéril, biocompatível, incluindo, mas não limitando a, salina, salina tamponada, dextrose e água. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção podem conter um agente (p. ex., um anticorpo). Em outras modalidades, as composições farmacêuticas contêm uma mistura de pelo menos dois agentes (p. ex., um anticorpoe um ou mais agentes anticancerígenos convencionais). Em modalidades ainda adicionais, as composições farmacêuticas da presente invenção contêm pelo menos dois agentes que são administrados a um paciente sob uma ou mais das seguintes condições: em periodicidades diferentes, em durações diferentes, em diferentes concentrações, por diferentes vias de administração, etc. Em algumas modalidades, o antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1 é administrado antes do segundo agente anticancerígeno, p. ex., 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 ou 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias, 1, 2, 3 ou 4 semanas antes da administração do agente anticancerígeno. Em algumas modalidades, o antagonista da via

. de sinalização de ILBG-CXCR1 é administrado após o segundo agente anticancerígeno, p. ex., 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 ou 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias, 1, 2, 3 ou 4 semanas após a - administração do agente anticancerígeno. Em algumas modalidades, o antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1 e o segundo agente anticancerígeno são administrados simul- —taneamente, mas em agendamentos diferentes, p. ex., o composto de antagonista de via de sinalização de IL8-CXCR1 é administrado diariamente, enquanto o segundo agente antican- cerígeno é administrado uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas. Em outras modalidades, o antago- nista da via de sinalização de IL8-CXCR1 é administrado uma vez por semana, enquanto o segundo agente anticancerígeno é administrado diariamente, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas.

Dependendo da doença a ser tratada, modalidades preferidas das presentes com- posições farmacêuticas são formuladas e administradas por via sistêmica ou local. Técnicas para a formulação e administração podem ser encontradas na última edição de "Reming- ton's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Vias adequadas podem, por exemplo, incluir a administração oral ou por transmucosa, assim como a distribuição . parenteral (p. ex., administração intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal intra- ventricular, intravenosa, intraperitoneal, ou intranasal). ” A presente invenção contempla a administração de compostos terapêuticos e, em algumas modalidades, um ou mais agentes anticancerígenos convencionais, de acordo com fr métodos de distribuição farmacêutica e técnicas de preparo aceitáveis. Por exemplo, com- postos terapêuticos e agentes anticancerígenos adequados podem ser administrados a um - indivíduo por via intravenosa em um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como salina fisiológica. Métodos padrões para a distribuição intracelular de agentes farmacêuticos são contempladas (p. ex., distribuição através de lipossomo). Tais métodos são bem conhecidos por aqueles de conhecimento ordinário da técnica.

Em algumas modalidades, as formulações da presente invenção são úteis para a administração parenteral (p. ex., intravenosa, subcutânea, intramuscular, intramedular e in- traperitoneal). A co-administração terapêutica de alguns agentes anticancerígenos contem- plados (p.ex, polipeptídeos terapêuticos) também pode ser feita com o uso de reagentes e técnicas de terapia gênica.

Em algumas modalidades da presente invenção, compostos terapêuticos são admi- nistrados a um indivíduo isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes anti- cancerígenos convencionais (p. ex., sequências nucleotídicas, fármacos, hormônios, etc.) ou em composições farmacêuticas onde os componentes são opcionalmente misturados com excipiente(s) ou outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em modalidades preferi- das da presente invenção, carreadores farmaceuticamente aceitáveis são biologicamente

R inertes. Em modalidades preferidas, as composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas usando carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na téc- - nica, em doses adequadas para administração oral. Esses carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, —drágeas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, soluções, suspensões e afins, para a res- pectiva ingestão oral ou nasal por um indivíduo.

Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas pela combinação dos princípios ativos com excipientes sólidos, moendo opcionalmente a mistura resultante e pro- cessando a mistura em grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado, para —obternúcleos de drágeas ou comprimidos. Excipientes adequados são enchimentos de car- boidratos ou proteína, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, etc.; celulose, tal como a metil celulose, hidroxipropilme- til-celulose, ou carboximetilcelulose de sódio; gomas, incluindo arábica e tragacanto; proteí- nas como gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantes ou de solubilização podem ser adicionados, tais como a polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou seu sal, como o alginato de sódio.

- Em modalidades preferidas, regimes de dose e administração são adaptados pelo médico, ou outros versados nas técnicas farmacológicas, com base em considerações far- " macológicas e terapêuticas bem conhecidas, incluindo, mas não limitando a, o nível deseja- do de efeito terapêutico e o nível prático de efeito terapêutico capaz de ser obtido. Geral- Re mente, é aconselhável seguir princípios farmacológicos bem conhecidos para administrar agentes quimioterápicos (p. ex., é geralmente aconselhável não alterar as doses em mais de - 50% no tempo e não mais de cada 3-4 de meias-vidas de agente). Para composições que têm relativamente pouca ou nenhuma consideração sobre toxicidade dose-dependente e quando deseja-se máxima eficácia (p. ex., a destruição de células cancerosas), doses supe- riores à dose média necessária não são incomuns. Esta abordagem para a dose é comu- mente referida como a estratégia da "máxima dose". Em certas modalidades, o antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1 é administrado a um indivíduo com uma dose de 10-40 mg por dia (p. ex., por 4-6 semanas). Em certas modalidades, ao indivíduo é administrada uma dose de carga entre 15 e 70 mg do antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1. Em certas modalidades, ao indivíduo é administrada uma dose de carga de cerca de 35-45 mg do antagonista da via de sinalização de IL8-CXCR1 (p. ex., por via subcutânea) e, em seguida, doses diárias de cerca de 10 mg (p. ex., por via subcutânea) por cerca de 4-6 se- manas.

Considerações adicionais sobre dose estão relacionadas com o cálculo dos níveis- alvo apropriados para o agente a ser administrado, a toxicidade potencial e acúmulo do a- gente, estimulação da resistência, falta de eficácia e com a descrição do intervalo do índice

' terapêutico do agente.

Em certas modalidades, a presente invenção contempla a utilização de métodos de - rotina de titulação da administração do agente.

Uma estratégia comum para a administração é definir um nível-alvo razoável para o agente no indivíduo.

Em algumas modalidades prefe- ridas, os níveis de agente são medidos no plasma do indivíduo.

Frequências e níveis de dose apropriados são então projetados para atingir o nível-alvo de estado estacionário dese- jado para o agente.

Níveis reais, ou médios, do agente no indivíduo são monitorados (p. ex., por hora, diariamente, semanalmente, etc.) tal que os níveis de dose ou frequência podem ser ajustados para manter os níveis-alvo.

Naturalmente, a farmacocinética e a farmacodi- —nâmica (p.ex, biodisponibilidade, depuração ou bioacumulação, biodistribuição, interações medicamentosas, etc.) do agente ou agentes em particular que estão sendo administrados pode potencialmente afetar o que são considerados níveis-alvo razoáveis e, assim, afetar níveis ou frequências de dose.

Métodos de dose em níveli-alvo tipicamente dependem do estabelecimento de um objetivo terapêutico razoável definido em termos de um intervalo desejável (ou intervalo terapêutico) para o agente no indivíduo.

Em geral, o limite inferior do intervalo terapêutico é . aproximadamente igual à concentração do agente que fornece cerca de 50% do máximo efeito terapêutico possível.

O limite superior do intervalo terapêutico é geralmente estabele- cido pela toxicidade do agente e não por sua eficácia.

A presente invenção contempla que o limite superior do intervalo terapêutico para um determinado agente será a concentração na "” qual menos de 5 ou 10% dos indivíduos apresentam efeitos colaterais tóxicos.

Em algumas modalidades, o limite superior do intervalo terapêutico é de cerca de duas vezes, ou menos, - que o limite inferior.

Aqueles versados na técnica entenderão que estas considerações so- bre dose são altamente variáveis e até certo ponto, individualistas (p. ex., com base em pre- disposições genéticas, considerações imunológicas, tolerâncias, resistências e outros). As- sim, em algumas modalidades, níveis de dose-alvo eficazes de um agente em um determi- nado indivíduo podem ser de 1, ... 5. .. 10,...15,...20,...50,...75,...100,...200,. . . X%, superior à ideal em outro indivíduo.

Por outro lado, alguns indivíduos podem sofrer significativos efeitos colaterais significativos e toxicidade relacionada com a saúde em níveis oufrequênciasde dose muito menores (1, ... 5, ...10,...15,...20,...50,...75,... 100, . . . 200, .. . X%) do que aquelas que tipicamente produzem níveis terapêuticos ideais em alguns ou na maioria dos indivíduos.

Na ausência de informações mais específicas, os níveis de administração-alvo são frequentemente situados no meio do intervalo terapêutico.

Em modalidades preferidas, o médico racionalmente projeta um regime de dose in- —dividualizado baseado em equações e princípios farmacológicos conhecidos.

Em geral, o médico projeta um regime de dose individualizado baseado no conhecimento de várias pro- priedades farmacológicas e farmacocinéticas do agente, incluindo, mas não limitando a, F

DP (biodisponibilidade fraccionada da dose), Cp (concentração no plasma), CL (taxa de depura- ção/depuração), Vss (volume de distribuição de fármaco no estado estacionário) Css (con- - centração no estado estacionário) e t1/2 (meia-vida do fármaco), assim como informações sobre a taxa de absorção e distribuição do agent . Aqueles versados na técnica são apre- sentados a todo número de textos farmacológicos bem conhecidos (p. ex., Goodman and Gilman's, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10th ed., Hardman et a/., eds., 2001) para mais explicações sobre essas variáveis e para equações completas ilustrando o cálculo de regimes de dose individualizados. Aqueles versados na técnica também serão capazes de antecipar possíveis flutuações nessas variáveis em diversos indivíduos. Por exemplo, o des- —vio-padrão dos valores observados para F, CL, e Vss é tipicamente de cerca de 20%, 50% e 30%, respectivamente. O efeito prático de parâmetros potencialmente muito diferentes em diversos indivíduos é que 95% do tempo do Css alcançado em um indivíduo está entre 35 e 270% daquele do nível-alvo. Para fármacos com baixos índices terapêuticos, este é um in- tervalo indesejavelmente amplo. Aqueles versados na técnica irão apreciar, entretanto, que uma vez que a Cp (concentração no plasma) do agente é medida, é possível estimar os va- lores de F, CL, e Vss diretamente. Isso permite que o médico ajuste eficazmente um regime - de dose de um determinado indivíduo. Em ainda outras modalidades, a presente invenção contempla que a continuação ” das técnicas de monitoramento terapêutico do fármaco seja usada para ajustar regimes e métodos individuais. Por exemplo, em uma modalidade, dados de Css são usados para a- tr perfeiçoar ainda mais as estimativas de CL/F e, subsequentemente, ajustar a dose de ma- nutenção individual para alcançar os níveis-alvo desejados do agente usando equações e - princípios farmacológicos conhecidos. O monitoramento terapêutico do fármaco pode ser conduzido durante praticamente todo a esquema de dose. Em modalidades preferidas, o monitoramento é realizado em diferentes períodos durante a dose e, especialmente, quando se administram doses intermitentes. Por exemplo, o monitoramento de fármaco pode ser conduzido concomitantemente, em frações de segundo, segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses, etc., da administração do agente, independentemente da metodologia de dose empregada (p. ex., dose intermitente, doses de carga, dose de manutenção, dose ale- atória, ou qualquer outro método de dose). Entretanto, aqueles versados na técnica irão a- preciar que quando a amostragem ocorre imediatamente após a administração de agentes, as alterações nos efeitos e dinâmicas de agentes podem não ser prontamente observáveis, pois as alterações na concentração plasmática do agente podem ser postergadas (p. ex., devido a uma baixa taxa de distribuição ou a outros fatores farmacodinâmicos). Consequen- temente, amostras de indivíduos obtidas logo após a administração do agente podem ter valor limitado ou diminuído.

O principal objetivo da coleta de amostras biológicas do indivíduo durante o nível-

y alvo de estado estacionário previsto da administração é modificar o regime de dose do indi- víduo com base no cálculo subsequente de estimativas revisadas da proporção de CL/F do . agente. Entretanto, aqueles versados na técnica irão apreciar que concentrações de fárma- co pós-absorção iniciais tipicamente não refletem a depuração do agente. Concentrações de fármaco iniciais pós-absorção são ditadas principalmente pela taxa de absorção do agente, pela estado central, ao invés do estacionário, volume de distribuição de agentes e pela taxa de distribuição. Cada uma dessas características farmacocinéticas têm valor limitado para o cálculo de regimes terapêuticos de dose de manutenção a longo prazo. Assim, em algumas modalidades, quando o objetivo é a dose terapêutica de manu- tençãoa longo prazo, as amostras biológicas são obtidas do indivíduo, células ou tecidos de interesse bem após a dose anterior ter sido administrada, e ainda de maior preferência logo antes da próxima dose planejada ser administrada. Ainda em outras modalidades, quando o agente terapêutico está quase totalmente depurado pelo indivíduo no intervalo entre as doses, então, a presente invenção contempla a coletade amostras biológicas do indivíduo em vários pontos do tempo após a administra- ção anterior e da maior preferência logo após a dose ter sido administrada. - VII.Repertaxina e Outros Inibidores de CXCR1 de Pequena Molécula Em certas modalidades, os métodos, kits e composições da presente invenção em- e pregam inibidores de pequena molécula de CXCR1. Um agente exemplar é repartaxina. Em certas modalidades, a dose in vivo da repartaxina está entre 3 e 60 mg por quilograma (p. E ex., 3 ...... 30 ...... 50 ...... 680 mg/kg). Em modalidades particulares, a dose de repartaxina é de cerca de 30 mg por quilograma. A fórmula química da repartaxina é mostrada abaixo: Lda,

LST o ne Em outras modalidades, os derivados da repertaxina são empregados. Outros an- tagonistas de CXCR1 de pequena molécula incluem SB265610 (Glaxo SmithKline Beecham; Benson et a/., 2000, 151:196-197), assim como SCH 527123 (2-hidróxi-N,N-dimetil-3-(2- [I(R)-1-(S5-metilfuran-2-il)propilJamino]-3,4-dioxociclobut-1-enilamino) — benzamida — (SCH 527123), um antagonista do receptor CXCR2/CXCR1 oralmente biodisponível (Schering Plough)). Outros inibidores de pequena molécula podem ser identificados pelos métodos de seleção descritos acima.

EXEMPLOS O exemplo a seguir é fomecido, a fim de demonstrar e ilustrar ainda mais certas modalidades e aspectos preferidos da presente invenção e não deve ser interpretado como limitante do escopo da mesma.

. EXEMPLO 1 CXCR1 Identifica Células-tronco Cancerosas . Este exemplo descreve a identificação de CXCR1, assim como de outras proteínas (p. ex., FBXKO21), como marcadores de células-tronco cancerosas.

Cultura de células. Linhagens celulares de mama (BCL) foram obtidas a partir da ATCC ("http://Wwww." seguido por "Igepromochem- atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfm") ou de coleções desenvolvidas nos laboratórios de Drs. S. Ethier (agora disponível em "httpo:/MWww." seguido por "aste- rand.com/Asterand/BIOREPOSITORY Hbreastcancercelllines.aspx, SUM44, SUM52, SUM149, SUM159, SUMI185, SUM190, SUM225, SUM229"), V.J. Môbus (BrCa-MZ-01), e V. Catros (S68). Todas as BCLs testadas foram obtidas de carcinomas exceto a MCF10A, que é derivada de doença fibrocís- tica e a 184A1 derivada de HMEC, que foi derivada de tecido mamário normal. As linhagens celulares foram cultivadas usando as condições de cultivo recomendadas. Todos os experi- mentos foram realizados com células confluentes na fase exponencial de crescimento.

Separação e ensaio ALDEFLUOR da população positiva para ALDH por FACS. À - atividade de ALDH foi avaliada em 33 BCLs representando os principais subtipos molecula- res de câncer de mama humano. O kit ALDEFLUOR (StemCell technologies, Durham, NC, SÍ EUA) foi usado para isolar a população com alta atividade enzimática de ALDH (17). Células obtidasa partir de linhagens celulares subconfluentes após tripsinização ou de xenoenxertos & recém dissociados foram suspensas em tampão de ensaio ALDEFLUOR contendo substrato para ALDH (BAAA, 1 umol/L por 1x106 células) e incubadas por 40 minutos a 37ºC. Em - cada experimento, uma amostra de células foi corada sob condições idênticas, com S5Ommol/L de dietilaminobenzaldeído (DEAB), um inibidor específico de ALDH, como contro- lenegativo. A triagem por citometria de fluxo foi realizada utilizando um FACStarPLUS (Bec- ton Dickinson). A fluorescência do ALDEFLUOR foi excitada a 488 nm e detectada usando isotiocianato de fluoresceína padrão (FITC) filtro passa-banda de 530/30. Para tumores xe- notransplantados, a incubação com um anticorpo anti-H2Kd (BD Biosciences, 1/200, 20 min no gelo), seguido por um anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (Jackson labs, 1/250,20 min no gelo) foi utilizada para eliminar as células de origem de camundongo. Os padrões de triagem foram estabelecidos utilizando células coradas com PI para a viabilida- de, células coradas com ALDEFLUOR tratadas com DEAB e aquelas marcadas com anti- corpo secundário sozinho. Antes de realizar perfis de RNA ou injeção em camundongos NOD/SCID, a pureza das populações classificadas foi verificada com a dupla triagem de — 10.000 células positivas e negativas para ALDEFLUOR em linhagens celulares BrCA-MZ-01 e SUM159. Para ambas as linhagens celulares, populações classificadas positivas para ALDEFLUOR continham mais de 98% das células positivas para ALDEFLUOR e nenhuma

' célula positiva para ALDEFLUOR foi detectada na população negativa para ALDEFLUOR. Tumorigenicidade em camundongos NOD/SCID. A tumorigenicidade de células po- . sitivas, negativas para ALDELFUOR e SUM159, MDA-MB-453 e BrCA-MZ-01 não separa- das foi avaliada em camundongos NOD/SCID. Bolsas de gordura foram depuradas do epité- lioem3semanas de idade antes da puberdade e humanizadas, injetando fibroblastos hu- manos (1:1 irradiados:não irradiados, 50.000 células/ 100uL de Matrigel/bolsa de gordura), como descrito (17). Os animais foram sacrificados, quando os tumores tinham 1,2 cm no maior diâmetro, em conformidade com os regulamentos para o uso de animais vertebrados em pesquisa. Uma parte de cada bolsa de gordura foi fixada em formalina e incluída em parafina para análise histológica. Outra parte foi avaliada pelo ensaio ALDEFLUOR, seguido de triagem e transplante em série.

Cultura independente de ancoragem. Células positivas, negativas para ALDEFLUOR e as não separadas de 184A1, SUM149 e SUM159 foram plaqueadas como células únicas em placas de adesão ultra-baixa (Coming, Acton, MA) em baixa densidade (5000 células viáveis/mL). As células foram cultivadas em meio livre de soro de epitélio ba- sal de mama (Cambrex Bio Science, Walkerville, MD), durante 3-7 dias, como descrito (18). - A capacidade das células para formar esferas foi quantificada após tratamento com diferen- tes doses de IL8 (Genway Biotech, San Diego, CA) adicionadas ao meio. SÍ Extração de RNA. O RNA total foi extraído de células positivas e negativas para —ALDEFLUOR congeladas usando o kit DNA/RNA All Prep Maxi, de acordo com as instru- a ções do fabricante (Qiagen, Sample and Assay technologies, Holanda). Oito BCLs foram usadas para análise da transcrição: 184A1, BICA-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA- - MB-453, SK-BR-7, SUM149 e SUM159. A integridade do RNA foi controlada por eletrofore- se em gel de agarose com formaldeído desnaturante e micro-análise (Agilent Bioanalyzer, —PaloAlto, CA).

Perfis de expressão gênica com microarranjos de DNA. Análises de expressão gê- nica utilizaram microarranjos de oligonucleotídeos humanos Affymetrix U133 Plus 2.0 que continham mais de 47.000 transcritos e variantes, incluindo 38.500 genes humanos bem caracterizados. A preparação de cRNA, hibridizações, lavagens e detecção, foi feita con- forme recomendado pelo fornecedor ("http:/Awww." seguido por "affymetrix.com/index.affx"). Os dados de expressão foram analisados pelo método RMA (Robust Multichip Average) em R usando Bioconductor e pacotes associados (19), como descrito (20, 21). O RMA fez ajus- te de valores basais, normalização de quantile e resumo de 11 oligonucleotídeos por gene.

Antes da análise, um processo de filtragem removeu os genes de conjunto de da- —doscom expressão baixa e mal medida, conforme definido pelo valor da expressão inferior a 100 unidades em todas as 16 amostras, mantendo 25,285 genes/ESTs. Um segundo filtro, com base na intensidade do desvio padrão (DP), foi aplicado para a análise não supervisio-

' nada para excluir os genes que mostram baixa variação de expressão em toda a análise.

O DP foi calculado com dados transformados por log2, em que os valores mais baixos foram - primeiro submetidos a função chão em um valor mínimo de 100 unidades, ou seja, a intensi- dade basal, mantendo a 13.550 genes/ESTs com DP superior a 0,5. Uma análise não su- pervisionada foi realizada em 16 células positivas, negativas para ALDEFLUOR em 13.550 genes.

Antes do agrupamento hierárquico, os dados filtrados foram transformados em log2 e submetidos ao programa Cluster (22) usando dados mediana-centrados em genes, a corre- lação de Pearson como similaridade métrica e agrupamento de articulação centroide.

Os resultados foram apresentados utilizando o programa TreeView (22). Para identificar e clas- sificar os genes discriminando populações positivas e negativas para ALDEFLUOR, um tes- te de Mann e Whitney foi aplicado aos 25.285 genes/ESTs e a taxa de falsa descoberta (FDR (23), foi usada para corrigir a hipótese de múltiplos testes.

O poder de classificação da assinatura discriminadora foi ilustrado pela classificação de amostras por agrupamento hie- rárquico.

UM LOOCV foi aplicado para estimar a acurácia de predição das assinaturas mo- leculares identificadas e a validade da análise supervisionada; cada amostra foi excluída, uma por uma, e classificada com a análise discriminante linear (LDA (24), usando modelo

- definido nas amostras não excluídas.

RT-PCR em tempo real.

Depois que as populações positivas para ALDEFLUOR e SJ negativas para ALDEFLUOR de diferentes linhagens celulares foram triadas, o RNA total foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (QIAGEN) e utilizado para ensaios de RT-PCR quantita- - tivo em tempo real (GRT-PCR) em um sistema de detecção de sequência ABI PRISMO 7900HT com módulo de bloco de 384 poços e acessório de automação (Applied Biosys- - tems). Iniciadores e sondas para o sistema Taqgman foram selecionados a partir do site da Applied Biosystems.

As sequências dos pares de iniciadores de PCR e sondas fluorogêni- cas utilizadas para CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 e TBP estão disponíveis no site da Applied Biosystems (ID de ensaio de CXCR1: Hs 00174146 mi; ID de ensaio de FBXO21: Hs 00372141 mi, ID de ensaio de NFYA: Hs 00953589 mi, ID de ensaio de NOTCH2: Hs 01050719 mi, ID de ensaio de RAD51L1: Hs00172522 mi, ID de ensaio de TBP: Hs 00427620 mi). O nível de expressão relativa de RNAm de CXCR1, FBXO21, —NFYA, NOTCH2, RAD51L1 foi computado com o relação gene TBP como padrão interno para normalizar as variações na qualidade do RNA e na quantidade de cDNA de entrada,

conforme descrito anteriormente (25). Ensaio de invasão.

Ensaios foram feitos em triplicata em câmaras Transwell com insertos de filtro de policarbonato de 8um de poro para placas de 12-poçoss (Corning, NY). Filtrosforam revestidos com 30 ul de extrato de membrana basal gelada 1:6 (Matrigel, BD- Bioscience) em DMEM/F12 incubado 1 hora a 37ºC.

Células foram adicionadas à câmara superior em 200 ui de meio livre de soro.

Para o ensaio de invasão, 5000 células foram se-

. meadas sobre filtros revestidos com Matrigel e a câmara inferior foi preenchida com 600 ul de meio suplementado com 10% de soro humano (Cambrex) ou com 600 ul de meio livre de . soro suplementado com IL8 (100ng/mL). Após incubação de 48 horas, as células na parte inferior do filtro foram contadas usando microscopia ótica. A invasão relativa foi normalizada paraaslinhagens celulares correspondentes não separadas sob condição de soro.

Infecção por lentívírus. Para a transdução do gene da luciferase, células 70% con- fluentes de HCC1954, MDA-MB-453 e SUM159 foram incubadas durante a noite com uma mistura precipitada 1:3 de sobrenadantes lentivirais Lenti-LUC-VSVG (Vector Core, Ann Ar- bor, MI) em meio de cultura. No dia seguinte, as células foram coletadas por tripsina/EDTA e —repicadas na proporção de 1:6. Após 1 semana de incubação, as células foram triadas de acordo com o fenótipo ALDEFLUOR e a expressão da luciferase foi verificada em cada po- pulação triada (positiva para ALDEFLUOR e negativa para ALDEFLUOR), adicionando 2 ml de D-luciferina a 0,0003% (Promega, Madison, WI) no meio de cultura e contando o fluxo de fótons pelo sistema de câmera de dispositivo (Xenogen, Alameda, CA).

Inoculação intracardíaca. Camundongos NOD/SCID de seis semanas de idade fo- ram anestesiados com mistura de isofluorano/ar a 2% e injetados no ventrículo esquerdo do - coração com 100000 células em 100 ul de PBS de Dulbecco estéril livre de Ca2+ e Mg2+. Para cada uma das três linhagens celulares (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) e para ca- SÍ da população (positiva para ALDEFLUOR, negativa para ALDEFLUOR e não triada), três animaisforam injetados. o Detecção de bioluminescência. A bioluminescência basal foi avaliada antes da ino- culação e inoculações de cada semana depois disso. Os camndongos foram anestesiados - com mistura d eisofluorano/ar a 2% e receberam uma dose única i.p. de 150 mg/kg de D- luciferina (Promega, Madison, WI) em PBS. Animais foram, em seguida, re-anestesiados 6 minutos após a administração da D-luciferina. Para a contagem de fluxo de fótons, um sis- tema de câmera de dispositivo acoplada à carga (Xenogen, Alameda, CA) foi usado com um sistema de distribuição de isofluorano de bocal cônico e aquecido para manter a temperatu- ra corporal. Resultados foram analisados após 2 a 12 minutos de exposição usando o soft- ware de Living Image fornecido com o sistema de imagem Xenogen. A intensidade de sinal foiquantificada como a soma de todas as contagens de fluxo de fótons detectados dentro de uma região uniforme de interesse colocada manualmente durante o pós-processamento de dados. O fluxo de fótons normalizado representa a relação entre o fluxo de fótons detectado cada semana após inoculações e o fluxo de fótons detectado antes da inoculação.

Análise estatística. Os resultados são apresentados como a média +DP de pelo — menos três experimentos individuais repetidos para cada grupo. As análises estatísticas utilizaram o programa SPSS (versão 10.0.5). Correlações entre grupos de amostra e parâ- metros moleculares foram calculados com o teste exato de Fisher ou ANOVA unidirecional

! para amostras independentes. Um valor de p de *0,05 foi considerado significativo. A maioria das linhagens celulares de mama contém uma população positiva para . ALDEFLUOR. O ensaio ALDEFLUOR (17) foi usado para isolar CSCs de 33 BCLs que re- presentam as diversas características e subtipos moleculares do câncer de mama (20). Veri- —ficou-se que 23 das 33 linhagens celulares continham uma população de células positiva para ALDEFLUOR que variou de 0,2 a quase 100%. Todas as 16 BCls ba- sais/mesenquimais continham uma população positiva para ALDEFLUOR, enquanto 7 das 12 BCLs luminais não continham quaisquer detectáveis células positivas para ALDEFLUOR (p = 0,0006, teste exato de Fischer).

Células positivas para ALDEFLUOR têm a capacidade de formação de tumoresfera. Foi previamente relatado que células-tronco e progenitoras do epitélio mamário são capazes de sobreviver e proliferar em condições de independentes de ancoragem e formam colônias esféricas flutuantes que são denominadas mamoesferas (18). Dados de tumores de mama, assim como linhagens celulares, demonstraram que células semelhantes às células-tronco —cancerosas ou células iniciadoras de câncer também podem ser isoladas e propagadas co- mo "tumoresferas" em ensaios similares (26). Todas as células iniciadoras de mamoesferas - na glândula mamária humana normal estão contidas dentro de uma população positiva para ALDEFLUOR (17). Para caracterizar a população positiva para ALDEFLUOR de BCLs, a r capacidade das populações positivas e negativas para ALDEFLUOR de 184A1, SUM149 e SUM159 em formar tumoresferas foi comparada. Em cada linhagem celular, a população - positiva para ALDEFLUOR apresentou maior capacidade formadora de tumoresfera em re- lação às células negativas para ALDEFLUOR.

' Células BCL positivas para ALDEFLUOR têm propriedades de célula-tronco cance- rosa in vivo. Para determinar a organização hierárquica da BCL, foram analisadas as propri- —edades de células-tronco das populações positivas e negativas para ALDEFLUOR das |i- nhagens celulares MDA-MB-453, SUM159 e BrCA-MZ-01. As populações positivas para ALDEFLUOR destas três BCLs constituíram entre 3,54+1,73% e 5,49+3,36% da população total de células (Fig. 1A-B, G-H; Fig. 2A-B). Como mostrado na Fig. 1F, L o tamanho e a latência de formação de tumores se correlacionou ao número de células positivas para —ALDEFLUOR injetadas. Notavelmente, 500 células positivas para ALDEFLUOR de MDA- MB-453 e 1.000 células positivas para ALDEFLUOR de SUM159 foram capazes de formar tumores. A capacidade de geração de tumor foi mantida através de passagens seriadas demonstrando a capacidade de auto-renovação dessas células. Em contraste, as células negativas para ALDEFLUOR não conseguiram gerar tumores, embora um crescimento limi- tado tenha sido produzido quando 50.000 células de MDA-MB-453 negativas para ALDEFLUOR foram injetadas. A marcação por H&E dos cortes de bolsa de gordura confir- mou que os tumores formados por células positivas para ALDEFLUOR continham células

: malignas, enquanto apenas células apoptóticas, residuais de Matrigel e tecido de camun- dongo foram observados nos locais das injeções de células negativas para ALDELFUOR . (Fig. 1E, K). Consistente com a população positiva para ALDEFLUOR ter características de célula-tronco cancerosa, tumores gerados por esta população recapitularam a heterogenei- dadefenotípica do tumor inicial, com uma proporção similar de células positivas e negativas para ALDEFLUOR (Fig. 1C, 1). Isso indica que as células positivas para ALDEFLUOR foram capazes de se auto-renovar, gerando células positivas para ALDEFLUOR e foram capazes de se diferenciar, gerando células negativas para ALDEFLUOR.

Quando células BrCa-MZ-01 foram separadas em componentes positivos e negati- vos paraALDEFLUOR, ambos foram capazes de geração de tumor.

Tumores gerados pela população positiva para ALDEFLUOR consistiram tanto em células positivas como negativas para ALDEFLUOR, recapitulando a heterogeneidade fenotípica do tumor inicial.

Em contra- partida, os tumores gerados pelas células negativas para ALDEFLUOR deram origem aos tumores de crescimento lento, contendo apenas células negativas para ALDEFLUOR.

Em contraste com a capacidade de células positivas para ALDEFLUOR de serem transplanta- das em série, passagens seriadas de tumores negativos para ALDEFLUOR produziram a - diminuição do crescimento do tumor, não havendo crescimento após três passagens.

Isto sugere que o componente positivo para ALDEFLUOR das células BrCa-MZ-01 contém célu- Ã las com propriedades de células-tronco, enquanto as células negativas para ALDEFLUOR contém células progenitoras capazes de sofrer um crescimento limitado, mas não de auto- e renovação.

Caracterização de perfil de expressão gênica das populações de células positivas e - negativas para ALDELFUOR.

Para determinar se as células positivas para ALDEFLUOR isoladas de diferentes BCLs expressavam um conjunto comum de genes de "célula-tronco —cancerosa", as populações de células positivas e negativas para ALDEFLUOR isoladas de oito BCLs (184A1, BrCA-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM49 e SUM159) foram analisados utilizando microarranjos de oligonucleotídeos de genoma intei- ro da Affymetrix.

O agrupamento hierárquico não supervisionado, aplicado às 16 amostras e aos 13.550 genes/ESTs filtrados, não separou as populações positivas e negativas para —ALDEFLUOR.

Em vez disso, as populações positivas e negativas para ALDEFLUOR se a- gruparam com a linhagem celular parental.

Isto sugere que as diferenças de transcritos de MRNA entre linhagens celulares clonais prevalecem sobre as diferenças entre as células positivas para ALDEFLUOR e negativas para ALDEFLUOR.

Isso sugere ainda que apenas um número limitado de genes é diferencialmente expresso entre as putativas células-tronco —cancerosase sua progênie.

Para determinar quais genes separariam populações positivas e negativas para ALDEFLUOR, o teste de Mann e Whitney U foi aplicado a todos os genes, menos aqueles y com expressão fraca e mal medida, ou seja, 25.285 conjuntos de sonda.

Este teste identifi- cou e classificou após a correção por FDR, 413 genes/ESTs que separaram as populações de células positivas e negativas para ALDEFLUOR.

Os 28 genes superexpressos corres- pondentes a genes específicos são apresentados na Tabela 1 e os genes mais frequente- mentesubexpressos são apresentados na Tabela 2. TABELA 1 — Genes Regulados Ascendentemente Categoria Símbolo | Descrição Citobanda | !n deconiate de DU Função — Genes anteriormente. sonda descritos por ter um repetição tetrapeptídica semelhante a homeobox ! (papeinabiiogia de chrâpost 239061 at desenvolvimento embrionário inicial Du roma romanas zdetannmeeno o james [xa [Pormesaormenh [LL rrems iancementateamat o fam [rss [Tri c tncctanano [eu frames Tamo usas [sr Lo e aeee am [ema [romeeneen — | [so ron fonema o fame [ams fumeso proteir ár dependente de cálcio/calmoduli [o [ee [em ttaeme fee [ma same | [| na enero tino estipe senta Apae a amais — [ame [omnes — - [eus enem — [ameno [ra [mepoeeimenss — [usas fara aaa James osaane — [O es fomenta fame [ame fun Do [O ea emamenmanoo — Jam — [es epa] o ssa Jamanta, farm [meo [tessairóemçame | 7 | raame aerea — [emo [amena [rresieaes — [sms Trovwovcataasmmenana nation [armess fissmo fRem [em Trmacmencmarcroz memos famenãa farm fo f femmaima co anne SO O A Des [ares ame Ig ente | eromatina Sw) Swyst [rea Tome men [ao see fiements — Po so cscrainaa, enfoenespecitco dapróstata) — | corinanaas | ameaça [maço [msm [eras [ementa — er [ama neon EAR [oescommanto — ares nonsense cetotemeo siemens [ amena [amena fossemero [runs ramaçonimiatia co somente vero Tanearo [ame [oe [ros fesmeremeneçã [ans [ams oem

TABELA 2 — Genes Regulados Descendentemente [stegonia[ simbolo — TDeseião — Jenonna ESET Fo o mao | Prosinaiomama mica 156 | ariopias — [22570nat Sie depetinanamíntadta x Lo esse | reatores | aa | rumos | rageeeera PO [srazação Tarso | etesstação aspargina-igadatomátogoS | cnrisgta3 | 218203 at — | Gicoslaçõo ceprateina. vei a a aa ras aapnaa (ammmns — [noutodaparantaaçeos Fosoreoslqlarants Fomaranstones eo Emo que Jura duma Lo Jar Desen farias | auena [reseendear | o oro uns 22a0ntar [ciente deetra LL uses aguesseaadems avos [rroeata at [oenadeto dept [covas pon concentra [nniiocasmaeto neta | EL e oa tenis [oreorna — fusão [EmaTtação depronna 153 arado de cel calda [e es Jus ques [as STRAEETT | | ros — uoecsarens — atego — [oorstar — frisos | agenda | Me forte o o otemantomãs | Spteng de RNA | coma feia o o enapsaz | 1sssati a at foccsssamem ne

O E E A CE EO - [o Jeso [ago ESSAS [omaszea orantn a [rsgimto somente | [o Jem mer o aan [amena [rosssinstême | [A faro esto Janes [nas quconammenente — | oxidativa mitocondrial, subunidades (fator E). chris 200082 s at “Sub-unidade de sintasa mitocondrial de ATP. o Came ERR o a | aa | amena (spia ca ementanamenat | E amem EE ar ovinos | anssn aa femea . PL eamerarto. ep — | caos a ' | erFeeeentorer | Posnaneaa O maças | oommacs Josenso | enem [ora iotentaenttt [arma onnaao fossa O Lo eme [ooniiooamento a | ovteãaa | oanans aa Jose ões — manterem ocetaçtor — amena — | auamea fm [O | tocessosst frota npaéica — TICER06S [ehrige1 — [225460528 — Dssconaddo O poder de classificação desta assinatura de separação foi ilustrado, classificando as 16 amostras positiva e negativas para ALDEFLUOR com os 413 genes/ESTs diferenci- almente expressos. O agrupamento hierárquico classificou 15 das 16 amostras (Fig. 2A). Vários genes conhecidos por desempenhar um papei na biologia de células-tronco estavam ascendentemente regulados nas populações positivas para ALDEFLUOR (Tabela 1), incluindo NFYA, NOTCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3 e TPRXL. Outros genes codificam proteínas que desempenham um papel putativo ou não caracterizado na função das células- tronco, como ARID1B, RAD51L1 e o receptor de quimiocina CXCR1/ILBRA (27). Genes —subexpressos na população positiva para ALDEFLUOR estão envolvidos na diferenciação celular, apoptose, splicing de RNA e metabolismo mitocondrial.

Para aumentar a estringência da análise, o limiar da análise de Mann e Whitney foi elevado para o risco 0,5 e obteve uma lista de 49 genes/ESTs que separou as populações positiva e negativa para ALDELFLUOR (genes com asterisco nas Tabelas 1-2). Com esta lista, todas as células positivas para ALDEFLUOR, com excepção de SK-BR-7, ficaram no mesmo grupo. Entre estes 49 genes/ESTS, 45 corresponderam a genes únicos identifica- dos; apenas 3 destes 45 foram superexpressos no grupo positivo para ALDEFLUOR, en- quanto 42 foram subexpressos. Genes superexpressos caracterizados codificam uma prote- ína F-box FBXO21 e CXCR1/ILS8RA. Genes subexpressos incluem aqueles que codificam proteínas mitocondriais (MRPL41, MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23, IMMP1L) e fato- res de diferenciação (NACA) e de splicing de pré-mRNA (LSM3, fator de processamento de pré-mRNA PRPF39 e PRPF4B). A validação cruzada que deixa um de fora (Leave-one-out) (LOOCV) a 0,5% de risco estimou a exatidão da predição da assinatura molecular identifica- dora e 88% das amostras foram preditas na classe certa com esta "assiantura de célula- tronco cancerosa", confirmando a análise supervisionada. Avaliação de RT-PCR quantitativa confirmou um aumento significativo de CXCR1 e - FBXO21 em células positivas para ALDEFLUOR. A análise por RT-PCR quantitativa de cin- co genes discriminantes superexpressos em populações positivas para ALDEFLUOR SÍ (CXCR1/IL8RA, FBKO21, NFYA, NOTCH2 e RAD51L1) foi realizada. Três linhagens celula- res utilizadas na análise de caracterização de perfis (BrCa-MZ-01, MDA-MB-453, SUM159) & e duas linhagens celulares luminais adicionais (MCF7, S68) foram classificados pelo ensaio ALDEFLUOR e populações positivas e negativas para ALDEFLUOR foram processadas . separadamente para análise de RT-PCR quantitativa. O nível de expressão na RT-PCR quantitativa de CXCR1 e FBXO21 é apresentado na Fig. 2 B e C. Os níveis de expressão —gênicamedidos por RT-PCR quantitativa confirmaram os resultados obtidos utilizando mi- croarranjos de DNA com um aumento do nível de MRNA de CXCR1 e FBXO21 na popula- ção positiva para ALDEFLUOR em relação à população negativa para ALDEFLUOR (p <0,05).

IL8 promove auto-renovação de células-tronco cancerosas . Os estudos de caracte- rização de perfil sugerem que o receptor de IL8 CXCR1/IL8RA foi consistentemente expres- so na população de células positivas para ALDEFLUOR. Para confirmar esta associação, a expressão da proteína de CXCR1/IL8RA foi medida por citometria de fluxo em populações positivas e negativas para ALDEFLUOR. As populações positivas e negativas para ALDEFLUOR de quatro linhagens celulares diferentes foram isoladas por FACS, fixadas e —marcadascom um anticorpo monoclonal de CXCR1I marcado com ficoeritrina. Como mos- trado na Fig. 3A, células positivas para ALDEFLUOR estavam altamente enriquecidas com células positivas para CXCR1 em comparação com as populações ALDEFLUOR-negativas.

Para determinar se a sinalização de IL8 é importante na função de células-tronco, quatro BCLs foram tratadas com IL8 recombinante humana para determinar seu efeito sobre a população de células-tronco cancerosas, conforme medido pela formação de tumoresferas e pela atividade enzimática de ALDH. Como mostrado na Fig. 3B, a adição de IL8 aumentou — aformação de tumoresferas primárias e secundárias de uma forma dose-dependente. Além disso, a IL8 aumentou a população ALDEFLUOR-positiva de uma forma dose-dependente em cada uma das quatro BCLs analisadas (Fig. 3C). Isso ilustra o poder da "assinatura CSC" para identificar vias que podem desempenhar um papel na função de células-tronco. O eixo de ILE/(CXCR1 está envolvido na invasão de células-tronco cancerosas. O eixodelL8/CXCRI1 foi relatado como desempenhador de um papel na invasão por células- tronco cancerosas (28, 29). Um ensaio de invasão de Matrigel foi utilizado, com soro como atrativo, para examinar a capacidade das populações de células positivas e negativas para ALDEFLUOR de três linhagens celulares diferentes (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) em invadir. Como mostrado na Fig. 4A, células positivas para ALDEFLUOR demonstraram inva- são através de Matrigel 6 a 20 vezes maior que a da população negativa para ALDEFLUOR (p < 0,01). Quando usado como quimioatrativo, a IL8 (100 ng/mL) aumentou a invensão por - células ALDEFLUOR-positivas (p<0,05) (Fig. 44). Em contraste com os seus efeitos sobre as células positivas para ALDEFLUOR, a IL8 não teve qualquer efeito sobre a capacidade SJ invasiva de células negativas para ALDELFLUOR. Estes resultados indicam que as células- tronco cancerosas exibiram comportamento invasivo e além disso que a IL8 facilita esse ce processo.

Células positivas para ALDEFLUOR aumentaram o potencial metastático. Foi pro- . posto que CSCs desempenham um papel crucial na metástase do câncer (30, 31). Os expe- rimentos acima demonstraram que as células ALDEFLUOR-positivas têm maior capacidade invasiva em relação às células ALDEFLUOR-negativas. Para determinar a relação entre a positividade para ALDEFLUOR e a capacidade metastática, HCC1954, MDA-MB-453 e SUM159 foram infectadas com um sistema repórter de lentivírus e luciferase. Células infec- tadas com luciferase foram triadas utilizando o ensaio ALDEFLUOR e introduzidas em ca- mundongos NOD/SCID por injeção intracardíaca. Uma suspensão de 100.000 células de cada população foi injetada e a metástase foi avaliada pela imagem de bioluminescência. Camundongos inoculados com células positivas para ALDEFLUOR desenvolveram metás- tases em diferentes locais e exibiram uma emissão maior de fluxo de fótons que camundog- nos inoculados com células não separadas, que desenvolveram não mais que uma metás- tase por camundongo, ou camundongos inoculados com células negativas para —ALDEFLUOR, que desenvolveram apenas metástases ocasionais limitadas aos linfonodos (Fig. 4B-J). Cortes histológicos confirmaram a presença de metástases nesses locais (Fig. 4K-M). Assim, a capacidade metastática de BCLs é predominantemente mediada por CSCs contidas na população positiva para ALDEFLUOR.

A hipótese de que tumores são organizados em uma hierarquia celular impulsiona- da por CSCs tem implicações fundamentais para a biologia do câncer, assim como implica- ções clínicas para a precoce detecção, prevenção e tratamento do câncer. Evidências das CSCs baseou-se em grande parte em modelos de xenoenxerto de passagem primária e inicial (32-34). Entretanto, o sucesso do estabelecimento do xenoenxerto de tumor de mama foi baixo particularmente para certos subtipos moleculares. Em contraste com os tumores primários, linhagens celulares estão disponíveis em quantidades ilimitadas e fornecem ape- nas populações carcinomatosas para análise molecular sem o tecido normal e estroma. No —câncerdemama, foi produzido um grande número de linhagens celulares imortalizadas que representam os diferentes subtipos moleculares encontrados em cânceres de mama huma- nos primários (2, 20). Entretanto, uma questão fundamental permanece: com que seme- lhança estas linhagens celulares são capazes de recapitular a biologia do câncer de mama humano. Evidência in vivo de células-tronco em linhagens celulares. Estudos recentes suge- rem que, embora linhagens celulares possam ser derivadas de modo clonal, elas contêm . uma hierarquia celular que representa diferentes estágios da diferenciação celular. Vários estudos utilizaram marcadores como CD44+/CD24- para identificar CSCs dentro de linha- S gens celulares de câncer de mama. Entretanto, sua utilidade é limitada pela observação de que frequentemente uma grande porcentagem de células dentro de uma linhagem celular expressa esses putativos marcadores de células-tronco. Por exemplo, mais de 90% das células em linhagens celulares de câncer de mama basal exibem o fenótipo CD44+/CD24-. - Na verdade, o fenótipo CD44+/CD24- não isolou a população tumorigênica dessas linha- gens celulares (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência em sua totalidade) Uma abordagem alternativa foi utiizada usar o SP dessas linhagens celulares. Entretanto, estudos funcionais utilizando coloração Hoechst são limitados pela toxicidade deste agente (35). Há também evidências de que a atividade funcional das célu- las-tronco não está contida dentro do SP (36). A atividade de ALDH avaliada pelo ensaio ALDEFLUOR isola células com proprie- dades de células-tronco de vários tipos de câncer (14, 37). Neste exemplo foi demonstrado que 23 das 33 BCLs (predominantemente linhagens basocelulares) contêm uma população positiva para ALDEFLUOR. Falta de uma população positiva para ALDEFLUOR em algumas BCLs luminais pode indicar que essas BCLs luminais são derivadas de células progenitoras negativas para ALDEFLUOR. Este exemplo utilizou ensaios in vívo em camundongos NOD/SCID para demonstrar as propriedades de células-tronco das populações positivas para ALDEFLUOR. A auto- renovação foi demonstrada por passagem seriada em camundongos NOD/SCID e a diferen-

ciação foi demonstrada pela capacidade de células positivas para ALDEFLUOR, mas não das negativas para ALDEFLUOR em regenerar a heterogeneidade celular do tumor inicial. Uma assinatura de células-tronco de câncer de mama. Utilizando oito linhagens ce- lulares de mama, este Exemplo identificou 413 genes cuja expressão discrimina células po- —sitivas de negativas para ALDEFLUOR. Essa assinatura contém uma série de genes conhe- cidos por desempenhar um papel na biologia das células-tronco. Genes superexpressos na população positiva para ALDEFLUOR incluem o homólogo 2 de Notch (NOTCH2), que regu- la a auto-renovação e a diferenciação de células-tronco mamárias (18, 38), NFYA, conheci- do por regular a auto-renovação e a diferenciação de células-tronco. (39, 40), o homólogo de pecanexPCNX, RBM15/OTT, que desempenha um papel pleiotrópico em células-tronco hematopoéticas (41) e afeta a diferenciação mieloide através da sinalização de NOTCH (42), o fator semelhante a homeobox TPRXL envolvido no desenvolvimento embrionário, ST3GAL3, que codifica uma antígeno embrionário estágio-específico 4 sintase, associada ao desenvolvimento fetal e à carcinogênese renal e gástrica (43). Notavelmente, a proteína do antigeno embrionário estágio-específico 4 (SSEA-4) é expressa em populações de célu- las-tronco, tais como células-tronco CXCR4+/CD133+/CD34+/lin- no sangue do cordão um- - bilical humano e células-tronco mamárias quiescentes (44). Genes subexpressos na população positiva para ALDEFLUOR estão envolvidos na SO diferenciação celular, apoptose e oxidação mitocondrial. Eles incluem genes que codificam — subunidades alfa de complexo associado ao polipeptídeo nascente NACA, proteínas de " morte programada PDCD5 e PDCD10, proteína de ribossomo mitocondrial L41 (MRPL41), que induz a apoptose através de maneira P53-dependente e independente através de BCL2 7 e caspases e proteínas envolvidas em processos mitocondriais como a fosforilação oxidativa (NDUFA2, ATP5J2, IMMP1L) e síntese proteica na mitocôndria (MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23). A regulação descendente de genes apoptóticos em CSCs pode de- sempenhar um papel na resistência destas células à radiação e quimioterapia (45, 46). ALDH1A1 não foi identificado como um gene diferencialmente expresso na assinatura posi- tiva para ALDEFLUOR. Entretanto, a análise do perfil de expressão gênica de BCLs indivi- duais revelou que, embora algumas tenham exibido expressão diferencial de ALDH1IA1 na população positiva para ALDEFLUOR, outras mostraram expressão diferencial de ALDH1A3, uma isoforma diferente de ALDH nesta população. Isto sugere que a expressão de diferentes isoformas de ALDH poderia contribuir para o fenótipo positivo par ALDEFLUOR.

De quimiocinas a "troncocinas." A expressão de CXCR1, um receptor de IL8, está aumentadaem uma variedade de cânceres (47-50). Embora a expressão de IL8 esteja as- sociada ao câncer de mama ER-negativo (51), esta quimiocina não foi anteriormente relata- da como desempenhadora de papel na função de células-tronco. Sua implicação na regula-

ção de crescimento e metástase é bem estabelecida no câncer de próstata independente de androgênio (52). Além disso, o nível de expressão de IL8 está associado à tumorigenicidade e metástase através da angiogênese e produção de VEGF (53, 54). Os dados de expressão gênica foram validados de três maneiras.

Primeiro, a análise por RT-PCR quantitativa con- firmou um aumento significativo do RNAm de CXCR1 na população positiva para ALDEFLUOR tanto de linhagens celulares incluídas como não incluídas na análise de carac- terização de perfil.

Segundo, demonstrou-se utilizando citometria de fluxo que células con- tendo CXCR1 foram encontradas exclusivamente na população positiva para ALDEFLUOR.

Terceiro, a IL8 recombinante aumentou a formação de mamoesfera e a porcentagem de células positivas para ALDEFLUOR em BCLs.

O eixo IL8/CXCR1 assim, parece regular a proliferação ou auto-renovação de células-tronco mamárias.

Já que células endoteliais e estromais secretam IL8, esta quimmiocina parece desempenhar um papel na mediação de interações entre células-tronco tumorais e o microambiente tumoral.

Estudos recentes sugeriram um papel para as interleucinas/quimiocinas na regulação das CSCs(55, 56). Isso inclui um papel para a IL6 em CSCs de mama e para a IL4 na mediação da quimiorresistência de CSCs de cólon (56-59). Estes fatores podem estar envolvidos na associ- - ação entre inflamação e câncer.

Isto também inclui um papel para CCL5 (RANTES), uma quimio- cina secretada por células-tronco mesenquimais, que atua como um fator parácrino e intensifica a SÍ motilidade, invasão e metástase de células de câncer de mama (55). As raízes da metástase.

CSCs podem ser responsáveis pela mediação de metásta- 7 ses de tumor.

Um elo entre CSC e metástase foi sugerido pela primeira vez com a identifi- cação de genes de células-tronco em uma assinatura de 11 genes gerada usando o perfil ] comparativo de tumores metastáticos e primários em modelo de camundongo transgênico do câncer de próstata e pacientes com câncer (60). Essa assinatura foi também um podero- so preditor de recorrência da doença, morte após a terapia e metástases distantes em uma variedade de tipos de câncer.

Este exemplo demonstrou que células positivas para ALDEFLUOR são mais metastáticas que células negativas para ALDEFLUOR e que a IL8, relatada previamente como desempenhadora de um papel na metástase tumoral, promove a invasão e quimiotaxia de células-tronco cancerosas, que preferencialmente expressam o receptor de IL8, CXCR1. A capacidade de isolar células-tronco cancerosas metastáticas de linhagens celulares deve facilitar os estudos sobre os mecanismos moleculares pelos quais as células-tronco cancerosas mediam a metástase do tumor.

EXEMPLO 2 Inibição de CXCR1 e Terapia de Combinação Este exemplo descreve vários métodos utilizados para testar o efeito da inibição de CXCR1 em células tumorais, assim como a combinação da inibição de CXCR1 em combi- nação com um agente antimitótico (docetaxel).

Efeito da inibição de CXCR1 no crescimento celular e na população positiva para ALDEFLUOR da linhagem celular SUM159. A linhagem celular SUM159 foi cultivada em condição aderente e as células trata- das usando o inibidor de CXCR1I/CXCR2, Repertaxina, ou dois anticorpos específicos de — bloqueio para CXCR1 ou CXCR?2. Após 4 dias de tratamento, o efeito sobre o crescimento celular foi analisado usando o ensaio MTT (Figura 5A) e sobre a população de células- tronco cancerosas usando o ensaio ALDEFLUOR (Figura 5B). Mais de 95% de inibição do crescimento celular foi observado nas células tratadas com Repertaxina ou com o anticorpo de bloqueio a CXCR1, enquanto nenhum efeito foi observado para as células tratadas com o anticorpo de bloqueio a CXCR2 (Figura 5A). Curiosamente, efeito similar foi observado na população positiva para ALDEFLUOR com uma redução de 80% e 50% da população posi- tiva para ALDEFLUOR nas células tratadas com Repertaxina e anticorpo de bloqueio a CXCR1 respectivamente (Figura 5B).

Tratamento com Repertaxina induz um efeito espectador mediado pela sinalização deFAS/ligante deFAS Células da linhagem celular SUM159 foram cultivadas em condições aderentes e, . em seguida, tratadas com Repertaxina, isoladamente ou em combinação com um antagonis- ta de FAS. Curiosamente, a inibição do crescimento celular induzida pelo tratamento com 7 Repertaxina foi parcialmente recuperada pela adição de um antagonista de FAS (anti/Fas- ligantedaBD PharMingen (cat f 556371)). Além disso, as células tratadas com um agonista . de FAS apresentaram uma inibição do crescimento celular similar àquele das células trata- das com Repertaxina. Estes resultados sugerem que o tratamento com a Repertaxina induz " um efeito espectador mediado pela sinalização de FAS/ligante de FAS.

Efeito do tratamento com Repertaxina sobre a ativação de FAK, AKT e FOXOA3.

Para avaliar o efeito do tratamento com Repertaxina sobre a sinalização a jusante de CXCR1, células SUM159 foram cultivadas, durante 2 dias, em condição aderente na ausência ou na presença de 100nM de Repertaxina e marcadas por imunofluorescência com anticorpos contra P-FAK, p -AKT e FOXOAS. Nas células não tratadas (Fig. 7A), detectou-se que 30% das células expressando p-FAK e 10% das células expressando p-AKT apresentaram inativação, enquanto — célulastratadas com Repertaxina exibiram uma completa inativação de p-FAK e p-AKT (Fig. 7B). As células SUM159 não tratadas apresentaram 80% de células positivas no citoplasma para FOXOAS3. Curiosamente, células SUM159 tratadas com Repertaxina apresentaram 80% de célu- las positivas no núcleo para FOXOA3. A alteração na localização celular de FOXOA3 do citoplasma para o núcleo indica uma ativação da proteína FOXOA3.

Curvas de crescimento de tumores após o tratamento com Repertaxina, docetaxel ou com a combinação O efeito de repertaxina, docetaxel, ou da combinação deles foi avaliado utilizando uma linhagem celular de câncer de mama (8A, SUM159) e três xenoenxertos de câncer de mama humano gerados a partir de diferentes pacientes (8B, MC1; 8C, UM2; 8D, UM3). Para cada amostra, 50.000 células foram injetadas na bolsa de gordura mamária de camundon- gos NOD-SCID que foram monitorados pelo tamanho do tumor. Injeções foram iniciadas quando o tamanho do tumor era de cerca de 4 mm. A Repertaxina foi injetada (15 mg/Kg) duas vezes por dia por 28 dias ou uma vez por semana, docetaxal foi injetado 1.P. (10 mg/Kg), ou a combinação (Repertaxina/Docetaxel) foi empregada. A Figura 8 mostra os ta- manhos dos tumores antes e durante o desenrolar de cada tratamento indicado (seta, início do tratamento). Resultados similares foram observados para cada amostra (SUM159, MC1, UM2, UM3), com uma redução estatisticamente significante do tamanho do tumor, quando tratadas com docetaxel isoladamente ou com a combinação rpertaxina/docetaxel comparada ao controle (p <0,01), enquanto nenhuma diferença significativa foi observada entre o cres- cimento dos tumores de controle e os tumores tratados com repertaxina.

Efeito do tratamento com repertaxina, docetaxel, ou com a combinação sobre a po- —pulaçãode células-tronco cancerosas, conforme avaliado pelo ensaio ALDEFLUOR A atividade de ALDH foi avaliada pelo ensaio ALDEFLUOR para analisar o tamanho . das populações de células-tronco cancerosas em cada tumor (9A. SUM159, 9B. MC1, 9C.

UM?2, 9D. UM3) tratado com repertaxina, docetaxel ou com a combinação. Resultados simi- "a lares são observados para cada amostra. Xenoenxertos tumorais tratados com docetaxel mostraram porcentagem similar ou aumento de porcentagem de células positivas para te ALDEFLUOR em comparação com o controle, enquanto o tratamento com repertaxina iso- ladamente ou em combinação com docetaxel produziu uma diminuição estatisticamente sig- . nificativa nas células positivas para ALDEFLUOR com 65% a 85% menos células-tronco cancerosas em comparação com o controle (p <0,01).

Efeito do tratamento com repertaxina, docetaxel, ou com a combinação sobre a po- pulação de células-tronco cancerosas, conforme avaliado por implantação em um camun- dongo secundário.

Diluições em série de células obtidas de tumores primários (10A4. SUM159, 10B. MC1, 10C UM2., 10D. UM3) sem tratamento (controle) e tratados com repertaxina, doceta- xeloucoma combinação foram implantados na bolsa de gordura mamária de camundongos NOD-SCID secundários. Tumores primários controle e tratados com docetaxel formaram tumores secundários em todas as diluições enquanto, apenas uma maior concentração de tumores primários tratados com repertaxina ou em combinação com docetaxel foi capaz de formar tumores secundários tardios, que eram de tamanho significativamente menor que o — dos tumores controle ou tratados com docetaxel (p < 0,01). Além disso, 1.000 e 100 células primárias tratadas com a combinação não conseguiram formar tumores secundários para 3 das 4 amostras (SUM159, UM2, UM3).

O tratamento com repertaxina reduz o potencial metastático da linhagem celular SUM159 A linhagem celular SUM159 foi infectada com um lentivírus expressando luciferase e

250.000 células infectadas com luciferase foram inoculadas no coração de camundongos —NOD/SCID. Os camundongos foram organizados em dois grupos. Os dois grupos de camundon- gos foram tratados 12 horas após a injeção intracardíaca quer com injeção s.c. de solução salina quer com injeção s.c. de repertaxina (15mg/Kg), duas vezes por dia durante 28 dias. A formação de metástase foi monitorada através de imagem de bioluminescência (11B: Camundongos trata- dos com solução salina; 11C: Camundongos tratados com repertaxina). A quantificação do fluxo de fótons normalizado medido em intervalos semanais após a inoculação revelou um aumento estatisticamente significativo da formação de metástase no grupo de camundongos tratados com solução salina em comparação ao grupo de camundongos tratados com repertaxina (11A).

EXEMPLO 3 Tratamento de células-tronco cancerosas por bloqueio de CXCR1 Este exemplo demonstra o efeito da inibição de CXCR1 nas células tumorais, tanto através de ensaios in vitro como de modelos de camundongo. - Dissociação do tecido mamário. Cem a duzentos gramas de tecido mamário normal de mamoplastias de redução foram picados com bisturis, dissociados enzimaticamente e SJ células individuais foram cultivadas em suspensão para gerar mamoesferas ou sobre um substrato de colágeno em condição aderente para induzir a diferenciação celular (Dontu et a al. Genes Dev. 17:1253-1270., aqui incorporada como referência em sua totalidade). Cultura de células. Linhagens celulares de câncer de mama foram cultivadas usan- . do condições de cultura recomendadas (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313. , aqui incorporada como referência em sua totalidade). Linhagens celulares de câncer de mama foram tratadas em condição aderente com repertaxina (Sigma-Aldrich), anticorpo mo- noclonal de camundongo anti-CXCR1 humano (Clone 42705, R&D Systems), anticorpo mo- noclonal de camundongo anti-CXCR2 humano (clone 48311, R&D Systems), anticorpo mo- noclonal de camundongo anti-CD95 humano (clone DX2, BD Pharmingen) utilizado como um agonista da sinalização de FAS, anticorpo monoclonal de camundongo anti-FAS-ligante humano (clone NOK-1, BD Pharmingen) utilizado como um antagonista da sinalização de FAS, ou com docetaxel (Taxotere, da Sanofi-Aventis).

Viabilidade celular. Para ensaios de MTT, as células foram plaqueadas em condi- ções de aderência em placas de 96 poços a 5.000 células por poço. Depois um dia, o trata- mento com repertaxina foi iniciado. O efeito do tratamento com repertaxina na viabilidade —celularfoi estimado em momentos diferentes pela adição de 20 ul. da solução de MTT (5 mg/mL em PBS) em cada poço. As células foram então incubadas por 1 hora a 37ºC, segui- da pela adição de 50 ul de DMSO a cada poço. A absorbância foi medida a 560 nm em lei-

tor de placas de fluorescência (Spectrafluor, Tecan). Para ensaios TUNEL, as células foram plaqueadas em condições de aderência em placas de 6 poços a 50.000 células por poço.

Depois um dia, o tratamento com repertaxina foi iniciado.

O número de células apoptóticas foi estimado após quatro dias de tratamento.

As células foram fixadas em 3,7% de formalde- ídoe coradas utilizando o kit TACS TdT (R&D Systems). Os núcleos foram contracorados com DAPIantifade (Invitrogen). Os cortes foram examinados com um microscópio de fluo- rescência (Leica, Bannockborn, IL, EUA), com células apoptóticas detectadas em verde.

Ensaio ALDEFLUOR.

O kit ALDEFLUOR (StemCell technologies) foi usado para i- solar a população com alta atividade enzimática de ALDH usando um FACStarPLUS (Bec- ton Dickinson), como descrito anteriormente (Ginestier et a/. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência em sua totalidade). Para eliminar células de origem de camun- dongos dos tumores xenotransplantados, a população celular foi marcada com um anticorpo anti-H2Kd (BD Biosciences, 1/200, 20 min no gelo), seguido por marcação com um anticor- po secundário marcado com ficoeritrina (PE) (Jackson labs, 1/250, 20 min no gelo). Teste ELISA.

Para medir o nível de ligante de FAS solúvel secretado no meio de cultura de células tratadas ou não com repertaxina, foi utilizado o Elisa de Human sFAS Li- - gand (Bender MedSystems). A absorbância foi lida em um espectrofotômetro utilizando 450 nm como o comprimento de onda primário. / Transferência (blotting) de Western.

As células foram lisadas em tampão de Laem- mlie carregadas em géis de SDS-poliacrilamida.

As transferências foram incubadas com os " respectivos anticorpos primários diluídos em TBST (contendo 0,1% de Tween20 e 2% de BSA), quer durante a noite a 40 quer por 2 horas em temperatura ambiente.

As transferên- 7 cias foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários apropriados (GE Healthcare, UK) e detectadas usando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce). Imunomarcação.

Para a marcação de imunofluorescência, células positivas para CXCR1 triadas foram fixadas com metanol a 95% a -20ºC por 10 minutos.

As células foram reidratadas em PBS e incubadas com os respectivos anticorpos em temperatura ambiente por 1 hora.

Os anticorpos primários utilizados foram P-FAK (1:50, Cell Signaling Technol- ogy), P-AKT (1:300, Cell Signaling Technology) e FOXO3a (1:250, Cell Signaling Technol- ogy) As lâminas foram em seguida lavadas e incubadas por 30 minutos com anticorpos se- cundários conjugados a PE (Jackson Labs) Os núcleos foram contracorados com DAPIantifade (Invitrogen) e cobertos com lamínulas.

Os cortes foram examinados em um microscópio de fluorescência (Leica, Bannockborn, IL, EUA). A imuno-histoquímica para a detecção da expressão de ALDH1 (1:100, BD Biosciences), P-FAK, P-AKT, FOXO3a foi feitaem corte de parafina (Ginestier et al.

Am.

J Pathol. 161:1223-1233., aqui incorporada como referência em sua totalidade). A marcação foi feita utilizando o kit Histostainplus (Zy- med laboratories). Diaminobenzidina (DAB) ou 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) foi usado como cromógeno e os cortes foram contracorados.

Modelo animal. A tumorigenicidade de células SUM159 ALDELFUOR- positivas/CXCR1-positivas e ALDEFLUOR-positivas/CXCR1-negativas foi avaliada em ca- mundongos NOD/SCID (Ginestier et a/. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). A linhagem celular SUM159 e três xenoenxertos de câncer de mama humano primário gerados a partir de três pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) foram utilizados para determinar a eficiência do tratamento com repertaxina sobre o cresci- mento tumoral (Ginestier et a/. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência em sua totalidade). Células destes tumores foram transplantadas ortotopicamente na bolsa de gordura depurada humanizado de camundongos NOD/SCID, sem cultivo in vitro. Bolsas de gordura foram preparadas como descrito anteriormente (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência em sua totalidade). Cinquenta mil células de cada xenotransplante foram injetadas na bolsa de gordura humanizada de camundongos NOD/SCID e o crescimento do tumor foi monitorado. Quando o tamanho do tumor era de aproximadamente 4 mm, o tratamento com repertaxina isoaladamente (s.c., 15mg/Kg duas vezes ao dia, durante 28 dias), docetaxel isoladamente (i.p., 10mg/Kg, uma vez por semana, - durante 4 semanas), em combinação (repertaxina/docetaxel), ou um grupo controle injetado com salina (i.p,, uma vez por semana e s.c. duas vezes ao dia, durante 28 dias) foi iniciado. SJ Os animais foram sacrificados, quando os tumores tinham aproximadamente 1,5 cm no mai- ordiâmetro, para evitar a necrose do tumor e em conformidade com os regulamentos para o uso de animais vertebrados em pesquisa. Uma parte de cada bolsa de gordura injetada foi fixada em formalina e incluída em parafina para análise histológica. O restante das células . tumorais foram re-implantadasd em camundongos NOD/SCID secundários. Diluições seria- das de células foram utilizadas para a re-implantação com a injeção de 10.000, 1.000 e 100 —célulaspara cada tumor tratado.

Cultura independente de ancoragem. BCLs tratadas, em condições de aderência, com repertaxina (100nM), anticorpo anti-CXCR1 (10ug/ml), ou ant-CXCR2 (10upg/ml) foram dissocia- das e plaqueadas como células isoladas em placas de adesão ultrabaixa (Coming, Acton, MA) em baixa densidade (5.000 células viáveis/mL). As células foram cultivadas como descrito anterior- mente (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporada como referência em sua totalidade). Culturas subsequentes após a dissociação de tumoresferas primárias foram pla- queadsa em placas de adesão ultra-baixo em uma densidade de 5.000 células viáveis/mL. A ca- pacidade de células em formar tumoresferas foi quantificada após a primeira (tumoresferas pri- márias) e a segunda (tumoresferas secundárias) passagem.

Extração de RNA e gRT-PCR. Após as células SUM159 serem tratadas, o RNA total foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (QIAGEN) e utilizado em ensaios de RT-PCR quantitativa em tempo real (GRT-PCR) em um sistema de detecção de sequências ABI PRISMO 7900HT. Inicia-

dores e sondas para o sistema Tagman foram selecionados a partir do site da Applied Biosystems ' (www ponto appliedbiosystems ponto com) (ID de ensaio de FAS-Ligante: Hs 00899442 mi; ID de ensaio de IL8: Hs 00174103 mi, ID de ensaio de TBP: Hs 00427620 mi). O nível de expres- são relativa de RNAm de FAS-Ligante e IL8 foi computado com relação ao gene TBP como pa- drãointerno para normalizar as variações na qualidade do RNA e na quantidade de cDNA de en- trada, conforme descrito anteriormente (Ginestier et a/. Clin. Cancer Res. — 12:4533-4544., aqui incorporada como referência em sua totalidade).

Análise por citometria de fluxo. A marcação de CD44/CD24/Lin foi realizada (Gines- tier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). A marcação de CD95/FAS foi realizada utilizando-se um anti-CD95 marcado com APC (1:20, BD biosciences). Para a marcação com CXCR1 e CXCR2, anticorpos primários anti-CXCR1 (1:100, Clone 42705, R&D Systems) e anti-CXCR2 (1:100, clone 48311, R&D Systems) fo- ram seguidos por uma marcação com um anticorpo secundário anti-ccamundongo marcado com PE (diluição 1:250, Jackson Labs). Células frescas foram coradas com 1ug/mL de PI (Sigma)por5 min para viabilidade.

Infecção viral. Duas construções lentivirais diferentes foram produzidas para a expressão - do gene da luciferase (Lenti-LUC-VSVG) (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. = 69:1302-1313,, aqui incorporada como referência, em sua totalidade) e para a inibição da expressão de PTEN 7 (Lenti-PTEN-SIRNA-DsRed) (Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:01000121., aqui incorporada como referência em sua totalidade), respectivamente. Todos as construções lentivirais foram preparadas a pela University of Michigan Vector. Um construção adenoviral para a superexpressão de FAK (ADd-FAK-GFP) também foi utilizada (Luo et a/. Cancer Res. 69:466-474., aqui incorporada como ". referência em sua totalidade). A infecção de células com diferentes vetores foi realizada como descrito previamente (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). A eficiência de infecção foi verificada pela mensuração do percen- tual de células expressando DsRed ou GFP.

Inoculação intracardíaca. Camundongos NOD/SCID de seis semanas de idade fo- ram anestesiados com mistura de isofluorano/ar a 2% e injetados no ventrículo esquerdo do coração com 250.000 células em 100 ul. de PBS de Dulbecco estéril livre de Ca2+ e Mg2+.

Para cada uma das três linhagens celulares (HCC1954, MDA-MB-453 e SUM159) e para cada tratamento (salina ou repertaxina) seis animais foram injetados. Doze horas após as injeções intracardíacas, os camundongos foram iniciados em injeções duas vezes ao dia de repertaxina ou soro fisiológico para os controles.

Detecção de bioluminescência. A bioluminescência basal foi avaliada antes da ino- —culaçãoeinoculaçõesde cada semana depois disso. Procedimentos de detecção de biolu- minescência foram realizados conforme descrito anteriormente (Charafe-Jaufíret et al. Can- cer Res. 69:1302-1313., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). O fluxo de fótons normalizado representa a relação entre o fluxo de fótons detectado cada semana a- pós inoculações e o fluxo de fótons detectado antes da inoculação.

A expressão de CXCR1 subdivide as populações de células-tronco cancerosas.

À identificação de vias de sinalização celular que regulam as células-tronco cancerosas (CSC) fornece potenciais alvos terapêuticos em uma população de células.

Uma assinatura de CSC de mama baseada em caracterização de perfil de expressão gênica que continha vá- rios genes potencialmente envolvidos nas vias regulatórias de CSC de mama foi identificada (Charafe-Jauffret et al.

Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). Entre os genes superespressos na população de CSC de mama, CXCR1, um receptor que se liga a quimiocina pró-inflamatório IL-8/CXCLB8, pareceu ser um candidato promissor já que a IL-8 recombinante estimulou a auto-renovação de CSCs de mama (Cha- rafe- Jauffret et al.

Cancer Res. 69:1302-1313,, aqui incorporada como referência, em sua totalidade). Utilizando citometria de fluxo, a expressão da proteína CXCR1 foi medida na população CSC de mama, conforme avaliado pelo ensaio ALDELFUOR nas linhagens celu- lares de câncer de mama humano HCC1954, MDA-MB-453 e SUM159. Células com propri- edades funcionais de células-tronco em xenoenxertos de camundongo NOD/SCID estavam - contidas na população de células ALDEFLUOR-positivas (Charafe-Jauffret et al.

Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporada como referência, em sua totalidade). A população - CXCR1-positiva, que representa menos de 2% da população total, estava quase exclusiva- mente contidana população ALDEFLUOR-positiva (VEJA a FIG.12A e a Tabela 4). % Tabela 4. Linhagens celulares de câncer de mama HCC1954 342 172 [E MDA-MB-453 422 o8 os SUM159 524 052 0.48 Xenoenxertos de câncer de mama humano.

MC1 123 181 1322 UM2 BA 123 0.88 UM3 97 084 076 A expressão CXCR2 também foi avaliada.

CXCR2 é um receptor que pode também se ligar a I1L-8/CXL8, embora com menor afinidade em comparação com CXCR1. Em con- traste com as células CXCR1 positivo, as células CXCR2 positivo foram igualmente distribu-

idas entre as populações ALDEFLUOR positivo e ALDEFLUOR negativo (ver figura 12A). Para determinar a organização hierárquica da população de células-tronco cancerosas de acordo com a expressão CXCR1, populações de células ALDEFLUOR-positivo/CXCR1- positivo e ALDEFLUOR-positivo/CXCR1-negativo foram ordenadas e injetadas em camun- —dongosNOD/SCID (ver FIG. 13 Ambas as populações de células geraram tumores. A ciné- tica de crescimento do tumor foi correlacionada com a latência e o tamanho da formação do tumor e o número de células injetadas. Tumores gerados pela população ALDEFLUOR- positivo/CXCR1-positivo reconstituíram a heterogeneidade fenotípica do tumor inicial após passagens seriadas considerando que a população ALDEFLUOR-positivo/CXCR1-negativo deu origem aos tumores que contêm apenas células ALDEFLUOR-positivo/CXCR1- negativo. Estes resultados sugerem que a hierarquia celular CSC é organizada de acordo com a expressão CXCR1, porém as duas populações de células tumorais exibiram capaci- dade similar. O bloqueio CXCR1 diminui o câncer de mama na população de células-tronco in vi- tro Três linhas de células diferentes foram tratadas com com repertaxina (100nM), um inibi- dor de CXCR1 / 2, para avaliar o efeito do bloqueio CXCR1 sobre a população de mama . CSC (Bertini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 101:11791-11796., aqui incorporado por refe- rência, na sua totalidade). Para SUM159, após três dias de tratamento, uma redução de cinco vezes na proporção de células ALDEFLUOR-positiva foi observada (VER FIG. 126). Um efeito similar foi observado após o tratamento de células SUM159 com um anticorpo de * bloqueio anti-CXCR1. Em contraste, nenhum efeito foi observado após o tratamento com um anticorpo de bloqueio anti-CXCR2, sugerindo que os efeitos de repertaxina sobre a popula- e ção ALDEFLUOR-positivo foram mediadas por CXCR1. Dados de tumores de mama, bem como linhas de células, demonstram que as célu- las-tronco cancerosas ou células iniciadoras de câncer também podem ser isoladas e pro- pagadas como "tumoresferas" na cultura de suspensão (Ponti et a/. Cancer Res. 65:5506-

5511., aqui incorporado por referência, na sua totalidade). Após três dias de tratamento com repertaxina ou com o anticorpo de bloqueio anti-CXCR1, quando células foram desanexadas e cultivadas em suspensão, uma diminuição de oito vezes na formação da tumoresfera pri- — máriae secundária foi observada em relação aos controles. Em contraste, o anticorpo anti- CXCR?2 de bloqueio não teve nenhum efeito sobre a formação da tumorsphere (VER FIG. 14). Surpreendentemente, após cinco dias de tratamento com repertaxina observamos uma diminuição maciça na viabilidade da população celular total avaliada pelo teste de MTT, — com apenas 3% das restantes células viáveis (ver FIG. 12C). Resultados semelhantes foram observados com o anticorpo anti-CXCR1 de bloqueio, mas não os anticorpos de bloqueio anti-CXCR2, indicando que este efeito foi dependente do bloqueio de CXCR1. Este efeito de repertaxina foi retardado com perda de viabilidade celular a partir de três dias após o trata- mento (ver FIG. 15A). O tratamento com repertaxina induziu um efeito similar na linha celu- lar do câncer da mama HCC1954 enquanto nenhum efeito foi observado em células MDA- MB-453 que abrigam uma mutação PTEN (Hollestelle et al. Cancer Res. 5:195-201., aqui incorporado por referência, na sua totalidade). (VIDE FIG. 14, 15B-C, e 16).

Utilizando um ensaio TUNEL, as células SUM159 foram marcadas após 4 dias de tratamento com repertaxina e um decréscimo maciço da viabilidade celular, devido à indu- ção de apoptose, com 36% de células apoptóticas detectadas após o tratamento de reperta- xina foi observada (ver FIG. 12D). Os resultados sugerem que o bloqueio CXCR1 resulta em uma diminuição da população de mama CSC seguida de indução de apoptose em massa na população restante volume do tumor.

Bloqueio CXCR1 induz a morte celular nas células CXCR1 negativo através de um efeito espectador. A observação de que uma morte de célula maciça de anticorpos induz bloqueio de repertaxina ou anti-CXCR1 apesar do fato de que a população CXCR1-positivo representava menos de 2% da população total de célula sugeriu que bloqueio de CXCR1 em células CXCR1-positivo induziu a morte de células CXCR1-negativo através de um efeito . atmosférico. As populações classificadas de CXCR1-positivo e CXCR1-negativo foram tra- tadas com repertaxina (ver FIG. 12E). Repertaxina diminuiu a viabilidade celular na popula- SJ ção CXCR1 positivo dentro de três dias, enquanto nenhum efeito foi observado na popula- çãoCXCR1-negativo. Repertaxina induziu a morte celular em massa de células separadas.

O efeito de repertaxina na viabilidade celular das populações não separadas e CXCR1- positivo foi dependente de dose (ver FIG. 12E). Os resultados são consistentes com o tra- ] tamento de repertaxina direcionados à população CXCR1 positivo que, por sua vez, induz a morte de célula CXCR1 negativo através de um efeito espectador.

Para determinar se este efeito foi mediado por um fator solúvel induzido por reper- taxin, o meio condicionado foi coletado da população CXCR1 positivo depois de três dias de tratamento de repertaxina e dialisada este meio, utilizando uma membrana de 3,5 KDa ex- clusão, a fim de remover repertaxina do meio, mantendo moléculas maiores que 3,5 KDa. O meio condicionado dialisado induziu uma diminuição maciça da viabilidade celular em am- basas populações CXCR1-negativo e não separadas, mas não na população CXCR1- positivo (ver FIG. 12F). Esses resultados demonstram que o bloqueio de CXCR1 na popula- ção CXCR1 positivo induz a morte celular na população CXCR1 negativo através de um fator não solúvel dialisável. Embora a população CXCR1 positivo é sensível a repertaxin, é resistente ao fator de morte dialisável.

O efeito induzido pelo espectador de bloqueio de CXCR1 é mediado por sinalização FAS-ligante/FAS. A interação FAS-ligante/FAS é ativada em diferentes estádios fisiológicos, como a involução da glândula mamária ou em condições de lesão tecidual, incluindo a indu-

zida pela quimioterapia (Chhipa et a/. J Cell Biochem. 101:68-79., Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., aqui incorporado por referência em sua totalidade). O nível de FAS solúvel ligante no meio das células tratadas com SUM159 repertaxina utilizando um teste ELISA para avaliar o papel da interação FAS-ligante/FAS na mediação do efeito observador de apoptose induzida por CXCR1 bloqueio. Mais do que um aumento de cinco vezes de FAS solúvel ligante no meio das células tratadas por quatro dias com repertaxina em comparação com células não tratadas foi observado (ver FIG. 17A). A regulação da transcrição do FAS- ligante por tratamento repertaxina medindo FAS-ligante nível de MRNA foi confirmada por RT-PCR (ver FIG. 17B). Um aumento de 4 vezes do nível de MRNA de FAS ligante na re- pertaxina trataram células foi observada em comparação com células não tratadas. Resulta- dos semelhantes foram observados após o tratamento com um agonista FAS que ativa a sinalização FAS, indicando que a FAS ligante é um alvo da sinalização FAS gerando um ciclo positivo de feed-back. 100% das células SUM159 expressaram a proteína FAS, con- forme determinado por citometria de fluxo. Tratamento das células SUM159 com o agonista FAS reproduzido o efeito de matar observado com o tratamento repertaxina com redução acentuada da viabilidade celular (ver FIG. 17C). O efeito do tratamento repertaxina na viabi- " lidade celular foi parcialmente compensado por um anticorpo bloqueador anti-FAS-Ligante, com 44% de células remanescentes viáveis após o tratamento com repertaxina e anticorpo . anti-FAS-ligante em comparação com apenas 3% com repertaxina sozinho (veja FIG . 17C). Os resultados sugerem que a morte celular massiva induzida por repertaxina é devido a um JA efeito de espetador mediada pela via FAS-Ligante/FAS. Tratamento de células SUM159 com o agonista do FAS resultou em um aumento ft de dez vezes e três vezes no percentual de células positivas e CXCR1 ALDEFLUOR- positivo, respectivamente (ver FIG. 17D / E e 18). Os efeitos de repertaxina em ambas as populações não foi resgatado pelos anti-FAS-ligante (ver FIG. 17D / E), sugerindo que a população ALDEFLUOR positivo que contém a população CXCR1 positivo, enquanto dire- tamente sensível ao bloqueio CXCR1 que por sua vez, induz a produção de FAS-ligante por estas células são resistentes à FAS-ligante/FAS pró-apoptótico de sinalização. Em contras- te, a população de células ALDEFLUOR negativo em massa não expressam CXCR1 mas é sensível à morte celular mediada por FAS-ligante.

A FAS-ligante/FAS sinalização desempenha um papel importante durante a involu- ção da glândula mamária (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., aqui incorporado por referência em sua totalidade). O efeito do bloqueio CXCR1 em células epiteliais mamárias humanas normais obtidas de mamoplastia de redução foi examinado. Como observado em linhasde células cancerígenas da mama, células mamárias CXCR1 positivo normais foram quase exclusivamente contidas na população ALDEFLUOR-positivo (ver FIG. 19A). Para determinar se a sinalização IL-8 é importante no tronco da mama normal / função de células go progenitoras, células epiteliais mamárias normais cultivadas em suspensão foram tratados com humanos recombinantes IL-8 e determinado o seu efeito sobre a população CSC, me- dida pela formação de mamoesferas (Dontu et a/. Genes Dev. 17:1253-1270., aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade). A adição de IL-8 aumentou a formação de mamoes- feras primária e secundária de uma forma dependente de dose (ver FIG. 19B), sugerindo que o eixo IL-8/CXCR1 pode estar envolvido na regulação do tronco mamário normal / proli- feração de células progenitoras ou auto-renovação. O tratamento com o agonista ou reper- taxina FAS não teve efeito sobre a viabilidade das células epiteliais mamárias normais culti- vadas em condições de aderência, mesmo quando altas concentrações de repertaxina (500nm) foram utilizadas (ver FIG. 16A). No entanto, como observado para as linhas de cé- lulas de câncer de mama, um aumento FAS solúvel ligante foi detectado no meio de células epiteliais mamárias normais tratadas com repertaxina (ver FIG. 20B). Essa observação pode ser explicada pela ausência de expressão de FAS nas células epiteliais normais cultivadas sob estas condições (ver FIG. 20C). Isto é consistente com estudos que demonstram que a expressão de FAS na glândula mamária ocorre apenas durante o processo de involução seguintes de lactação (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., aqui incorporado por refe- - rência em sua totalidade). Em contraste com a ausência de efeito sobre a população em massa de células do epitélio mamário normal, repertaxina diminuiu significativamente a for- é” mação mammosphere por essas células (ver FIG. 20C). Estes resultados sugerem que o eixo IL-8/CXCR1 desempenha um papel importan- e. te na regulação e na sobrevivência do tronco normais e malignas epiteliais mamárias / popu- lações de células progenitoras. A capacidade de afetar a população de células em massa f através de um efeito de espetador mediado por FAS-ligante pode estar relacionado com o nível de expressão de FAS nestas células.

Efeitos do bloqueio CXCR1 sobre células-tronco cancerosas são mediadas pela via FAK/AKT/FOXO3A. CXCR1 age através de uma via de transdução de sinal que envolve a fosforilação da quinase de adesão focal (FAK), resultando na ativação da AKT (Waugh et al. Clin. Cancer Res. 14:6735-6741., aqui incorporado por referência, na sua totalidade). Para avaliar o impacto do bloqueio CXCR1 da ativação FAK e AKT o nível de FAK e proteínas —AKT fosforiladas foi medido por western blot para as três linhas de células diferentes. Para SUM159 e HCC1954, foi detectada uma diminuição de FA fosforilação de FAK Tyr**" e AKT Ser”? em células tratadas com repertaxina em comparação com células não tratadas, suge- rindo que os efeitos de repertaxina podem ser mediados pela via FAK / AKT (ver figuras. 21A e 22). A observação de que MDA-MB453 é resistente ao tratamento de repertaxina po- de ser explicado pela presença de uma mutação PTEN(919G> A), que ativa a via PISK/AKT (Hollestelle et a/. Mol. Cancer Res. 5:195-201., aqui incorporado por referência, na sua tota- lidade). Nenhuma modificação de fosforilação de FAK Tyr?" and AKT Ser"? foi detectado após o tratamento de repertaxina em linha celular MDAMB453 (ver FIG. 22). Para confirmar um papel funcional da via FAK / AKT na mediação dos efeitos do bloqueio CXCR1, duas construções virais foram utilizadas, um derrubando a expressão PTEN através de um PTEN ShRNA ea outra levando a superexpressão de FAK. PTEN, através da sua fosfatase lipídica antagoniza a sinalização PI3-K/AKT (Vivanco et al. Nat. Rev. Cancer 2:489-501., aqui in- corporado por referência, na sua totalidade). PTEN knockdown resultou na ativação de AKT, como demonstrado pelo aumento da fosforilação AKT Ser”? (ver figuras. 21A e 22). knock- down PTEN bloqueou o efeito do tratamento sobre repertaxina FAK e atividade de AKT. A superexpressão FAK também bloqueou os efeitos de repertaxina e induziu a ativação da FAKeAKT, medido pelo aumento da expressão de fosforilação de FAK Tyr**" e AKT Ser””*. Estes resultados indicam que os efeitos do bloqueio CXCR1 são mediados pela sinalização FAK / AKT.

O uso da marcação da imunofluorescência em células-CXCR1 positvo confirmou que os resultados do tratamento de repertaxina em uma diminuição dramática de expressão fosfo-FAK e fosfo-AKT em comparação com células não tratadas (ver FIG. 21B). AKT regula a atividade do fator de transcrição FOXO3A forkhead através de um evento de fosforilação . que resulta em sequestro de FOXO3A citoplasmática (Brunet et a/. Mol. Cell Biol. 21:952-

965., aqui incorporado por referência, na sua totalidade). Em contraste, a forma não fosfori- ” lada de FOXOB3A transita para o núcleo, onde atua como um fator de transcrição que regula asíntesedo FAS-igante (Jonsson et a/. Nat. Med. 11:666-671.), aqui incorporado por refe- fm rência, na sua totalidade). Repertaxina induz a morte celular através de um efeito de espe- tador emdiado por FAS-ligante; os efeitos de repertaxina nesta via de transdução de sinal 7 foram examinadas pela técnica de imunofluorescência. FOXO3SA esteve presente em uma localização citoplasmática em células não tratadas, mas empurrados para o núcleo após o tratamento repertaxina (ver FIG. 21B). Isso indica que o bloqueio CXCR1 induz atividade FOXOB3A através da inibição da via FAK / AKT. Células com supressão de PTEN ou a su- perexpressão FAK exibem um alto nível de FAK-fosfo e expressão fosfo-Akt, detectados por imunofluorescência, em ambas as células tratadas com repertaxina e não tratadas. O trata- mento de repertaxina não induziu a ativação de FOXO3A em células com supressão de PTEN Ou a superexpressão FAK, como mostrado pela localização citoplasmática de FOXOS3A (VER FIG. 21B). As a consequence of the constitutive activation of the FAK/AKT pathway, cells with PTEN deletion or FAK overexpression displayed resistance to repertaxina treatment. Células com a supressão PTEN ou a superexpressão FAK não exibem qualquer diminuição da viabi- lidade celular com o tratamento de repertaxin. Já foi proposto que a sinalização AKT de- sempenha um papel fundamental na biologia do CSC (ver figuras. 21B e 22) (Dubrovska et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 106:268-273., Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:21000121., Yil-

maz et al. Nature 441:475-482., aqui incorporados por referência em suas totalidades). À ativação da via FAK /AKT bloqueou os efeitos de repertaxina nas populações CSC, como mostra a manutenção das populações ALDELFUOR positivo após o tratamento com o inibi- dor (ver FIG. 21B). Todos os resultados indicam que o bloqueio CXCR1 afeta diretamente o caminho FAK/AKT/FOXO3SA. O tratamento de repertaxina inibe a sinalização AKT que é crucial para a atividade CSC e, posteriormente, induz um efeito espectador sobre o grosso das células tumorais mediadas por FAS-ligante gerado por CSC.

O tratamento de repertaxina reduz a população de câncer de mama de células- tronco in vivo. Evidências recentes sugerem que CSC de mama são relativamente resisten- tes à quimioterapia e à radiação e podem contribuir para o ressurgimento do tumor após a terapia (Phillips et a/. J Natl. Cancer Inst. 98:1777-1785. Yu et al. Cell 131:1109-1123,, Li et al. J Natl. Cancer Inst. 100:672-679., aqui incorporado por referência em sua totalidade). O conceito de CSC sugere que melhorias significativas na evolução clínica iriam exigir efetiva segmentação da população CSC (Reya et al. Nature 414:105-111.,aqui incorporado por re- ferência, na sua totalidade). Vários fatores são sintetizados e secretados durante o processo de apoptose das células tumorais em massa são orientados pela quimioterapia. Dentre es- . ses fatores, FAS-ligante amplifica os efeitos da quimioterapia mediando um efeito letal es- pectador (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79. aqui incorporada por referência em sua - totalidade). A quimioterapia também pode induzir a produção de IL-8 em células lesadas. O agente quimioterápico comumente utilizado, docetaxel, induziu IL-8 e mMRNA FAS-ligante CS nas células SUM159 (ver FIG. 10a/ B). Também foi detectado um aumento de 4 vezes dos níveis de MRNA para IL-8 após tratamento com o agonista FAS (ver FIG. 10B). Demonstra- 7 mos que IL-8 é capaz de regular a população CSC. Isso indica que a adição de repertaxina à quimioterapia citotóxica pode bloquear o efeito e ser direcionado para população de célula —troncode câncer.

A linha celular SUM159 e três xenoenxertos primários de mama humana gerados a partir de três pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) foram utilizados para explorar a eficiên- cia do tratamento de repertaxina no crescimento do tumor. As células destes tumores foram transplantadas para a pata ortotopicamente humanizada apurada de camundongos NOD / —SCID, sem cultivo in vitro . Para cada um destes xenotransplantes a população CSC foi ex- clusivamente contida na população ALDEFLUOR-positivo (Ginestier et a/. Cell Stem Cell 1:555-567., Charafe al-Jauffret al. Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporado por referên- cia em sua totalidade). Em cada um dos tumores, a população CXCR1-positivo foi quase exclusivamente contida nessa população ALDEFLUOR-positivo (ver Tabela 5) e a via PTEN /FAK/AKT é ativada (ver FIG. 25).

Tabela 5.

O ADEFLUOR — CXCR1Sobreposição CXCRI/ALDEFLUOR | (%) (%) e. Linhagens celulares de câncer de mama HCC1954 3.42 172 0.94 MDA-MB-453 422 os os SUMI159 524 0.52 0.48 Xenoenxertos de câncer de mama humano MC1 123 1.81 1.32 UM2 84 123 0.88 UM3 27 0.84 0.76

50.000 células de cada xenotransplante foram injetadas na pata ortotopicamente humanizada apurada de camundongos NOD / SCID e o crescimento tumoral controlado.

. Quando o tamanho do tumor for de aproximadamente quatro milímetros, o tratamento foi iniciado com apenas repertaxina (15mg/Kkg, duas vezes ao dia, durante 28 dias), apenas “ docetaxel (10mg/Kg, uma vez por semana, durante 4 semanas), ou uma combinação das duas drogas . O crescimento tumoral foi comparado a controles injetados de solução salina.

te Para cada xenotransplante, uma significativa inibição do crescimento tumoral induzido por tratamento com docetaxel ou a combinação de repertaxina / docetaxel foi observada (ver -10 figuras 26A e 27). O tratamento com apenas repertaxina teve um impacto moderado sobre o crescimento tumoral. Após quatro semanas de tratamento, os animais foram sacrificados e os tumores residuais foram analisados utilizando o teste ALDEFLUOR. Tumores residuais tratados com apenas docetaxel continham uma manutenção ou aumento de porcentagem de células ALDELFUOR-positivo em comparação aos controles (ver figuras 26B e 27). Em contraste, o tratamento de apenas repertaxina ou em combinação com docetaxel reduziu a população de ALDEFLUOR positivo em mais de 75% (ver as figuras 26B e 27). Os resulta- dos foram confirmados por imunoistoquímica de expressão ALDH1 em xenotransplantes diferentes. A diminuição de células ALDH1-positivo foi detectada em tumores tratados com repertaxina comparados aos tumores não tratados, enquanto que a porcentagem de células —ALDH1-positivo permaneceram inalteradas ou aumentadas em tumores tratados com doce- taxel (ver figuras 26D).

A presença de células CD44*/CD24' desses tumores foi avaliada. Marcadores a- presentaram previamente serem expressos em células-tronco de câncer de mama (Al Hajj et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 100:3983-3988., aqui incorporado por referência na sua to- talidade). A sobreposição entre o fenótipo CD44*/CD24' e a expressão CXCR1 foi medida.

Células CXCR1-positivo estavam presentes na população de células CD44+/CD24- e da população de células expressando CD24 ou CD44 negativo (ver Tabela 6). Tabela 6 O cn24/CDA4t — CXCR1 Sobreposição CD44-CD44+/CXCR1+ (%) (%) (%) Xenoenxertos de câncer de mama humano MC1 68 18 os UM2 37 12 o3 UM3 48 os 02 Nos tumores residuais tratados apenas com docetaxel, ou uma porcentagem inalte- rada ou aumentada de células CD44*/CD24 foi observada, visto que o tratamento com ape- nas repertaxina ou em combinação com docetaxel resultou em uma redução da população de células CD44*/CD24' (ver figura 28). Um ensaio funcional in vivo que consiste de reimplante de células de tumores trata- dos em camundongos NOD/SCID secundário forneceu um teste direto avaliando a iniciação “10 dotumore a capacidade de auto-renovação da CSC remanescente após o tratamento.

As células tumorais derivadas de animais controle ou tratados com docetaxel mostrou o recres- : cimento do tumor semelhante em todas as diluições de camundongos NOD/SCID secundá- rios.

Em contraste, o tratamento de repertaxina com ou sem docetaxel, reduziu o crescimen- “ to do tumor em pacientes secundários (ver FIG. 26C). Quando o mesmo número de células foram injetadas, os de animais tratados com repertaxina apresentaram uma redução de 2-5 É vezes no crescimento do tumor em comparação com células de animais controle ou tratados com docetaxel (ver FIG. 26C). Para cada modelo de xenotransplante, 1000 ou 100 mil célu- las tumorais provenientes de animais tratados com uma combinação de docetaxel e reperta- xina não formaram quaisquer tumores secundários em camundongos NOD / SCID (ver FIG. 26C,27e Tabela?7). Estes estudos demonstram que o tratamento de repertaxina especifi- camente é dirgido e reduz a população CSC.

Tabela 7

Tumores/injeções Números de células injetadas 1 500 2500 1,000 500 250 100 Controle 66 22 — E — - 6/8 Repertaxinal? aa 22 22 48 18 or [E Docetaxel 22 414 22 66 34 26 8/9 Repertaxina/docetaxel | 22 34 22 176 mn o [) O tratamento de repertaxina inibe a sinalização FAK/ AKT e ativa FOXO3SA in vivo. A expressão de fosfo-FAK e fosfo-Akt foi analisada por imunoistoquímica em cada um dos xenotransplantes após o tratamento. A expressão de fosfo-FAK membranosa foi detectada em 50% das células do controle e os tumores tratados com docetaxel enquanto que a ex- pressão fosfo-FAK foi abolida nos tumores tratados com apenas repertaxina ou em combi- nação com docetaxel (ver FIG. 26D). Resultados similares foram observados para a expres- são de fosfo-AKT, com 70% de células expressando AKT-fosfo nos tumores não tratados, ' 20% de células fosfo-AKT-positivo em tumores tratados com docetaxel e uma completa ini- . bição da expressão de fosfo-AKT nos tumores tratados com repertaxina sozinho ou em combinação com docetaxel (ver FIG. 26D). FOXO3A nuclear foi detectado nas células dos . tumores tratados com docetaxel, repertaxina sozinho, e a combinação de repertaxina / doce- ' taxel. Estes dados in vivo são consistentes com os dadis in vitro e confirmar que o tratamen- ' to de repertaxina inibe a sinalização de FAK / AKT e ativa FOXO3A.

O tratamento de repertaxina reduz o desenvolvimento de metástases sistêmicas. Para determinar se repertaxina reduz metástases sistêmicas, infectamos e linhas celulares de câncer da mama HCC1954, MDA-MB-453, e SUM159 com um sistema de repórter luci- ferase lentivírus e introduziu as células em camundongos NOD / SCID por injeção intracar- díaca. Uma suspensão de 250.000 células por cada linha celular foram injetadas e a forma- ção de metástases foi monitorada uma vez por semana pela imagem de bioluminescência. Doze horas após a injeção intracardíaca, os camundongos foram tratados duas vezes por dia por injecção repertaxina ou soro fisiológico para os controles. O tratamento de repertaxi- na em camundongos injetados com células HCC1954 e SUM159 e formação de metástase significativamente reduzida com menor emissão de fluxo de fótons no tratamento em com- paração com os camundongos não tratados (ver FIG. 29A/B). Seções histológicas confirma- rama presença de metástases em vários locais em animais não tratados (ver FIG. 29D). O tratamento de repertaxina não tem qualquer efeito sobre a formação de metástases em ca- mundongos injetados com células MDA-MB-453 (ver FIG. 29C). As emissões de fluxo de fótons e do número de animais que desenvolveram metástases foram semelhantes em am-

bos os grupos tratados com repertaxina e não tratados. Este resultado é consistente com dados que descrevem MDA-MB-453 como uma linhagem de células resistentes à repertaxi- na devido à presença de uma mutação de PTEN. Esses resultados indicam que o bloqueio CXCR1 com agentes como repertaxina pode ser capaz de reduzir a metástase, que é medi- ada pela população CSC (Charafe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorpo- rado por referência na sua totalidade).

Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção indicam que subcomponentes celulares com propriedades de células-tronco inici- am o crescimento do tumor e a metástase Visvader et al. Nat. Rev. Cancer 2:489-501., aqui incorporado por referência na sua totalidade). Em virtude da sua relativa resistência às atu- ais modalidades terapêuticas, essas células podem contribuir para a resistência ao trata- mento e relapso (Reya et al. Nature 414:105-111., aqui incorporado por referência na sua totalidade). A presente invenção proporciona uma abordagem baseada no bloqueio do re- ceptor de citocina CXCR1, que se expressa em células-tronco do câncer de mama, para ser eficazmente direcionado a população de células-tronco cancerosas e melhorar os resultados terapêuticos. Experimentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades da inven- . ção presente em uma série de sistemas têm demonstrado que as redes de citocinas de- sempenham um papel importante na tumorigênese. Há evidências de que várias dessas S citocinas podem regular o comportamento das células-tronco. IL-4 é capaz de regular a au- to-renovação das células-tronco do câncer de pâncreas e IL-6 de regulação células-tronco e” do câncer no câncer de cólon e de mama (Todaro et al. Cell Stem Cell 1:389-402., Sansone et al. J Clin. Invest 117:3988-4002., aqui incorporado por referência em sua totalidade). O 7 papel de IL-8 na mediação da invasão tumoral e metástase já foi demonstradi (Waugh & Wilson. Cancer Res. 14:6735-6741., Inoue et a/. Clin. Cancer Res. 6:2104-2119,, aqui incor- —porado por referência em sua totalidade). Além disso, IL-8 aumenta a auto-renovação de células-tronco neurais durante o processo cicatricial no cérebro (Beech et a/. J Neuroimmu- nol. 184:198-208., aqui incorporado por referência na sua totalidade). As células-tronco do câncer de pulmão foram descritas como expressando o receptor de quimiocina CXCR1 (Le- vina et al. PLoS. ONE. 3:e3077., aqui incorporado por referência na sua totalidade). Experi- mentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção de- monstraram que a população CXCR1 positivo é quase exclusivamente contida na população ALDEFLUOR positivo em linhas celulares de câncer de mama e xenoenxertos primários, bem como em células mamárias normais. O receptor de quimiocina é superexpresso em ALDEFLUOR positivo de mama na população de células de câncer (et al Charafe-Jauffret.

Cancer Res. 69:1302-1313., aqui incorporado por referência na sua totalidade). No câncer de mama, IL-8 é produzido no microambiente tumoral por um número de tipos de células, incluindo células inflamatórias, células do endotélio vascular, fibroblastos associados ao tu-

mor e as células-tronco mesenquimais (Waugh et a/. Clin.

Cancer Res. 14:6735-6741,, aqui incorporado por referência, na sua totalidade). As redes de citocinas mediam a interação entre estes dois tipos de células, portanto, células-tronco cancerosas podem ser direciona- das por meio do bloqueio do receptor da IL-8 CXCR1. Utilizando ensaios in vitro, foi demonstrado que CXCR1 mas não o bloqueio CXCR2 (uma alternativa receptor IL-8) reduziu a população de câncer de mama de células-tronco.

Isso foi seguido da indução de apoptose em toda população de células remanescente, que carece de expressão CXCR1. Além dos anticorpos bloqueadores CXCR1, experimentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades demonstram que repertaxin, um ini- bidor CXCR1 /2, induzido efeitos similares, orientando a população CXCR1 positivo.

Em contraste com seus efeitos diretos sobre a população de células-tronco de câncer expres- sando CXCR1, repertaxina não teve efeito direto sobre a população em massa de células tumorais que carece de expressão CXCR1. Isso indica que o bloqueio CXCR1 em células CXCR1 positivo induziu morte celular nas células CXCR1 negativa através de um efeito es- —pectador.

Os experimentos aqui descritos demonstram que o caminho FAS-ligante/FAS é o mediador deste efeito de morte de espectador.

Este fenômeno explica a eficácia do trata- - mento de repertaxina em induzir apoptose maciça na população de células inteiras apesar do fato de que a população CXCR1 positivo representar menos de 1% da população celular.

Fr O papel da FAS ligante foi demonstrada pelo efetivo bloqueio de transeunte matando pelo anticorpo anti-FAS-ligante.

SS Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção indicam que as interações de citocina semelhantes podem ocorrer em tumores 7 expostos a quimioterapia citotóxica.

A quimioterapia pode diretamente induzir a apoptose celular em células tumorais diferenciadas, bem como induzir a produção de FAS-ligante por estas células que morrem, que por sua vez, induzem apoptose em células tumorais vizinhas através de um efeito de espetador FAS mediada.

Concomitante com a produção de FAS- ligante, essas células lesadas também secretam o aumento dos níveis de IL-8-in um pro- cesso semelhante a involução mamária ou cicatrização de feridas.

Como é o caso na glân- dula mamária involutiva, esta IL-8 pode estimular as células-tronco do câncer de mama, — bem como protegê-las da apoptose.

Isso pode contribuir para o aumento relativo em células- tronco do câncer observadas após quimioterapia em modelos pré-clínicos (4) e ensaios clí- nicos neo-adjuvantes (5). Os efeitos da quimioterapia na apoptose e vias de auto-renovação em tumores são mostrados na Figura 30. Para determinar se o bloqueio CXCR1 poderia ter como alvo as células-tronco do —câncerde mama in vivo, os efeitos do docetaxel citotóxico foram comparados com reperta- xina sobre compartimentos de células tronco cancerígenas e sobre o crescimento tumoral em camundongos NOD / SCID.

O Docetaxel é um dos mais eficazes agentes quimioterápi-

cos usados atualmente para tratar mulheres com câncer de mama.

O câncer de populações de células foram avaliadas pelo ensaio ALDEFLUOR e transplante de série em camundon- gos NOD / SCID.

Utilizando estes ensaios, foi determinado que o tratamento com quimiote- rapia resultou em nenhuma mudança ou um aumento relativo do câncer de populações de células progenitoras.

Em contraste, o tratamento de apenas repertaxina ou com quimiotera- pia reduziu significativamente a população de células-tronco cancerosas.

Apesar da redução significativa nas populações de tumor inicial, o uso de repertaxina só não resultou em redu- ção significativa do tumor.

A combinação de repertaxina mais a quimioterapia resultou em uma redução significativa no tamanho do tumor, bem como na população de células tronco —cancerosas.

Combinando estes agentes para atingir tanto o câncer de células-tronco e uma população de células tumorais em massa maximiza a eficácia desses tratamentos.

Para elucidar o mecanismo de ação de repertaxin, os caminhos a jusante da CXCR1 foram analisados.

A interação entre CXCR1, FAK e AKT foi confirmada.

O bloqueio CXCR1 age especificamente através de FAK e ativação da AKT.

Experimentos realizados durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção indicam que a ativação de AKT regula células tronco normais e malignas da mama com células-tronco de auto- " renovação através da fosforilação de GSK3B resultando na ativação da via WNT (al Korkaya al.

PLoS Biolog. 7:21000121, aqui incorporado por referência na sua totalidade). Estes resul- " tados indicam por que as células com PTEN knockdown são resistentes a repertaxin.

Uma função adicional de AKT é a regulação da sobrevivência das células através da fosforilação E do fator de transcrição forkhead FOXOSA.

Fosforilação da AKT de FOXO3A resulta em seu sequestro citoplasmática.

Em contraste, foi demonstrado que o bloqueio CXCR1 leva a ati- ' vação de AKT, resultando em diminuição da translocação de FOXOSA no núcleo onde induz a um certo número de genes, incluindo FAS ligante (Jonsson et a/. Nat.

Med. 11:666-671.), —aquiincorporado por referência, na sua totalidade). FAS-ligante CXCR1 induzido através de bloqueio por sua vez é responsável pelos efeitos de eliminação observados (ver FIG. 30). Além de seu papel na sinalização de CXCR1, FAK medeia as interações das célu- las com componentes da matriz extracelular através de receptores de integrina (Waugh et al.

Clin.

Cancer Res. 14:6735-6741., aqui incorporado por referência, na sua totalidade). À sinalização FAK desempenha um papel na regulação do auto-renovação de células-tronco mamárias normais e malignas de camundongos em modelos transgênicos (Luo et a/. Cancer Res. 69:466-474., aqui incorporado por referência na sua totalidade). ativação de FAK tam- bém promove a sobrevivência da célula, bloqueando FADD e apoptose mediada por RIP (Kurenova et al.

Mol.

Cell Biol. 24:4361-4371. Xu et al.

J Biol.

Chem. 275:30597-30604., aqui incorporado por referência em sua totalidade). Isso fornece uma explicação para a resistên- cia da população de células-tronco cancerígenas para a apoptose induzida por FAS/ FAS- ligante.

Foi demonstrado que o câncer de mama de células-tronco desempenha um papel importante na invasão tumoral e metástase (Crocker et al. J Mol Cell. Med. 2008, Charafe- Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313,, aqui incorporado por referência em sua totalida- de). É mostrado aqui que IL-8 e CXCR1 também desempenham um papel importante nes- ses processos. Os efeitos do bloqueio CXCR1 foram analisados utilizando repertaxina sobre a formação de metástase experimental. Foi demonstrado que o bloqueio CXCR1 reduz o desenvolvimento da metástase, quando administrado após a injeção intracardíaca de célu- las de câncer de mama. Estudos clínicos utilizando repertaxina demonstraram uma falta de toxicidade. As estratégias que visam a interferir com loops de regulação de citocinas como a IL-8 e CXCR1 representam métodos para atingir o câncer de mama de células-tronco.

REFERÊNCIAS As seguintes referências são incorporadas neste documento como referência em suas totalidades, como se fossem totalmente apresentadas neste documento. L Hanaban D and Weinberg R A. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100; 57-70. : 2. Neve R M, Chin K, Fridlyand 5 et al. À collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes, Cancer Cell 2006; 10; 515-527. . . 3. Bonnet D and Dick J E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat.Med. 1997; 3: 730-737. é 4, Glinsky G V. Stem cell origin of death-from-cançer phenotypes of human prostate and breast cancers. Stem Cell Rev. 2007: 3: 79-93. i 5, Jaiswal S, Traver D, Miyamoto T, Akashi K, Lagasse E, and Weissman I L. Expression of BCR/ABL and BCI.-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2003; 100; 10002-10007.

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Claims (16)

, REIVINDICAÇÕES

1. Método de detecção de células tronco de tumor sólido, CARACTERIZADO pelo Ú fato de que compreende: a detecção de células tronco de tumor sólido CXCR1 + ou FBXO21 + a partir de uma amostra de tecido tomadas a partir de um tumor de um indivíduo.

| 5 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita detecção compreende colocar a dita amostra de tecido em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende Repertaxina.

4, Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma molécula de sinal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita molécula de sinal compreende uma molécula fluorescente ou uma enzima que pode catalisar uma reação de produção de cor na presença de um substrato colorimétrico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que nenhuma outra proteína ou ácido nucléico é analisado a fim de determinar a presença ou ausência das ditas células tronco de tumor sólido CXCR1 ou FBXO21+.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em: um tumor de câncer de próstata, um tumor de câncer de ovário, um tumor de câncer de mama, um melanoma, um tumor de câncer de pulmão de célula não-pequena, um tumor de câncer de pulmão de célula pe- quena e um tumor de adenocarcinoma esofagiano.

8. População isolada de células tronco de câncer, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste em: a) tumorigênica e b) CXCR1+ ou FBXO21+.

9. População isolada de células tronco de câncer, de acordo com a reivindicação 8, p CARACTERIZADA pelo fato de que as ditas células tronco de câncer consistem em células tronco de câncer selecionadas a partir do grupo que consiste em: células tronco de câncer ' 30 de próstata, células tronco de câncer de ovário, células tronco de câncer de mama, células tronco de câncer de pele, células tronco de câncer de pulmão de célula não-pequena, célu- las tronco de câncer de pulmão de célula pequena e células tronco de adenocarcinoma eso- fagiano.

10. População isolada de células tronco de câncer, de acordo com a reivindicação 8 CARACTERIZADA pelo fato de que a população compreende ao menos 60% de células tronco de câncer e menos do que 40% de células de tumor não-tumorigênicas.

11. População isolada de células tronco de câncer, de acordo com a reivindicação

. 2 à 8, CARACTERIZADA pelo fato de que as células tronco de câncer são enriquecidas ao me- nos ao dobro, comparado com as células de tumor não-tumorigênicas não-fracionadas.

]

12. População isolada de células tronco de câncer, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que as células tronco de câncer são enriquecidas ao me- i 5 nos quatro vezes, comparado com as células de tumor não-tumorigênicas não-fracionadas.

13. Uso de um composto, em que o composto consiste em um antagonista de CXCR 1 ou FBXO21, ou um antagonista de via de sinalização de IL8-CXCR1, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento de tumor.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto consiste em Repertaxina ou um derivado de Repertaxina.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antagonista de CXCR1 ou FBXO21, ou antagonista de via de sinalização de IL8- CXCR1 compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tumor compreende células tronco de câncer selecionadas a partir do grupo que consiste em: células tronco de câncer de próstata, células tronco de câncer de ovário, células tronco de câncer de mama, células tronco de câncer de pele, células tronco de câncer de pulmão de célula não-pequena, células tronco de câncer de pulmão de célula pequena e células —troncode adenocarcinoma esofagiano.