RS55784B1 - Anti-cxcr1 kompozicije i postupci - Google Patents

Anti-cxcr1 kompozicije i postupci

Info

Publication number
RS55784B1
RS55784B1 RS20170301A RSP20170301A RS55784B1 RS 55784 B1 RS55784 B1 RS 55784B1 RS 20170301 A RS20170301 A RS 20170301A RS P20170301 A RSP20170301 A RS P20170301A RS 55784 B1 RS55784 B1 RS 55784B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cxcr1
cancer
repertaxin
cell
Prior art date
Application number
RS20170301A
Other languages
English (en)
Inventor
Max S Wicha
Christophe Ginestier
Original Assignee
Univ Michigan Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Michigan Regents filed Critical Univ Michigan Regents
Publication of RS55784B1 publication Critical patent/RS55784B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5751—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7158—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

TZJAVA UVEZT SA ISTRAŽIVANJIMAILIRAZVOJEM KOJI IMAJU FEDERALNO FINANSIRANJE
[0001] Ovaj pronalazak je finansiran Vladinim subvencijama broj CA66233, CA101860 i 5 P 30 CA46592 koje su dodeljene Nacionalnom Institutu za zdravlje (NIH). Federalna vlada ima određena prava nad ovim pronalaskom.
OBLAST PRONALASKA
[0002J Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke u terapiji kancera, koji uključuje davanje inhibitora IL8-CXCR1 signalnog puta (na primer, nekog anti-CXCRl antitela ili Repertaksina) u kombinaciji sa nekim hemoterapeutskim agensom, čime se ubijaju ne-tumorogene i tumorogene ćelije kod tretiranog subjekta. Predmetni pronalazak takođe razmatra kompozicije i postupke za detekciju prisustva i izolovanje matičnih ćelija čvrstih tumora kod pacijenta (na primer, na osnovu prisustva CXCR1 iliFBX021).
OSNOVA PRONALASKA
[0003] Kancer je još uvek drugi na listi najčešćih uzroka smrtnosti u ovoj zemlji, sa preko 500 000 slučajeva godišnje. Uprkos napretku u dijagnostikovanju i terapiji, smrtnost od kancera i dalje je veoma visoka. Uprkos značajnom napretku u razumevanju molekulske osnove kancera, nova saznanja još uvek nisu translirana u efikasne terapeutske strategije.
[0004] Konkretno, kancer dojke je najčešći tip kancera kod žena u Americi, jer jedna od devet žena razvija ovu bolest tokom života. Nažalost, metastatski kancer dojke još uvek je neizlečiv. Većina žena sa metastatiskim kancerom dojke podlegne ovoj bolesti.
[0005] Konvencionalne terapije (radijaciona terapija, hemoterapija i hormonska terapija), iako korisne, ograničene su urgentnošću tretiranja kancerskih ćelija neosetljivih na tretman. Očigledno je da su potrebni novi pristupi u identifikaciji meta u tretiranju metastatskih kancera dojke i kancera uopšte.
[0006] Ginestier i sar., (99<th>AACR Annual Meeting , April 2008, Abstract#5004) izučavali su ulogu IL8/CXCR1 ose u regulaciji funkcije matičnih ćelija kancera dojke.
[0007]Pronalazak WO 2005/103711 odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline i na aminokiselinsku sekvencu humanog CXCR1 i na njegovu regulaciju u terapiji kardiovaskularnih poremećaja, gastrointestinalnih bolesti i bolesti jetre, metaboličkih bolesti, inflamatornih bolesti, hematoloških bolesti, respiratornih bolesti, neuroloških bolesti, uroloških bolesti, kancera i reproduktivnih bolesti u sisara.
[0008]Pronalazak US 2007/208074 obelodanjuje postupak za smanjenje rasta ili invazivnosti tumorskih ćelija, kao i agense koji smanjuju nivo ili aktivnost IL-8 ili IL-8 receptora.
[0009]Pronalazak WO 2008/036419 odnosi se na kompozicije i postupke za terapiju, karakterizaciju i dijagnostikovanje kancera i ALDH1 markera kancerskih matičnih ćelija.
SAŽETAK PRONALASKA
[0010]Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke u terapiji kancera, koji uključuju administraciju inhibitora IL8-CXCR1 signalnog puta (na primer, nekog anti-CXCRl antitela ili Repertaksina) i nekog dodatnog hemoterapeutskog agensa, tako da ovaj tretman dovodi do uništavanja ne-tumorogenih i tumorogenih ćelija kod subjekta. Predmetni pronalazak takođe razmatra kompozicije i postupke za dijagnostikovanje prisustva matičnih ćelija solidnih tumora kod pacijenta (na primer, na osnovu prisustva CXCR1 ili FBX021).
[0011]U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za tretiranje kancera administrirani em antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta i dodatnog hemoterapeutskog agensa. U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke namenjene smanjenju ili ueliminaciji matičnih ćelija kancera i ne-tumorogenih kancerskih ćelija koji uključuju: primenu repertaksina ili nekog njegovog derivata kod subjekta, u uslovima pod kojim je makar deo kancerskih ćelija već uništen. U drugim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke smanjenja broja ili eliminacije matičnih ćelija kancera i ne-tumorogenih kancerskih ćelija kod subjekta, koji uključuju: primenu antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta i dodatnog hemoterapeutskog agensa kod subjekta, pod uslovom da je jedan deo matičnih ćelija kancera već uništen, kompozicije ili komplete koji uključuju antagonistu IL8-CXCR1 signalnog puta i dodatni hemoterapeutski agens.
[0012]U nekim oblicima izvođenja, antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta uključuje neki agens koji specifično blokira vezivanje IL8 za CXCR1 receptor. U nekim oblicima izvođenja, agens se vezuje (specifičan je) za CXCR1 receptor, ali se ne vezuje za CXCR2 receptor. U nekim oblicima izvođenja, agens se vezuje za CXCR1 receptor. U konkretnim oblicima izvođenja, agens uključuje neko anti-CXCRl antitelo ili fragment tog antitela. U dodatnim oblicima izvođenja, agens uključuje Repertaksin ili neki njegov derivat. U narednim oblicima izvođenja, dodatni hemoterapeutski agens uključuje jedinjenje sa anti-mitotičkim delovanjem. U nekim oblicima izvođenja, jedinjenje sa anti-mitotičkim delovanjem izabrano je iz grupe koju čine: docetaksel, doksorubicin, paklitaksel, fluorouracil, vinkristin, vinblastin, nokodazol, kolhicin, podofilotoksin, steganacin i kombretastatin. U drugim oblicima izvođenja, anti-mitotičko jedinjenje je neki alkaloid kataraltusa (na primer, vinkristin i vinblastin); ili neki benzimidazol-karbamat, kao što je nokodazol; ili kolhicin ili druga srodna jedinjenja, kao što su podofilotoksin, steganacin ili kombretastatin; ili neki taksan, kao što je paklitaksel i docetaksel. U nekim oblicima izvođenja, dodatni hemoterapeutski agens je docetaksel.
[0013] U konretnim oblicima izvođenja, subjekt ima tip kancera koji, kada se tretira hemoterapeutikom, povećano proizvodi IL-8 (koji, na primer izaziva povećanje broja kancerskih matičnih ćelija). U nekim oblicima izvođenja, subjekt boluje od tipa kancera koji je izabran iz grupe koju čine: kancer prostate, ovarijalni kancer, kancer dojke, melanom, ne-sitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća i adenokarcinom jednjaka.
[0014] Predmetna aplikacija dalje opisuje postupak detekcije matičnih ćelija solidnih tumora, koji uključuje; a) obezbeđivanje i) uzorka koji je uzorkovan iz tumora subjekta, i ii) antitelo ili fragment antitela (ili nekog drugog vezujućeg molekula), koji je specifičan za CXCR1 protein ili FBX021 protein (ili neki drugi protein iz Tabele 1); i b) dovođenje u kontakt tog uzorka i antitela ili fragmenta antitela, pod uslovima koji omogućavaju da se detektuje prisustvo ili odsustvo CXCR1+ ili FBX021+ matičnih ćelija tumora.
[0015] Antitelo ili fragment antitela mogu se konjugovati sa signalnim molekulom. Signalni molekul može sadržati fluorescentni molekul. Signalni molekul može sadržati enzim koji katalizuje bojenu rekaciju u prisustvu obojenog supstrata. Ovaj postupak može dalje da obuhvati dovođenje u kontak uzorka sa sekundarnim antitelom ili fragmentom sekundarnog antitela. Sekundarno antitelo ili fragment sekundarnog antitela mogu sadržati signalni molekul. Konkretno, ne testira se ni jedan drugi protein ili nukleinska kiselina, kako bi se odredilo prisustvo ili odsustvo CXCR1 ili FBX021-pozitivnih matičnih ćelija tumora. Tumor je neki tumor iz grupe koji čine: tumor prostate, ovarijani kancer, tumor dojke, melanom, ne-sitnoćelijski kancerski tumor pluća, sitnoćelijski kancerski tumor pluća, i adenokarcinom jednjaka.
[0016]Predmetna prijava dalje opisuje postupke obogaćivanja populacije matičnih ćelija tumora, koji uključuje: a) disocijaciju solidnog tumora, kako bi se dobile disocirane ćelije; b) dovođenje u kontakt disociranih ćelija sa reagensom koji se vezuje za CXCR1 ili FBX021 (ili druge proteine prikazane u Tabeli 1); i c) selekciju ćelija koje se vezuju za reagens, tako da se dobije obogaćena populacija matičnih ćelija tumora.
[0017] U nekim slučajevima, ne primenjuju se dodatni reagensi u cilju dobijanja obogaćene populacije matičnih ćelija tumora. Tumor je izabran iz grupe koju čine: tumor prostate, ovarijalni kaner, tumor dojke, melanom, ne-sitnoćelijski kancerski tumor pluća, sitnoćelijski kancerski tumor pluća i adenokarcinom jednjaka. Reagens može biti neko antitelo ili fragment antitela (na primer, Fab fragment). Reagens se može konjugovati sa fluorohromom ili magnetnim česticama. U nekim slučajevima, ćelije se selekcionišu protočnom citometrijom, fluorescentno-aktiviranim sortiranjem ćelija, ispiranjem, afinitetnom hromatografijom ili magnetnom selekcijom. Predmetna prijava dalje opisuje obogaćenu populaciju matičnih ćelija tumora izolovanu postupkom koji je ovde opisan.
[0018] Opisane su izolovane populacije kancerskih matičnih ćelija koje su: a) tumorogene; i b) eksprimiraju CXCR1+ ili FBX021+. U nekim slučajevima, kancerske matične ćelije su kancerske matične ćelije izolovane iz grupe koju čine: matične ćelije kancera prostate, matične ćelije ovarijalnog kancera, matične ćelije kancera dojke, matične ćelije kancera kože, matične ćelije ne-sitnoćelijskog kancerskog tumora pluća, matične ćelije sitnoćelijskog kancerskog tumora pluća i matične ćelije adenokarcinoma jednjaka. U nekim slučajevima, populacija uključuje najmanje 60% kancerskih matičnih ćelija i manje od 40 % ne-tumorogenih tumorskih ćelija. Kancerske matične ćelije se mogu obogatiti najmanje dva puta u odnosu na nefrakcionisane ne-tumorogene tumorske ćelije (na primer, 2-puta, 3- puta, 4-puta, 5-puta,10-puta,... 100-puta,... 1000-puta).
[0019] U nekim slučajevima, predmetna prijava opisuje postupke dobijanja kompozicije tumorskih ćelija koja uključuje kancerske matične ćelije i ne-tumorogene tumorske ćelije, naznačeno time da je od tih ćelija najmanje 60% tumorogenih matičnih ćelija i 40 % ili manje ne-tumorogenih tumorskih ćelija, pri čemu postupak obuhvata: a) dobijanje disocirane smeše tumorskih ćelija iz tumora; b) razdvajanje smeše tumorskih ćelija u prvu frakciju, koja uključuje najmanje 60% kancerskih matičnih ćelija i 40 % ili manje ne-tumorogenih tumorskih ćelija i u drugu frakciju tumorskih ćelija u kojoj nema tumorskih matičnih ćelija, naznačeno time da se separacija odvija dovođenjem u kontakt smeše sa reagensom reaktivnim na CXCR1 ili FBX021; i c) demonstriranja tumorogenosti prve frakcije postupkom: i) serijskog ubrizgavanja u prvu životinju domaćina i demonstriranja daje druga frakcija ne-tumorogena, serijskim ubrizgavanjem u drugu životinju domaćina. U nekim oblicima izvođenja, separacija se obavlja protočnom citometrijom, fluorescentno-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS), ispiranjem, afinitetnom hromatografijom ili magnetnom selekcijom. U nekim oblicima izvođenja, separacija se odvija fluorescentno-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS).
[0020] Konkretno, postupci izbora tretmana pacijenta sa solidnim tumorom mogu da uključe: (a) uzimanje uzorka od pacijenta; (b) identifikovanja prisusva CXCR1+ ili FBX021+ matičnih ćelija solidnog tumora; i (c) selektovanja tretmana koji deluje na CXCR1+ ili FBX021+ matične ćelije solidnog tumora (na primer, izbor primene nekog anti-CXCRl antitela ili fragmenta antitela). Matične ćelije solidnog tumora koje eksprimiraju CXCR1+ ilir FBX021+ mogu biti kancerske matične ćelije izabrane iz grupe koju čine: matične ćelije kancera prostate, matične ćelije ovarijalnog kancera, matične ćelije kancera dojke, matične ćelije kancera kože, matične ćelije ne-sitnoćelijskog kancera pluća, matične ćelije sitnoćelijskog kancera pluća, i matične ćelije adenokarcinoma j ednj aka.
[0021] Predmetna prijava takođe opisuje postupke pretraživanja jedinjenja, koji se sastoje od: a) izlaganja uzorka koji uključuje CXCR1+ ili FBX021+ kancersku matičnu ćeliju, jedinjenju koje potencijalno ispoljava anti-neoplastično delovanje, naznačeno time da jedinjenje koje potencijalno ispoljava anti-neoplastično delovanje uključuje antagonistu CXCR1 ili FBX021 ili antagonistu IL8-CXCR1 signalnog puta; i b) detekcije promena u ćeliji koje nastaju usled izlaganja ćelije navedenom jedinjenju.
[0022] Uzorak može da obuhvati ne-adherentne mamosfere. Antagonist CXCR1 ili FBX021 ili antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta može da obuhvati antitelo ili fragment antitela. Antagonist CXCR1 može biti derivat Repartaksina. Detekcija može uključiti detekciju ćelijske smrti tumorogenih ćelija dojke. Postupak može dalje uključiti identifikovanje potencijalnog anti-neoplastičnog agensa koji se sposoban da uništi tumorogene ćelije kao i ne-tumorogene kancerske ćelije.
[0023] U nekim slučajevima, predmetna prijava opisuje postupke kojima se utvrđuje sposobnost testiranog jedinjenj a da inhibira tumorogenezu matičnih ćelija solidnog tumora, koji uključuju: a) dobijanje obogaćenih matičnih ćelija solidnog tumora, naznačeno time da su matične ćelije solidnog tumora: i) obogaćene najmanje dva puta u poređenju sa ne-frakcionisanim tumorskim ćelijama; i ii) da eksprimiraju CXCR1 ili FBX021; b) izlaganja prvog seta, ali ne i drugogo seta, matičnih ćelija solidnog tumora potencijalnom jedinjenju koje se testira; c) ubrizgavanja prvog seta matičnih ćelija solidnog tumora u prvu životinju-domaćina i ubrizgavanja drugog seta matičnih ćelija solidnog tumora u drugu životinju-domaćina; i d) upoređivanje tumora, ukoliko je prisutan, u prvoj životinji sa tumorom formiranim u drugoj životinji, kako bi se odredilo da li testirano jedinjenje inhibira formiranje tumora. Konkretno, testirano jedinjenje je neki inhibitor CXCR1 ili FBX021 ili je inhibitor IL8-CXCR1 signalnog puta.
[0024]Predmetna patentna prijava dalje opisuje postupke u cilju utvrđivanja sposobnosti testiranog jedinjenj a da inhibira tumorogenezu matičnih ćelija solidnog tumora, koji obuhvataju: a) uzimanje uzorka koji sadrži najmanje 60% matičnih ćelija solidnog tumora, naznačeno time da matične ćelije solidnog tumora eksprimiraju CXCR1 ili FBX021; b) ubrizgavanja matičnih ćelija solidnog tumora u prvu i drugu životinju-domaćina; c) tretiranja prve životinje-domaćina testiranim jedinjenjem, i netretiranje druge životinje-domaćina testiranim jedinjenje; i d) upoređivanje tumora, ukoliko je prisutan, u prvoj životinji sa tumorom koji je formiran u drugoj životinji, kako bi se odredilo da li testirano jedinjenje inhibira formiranje tumora. Testirano jedinjenje može biti inhibitior CXCR1 ili FBX021 ili inhibitor IL8-CXCR1 signalnog puta.
OPIS SLIKA
[0025]Slikal prikazuje ALDEFLUOR-pozitivnu populaciju ćelija iz ćelijskih linija kancera dojke (MDA-MB-453, SUM159) koje imaju kancerska svojstva. A-B, G-H. Prikaz reprezentativne protočno-citometrijske analize enzimske aktivnosti ALDH u MDA-MB-453 (A-B) i SUMI59 ćelijama (G-H). Test ALDEFLUOR je izveden kao što je opisano u Primeru 1, koji sledi. (C, T). ALDEFLUOR-pozitivna populacija ćelija sposobna daje da u NOD/SCID mišu generiše tumor koji reprodukuje fenotipsku heterogenost inicijalnog tumora. (F, L) Krive rasta tumora predstavljene su u funkciji broja ubrizganih ćelija (za MDA-MB-453: 50 000 ćelija, 5 000 ćelija i 500 ćelija i za SUMI59: 100 000 ćelija, 10 000 ćelija i 1 000 ćelija) i za svaku populaciju (ALDEFLUOR-pozitivne ALDEFLUOR-negativne, neseparisane). Kinetika rasta tumora korelira sa latencijom i veličinom formiranja tumora i brojem ALDEFLUOR- pozitivnih ćelija (F, L). (D, J) H&E bojenje ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija na injekcionom mestu pokazuje prisustvo tumorskih ćelija (D: Injekciono mesto MDA-MB-453 ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija i J: Injekciono mesto SUM59 ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija). (E, K) Injekciono mesto ALDEFLUOR-negativnih ćelija sadržalo je samo rezidualni Matrigel, apoptotične ćelije i ostatke mišjeg tkiva (E: Injekciono mesto MDA-MB-453 ALDEFLUOR-negativnih ćelija i K: Injekciono mesto SUM59 ALDEFLUOR-negativnih ćelija). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD. Slika 2 prikazuje klasifikaciju ALDEFLUOR-pozitivnih i ALDEFLUOR-negativnih populacija izolovanih iz ćelijskih linija tumora dojke na osnovu specifičnog potpisa ("signature") matičnih ćelija". Slika 2A. Hijerarhijsko grupisanje 16 uzoraka na osnovu ekspresije 413-signifikantnih gena. Podaci u svakom redu matriksa predstavljaju jedan gen, a svaka kolona predstavlja uzorak. Obratiti pažnju na separaciju ALDEFLUOR-pozitivnih (podvučena imena) i negativnih uzoraka (nepodvučena imena) sa 413 gena za 15 od 16 uzoraka. Neki geni koji su obuhvaćeni signaturom su označeni HUGO skraćenicama, koje se koristi u 'Entrez Gene' (Geni čija se ekspresija smanjuje u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama obeleženi su zeleno, a geni čija se ekspresija poveća u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama obeleženi su crveno). SI. 2B-C. Potvrda rezultata genske ekspresije izvršena u grupi od pet ćelijskih linija kancera dojke sortiranih u odnosu na ALDEFLUOR fenotip, izvršena je određivanjem ekspresije pet diskriminatornih gena pojačano eksprimiranih u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 i RAD51L1), primenom kvantitativnog RT-PCR. Nivoi ekspresije CXCR1 i FBX02 iRNK, određeni kvantitiativnim RT-PCR, predstavljeni su na ovoj slici. Nivoi genske ekspresije izmereni pomoću kvantitativnog RT-PCR potvrđuju rezultate dobijene DNK mikronizovima, koji ukazuju na povećanje nivoa CXCR1- i FBX021-iRNK u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama u odnosu na ALDEFLUOR-negativne populacije (p < 0.05). Slika 3 prikazuje ulogu IL8/CXCR1 ose u regulaciji matičnih ćelija kancera dojke. A. Ćelije koje eksprimiraju CXCR1 sadržane su u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji ćelija. ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne populacije iz četiti različite ćelijske linije tumora dojke (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453, BrCa-MZ-01) izolovane su FACS analizom, fiksirane su i analizirane su u vezi sa ekspresijom CXCR1 proteina, imunobojenjem i FACS analizom. ALDEFLUOR - pozitivne ćelije bile su visoko-obogaćene CXCR1 -pozitivnim ćelijama, u odnosu na ALDEFLUOR-negativne populacije. B. Efekat IL8 tretmana na formiranje tumorsfere u tri različite ćelijske linije (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453). Tretman IL8 povećao je formiranje primarnih i sekundarnih tumorosfera na dozno-zavisan način. C. Efekat IL8-tretmana na ALDEFLUOR-pozitivne populacije četiri različitie ćelijske linije koje su gajene u kulturi pri adherirajućim uslovima. U svakoj od četiri analizirane ćelijske linije, IL8 je povećao ALDEFLUOR-pozitivnu populaciju na dozno-zavisan način (<*>p < 0.05/<**>p < 0.01, statistički značajno u odnosu na kontrolnu grupu). Slika 4 prikazuje ALDEFLUOR-pozitivne ćelija koje ispoljavaju povećani metastatički potencijal. A. IL8/CXCR1 osa uključena je u invazivnost kancerskih matičnih ćelija. Uloga IL8/CXCR1 u invaziji procenjena je Matrigel invazionim testom, u prisustvu seruma ili IL8 kao atraktanata za tri različite ćelijske linije (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159). ALDEFLUOR-pozitivne ćelije ispoljile su 6 do 20-puta veću invazivnost od ALDEFLUOR-negativnih ćelija (p
< 0.01). Kada se IL8 (100 ng/ml) primeni kao atraktant, uočava se značajno povećanje ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija koje invadiraju kroz Matrigel u odnosu na ćelije kod kojih je serum primenjen kao atraktant (p < 0.05). Suprotno tome, IL8 nije imao uticaja na invazivni kapacitet ALDEFLUOR-negativne populacije. B-M. ALDEFLUOR-pozitivne populacije ispoljile su povećani metastatički potencijal. B-D. Kvantifikacija normalizovanog fluksa fotona izmerena u nedeljnim intervalima nakon inokulacije 100 000 ćelija inficiranih luciferazom u svakoj grupi (ALDEFLUOR-pozitivne, ALDEFLUOR-negativne, neseparisane). E-J. Detekcija metastaza primenom bioluminescentnog oslikavanja (E, G, I: Miševi okrenuti nadole; F, H, J: Miševi okrenuti nagore). Miševi inokulirani ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama razvili su nekoliko metastaza na različitim mestima (kost, mišić, pluća, meko tkivo) i imali su veću emisiju fotona od miševa inokuliranih neseparisanim ćelijama, koji su razvili maksimalno jednu metastazu po mišu. Suprotno tome, kod miševa inokuliranih ALDEFLUOR- negativnim ćelijama retko su uočene veoma male metastaze, koje su bile ograničene na limfne čvorove. K-M. Histološka potvrda, H&E bojenje, metastaze u kosti (K), mekom tkivu (L) i mišiću (M) koje su nastale usled injektovanja ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija.
Slika 5 prikazuje efekat inhibicije CXCR1 na vijabilnost tumorskih ćelija (Fig. 5A), kao i na vijabilnost kancerskih matičnih ćelija (Fig. 5B).
Slika 6 prikazuje da tretman Repertaksinom indukuje uzgredni ("bvstander") efekat posredovan FAS ligand/FAS signalizacijom i specifično prikazuje da je inhibicija rasta ćelija izazvana Repertaksinom, delimično umanjena dodavanjem antagoniste FAS, te da ćelije tretirane FAS agonistom ispoljavaju sličnu inhibiciju rasta ćelija kao i ćelije tretirane Repertaksinom.
Slika 7 prikazuje aktivaciju FAK, AKT i FOXOA3 bez tretmana Repertaksinom (7A) i u prisustvu Repertaksina (7B).
Slika 8 prikazuje efekat tretmana repertaksinom, docetakselom ili njihovom kombinacijom, na ćelijsku liniju kancera dojke (8A, SUMI59) i tri humana ksenografta kancera dojke izolovana iz različitih pacijenata (8B, MCI; 8C, UM2; i 8D, UM3).
Slika 9 prikazuje efekat tretmana repertaksinom, docetakselom ili njihovom kombinacijom na populaciju kancerskih matičnih ćelija, u ALDEFLUOR testu, na različitim ćelijskim linijama, uključujući SUMI59 (9A), MCI (9B), UM2 (9C), UM3 (9D).
Slika 10. prikazuje efekat Rrepertaksina, docetaksela ili kombinacije na serijska razblažanja primarnih tumora (10A. SUM159, 10B. MCI, 10C. UM2, 10D. UM3), koji su implantirani u masno tkivo dojke sekundarnih NOD-SCID miševa.
Slika 11. prikazuje da tretman repertaksinom redukuje metastatski potencijal SUMI59 ćelijske linije. Slika 11A prikazuje kvantifikaciju normalizovane emisije fotona izmerene u nedeljnim intervalima nakon inokulacije intrakardijačno injektovanim SUM 159 ćelijama. Formiranje metastaze je praćeno bioluminescentnim oslikavanjem (11B: Miševi tretirani fiziološkim rastvorom; 11C: Miševi tretirani repertaksinom).
Slika 12. prikazuje primere preklapanja ALDEFLUOR-pozitivne subpopulacije i CXCR1-pozitivne subpopulacije (gore) ili CXCR2-pozitivne subpopulacije (dole) SUMI59 ćelija. B-C. SUM159 ćelije su gajene u kulturi u adherentnim uslovima i tretirane su repertaksinom (100 nM) ili specifičnim blokirajućim antitelima selektivnim za CXCR1 (10 ug/ml) ili CXCR2 (10 |ng/ml). Nakon tri dana, uticaj tretmana na tumorske matične ćelije analiziranje u ALDEFLUOR testu; (B) ćelijska vijabilnost testirana je nakon pet dana, primenom MTT testa (C). Nakon tretmana repertaksinom ili anti-CXCRl antitelom uočeno je značajno smanjenje ALDEFLUOR-pozitivne populacije i ćelijske vijabilnosti. Suprotno tome, nije uočen značajan efekat u prisustvu anti-CXCR2 antitela. D. Četiri dana nakon tretmana, broj apoptotičnih ćelija je procenjen primenom TUNEL testom. Detektovano je 36% povećanja broja apoptotičnih ćelija (obojene zeleno) kod populacije tretirane repertaksinom u odnosu na kontolne ćelije koje su uglavnom bile vijabilne (obojene plavo). E-F. Da bi se utvrdilo da li je ćelijska smrt izazvana nekim sporednim efektom, CXCR1- pozitivne i CXCR1 -negativne populacije su sortirane protočnom citometrijom, nakon čega je svaka populacija tretirana različitim koncentracijama repertaksina (D). Dektovano je smanjenje vijabilnosti CXCR1-pozitivnih i nesortiranih populacija, a nije uočen efekat u populaciji CXCR1-negativnih ćelija (E). Dijaliziran kondicioni medijum (dCM) dobijen iz kulture CXCR1-pozitivnih ćelija tretiranih repertaksinom tokom tri dana, primenjen je u tretmanu sortiranih CXCR1 -pozitivnih, CXCR1-negativnih ili nesortiranih populacija. Primenjena su serijska razblaženja dijalizovanog kondicionog medijuma (Kontrola, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). Nakon dva dana tretmana, ispitana je ćelijska vijabilnost primenom MTT testa. Snažno smanjenje vijabilnosti ćelija uočeno je i u CXCR1-negativnim i u nesortiranim populacijama, a efekat nije uočen u CXCR1-pozitivnim populacijama (F).
Slika 13 prikazuje tumorogenost ALDEFLUOR-pozitivnih/CXCRl-pozitivnih i ALDEFLUOR-pozitivnih/CXCRl- negativnih populacija ćelija iz SUM159 ćelijske linije. A. Krive rasta tumora prikazane su u zavisnosti od broja ubrizganih ćelija (50 000 ćelija, 5 000 ćelija, 1 000 ćelija i 500 ćelija) i za svaku populaciju (ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-pozitivne, ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-negativne). Obe ćelijske populacije su generisale tumore. Kinetika rasta tumora korelira sa latencijom i veličinom formiranja tumora i brojem ubrizganih ćelija. B-C. Tumori koje su genereisale ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-pozitivne populacije ispoljili su fenotipsku heterogenost inicijalnog tumora nakon serijskih pasažiranja, dok je ALDEFLUOR-pozitivna/CXCRl-negativna populacija proizvela tumore koji su sadržali samo ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-negativne ćelije. Transplantirali smo obe ćelijske populacije iz tri pasaža. Slika 14. Prikazuje efekat blokade CXCR1 na formiranje tumorsfere. SUM159 i HCC1954 ćelije su zasejane pri adherentnim uslovima i tretirane su tri dana repertaksinom (100 nM), anti-CXCR1 blokirajućim antitelom (10lug/ml) ili anti-CXCR2 blokirajućim antitelom (10 u^/ml). Nakon tri dana tretmana, ćelije se odlepljene i kultivisane u suspenziji. Određen je broj tumorsfera formiranih nakon 5 dana u kulturi. Slični rezultati uočeni su za obe ćelijske linije, sa značajnim smanjenjem formiranja primarnih i sekundarnih tumorsfera u uslovima tretmana repertaksinom i anti-CXCRl-antitelom u poređenju sa kontrolom. Suprotno tome, anti-CXCR2 blokirajuće antitelo nije ostvarilo uticaj na formiranje tumorosfera.
Slika 15. prikazuje efekat tretmana repertaksinom na vijabilnost ćelija SUM159, HCC1954 i MDA-MB-453 ćelijskih linija. Tri različitie ćelijske linije (SUM159, HCC1954, MDA-MB-453) kultivisane su u adherentnim uslovima i tretirane su repertaksinom (100 nM). Ćelijska vijabilnost procenjena je nakon jednog, tri i pet dana, primenom MTT testa. Uočeno je smanjenje ćelijske vijabilnosti nakon 3 dana tretmana u SUM159 i HCC1954 ćelijskoj liniji. Međutim, repertaksin nije uticao na vijabilnost MDA-MB 453 ćelija.
Slikal6. prikazuje efekat blokade CXCR1 na ALDEFLUOR-pozitivne populacije in vitro. A-B. HCC1954 (A) i MDA-MB-453 (B) ćelije su zasejane u kulturi u adherentnim uslovima i tretirane su repertaksinom (100 nM) ili specifičnim blokirajućim antitelima na CXCR1 (10 |ig/ml) ili CXCR2 (10 ug/ml). Nakon tri dana, efekat na populaciju kancerskih matičnih ćelija analiziranje pomoću ALDEFLUOR testa. U HCC1954 liniji uočeno je značajno smanjenje ALDEFLUOR-pozitivnih populacija i vijabilnosti ćelija nakon tretmana repertaksinom ili anti-CXCRl antitelom. Suprotno time, nije uočen značajan efekat sa anti-CXCR2 antitelom (A). U MDA-MB-453 liniji, nije uočen nikakav uticaj na ALDEFLUOR-pozitivne populacije (B).
Slika 17 prikazuje da tretman repertaksinom izaziva uzgredan ("bvstander") efekat posredovan signalizacijom preko FAS/FAS-liganda. A. Da bi se odredilo da lije sporedan citotoksičan efekat indukovan tretmanom repertaksinom, posredovan FAS-ligandom, izmeren je nivo solubilnog FAS-liganda u medijumu, primenom ELISA testa. Nakon 4 dana tretmana, nivo solubilnog FAS-liganda u medijumu ćelija tretiranih repertaksinom bio je više od 4 puta veći u odnosu na nivo u ne-tretiranim kontrolama. B. Nivo iRNK- FAS liganda određen RT-PCR, potvrdio je povećanje produkcije FAS-liganda nakon tretmana repertaksinom. Slični rezultati uočeni su nakon 4 dana tretmana FAS agonistom, koji aktivira FAS signalizaciju, sa povećanjem nivoa iRNK FAS-liganda od pet puta u odnosu na kontrolu. C. SUM159 ćelije su kultivisane u adherentnim uslovima i tretirane su samo repertaksinom ili zajedno sa FAS-ligandom. Inhibicija rasta ćelija indukovana tretmanom Repertaksinom delimično je sprečena dodavanjem anti-FAS-Liganda. Ćelije tretirane agonistom FAS ispoljile su sličan nivo inhibicije ćelijskog rasta kao i ćelije tretirane samo repertaksinom. D-E. Analiziran je efekat repertaksina, samog ili u kombinaciji sa anti-F AS-Ugandom i tretman FAS-agonistom na CXCR1-pozitivne i ALDEFLUOR-pozitivne populacije. Značajno smanjenje CXCR1-pozitivne i ALDEFLUOR-pozitivne populacije indukovano tretmanom repertaksinom nije sprečeno anti-F AS-Ugandom, a tretman FAS-agonistom proizveo je povećanje procenta CXCR1-pozitivnih i ALDEFLUOR-pozitivnih populacija od 10, odnosno 3 puta.
Slika 18. Prikazuje efekat FAS agoniste na CXCR1-pozitivne i CXCR1 -negativne ćelije. CXCR1-pozitivne i CXCR1-negativne populacije su sortirane protočnom citometrijom i svaka populacija je tretirana različitim koncentracijama FAS agoniste. Uočeno je smanjenje vijabilnosti CXCR1-negativnih i nesortiranih populacija, a nije uočen efekat u populaciji CXCR1-pozitivnih ćelija.
Slika 19. Prikazuje analizu ekspresije CXCR1 proteina u normalnim matičnim /progenitorskim ćelijama dojke i efekat IL-8 tretmana na formiranje mamosfere. A. ALDEFLUOR-pozitivne i - negativne populacije iz normalnih epitelnih ćelija dojke izolovane su iz mamoplasta, analizirane FACS-om, fiksirane su i analizirane su na ekspresiju CXCR1 proteina, pomoću immunobojenja i FACS analize. ALDEFLUOR-pozitivne ćelije su veoma obogaćene CXCR1-pozitivnim ćelijama u poređenju sa ALDEFLUOR-negativnom populacijom. B-C. Efekat IL8 tretmana na formiranje mamosfere. IL8 tretman povećava formiranje primarnih (B) i sekundarnih mamosfera (C) na dozno-zavisan način.
Slika 20 prikazuje uticaj tretmana repertaksinom na normalne epitelne ćelije dojke. Normalne epitelne ćelije dojke izolovane iz redukcionog mamoplasta, kultivisane su u adherentnim uslovima i tretirane su reperaksinom (100 nM ili 500 nM) ili agonistom FAS (500 ng/ml). Nakon petodnevnog tretmana, vijabilnost ćelija je procenjena MTT testom. Tretman repertaksinom ili agonistom FAS nije uticao na vijabilnost normalnih epitelnih ćelija dojke, čak i kada su primenjene visoke koncentracije repertaksina (500 nM). B. Nivoi solubilnog FAS-liganda određeni su primenom ELISA testa, u medijumu kulture normalnih epitelnih ćelija dojke koje su tretirane repertaksinom. Nakon četvorodnevnog tretmana solubilni FAS-ligand detektovan je u medijumu tretiranih ćelija. C. Analiza ekspresije FAS/CD95 u normalnim epitelnim ćelijama dojke, pomoću FACS analize. Nije detektovana ekspresije FAS/CD95 u kulturi normalnih epitelnih ćelija dojke, koje su gajene u adherentnim uslovima. D. Efekat tretmana repertaksinom na formiranje mamosfera. Normalne epitelne ćelije dojke su kultivisane u adherentnim uslovima i tretirane su repertaksinom tokom četiri, osam, jedanaest ili petnaest dana (100 nM). Nakon tretmana repertaksinom, ćelije su odlepljene u kultivisane u suspenziji. Značajno smanjenje ćelija koje iniciraju formiranje mamosfera A uočeno je u uslovima tretmana repertaksinom.
Slika 21 prikazuje efekat repertaksina na aktivaciju FAK, AKT i FOX03a. Efekat tretmana repertaksinom na nishodnu signalizaciju CXCR1, procenjen je primenom dva različita viralna konstrukta, jednog koji onesposobljava ekspresiju PTEN posredstvom PTEN-siRNA i drugog koji dovodi do povećane ekspresije FAK (Ad-FAK). A. SUM159 kontrola, SUM159 PTEN-siRNA i SUMI 59 Ad-FAK ćelije kultivisane su u adherentnim uslovima tokom dva dana u odsusutvu ili prisustvu 100 nM repertaksina, a aktivacija FAK/AKT puta je procenjena primenom imunoblotinga (western bloting). Tretman repertaksinom doveo je do smanjenja fosforilacije na FAK Tyr397 i AKT Ser473 pozicijama, dok su delecija PTEN i povećana ekspresija FAK blokirale efekat tretmana repertaksinom na FAK i AKT aktivnost. B. Primenom imunofluorescentnog bojenja CXCR1-pozitivnih ćelija, potvrdili smo da tretman repertaksinom dovodi do nestanka ekspresije fosfo-FAK (membransko bojenje crvenom fluorescencijom) i fosfo-AKT (citoplazmatsko bojenje crvenom fluorescencijom). Imunofluoresecentno bojenje anti-FOX03A pokazalo je citoplazmatsku lokalizaciju FOX03a (crveno) u netretiranim ćelijama, dok je tretman repertaksinom izazvao premeštanje FOX03A u jedro. Suprotno tome, ćelije sa deletiranim PTEN ili povećanom ekspresijom FAK ispoljile su visok nivo ekspresije fosfo-FAK, fosfo-AKT i citoplazmatske FOX03A, kako u ćelijama koje su tretirane, tako i u ćelijama koje nisu tretirane repertaksinom. U svim uzorcima, jedra su kontrastno obojena DAPI bojom (plavo). C-D. Efekat repertaksina na vijabilnost SUM 159 PTEN-siRNA i SUMI59 Ad-FAK ćelija i na populaciju kancerskih matičnih ćelija procenjena je pomoću MTT, odnosno, ALDEFLUOR testa. Nakon tri dana tretmana, ćelije sa delecijom PTEN ili povećanom ekspresijom FAK, razvile su rezistenciju na repertaksin (C). Tretman repertaksinom nije promenio proporciju ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija sa onesposobljenim SUM159 PTEN. (D).
Slika 22 prikazuje efekat tretmana repertaksinom na aktivaciju FAK/AKT u HCC1954 i MDA-MB-453 ćelijskim linijama. Efekat repertaksina na nishodnu signalizaciju CXCR1 procenjen je primenom lentiviralne konstrukcije koja je onesposobila ekspresiju PTEN, posredstvom PTEN-siRNA A. Ćelije HCC1954 kontrole i HCC1954 PTEN-siRNA kultivisane su u adherentnim uslovima tokom dva dana u odsustvu ili prisustvu 100 nM repertaksina, a aktivacija FAK/AKT puta procenjena je imunoblotingom. Tretman repertaksinom doveo je do smanjenja fosforilacije na FAK Tyr397 i AKT Ser473 pozicijama, dok je delecija PTEN blokirala efekat tretmana repertaksinom na FAK i AKT aktivnost. B. Tretman repertaksinom nije uticao na vijabilnost ćelija MDA-MB-453 ćelijske linije koje nose PTEN mutaciju. Primenom imunoblot analize dokazano je da FAK/AKT put nije poremećen tretmanom repertaksinom.
Slika 23 prikazuje efekat repertaksina na vijabilnost HCC1954 PTEN-siRNA ćelija, u MTT testu. Nakon tri dana tretmana, ćelije sa PTEN delecijom razvile su rezistenciju na repertaksin.
Slika 24 prikazuje ekspresiju FAS-liganda i IL-8 iRNK, nakon tretmana docetakselom ili repertaksinom, izmerene kvantitativnim RT-PCR. A-B. SUMI 59 ćelije kultivisane u adherentnim uslovima tretirane su repertaksinom (100 nM), agonostom FAS (500 ng/ml) ili docetakselom (10 nM). Nakon tri dana tretmana ćelije su prikupljene i ekstrahovana je RNK. Docetaksel je indukovao i ekspresiju iRNK za FAS-ligand (A) i za IL-8 (B) u SUM159 ćelijama. Detektovano je četvorostruko povećanje nivoa IL-8 iRNK nakon tretmana agonistom FAS ili docetakselom (B).
Slika 25 prikazuje procenu aktivacije PTEN/FAK/AKT u tri različita ksenografta tumora dojke. Imunoblot analiza je pokazala da su oba ksenografta ispoljila ekspresiju PTEN i aktivaciju FAK/AKT puta, kao što je prikazano na osnovu fosforilacije FAK Tyr397 i AKT Ser473 ostataka.
Slika 26 prikazuje efekat tretmana repertaksinom na populaciju matičnih ćelija kancera dojke in vivo. A-C. Efekat repertaksina na rast tumora i na populaciju kancerskih matičnih ćelija in vivo procenjen je na ćelijskoj liniji kancera dojke (SUM 159) i na tri ksenografta humanog kancera dojke izolovana od različitih pacijenata (MCI, UM2, UM3). A. Od svakog uzorka injektovano je 50 000 ćelija u humanizovano masno tkivo dojke NOD/SCID miševa, nakon čega je praćena promena veličine tumora. Kada su tumori dostigli oko 4 mm, ubrizgana je s.c. injekcija repertaksina (15 mg/Kg) dva puta dnevno tokom 28 dana ili jednom nedeljno LP. injekcija docetaksela (10 mg/Kg) ili kombinacija (repertaksina/docetaksela). Grafik prikazuje veličinu tumora pre i tokom svakog pomenutog tretmana (strelica, početak tretmana). Slični rezultati su uočeni kod svih uzoraka, sa statistički značajnim smanjenjem veličine tumora kod tumora tretiranih samo docetakselom ili kombinacijom repertaksin/docetaksel u odnosu na kontrole, a nije utvrđena razlika u rastu kontrolnog tumora i tumora tretiranih samo repertaksinom. B- C. Procena repertaksina, docetaksela, ili kombinovanog tretmana na populacije kancerskih matičnih ćelija izvršena je ALDEFLUOR testom (B) i reinplantacijom u drugog miša. (C). Tumorski ksenografti tretirani docetakselom pokazali su sličan ili veći procenat ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija u odnosu na kontrolu, dok je tretman repertaksinom samim ili u kombinaciji sa docetakselom proizveo statistički značajno smanjenje ALDEFLUOR- pozitivnih ćelija, sa 65% do 85% smanjenja populacije kancerskih matičnih ćelija u poređenju sa kontrolom (p < 0.01) (B). Serijska razblaženja ćelija dobijenih iz primarnih tumora, netretiranih (kontrola) i tretiranih miševa implantirana su u masno tkivo dojke sekundarnih NOD/SCID miševa koji nisu primili nikakav dalji tretman. Kontrolni i docetakselom tretirani primarni tumori formirali su sekundarne tumore pri svim razblaženjima, dok je iz primarnih tumora tretiranih repertaksinom ili kombinacijom sa docetakselom, sekundarne tumore mogla da formira samo inokulacija najvećeg broja ćelija. Dalje, rast tumora bio je značajno odložen i tumori su bili značajno manji od onih razvijenih kod kontrola ili tretiranih docetakselom (C). D. Ksenotransplantati iz svake grupe su prikupljeni i imunohemijski obojeni kako bi se deetktovala ekspresija fosfo-FAK, fosfo-AKT, FOX03A i ALDH1. Membranska ekspresija fosfo-FAK i citoplazmatska ekspresija fosfo-AKT (strelia) detektovana je u kontroli i kod docetakselom-tretiranih tumora, a ekspresija nije detektovana u tumorima koji su tretirani repertaksinom ili kombinacijom repertaksina i docetaksela. Jedarna ekspresija FOX03A (braon) detektovana je u ćelijama koje su tretirane docetakselom ili repertaksinom pojedinačno ili u kombinaciji. Detektovano je smanjenje ekspresije ALDH1 (strelica) u tumorima koji su tretirani repertaksinom samim ili u kombinaciji sa u odnosu na kontrolu i kod tumora tretiranih docetakselom.
Slika 27 prikazuje efekat tretmana repertaksinom na populaciju matičnih ćelija kancera dojke in vivo. A-C. Efekat tretmana repertaksinom na rast tumora i na populaciju matičnih kancerskih ćelija in vivo, ispitan je na ćelijskoj liniji kancera dojke (SUM 159, A) i na tri humana ksenografta kancera dojke dobijena od različitih pacijenata. Od svakog uzorka injektovano je po 50 000 ćelija u humanizovano masno tkivo NOD/SCID miša, nakon čega je praćena veličina tumora. Kada su tumori dostigli veličinu od oko 4 mm, injektovan je repertaksin (15 mg/Kg) dva puta na dan, tokom 28 dana ili je LP. injektovan docetaksel (10 mg/Kg) ili je data kombinacija (repertaksin/docetaksel). Grafik prikazuje veličinu tumora pre i tokom svakog od pomenutih tretmana (strelica, početak tretmana). Za sve uzorke su dobijeni slični rezultati, sa statistički značajnim smamnjenjem veličine tumora u grupama tretiranim docetakselom ili kombinacijom repertaksin/docetaksel u odnosu na kontrolu, a nisu uočene značajne razlike u rastu između kontrolnih tumora i tumora tretiranih samo repertaksinom. Procena uticaja repertaksina, docetaksela, ili kombinovanog tretmana populacije kancerskih matičnih ćelija izvedena je primenom ALDEFLUOR testa i reimplantacijom u sekundarnog miša. Docetaksel-tretirani ksenografti tumora ispoljili su sličan ili veći procenat ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolom, dok je tretman samo repertaksinom ili kombinacijom sa docetakselom proizveo statistički značajno smanjenje ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija, sa 65% do 85% smanjenja kancerskih matičnih ćelija u poređenju sa kontrolom (p < 0.01). Serijska razblaženja ćelija dobij ena iz primarnih tumora, netretiranih (kontrola) i tretiranih miševa implantirana su u masno tkivo sekundarnih NOD/SCTD miševa, koji nisu primili nikakav dalji tretman. Kontrolni primarni tumori i primarni tumori tretirani docetakselom formirali su sekundarne tumore pri svim razblaženjima, dok su samo visoke koncentracije ćelija iz primarnih tumora tretiranih repertaksinom ili kombinacijom sa docetakselom bile sposobne da formiraju tumor. Rast tumora je značajno odložen, a nastali tumori su bili značajno manje veličine u poređenju sa kontrolnim tumorima ili tumorima tretiranim docetakselom.
Slika 28 prikazuje efekat tretmana repertaksinom na populaciju matičnih ćelija tumora dojke, procenjen na osnovu CD44+/CD24- fenotipa. A-B. Uticaj tretmana repertaksinom, docetakselom ili njihovom kombinacijom na populaciju kancerskih matičnih ćelija procenjen je na osnovu prisustva CD44+/CD24- ćelija. Kod rezidualnih tumora tretiranih samo docetakselom, dosledno smo uočavali ili nepromenjen ili uvećan procenat CD44+/CD24- ćelija, dok je tretman repertaksinom, samostalno ili u kombinaciji sa docetakselom doveo do smanjenja brojnosti CD44+/CD24- ćelijske populacije. A. Predstavljen je dijagram toka za UM3 ksenograft. B. Slični rezultati uočeni su kod MCI, UM2 i UM3. Gotovo sve SUM 159 ćelije su CD44+/CD24-u uslovima tretmana.
Slika 29 prikazuje da tretman repertaksinom smanjuje razvoj sistemskih metastaza. Efekat repertaksina na formiranje metastaza procenjen je na ćelijskim linijama tumora dojke HCC1954
(A), SUM159 (B), MDA-MB-453 (C), koje su inficirane lentivirusom koji eksprimira luciferazu, nakon čega je 250 000 ćelija inficiranih luciferazom inokulirano u NOD/SCID miševe
posredstvom intrakardijalne injekcije. Dvanaest sati nakon ove intrakardijalne injekcije, miševi su primili s.c. injekciju fiziološkog rastvora ili s.c. injekciju repertaksina (15 mg/kg), dva puta dnevno tokom 28 dana. Formiranje metastaza je praćeno primenom bioluminescentnog oslikavanja. Kvantifikacija normalizovanog fluksa protona izmerena u nedeljnim intervalima nakon inokulacije, pokazala je statistički značajno smanjenje formiranje metastaza kod miševa tretiranih repertaksinom u odnosu kontrole tretirane fiziološkim rastvorom, za miševe inokulisane HCC1954 ili SUM159 ćelijama (A-B). Suprotno ovome, tretman repertaksinom nije imao uticaja na formiranje metastaza kod miševa sa injektovanim MDA-MB-453 ćelijama. (C). Histološka potvrda, bojenjem hematoksilinom&eozinom, metastaza u kostima i mekim tkivima, koje su nastale kod miševa koji nisu tretirani repertaksinom (D).
Slika 30 prikazuje IL-8/CXCRl signalizaciju u kancerskim matičnim ćelijama tretiranim hemoterapijom samostalno ili u kombinaciji sa repertaksinom. A. Predstavljanje potencijalne signalizacije TL-8/CXCRl u kancerskim matičnim ćelijama. Aktivacija CXCR1 nakon vezivanja IL-8 indukuje fosforilaciju fokalne adhezione kinaze (Focal Adhesion Kinase - FAK). Aktivna FAK fosforiliše AKT i aktivira WNT put, koji reguliše samoobnavljanje matičnih ćelija i FOX03A koji reguliše preživljavanje ćelija. Aktivacija FAK štiti kancerske matične ćelije od efekta posredovanog FAS-ligand/FAS, inhibicijom FADD, i nishodnom efektorskom FAS signalizacijom. U prisustvu hemoterapeutika, glavnina tumorskih ćelija je osetljiva na taj tretman i otpušta visok nivo proteina IL-8 i FAS-liganda tokom procesa apoptoze. Kancerske ćelije tumora dojke su stimulisane IL-8- posredovanim efektom i rezistentne su na ovaj destruktivni uticaj zahvaljujući FAS-ligandu. B. Tretman repertaksinom blokira IL-8/CXCRl signalizaciju i inhibira samoobnavljanje i preživljavanje matičnih ćelija kancera dojke. Kada se tretman repertaksinom kombinuje sa hemoterapijom, kancerske matične ćelije su senzitizirane destruktivnim efektom posredovanim FAS-ligandom.
DEFINICIJE
[0026]Sledi opis brojnih termina i izraza koji teba da olakšaju razumevanje predmetnog pronalaska: U značenju koje je ovde primenjeno, izrazi "antikancerski agens," "konvencionalni antikancerski agens" ili "kancerski terapeutski lek" odnose se na sve terapeutske agense (na primer, hemoterapeutska jedinjenja i/ili molekulska terapeutska jedinjenja), radijacionu terapiju ili hirurške intervencije, koje se koriste u tretmanu kancera (na primer, kod sisara).
[0027]U značenju koje je ovde primenjeno, termini "lek" i "hemoterapeutski agens" odnose se na farmakološki aktivne molekule koji se koriste u dijagnostikovanju, tretiranju ili prevenciji bolesti ili patoloških stanja u fiziološkim sistemima( na primer,subjekt iliin vivo, in vitroiliex vivoćelije, tkiva i organi). Lekovi deluju tako što menjaju fiziološki proces nekog živog organizma, tkiva, ćelije iliin vitrosistema kod kojeg se administriraju. Termini "lek" i "hemoterapeutski agens" treba da obuhvate anti-hiperproliferativna i anti-neoplastična jedinjenja, kao i ostala biološka terapeutska jedinjenja.
[0028]"Efektivna količina" je količina dovoljna da dovede do povoljnih ili željenih rezultata. Efektivna količina može se administrirati u jednoj ili više primena.
[0029]U značenju koje je ovde primenjeno, termin "administracija" odnosi se na akt davanja leka, proleka, antitela ili nekog drugog agensa ili terapeutskog tretmana nekom fiziološkom sistemu (na primer, subjektu iliin vivo, in vitroiliex vivoćelijama tkivima i organima). Ilustrativni primeri ruta administracije u organima čoveka mogu biti kroz oči (oftalmička), usta (oralna), kožu (transdermalna), nos (nazalna), pluća (inhalatorna), oralnu mukozu (bukalna), uši,, putem injekcija( na primer,intravenski, subkutano, intratumorski, intraperitonealno,i td.)i slično.
[0030] "Ko-administracija" se odnosi na administraciju više od jednog hemijskog agensa ili terapeutskog tretmana{ na primer,radijaciona terapija) nekom fiziološkom sistemu( naprimer,a subjektu iliin vivo, in vitro,iliex vivoćelijama, tkivima i organima). "Ko-administracija" odgovarajućih hemijskih agenasa (na primer, antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta i dodatnog hemoterapeutika) može biti istovremena, ili bilo kojim vremenskim redosledom ili u fizičkoj kombinaciji.
[0031] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "regresija" odnosi se na prelazak bolesne osobe, ćelije, tkiva ili organa u nepatološko ili manje patološko stanje u odnosu na osnovnog nepatološkog pojedinca, ćeliju, tkivo ili organ. Na primer, regresija tumora obuhvata smanjenje mase tumora kao i kompletan nestanak jednog ili više tumora.
[0032] U značenju koje je ovde primenjeno, termin" in vitro"odnosi se na artificijelno okruženje i na postupke ili reakcije koje se odvijaju unutar tog artificijelnog okruženja.In vitrookruženja mogu bez ograničenja uključiti epruvete i ćelijske kulture. Termin" in vivo"odnosi se na prirodno okruženje( na primer,životinju ili ćeliju), kao i na procese ili reakcije koje se dešavaju unutar prirodnog okruženja.
[0033] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "ćelijska kultura" odnosi se na svakuin vitrokulturu ćelija. Ovim terminom su obuhvaćene kontinualne ćelijske linije( na primer,imortalizovane), primarne ćelijske kulture, ograničene ćelijske linije( na primer,ne-transformisane ćelije) i svaka druga populacija ćelija koja se održavain vitro,uključujući oocite i embrione.
[0034] U značenju koje je ovde primenjeno, termini "subjekt" ili "pacijent" odnose se na organizme koji se tretiraju postupcima saglasnim predmetnom pronalasku. Ti organizmi obuhvataju, bez ograničenja, ljude i veterinarske životinje (pse, mačke, konje, svinje, goveda, ovce, koze i slično). U kontekstu ovog pronalaska, termini "subjekt" ili "pacijent" načelno označavaju pojedinca koji će primiti ili koji je primio tretman.
[0035] Termin "dijagnostikovan", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na prepoznavanje bolesti na osnovu signala ili simptoma ili genetičke analize, patološke analize, histološke analize i slično.
[0036] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "antisens" koristi se u vezi sa sekvencama nukleinskih kiselina( na primer,RNK, fosforotioat DNK), koje su komplementarne specifičnoj RNK sekvenci( naprimer,iRNK). Ovom definicijom su obuhvaćene prirodni i sintetički antisens RNK molekuli, uključujući molekule koji regulišu gensku ekspresiju, male interferirajuće RNK ili mikroRNK. Jedan tip antisens sekvence koji se može primeniti u kontekstu predmetnog pronalaska jesu one specifične za CXCR1 iRNK.
[0037] Termini "test jedinjenje" ili "jedinjenje-kandidat" odnosi se na svaki hemijski entitet, farmaceutik, lek i slično, koje se može primeniti u terapiji ili prevenciji bolesti, oboljenja, tegoba ili poremećaja telesnih funkcija, ili na drugi način izmenjene fiziologije ili ćelijskog statusa uzorka. Test-jedinjenja uključuju i poznata i potencijalna terapeutska jedinjenja. Test-jedinjenje se utvrđuje kao terapeutsko jedinjenje, primenom postupaka pretraživanja saglasno pronalasku. "Poznato terapeutsko jedinjenje" odnosi se na terapeutsko jedinjenje za koje je ranije pokazano
( na primer,kroz studije na životinjama ili na osnovu prethodnog iskustva u primeni na ljudima)
daje efikasno u takvim tretmanima ili u prevenciji bolesti. U poželjnom obliku izvođenja, "test-jedinjenja" su antikancerski agensi. U naročito poželjnim oblicima izvođenja, "test-jedinjenja" su anti-kancerski agensi koji indukuju apoptozu u ćelijama.
[0038] U značenju koje je ovde primenjeno termin "antigen-vezujući protein" odnosi se na proteine koji vezuju specifičan antigen. "Antigen-vezujući proteini" obuhvataju, bez ograničenja, imunoglobuline, uključujući poliklonska, monoklonska, himerna, jednolančana i humanizovana antitela, Fab fragmente, F(ab')2 fragmente i Fab ekspresione biblioteke. Poliklonska antitela proizvode se primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Ona se dobijaju imunizovanjem različitih vrsta životinja, uključujući zečeve, miševe, pacove, ovce, koze i drugo, injektovanjem peptida koji je sličan ciljnom epitopu. U poželjnim oblicima izvođenja, taj peptid se konjuguje za imunogeni nosač( na primer,toksoid difterije, albumin goveđeg seruma (BSA) ili hemocijanin prilepka (KLH)). U cilju povećanja imunološkog odgovora koriste se brojne pomoćne materije zavisno od vrste domaćina, uključujući, bez ograničenja, Frojndov adjuvans (kompletan i nekompletan), mineralni gelovi, kao što su aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance, kao što je lizolecitin, pluronski polioli, peptidi, ulja, emulzije, hemocijanin puža prilepka, dinitrofenol i potencijalno korisni humani adjuvansi, kao što su BCG (Bacille Calmette-Guerin) i Corvnebacterium parvum.
[0039]Monoklonska antitela je moguće proizvesti primenom postupaka za proizvodnju antitela u kontinulanim ćelijskim linijama( videti na primer,Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY). Postupci obuhvataju, bez ograničenja, tehnike hibridoma, koje su prvobitno razvijene od strane Kohlera i Milsteina (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), kao i tehnike trioma, tehniku hibridoma humanih B-ćelija( videti na primer,Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)), kao i tehniku EBV- hibridoma, za proizvodnju humanih antitela (Cole i sar., in Monoclonal Antibodies and Cancer Ther- apy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)).
[0040]Saglasno pronalasku, opisani postupci za proizvodnju jednolančanih antitiela (U.S. 4,946,778) mogu se adaptirati za proizvodnju specifičnih jednolančanih antitela. Dopunski oblik izvođenja pronalaska primenjuje postupke poznate u stanju tehnike za konstruisanje Fab ekspresionih biblioteka (Huse i sar., Science, 246:1275-1281 (1989)), sa ciljem brze i lake identifikacije monoklonskih Fab fragmenat željene specifičnosti.
[0041]Fragmenti antitela koji sadrže idiotip (antigen-vezujući region) molekula antitela mogu se dobiti postupcima poznatim u stanju tehnike. Ovakvi fragmenti obuhvataju, bez ograničenja: F(ab')2 fragmente, koji se mogu dobiti digestijom molekula antitela pepsinom; Fab' fragmenti, koji se mogu dobiti redukcijom disulfidnih mostova u F(ab')2 fragmentu, kao i Fab fragmenti koji se mogu proizvesti tretiranjem molekula antitela papainom i redukujućim agensom.
[0042]Geni koji kodiraju antigen-vezujuće proteine mogu se izolovati postupcima koji su poznati u stanju tehnike. U postupku proizvodnje antitela, pretraživanje željenog antitela može se postići postupcima koji su poznatu u stanju tehnike( na primer,radioimunoeseji, ELISA eseji (enzvme-linked immunosorbant assay), "sendvič" imunoeseji, imunoradiometrijski eseji, reakcije gel-difuzione precipitacije, imunodifuzioni eseji,in situimunoeseji (uz primenu koloidnog zlata, enzima ili radioizotopskog obeležavanja, na primer), Western blot, reakcije precipitacije, test aglutinacije( na primer,test gel aglutinacije, testovi hemaglutinacije,i td.),testovi fiksacije komplementa, imunofluorescentni testovi, protein A testovi i imunoelectroforezni testovi,/' td.) i td.
[0043]U značenju koje je ovde primenjeno, termin "modulisati" označava aktivnost jedinjenja koje utiče na( na primer,ubrzava ili usporava) neki aspekt ćelijske funkcije, uključujući, bez ograničenja, ćelijski rast, proliferaciju, invaziju, angiogenezu, apoptozu i slično.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0044] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke tretiranja kancera, putem administracije inhibitora IL8-CXCR1 signalnog puta (na primer, anti-CXCRl antitela ili repertaksina) i dodatnog hemoterapeutiskog agensa, na način koji ubija ne-tumorogene i tumorogene kancerske ćelije kod subjekta koji je primio tretman. Predmetni pronalazak takođe razmatra kompozicije i postupke za dijagnostikovanje prisustva matičnih ćelija solidnih tumora kod pacijenta (na primer, na osnovu prisustva CXCR1 ili FBX021).
I. Tumorogene kancerske ćelije, ALDH, CXCR1 i inhibicija CXCR1
[0045] Evolucija normalne ćelije u potpuno transformisanu ćeliju zahteva deregulaciju većeg broja ćelijskih procesa (1, 2). Prema klasičnim modelima karcenogeneze, ovi događaji se mogu desiti u svakoj ćeliji. Suprotno tome, prema "hipotezi kancerskih matičnih ćelija" preferencijalne mete onkogene transformacije su tkivne matične ili rane progenitorske ćelije koje su stekle potencijal samo-obnavljanja (3-6). Takve "tumor-inicijacione ćelije" ili "kancerske matične ćelije" (CSC), odlikuju se sposobnošću da se samo-obnavljaju, što je proces koji upravlja tumorogenezom i diferencijacijom koja doprinosi heterogenosti tumorskih ćelija. Skorašnji podaci koji podržavaju hipotezu kancerskih matičnih ćelija dobijeni su primenom ksenografta primarnih humanih tumora. Ova istraživanja su ukazala da su tumori sačinjeni od hijerarhije ćelija kojom upravlja kancerska matična ćelija. Uz to, skorašnji podaci ukazuju da imoratlizovane ćelijske linije dobijene od mišjih i humanih tkiva takođe mogu da sadrže ćelijsku populaciju koja ispoljava svojstva matičnih ćelija. Većina ovih studija zasnivala se na in vitro istraživanjima kojima se utvrđuju svojstva kao što su klonogeni potencijal, sposobnost formiranja sfera i multipni potencijal za diferencijaciju prema različitim ćelijskim linijama (7-10). Nešto ograničeni]a istraživanja koja se zasnivaju na funkcionalnoj transplantaciji imortalizovanih ćelijskih linija u ksenografte takođe su ukazala na postojanje navedene hijerarhije ćelija. U ovim istraživanjima za identifikaciju takozvanih "bočnih populacija" (SP) primenjivana je ekskluzija Hoechst boje (7, 9, 11). Uz to, ćelijski markeri definisani primenom primarnih tumorskih ksenografta, kao što su CD44 i CD 133, primenjeni su za identifikaciju sličnih populacija u uspostavljenim ćelijskim linijama (7, 8).
[0046] Kao što će biti opisano u narednim primerima, ekspresija enzima aldehid dehidrogenaze (ALDH), koja je marker matičnih ćelija, izučavana je u 33 ćelijske linije dobijene iz humanih kancera dojke i netransformisanih ćelija dojke. ALDH je detoksifikujući enzim odgovoran za oksidaciju unutarćelijskih aldehida, a smatra se igra ulogu u diferencijaciji matičnih ćelija, kroz metabolizam retinala u retinoičnu kiselinu (12, 13). Aktivnost ALDH procenjena fluoresecentnim ALDEFLUOR testom uspešno se primenjuje za izolovanje kancerskih matičnih ćelija u multipnim mijelomima i aktunoj mijeloidnoj leukemiji (AML), kao i kod tumora mozga (14-16). Nedavno je pokazano da se aktivnost ALDH može primeniti za razdvajanje subpopulacije ćelija koje ispoljavaju svojstva matičnih ćelija od normalnog humanog tkiva dojke i karcinoma dojke (17). ALDEFLUOR-pozitivna populacija izolovana iz redukcionog mamoplastnog tkiva ima sposobnost da rekonstituiše kanale alveolarnih struktura u masnom tkivu dojke humanizovanih NOD/SCID miševa. Osim toga, ALDELFUOR-pozitivne ćelije izolovane iz humanih karcinoma dojke imaju svojstva matičnih ćelija, što je demonstrirano njihovom sposobnošću da rekonstituišu tumore u serijskim pasažima u NOD/SCID miševima, kao i da uspostave fenotopsku heterogenost inicijalnih tumora (17). U primerima koji slede, biće pokazano da većina ćelijskih linija kancera dojke sadrži ALDEFLUOR-pozitivne populacije sa posebnim molekulskim profilom koji odlikuju svojstva kancerskih matičnih ćelija.
[0047] Kao što je prikazano u narednim primerima, rad koji je sproveden tokom razvoja predmetnog pronalaska identifikovao je CXCR1 (receptor za inflamatorni hemokin IL8), kao marker kancerskih matičnih ćelija. Samo ćelije koje su ALDELFUOR-pozitivne eksprimiraju CXCR1. Takođe, pokazano je da ovaj receptor ima funkcionalnu ulogu jer rekombinantni IL8 sposoban da poveća proporciju matičnih ćelija u ćelijskim linijama, na osnovu merenja ALDELFUOR testom i testom formiranja sfera. Iako je poznato daje IL8 povezan sa agresivnim kancerima dojke i da je nivo ovog citokina u serumu veći u žena sa metastazom, smatra se da predmetni pronalazak po prvi put pokazuje funkcionalnu vezu između IL8 i njegovog receptora CXCR1 u matičnim ćelijama.
[0048] Kao što je dalje opisano u primerima, pokazano je da je moguće selektivno delovati na kancerske matične ćelije, blokiranjem CXCR1 receptora u ovim ćelijama. U jednom od pristupa koji se opisani u primerima, ćelijske linije kancera dojke tretirane su monoklonskim antitelima na CXCR1, ali ne i na drugi IL8 receptor, CXCR2. Ovakav tretman selektivno deluje na kancerske matične ćelije, što je pokazano smanjenjem ALDELFUOR-pozitivne populacije. Upadljivo, utvrđeno je da, iako je CXCR1 eksprimiran u veoma niskom procentu ćelija (na primer, manje od 1%), takva blokada CXCR1 receptora indukuje ćelijsku smrt u većini ostalih kancerskih ćelija, bez obzira na činjenicu što one nemaju CXCR1 receptor. Otkriven je molekulski put kojim je posredovan efekat IL8 na kancerske matične ćelije i koji je odgovoran za takozvani uzgredni "bstander" efekat u ubijanju drugih ćelija. IL8 stimuliše samo-obnavljanje matičnih ćelija, vezivanjem za CXCR1, što dovodi do aktivacije puta fokalne adhezione kinaze (Fak). To dalje dovodi do aktivacije Akt koja upravlja samo-obnavljanjem matičnih ćelija. Kada se ovaj put blokira u kancerskim matičnim ćelijama, smanjenje Akt signalizacije uzrokuje sekvestraciju Foxo transkripcionog faktora u citoplazmi, što dalje dovodi do povećanje sinteze Fas liganda. Fas ligand se oslobađa iz kancerskih matičnih ćelija i indukuje ćelijsku smrt okolnih ćelija koje sadrže Fas receptor.
[0049] Iako predmetni pronalazak nije ograničen na neki određeni mehanizam, i uz razumevanje da poznavanje mehanizma nije neophodno za primenu predmetnog pronalaska, smatra se da CXCR1 posreduje u samoobnavljanju kancerskih matičnih ćelija, signalizacijom koja obuhvata Fak i Akt i da blokada ovog puta indukuje ćelijsku smrt u kancerskim ćelijama, kao i u okolnim tumorskim ćelijama. Zbog toga, u nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije i postupke koji remete IL8-CXCR1 put signalizacije (na primer, pomoću anti-CXCR1 antitela, anti-F AK antitela ili drugih agenasa), sa ciljem da se tretira kancer.
[0050] S obzirom na to da je IL8 hemokin uključun u tkivnu inflamaciju, i ranije je postojao interes da se razviju inhibitori IL8 signalizacije. Mali molekulski inhibitor, repartaksin, razvijen je kao anti-inflamatorni agens sa potencijalom da umanji komplikacije miokardijalnog infarkta i šloga. Repartaksin je uveden u fazu I i fazu II kliničkih istraživanja, gde je ispoljio nizak nivo toksičnosti. Kao što je prikazano u primerima, repartaksin je (slično anti-CXCRl antitelima) sposoban da cpecifično deluje na kancerske matične ćelije, kao i da indukuje apoptozu posredovanu Fas Ugandom, uzgrednim efektom u okolnim ćelijama. Još važnije, u tumorskim ksenograftima repartaksin pojačava efekat hemoterapije. Međutim, suprotno hemoterapiji, koja preferencijalno uništava diferencirane ćelije u tumorima, ostavljajući tumorske matične ćelije netaknutima, repartaksin deluje baš na tumorske matične ćelije. Ovo svojstvo repertaksina je dokazano u primerima, smanjenjem brojnosti ALDELFUOR populacije kod tumora tretiranih repartaksinom i smanjenjem sposobnosti tretiranih tumora da formiraju sekundarne tumore u miševima. Takođe je testirana sposobnost repartaksina da blokira nastanak metastaze. U modelu eksperimentalno indukovane metastaze, tumorske ćelije su obeležene luciferazom i ubrizgane su direktno u srčanu komoru. Jedan dan nakon uvođenja tumorskih ćelija, u jednoj grupi životinja započet je tretman repartaksinom, dok druga grupa nije primala tretman. Repartaksin je značajno smanjio nastanak metastaza.
[0051]Predmetni pronalazak identifikuje CXCR1 receptor za IL8, kao metu delovanja u terapiji kancerskih matičnih ćelija. Mali molekulski inhibitor repartaksin inhibira aktivnost oba IL8 receptora, CXCR1 i CXCR2. Primeri pokazuju da je CXCR1 dominantno prisutan receptor za IL8 na kancerskim matičnim ćelijama. Primeri, takođe, jasno ukazuju da razlog zbog kojih je citotoksična hemoterapija neefikasna u pogledu tretiranja uspostavljenih kancere ne leži samo u neselektivnosti ove terapije prema kancerskim matičnim ćelijama, već i u povećanom oslobađanju IL8, do kojeg dolazi tokom citotoksične hemoterapije tumora. Predmetni primeri ukazuju da primena CXCR1 inhibitora ima povoljan uticaj, kako na povećanje specifičnosti terapije prema kancerskim matičnim ćelijama, tako i u blokiranju povećanog osloabađanja IL8 do kojeg dolazi usled citotoksične terapije.
[0052]Blokada IL8-CXCR1 signalnog puta nije ograničena samo na primenu u kanceru dojke, već se može primeniti kod bilo kog tipa kancera. Poželjno je, međutim da se tretira onaj tip kancera kod kojeg postoji dokaz o povećanju produkcije IL8 production (na primer, zajedno sa hemoterapijom). Pokazano je da hemoterapeutski agensi direktno regulišu transkripciju 1L8 u kancerskim ćelijama. Paklitaksel povećava transkripciju i sekreciju IL8 u kancerskim ćelijskim linijama ovarijalnog kancera, kancera dojke i kancera pluća (Uslu i sar., 2005, Int. J. Gvnecol. Cancer, 15:240-245; i Collins i sar., 2000, Can. Imm. Immuno., 49:78-84). Takođe, primena adriamicina i 5-fluoro-2'-deksiuridina kod kancerskih ćelija dojke (DeLarco i sar., 2001, Can. Res. 61:2857-2861), 5-FU kod ćelija oralnih kancera (Tamatani i sar., 2004, Int., J. Can., 108:912:921), doksorubicina kod ćelijskih linija sitnoćelijskog kancera pluća (Shibakura i sar., 2003, Int. J. Can., 103:380-386) i dakarbazina kod ćelija melanoma (Lev i sar., 2003, Mol., Can. Ther., 2:753-763), dovodi do povećanja ekspresije CXCL8. Zbog toga, u nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje agense koji deluju na IL8-CXCR1, u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensima (na primer, sličnim onima koji su pomenuti u prethodnim referencama), sa ciljem tretiranja subjekta sa određenim tipom kancera, uključujući bez ograničenja, kancer prostate, ovarijalni kancer, kancer dojke, melanom, ne-sitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer i adenokarcinom jednjaka.
[0053]Predmenti pronalazak nije ograničem u pogledu kancera koji se tretira, već uključuje, bez ograničenja, fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogeni sarkom, hordom, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangio-endoteliosarkom, sinoviom, mezoteliom, Juingov tumor, lejomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, kancer pankreasa, kancer dojke, ovarijalni kancer, kancer prostate, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojnih žlezda, karcinom potkožnih žlezda, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinom, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnih kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Wilmsov tumor, cervikalni kancer, testikulami tumor, karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom mokraćne bešike, epitelijalni karcinom, gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustički neurom, oligodendrogliom, meningiom, melanom, neuroblastom, i retinoblastom.
II. Detekcija markrea kancerskih matičnih ćelija solidnih tumora
[0054] U nekim slučajevima, predmetna prijava opisuje postupke detekcije ekspresije markera kancerskih matičnih ćelija (na primer, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP i drugih markera prikazanih u Tabeli 1). Ekspresija se može odrediti direktnim merenjem (na primer, na nivou iRNK ili proteina). Ekspresija se može detektovati u uzorcima tkiva (na primer, u biopsijama tkiva). Ekspresija se može detektovati u telesnim tečnostima (uključujući, bez ograničenja, plazmu, serum, celu krv, sluz i urin).
[0055] Predmetna prijava dalje opisuje panel i komplete za detekciju markera. Detekcija prisustva kancerskih matičnih ćelija može se primeniti u cilju prognoze bolesti subjekta. Dobijene informacije se koristiti za usmeravanje tretmana. Na primer, ukoliko se utvrdi da se kod subjekta eksprimira marker koji ukazuje na postojanje matičnih ćelija solidnog tumora (na primer, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP i drugih proteina prikazanih u Tabeli 1), moguće je započeti sa dodatnim terapijama (na primer, sa radijacionom terapijom) u ranijim vremenskim tačkama kada je verovatnije da ta takva terapija ostvarila povoljan efekat (na primer, pre pojave metastaza). Uz to, ukoliko se kod subjekta utvrdi postojanje tumora koji nije osetljiv na određenu terapiju, moguće je prekinuti terapiju i tako izbeći nepotrebne troškove i negativne efekte neodgovarajuće terapije.
[0056] Predmetna prijava opisuje panel za analizu većeg broja markera (na primer, u kombinaciji sa CXCR1 ili FBX021 i najmanje jednim od CD44, CD24 i ESA). Panel omogućava simultanu istovremenu analizu više markera koji su u vezi sa karcinogenezom i/ili metastazom. Zavisno od subjekta, paneli se mogu analizirati samostalno ili u kombinaciji, kako bi se obezbedila najbolja moguća dijagnoza ili prognoza. Markeri koji se priključuju panelu biraju se na osnovu ispitivanja njihovih prediktivnih vrednosti, primenom odgovarajućih postupaka, uključujući, bez ograničenja, i one koji su opisani u narednim primerima.
1. Detekcija RNK
[0057]Kancerske matične ćelije solidnog tumora mogu se detektovati merenjem ekspresije odgovarajuće iRNK u uzorku tkiva. Ekspresija iRNK može se izmeriti nekim pogodnim postupkom, uključujući, bez ograničenja, one koji će biti kasnije opisani. Pristupni broj nukleinske kiseline koja kodira humani CXCR1 je NM 000634 (na koji se ovaj pronalazak poziva), dok je pristupni broj nukleinske kiseline koja kodira humani FBX021, NM 033624. Ove sekvence mogu se koristiti za dizajniranje prajmera i proba (kao i siRNK sekvenci).
[0058]U nekim slučajevima, RNK se detektuje Northern blot analizom. "Nordern blot" uključuje izdvajanje RNK i hibridizaciju komplementarne obeležene probe.
[0059]U drugim slučajevima, RNK (ili odgovarajuća cDNK) može se detektovati hibridizacijom sa oligonukleotidnim probama. Dostupni su brojni hibridizacioni testovi koji primenjuju različite tehnologije. Na primer, u nekim slučajevima se primenjuje TaqMan test (PE Biosvstems, Foster City, CA; videti, na primer, U.S. Patent Nos. 5,962,233 i 5,538,848, oba su navedena u priključenim referencama). Ovaj test se izvodi tokom reakcije PCR. TaqMan test zasniva se na 5'-3' egzonukleaznoj aktivnosti AMPLITAQ GOLD DNK polimeraze. Proba koja se sastoji od oligonukleotida sa 5'-reporterskom bojom (na primer, neka fluorescentna boja) i 3'-hvatačkom bojom uključuju se u PCR reakciju. Ako se tokom PCR reakcije, proba veže za metu, 5'-3' nukleolitička aktivnost AMPLITAQ GOLD polimeraze iseca probu između reporter boje i hvatačke boje. Razdvajanje reporterske boje od hvatačke boje dovodo do povećanja fluorescencije. Signal se akumulira sa svakim ciklusom PCR i može se pratiti fluorimetrom.
[0060]Nivo ekspresije RNK može se odrediti pomoću reverzno-transkripcione PCR (RT-PCR). U ovom postupku, RNK se enzimski konvertuje u komplementarnu DNK ili "cDNK" radom enzima reverzna transkriptaza. Tako dobijena cDNK se zatim koristi kao matrica za reakciju PCR. Proizvodi PCR reakcije mogu se detektovati nekim pogodnim postupkom, uključujući, bez ograničenja, gel elektroforezu i bojenje DNK specifičnom bojom, ili hibridizacijom sa obeleženom probom. U nekim slučajevima primenjuje se postupak kvantitativne reverzno-transkripcione PCR, sa standardizovanom smešom kompetitivnih matrica, koji je opisan u U.S.
Patentima 5,639,606, 5,643,765, i 5,876,978.
2. Detekcija proteina
[0061]Ekspresija gena za markere kancerskih matičnih ćelija može se detektovati merenjem ekspresije odgovarajućih proteina ili polipeptida (na primer, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP i ostalih proteina iz Tabele 1). Ekspresija proteina se može detektovati bilo kojim pogodnim postupkom. Proteini se u nekim slučajevima detektuju imunohistohemijski. U nekim slučajevim detektuju se vezivanjem za antitelo razvijeno na taj protein. Pristupni broj za humani protein CXCR1 je NP 000625, dok je pristupni broj za humani protein FBX021, NP 296373. Postupak razvijanja antitela biće kasnije opisan.
[0062]Vezivanje antitela detektuje se postupcima poznatim u stanju tehnike (na primer, radioimunoesej, ELISA (enzvme linked immunosorbant assay), "sendvič-imunoesej, imunoradiometrijski eseji, gel-difuzione reakcije precipitacije, imunodifuzioni eseji, in situ imunoeseji (na primer, primenom koloidnog zlata, enzima ili radioizotopskog obeležavanja, na primer), Western blot, reakcije precipitacije, aglutinizacioni testovi (na primer, gel-aglutinacioni testovi, testovi hemaglutinacije, i td.), testovi fiksacije komplementa, imunofluorescentni testovi, protein A testovi i testovi imunoelektroforeze, i td.
[0063]Vezivanje antitela za ciljni protein detektuje se detektovanjem obeleživača na primarnom antitelu. Primarno antitelo se može detektovati detektovanjem sekundarnog antitela ili reagensa vezanog za primarno antitelo. Sekundarno antitelo može biti obeleženo. Brojni postupci za detektovanje vezivanja u imunoesejima poznati su u stanju tehnike i obuhvaćeni su ovom patentnom prijavom.
[0064]U nekim slučajevima, može se primeniti automatizovani test za detekciju. Postupci automatizacije imunoeseja obuhvataju one opisane u U.S. Patentima 5,885,530, 4,981,785,6,159,750 i 5,358,691. Analiza i prezentacija rezultata može takođe biti automatizovana. Na primer, moguće je primeniti programski paket koji daje prognozu ishoda lečenja na osnovu prisustva ili odsustva serije proteina koji odgovaraju kancerskim markerima.
[0065]U mnogim aspektima, imunotestovi opisani u U.S. Patentima 5,599,677 i 5,672,480.
3. Tehnologija cDNK mikronizova ( Microarray Technology)
[0066]Mikronizovi cDNK sačinjeni su od velikog broja (najčešće nekoliko hiljada) različitih cDNK, koje nanete (najčešće pomoću robotskog uređaja za nanošenje) na unapred utvrđeno mesto na tvrdoj podlozi, kao što je staklena mikroskopska pločica. Sekvence cDNK su najčešeće dobijene PCR amplifikacijom umetaka plazmidne biblioteke, pomoću proba (prajmera) koje su komplementarne linearnom segmentu dela plazmida ili genu, onda kada je sekvenca gena poznata. Dužina PCR proizvoda pogodnih za primenu u mikronizovima tipično je između 0.5 i 2.5 kB. Mogu se izabrati cDNK pune dužine, eksprimirane oznake na sekvencama (engl. espressed sequence tags - EST) ili nasumično odabrane cDNK iz biblioteka od interesa. Sekvenca EST je delimično sekvencionirana, kao što je opisano kod Hillier, i sar., 1996, 6:807-828. Iako neke EST sekvence odgovaraju poznatim genima, mnogo je češći slučaj daje o konkretnoj EST dostupno veoma malo ili nimalo podataka, osim za mali broj 3' i/ili 5' sekvenci i možda, tkivno poreklo mRNK iz koje su EST sekvence dobijene. Stručnjacima u stanju tehnike je jasno da uopšteno, cDNK sadrži dovoljno podataka o sekvenci da bi se jednoznačno identifikovao gen unutar humanog genoma. Takođe, uopšteno govoreći cDNK su dovoljne dužine da se selektivno hibridizuju, selektivno, specifično i jedinstveno za cDNK dobijenu od mRNK koja je dobijena prepisivanjem jednog gena pod hibridizacionim uslovima eksperimenta.
[0067]U tipičnom eksperimentu mikronizova, mikronizovi cDNK se hibridizuje sa različito obeleženim populacijama RNK, DNK ili cDNK koje su dobijene iz dva različita uzorka. Najčešće RNK (bilo ukupne RNK ili poli A-RNK) izoluju se iz ćelija ili tkiva od interesa i reverzno se transkribuju, kako bi se dobila cDNK. Obeležavanje se uobičajeno sprovodi tokom faze reverzne transkripcije, ugrađivanjem obeleženog nukleotida u reakcionu smešu. Moguće je koristiti različite obeleživače, ali su najčešće koriste nukleotidi konjugovani sa fluorescentnim bojama, kao što su Cy3 ili Cy5. Na primer, mogu se primeniti Cy5-dUTP i Cy3-dUTP. Količina cDNK koja je dobijena iz jednog uzorka (koji predstavlja, na primer, jedan određeni tip ćelije, tkiva ili uslova rasta) obeležava se jednom fluoroforom, dok se cDNK dobijena iz drugog uzorka (koji predstavlja, na primer, drugi tip ćelije, tkiva ili uslova rasta) obeležava drugom fluoroforom. Slične količine obeleženog materijala iz dva uzorka se ko-hibridizuje u mikronizu. U slučaju eksperimenta mikroniza u kojem su uzorci obeleženi bojom Cy5 (koja fluorescira crveno) i Cy3 (koja fluorescira zeleno), primarni podaci (dobijeni skeniranjem mikroniza detektorom koji je sposoban da kvantitativno detektuje intenzitet fluorescencije) dobijaju se u vidu odnosa intenziteta fluorescencije (crveno/zeleno, R/G). Ovi odnosi predstavljaju relativne koncentracije cDNK molekula koji su hidbridizovani sa cDNK koja se naneta na mikroniz, a to reflektuje relativan nivo ekspresije iRNK koja odgovara svakoj cDNK/genu koji se nalazi na mikronizu.
[0068]Svaki eksperiment mikroniza može da obezbedi desetine hiljada podataka, od kojih svaki predstavlja relativnu ekspresiju određenog gena u dva uzorka. Od ključne važnosti su odgovarajuća organizacija i analiza podataka, pa su stoga razvijeni brojni komjuterski programi koji uključuju standardna statistička oruđa razvijena kako bi se olakšala analiza podataka. Jedan osnov za organizaciju podataka o genskoj ekspresiji jeste da se podaci grupišu u klastere geni sa sličnim obrascem ekspresije. Postupak formiranja hijerarhijske klasterske analize i prikaza podataka dobijenih iz eksperimenata mikronizova opisan je u Eisen i sar., 1998, PNAS 95:14863-14868. Kao što je tamo opisano, klasterovanje se može kombinovati sa grafičkom reprezentacijom, primarnih podataka u kojima je svaka tačka prikazana bojom koja i kvantitativno i kvalitativno predstavlja tu tačku. Konvertovanjem podataka iz velike tabele brojeva u vizuelni format, olakšava se intuitivna analiza podataka. Dodatne informacije i detalji koji se odnose na matematička oruđa i/ili pristupe klastiranju moguće je naći, na primer, u Sokal & Sneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W. H. Freeman, San Francisco,1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, New York, 1975; Paull i sar., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92; Weinstein i sar., 1992, Science 258:447-51; van Osdol i sar., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9; i Weinstein i sar., 1997, Science, 275:343-9.
[0069]Dodatni podaci o eksperimentalnim postupcima koji se korišćeni u predmetnom pronalasku, mogu se naći u narednim primerima. Dodatne informacije koje opisuju postupke za pravljenje i korišćenje mikronizova moguće je naći u U.S. Pat. No. 5,807,522. Instrukcije za konstruisanje hardvera za mikronizove (na primer, nizača i skenera) koji koriste komercijalno dostupne delove. Dodatna pojašnjenja koja se odnose na tehnologiju mikronizova i na protokole za pripremu uzoraka i izvođenje eksperimenata, mogu se naći, na primer, u "DNA arrays for analysis of gene expression", Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; Fluorescence-based expression monitoring using microarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; i M. Schena (ur.), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1999.
4. Analiza podataka
[0070]Za prevođenje sirovih podataka dobijenih pomoću detekcionih eseja, u vrednosti koje mogu imati kličničku prediktivnu upotrebu, moguće je koristiti kompjuterski program. Lekari mogu da pristupe tim prediktivnim vrednostima primenom odgovarajućih sredstava. Tako predmetna prijava obezbeđuje dodatnu korist, jer kliničar, koji verovatno nije obučen u oblasti genetike ili molekularne biologije, ne mora nužno da razume sirove podatke. Podaci se prezentuju direktno kliničaru u obrađenom obliku. Kliničar je tada može neposredno da primeni informacije kako bi optimizovao lečenje pacijenta.
[0071] Predmetna prijava takođe predviđa primenu nekog postupka koji je može da primi, preradi i prenese informacije ka i iz laboratorija koje sprovode testiranja, medicinskom personalu i pacijentima. Na primer, uzorak, (na primer biopsija ili serum ili urin) koje je dobijen od pacijenta i dat na analizu (na primer, kliničkoj laboratoriji u bolničkom objektu, agenciji za genomsko profilisanje i td, koja se nalazi u bilo kojem delu sveta, na primer, u zemlji izvan zemlje gde subjekt živi ili gde će se informacije koristiti), koristi se za dobijanje sirovih podataka. Kada uzorak uključuje tkivo ili neki drugi biološki uzorak, subjekt može da poseti klinički centar kako bi se dobio uzorak i može da se pošalje u centar za profilisanje ili subjekt može da preuzme uzorke i da ih direktno pošalje u centar za profilisanje. Kada podaci stimgnu iz servisa za profilisanje i kada se odredi profil (na primer, ekspresioni podaci), podaci su speciifčni za tražene dijagnostičke i prognostičke informacije datog subjekta.
[0072] Podaci se zatim pripremaju u formatu koji je pogodan za korišćenje od strane kliničara. Na primer, umesto da budu u formi sirovih podataka ekspresione analize (na primer, tokom ispitivanja velikog broja markera), podaci se mogu prirediti u formatu koji predstavlja dijagnozu ili procenu rizika subjekta, zajedno sa preporukama u vezi sa određenim tretmanom. Podaci se mogu predstaviti kliničaru u nekom pogodnom obliku. Na primer, u nekim oblicima izvođenja servis koji obavlja profilisanje uzorka može dati izveštaj kliničaru u štampanoj formi (na primer, poslati izveštaj u ustanovu u kojoj se sprovodi tretman) ili ih može prikazati kliničaru na ekranu kompjutera.
[0073] U nekim slučajevima, informacije se najpre analiziraju na mestu gde će se izvesti tretman ili u nekom regionalnom centru. Sirovi podaci se zatim šalju u centralnu ustanovu na dalju analizu i/ili na konvertovanje sirovih podataka u oblik koji je koristan kliničaru i pacijentu. Prednost postojanja centralne ustanove za obradu podataka jeste to što ona obezbeđuje privatnost (svi podaci se čuvaju u centralnoj ustanovi sa jedinstvenim sigurnosnim protokolom), brzina, i jednoobraznost analize. Centralna ustanova za obradu podataka može takođe i da kontroliše sudbinu podataka nakon tretmana subjekta. Na primer, primenom elektronskog sistema za komunikaciju, centralna ustanova može da obezbedi prijem podataka od strane kliničara, subjekta ili istraživača.
[0074] U nekim slučajevima, subjekt ima mogućnost da direktno pristupi podacima pomoću elektronskog sistema za komunikaciju. Subjekt može da izabere dalju intervenciju ili medicinsko savetovanje zavisno od dobijenih rezultata. U nekim oblicima izvođenja, podaci se koriste u istraživačke svrhe. Na primer, podaci se mogu koristiti za dalju optimizaciju uključivanja novih ili eliminaciju nekih postojećim markera kao korisnih indikatora određenog stanja ili faze bolesti.
5. Kompleti
[0075] U narednim oblicima izvođenja, predmetna prijava opisuje komplete za detekciju i karakterizaciju kancera (na primer, detektovanje jednog ili više markera, ili za modulaciju aktivnosti peptida koji je eksprimiran od strane jednog ili više markera). Ovakvi kompleti mogu da sadrže reagens specifičan za detekciju iRNK ili cDNK (na primer, oligonukleotidne probe ili prajmere). Kompleti mogu da sadrže sve komponente neophodne i/ili dovoljne da se obavi test detekcije, kao i kontrole, uputstva za izvođenje testova i potreban softver za analizu i prezentaciju rezultata.
[0076] Komplet se može primeniti za testiranje prisustva polinukleotida ili proteina. Komplet može da sadrži antitelo za detekciju polipeptida ili probu za detekciju polinukleotida. Uz to, komplet sadrži standard ili kontrolni uzorak; instrukcije za obradu uzoraka, izvođenje testa i interpretaciju rezultata; kao i pufere i druge reagense neophodne za izvođenje testa. U nekim slučajevima, komplet sadrži parove prajmera za detekciju ekspresije jednog ili više gena koji su tipični za matične ćelije solidnih tumora. U nekim slučajevima, komplet sadrži cDNK ili niz oligonukleotida za detekciju jednog ili više gena koji su tipični za matične ćelije solidnih tumora.
6. In vivo oslikavanje
[0077] Za vizuelizaciju ekspresije kancerskih markera u životinji (na primer, kod čoveka ili nekog drugog sisara) primenjuju se tehnike in vivo oslikavanja. Na primer, kancerska marker iRNK (na primer, CXCR1 ili FBX021 može biti iRNK) ili protein (na primer, CXCR1 ili FBX021 protein) može se obeležiti pomoću obeleženog antitela specifičnog za neki kancerski marker. Speciifčno vezano i obeleženo antitelo može se detektovati kod pojedinca primenom postupaka in vivo oslikavanja, uključujući, bez ograničenja, radionukleidno oslikavanje, pozitron emisionu tomografiju, komputerizovanu aksijalnu tomografiju, oslikavanje pomoću X-zraka ili magnetne rezonance, fluorescentnu detekciju i hemiluminescentnu detekciju. Postupci za generisanje antitela na kancerske markere biće kasnije opisani.
[0078]Postupci in vivo oslikavanja korisni su za dijagnostikovanje kancera koji eksprimiraju kancerske markere solidnih tumora. Za vizuelizaciju prisustva markera koji ukazuje na postojanje kancera primenjuje se in vivo oslikavanje. Ovakvi postupci omogućavaju dijagnozu bez primene neprijatne biopsije. Postupci in vivo oslikavanja mogu takođe biti korisni za dobijanje prognoze bolesti za kancerskog bolesnika. Na primer, moguće je detektovati prisustvo markera koji ukazuje na postojanje kancerskih matičnih ćelija. Postupci in vivo oslikavanja saglasno predmetnom pronalasku mogu se dalje primeniti za detekciju metastaza kancera u drugim delovima tela.
[0079]U nekim slučajevima su reagensi (na primer, antitela) specifični za CXCR1 ili FBX021 fluorescentno obeleženi. Obeležena antitela uvode se u subjekta (na primer, oralno ili parenteralno). Fluorescentno obeležena antitela detektuju se nekim pogodnim postupkom (na primer, aparatom koji je opisan u U.S. Patent 6,198,107).
[0080]U drugim slučajevima, antitela su radioaktivno obeležena. Primena antitela u in vivo dijagnostici dobro je poznata u stanju tehnike. Sumerdon i sar., (Nucl. Med. Biol 17:247-254
[1990] opisali su optimizovani helator antitela za radioimunoscintografsko oslikavanje tumora, primenom Indium-111 kao obeleživača. Griffin i sar., (J Clin One 9:631-640 [1991]) opisali su primenu ovog agensa u detekciji tumora kod pacijenata kod kojih postoji sumnja na kancer pankreasa. Primena sličnih agenasa sa paramagnetisanimj onima kao obeleživačima za magnetno rezonantno oslikavanje poznata je u stanju tehnike (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 [1991]). Izbor obleživača zavisiće od izabranog modaliteta oslikavanja. Radioaktivni obeleživači, kao što je Indijum-111, Tehnecijum-99 ili Jod-131 mogu se koristiti za lanearna skeniranja ili za jednofotonsku emisionu kompjuterizovanu tomografiju (SPECT). Pozitron-emisioni obeleživači, kao što je Fluor-19, takođe se mogu koristiti za pozitron-emisionu tomografiju (PET). Za MRT, moguće je koristiti paramagnetisane jone, kao što su Gadolinijum (III) ili Mangan (II).
[0081]Dostupni su radioaktivni metali sa polu-životom od 1 sata do 3.5 dana, konjugovani za antitela, kao što je skandijum-47 (3.5 dana) galijum-67 (2.8 dana), galijum-68 (68 minuta), tehnecijum-99m (6 sati) i indijum-111 (3.2 dana), od kojih su galijum-67, tehnecijum-99m, indijum-111 poželjni za oslikavanje gama-kamerama, dok je galijum-68 poželjan za pozitron emisionu tomografiju.
[0082]Obeležavanje antitela, obeleživačima kao što su radiometali moguće je izvesti primenom bifunkcionalnog helirajućeg agensa, kao što je dietilen-triamin-pentasirćetna kiselina (DTPA), kao što je opisano u, na primer, Khaw i sar., (Science 209:295 [1980]) za In-111 i Tc-99m i od strane Scheinberg i sar., (Science 215:1511 [1982]). Mogu se koristiti i drugi helirajući agensi, ali su poželjni l-(p-karboksimetoksibenzil)-EDTA i karboksikarbonski anhidrid DTP A, jer njihova upotreba omogućava konjugovanje koje suštinski ne ostvaruje uticaj na imunoreaktivnost antitela.
[0083]Drugi postupak kuplovanja DPTA za proteine, jeste primena cikličnog anhidrida DTP A, kao što je opisano kod Hnatovvich i sar., (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982]), za obeležavanje albumina pomoću In-111, koje se može adaptirati za obeležavanje antitela. Pogodan postupak obeležavanja antitela pomoću Tc-99m koji se ne zasniva na helaciji sa DPTA, jeste postupak prethodnog kalajisanja, opisan kod Crockford i sar., (U.S. Pat. No. 4,323,546).
[0084]Postupak obeležavanja imunoglobulina pomoću Tc-99m opisan je kod Wong i sar. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251 [1978]) za proteine plazme, a nedavno je uspešno primenjen kod Wong i sar., (J. Nucl. Med., 23:229 [1981]) za obeležavanje antitela.
[0085]U slučaju radiometala konjugovanih za specifično antitelo, nekada je poželjno uvesti maksimalno moguću proporciju radioobeleživača u molekule antitela, bez remećenja imunospecifičnosti. Dalja poboljšanja mogu da se postignu delovanjem na radioobeležavanje u prisustvu specifičnih markera kancerskih matičnih ćelija, saglasno pronalasku, kako bi se zaštitilo antigen-vezujućeg mesta na antitelu.
[0086]Za in vivo oslikavanje može se primeniti in vivo biofotonsko oslikavanje (Xenogen, Almeda, CA). Ovaj postupak in vivo oslikavanja u realnom vremenu zasniva se na luciferazi. Gen za luciferazu ugrađen je u ćelije, mikroorganizme i životinje (na primer, u vidu fuzionog proteina sa kancerskim markerom saglasno ovom pronalasku). Kada je aktivan, ovaj gen dovodi do reakcije koja emituje svetlost. Registracijau i analizu slike obavlja CCD kamera i softverski paket.
III. Antitela i fragmenti antitela
[0087]Predmetna prijava opisuje izolovana antitela i fragmente antitela specifične za CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, i ostale proteine prikazane u Tabeli 1. Antitelo, fragment antitela, može biti neko monoklonsko ili poliklonsko antitelo koje specifično prepoznaje ove proteine. Monokolonska antitela ili njihovi fragmenti, koji se specifično vezuju za CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP i druge proteine, opisani su u Tabeli 1. Ova monoklonska antitela ili njihovi fragmenti mogu biti himerna ili humanizovana antitela, koja se specifično vezuju za ove proteine. Monoklonska antitela ili njihovi fragmenti mogu biti humana antitela koja specifično vezuju ove proteine.
[0088] Antitela specifična za CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP, i druge proteine iz Tabele 1, imaju primenu u eksperimentalnim, dijagnostičkim i terapeutskim postupcima koji su ovde opisani. Ova antitela mogu se primeniti za detekciju ekspresije proteina markera kancerskih matičnih ćelija u biološkim uzorcima, kao što su na primer, biopsije tkiva pacijenta, pleuralna efuzija, ili uzorak krvi. Biopsije tkiva mogu se iseći i proteini mogu biti detektovani primenom, na primer, imunofluorescencije ili imunohistohemije. Alternativno, pojedinačne ćelije iz uzorka se izoluju i ekspresija proteina se detektuje na fiksnim ili živim ćelijama primenom FACS analize. Dalje, antitela se mogu primeniti u proteinskim nizovima, za detekciju ekspresije markera kancerskih matičnih ćelija, na primer, na tumorskim ćelijama, u lizatima ćelija ili u drugim proteinskim uzorcima. Antitela se mogu primeniti za inhibiciju rasta tumorskih ćelija, dovođenjem u kontakt antitela sa tumorskim ćelijama i u in vitro ćelijskim testovima i u in vivo životinjskim modelima. Antitela se mogu primeniti za tretiranje kancera kod pacijenata, administrirani em terapeutski efektivne količine antitela specifičnih za ćelijske markere kancerskih matičnih ćelija (na primer, iz Tabele 1). U kontekstu ovog pronalaska primenjuje se antitelo na CXCR1 ili fragment antitela
[0089] Poliklonska antitela mogu se dobiti postupcima koji su poznati u stanju tehnike. Poliklonska antitela mogu se razviti imunizacijom životinja (na primer, zeca, pacova, miša, magarca), nakon više potkožnih ili intraperitonealnih injekcija odgovarajućeg antigena (prečišćeni fragment peptida, rekombinantni protein pune dužine, fuzioni protein i td.), opciono konjugovan sa proteinom hemocijaninom iz puža prilepka (KLH), albuminom seruma i td., razblaženim u sterilnom fiziološkom rastvoru i kombinovanog sa adjuvansom (na primer, kompletnim ili nekompletnim Frojndovim adjuvansom), kako bi se dobila stabilna emulzija. Poliklonsko antitelo se izdvaja iz krvi, ascita i slično, životinja koje su imunizovane na prethodni način. Prikupljena krv se zgrušava i odliva se serum, izbistri se centrifugiranjem i testira na titar antitela. Poliklonska antitela se prečišćavaju iz seruma ili ascita primenom standardnih postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući afinitetnu hromatografiju, jon-izmenjivačku hromatografiju, gel elektroforezu, dijalizu i td.
[0090]Monoklonska antitela se mogu dobiti primenom postupka hibridoma, kao što je onaj opisan kod Kohler i Milstein (1975) Nature 256:495. Primenom postupka hibridoma, miš, hrčak ili neka druga pogodna životinja-domaćin se imunizuje, kao što je već opisano, da bi se u limfocitima izazvala produkcija antitela koji se specifično vezuju za imunizujući antigen. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro. Nakon imunizacije, limfociti se izoluju i fuzionišu sa pogodnim ćelijam mijeloma ćelijske linije, primenom polietilen-glikola, kako bi se dobila ćelija hibridom koja se može selektovati od nefuzionisanih limfocita i mijeloma ćelija. Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela direktno specifična za izabrani antigen, na osnovu determinacije imunoprecipitacijom, imunoblotingom ili in vitro vezujućim testom, kao što su radioimunoesej (RIA) i enzimski imunoadsorbentni esej (ELISA), mogu se dalje propagirati u in vitro kulturi, primenom standardnih postupaka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) ili in vivo, u vidu ascitnih tumora u životinjama. Takva monoklonska antitela mogu se dalje prečistiti iz medijuma ćelijske kutlure ili iz fluida ascita, kao što je opisano za poliklonska antitela.
[0091]Monoklonska antitela se mogu takođe proizvesti primenom tehnologije rekombinantne DNK, kao što je opisano u U.S. Patentu 4,816,567. Izoluju se polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo, na primer iz zrelih B-ćelija ili hibridoma, postupkom RT-PCR uz primenu oligonukleotidnih prajmera koji spefično umnožavaju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela, a njihove sekvence se utvrđuju primenom ustaljenih postupaka. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance zatim se kloniraju u pogodne vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije-domaćina, kao što su ćelije E. coli, COS ćelije majmuna, ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), ili mijeloma ćelije, koje inače ne proizvode imunoglobuline, a u tim ćelijama-domaćinima proizvode se monoklonska antitela. Rekombinantna monoklonska antitela ili njihovi fragmenti željenih vrsta mogu se izolovati iz fagnih biblioteka, kao što je opisano (McCaffertv i sar., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson i sar., 1991, Nature, 352:624-628; i Marks i sar., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
[0092]Polinukleotid(i) koji kodiraju monoklonska antitela mogu se dalje modifikovati na različite načine, primenom rekombinantne DNK tehnologije, kako bi se dobila izmenjena antitela. Konstantni domeni lakih i teških lanaca mišjeg antitela, mogu se na primer, supstituisati 1) istim regionom humanog antitela, čime se dobija himerno antitelo ili 2) ili se mogu supstituisati nekim ne-imunoglobulinskim polipeptidom, čime se dobija fuziono antitelo. Konstatni regioni se mogu skratiti ili potpuno ukloniti, čime se dobija fragment željenog monoklonskog antitela. Takođe je moguće primeniti usmerenu ili zgusnutu mutagenezu varijabilnog regiona, kako bi se optimizovala specifičnost, afinitet i drugo, nekog monoklonskog antitela.
[0093]Monoklansko antitelo specifično na marker kancerske matične ćelije može biti neko humanizovano antitelo. Humanizovana antitela su antitela koja sadrže minimalne sekvence ne-humanih (na primer, mišjih) antitela unutar varijabilnog regiona. Takva antitela se koriste u terapijske svrhe da bi se smanjila antigenost i reakcije HAMA (humanog anti-mišje antitelo) kada se administriraju kod ljudi. U praksi su humanizovana antitela tipično humana antitela sa minimumom ili bez ne-humanih sekvenci. Covečje antitelo je antitelo koje se proizvodi u čoveku ili antitelo koje ima amino-kiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje se proizvodi u čoveku.
[0094]Humanizovana antitela se mogu proizvesti primenom različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Neko antitelo se može humanizovati supstituisanjem CDR čovečjeg antitela nekim ne-čovečjim antitelom (na primer, miš, pacov, zec, hrčak, i td) koje poseduje željenu specifičnost, afinitet i sposobnosti vezivanja (Jones i sar., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann i sar., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeven i sar., 1988, Science, 239:1534-1536). Humanizovana antitela mogu se dalje modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka, bilo u Fv okvirnom regionu i/ili unutar zamenjene ne-čovečje sekvence, kako bi se doradila i optimizovala specifičnost, specifičnost, afinitet i/ili sposobnosti vezivanja.
[0095]Covečja antitela mogu se direktno proizvesti primenom različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Moguće je pripremiti imortalizovane B limfocite imunizovane in vitro ili izolovane od imunizovanih osoba koje proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena (videti, na primer, Cole i sar., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, Alan R. Liss, p. 77
(1985); Boemer i sar., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; i U.S. Patent 5,750,373). Čovečja antitela se takođe mogu selektovati iz fagnih biblioteka, gde fagna biblioteka eksprimira antitela poreklom od čoveka (Vaughan i sar.,1996, Nature Biotechnologv, 14:309-314; Sheets i sar., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom i Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks i sar., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humanizovana antitela se mogu takođe proizvesti u transgenim miševima koji sadrže genske lokuse koji kodiraju čovečje imunoglobuline, a koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene produkcije imunoglobulina. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentnim prijavama 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016.
[0096]Predmetni pronalazak takođe obuhvata dvojno-specifična antitela koja specifično prepoznaju markere kancerskih matičnih ćelija. Dvojno-specifična antitela su antitela sposobna da prepoznaju i vežu najmanje dva različita epitopa.
[0097]Dvojno-specifična antitela mogu biti intaktna antitela ili fragmenti antitela. Postupci proizvodnje dvojno-specifičnih antitela su uobičajeni u stanju tehnike (Millstein i sar.,1983, Nature 305:537-539; Brennan i sar., 1985, Science 229:81; Suresh i sar., 1986, Methods in Enzvmol. 121:120; Traunecker i sar.,1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby i sar.,1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny i sar.,1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber i sar.,1994, J. Immunol. 152:5368; i U.S. Patent 5,731,168).
[0098]U nekim oblicima izvođenja pronalaska, može biti poželjno da se primeni fragment antitela, pre nego antitelo, kako bi se povećao stepen prodiranja antitela u tumor. U stanju tehnike poznate su postpci proizvodnje fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se dobijaju proteolitičkom digestijom intaktnih antitela (na primer, Morimoto i sar., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 i Brennan i sar., 1985, Science, 229:81). Ovi fragmenti se danas uobičajeno proizvode direktno u rekombinantnim ćelijama- domaćina, kao što je već opisano. Stoga, Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu se eksprimirati i osloboditi iz E. coli ili neke druge ćelije-domaćina, što dozvoljava proizvoidnju velikih količina ovih fragmenata. Alternativno, ovakvi fragmenti antitela mogu se izolovati iz fagnih biblioteka, kao što je opisano. Fragment antitela mogu biti linearna antitela, kao što je opisano u U.S. Patentu 5,641,870 i mogu biti monospecifična ili dvojno-specifična. Ostali postupci proizvodnje fragmenata antitela poznati su stručnjacima u oblasti.
[0099]U nekim slučajevima, naročito kada je reč o fragmentima antitela, može biti poželjno da se antitelo modifikuje kako bi se povećao polu-život u serumu. Ovo se može postići ugrađivanjem vezujućeg epitopa spasonosnog receptora u fragment antitela, mutiranjem odgovarajućeg regiona u tom fragmentu antitela ili ugrađivanjem epitopa u peptidnu oznaku koja se zatim fuzioniše za fragment antitela na jednom od dva kraja ili u sredini (na primer, postupkom DNK ili peptidne sinteze).
[0100] Predmetni pronalazak dalje obuhvata varijante i ekvivalente koje su suštinski homologe ovde navedenim himernim, humanizovanim i čovečjim antitelima ili njihovim fragmentima. Ona mogu obuhvatiti, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, to jest supstitucije jedne ili više aminokiselina sličnom aminokiselinom. Na primer, konzervativne supstitucije obuhvataju supstitucije jedne aminokiseline nekom drugom aminokiselinom koja pripada istoj klasi, kao što je na primer, zamena jedne kisele aminokiseline drugom aminokiselinom, jedne bazne aminokiseline, drugom baznom aminokiselinom. Šta se podrazumeva pod konzervativnom aminokiselinskom suptitucijom poznato je u stanju tehnike.
[0101] Pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate koji uključuju antitelo konjugovano sa nekim citotoksičnim agensom. Citotoksični agensi obuhvataju hemoterapeutske agense, inhibitore rasta, toksine (na primer, enzimski aktivan toksin bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla), radioaktivni izotope (na primer, radiokonjugat), i td. Hemoterapeutski agensi koji se mogu primeniti u generisanju ovakvih imunokonjugata obuhvataju metotreksat, adriamicin, doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili neke druge interkalirajuće agense. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu primeniti uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina, A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phvtolaca americana (PAPI, PAPU, and PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene. Dostupni su brojni radionuklidi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela, uk<l>jučujući 2J"O Bi, 131 I, 131 In, 90 Y i<186>Re. Konjugati antitela i citotoksičnog agensa proizvode se primenom različitih bifunkcionalnih protein-kuplujućih agenasa, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridiiditiol)-propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat-HCL), aktivni estri (kao što je, di-sukcinimidil-suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil) heksan-diamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazo-niumbenzoil)-etilen-diamin), di-izocijanati (kao što je toluen 2,6-di-izocijanat) i bis-aktivna fluoridna jedinjenja (kao što je l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Mogu se primeniti konjugati antitela sa jednim ili više niskomolekulskih toksina, kao što su kalihemicin, majtanzinoidi, trihoten i CC1065, kao i derivati ovih toksina.
[0102]U nekim oblicima izvođenja, antitelo primenjeno u kontekstu pronalaska, sadrži Fc regione antitela poreklom od čoveka, koji su modifikovani tako da pojačaju efektorsku funkciju, na primer antigen-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovo se postiže uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc region antitela. Na primer, moguće je uvesti jedan ili više cisteinskih ostataka u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu, a time se poboljšava citotoksičnost posredovana komplementom i citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) (Caron i sar., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922). Homodimerna antititela sa poboljšanom antitumorskom aktivnošću mogu se takođe dobiti primenom heterobifunkcionalni unakrsnih veznika, kao što je opusano u Wolff i sar., 1993, Cancer Researh 53:2560-2565. Alternativno, moguće je proizvesti antitelo koje poseduje dva Fc regiona (Stevenson i sar., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).
IV. Pretraživanje lekova
[0103]Predmetna prijava opisuje testove za pretraživanje lekova (na primer, lekova sa antikancerskom aktivnošću). Postupci pretraživanja zasnivaju se na markerima kancerskih matičnih ćelija (na primer, CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP i drugi proteine iz Tabele 1) identifikovane primenom postupaka saglasnih predmentoj prijavi. Na primer, predmetna prijava opisuje postupke trijažiranja jedinjenja koji menjaju (na primer, povećavaju ili smanjuju) ekspresiju ili aktivnost CXCR1 ili FBX021. Jedinjenja-kandidati mogu biti antisens agensi ili siRNA agensi (na primer, oligonukleotidi) usmereni protiv kancerskih markera. Jedinjenj a-kandidati mogu biti i antitela koja specifično vezuju markere kancerskih matičnih ćelija. Biblioteke jedinjenja malih molekula mogu se trijažirati primenom postupkaka koji su ovde opisani.
[0104]U jednom postupku pretraživanja, jedinjenj a-kandidati se procenjuju na osnovu sposobnosti da izmene ekspresiju markera kancerskih matičnih ćelija, izlaganjem ćelija koje eksprimiraju markere kancerskih matičnih ćelija tim jedinjenj ima i testiranjem uticaja koje jedinjenje ostvaruje na ekspresiju. Efekat jedinjenja-kandidata na ekspresiju gena markera kancera može se ispitati merenjem nivoa iRNK za taj marker u ćeliji. Ekspresija iRNK može se detektovati nekim pogodnim postupkom. Efekat jedinjenja-kandidata na ekspresiju gena koji kodiraju markere kancera može se testirati merenjem nivoa polipeptida koji su kodirani tim genima. Nivo eksprimiranih polipeptida može se odrediti primenom pogodnih postupaka, uključujući, bez ograničenja, postupke koji su ovde opisani. U nekim slučajevima, detektuju se i druge promene funkcionisanja ćelija (na primer, apoptoza).
[0105]Konkretno, predmetna prijava opisuje postupke pretraživanja u cilju identifikacije modulatora, to jest, kandidata ili test-jedinjenja ili agenasa (na primer, proteina, peptida, peptidomimetika, peptoida, malih molekula ili drugih lekova), koji se vezuju za ili menjaju signalizaciju ili funkcionisanje markera kancerskih ćelija, saglasno pronalasku i koji ispoljavaju inhbitorni (ili stimulatorni) efekat na ekspresiju markera kancerske matične ćelije ili na njegovu aktivnost ili ispoljavaju stimulatorni uticaj na ekspresiju ili aktivnost supstrata kancerskog markera. Ovako identifikovana jedinjenja mogu se primeniti za modulaciju aktivnosti proizvoda ciljnih gena (na primer, gena za markere kancerskih matičnih ćelija, kao što CXCR1 ili FBX021), direktno ili indirektno u terapeutskom protokolu, za razrađivanje biološke funkcije proizvoda ciiljnog gena ili za identifikovanje jedinjenja koja ugrožavaju normalne interakcije ciljnog gena. Jedinjenja koja inhibiraju aktivnost ili ekspresiju kancerskih markera korisna su tretmanu proliferativnih poremećaja, na primer, kancera, posebno metastatskog kancera ili za eliminaciju ili kontrolu tumorskih matičnih ćelija ili u prevenciji ili redukciji rizika od kancera.
[0106]Prijava opisuje testove za pretraživanje kandidata ili test-jedinjenja koja su supstrati proteina, polipetida ili biološki aktivnih delova markera kancera. Prijava takođe opisuje testove za pretraživanje kandidata ili test-jedinjenja koja vezuju ili modulišu aktivnost proteina, polipeptida ili biološki aktivnih delova markera kancera.
[0107]Test-jedinjenja se mogu dobiti primenom brojnih postupaka kombinatornih bilbioteka poznatih u stanju tehnike, uključujući, biološke biblioteke; peptoidne biblioteke (biblioteke molekula koji imaju funkcionalna svojstva peptida, ali sa novom, ne-peptidnom osovinom koja je otporna na enzimsku degradaciju, ali koja uprkos tome zadržava biološku aktivnost; videti, na primer, Zuckennann i sar., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]); prostorno pristupačne bibioteke paralelne čvrste i tečne fazne; sintetski postupci biblioteka koji zahtevaju dekonvulziju; i sintetske biblioteke kod kojih se selekcija odvija putem afinitetne hromatografije. Za primenu sa peptidnim bibliotekama poželjni su pristupi biološke biblioteke i peptoidne biblioteke, dok su preostala četiri postupka primenljiva na peptidne, ne-peptidne oligomerne i nisko-molekulske biblioteke jedinjenja (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
[0108]Primeri postupaka sinteze molekulskih biblioteka mogu se naći u stanju tehnike, na primer, u: DeWitt i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]; Erb i sar., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]; Zuckermann i sar., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho i sar., Science 261:1303 [1993]; Carrell i sar., Angevv. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell i sar., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; i Gallop i sar., J. Med. Chem. 37:1233 [1994].
[0109]Biblioteke jedinjenja mogu biti prezentovane u rastvoru (na primer, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), ili na zrncima (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), čipovima (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bakterijama ili sporama (U.S. Patent No. 5,223,409), plazmidima (Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992]) ili na fagima (Scott i Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cvvirla i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]).
[0110]U jednom aspektu, test je ćelijski test u kojem ćelija, koja eksprimira proteinski marker kancerske ćelije ili njegov biološki aktivan deo, stupa u kontakt sa testiranim jedinjenj em, a zatim se određuje sposobnost testiranog jedinjenja da moduliše aktivnost markera kancera. Sposobnost testiranog jedinjenja da moduliše aktivnost marketa kancerske matične ćelije može se odrediti praćenjem, na primer, promena enzimske aktivnosti. Ćelija može biti neka ćelija sisarskog porekla.
[0111]Može se odrediti sposobnost testiranog jedinjenja da moduliše vezivanje kancerskog markera kancera za neki molekul, vezivanjem za supstrat tog kancerskog markera. To se postiže kuplovanjem jedinjenja, na primer, supstrata sa radioizotopom ili enzimatskim obeleživačem, tako da se vezivanje molekula, na primer, supstrata za kancerski marker može odrediti detektovanjem obeleženog molekula, na primer supstrata u kompleks.
[0112]Alternativno, marker kancerske matične ćelije se kupluje za radioizotop ili neki enzimatski obeleživač, kako bi se pratila sposobnost testiranog jedinjenja da moduliše vezivanje kancerskog markera za supstrat kancerskog markera. Molekuli (na primer, supstrati) mogu se obeležiti pomoću 1251,<35>S<14>C ili<3>H, direktno ili indirektno, a radioizotop se može detektovati direktnim brojanjem radioemisije ili scintilacionim brojanjem. Alternativno, jedinjenja se mogu enzimski obeležiti, na primer, vezivanjem enzima peroksidaza rena, alkalna fosfataza ili luciferaza, a enzimatski obeleživač se može detektovati merenjem konverzije odgovarajućeg supstrata u proizvod.
[0113]Moguće je proceniti sposobnost jedinjenja (na primer, supstrata markera kancerske matične ćelije) da stupi u interakciju sa markerom kancerske matične ćelije, bilo da su učesnici interakcije obeleženi ili neobeleženi. Na primer, mikrofiziometar se može upotrebiti za detekciju interakcije jedinjenja sa kancerskim markerom, bez obeležavanja jedinjenja ili kancerskog markera (McConnell i sar., Science 257:1906-1912 [1992]). U značenju koje je ovde primenjeno, "mikrofiziometar" (na primer, Cvtosensor) je analitički instrument koji pomoću svetlosnog potenciometarskog senzora (LAPS), meri brzinu kojom ćelija acidifikuje svoje okruženje. Promene brzine acidifikacije koriste se kao indikator interakcije između jedinjenja i kancerskog markera.
[0114]U narednom aspektu, obezbeđen je ne-ćelijski test, u kojem se protein kancerskog markera ili njegov biološki aktivan deo dovodi u kontakt sa testiranim jedinjenjem, a zatim se procenjuje sposobnost testiranog jedinjenja da se veže za protein markera kancerske matične ćelije ili njegov biološki aktivan deo. Biološki aktivni delovi kancerskih marker proteina koji se primenjuju u testovima saglasno ovom pronalasku obuhvataju fragmente koji učestvuju u interakciji sa supstratima ili sa drugim proteinima, na primer, fragmenti sa visokom površinskom verovatnoćom.
[0115]Testovi bez ćelija uključuju pripremanje reakcione smeše proteina ciljnog gena i testiranog jedinjenja, pod uslovima i u vremenu koje je dovoljno da te dve komponente stupe u interakciju i da se vežu u komplekse, koje se zatim mogu izolovati i detektovati.
[0116]Moguće je detektovati interakciju između dva molekula, primenom fluorescentnog transfera energije (FRET) (videti, na primer, Lakovvicz i sar., U.S. Patent No. 5,631,169; Stavrianopoulos i sar., U.S. Patent No. 4,968,103). Fluorofora za obeležavanje bira se tako da emitovana energija prvog molekula donora bude apsorbovana od strane fluorescentenog obeleživača na drugom "akceptorskom" molekulu, koji tada počinje da fluorescira usled apsorbovane energije.
[0117]Alternativno, "donorski" molekul proteina može iskoristiti prirodnu fluorescentnu energiju triptofanskih ostatataka. Biraju se oni obeleživači koji emituju različite talasne dužine svetlosti, tako da se obeleživač "akceptorskog" molekula razlikuje od onog kod "donora". Imajući u vidu da efikasnost energetskog transfera između dva obeleživača zavisi od međusobne udaljenost ovih molekula, moguće je odrediti prostorne odnose između molekula. Kada se vezivanje odvija između molekula, trebalo bi da je fluorescentna emisija obeleživača "akceptorskog" molekula u testu maksimalna. FRET posredovano vezivanje može se izmereti standardnom fluorometetrijskom detekcijom, koja je poznata u stanju tehnike (na primer, pomoću fiuoreometra).
[0118]U narednom aspektu pronalaska, sposobnost proteina markera kancerskih matičnih ćelija da se vežu za ciljni molekul može se odrediti analizom biomolekulskih interakcija u realnom vremenu (real-time Biomolecular Interaction Analvsis (BIA)) (videti, na primer, Sjolander i Urbaniczkv, Anal. Chem. 63:2338-2345 [1991] i Szabo i sar., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705
[1995]). "Surface plasmon resonance" ili "BIA" detects biospecific interactions in real time, without labeling any of the interactants (na primer, BlAcore). Promena mase na vezujućoj površini (što ukazuje na vezivanje) rezultira promenama refraktivnog indeksa svetlosti u blizini površine (optički fenomen površinske plazmon rezonance (SPR)), što rezultira merljivim signalom koji se može koristiti kao indikacija realnih reakcija između bioloških molekula.
[0119]Proizvod ciljnog gena ili testirana supstanca mogu se ugraditi na čvrstu podlogu. Kompleksi proizvoda ciljnog gena/test-jedinjenja ugrađeni na čvrstu podlogu mogu se detektovati na završetku reakcije. Proizvod ciljnog gena može se ugraditi na čvrstu površinu, a test-jedinjenje (koje nije ugrađeno) može se obeležiti, direktno ili indirektno, nekim detektabilnim obeleživačem, kao što je već pomenuto.
[0120]Nekada je poželjno da se markeri kancerskih ćelija, anti-kancerska antitiela ili ciljni molekuli imunobilizuju na podlogu, kako bi se olakšalo razdvajanje kompleksa od ne-kompleksovanih formi jednog ili oba proteina, kao i da bi se omogućila automatizacija ovog testa. Vezivanje test-jedinjenja za proteine markere kancerskih matičnih ćelija ili interakcija proteina kancerskih markera sa ciljnim molekulom u prisustvu ili odsustvu jedinjenja-kandidata, može se izvesti u nekom sudu koji sadrži sve reaktante. Primeri ovakvih sudova obuhvataju mikrotitar ploče, epruvete i tube za mikrocentrifuge. U jednom obliku izvođenja, obezbeđen je fuzioni protein koji sadrži dodatni domen koji omogućava da se jedan ili više proteina veže za matriks. Na primer, fuzioni proteini između glutation-S-transferaze i markera kancerskih ćelija ili glutation-S-transferaze/ciljni fuzioni proteini mogu se adsorbovati na glutation Sepharose loptice (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ili glutation-derivirane mikrotitar ploče, koje se zatim meša sa test-jedinjenjem ili test-jedinjenjem i ne-adsorbovanim ciljnim proteinom ili protein markerom kancera i smeša se inkubira pod uslovima koji pogoduju složenim formacija (na primer, pri fiziološkim uslovima soli i pH). Nakon inkubacije, zrnca ili bunarići mikrotitar ploča se ispiraju da bi se uklonile nevezane komponente, odnosno imobilisani matriks u slučaju zrnaca, kompleksi se detektuju direktno ili indirektno, kao što je već opisano.
[0121] Alternativno, kompleksi se mogu disocirati od matriksa, a nivo vezivanja kancerskih markera ili njihova aktivnost može se odrediti primenom standardnih postupaka. Druge tehnike za imobilizaciju proteina kancerskih markera ili ciljnih molekula na matriks obuhvataju primenu biotina i streptavidina. Biotinilovani proteini markeri kancera ili ciljni molekuli mogu se dobiti od biotin-NHS (N-hidroksi-sukcinimid), primenom postupaka poznatih u stanju tehnike (na primer, kompleti za biotinilaciju, Pierce Chemicals, Rockford, IL) i mogu se imobilisati na bunarićima mikrotitar ploča sa 96 bunarića, sa dnom obloženim streptavidinom obloženih (Pierce Chemical).
[0122] Ovaj test se sprovodi tako što se ne-imobilisane komponente dodaju na obloženu površinu koja sadrži usidrene komponente. Nakon završetka reakcije, komponente koje nisu reagovale se uklanjaju ispiranjem, pod uslovima koji omogućavaju da formirani kompleksi ostanu vezani za podlogu. Kada su prethodno ne-imobilisane komponente obeležene, detekcija signala vezanog na podlogu ukazuje na formiranje kompleksa. Kada prethodno ne-imobilisane komponenente nisu obeležene, za detekciju kompleksa vezanog za podlogu primenjuje se pristup indirektnog obeležavanja; na primer, primenom obeleženih antitela specifičnih za imobilisane komponente (antitelo se može direktno obeležiti ili indirektno obeležiti, na primer, obeleženo anti Ig-G antitelo).
[0123] Ovaj test se izvodi pomoću antitela koji reaguju sa proteinima markerima kancerskih matičnih ćelija ili sa ciljnim molekulima, tako da ta reakcija ne utiču na vezivanje proteina markera kancerskih matičnih ćelija za njihove molekulske mete. Ovakva antitela mogu se imobilsati na dno bunarića mikrotitar ploče, pa se slobodni ciljni proteini ili proteini markeri kancera na ovaj način mogu uhvatiti konjugacijom sa antitelom. Postupci detekcije ovih kompleksa, osim onih koji su već opisani u vezi sa GST-imobilisanim kompleksima, uključuju imunodetekciju kompleksa pomoću antitela reaktivnih na proteine markere kancera ili na ciljne molekule, kao i enzimske eseje koji se zasnivaju na detekciji enzimske aktivnosti povezane sa proteinom markerom kancera ili sa ciljnim molekulom.
[0124]Alternativno, ne-ćelijski test se može sprovesti u tečnoj fazi. U ovakvom eseju, proizvodi reakcije se razdvajaju od neizregovalih komponenti, primenom jednog od brojnih standardnih postupaka, uključujući, bez ograničenja: diferencijalno centrifugiranje (videti, na primer, Rivaš i Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7 [1993]); hromatografiju (gel-filtracionu hromatografiju, jono-izmenjivačku hromatografiju); electroforezu (videti, na primer, Ausubel i sar., urednici. Current Protocols in Molecular Biologv 1999, J. Wiley: New York.); i imunoprecipitaciju (videti, na primer, Ausubel i sar., urednici. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York). Smole i hromatografski postupci poznati su stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl 699:499-525 [1997]). Fluorescentni energetski transfer može se primeniti, kao što je ovde opisano, za detekciju vezivanja bez dodatnog koraka prečišćavanja kompleksa iz rastvora.
[0125]Ovaj test može da uključi reakciju proteina markera kancerskih matičnih ćelija ili njihovih biološki aktivnih delova sa poznatim jedinjenj em, za koje se zna da vezuje za marker kancera, kako bi se formirala reakciona smeša, zatim dovođenje u kontakt reakcione smeše sa testiranim jedinjenjem i određivanje sposobnosti test-jedinjenja da stupi u interakciju sa proteinom markerom kancera, pri čemu se ta sposobnosti određuje na osnovu sposobnosti test-jedinjenja da preferencijalno veže marker kancera ili njegov biološki aktivan deo, ili da moduliše aktivnost ciljnog molekula, u poređenju sa poznatim jedinjenjem.
[0126]U meri u kojoj markeri kancerskih matičnih ćelija in vivo mogu da stupe u interakcije sa jednim ili više ćelijskih ili vanćelijskih makromolekula, kao što su proteini, oni mogu biti korisni inhibitori tih interakcija. Moguće je primeniti homogeni test za identifikaciju ovih inhibitora.
[0127]Na primer, prethodno formirani kompleksi proizvoda ciljnog gena i interaktivni ćelijski i vanćelijski vezujući proizvodi pripremaju se tako da se ili proizvod ciljnog gena ili njegov vezujući partner obeleži, dok se signal generiše samo usled formiranja kompleksa (videti, na primer, U.S. Patent No. 4,109,496 koji primenjuje ovaj pristup u imunoeseju). Dodavanje testirane supstnace koja kompetitivno istiskuje partikule iz preformiranog kompleksa, dovešće do nastanka signala čiji je intenzitet iznad pozadinske emisije. Na ovaj način identifikuju se supstance koje prekidaju vezivanje proizvoda ciljnog gena i vezujućeg partnera. Alternativno, proteini markeri kancera mogu se primeniti kao "proteini-mamci" u dvo-hibridnom testu ili tri-hibridnom testu (videti, na primer, U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos i sar., Cell 72:223-232
[1993]; Madura i sar., J. Biol. Chem. 268.12046-12054 [1993]; Bartel i sar., Biotechniques 14:920-924 [1993]; Iwabuchi i sar., Oncogene 8:1693-1696 [1993]; i Brent WO 94/10300), kako bi se identifikovali drugi proteini koji vezuju ili stupaju u interakciju sa kancerskim markerima ("vezujući proteini kancerskih markera" ili "kancer-marker bp") i koji su uključeni u aktivnost kancerskog markera. Ovi kancer marker-bp mogu biti aktivatori ili inhibitori signala tih proteina kancerskih markera ili meta, kao, na primer, nizvodni elementi signalnih puteva koji su posredovani markerima kancera.
[0128]Moguće je identifikovati modulatore ekspresije kancerskih markera. Na primer, ćelijska ili ne-ćelijska smeša dovodi se u kontakt sa jedinjenjem-kandidatom, nakon čega se određuje relativna ekspresija iRNK ili proteina markera kancera u odnosu na istu ekspresiju iRNK ili proteina markera kancera u odustvu jedinjenja-kandidata. Kada je ekspresija iRNK ili proteina markera kancera veća u prisustvu jedinjenja-kandidata nego u njegovom odustsvu, to jedinjenje se kategoriše kao stimulator iRNK ili proteina markera kancera. Suprotno tome, kada je ekspresija iRNK ili proteina manja (odnosno, statistički značajno manja), u prisustvu jedinjenja-kandidata nego u njegovom odustvu, to jedinjenje se kategoriše kao inhibitor ekspresije iRNK ili proteina markera. Nivo ekspresije iRNK ili proteina markera kancera može se odrediti postupcima koji su opisani za detekciju iRNK ili proteina.
[0129]Ova patentna prijava se dalje odnosi na nove agnese koji su otkriveni prethodno opisanim testovima pretraživanja (videti, na primer, kasnije opis terapija kancera). U skladu sa tim, unutar domena ovog pronalaska je dalje primena agensa koji je otkriven kao što je opisano (na primer, agens koji moduliše marker kancera, antisens molekul nukleinske kiseline markera kancera, siRNK molekul, specifično antitelo na marker kancera, ili vezujući protein markera kancera), u odgovarajućem animalnom modelu (kao što su oni opisani) kako bi se odredila efikasnost, toksičnost, nus-efekti ili mehanizam delovanja ili tretmana ovim agensom. Takođe, novi agensi identifikovani prethodno opisanim postupcima pretraživanja mogu biti primenjeni za terapiju kao što je opisano (na primer, za tretiranje pacijenta koji boluje od kancera).
[0130]Predmetna prijava primenjuje neadherentne mamosfere za različite postupke pretraživanja, uključujući postupke pretraživanja antagonista CXCR1 ili FBX021 signalnog puta. Ne-adherentne mamosfere su in vitro sistemi koji omogućavaju propagaciju primarnih humanih epitelnih matičnih ćelija i progenitorskih ćelija u nediferencirano stanje, na osnovu sposobnosti tih ćelija da u suspenziji proliferišu u sferične strukture. Ne-adherentne mamosfere ranije su opisane kod Dontu i sar., Genes Dev. 2003 May 15;17(10): 1253-70, i Dontu i sar., Breast Cancer Res. 2004;6(6):R605-15. Ove reference su posebno relevantne za konstrukciju i primenu ne-adherentnih mamosfera. Kao što je opisano kod Dontu i sar., mamosfere su sačinjene od matičnih i prethodničkih ćelija, koje su sposobne za samo-obnavljanje i višelinijsku diferencijaciju. Dontu i sar., takođe opisuju da mamosfere sadrže ćelije sposobne da klonski generišu složene funkcionalne duktalno-alveolarne strukture u rekonstituisanim 3-D in vitro sistemima u Matrigelu.
[0131]Mogu se primeniti naredni ilustrativni postupci pretraživanja. Za studijein vitro,ćelije je moguće tretirati adenovirusnim konstruktima koji eksprimiraju kontrolnu siRNK ili siRNK za CXCR1 ili FBX021 (m.o.i. 10 do 100), tokom 3 dana ili nisko-molekulskim jedinjenjima-kandidatima (na primer, derivatom PHA665752) (0.1-0.5 uM), tokom 3 dana i uporediti sposobnost CXCR1+ ili FBX021+ ćelija u netretiranim i tretiranim ćelijama da formiraju tumorske sfere. Uin vivostudijama, moguće je pratiti rast tumora nakon inficiranja kancerskih ćelija humanog kancera dojke lentivirusom koji eksprimira luciferazu. Kancerske ćelije koje eksprimiraju luciferazu ubrizgavaju se u tkivo dojke, čime se uspostavljaju tumori veličine oko 0.5-0.7 cm, u grupi od 5 životinja. Životinje sa uspostavljenim tumorima mogu se zatim tretirati kandidatom za inhibitora CXCR1 ili FBX021 (dnevno, i.v. 30 mg/kg/dan, tokom 7 dana) ili nosačem. Moguće je sprovesti paralelnu studiju tokom koje se životinje inficiraju adenovirusom koji eksprimira kontrolnu siRNK ili kandidata siRNK za CXCR1 ili FBX021 siRNA (m.o.i. 100 ili 500 tokom 7 dana). Životinje se zatim, posmatraju 7, 14, 21 i 28 dana kako bi se izmerila veličina tumora, a zatim se životinje žrtvuju. Veličina tumora se dalje procenjuje autopsijom, dok se deo tumora može obojiti kako bi se histološki obradio. U preostalom tkivu tumora mogu se prikupiti i sortirati ćelije i odrediti procenat CXCR1+ ili FBX021+ i CXCR1- ili FBX021-ćelija. Da bi se potvrdilo da da primena kandidata inhibitora CXCR1 ili FBX021 i kandidata siRNK za CXCR1 ili FBX021 siRNA putem adenovirusne infekcije inhibira signalnu funkciju, moguće je ispitati fosforilaciju nishodnih medijatora CXCR1 ili FBX021, kao što su Gab-1 i ERK (videti, Chistensen i sar., Cancer Res., 2003; 63:7345-7355).
V. Terapije kancera
[0132]U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje terapije kancera. Terapije mogu biti usmerene na markere kancere (na primer, uključujući, bez ograničenja, CXCR1 ili FBX021 i proteine CXCR1 ili FBX021 signalnih puteva.) Moguće je primeniti poznate i naknadno razvijene terapije. Na primer, terapeutski agensi kancerskih matičnih ćelija opisani su u U.S. Patentima 6,984,522 i 7,115,360 i aplikacijama WO03/050502, WO05/074633, i WO05/005601.
Terapija antitelima
[0133]U kontekstu predmetnog pronalaska primenjuju se antitela specifična na CXCR1. U terapijskim postupcima koji su opisani ovim pronalaskom moguće je primeniti sve pogodne klase antitela (na primer, monoklonska, poliklonska ili sintetska). U nekim oblicima izvođenja, u terapiji kancera koriste se humanizovana antitela. Postupci za humanizaciju antitela dobro su poznati u stanju tehnike (videti, na primer, U.S. Patente 6,180,370, 5,585,089, 6,054,297, i 5,565,332).
[0134]U nekim oblicima izvođenja, terapeutska antitela obuhvataju antitela specifična za markere kancerskih matičnih ćelija ovog predmetnog pronalaska, naznačena time da je antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom. U tim oblicima izvođenja proizvedeni su tumor-specifčni terapeutski agensi koji ne deluju na normalne ćelije, što umanjuje štetne efekte tradicionalne hemoterapije. U nekim aplikacijama, predviđeno je da se kao terapeutski agens koristi neki farmakološki agens koji vezuje antitelo, a koji je citotoksičan ili je na drugi način štetan za ćelije, i koji može da ubije ćeliju ili da suprimira njen rast ili da prekine ćelijsku deobu endotelnih ćelija. Predmetni pronalazak predviđa primenu svakog takvog farmakološkog agensa, ako se može konjugovati za antitelo i isporučiti u aktivnom obliku. Ilustrativni primeri antićelijskih agenasa obuhvataju hemoterapijske agense, radioizotope i citotoksine. Terapeutska antitela predmetnog pronalaska uključuju različite citotoksične entitete, uključujući, bez ograničenja, radioaktivne izotope (na primer, jod-131, jod-123, tehnicijum-99m, indijum-111, renijum-188, renijum-186, galijum-67, bakar-67, itrijum-90, jodid-125 ili astatin-211), hormone, kao što su steroidni hormoni, antimetabolite, kao što su citozini (na primer, arabinozid, fluorouracil, metotreksat ili aminopterin; antraciklin; mitomicin C), vinka alkaloide (na primer, demekolcin; etopozid; mitramicin) i antitumorske alkilirajuće agense, kao što je hlorambucil ili melfalan. Ostali oblici izvođenja mogu da obuhvate agense, kao što su koagulanti, citokini, faktori rasta, bakterijski endotoksini ili A lipid bakterijskog endotoksina. U nekim oblicima izvođenja terapeutski agensi obuhvataju toksine iz biljaka, gljiva ili bakterija, kao što su A lanci toksina, zatim proteine koji inaktirviraju ribozome, kao što su a-sarcin, aspergilin, restriktocin. ribonukleaze, toksin diferije ili egzotoksin pseudomonasa, da spomeno samo neke primere. U nekim oblicima izvođenja, koristi se deglikolizovani A lanac ricina.
[0135]U svakom slučaju, pretpostavljeno je da pomenuti agensi mogu, ako je potrebno, da se uspešno konjuguju za antitelo, na načini koji će omogućiti pravilno usmeravanje, internalizaciju, oslobađanje ili prezentaciju antitela krvnim elementima na ciljnom mestu, primenom konjugacionih postupaka poznatih u stanju tehnike (videti, na primer, Ghose i sar., Methods Enzvmol., 93:280 [1983]).
[0136]U nekim oblicima izvođenja pronalazak obezbeđuje imunotoksine koji deluju na markere kancerskih matičnih ćelija predmetnog pronalaska. Imunotoksini su konjugati specifičnih ciljnih agenasa, najčešće antitela ili njihovih fragmenta i citotoksičnog agensa, kao što deo molekula toksina. Usmeravajući agens usmerava toksin samo na one ćelije koje ispoljavaju ciljni protein i tako ih selektivno ubija. U nekim oblicima izvođenja, terapeutska antitela koriste unakrsne veznike koji im povećavaju stabilnostin vivo(Thorpe i sar., Cancer Res., 48:6396 [1988]).
[0137]U nekim oblicima izvođenja, naročito onima koji uključuju solidne tumore, dizajniraju se antitela koja ostvaruju citotoksičan ili destruktivan uticaj na krvne sudove tumora, tako što suprimiraju rast ili deobu u endotelnim ćelijama krvnih sudova. Takvo delovanje izaziva kolaps krvnih sudova unutar tumora i tako lišava tumorske ćelije, naročito one koje su udaljene od krvnih sudova, kiseonika i hranljivih sastojaka, što posledično izaziva ćelijsku smrt i nekrozu tumora.
[0138]U nekim oblicima izvođenja, terapeutici koji se zasnivaju na antitelina formulišu se u vidu farmaceutskih kompozicija kao što će biti kasnije opisano. U nekim oblicima izvođenja, primena kompozicije antitela predmetnog pronalaska kod subjekta dovodi do merljivog smanjenja kancera (na primer, smanjenja ili eliminacije tumora).
VI. Terapeutske kompozicije i njihova administracija
[0139]Farmaceutska kompozicija koja sadrži regulatore tumorogeneze saglasno predmetnom pronalasku može se administrirati na bilo koji efikasan način. Na primer, moguće je administrirati antagonistu IL8-CXCR1 signalnog puta ili neki drugi terapeutski agens koji deluje kao antagonista proteina u signalnoj transdukciji/reaktivnom putu IL8-CXCR1. U nekim oblicima izvođenja pronalaska, terapeutski agens uključuje Repertaksin ili njegov derivat.
[0140]U nekim oblicima izvođenja, odgovarajući fiziološki rastvor koji sadrži efektivnu koncentraciju antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta, može se administrirati površinski, intraokularno, parenteralno, oralno, intranazalno, intravenski, intramuskularno, subkutano ili na neki drugi efikasan način. Konkretno, antagonost IL8-CXCR1 signalnog puta može se direktno ubrizgati iglom u ciljni kancer ili tumor (na primer, u tkivo dojke), u količini koja je dovoljna da se terapeutski utiče na ćelije tumora u ciljnom tkivu. Alternativno, kancer ili tumor prisutan u telesnim šupljinama, kao što je oko, gastrointestinalni trakt, genito-urinarni trakt (na primer, mokraćna bešika), plućni ili bronhijalni sistem i slično, može se tretirati odgovarajućom fiziološkom kompozicijom (na primer, rastvorom kao što je fiziološki rastvor ili fosfatni pufer, suspenzijom ili emulzijom, koja je sterilna), koja sadrži efektivnu koncentraciju antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta, direktnim ubrizgavanjem pomoću igle ili katetera ili na pomoću cevčice koja se postavlja u šuplji organ napadnut kancerom ili tumorom. Lociranje i navođenje igle ili kateterske cevčive u tkivo moguće je izvesti pomoću nekog uređaja za vizuelizaciju, kao što su sistemi sa X-zracima, sonogramom ili optičkim vlaknima. U narednom obliku izvođenja, odgovarajući fiziološki rastvor koji sadrži efektivnu koncentraciju antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta, može se administrirati sistemski u krv, kako bi se tretirao kancer ili tumor do kojeg se ne može direktno pristupiti ili koji je anatomski izolovan.
[0141] Ove manipulacije imaju za cilj da dovedu antagonistu IL8-CXCR1 signalnog puta u kontakt sa ciljnim tumorom, kako bi se omogućilo antagonisti da stupi u kontakt, prenese ili transfektuje u tumorske ćelije (zavisno od priorde agensa). U jednom obliku izvođenja, solidni tumori prisutni u epitelnom sloju šupljih organa mogu se tretirati infuzijom suspenzije u šuplji organ ispunjen tečnošću, ili rasprskavanjem ili isparavanjem gasa u šuplji, gasom ispunjeni organ. Stoga, tumorske ćelije (kao što su matične ćelije solidnog tumora) mogu biti prisutne između ili unutar epitelnog tkiva u površinskom sloju koji oblaže plućno bronhijalno stablo, gastrointestinalni trakt, ženske reproduktivne organe, genito-urinarni trakt, mokraćnu bešiku, žučnu kesu ili neko drugo tkivo koje se može dovesti u kontakt sa antagonistom IL8-CXCR1 signalnog puta. U narednom obliku izvođenja, solidni tumor može biti lociran u ili na površini centralnog nervnog sistema, kao što je na primer, kičmena moždina, moždinski korenovi ili mozak, tako da antagonista IL8-CXCR1 signalnog puta ubrizgan u cerebrospinalnu tečnost stupa u kontakt i prenosi ćelije solidnog tumora u taj prostor. Stručnjak u oblasti onkologije razume da se antagonist može administrirati u solidni tumor direktnim ubrizgavanjem u tumor, tako da se antagonist dovede u kontakt i da ostvari efekat sa tumorskim ćelijama unutar tumora.
[0142]Identifikovane tumorogene ćelije mogu se takođe primeniti za razvijanje anti-kancerskih antitela. Postupak se sastoji od dobijanja obogaćene populacije tumorogenih ćelija ili izolovanih tumorogenih ćelija; tretiranja populacije kako bi se sprečila replikacija ćelija (na primer, zračenjem) i primene tretiranih ćelija kod čoveka ili životinje, u količini koja je dovoljna da izazove imunski odgovor prema matičnim ćelijama solidnog tumora. Za preporuke u vezi sa efektinim dozama ćelija koje treba ubrizgati ili administrirati oralnim putem; videti U.S. Pat. Nos. 6,218,166,6,207,147, i 6,156,305. Ovaj postupak može da uključi dobijanje obogaćene populacije matičnih ćelija solidnog tumora ili izolovanih matičnih ćelija solidnog tumora; mešanje tumorskih matičnih ćelija u in vitro kulturi sa imunskim efektorskim ćelijama (saglasno imunološkim postupcima poznatim u stanju tehnike), subjekta ili životinje domaćina čije se antitelo razvija; uklanjanja imunskih efektorskih ćelija iz kulture; i transplantiranja imunskih efektorskih ćelija u domaćina, u dozi koja je dovoljna da stimuliše imunski odgovor životinje.
[0143]Saglasno predmentom pronalasku, anti-tumorogeni terapeutski agensi (na primer, antagonist 1L8-CXCR1 signalnog puta) zajedno se primenjuju sa drugim neoplastičnim terapijama. U ovom pronalasku primenu nalazi širok opseg terapeutskih agenasa. Svaki terapeutski agens koji se može zajedno primeniti sa agensom predmetnog pronalaska ili se može asocitati sa agensima predmetnog pronalaska, pogodan je za primenu u postupcima saglasno predmetnom pronalasku.
[0144]U nekim oblicima izvođenja predmetnog pronalaska predviđena je primena različitih klasa antineoplastičnih (na primer, antikancerskih) agenasa. Antikancerski agensi pogodni za primenu u predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, agense koji indukuju apopotozu, agense koji inhibiraju funkciju adenozin deaminaze, inhibiraju biosintezu pirimidina, inhibiraju biosintezu purinskog prstena, inhibiraju međukonverziju nukleotida, inhibiraju ribonukleotid reduktaze, inhibiraju sintezu timidin-monofosfata (TMP), inhibiraju redukciju dihidrofolata, inhibiraju sintezu DNK, formiraju adukte sa DNK, oštećuju DNK, inhibiraju popravke DNK, interkaliraju sa DNK, deaminiraju asparagin, inhibiraju sintezu RNK, inhibiraju sintezu proteina, inhibiraju sintezu ili funkciju mikrotubula i slično.
[0145]U nekim oblicima izvođenja, ilustrativni antikancerski agensi pogodni za primenu u kompozicijama i postupcima predmetnog pronalaska, obuhvataju, bez ograničenja: 1) alkaloide, uključujući inhibitore mikrotubula( na primer,vinkristine, vinblastin i vindezin, i td.,), stabilizatore mikrotubula( na primer,paklitaksel (TAXOL) i docetaksel, i td). i inhibitore funkcije hromatina, uključujući inhibitore topoizomeraza, kao što su epipodofilotoksine (na primer, etopozid (VP-16) i tenipozid (VM-26),/ td)i agense koji deluju na topoizomerazu I( na primer,kamptotecin i izirinotekan (CPT-11),i td) ; 2),agense koji se kovalentno vezuju za DNK (alkilirajuće agense), uključujući azotni iperit( na primer,mehloretamin, hlorambucil, ciklofosfamid, ifosfamid i busulfan (MYLERAN),i td.),nitrozouree( na primer,karmustin, lomustin i semustin i td.) i druge alkilirajuće agense( na primer,dakarbazin, hidroksimetilmelamin, tiotep i mitomicin, i td); 3) agense koji se ne-kovalentno vezuju za DNK (antitumorske antibiotike), uključujući inhibitore nukleinske kiseline( na primer,daktinomicin (aktinomicin D),/ td),antracikline (na primer, daunorubicin (daunomicin cerubidin), doksorubicin (adriamicin) i idarubicin (idamicin), i td.), antracenedioni( na primer,analozi antraciklina, kao što je mitoksantron, i td), bleomicini (BLENOXANE),/ td.i plikamicin (mitramicin),i td. ;4) antimetaboliti, uključujuću antifolate( naprimer,metotreksate, FOLEKS, i MEKŠATE,/ td.),antimetabolite purina( na primer,6-merkaptopurin (6-MP, PURINETOL), 6-tioguanin (6-TG), azatioprin, aciklovir, ganciklovir, hlorodeoksiadenozin, 2-hlorodeoksiadenozin (CdA) i 2'-deoksikoformicin (pentostatin),i td.),antagonisti pirimidina( na primer,fluoropirimidini( na primer,5-fluorouracil (ADRUCIL), 5-fluorodeoksiuridin (FdUrd)
(floksuridin))/ td.),i citozin arabinozidi( na primer,CITOSAR (ara-C) i fludarabin,/ td.) ; 5)enzimi, uključujući L-asparaginazu i hidroksi-ureu/ td. ;6) hormone, uključujući glukokortikoide, antiestrogene( na primer,tamoksifen,i td.),nesteroidne antiandrogene( na primer,flutamidi td.),i inhibitore aromataze( naprimer,anastrozol (ARTMIDEKS),/ td.) ;7) jedinjenja platine( na primer,cisplatin i karboplatin,/ td.) ;8) monoklonska antitela konjugovana sa antikancerskim lekovima, toksinima i/ili radionuklidimai td. ;9) modifikatore biološkog odgovora( na primer,interferone( na primer,IFN-a,i td.)i interleukine( na primer,IL-2,i td.), i td.) ;10) adoptivnu imunoterapiju; 11) hematopoetske faktore rasta; 12) agense koji indukuju diferencijaciju tumorskih ćelija( na primer,all-trans-retinoičnu kiselinu,i td.) ;13) postupke genske terapije 14) postupke antisens terapije; 15) tumor vakcine; 16) terapije usmerene protiv tumorskih metastaza( na primer,batimastat,i td.) ;17) inhibitore angiogeneze 18) inhibitore proteozoma( na primer,VELCADE); 19) inhibitore acetilacije i/ili metilacije( na primer,inhibitore HDAC); 20)
modulatore NF kappa B; 21) inhibitore regulatora ćelijskog ciklusa( naprimer,CDK inhibitore);
22) modulatore funkcije p53 proteina; i 23) radijaciju.
[0146] Onkolitički agensi koji se rutinski primenjuju u terapiji kancera mogu naći primenu u kompozicijama i postupcima saglasno pronalasku. Na primer, U.S. Food and Drug Administration (USFDA) vodi evidenciju o onkolitičkim agensima koji su odobreni za primenu u Sjedinjenim Državama. Međunarodne agencije analogne USFDA imaju slične evidencije. Tabela 3 predstavlja listu ilustrativnih antineoplastičnih agenasa koji su dozvoljeni za upotrebu u Sjedinjenim Državama. Stručnjaci u ovoj oblasti razumeju da "oznake proizvoda" koje su neophodne na svim odobrenim hemoterapeuticima u SAD, opisuju samo odobrenu indikaciju, daju informacije o dozi, o toksičnosti i slično, za ilustrativne agense.
[0147]Kao terapeutski agensi u predmetnom pronalasku mogu se primeniti antimikrobni terapeutski agensi. Svaki agens koji može da ubije, inhibira, ili na drugi način umanji funkciju mikroba može naći primenu, a mogu se primeniti i agensi za koje se pretpostavlja da mogu imati takve aktivnosti. Antimikrobni agensi obuhvataju, bez ograničenja, prirodne i sintetske antibiotike, antitela, inhibitorne proteine (na primer, defensine), antisens nukleinske kiseline, agense koji oštećuju membranu i slično, samostalno ili u kombinaciji. Može se primeniti svaki tip antibiotika, uključujući bez ograničenja, antibakterijske agense, antivirusne agense, antifugalne agense, i slično.
[0148]Jedinjenja (i svi drugi terapeutski agensi) povezana sa usmeravajućim agensima mogu biti sposobna da specifično utiču na funkciju određenog tipa ćelije (na primer, na tumorsku ćeliju). Načelno govoreći, terapeutsko jedinjenje koje je asocirano sa usmeravajućima agensom, deluje na neuplastične ćelije putem interakcija usmeravajućeg agensa sa nekim entitetom na površini te ćelije, a koji se zatim preuzima u ćeliju receptorom-posredovanom endocitozom.
[0149]Svaki entitet za koji se zna da se nalazi na površini ciljnih ćelija (na primer, tumorskih ćelija) može naći primenu u okviru predmetnog pronalaska. Na primer, neko antitelo usmereno protiv ovakvog entiteta može usmeriti kompozicije prema površini ćelija koje sadrže taj entitet. Alternativno, usmeravajući entitet može biti ligand usmeren prema receptom koji se nalazi na površini ćelija i obrnuto. Na sličan način se mogu primeniti vitamini da usmere terapeutike predmetnog pronalaska prema određenom tipu ćelija.
[0150]U značenju koje je ovde primenjeno, termin, "usmeravajući molekuli" označava hemijske entitete i njihove delove koji se mogu primeniti za usmeravanje terapeutskih jedinjenja prema ćelijama, tkivima i organima od interesa. U okviru predmetnog pronalaska predviđena je primena različitih tipova usmeravajućih molekula, uključujući, bez ograničenja, signalne peptide, antitela, nukleinske kiseline, toksine i slično. Usmeravajući entiteti mogu dodatno podstaći vezivanje asociranih jedinjenja (na primer, malih molekula) ili ulazak jedinjenja u ciljne ćelije, tkiva i organe. Poželjno je da se usmeravajući entiteti biraju na osnovu svoje specifičnosti, afiniteta i efikasnosti u pogledu selektivnog isporučivan]a prikačenih jedinjenja, na ciljna mesta unutar pacijenta, tkiva ili u ćeliju, uključujući specifične subćelijske lokacije i organele.
[0151]Kada je reč o administraciji svih lekova postoje brojna pitanja, a to se posebno odnosi na citotoksične lekove (na primer, antikancerskih lekova). Jedno posebno važno pitanje odnosi se na obezbeđivanje uslova da primenjeni agensi utiču samo na ciljne ćelije (na primer, kancerske ćelije), tkiva ili organe. Nespecifična ili nenameravana isporuka visoko-toksičnog agensa u netargetirano tkivo može da izazove ozbiljnu toksičnost.
[0152]Načinjeni su brojni pokušaji da se dizajniraju sheme isporuke lekova kojima bi se resili problemi povezani sa nespecifičnom isporukom leka.( videti, na primer,K.N. Svrigos i A.A. Epenetos Anticancer Res., 19:606-614 (1999); Y.J. Park i sar., J. Controlled Release, 78:67-79
(2002); RV.J. Chari, Adv. Drug Deliv. Rev., 31:89-104 (1998); i D. Putnam i J. Kopecek, Adv. Polvmer Sci., 122:55-123 (1995)). Za ublažavanje uzgredne toksičnosti povezane sa administracijom lekova često se koristi pristup konjugovanja usmeravajućih entiteta, kao što su antitela i peptidni ligand (na primer, RDG za endotelne ćelije).
[0153]Jedinjenja i antikancerski agensi mogu se administrirati u nekom sterilnom, biokompatibilnom farmaceutskom nosaču, uključujući, bez ograničenja, fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu i vodu. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati jedan agens (na primer, antitelo). Saglasno predmetnom pronalasku, farmaceutske kompozicije mogu sadržati smešu najmanje dva agensa( na primer,antitelo i jedan ili više konvencionalnih antikancerskih agenasa). Dalje, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska sadrže najmanje dva agensa koja se administriraju pacijentu pod jednim ili više navedenih uslova: u različitim periodima, u različitom trajanju, u različitim koncentracijama, različitim rutama primene i td. U nekim oblicima izvođenja, antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta se administrira pre drugog antikancerskog agensa,na primer,0.5, 1, 2 3, 4, 5, 10, 12 ili 18 sati 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 dana, 1, 2, 3, ili 4 nedelje pre administracije antikancerskog agensa. U nekim oblicima izvođenja, antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta administrira se nakon drugog antikancerskog agensa, na primer, 0.5, 1, 2 3, 4, 5, 10, 12, ili 18 sati, 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 dana, 1,2,3, ili 4 nedelje nakon administracije antikancerskog agensa. U nekim oblicima izvođenja, antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta i drugi antikancerski agens se administriraju istovremeno, ali pri različitim rasporedima, na primer, antagonist IL8- CXCR1 signalnog puta se dnevno, dok se drugi antikancerski agens administrira jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom u četiri nedelje. U drugim oblicima izvođenja, antagonist IL8- CXCR1 signalnog puta se administrira jednom nedeljno, dok se drugi antikancerski agens administrira dnevno, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom u četiri nedelje.
[0154] Zavisno od uslova tretiranja, poželjni oblici izvođenja predmetnih farmaceutskih kompozicija formulišu se i administriraju sistemski ili lokalno. Postupci formulacije i administracije mogu se pronaći u poslednjem izdanju "Remington's Pharmaceutical Sciences"
(Mack Publishing Co, Easton Pa.). Pogodne rute mogu, na primer, obuhvatiti oralnu ili transmukoznu administraciju, kao i parenteralnu isporuku (na primer, intramuskularnu, subkutanu, intramedulamu, intratekalnu, intraventrikularnu, intravensku, intraperitonealnu, ili intranazalnu administraciju).
[0155] Predmenti pronalazak predviđa administraciju terapeutskog jedinjenja i u nekim oblicima izvođenja, jednog ili više antikancerskih agenasa, saglasno sa farmaceutski prihvatljivim postupcima isporuke leka i pripreme. Na primer, terapeutska jedinjenja i pogodni antikancerski agens mogu se administrirati subjektu intravenski u farmaceutski prihvatljivom nosaču, kao što je fiziološki rastvor. Predviđeni su standardni postupci za unutarćelijsku isporuku farmaceutskih agenasa( na primer,putem lipozoma). Ovakvi postupci dobro su poznati prosečnom stručnjaku u oblasti.
[0156] U nekim oblicima izvođenja, formulacije predmetnog pronalaska su pogodne za parenteralnu administraciju (na primer, intravensku, subkutanu, intramuskularnu, intramedulamu, i intraperitonealnu). Terapeutska ko-administracija nekih predviđenih antikancerskih agenasa( na primer,terapeutskih polipeptida) može se takođe postići primenom reagenasa i postupaka genske terapije.
[0157] U nekim oblicima izvođenja predmetnog pronalaska, terapeutska jedinjenja se administriraju subjektu u kombinaciji sa jednim ili više konvencionalnih antikancerskih agenasa( na primer,nukleotidnim sekvencama, lekovima, hormonima i td) ili u farmaceutskim kompozicijama u kojima su komponente opciono kombinovane sa pomoćnim materijama ili drugim farmaceutski prihvatljivim nosačima. U poželjnim oblicima izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosači su biološki inertni. U poželjnim oblicima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska se formulišu pomoću farmaceutski prihvatljivih nosača dobro poznatih u stanju tehnike, u dozama pogodnim za oralnu administraciju. Ovakvi nosači omogućavaju formulisanje farmaceutskih kompozicija u vidu tableta, pilula, kapsula, dražeja, tečnosti, gelova, sirupa, emulzija, rastvora, suspenzija i slično, za odgovarajuću oralnu ili nazalnu ingestiju od strane subjekta koji se tretira.
[0158]Farmaceutski preparati za oralnu primenu mogu se dobiti mešanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim pomoćnim materijama, opcionim mlevenjem tako dobijene smeše u granule, nakon dodavanja poželjnih pomoćnih materija kako bi se dobilo jezgro tablete ili dražeje. Pogodne pomoćne materije su ugljeno-hidratni ili proteinski agensi za dopunjavanje, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; škrob iz kukuruza, pšenice, pirinča, krompira i td; celuloza, kao što je metil celuloza, hidroksipropilmetilceluloza, ili natrijum karboksi-metilceluloza; gume, uključujući arabiku i tragakant; i proteine, kao što su želatin i kolagen. Kada je potrebnom mogu se dodati agensi za dezintegrisanje ili solubilizaciju, kao što su unakrno vezani polivinil pirolidon, agar, algininska kiselina ili njene soli, kao što je natrijum-alginat.
[0159]U poželjnim oblicima izvođenja, režimi doziranja i administracije uobličavaju se od strane kliničara ili druge osobe koja je stručna u farmakologiji, a na osnovu dobro poznatih farmakoloških i terapeutskih razmatranja, uključujući, bez ograničenja, željeni nivo terapeutskog efekta, i praktičan nivo terapeutskog efekta koji se želi postići. Načelno se savetuje da se prate poznati farmakološki principi administracije hemoterapeutskih agenasa (na primer, poželjno je da se doza ne menja više od 50 % u jednom trenutku i u razmaku od perioda koji nije kraći od 3-4 polu-života agensa). Ako kompozicija ispoljava relativno mali rizik od toksičnosti, i ako je potrebna njena maksimalna efikasnost( na primer,destrukcija kancerskih ćelija), nije neobično primeniti i doze veće od prosečnih željenih doza. Ovakav pristup u doziranju obično se označava kao strategija "maksimalne doze". U nekim oblicima izvođenja, antagonist IL8-CXCR1 signalnog puta administrira se subjektu u dozi od 1-40 mg na dan (na primer, tokom 4-6 nedelja). U nekim oblicima izvođenja, subjektu se administrira početna doza od oko 15-70 mg antagoniste IL8-CXCR1 signalnog puta. U nekim oblicima izvođenja, subjektu se administrira početna doza od 35-45 mg antagoniste TL8-CXCR1 signalnog puta (na primer, subkutano), a zatim dnevne doze od oko 10 mg (na primer, subkutano) tokom 4-6 nedelja.
[0160]Dodatna razmatranja u vezi sa doziranjem odnose se na odgovarajuće nivoe usmeravajućih agenasa koji se administriraju, akumulaciju tih agenasa i potencijalnu toksičnost, stimulaciju ili rezistenciju, nedostatak efikasnosti i opisivanje opsega terapeutskog indeksa tog agensa.
[0161] U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak predviđa primenu rutinskih postupaka titriranja administracije agensa. Uobičajena strategija za administraciju jeste određivanje razumnog ciljnog nivoa agensa kod subjekta. U nekim oblicima izvođenja, nivoi agensa mere se u plazmi subjekta. Na osnovu toga se dizajniraju odgovorajući dozni nivoi i frekvencije kako bi se postiglo željeni stabilni nivo tog agensa. Prate se stvarni ili prosečni nivoi agensa kod subjekta( na primer,na sat, dnevnom nedeljno i td), na osnovu čega se mogu podešavati dozni nivoi i frekvencije sa ciljem održanja željenog nivoa agensa. Naravno, na izabrane ciljne nivoe agensa, pa time i na biranje doze i frekvencije mogu potencijalno uticati farmakokinetika i farmakodinamika( na primer,bioaloška dostupnost, izbacivanje ili biolakumulacija, biološka distribucija, interakcije sa lekovima i td) određenog agensa ili agensa koji se administrira.
[0162] Postupci određivanja nivoa doze tipično se zasnivaju na uspostvaljanju realnog terapeutskog cilja koji se definiše u smislu opsega (ili terapeutskog opsega) tog agensa kod subjekta. Načelno, donji nivo terapeutskog opsega ugrubo je jednak koncentraciji tog agensa koja obezbeđuje postizanje 50 % maksimalno mogućeg terapeutskog efekta. Gornji limit terapeutskog opsega se najčešće određuje na osnovu toksičnosti agensa, a ne na osnovu njegove efikasnosti. Predmetni pronalazak predviđa da će gornji limit terapeutskog opsega za određeni agens biti koncentracija pri kojoj manje od 5 ili 10% subjekata oseća sporedne toksične efekte. U nekim oblicima izvođenja, gornji limit terapeutskog opsega je maksimalno dva puta veći od donjeg limita. Stručnjak u stanju tehnike razume da ova razmatranja veoma variraju i da su do izvesne mere individualna( na primer,zavisno od genetičke predispozicije, imunoloških razmatranja, tolerancije, rezistencije i slično). Stoga u nekim oblicima izvođenja, efektivni ciljni nivoi doza konkretnog agensa mogu biti 1, ... 5,... 10, ... 15, ... 20, ... 50,... 75, ... 100,... 200,... X %, veći od optimalnog kod nekog drugog subjekta. Suprotno tome, neki subjekti mogu imati značajne sporedne efekte i toksičnost usled drugih zdravstvenih razloga pri doznim nivoima i frekvencijama daleko manjim od (1, ... 5, ... 10,... 15,... 20,... 50, ... 75,... 100,... 200,... X %) od onih koji tipično proizvode optimalne terapeutske efekte koj nekih ili kod većine subjekata. Kada nema dovoljno specifičnih informacija, ciljni nivoi administracije se najčešće podešavaju na sredinu terapeutskog opsega.
[0163] U poželjnim oblicima izvođenja, kliničar racionalno dizajnira individualizovani dozni režim, na osnovu poznatih farmakoloških principa i jednačina. Načelno govoreći, kliničar dizajnira individualizovan dozni režim na osnovu poznavanja različitih farmakoloških i farmakokinetičkih svojstava izabranog agensa, uključujući, bez ograničenja, F (frakcionu biološku dostupnost doze), Cp (koncentraciju u plazmi), CL (izlučivanje/brzinu izlučivanja), Vss (zapreminu distribucije leka pri stabilnim uslovima), Css (koncentraciju pri stabilnim uslovima) tl/2 (polu-život leka), kao i informacije o brzini apsorpcije i distribucije agensa. Stručnjak u oblasti može da se pozove na brojne poznate farmakološke tekstove( na primer,Goodman and Gilman's, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10<th>ed., Hardman i sar., ur., 2001) za dalja objašnjenja varijabli i za potpune jednačine koje ilustruju izračunavanje individualnih doznih režima. Stručnjak u oblasti može da predvidi potencijalne fluktuacije ovih varijabli kod nekog pojedinačnog subjekta. Na primer, standardna devijacija uočenih vrednosti za F, CL i Vss tipično je oko 20 %, 50 % i 30 %. Praktičan efekat potencijalno široko varirajućih parametara kod pojedinačnog subjekta je da će tokom 95 % vremena nivo Css dostignut kod jednog subjekat biti između 35 i 270 % u odnosu na ciljni nivo. Za lekove sa niskim terapeutskim indeksom, ovo bi bio nepoželjno širok opseg. Osobe stručne u oblasti znaju međutim, da jednom kada se izmeri nivo Cp (koncentracija u plazmi), moguće je direktno proceniti vrednosti F, CL i Vss. To omogućava kliničaru da efekasno podesi dozni režim kod pojedinačnog subjekta.
[0164] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak predviđa primenu postupaka za kontinualno terapeutsko praćenje leka, kako se dodatno podesila individualno doziranje i režimi isporuke. Na primer, u jednom obliku izvođenja, primnjuje se vrednost Css za dodatno procenjivanje CL/F i podešavanje održavanje doze kako bi se postigali ciljni nivoi leka, primenom poznatih farmakoloških principa i jednačina. Terapeutsko praćenje može se sprovesti u svakom trenutku tokom doznog rasporeda. U poželjnim oblicima izvođenja, praćenje se sprovodi u nekoliko vremenskih tačaka tokom doziranja i naročito onda kada se primenjuju isprekidane doze. Na primer, praćenje se može sprovesti neposredno nakon, na primer, jedne sekunde, nekoliko sekundi, minuta, sati, dana nedelja, meseci i td, nakon administracije agensa, nezavisno od primenjene dozne tehnologije (na primer, isprekidano doziranje, početno doziranje, održavanje, nasumično doziranje, ili neki drugi dozni postupak). Međutim, stručnjaku u ovoj oblasti biće poznato da ukoliko se uzorak uzme neposredno nakon administracije agensa, promene efekata agensa i njegova dinamika neće biti lako uočljivi, jer promene koncentracije agensa u plazmi mogu zahtevati neko vreme (na primer, zbog spore distribucije ili drugih farmakodinamičkih faktora). U skladu sa tim, uzorci uzeti od subjekta neposredno nakon administracije agensa mogu imati ograničen ili mali značaj.
[0165]Primarni cilj prikupljanja bioloških uzoraka od subjekta tokom predviđenog stabilnog ciljnog nivoa administracije jeste da se modifikuje individualan dozni režim na osnovu izračunavanja ponovo utvrđenih vrednosti CL/F tog agensa. Stručnjaku u oblasti će biti poznato da rane postapsorptivne koncentracije leka ne reflektuju u potpunosti kinetiku izlučivanja leka. Rane postapsorptivne koncentracije leka uslovljene su pre svega, brzinom apsorpcije agensa, centralnim, a ne stabilnilnim nivoom, zapreminom agensa i brzinom distribucije. Svaka od navedenih farmakokintečkih karakteristika ima ograničen značaj pri izračunavanju dugotrajnih doznih režima za održavanje.
[0166]Saglasno tome, u nekim oblicima izvođenja, kada je cilj terapeutska, dugotrajno održiva doza, biološki uzorci se uzorkuju od subjekta, ćelija ili tkiva od interesa dosta nakon administracije prethodne doze, a najpoželjnije je neposredno pre administracije naredne doze.
[0167]U narednim oblicima izvođenja, u slučaju kada se terapeutski agens gotovo u potpunosti eliminiše iz subjekta u intervalu između administracije dve doze, predmetni pronalazak predviđa uzorkovanje bioloških uzoraka od subjekta u različitim vremenskim tačkama nakon prethodne administracije, a najpoželjnije odmah nakon što je doza administrirana.
VII.Repertaksin i drugi niskomolekulski inhibitirori CXCR1
[0168]Saglasno predmetnom pronalasku moguće je primeniti niskomolekulske inhibitore CXCR1. Jedan ilistrativan agens je repartaksin. U nekim oblicima izvođenja, doza repertaksina in vivo iznosi između 3 i 60 mg po kilogramu (na primer, 3 ...30 ... 50 ... 60 mg/kg). U jednom konkretnom obliku izvođenja, doza repartaksina je oko 30 mg po kilograma. Hemijska formula repertaksina je prikazan ispod:
[0169]U nekim oblicima izvođenja, primenjuju se derivati repertaksina. Drugi niskomolekulski antagonisti CXCR1 obuhvataju SB265610 (Glaxo SmithKline Beecham; Benson i sar., 2000, 151:196-197) i SCH 527123 (2-hidroksi-N,N-dimetil-3-(2-[[(R)-l-(5-metilfuran-2-il)propil]-amino]-3,4-dioksociklobut-l-enilamino}benzamid (SCH 527123), oralni biološki dostupan antagonist CXCR2/CXCR1 receptora (Schering Plough)). Ostale niskomolekulske inhibitore moguće je identifikovati postupcima pretraživanja koji su prethodno opisani.
PRIMERI
[0170] Naredni primeri su dati u cilju demonstriranja i dodatnog ilustrovanja nekih poželjnih oblika izvođenja i aspekata predmetnog pronalaska i ne mogu se tumačiti da ga na bilo koji način ograničavaju.
PRIMER 1
Prisustvo CXCR1 odlikuje kancerske matične ćelije
[0171] Ovaj primer opisuje identifikaciju CXCR1, kao i drugih proteina (na primer, FBX021), kao markera kancerskih matičnih ćelija.
[0172]Ćelijska kultura.Ćelijske linije dojke (BCL) nabavljene su od ATCC ("http://www.", iza čega sledi "lgcpromochem- atcc.com/common/catalog/cellBiology/ cellBiologyIndex.cfm") ili potiču iz kolekcija razvijenih u laboratorij ama dr. S. Ethier (sada dostupne na "http://www.", iza čega sledi "asterand.com/asterand/BIOREPOSITORY/hbreastcancercell- lines.aspx, SUM44, SUM52, SUM149, SUM159, SUM185, SUM190, SUM225, SUM229"), V.J. Mobusa (BrCa-MZ-01) i V. Catrosa (S68). Sve BCL linije su dobijene iz karcinoma, sa izuzetkom MCF10A, koja je dobijena iz fibrocistične bolesti, kao i HMEC-derivirane ćelijske linije 184A1, koja je uspostavljena od normalnog tkiva dojke. Ove ćelijske linije gajene u preporučenim uslovima. Svi eksperimenti su izvedeni na subkonfluentnim kulturama u eksponencijalnoj fazi rasta.
[0173]ALDEFLUOR test i separacija ALDH- pozitivne populacije ćelije primenom FACS analize.ALDH aktivnost testirana je u 33 BCL linija koje reprezentuju osnovne molekulske podtipove humanog kancera dojke. Komplet za ALDEFLUOR testiranje (StemCell technologies, Durham, NC, USA) primenjen je za izolovanje populacije sa visokom enzimskom aktivnošću ALDH (17). Ćelije dobijene iz subkonflunetnih ćelijskih linija nakon tripsinizacije ili od sveže disociranih ksenografta, suspendovane su u puferu za ALDEFLUOR test, koji je sadržao supstrat ALDH (BAAA, 1 umol/1 per 1><10<6>ćelija) i inkubirane su 40 minuta na 37°C. U svakom eksperimentu, uzorak ćelija obojen pod identičnim uslovima, u prisustvu 50 mmol/L dietilaminobenzaldehida (DEAB), koji specifično inhibira ALDH, služio je kao negativna kontrola. Sortiranje protočnom citometrijom sprovedeno je na FACStarPLUS (Becton Dickinson). ALDEFLUOR fluorescencija je ekscitirana na 488 nm i detektovana pomoću standardna fluorescein izotiocijanata (FITC) i 530/30 propusnog filtera. Za ksenotransplantirane tumore, inkubacija u prisustvu anti-H2Kd antitela (BD biosciences, 1/200,20 min on ice), praćena inkubacijom sa sekundarnim antitelom koje je obeleženo fikoeritrinom (Jackson labs, 1/250,20 min na ledu), primenjena je za eliminaciju ćelija mišjeg porekla. Sortirna kapija uspostavljena je na osnovu ćelija obojenih PI u testu vijabilnosti, ALDEFLUOR-obojenih ćelija tretiranih DEAB-om i ćelija koje su obojene samo sekundarnim antitelom. Pre profilisanja RNK profilisanja ili ubrizgavanja u NOD/SCID miševe, prečišćenost sortiranih populacija ispitana je dvojnim sortiranja 10 000 ALDEFLUOR-pozitivnih i negativnih ćelija iz BrCa-MZ-01 i SUM159 ćelijskih linija. U obe ćelijske linije, sortirane ALDEFLUOR-pozitivne populacije sadržale su više od 98 % ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija, a ALDEFLUOR-pozitivne ćelije nisu detektovane u ALDEFLUOR-negativnim populacijama. [0174JTumorigenost u NOD/ SCID miševima.Tumorigenost ALDELFUOR-pozitivnih, - negativnih i neseparisanih SUM 159, MDA-MB-453 i BrCa-MZ-01 ćelija procenjena je na NOD/SCID miševima. Masno tkivo je oslobođeno od epitela 3 nedelje pre puberteta i humanizovano ubrizgavanjem fibroblasta poreklom od čoveka (1:1 ozračeni : ne-ozračeni, 50 000 ćelija/100 ml Matrigel/masnom jastučetu), kao što je opisano (17). Životinje su eutanazirane kada su tumori dostigli oko 1.2 cm u dijametra, što je u skladu sa regulativnom za primenu kičmenjaka u istraživačke svrhe. Deo svakog masnog jastučeta je fiksiran u formalinu i uronjen u parafin za potrebe histološke analize. Drugi deo testiran je u ALDEFLUOR testu, nakon sortiranja i serijske transplantacije.
[0175]Plutajuće kulture.ALDEFLUOR-pozitivne, -negativne i neseparisane ćelije iz 184A1, SUM149 i SUM159 zasejane su kao pojedinačne ćelije na ultranisko adherirajućim sudovima (Corning, Acton, MA) i pri maloj gustini (5 000 vijabilnih ćelija/ml). Ćelije su gajene u bazalnom medijumu epitelnih ćelija dojke, bez dodatka seruma (Cambrex Bio Science, Walkerville, MD) tokom 3-7 dana, kao što je opisano (18). Kapacitet ćelija da formiraju sfere kvantifikovan je nakon tretmana različitim dozama IL8 (GenWay Biotech, San Diego, CA) koji je dodat u medijum.
[0176]Ekstrakcija RNK.Ukupna RNK je ekstrahovana iz zamrznutih ALDEFLUOR-pozitivnih i -negativnih ćelija, pomoću DNA/RNA AH Prep Maxi kompleta, saglasno uputstvima proizvođača (Qiagen, Sample and Assay technologies, The Netherlands). Za transkripcionu analizu korišćeno je osam BCL linija: 184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM149 i SUM159. Integritet RNK je proveren denaturišućom formaldehid-agaroza gel elektroforezom i mikro-analizom (Agilent Bioanalvzer, Palo Alto, CA).
[0177]Profilisanje genske ekspresije pomoću DNK mikronizova.Genska ekspresiona analiza se zasnivala na Affymetrix U133 Plus 2.0 humanom oligonukleotidnom mikronizu koji je sadržao više od 47 000 transkripata i varijanti, uključujući 38 500 dobro okarakterisanih gena čoveka. Priprema cRNK, hibridizacija, ispiranje i detekcija urađeni su prema uputstvu proizvođača ("http://www.", iza čega sledi "affymetrix.com/index.affx"). Ekspresioni podaci su analizirani postupkom RMA (Robust Multichip Average) u R, primenom Bioconductor-a i srodnih paketa (19), kao što je opisano (20,21). RMA vrši podešavanja pozadine, kvantilnu normalizaciju i sabiranje 11 oligonukleotida po genu.
[0178]Pre analize, filtriranjem podataka iz baze, uklonjeni su geni koji imaju veoma nisku ili teško merljivu ekspresiju, što je definisano nivoom ekspresije manje od 100 jedinica u svih 16 uzoraka, nakon čega je preostala grupa od 25 285 gena/EST. Primenjen je i drugi filter, koji se zasniva na veličini standardne devijacije (SD), za nenadgledane analize, čime su isključeni geni koji ispoljavaju nisku ekspresionu varijaciju tokom analiza. SD je izračunata na log2-transformisanim podacima, u kojima su najniže vrednosti najpre svedene na minimalnu vrednost od 100 jedinica, odnosno, intenzitet pozadine, nakon čega je ostala grupa od 13 550 gena/EST, sa SD većom od 0.5. Nenadgledana analiza je izvršena na 16 ALDEFLUOR-pozitivnih, -negativnih ćelija na 13 550 gena. Pre hijerarhijskog klasterovanja, filtrirani podaci su log2-transformisani i podvrgnuti analizi u Cluster programu (22), uz centriranje oko medijane na genima, Pearson-ovu korelaciju, kao meru sličnosti i centroidno klasterovanje. Rezultati su prikazani pomoću TreeView programa (22). Da bi se identifikovali i rangirali geni čija ekspresija razlikuje ALDEFLUOR-pozitivne od - negativnih populacija, primenjen je Mann-Whitney U test, na 25 285 gena/EST, a hipoteza multipnog testiranja je korigovana FDR postupkom (false discovery rate) (23). Snaga klasifikacije diskriminatora ilustrovana je klasifikacijom uzoraka hijerarhijskim klasterovanjem. Tačnost predikcije identifikovanih molekularnih signatura i validnost primenjene analize provenjena je pomoću LOOCV; uzorci su isključeni jedan po jedan i klasifikovani linearnom diskriminantnom analizom (LDA, (24) pomoću modela definisanog na ne-isključenim uzorcima.
[0179]PCR u realnom vremenu.Nakon sortiranja ALDEFLUOR-pozitivnih i ALDEFLUOR-negativnih populacija iz različitih ćelijskih linija, izolovana je ukupna RNK pomoću RNeasv Mini Kit (OJAGEN), koja je dalje korišćena za kvantitativni RT-PCR (qRT-PCR), u ABI PRISM® 7900HT detekcionom sistemu, sa blok modulom od 384 bunarića i automatskim radom (Applied Biosvstems). Prajmeri i probe za Taqman sistem izabrane su na vebsajtu Applied Biosvstems. Sekvence PCR prajmerskih parova i fluorogene probe koje su korišćene za CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 i TBP dostupne su na vebsajtu Applied Biosvstems (CXCR1 test ID: Hs_00174146_mi; FBX021 test ID: Hs_00372141_mi, NFYA test ID: Hs_00953589_mi, NOTCH2 test ID: Hs_01050719_mi, RAD51L1 test ID: Hs00172522_mi, TBP test ID: Hs_00427620_mi). Nivo relativne ekspresije iRNK za CXCR1, FBX021, NFYA, N0TCH2, RAD51L1 izračunat je u odnosu na ekspresiju TBP gena, koja je korišćena kao interni standard, za normalizovanje varijacija u kvalitetu RNK i količine ulazne cDNK, kao što je prethodno opisano (25).
[0180]Test invazije.Testovi su sprovedeni u triplikatu u "transwell" komorama sa ugradcima polikarbonatnog filtera veličine pora od 8 um za posude sa 12 bunarića (Corning, NY). Filteri su obloženi sa 30 ul ledenog 1:6 membranskog ekstrakta (Matrigel, BD-Bioscience) u DMEM/F12 inkubirani 1 sat na 37°C. U gornju komoru su dodate ćelije suspendovane u 200 jal medijuma bez seruma. Za test invazije, 5 000 ćelija je zasejano na Matrigel-obložene filtere, a u donju komoru je usuto 600 ul medijuma sa 10 % humanim serumom (Cambrex) ili sa 600 ul medijuma bez seruma, obogaćenog IL8 (100 ng/mL). Nakon 48 sati inkubacije, ćelije na donjoj strani filtera su izbrojane pod svetlosnim mikroskopom. Relativna invazija je normalizovana u odnosu na odgovarajuće neseparisane ćelijske linije gajene u prisustvu seruma.
[0181]Lentivirusna infekcija.Za transdukciju luciferaznog gena, 70 %-konfluentne kulture HCC1954, MDA-MB-453 i SUM159 inkubirane su tokom noći sa 1:3 precipitiranom smešom supernatanta lentivirusa Lenti-LUC-VSVG (Vector Ćore, Ann Arbor, MI) u medijumu za kulturu. Narednog dana ćelije su pokupljene izlaganjem tripsinu/EDTA i subkultivisane su u odnosu 1:6. Nakon jedne nedelje inkubacije, ćelije su soritrane prema ALDEFLUOR fenotipu, a ekspresija luciferaze je potvrđena u svakoj od sortiranih populacija (ALDEFLUOR-pozitivne i ALDEFLUOR-negativne), dodavanjem 2 ml D-luciferina 0.0003% (Promega, Madison, WI) u medijum kulture i brojanjem fluksa fotona na brojaču sa kamerom (Xenogen, Alameda, CA).
[0182]Intrakardijačna inokulacija.Šest nedelja stari NOD/SCID su anestezirani 2% mešavinom izofluorana u vazduhu, nakon čega je u levu komoru ubrzigano 100 000 ćelija u 100 uL sterilnog Dulbecco's PBS, bez Ca i Mg . Po tri životinje tretirane su po svakoj od tri ćelijske linije (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) i za svaku populaciju (ALDEFLUOR-pozitivne, ALDEFLUOR-negativne i nesortirane).
[0183]Bioluminescentna detekcija.Bazalna bioluminescencija je procenjena pre inokulacije i svake nedelje nakon inokulacije. Miševi su anestezirani 2 % smešom izofluorana/vazduha i data im je pojedinačna i.p. doza od 150 mg/kg D-luciferina (Promega, Madison, WI) u PBS. Životinje su zatim ponovo uvedene u anesteziju 6 minuta nakon administracije D- luciferina. Za brojanje fluksa fotona, primenjen je CCD sistem (Charged-coupled device, Xenogen, Alameda, CA) sa konusnim sistemom za isporuku izoflurana i ugrejanom površinom za održavanje telesne temperature. Rezultati su analizirani 2 do 12 minuta nakon izlaganja, pomoću "Living Image" softverskog paketa sa Xenogen sistemom za oslikavanje. Intenzitet signala je kvantifikovan kao zbir svih detektovanih fotona u istovetnom regionu od interesa koji je ručno određen tokom naknadne obrade podataka. Normalizovani fluks fotona predstavlja odnos broja fotona detektovan svake nedelje nakon inokulacije i broja fotona detektovanih pre inokulacije.
[0184]Statistička analiza.Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD iz najmanje tri ponovljena pojedinačna eksperimenta u svakoj grupi. Statistička analiza je obavljena primenom SPSS programskog paketa (verzija 10.0.5). Korelacija između grupa i molekularnih parametara je izračunata Fisher-ovim egzaktnim testom i jednofaktorskom ANO VA za nezavisne uzorke, p-vrednost manja od<*>0.05 smatrana je statistički značajnom.
[0185]Većina ćelijskih linija dojke sadrži ALDEFLUOR- pozitivne populacije.ALDEFLUOR test (17) je primenjen za izolovanje CSC iz 33 BCL linije, koje predstavljaju različite molekularne podtipove i odlike kancera dojke (20). Utvrđeno je da 23 od 33 ćelijske linije sadrži ALDEFLUOR-pozitivne ćelijske populacije, koje se kreću od 0.2 do skoro 100 %>. Svih 16 bazalnih/mezenhimskih BCL je sadržalo ALDEFLUOR-pozitivne populacije, dok 7 od 12 luminalnih BCL nije sadržalo detektabilne ALDEFLUOR-pozitivne ćelije (p = 0.0006, Fischer egzaktni test).
[0186]ALDEFLUOR- pozitivne ćelije imaju kapacitet za formiranje tumorsfera.Ranije je obelodanjeno da su matične epitelne ćelije dojke i progenotorske ćelije sposobne da prežive i da proliferišu u uslovima nezavisno od podloge i da formiraju plutajuće sferne kolonije koje se nazivaju mamosfere (18). Podaci iz tumora dojke, kao i ćelijskih linija, pokazali su da se kancerske ćelije slične matičnim ćelijama, ili kancer-inicijatorske ćelije takođe mogu izolovati i propagirati kao "tumorsfere" u sličnim testovima (26). Sve ćelije sa sposobnošću inicijacije mamosfera u normalnim humanim mlečnim žlezdama pripadaju ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama (17). Da bi se okarakterisale ALDEFLUOR-pozitivne populacije iz BCL linija, upoređena je sposobnost ALDEFLUOR-pozitivnih i -negativnih populacija iz 184A1, SUMI49 i SUM159 da formiraju tumorsfere. U svakoj ćelijskol liniji, populacija ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija je ispoljila povećanje sposobnosti za formiranje tumorsfera u poređenju sa ALDEFLUOR-negativnim ćelijama.
[0187]ALDEFLUOR- pozitivne BCL ćelije imaju odlike kancerskih matičnih ćelija in vivo.U cilju određivanja hijerarhijske organizacije BCL linija, analizirana su svojstva matičnih ćelija ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne populacije u okviru MDA-MB-453, SUMI59, i BrCa-MZ-01 ćelijskih linija. ALDEFLUOR-pozitivne populacije ove tri BCL linije konstituisale su između 3.54 ± 1.73 % i 5.49 ± 3.36 % ukupnih ćelijskih populacija (SI. 1A-B, G-H; SI. 2A-B). Kao što je prikazano na SI. IF, L, veličina i latencija formiranja tumora korelisala je sa brojem ubrizganih ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija. Značajno je napomenuti da je 500 ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija iz MDA-MB-453 i 1 000 ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija iz SUMI59 bilo sposobno da formira tumore. Kapacitet za generisanje tumora, održavan tokom serijskog pasažiranja, ukazuje na sposobnost ovih ćelija da se samo-obnavljaju. Suprotno tome, ALDEFLUOR-negativne ćelije nisu generisale tumore, iako je uočen mali rast kada je ubrizgano 50 000 ALDEFLUOR-negativnih MDA-MB-453 ćelija. H&E bojenje isečaka masnog tkiva potvrdilo je da tumori formirani ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama sadrže maligne ćelije, dok su na mestima ubrizgavanja ALDELFUOR-negativnih ćelija uočeni samo ostaci Matrigela, apoptotske ćelije ćelije mišjeg tkiva (Fig. 1E, K). U skladu sa pretpostavkom da ALDEFLUOR-pozitivne populacije imaju odlike kancerskih matičnih ćelija, tumori generisani ovim populacijama rekapitulirali su fenotipsku heterogenost inicijalnog tumora, sa sličnim odnosom ALDEFLUOR-pozitivnih -negativnih ćelija (Fig. 1C, I). To ukazuje da su ALDEFLUOR-pozitivne ćelije sposobne da se samo-obnavljaju, generišući ALDEFLUOR-pozitivne ćelije i da su sposobne da se diferenciraju, generišući ALDEFLUOR-negativne ćelije.
[0188]Kada su BrCa-MZ-01 ćelije razdvojene na ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne komponente, obe su bile sposobne da genenrišu tumor. Tumori generisani ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama sadržali su i ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne ćelije, rekapitulirajući fenotipsku heterogenosti inicijalnog tumora. Suprotno tome, tumori generisani ALDEFLUOR-negativnim ćelijama dali su samo sporo-rastuće tumore, koji su sadržali samo ALDEFLUOR-negativne ćelije. Za razliku od sposobnosti ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija da se serijski tranplantiraju, serijski pasaži ALDEFLUOR-negativnih tumora proizvode tumore sa usporavajućim rastom, koji u potpunosti prestaje nakon tri pasaža. Ovakav nalaz ukazuje da ALDEFLUOR-pozitivna komponenta BrCa-MZ-01 ćelija sadrži ćelije koje imaju odlike matičnih ćelija, dok ALDEFLUOR-negativne ćelije sadrže progenitorske ćelije sposobne za ograničen rast i samo-obnavljanje.
[0189]Profilisanje genske ekspresije ALDELFUOR- pozitivnih i — negativnih populacija.U cilju utvrđivanja da li ALDEFLUOR-pozitivne ćelije izolovane iz različitih BCL linija eksprimiraju zajednički set gena"kancerske matične ćelije", ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne ćelijske populacije izolovane iz osam BCLlinija (184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM49 i SUMI59) analizirane su Affymetrix genomskim oligonikleotidnim mikronizom. Nenadgledano hijerarhijsko klasterovanje, primenjeno na svih 16 uzoraka i 13 550 odabranih gena/ESTs, nije rezultiralo utvrđivanjem razlika između ALDEFLUOR-pozitivnih i -negativnih populacija. Umesto toga, ALDEFLUOR-pozitivne i - negativne populacije klasterovale su se sa parentalnom ćelijskom linijom. To ukazuje da razlike u iRNK transkriptima između klonskih ćelijskih linija istiskuju razlike između ALDEFLUOR-pozitivnih i ALDEFLUOR-negativnih ćelija. To dalje ukazuje da se samo mali broj gena diferencijalno eksprimira između mogućih kancerskih matičnih ćelija i njihovog potomstva.
[0190]Za utvrđivanje razlika eksprimiranih gena kod ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne populacije, Mann-Whitney U test primenjen je na sve gene, ali sa niskom ili teško merljivom ekspresijom, odnosno, na set od 25 285 gena. Nakon FDR korekcije, ovim testom je identifikovano i rangirano 413 gena/EST koji se različito eksprimiraju u ALDEFLUOR-pozitivnim i -negativnim ćelijskim populacijama. Dvadesetosam ushodno regulisanih gena koji predstavljaju jedinstvene gene prikazano je u Tabeli l, dok su najčešće nishodno regulisani geni prikazani u Tabeli 2.
[01911Snaga ove diskrimanatorne klasifikacije ilustrovana je klasifikacijom 16 ALDEFLUOR-pozitivnih i -negativnih uzoraka na osnovu 413 diferencijalno eksprimiranih gena/EST. Hijerarhijskim klasterovanjem rangirano je 15 od 16 uzoraka (SI. 2A).
[0192]Veliki broj gena sa poznatom ulogom u biologiji matičnih ćelija je ushodno regulisano u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama (Table 1), uključujući gene NFYA, NOTCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3 i TPRXL. Ostali geni kodiraju proteine koji imaju pretpostavljene ili nepoznate uloge u funkcionisanju matičnih ćelija, kao što su ARID1B, RAD51L1 i receptor hemokina CXCR1/IL8RA (27). Nishodno regulisani geni u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji uključeni su u diferencijaciju, apoptozu, obradu RNK i metabolizam u mitohondrijama.
[0193]Strogost analize uvećavana je podizanjem praga Mann -Whitney testa na 0.5, nakon čega je dobijen niz od 49 gena/EST koji se različito eksprimiraju kod ALDELFLUOR-pozitivne i - negativne populacije (geni sa zvezdicom u Tabelama 1-2). Saglasno ovoj listi, sve ALDEFLUOR-pozitivne ćelije, sa izuzetkom SK-BR-7, grupišu se zajedno. Među ovih 49 gena/ESTS, 45 gena odgovara jedinstvenim identifikovanim genima; samo 3 od tih 45 pojačano se eksprimiraju u ALDEFLUOR-pozitivnoj grupi, dok se 42 smanjeno eksprimira. Okarakterisani pojačano eksprimirani geni kodiraju F-box proteine FBX021 i CXCR1/IL8RA. Smanjeno eksprimirani geni obuhvataju one koji kodiraju mitohondrijske proteine (MRPL41, MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23, IMMP1L), i faktore diferencijacije (NACA) i obrade pre-iRNK (LSM3, pre-iRNK faktor obrade PRPF39 i PRPF4B). Unakrsna validacija po tipu "izostavi jednu" (LOOCV) pri 0.5% rizika procenila je tačnost predviđanja identifikatorske molekulske signature i 88 % uzoraka predviđeno u odgovarajućoj klasi sa "signaturom kancerskih matičnih ćelija" potvrdilo je nadgledanu analizu.
[0194]Primena kvantitativnog RT-PCR potvrdila je povećanu ekspresiju CXCR1 i FBX021 u ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama. Izvedena je kvantitativna RT-PCR analiza pet diskriminatorskih gena pojačano eksprimiranih u ALDEFLUOR-pozitivnim populacijama (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 i RAD51L1). Tri ćelijske linije korišćene u ovom genskom profilisanju (BrCa-MZ-01, MDA-MB-453, SUM159) i dve dodatne luminalne linije (MCF7, S68) sortirane su ALDEFLUOR-testom, a ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne populacije su odvojene analizirane kvantitativnom RT- PCR analizom. Nivoi kvantitativne RT-PCR ekspresije CXCR1 i FBX021 prezentovani su na SI. 2B i C. Nivoi genske ekspresije izmereni kvantitativnim RT-PCR potvrdili su rezultate dobijene primenom DNK mikronizova, sa povećanjem nivoa CXCR1 i FBX021 iRNK u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji u poređenju sa ALDEFLUOR- negativnom populacijom (p < 0.05).
[0195]IL8podstiče samo- obnavljanje kancerskih matičnih ćelija..Studije profilisanja ukazale su da se receptor za IL8, CXCR1/IL8RA dosledno pojačano eksprimira u ALDEFLUOR-pozitivnoj ćelijskoj populaciji. Ova asocijacija je potvrđena, merenjem proteinske ekspresije CXCR1/IL8RA protočnom citometrijom u ALDEFLUOR-pozitivnim i -negativnim populacijama. ALDEFLUOR-pozitivne i -negativne populacije iz četiri različite ćelijske linije izolovane su FACS analizom, fiksirane i obojene CXCR1 monoklonskim antitelom obeleženim fikoeritrinom. Kao što je prikazano na SI. 3A, ALDEFLUOR-pozitivne ćelije su visoko obogaćene u populaciji CXCR1-pozitivnih ćelija, u odnosu na ALDEFLUOR-negativne populacije.
[0196]Značaj IL8 signalizacije u funckionisanju matičnih ćelija određen je na četiri BCL linije, tretirane humanim rekombinantnim TL8, kako bi se odredio njegov uticaj na populaciju kancerskih matičnih ćelija, merenjem formiranja tumorsfera i ALDH enzimske aktivnosti. Kao što je prikazano na SI. 3B, dodavanje IL8 povećalo je formiranje primarnih i sekundarnih tumorsfera na dozno-zavisan način. Dalje, u svakoj od četiri analizirane BCL, IL8 je povećao ALDEFLUOR-pozitivne populacije na dozno-zavisan način (SI. 3C). Ovo ilustruje snagu "CSC signature" u identifikaciji puteva koji mogu imati ulogu u funkcionisanju kancerskih matičnih ćelija.
[0197]IL8ICXCR1 osovina uključuna je u invazivsnost kancerskih matičnih ćelija.Pokazano je da IL8/CXCR1 osa ima ulogu u invazivnosti kancerskih matičnih ćelija (28, 29). Primenjen je invazioni Matrigel test, sa serumom kao atraktantnom, kako bi se ispitala sposobnost ALDEFLUOR-pozitivnih i -negativnih ćelijskih populacija iz tri različite ćelijske linije (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) da invadiraju. Kao što je prikazano na SI. 4A, ALDEFLUOR-pozitivne ćelije pokazale su 6 do 20-puta veću invazivnost kroz Matrigel od ALDEFLUOR-negativne populacije (p < 0.01). Kada je IL8 (100 ng/ml) primenjen kao hemoatraktant, povećao je invazivnost ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija (p < 0.05) (SI. 4A). Suprotno svom efektu na ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama, cells, IL8 nije uticao na invazivni kapacitet ALDELFLUOR-negativnih ćelija. Ovi rezultati ukazuju da kancerske matične ćelije ispoljavaju invazivni fenotip i da IL8 podstiče proces invazije.
[0198]ALDEFLUOR- pozitivne ćelije imaju povećani metastatski potencijal.Predloženo je hipoteza da CSC imaju ključnu ulogu u kancerskoj metastazi (30, 31). Prethodni eksperimenti su pokazali da ALDEFLUOR-pozitivne ćelije imaju povećan invazivni kapacitet u poređenju sa ALDEFLUOR-negativnim ćelijama. Da bi se utvrdio odnos između ALDEFLUOR-pozitivnosti i kapaciteta za metastaze, HCC1954, MDA-MB-453 i SUM 159 su inficirane luciferazni lentivirusnim reporterskim sistemom. Ćelije inficirane luciferazom sortirane su pomoću ALDEFLUOR testa i uvedene u NOD/SCID miša intrakardijačnom injekcijom. Injektovana je suspenzija od 100 000 ćelija iz svake populacije, a metastaze su procenjen bioluminescentnim oslikavanjem. Miševi inokulirani ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama razvili su metastaze na različitim mestima i ispoljile su viši emisioni fluks fotona od miševa inokuliranih neseparisanim ćelijama, koje su razvile ne više od jedne metastaze po mišu ili od miševa inokuliranih ALDEFLUOR-negativnim ćelijama, koji su samo po negde razvili metastaze ograničene na limfne čvorove (SI. 4B-J). Histološki presecei potvrdili su prisustvo metastaza na tim mestima (SI. 4K-M). Stoga, kapacitet BCL linija da metastaziraju pre svega je posredovan CSC ćelijama unutar ALDEFLUOR-pozitivne populacije.
[0199]Hipoteza da su tumori organizovani u ćelijske hijejarhije koje pokreću CSC može da ima suštinske implikacije na biologiju kancera, kao i kliničke implikacije u ranoj detekciji, prevenciji i tretmanu kancera. Dokazi o CSC najvećim delom su dobijeni na primarnim i pasažima ksenografta (32-34). Međutim, uspeh u uspostavljanju ksenografta tumora dojke bio je mali, naročito kada je reč o nekim molekulskim podtipovima. Za razliku od primarnih tumora, dostupne ćelijske linije u neograničenim količinama obezbeđuju karcinomatozne populacije za molekulske analize, bez prisustva normalnog tkiva i strome. U kanceru dojke, proizveden je veliki broj imortalizovanih ćelijskih linija koje predstavljaju različite molekulske podtipove otkrivene u primarnim humanim kancerima dojke (2, 20). Međutim, ostaje pitanje koliko su sposobne ove ćelijske linije da rekapituliraju biologiju humanih kancera dojke?
[0200]In vivo dokaz za matične ćelije u ćelijskim linijama.Nedavna istraživanja su ukazala da iako su ćelijske linije nastale kloniranjem, one sadrže ćelijsku hijerarhiju koja reprezentuje različite faze ćelijske diferencijacije. Nekoliko istraživanja koristilo je ćelijske markere, kao što su CD44+/CD24- za identifikaciju CSC unutar ćelijskih linija kancera dojke. Međutim, njihova primenljivost je bila ograničena, zbog činjenice da veoma često veliki procenat ćelija unutar ćelijske linije eksprimira ove pretpostavljene markere matičnih ćelija. Na primer, više od 90 % ćelija u ćelijskim linijama bazalnog kancera dojke ispoljava CD44+/CD24- fenotip. Zaista, prisustvo CD44+/CD24-fenotipa ne razlikuje tumorogenu populaciju unutar ovih ćelijskih linija (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). Kao alternativni pristup korišćene su SP iz tih ćelijskih linija. Međutim, funkcionalne studije koje se zasnivaju na Hoechst bojenju ograničene su zbog toksičnosti ovog agensa (35). Postoje dokazi da se funkcionalne matične ćelije ne nalaze unutar SP (36). Testiranje ALDH aktivnosti pomoću ALDEFLUOR testa izoluje iz različitih kancera ćelije sa svojstvima matičnih ćelija (14, 37). U ovom primeru pokazano je da 23 od 33 BCL linije (najviše bazalne ćelijske linije) sadrže ALDEFLUOR-pozitivne populacije. Nedostatak ALDEFLUOR-pozitivne populacije u nekim luminalnim BCL može ukazati da su ove luminalne BCL nastale od ALDEFLUOR-negativnih progenitorskih ćelija.
[0201]Ovaj primer koristi in vivo testove u NOD/SCID miševima da demonstrira svojstva matičnih ćelija iz ALDEFLUOR-pozitivne populacije. Sposbnost samo-obnavljanja demonstrirana je serijskim pasažiranjem u NOD/SCID miševima, dok je diferencijacija demonstrirana sposobnošću ALDEFLUOR-pozitivnih, ali ne i ALDEFLUOR-negativnih ćelija da regenerišu ćelijsku heterogenost inicijalnog tumora.
[0202]Signatura kancerskih matičnih ćelija dojke.U ovom primeru na osam ćelijskih linija identifikovano je 413 gena čija se ekspresija razlikuje u ALDEFLUOR-pozitivne i - negativnih ćelijama. Ova signatura sadrži veliki broj gena za koje se zna da imaju ulogu u biologiji matičnih ćelija. Geni u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji koji se pojačano eksprimiraju obuhvataju Notch homolog 2 (NOTCH2), koji reguliše samo-obnavljanje i diferencijaciju matičnih ćelija dojke (18, 38), NFYA, koji reguliše samo-obnavljanje i diferencijaciju matičnih ćelija (39,40), pekaneks homolog PCNX, RBM15/OTT, koji ima plejotropne uloge u hematopoetskim matičnim ćelijama (41) i utiče na mijeloidnu diferencijaciju preko NOTCH signalizacije (42), homeobox-u sličan faktor TPRXL, uključen u embrionsko razviće, ST3GAL3, koji kodira fazno-specifičnu embrionu antigen-4 sintazu, asociranu sa fetalnim razvoj en i bubrežnom i želudačnom karcinogenezom (43). Važno je napomenuti da je fazno-zavisan embrioni antigen-4 protein (SSEA-4) eksprimiran u populacijama matičnih ćelija, kao što su CXCR4+/CD133+/CD34+/lin-matične ćelije u krvi pupčanog krvotoka čoveka i u mirujućim matičnim ćelijama dojke (44).
[0203]Smanjeno eksprimirani geni u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji obuhvataju gene koji su uključeni u diferencijaciju, apoptozu i oksidaciju mitohondrija. Oni obuhvataju gene koji kodiraju nascentnu polipeptid-asociranu alfa subjedinicu NACA, proteine programirane smrti PDCD5 i PDCD10, proteine mitohondrijskih ribozoma L41 (MRPL41), koji indukuju apoptozu na P53-zavisan i nezavisan način, preko BCL2 i kaspaza i proteine uključene u mitohondrijske procese, kao što su oksidativna fosforilacija (NDUFA2, ATP5J2, IMMP1L) i proteinska sinteza u mitohondrijama (MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23). Nishodna regulacija apoptotskih gena u CSC može biti razlog rezistancije ovih ćelija na radijaciju i hemoterapiju (45,46). ALDH1A1 nije identifikovan kao diferencijalno eksprimiran gen ALDEFLUOR-pozitivne signature. Međutim, ispitivanje profila genske ekspresije individualnih BCL pokazao je da neke od njih pokazuju diferencijalnu ekspresiju ALDH1A1 u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji, druge BLC pokazuju diferencijalnu ekspresiju ALDH1A3, drugačije izoforme ALDH u ovim populacijama. To ukazuje da fenotipu ALDEFLUOR-pozitivnih populacija može doprineti ekspresija različitih izoformi ALDH.
[0204]Od hemokina do " stemokina."Ekspresija CXCR1, receptora za IL8, povećana je u različitim kancerima (47-50). Iako je ekspresija IL8 povezana sa ER-negativnim kancerom dojke (51), prethodno nije uočeno da ovaj hemokin ima ulogu u funkcionisanju kancerskim matičnih ćelija. Njegova uključenost u regulaciju rasta i metastaza dobro je upoznata u androgen-nezavisno kanceru prostate (52). Takođe, nivo ekspresije IL8 u vezi je sa tumorgenošću i metastazama, preko produkcije VEGF i angiogeneze (53, 54). Genska ekspresija validirana je na tri načina. Prvo, kvantitativna RT-PCR analiza potvrdila je značajno povećanje iRNK za CXCR1 u ALDEFLUOR-pozitivnoj populaciji u svim ćelijskim linijama, kako u onima koje su uključene, tako i u onima koje nisu uključene u gensko profilisanje. Drugo, primenom protočne citometrije pokazano je da se ćelije koje sadrže CXCR1 nalaze isključivo u populaciji ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija. Treće rekombinantni IL8 povećao je formiranje mamosfera i procenat ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija u BCL linijama. Na osnovu toga se može zaključiti da IL8/CXCR1 osa reguliše proliferaciju i samo-obnavljanje matičnih ćelija dojke. S obzirom na to da endotelne i stromalne ćelije izlučuju IL8, ovaj hemokin izgleda posreduje u interakcijama tumorskih matičnih ćelija i tumorskog mikrookruženja.
[0205]Nedavna istraživanja su ukazala na ulogu interleukina/hemokina u regulaciji CSC (55, 56). To uključuje ulogu IL6 u CSC dojke i IL4 u posredovanju hemorezistencije u matičnim ćelijama debelog creva (56-59). Ovi faktori mogu posredovati između inflamacije i kancera. To takođe ukazuje na ulogu CCL5 (RANTES), hemokina kojeg izlučuju mezenhimske matične ćelije, koji deluje kao parakrini faktor i pojačava pokretljivost kancerskih ćelija dojke, invazivnost i metastaze (55).
[0206]Koreni metastaze.CSC mogu biti odgovorne za tumorske metastaze. Na povezanost CSC sa metastazama najpre je ukazano nakon identifikacije gena matičnih ćelija u 11-genskoj signaturi generisanoj primenom uporednog profilisanja metastastatskih i primarnih tumora u transgenom mišjem modelu kancera prostate i humanih pacijenata koji boluju od iste bolesti (60). Ova signatura je snažan prediktor relapsa bolesti, smrtnog ishoda nakon terapije i pojave udaljenih metastaza kod različitih tipova kancera. Ovaj primer demonstrira da ALDEFLUOR-pozitivne ćelije imaju veću sposbnost mezastaze od ALDEFLUOR-negativnih ćelija i da IL8, za koji je ranije utvrđeno da ima ulogu u tumorskim metastazama, podstiče invaziju i hemotaksiju kancerskih matičnih ćelija, koje preferencijalno eksprimiraju receptor za IL8, CXCR1 receptor. Sposobnost da se izoluje metastatske kancerske matične ćelije iz ćelijske linije trebalo bi da olakša istraživanja molekulskih mehanizama kojima kancerske ćelije posreduju u nastanku metastaze tumora.
PRIMER 2
Inhibicija CXCR1 i kombinovana terapija
[0207] Ovaj primer opisuje različite postupke koji se primenjuju u testiranju efekta inhibicije CXCR1 u tumorskim ćelijama, kao i kombinovane inhibicije CXCR1 i delovanja nekog anti-mitotikog agensa (docetaksel).
Efekat inhibicije CXCR1 na rast ćelija i na ALDEFLUOR- pozitivne populacije SUMI59 ćelijske
linije.
[0208] Ćelijska linija SUM 159 kultivisana je u adherentnim uslovima, a ćelije su tretirane inhibitorom CXCR1/CXCR2 repertaksinom ili sa dva specifična blokirajuća antitela za CXCR1 ili CXCR2. Nakon četiri dana tretmana efekat na rast ćelija analiziran je MTT testom (SI. 5A), dok je uticaj na kancerske matične ćelije ispitan pomoću ALDEFLUOR testa (Slika 5B). Uočeno je više od 95% inhibicije rasta ćelija kod ćelija tretiranih repertaksinom ili CXCR1 blokirajućim antitelom, dok efekat nije uočen na ćelijama tretiranim CXCR2 blokirajućim antitelom (Slika 5A). Interesantno je napomenuti daje sličan efekat uočen u populaciji ALDEFLUOR-pozitivnih ćelijama, sa smanjenjem rasta od 80%> i 50% ALDEFLUOR-pozitivne populacije kod ćelija tretiranih repertaksinom, odnosno, CXCR1 blokirajućim antitelom (Slika 5B).
Tretman repertaksinom indukuje uzgredni (" bystander") efekat koji je uzrokovan FASIFAS ligand
signalizacijom
[02091Ćelije SUM 159 ćelijske linije kultivisane su u adherentnim uslovima, a zatim se tretirane repertaksinom, samostalno ili u kombinaciji sa FAS antagonistom. Interesantno je napomenuti da je inhibicija rasta ćelija indukovana repertaksinom delimično bila oporavljena dodavanjem FAS antagoniste (anti/Fas-ligand nabavljen od BD Pharmingen (cat# 556371)). Zapravo, ćelije tretirane FAS agonistom ispoljile su sličan stepen inhibicije rasta kao i ćelije tretirane repertaksinom. Ovi rezultati ukazuju da tretman repertaksinom indukuje uzgredni ("bvstander") efekat posredovan FAS/FAS ligand signalizacijom.
Efekat tretmana repertaksinom na aktivaciju FAK, AKT i FOXOA3
[0210]Efekat tretmana repertaksinom na nizvodnu signalizaciju CXCR1 receptora, ispitan je na SUM159 ćelijama koje su kultivisane 2 dana u adherentnim uslovima u odsustvu ili prisustvu 100 nM repertaksina i obeležene su imunofluorescencentno antitelima usmerenim na p-FAK, p-AKT, i FOXOA3. Kod ne-tretiranih ćelija (SI. 7A), bilo je inaktivirano 30 % ćelija koje eksprimiraju p-FAK i 10% ćelija koje eksprimiraju p-AKT, dok su ćelije tretirane repertaksinom ispoljile potpunu inhibiciju p-FAK i p-AKT (Fig. 7B). U netretiranim SUMI59 ćelijama, 80 % ćelija ima pozitivnu citoplazmatsku aktivnost na FOXOA3. Intereseantno, 80% ćelija SUM 159 ćelija tretiranih repertaksinom ispoljava pozitivnu reakciju na FOXOA3 u jedru. Promena ćelijske lokalizacije FOXOA3 iz citoplazme u jedro ukazuje na aktivaciju FOXOA3 proteina.
Krive rasta tumora nakon tretmana Repertaksinom, docetakselom ili njihovom kombinacijom
[0211]Efekat repertaksina, docetaksela ili njihove kombinacije procenjen je na ćelijskim linijama kancera dojke (8A, SUM 159) i na tri humana ksenografta kancera dojke generisana od različitih pacijenata (8B, MCI; 8C, UM2; and 8D, UM3). Ubrizgano je 50 000 ćelija iz svakog uzorka u masno tkivo dojke NOD-SCID miševa, kod kojih je zatim praćena veličina tumora. Tretman je započet kada je tumor dostigao veličinu od oko 4 mm. Repertaksin je ubrizgavan (15 mg/Kg) dva puta na dan, 28 dana ili jednom nedeljno, docetaksel je ubrizgan i.p. samostalno (10 mg/Kg) ili u kombinaciji (repertaksin/docetaksel). Slika 8 prikazuje veličine tumora pre ii tokom tretmana (strelica, početak tretmana). Slični rezultati dobijeni su kod svih uzoraka (SUM159, MCI, UM2, UM3), sa statistički značajnim smanjenjem veličine tumora u grupama tretiranim samo docetakselom ili kombinacijom repertaksin/docetaksel, u odnosu na kontrolu (p < 0.01), a značajne promene u rastu nisu uočene između kontrolnih tumora i tumora tretiranih repertaksinom.
Efekat repertaksina, docetaksela ili njihovog kombinovanog tretmana na populaciju kancerskih
matičnih ćelija na osnovuprocene ALDEFLUOR testom
[0212]ALDH aktivnost je procenjena ALDEFLUOR testom za analiziranje veličine populacije kancerskih matičnih ćelija u svakom tumoru (9A. SUM159, 9B. MCI, 9C. UM2, 9D. UM3) tretiranom repertaksinom, docetakselom ili njihovom kombinacijom. Slični rezultati su uočeni u svim uzorcima. Tumorski ksenografti tretirani docetakselom ispoljili su sličan ili veći procenat ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija u odnosu na kontrole, dok je tretman repertaksinom, samostalno ili u kombinaciji sa docetakselom proizveo statistički značajno smanjenje u ALDEFLUOR-pozitivnim ćelija, sa 65% do 85% manje kancerskih matičnih ćelija u odnosu na kontrolu (p < 0.01).
Efekat repertaksina, docetaksela ili kombinovanog tretmana na populaciju kancerskih matičnih
ćelija, procenjen na osnovu implantacije u sekundarnog miša
[0213]Serijska razblaženja ćelije dobijena iz primarnih tumora (10A. SUM159, 10B. MCI, 10C. UM2, 10D. UM3) netretiranih (kontrola) i tretiranih repertaksinom, docetakselom ili kombinacijom, implantirana su u masno tkivo dojke sekundarnih NOD-SCID miševa. Kontrolni i docetakselom tretirani tumori formirali su sekundarne tumore pri svim razblaženjima, dok su primarni tumori tretirani repertaksinom ili njegovom kombinacijom sa docetakselom, samo pri visokim koncentracijama odloženo formirali sekundarne tumore koji su bili značajno manjih dimenzija u poređenju sa kontrolom ili sa tumorima tretiranim docetakselom (p < 0.01). Staviše, razblaženja od 1000 i 100 primarnih ćelija tretiranih ovom kombinacijom, iz 3 od ukupno 4 uzorka (SUMI59, UM2, UM3), nisu uspela da formira sekundarne tumore.
Tretman repertaksinom smanjuje metastatski potencijal SUMI 59 ćelijskih linija
[0214]Ćelijska linija SUM159 inficiranana je lentivirusom koji eksprimira luciferazu, a zatim je inokulirano 250 000 tih ćelija u srce NOD/SCID miševa. Miševi su podeljeni u dve grupe. Obe grupe miševa su 12 sati nakon intrakardijačne injekcije, primile ili s.c. injekciju fiziološkog rastvora ili s.c. injekciju repertaksina (15 mg/kg), dva puta dnevno, 28 dana. Formiranje metastaza je praćeno primenom bioluminescencentnog oslikavanja (11 B: Miševi tretirani fiziološkim ratsvorom; 11C: Miševi tretirani repertaksinom). Kvantitfikacija normalizovanog fluksa fotona izmerenog u nedeljnim intervalima nakon inokulacije pokazala je statistički značajno povećanje formiranih metastaza u grupi miševa tretiranih fiziološkim rastvorom u poređenju sa grupom miševa tretiranih repertaksinom (11 A).
PRIMER 3
Tretman kancerskih matičnih ćelija blokiranjem CXCR1
[0215] Ovaj primer pokazuje efekat inhibicije CXCR1 na tumorske ćelije, u in vitro testu i u modelu miša.
[0216]Disocijacija tkiva dojke.100-200 g normalnog tkiva dojke iz redukujućih mamoplasta usitnjeno je skalpelom, disorcirano je enzimski i pojedinačne ćelije su kultivisane u suspenziji, kako bi se dobile mamosfere ili su kultivisane na supstratu od kolagena u adherentnim uslovima, da bi se indukovala diferencijacija ćelija (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270).
[0217]Ćelijska kultura.Ćelijske linije kancera dojke su gajene u preporučenim uslovima za održavanje kulture (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). Ćelijske linije kancera dojke tretirane su pri adherentnim uslovima reperatksinom (Sigma-Aldrich), anti-humanim CXCR1 mišjim monoklonskim antitelom (Clone 42705, R&D svstems), anti-humanim CXCR2 mišjim monoklonskim antitelom (klon 48311, R&D svstems), anti-humanim CD95 mišjim monoklonskim antitelom (klon DX2, BD Pharmingen), koji je primenjan kao agonist FAS signalizacije, anti-humanim FAS-Ligand mišjim monoklonskim antitelom (klon NOK-1, BD Pharmingen), koje je primenjeno kao antagonist FAS signalizacije ili docetakselom (Taxotere, Sanofi-Aventis).
[0218]Vijabilnost ćelija.Za potrebe MTT testova, ćelije su zasejane u adherentnim uslovima na pločama sa 96 bunarića, pri gustini od 5 000 ćelija po bunariću. Nakon jednog dana, započet je tretman repertaksinom. Efekat tretmana repertaksinom na vijabilnost ćelija procenjen je u različitim vremenskim tačkama, dodavanjem 20 ul MTT rastvora (5 mg/mL u PBS) u svaki bunarić. Ćelije su zatim inkubirane tokom 1 sata na 37 °C, nakon čega je u svaki bunarić dodato 50 uL DMSO. Apsorbanca je očitana na 560 nm u čitaču mikrotitar ploča (Spectrafluor, Tečan). Za potrebe TUNEL testa, ćelije su zasejane u adherentnim uslovima na ploče sa 6 bunarića, pri gustini od 50 000 ćelija po bunariću. Nakon jednog dana započet je tretman repertaksinom. Broj apoptotičnih ćelija procenjen je nakon četiri dana tretmana. Ćelije su fiksirane u 3.7% formaldehidu i obeležene pomoću TACS TdT kompleta (R&D svstems). Jedra su kontrastno obojena DAPl/antifada bojom (Invitrogen). Preseci su ispitani na fluorescentnom mikroskopu (Leica, Bannockborn, IL, USA), pri čemu su apoptotične ćelije obojene zelenom.
[0219]ALDEFLUOR test.Primenjen je ALDEFLUOR komplet (StemCell technologies) za izolaciju ćelija koje ispoljavaju visoku aktivnost ALDH, primenom FACStarPLUS (Becton Dickinson) kao što je prethodno opisano (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). Ćelije mišjeg porekla se eliminisane iz ksenografta tumora, inkubiranjem populacije ćelija sa anti-H2Kd antitelom (BD biosciences, 1/200, 20 min na ledu) i sekundarnim antitelom obeleženim fikoeritrinom (PE) (Jackson labs, 1/250, 20 min na ledu).
[0220]ELISA test.Nivo solubilnog FAS-liganda oslobođenog u medijum kulture ćelija koje su tretirane, odnosno, nisu tretirane repertaksinom, određen je ELISA postupkom, primenom kompleta za detekciju humanog sFAS Ligand ELISA (Bender Medsvstems). Apsorbanca je očitana spektrofotometrijski, na primarnoj talasnoj dužini od 450 nm.
[0221]Westernblot.Ćelije su lizirane u Laemmli puferu i nanete su na SDS-poliakrilamidne gelove. Blotovi su inkubirani u odgovarajućim primarnim antitelima rastvorenim u TBST (koji je sadržao 0.1 % Tween20 i 2 % BSA), preko noći na 4°C ili 2 sata na sobnoj temperaturi. Blotovi su isprani i inkubirani sa odgovarajućim sekundarnim antitelima (GE Healthcare, UK), a nakon toga su detektovani pomoću SuperSignal West Pico hemiluminescentnog supstrata (Pierce).
[0222]Imunobojenje.Za potrebe imunofluorescentnog bojenja, sortirane CXCR1 -pozitivne ćelije su fiksirane u 95 % metanolu na -20°C tokom 10 minuta. Ćelije su rehidrataisane u PBS i inkubirane sa odgovarajućim antitelima na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Korišćena su sledeća primarna antitela P-FAK (1:50, Cell Signaling Technologv), P-AKT (1:300, Cell Signaling Technologv) i FOX03a (1:250, Cell Signaling Technologv). Preseci su zatim isprani i inkubirani 30 minuta sa sekundarnim antitelima konjugovanim sa PE (Jackson labs). Jedra su kontrastno obojena DAPI/antifada bojom (Invitrogen), a ćelije su pokrivene pokrovnim pločicama. Preseci su ispitani pod fluorescentnim mikroskopom (Leica, Bannockborn, IL, USA). Imunohistohemijska analiza ekspresije ALDH1 (1:100, BD biosciences), P-FAK, P-AKT, FOX03a izvršena je na parafinskim presecima (Ginestier i sar., Am. J Pathol. 161:1223-1233., koja je ovde obuhvaćena u celosti). Bojenje je obavljeno pomoću Histostainplus kompleta (Zymed Laboratories). Kao hromogeni su primenjeni diaminobenzidin (DAB) ili 3-amino-9-etilkarbazol (AEC), a preseci su kontrastno obojeni hematoksilinom.
[0223]Životinjski model.Tumorigenost ALDELFUOR-pozitivne/CXCRl-pozitivne i ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-negativne populacije SUM 159 ćelija procenjena je u NOD/SCID miševima (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). Ćelijska linija SUM159 i tri primarne kulture ksenografta humanih kancera dojke generisanih u tri različita pacijenta (MCI, UM2, UM3) korišćeni su da se odredi efikasnost tretmana repertaksinom na rast tumora (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). Ćelije iz ovih tumora su transplantirane ortotopski u humanizovano prečišćeno masno tkivo NOD/SCID miševa, bez kultivacije in vitro. Isečci masnog tkiva su pripremljeni kao što je opisano (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). Ukupno 50 000 ćelija iz svakog ksenotransplanta injektovano je u humanizovano masno tkivo NOD/SCID miševa, a zatim je praćen rast tumora. Kada je tumor dostigao veličinu od oko 4 mm, započet je tretman repertaksinom (s.c, 15 mg/Kg, dva puta dnevno, 28 dana), docetakselom (i.p., 10 mg/Kg, jednom nedeljno, 4 nedelje) ili njihovom kombinacijom (repertaksin/docetaksel), dok je kontrolna grupa tretirana fiziološkim rastvorom (i.p., jednom nedeljno, ili s.c. dva puta dnevno, 28 dana). Životinje su eutanazirane kada je tumor dostigao oko 1.5 cm u svom najvećem dijametru, kako bi se izbegla nekroza tumora i kako bi se eksperiment odvijao saglasno regulativi za primenu kičmenjaka u istraživanjima. Jedan deo isečka masnog tkiva je fiksiran u formalinu i uronjen u parafin za histološke analize. Ostatak tumorskih ćelija je re-implantiran u sekundarnog NOD/SCID miša. Primenjena su serijska razblaženja za re-implantaciju uz ubrizgavanje 10 000, 1 000 ili 100 ćelija za svaki tretirani tumor.
[0224]Plutajuće kulture.BCL linije tretirane u adherentnim uslovima, repertaksinom (100 nM), anti-CXCRl antitelom (10 mg/ml) ili anti-CXCR2 (10 mg/ml), disocirane su i zasejane kao pojedinačne ćelije na ultra-nisko-adherentnim pločama (Corning, Acton, MA), pri maloj gustini (5 000 vijabilnih ćelija/ml). Ćelije su gajene kako je prethodno opisano (Charafe-Jauffret i sar.,. Cancer Res. 69:1302-1313). Naredne kulture nakon disocijacije primarnih tumorosfera zasejane su pri gustini od 5 000 vijabilnih ćelija/ml. Kapacitet ćelija da formiraju tumorsfere je kvantifikovan nakon prvog (primarne tumorosfere) i drugog (sekundarne tumorosfere) pasaža.
[0225]Ekstrakcija RNK i qRT- PCR.Nakon tretmana SUM 159 ćelija, ukupna RNK je izolovana RNeasv Mini Kompletom (QIAGEN) i analizirana kvantitativnim RT-PCR (qRT-PCR) testom u ABI PRISM® 7900HT sistemu za detekciju sekvenci. Prajmeri i probe za Taqman sistem su selektovani sa Applied Biosvstems vebsajta (www dot appliedbiosvstems dot com) (FAS-Ligand test ID: Hs_00899442_mi; IL8 test ID: Hs_00174103_min, TBP test ID: Hs. 00427620_mi). Relativni nivoi ekspresije iRNK za FAS-Ligand i IL8 izračunati su u odnosu na interni standard TBP gena, kako bi se normalizovale varijacije u kvalitetu RNK i količina nanete cDNA, što je već objašnjeno (Ginestier i sar., Clin. Cancer Res. 12:4533-4544).
[0226]Protočno- citometrijska analiza.Izvedeno je CD44/CD24/Lin bojenje (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567). CD95/FAS bojenje obavljeno je pomoću anti-CD95 antitela obeleženog APC-om (1:20, BD biosciences). Za bojenje CXCR1 i CXCR2, korišćena su primarna antitela, anti-CXCRl (1:100, klon 42705, R&D svstems) i anti-CXCR2 (1:100, klon 48311, R&D svstems), a zatim je obeležavanje izvršeno sekundarnim anti-mišjim antitelom obeleženim sa PE (razblaženje 1:250, Jackson Labs). Vijabilnost svežih ćelija je procenjena bojenjem 1 mg/ml propidijum-jodidom (Sigma), tokom 5 min.
[0227]Virusna infekcija.Proizvedena su dva lentivirusna kontrukta za ekspresiju gena za luciferazu (Lenti- LUC-VSVG) (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313 ) i za inhibiciju ekspresije PTEN (Lenti-PTEN- SiRNA-DsRed) (Korkava i sar., PLoS Biolog. 7:el000121. ). Oba lentivirusna konstrukta su nabavljena od Universitv of Michigan Vector. Primenjeni su i adenovirusni konstrukti za povećanu ekspresiju FAK (Ad-FAK-GFP) (Luo i sar., Cancer Res. 69:466-474). Infekcija ćelija različitim vektorima obavljena je kao što je ranije opisano (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). Uspešnost infekcije potvrđena je određivanjem procenta ćelija koje eksprimiraju DsRed ili GFP.
[0228]Intrakardijana inokulacija.Šest nedelja stari NOD/SCID miševi anestezirani su smešom 2% izofluoran/vazduha, a zatim im je u levu komoru ubrizgano 250 000 ćelija rastvorenih u 100 uL sterilnog Dulbecco PBS rastvora bez Ca 2_|_ i Mg" . Injektovano je po šest životinja za svaku od tri ćelijske linije (HCC1954, MDA-MB-453 i SUM 159) i za svaki tretman (fiziološki rastvor ili repertaksin). Dvanaest sati nakon intrakardijačnih injekcija, miševima je ubrizgan repertaksin dva puta dnevno ili ili fiziološki rastvor, za kontrole.
[0229]Bioluminescentna detekcija.Pre inokulacije je određen bazalni nivo bioluminescencije, a intenzitet je zatim meren jednom nedeljno nakon inokulacije. Postupci bioluminescentne detekcije su izvedeni kao što je prethodno opisano (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). Normalizovani fluks fotona predstavlja odnos fluksa fotona detektovan u nedeljnim periodima nakon inokulacije i fluksa fotona detektovanog pre inokulacije.
[0230]Ekspresija CXCR1 kao osnov razlikovanja populacija kancerskih matičnih ćelija.Identifikacija signalnih puteva koji učestvuju u regulaciji kancerskih matičnih ćelija (CSC) obezbedila bi potencijalne terapeutske mete u ćelijskim populacijama. Određivanje profila genske ekspresije nekoliko gena koji su potencijalno uključeni u regulatorne puteve CSC dojke omogućilo je otkrivanje signature CSC ćelija dojke (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). Među genima koji se pojačano eksprimiraju u populaciji CSC ćelija dojke, kao najizgledniji kandidat izdvojio se CXCR1, receptor koji vezuje proinflamatorni hemokin IL-8/CXCL8, s obzirom na to da rekombinantni IL-8 stimuliše samo-obnavljanje CSC ćelija dojke (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). Primenom protočne citometrije određena je ekspresija CXCR1 proteina u CSC populaciji razdvojenoj na osnovu ALDELFUOR testiranja ćelijskih linija humanog kancera dojke HCC1954, MDA-MB-453 i SUM159. Ćelije sa funkcionalnim svojstvima matičnih ćelija u NOD/SCID mišjim ksenograftima pripadale su ALDEFLUOR- pozitivnoj ćelijskoj populaciji (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). CXCR1-pozitivne ćelije, koje čine manje od 2 % ukupne populacije, pripadaju gotovo u potpunosti ALDEFLUOR-pozitivnim ćelijama (videti S1.12A i Tabela 4).
[0231]Procenjena je i ekspresija CXCR2 receptora. CXCR2 receptor takođe vezuje IL-8/CXL8, mada sa manjim afinitetom u poređenju sa CXCR1. Za razliku od CXCR1-pozitivnih ćelija, CXCR2-pozitivne ćelije bile su jednako prisutne u obe populacije, ALDEFLUOR-pozitivnoj i ALDEFLUOR-negativnoj (vidi SI. 12A). Da bi se odredila hijerarhijska organizacija populacija kancerskih matičnih ćelija u odnosu na ekspresiju CXCR1, ćelije su sortirane na ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-pozitivne i ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-negativne ćelijske, a zatim su injektovane u NOD/SCID miševe (videti, SI. 13). Obe ćelijske populacije proizvele su tumore. Kinetika rasta tumora bila je u korelaciji sa latencijom i veličinom formiranog tumora, kao i sa brojem injektovanih ćelija. Tumori generisani od ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-pozitivne populacije rekonstituisali su fenotipsku heterogenost inicijalnog tumora nakon serijskih pasažiranja, dok je ALDEFLUOR-pozitivna/CXCRl-negativna populacija ćelija proizvela tumore koji su sadržali samo ALDEFLUOR-pozitivne/CXCRl-negativne ćelije. Ovi rezultati su ukazali daje ćelijska hijerarhija CSC organizovana u odnosu na ekspresiju CXCR1, iako su obe ćelijske populacije ispoljile slične tumorogene kapacitete.
[0232]Blokada CXCR1 smanjuje populaciju kancerskih matičnih ćelija tumora dojke in vitro.Tri različite ćelijske linije tretirane su repertaksinom (100 nM), inhibitorom CXCRl/2, kako bi se procenio efekat blokade CXCR1 na CSC populaciju dojke (Bertini i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 101:11791-11796). U SUM159 ćelijama, nakon tri dana tretmana, proporcija ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija smanjena je pet puta (videti, SI. 12B). Sličan efekat je uočen nakon tretmana SUM 159 ćelija, anti-CXCRl blokirajućim antitelom. Suprotno tome, nije uočen efekat nakon tretmana anti-CXCR2 blokirajućim antitelom, što je ukazalo da su efekti repertaksina na ALDEFLUOR- pozitivne populacije posredovani preko CXCR1.
[0233]Podaci iz tumora dojke, kao i iz ćelijskih linija pokazuju da kancerske, matičnim ćelijama slične ćelije, ili kancer-inicijatorske ćelije mogu takođe biti izolovane i propagirane kao "tumorsfere" u suspenzionoj kulturi (Ponti i sar., Cancer Res. 65:5506-5511). Nakon tri dana tretmana repertaksinom ilianti-C¥C7?7blokirajućim antitelom, kada su ćelije odlepljene i kultivisane u suspenziji, uočeno je daje formiranje primarnih i sekundarnih tumorsfera smanjeno 8 puta u odnosu na kontrole. Suprotno tome, anti-CXCR2 blokirajuće antitelo nije ostvarilo uticaj na formiranje tumorsfera (videti, SI. 14).
[0234]Iznenađujuće, nakon pet dana tretmana repertaksinom, uočili smo ogromno smanjenje vijabilnosti ukupne populacije ćelije, na osnovu MTT testa, sa samo 3 % preostalih vijabilnih ćelija (videti, SI. 12C). Slični rezultati su uočeni sa anti-CXCRl blokirajućim antitelom, ali ne i sa anti-CXCR2 blokirajućim antitelo, što ukazuje daje efekat zavisan od blokade CXCR1. Ovaj efekat repertaksina bio je odložen, jer je gubitak vijabilnosti započeo tek nakon tri dana tretmana (videti, SI. 15A). Tretman repertaksinom je indukovao sličan efekat na HCC1954 ćelijskoj liniji kancera dojke, dok efekat nije uočen na MDA-MB-453 ćelijama, koje poseduju PTEN mutaciju (Hollestelle i sar., Cancer Res. 5:195-201.) (videti, SI. 14, 15B-C i 16).
[0235]Na SUM159 ćelijama koje su obojene TUNEL testom, nakon 4 dana tretmana repertaksinom, uočeno je snažno smanjenje ćelijske vijabilnosti, usled indukcije apoptoze, sa 36% apoptotinih ćelija detektovanih nakon tretmana repertaksinom (videti, SI. 12D). Rezultati ukazuju da blokada CXCR1 dovodi do smanjenja populacije CSC dojke, usled masovne apoptoze u preostaloj masi tumorskih ćelija.
[0236]Blokada CXCR1 indukuje ćelijsku smrt u CXCR1- negativnim ćelijama, posredstvom uzgrednog (" bystander") efekta.Podatak da repertaksin ili anti-CXCRl blokirajuće antitelo indukuju masovnu ćelijsku smrt, uprkos tome što CXCR1 -pozitivne ćelije čine manje od 2 % ukupne ćelijske populacije, ukazuje da blokada CXCR1 u CXCR1-pozitivnim ćelijama indukuje smrt u CXCR1-negativnim ćelijama putem takozvanog "bvstander efekta". Sortirane CXCR1-pozitivne i CXCR1-negativne populacije tretirane su repertaksinom (vidrti, SI. 12E). Repertaksin je smanjio vijabilnost u populaciji CXCR1-pozitivnih ćelija, u toku tri dana, a efekat nije uočen u populaciji CXCR1-negativnih ćelija. Repertaksin je indukovao masovnu smrt ćelija u populaciji neseparisanih ćelija. Efekat repertaksina na vijabilnost neseparisanih ćelija i na CXCR1-pozitivnih ćelija bio je dozno-zavisan (videti, SI. 12E). Rezultati su saglasni sa hipotezom da tretman repertaksinom deluje na CXCR1-pozitivne populacije, koje zatim indukuju smrt CXCR1-negativnih ćelija, posredstvom uzgredno ("bvstander") efekta.
[0237]Da bi se utvrdilo da li je ovaj efekat posredovan solubilnim faktorom čije je oslobađanje indukovano repertaksinom, prikupljen je kondicionirani medij um CXCR1-pozitivnih ćelija nakon tri dana tretmana repertaksinom, a zatim je taj medijum dijaliziran kroz membranu od 3.5 KDa ekskluzione molekulske mase, kako bi se iz njega uklonio repertaksin, a zadržali ostali molekuli veći od 3.5 KDa. Kada je primenjen na ćelije, dijalizirani kondicionirani medijum indukovao je snažno smanjenje vijabilnosti, i u populaciji CXCR1- negativnih i u populaciji neseparisanih ćelija, ali ne i u CXCR1-pozitivnoj populaciji (videti, SI. 12F). Ovi rezultati su pokazali da blokada CXCR1 u CXCR1-pozitivnoj populaciji indukuje ćelijsku smrt u CXCR1-negativnoj populaciji putem solubilnog nedijalizovanog faktora. Iako je CXCR1-pozitivna populacija osetljiva na repertaksin, ona je rezistentna na dijalizirani faktor smrti.
[0238]Uzgredni (" bystander") efekat indukovan blokadom CXCR1, posredovan je FAS-UgandlFAS signalizacijom.Interakcija FAS-liganda/FAS aktivira se u različitim fiziološkim uslovima, kao što je involucija mlečnih žlezda ili u uslovima povrede tkiva, uključujući i onu izazvanu hemoterapijom (Chhipa i sar., J Cell Biochem. 101:68-79., Song i sar., J Clin. Invest 106:1209-1220.). Uloga interakcije FAS-liganda/FAS receptora u nastanku uzgrednog apoptotskog efekta ("bvstander efekat") do kojeg dolazi nakon blokade CXCR1 procenjena je određivanjem nivoa solubilnog FAS-liganda u medijumu SUM159 ćelija tretiranh repertaksinom, primenom ELISA testa. Nivo solubilnog FAS-liganda bio je više od pet puta veći u medijumu ćelija tretiranih četiri dana repertaksinom u odnosu na netretirane ćelije (videti, SI. 17A). Primenom RT-PCR potrvrđena je i transkripciona regulacija iRNK za FAS-ligand nakon tretmana repertaksinom (videti SI. 17B). Nivo iRNK za FAS-ligand povećao se četiri puta u ćelijama tretiranim repertaksinom u odnosu na netretirane ćelije. Slični rezultati uočeni su nakon tretmana FAS agonistom koji aktivira FAS signalizaciju, što je ukazalo da je FAS-ligand meta FAS signalizacije koja izaziva pozitivnu povratnu spregu. Sve ćelije (100%) unutar populacije SUM159 ćelija eksprirale su FAS protein, što je utvrđeno protočnom citometrijom. Nakon tretmana SUM159 ćelija agonistom FAS izazvan je isti citotoksični efekat, kao i onaj uočen nakon tretmana repertaksinom, uz snažno smanjenje ćelijske vijabilnosti (videti, SI. 17C). Efekat repertaksina na vijabilnost ćelija delimično je umanjen primenom anti-FAS-Ligand blokirajućeg antitela, sa 44% ćelija koje su ostale vijabilne nakon tretmana repertaksinom i anti-F AS-ligand antitelom, u odnosu na samo 3 % onih koje su ostale nakon tretmana samo repertaksinom (videti, SI. 17C). Rezultati ukazuju da je masovna ćelijska smrt indukovana repertaksinom uslovljena uzgrednim ("bvstander") efektom koji je posredovan FAS-Ligand/FAS signalnim putem.
[0239]Tretman SUMI59 ćelija FAS agonistom rezultirao je desetostrukim povećanjem CXCR1-pozitivnih i trostrukim povećanjem broja ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija (videti, SI. 17D/E i 18). Efekti repertaksina na obe populacije nisu umanjeni anti-FAS-ligand antitelom (videti, SI. 17D/E), što ukazuje da je ALDEFLUOR-pozitivna populacija, koja obuhvata CXCR1 -pozitivnu populaciju, iako direktno osetljiva na blokadu CXCR1 koja indukuje nastanak FAS-liganda u ovim ćelijama, istovremeno rezistentna na FAS-ligand/FAS pro-apoptotičku signalizaciju. Suprotno tome, the ALDEFLUOR-negativna masa populacije ne eksprimira CXCR1, ali je osetljiva na FAS-ligandom posredovanu ćelijsku smrt.
[0240]FAS-ligand/FAS signalizacija ima važnu ulogu tokom involucije mlečnih žlezda (Song i sar., J Clin. hrvest 106:1209-1220). Efekat blokade CXCR1 na normalne humane epitelne ćelije dojke ispitan je na redukcionim mamoplastima. Kao što je uočeno u ćelijskim linijama kancera dojke, CXCR1-pozitivne normalne ćelije dojke gotovo se u potpunosti nalaze unutar ALDEFLUOR-pozitivne populacije (videti, SI. 19A). Da bi se odredilo da lije IL-8 signalizacija važna za funkciju normalnih matičnih/progenitorskih ćelija dojke, normalne epitelne ćelije dojke kultivisane u suspenziji, tretirane su humanim rekombinantnim IL-8 i određenje efekat na CSC populaciju, merenjem formiranja mamosfera (Dontu i sar., Genes Dev. 17:1253-1270). Dodavanje IL-8 povećalo je formiranje primarnih i sekundarnih mamosfera na dozno-zavisan način (videti, SI. 19B), što je ukazalo da IL-8/CXCRl osa može biti uključena u regulaciju proliferacije i samo-obnavljanja normalnih matičnih/progenitorskih ćelija. Tretman repertaksinom ili FAS agonistom nije imao uticaja na vijabilnost normalnih epitelnih ćelija dojke kada su kultivisane u adherentnim uslovima, čak i kada su primenjene visoke koncentracije repertaksina (500 nM) (videti, SI. 16A). Međutim, kao što je uočeno u ćelijskim linijama kancera dojke, u medijumu normalnih epitelnih ćelija dojke tretiranih repertaksinom primećeno je povećanje nivoa solubilnog FAS-liganda (videti, SI. 20B). Ova opservacija može se objasniti odsustvom ekspresije FAS u normalnim epitelilnim ćelijama kada su kultivisane pod ovim uslovima (videti, SI. 20C). Ovaj nalaz je u saglasnosti sa istraživanjima koja su pokazala da se ekspresija FAS u mlečnim žlezdama dešava samo tokom procesa involucije koji se dešava nakon perioda laktacije (Song i sar., J Clin. Invest 106:1209-1220). Za razliku od nedostatka njegovog efekta na najveći deo populacije normalnih epitelnih ćelija mlečnih žlezda, repertaksin značajno smanjuje formiranje mamosfera od strane ovih ćelija (videti, SI. 20C).
[0241]Ovi rezultati ukazuju da IL-8/CXCRl osa igra značajnu ulogu u regulaciji i preživljavanju normalnih i malignih epitelnih matičnih/progenitorskih ćelija mlečnih žlezda. Sposobnost da utiče na veći deo populacije zahvaljujući FAS-ligandom posredovanom uzgrednom ("bvstander") efektu može biti u vezi sa nivoom ekspresije FAS u ovim ćelijama.
[0242]Efekti blokade CXCR1 na kancerske matične ćelije posredovani su FAKIAKTIFOX03A signalnim putem.CXCR1 ostvaruje svoje efekte aktiviranjem signalnog puta koji uključuju fosforilaciju fokalne adhezione kinaze (FAK), što rezultira aktivacijom AKT (Waugh i sar., Clin. Cancer Res. 14:6735-6741). Da bi se procenio uticaj blokade CXCR1 na aktivaciju FAK i AKT, nivoi fosforilisanih FAK i AKT proteina izmereni su vvestern blotom, u trima ćelijskim linijama. U SUM159 i HCC1954 linijama, detektovano je smanjenje FAK Tyr<397>i AKT Ser<473>fosforilacije u ćelijama tretiranim repertaksinom u odnosu na netretirane ćelije, što je ukazalo da efekti repertaksina mogu biti posredovani FAK/AKT signalnim putem (videti, SI. 21A i 22). Podatak da su MDA-MB453 ćelije rezistentne na tretman repertaksinom može se objasniti prisustvom PTEN mutacije (919 G > A), koja aktivira PI3K/AKT put signalizacije (Hollestelle i sar., Mol. Cancer Res. 5:195-201., na koju se ovaj pronalazak poziva u celosti). Nije detektovana modifikacija u fosforilaciji FAK Tyr<397>[AKT Ser<473>nakon tretmana repertaksinom u MDAMB453 ćelijskoj liniji (videti, SI. 22). Da bi se potvrdila funkcionalna uloga FAK7AKT puta u posredovanju ovih efekata blokade CXCR1, primenjena su dva virusna konstrukta, od kojih jedan eliminiše ekspresiju PTEN pomoću PTEN shRNA, dok drugi eliminiše pojačanu ekspresiju FAK. PTEN, pomoću svoje lipidne fosfataze antagonizuje PI3-K/AKT signalizaciju (Vivanco i sar., Nat. Rev. Cancer 2:489-501.). Eliminacija PTEN rezultira aktivacijom AKT, što je pokazano kao povećanje fosforilacije AKT Ser<473>(videti, SI. 21A i 22). Eliminacija ekspresije PTEN blokirala je efekat repertaksina na aktivnosti FAK i AKT. Pojačana ekspresija FAK takođe je blokirala ovaj efekat repertaksina i indukovala je aktivaciju FAK i AKT, što je izmereno kao povećanje ekspresije fosforilisanih FAK Tyr<397>[AKT Ser473 Ovi rezultati su ukazali da su efekti blokade CXCR1 posredovani FAK/AKT signalizacijom. [02431Primena imunofluorescentnog bojenja CXCR1-pozitivnih ćelija potvrdila je da tretman repertaksinom dovodi do dramatičnog smanjenja ekspresije fosfo-FAK i fosfo-AKT u poređenju sa netretiranim ćelijama (SEE FIG. 21B). AKT reguliše aktivnost račvastog transkripcionog faktora FOX03A putem fosforilacije koja rezultira sekvestracijom FOX03A u citoplazmi (Brunet i sar., Mol. Cell Biol. 21:952-965). Suprotno tome, nefosforilisana forma FOX03A prelazi u jedro, gde deluje kao transkripcioni faktor koji reguliše sintezu FAS-liganda (Jonsson i sar., Nat. Med. 11:666-671). Repertaksin indukuje ćelijsku smrt, FAS-ligandom posredovanim uzgrednim ("bvstander") efektom; efekti repertaksina na put signalne transdukcije ispitani su imunofluorescentnim bojenjem. FOX03A bio je prisutan u citoplazmi netretiranih ćelija, ali se prebacio u jedro nakon tretmana repertaksinom (videti, SI. 21B). To ukazuje da blokada CXCR1 indukuje aktivnost FOX03A, putem inhibicije FAK/AKT puta. Ćelije sa PTEN delecijom ili preteranom ekspresijom FAK ispoljavaju visok nivo ekspresije fosfo-FAK i fosfo-Akt, što je detektovano imunofluorescencijom, i u ćelijama koje su tretirane i u ćelijama koje nisu tretirane repertaksinom. Tretman repertaksinom nije izazvao aktivaciju FOX03A u ćelijama sa PTEN delecijom ili povećanom ekspresijom FAK, što je pokazano citoplazmatskom lokalizacijom FOX03A (videti, S1.21B).
[0244]Kao posledica konstitutivne aktivacije FAK/AKT, ćelije sa PTEN delecijom ili preteranom ekspresijom FAK ispoljavaju rezistanciju na tretman repertaksinom. Ćelije sa PTEN delecijom ili povećanom ekspresijom FAK ne ispoljavaju smanjenje ćelijske vijabilnosti nakon tretmana repertaksinom. Predloženo je da AKT signalizacija ima kritičnu ulogu u biološkom funkcionisanju CSC (videti, SI. 21B i 22) (Dubrovska i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 106:268-273., Korkava i sar., PLoS Biolog. 7:el000121., Yilmaz i sar., Nature 441:475-482.). Aktivacija FAK/AKT puta blokira efekte repertaksina na CSC populacije, što je pokazano održavanjem ALDELFUOR-pozitivne populacije nakon tretmana inhibitorom (videti, SI. 21B). Svi dobijeni rezultati ukazuju da blokada CXCR1 direktno utiče na FAK/AKT/FOX03A put. Tretman repertaksinom inhibita AKT signalizaciju, koja je ključna za aktivnost CSC i posledično indukuje uzgredni ("bvstander") uticaj na masu tumorskih ćelija, što je posredovano FAS-ligandom koji nastaje u CSC ćelijama.
[0245]Tretman repertaksinom smanjuje populaciju kancerskih matičnih ćelija in vivo.Nedavni podaci ukazuju da su CSC dojke relativno rezistentne na hemoterapiju i radijaciju, što doprinosi ponovonom rastu tumora nakon terapije (Phillips i sar., J Natl. Cancer Inst. 98:1777-1785., Yu i sar., Cell 131:1109-1123., Li i sar., J Natl. Cancer Inst. 100:672-679.). Ovaj CSC koncept ukazuje da značajna poboljšanja kliničkog ishoda zahtevaju efikasno delovanje protiv CSC populacije ćelija (Reya i sar., Nature 414:105-111). Nekoliko faktora se sintetiše i izlučuje tokom apoptotičnog procesa, kojim je pogođena masa tumorskih ćelija tokom hemoterapije. Među ovim faktorima, FAS-ligand amplifikuje efekte hemoterapije usled uzgrednog ("bystander") citotoksičnog efekta (Chhipa i sar., J Cell Biochem. 101:68-79., na koju se pronalazak poziva u celosti). Hemoterapija može takođe indukovati nastanak IL-8 u oštećenim ćelijama. Najčešće korišćen hemoterapeutski agens, docetaksel, indukovao je i IL-8 i FAS-ligand iRNK u SUM159 ćelijama (videti, SI. lOaB). Takođe smo detektovali četvorostruko povećanje nivoa iRNK za IL-8 nakon tretmana FAS agonistom (videti, SI. 10B). Pokazali smo daje IL-8 sposoban da reguliše populaciju CSC ćelija. To ukazuje da dodavanje repertaksina citotoksičnoj hemoterapiji može blokirati ovaj efekat i delovati na populaciju kancerskih matičnih ćelija.
[0246]SUM159 ćelijska linija i tri primarna ksenografta humanog kancera dojke generisana iz različitih pacijenata (MCI, UM2, UM3) primenjena su sa ciljem da se izuči efikasnost tretmana repertaksinom na rast tumora. Ćelije iz ovih tumora su transplantirane ortotopski u humanizovana pročišćeno masno tkivo NOD/SCID miševa, bez kultuivacijein vitro.U svakom od ovih ksenotransplanata CSC populacija se isključivo nalazila unutar ALDEFLUOR-pozitivne populacije (Ginestier i sar., Cell Stem Cell 1:555-567., Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313). U svakom od ovih tumora, CXCR1 -pozitivna populacija je gotovo u potpunosi bila unutar ALDEFLUOR-pozitivne populacije (videti, Tabela 5) i PTEN/FAK/AKT put je bio aktiviran (videti, SI. 25).
[0247]50 000 ćelija iz svakog ksenotransplanta je ubrizgano u humanizovano masno tkivo NOD/SCID miševa, a zatim je praćen rast tumora. Kada je tumor dostigao veličinu od 4 mm, započet je tretman samo repertaksinom (15 mg/kg, dva putan dnevno, 28 dana), samo docetakselom (10 mg/Kg, jednom nedeljno, četiri nedelje) ili kombinovanom terapijom. Rast tumora je upoređen sa kontrolama koje su primile fiziološki rastvor. Kod svih ksenotransplanta uočena je značajna inhibicija rasta nakon tretmana docetakselom ili kombinacijom repertaksin/docetaksel (videti, SI. 26A i 27). Tretman repertaksinom imao je umereni uticaj na rast tumora. Nakon četiri nedelje tretmana, životinje su žrtvovane i rezidualni tumori su iskorišćeni za ALDEFLUOR test. Rezidualni tumori nakon tretmana docetakselom sadržali su ili neporemenjen ili povećan procenat ALDELFUOR-pozitivnih ćelija u poređenju sa netretiranim kontrolama (videti, SI. 26B i 27). Suprotno tome, tretman repertaksinom, samostalno ili u kombinaciji sa docetakselom smanjio je populaciju ALDEFLUOR-pozitivnih ćelija za više od 75% (videti, SI. 26B i 27). Ovi rezultati potvrđeni su imunohistohemijskom analizom ALDH1 ekspresije u različitim ksenotransplantima. Smanjenje broja ALDH 1-pozitivnih ćelija je detektovano kod tumora tretiranih repertaksinom u poređenju sa netretiranim tumorima, dok je procenat ALDH 1-pozitivnih ćelija ostao nepromenjen ili se povećao u tumorima tretiranim samo docetakselom (videti, SI. 26D).
[0248]U ovim tumorima određeno je prisustvo CD44+/CD24-. Za ove markere je prethodno pokazano da se eksprimiraju u kancerskim matičnim ćelijama dojke (Al Hajj i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 100:3983-3988). Određen je stepen preklapanja ekspresije CD44<+>/CD24-fenotipa i CXCR1. CXCR1-pozitivne ćelije prisutne su u populaciji CD44+/CD24- ćelija, kao i u populaciji ćelija koje eksprimiraju CD24 ili koje su CD44-negativne (videti, Tabela 6).
[0249]U rezidualnim tumorima tretiranim samo docetakselom, uočen je isti ili povećani procenat CD44<+>/CD24"ćelija, dok je tretman repertaksinom, samostalno ili u kombinaciji sa docetakselom rezultirao smanjenjem CD44<+>/CD24- ćelijske populacije (videti, SI. 28).
[0250]Funkcionalanin vivotest koji se sastoji od reimplantacije ćelija iz tretiranih tumora u sekundarne NOD/SCID miševe obezbedio je direktno merenje tumor-inicirajućih i samoobnavljajućih sposobnosti CSC ćelija koje preostaju nakon tretmana. Tumorske ćelije dobijene iz kontrolnih ili docetakselom tretiranih životinja, pokazale su sličan nivo ponovnog uspostavljanja tumora pri svim razblaženjima u sekundarnim NOD/SCID miševima. Suprotno tome, tretman repertaksinom, sa ili bez docetaksela, redukovao je rast tumora u sekundarnim primaocima (videti, SI. 26C). Kada je ubrizgan isti broj ćelija, one iz životinja tretiranih reperataksinom ispoljile su smanjenje od 2-5 puta u pogledu rasta tumora, u poređenju sa ćelijama iz kontrolnih životinja ili životinja tretiranih docetakselom (videti, SI. 26C). Ni u jednom ksenotransplantnom modelu, ubrizgavanje 1 000 ili 100 tumorskih ćelija dobijenih iz životinja tretiranih kombinacijom repertaksina i docetaksela nije dovela do formiranja sekundarnih tumora u NOD/SCID miševima (videti, SI. 26C, 27 i Tabelu 7). Ova istraživanja su pokazala da tretman repertaksinom deluje specifično na CSC populaciju ćelija, smanjujući njiohvo broj.
[0251]Tretman tepertaksinom inhibira FAK/ AKT signalizaciju i aktivira FOX03A in vivo.Ekspresija fosfo-FAK i fosfo-AKT je ispitana imunohistohemijski u svakom od ksenotransplanta nakon tretmana. Membranska ekspresija fosfo-FAK detektovana je u 50 % ćelija iz kontrolnih tumora i tumora tretiranih docetakselom, dok je ekspresija fosfo-FAK potpuno sprečena u tumorima tretiranim samo repertaksinom ili u kombinaciji sa docetakselom (videti, SI. 26D). Slični rezultati su dobijeni za ekspresiju fosfo-AKT, sa 70 % ćelija koje eksprimiraju fosfo- AKT u netretiranim tumorima, 20 % fosfo-AKT-pozitivnih ćelija u tumorima tretiranim docetakselom i potpunom inhibicijom ekspresije fosfo-AKT u tumorima koji su tretirani samo repertaksinom ili u kombinaciji sa docetakselom (videti, SI. 26D). Prisustvo FOX03A u jedru detektovano je u ćelijama iz tumora tretiranim samo docetakselom, samo repertaksinom i kombinacijom repertaksin/docetaksel. Oviin vivopodaci su saglasni sain vitropodacima i potvrđuju da tretman repertaksinom inhibira FAK/AKT signalizaciju i aktivira FOX03A.
[0252]Tretman repertaksinom redukuje razvoj sistemskih metastaza.Da bi se utvrdilo da li repertaksin redukuje sistemske metastaze, inficirali smo HCC1954, MDA-MB-453 i SUM 159 ćelijske linije kancera dojke, luciferaznim lentavirusnim reporter-sistemom i uveli smo ove ćelije u NOD/SCID miševe intrakardijačnom injekcijom. Ubrizgana je suspenzija od 250 000 ćelija po svakoj ćelijskoj liniji, a formiranje metastaza praćeno je fluorescentnim oslikavanjem, jednom nedeljno. Dvanaest sati nakon intrakardijačne injekcije, miševi su tretirani repertaksinom dva puta dnevno, dok su kontrole primile fiziološki rastvor. Tretman repertaksinom miševa koji su injektovani HCC1954 i SUM 159 ćelijama značajno je smanjio formiranje metastaza sa najmanjom fluksom emitovanih fotona kod tretiranih u poređenju sa netretiranim miševima (videti, SI. 29AB). Histološki preseci potvrdili su prisustvo metastaza na nekoliko mesta kod netretiranih životinja (videti, SI. 29D). Tretman repertaksinom nije uticao na formiranje metastaza u miševa injektovanih MDA-MB-453 ćelijama (videti, SI. 29C). Fluks emitovanih fotona i broj životinja koje su razvile metastaze bio je sličan kod obe grupe koje su tretirane repertaksinom ili koje nisu bile tretirane. Ovi rezultati su konzistentni sa podacima koji definišu MDA-MB-453 kao ćelijsku liniju koja je rezistentna na repertaksin zbog prisustva PTEN mutacije. Ovi rezultati ukazuju da blokada CXCR1 agensima, kao što je repertaksin, može biti sposobna da redukuje metastaze, što je uslovljenom CSC populacijom (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313).
[0253]Eksperimenti koji su sprovedeni tokom razvijanja oblika izvođenja predmetnog pronalaska ukazuju da ćelijske subkomponente sa svojstvima matičnih ćelija upravljaju rastom tumora i metastazama (Visvader i sar., Nat. Rev. Cancer 8:755-768). Zbog njihove relativne rezistentnosti na postojeće terapeutske modalitete, ove ćelije mogu doprineti rezistenciji na tretman i relaps bolesti (Reya i sar., Nature 414:105-111.) Predmetni pronalazak obezbeđuje pristup zasnovan na blokiranju CXCR1 citokinskog receptora, koji je eksprimiran na kancerskim matičnim ćelijama dojke, za efikasno delovanje na populaciju kancerskih matičnih ćelija i sa ciljem poboljšanja ishoda lečenja. Istraživanja sprovedena tokom razvoja oblika izvođenja pronalaska u brojnim sistemima, pokazala su da mreža citokina ima značajnu ulogu u tumorogenezi. Postoje dokazi da nekoliko ovih citokina može da reguliše ponašanje matičnih ćelija. Citokin IL-4 može da reguliše samo-obnavljanje kancerskih matičnih ćelija pankreasa, dok IL-6 reguliše kancerske matične ćelije debelog creva i kancera dojke (Todaro i sar., Cell Stem Cell 1:389-402., Sansone i sar., J Clin. Invest 117:3988-4002). Uloga IL-8 u invaziji tumora i metastazi prethodno je utvrđena (Waugh & Wilson. Cancer Res. 14:6735-6741., Tnoue i sar., Clin. Cancer Res. 6:2104-2119.). Uz to, IL-8 pojačava samo-obnavljanje nervnih matičnih ćelija tokom zarastanja povreda mozga (Beech i sar., J Neuroimmunol. 184:198-208.). Opisano je da kancerske matične ćelije pluća eksprimiraju hemokinski receptor CXCR1 (Levina i sar., PLoS. ONE. 3:e3077.). Istraživanja sprovedena tokom razvoja oblika izvođenja predmetnog pronalaska, pokazala su da je CXCR1-pozitivna populacija gotovo u potpunosti sadržana unutar ALDEFLUOR- pozitivne populacije ćelijskih linija kancera dojke i primarnih ksenografta, kao i normalnih ćelija mlečnih žlezda. Ovaj hemokinski receptor se pojačano eksprimira u ALDEFLUOR-pozitivnim populacija kancera dojke (Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313.). U kancerima dojke, IL-8 se proizvodi u tumorskom mikrookruženju u mnogim tipovima ćelija, uključujući inflamatorne ćelije, vaskularne endotelne ćelije, tumor-asocirane fibroblaste i mezenhimske matične ćelije (Waugh i sar., Clin. Cancer Res. 14:6735-6741). Mreže citokina posreduju u interakcijama između ovih ćelijskih tipova, pa se stoga kancerske matične ćelije mogu specifično targetirati putem blokade CXCR1 receptora za IL8.
[0254]Primenom in vitrotestova, pokazano je da blokada CXCR1, ali ne i CXCR2 (alterantivni receptor za IL-8) redukuje ćelijsku populaciju kancerskih matičnih ćelija. Ovo je praćeno indukcijom apoptoze u celokupnoj preostaloj populaciji ćelija, koje ne eksprimiraju CXCR1. Uz blokirajuća antitela specifična za CXCR1, istraživanja sprovedena tokom razvoja oblika izvođenja predmetnog pronalaska, pokazala su da repertaksin, koji je inhibitor CXCRl/2, indukuje slične efekte, delujući na populaciju CXCR1-pozitivnih ćelija. Suprotno njegovom efektu na populaciju kancerskih matičnih ćelija koje eksprimiraju CXCR1, repertaksin nije uticao na masu tumorskih ćelija kojima nedostaje CXCR1. To ukazuje da blokada CXCR1 u CXCR1-pozitivnim ćelijama indukuje ćelijsku smrt u CXCR1-negativnim ćelijama, takozvanim "bvstander", uzgrednim efektom. Ovde predstavljena istraživanja pokazuju da je FAS-ligand/FAS signalni put medijator ovog uzgrednog ("bvstander") citotoksičnog efekta. Ovaj fenomen može da objasni efikasnost tretmana repertaksinom u indukciji masovne apoptoze u celokupnoj populaciji, bez obzira na činjenicu da CXCR1-pozitivna populacija predstavlja manje od 1 % ćelijske populacije. Uloga FAS-liganda demonstrirana je efikasnim blokiranjem "bvstander" citotoksičnog efekta davanjem anti-F AS-ligand blokirajućeg antitela.
[0255] Istraživanja sprovedena tokom razvoja oblika izvođenja predmetnog pronalaska ukazuju da slične interakcije citokina mogu biti prisutne u tumorima koji su izloženi citotoksičnoj hemoterapiji. Hemoterapija može direktno da indukuje ćelijsku apoptozu u diferenciranim tumorskim ćelijama, kao i produkciju FAS-liganda u ovim umirućim ćelijama, što dalje izaziva apoptozu u okolnim tumorskim ćelijama putem FAS-posredovanog "bvstander" efekta. Zajedno sa produkcijom FAS-liganda, povređene ćelije takođe oslobađaju povećani nivo IL-8 u procesu koji podseća na involuciju mlečnih žlezda ili na zarastanje rana. Kao i u slučaju involucije mlečnih žlezda, tako nastali IL-8 može stimulisati kancerske matične ćelije dojke, štiteći od apoptoze. To može doprineti relativnom povećanju broja kancerskih matičnih ćelija nakon hemoterapije u prekliničkim modelima (4) i neo-adjuvantnim kliničkim ispitivanjima (5). Ovaj efekat hemoterapije na puteve apoptoze i samo-obnavljanja u tumorima prikazanje na Slici 30.
[0256] Da bi se utvrdilo da li blokada CXCR1 može da deluje na kancerske matične ćelije dojkein vivo,efekti citotoksičnog agensa docetaksela upoređeni su sa repertaksinom u odeljku kancerskih matičnih ćelija, kao i u pogledu rasta tumora u NOD/SCID miševima. Docetaksel je jedan od najefikasnijih hemoterapeutiskih agenasa koji su u trenutnoj primeni u lečenju kancera dojke. Populacija kancerskih matičnih ćelija je procenjena ALDEFLUOR testom, a zatim je serijski transplantirana u NOD/SCID miševe. Primenom ovih testova pokazano je da sama hemoterapija dovodi ili do odustva promene ili do relativnog povećanja populacije kancerskih matičnih ćelija. Suprotno tome, tretman repertaksinom samostalno ili u kombinaciji sa hemoterapijom, značajno smanjuje populaciju kancerskih matičnih ćelija. Uprkos značajnom smanjenju populacije tumor-inicirajućih ćelija, izolovana primena repertaksina ne rezultira značajnim smanjenje tumora. Kombinacija repertaksina i hemoterapije rezultirala je značajnim smanjenjem veličine tumora i populacije kancerskih matičnih ćelija. Kombinovanje ovih agenasa u delovanju na kancerske matične ćelije i masu tumorskih ćelija ostvaruje maksimalnu efikasnost ovih tretmana.
[0257]Za pojašnjenje mehanizma delovanja repertaksina, analizirani su nizvodni putevi ispod CXCR1 receptora. Potvrđene su interakcije između CXCR1, FAK i AKT. Blokada CXCR1 specifično izaziva aktivaciju FAK i AKT. Istraživanja sprovedena tokom razvoja oblika izvođenja predmetnog pronalaska ukazuju da aktivacija AKT reguliše samo-obnavljanje normalnih i malignih matičnih ćelija dojke, putem fosforilacije GSK3|3, što dovodi do aktivacije WNT signalnog puta (Korkava i sar., PLoS Biolog. 7:el000121). Ovi rezultati ukazuju na to da su ćelije u kojima je onemogućena ekspresija PTEN rezistentne na repertaksin. Dodatna uloga AKT je da reguliše preživljavanje ćelija putem fosforilacije račvastog transkripcionog faktora FOX03A. Fosforilacija koju AKT ostvaruje nad FOX03A rezultira njegovom sekvestracijom u citoplazmi. Suprotno tome pokazano je da blokada CXCR1 dovodi do smanjenja aktivacije AKT što dovodi do translokacije FOX03A u jedro, gde izaziva ekspresiju brojnih gena, uključujući gen za FAS-ligand (Jonsson i sar., Nat. Med. 11:666-671). FAS-ligand koji je indukovan blokadom CXCR1 izaziva uočene "bvstander" citotoksične efekte (videti, SI 30).
[0258]Osim uloge u signalizaciji CXCR1 receptora, FAK posreduje u interakcijama ćelija sa komponentama vanćelijskog matriksa posredstvom integrinskih receptora (Waugh i sar., Clin. Cancer Res. 14:6735-6741). FAK signalizacija igra važnu ulogu u regulaciji samo-obnavljanja normalnih i malignih mišjih matičnih ćelija dojke u transgenim modelima (Luo i sar., Cancer Res. 69:466-474). Aktivacija FAK takođe podstiče preživljavanje ćelija, blokiranjem FADD i RIP-posredovane apoptoze (Kurenova i sar., Mol. Cell Biol. 24:4361-4371., Xu i sar., J Biol. Chem. 275:30597-30604). Ovo je verovatno objašnjenje za rezistenciju populacije kancerskih matičnih ćelija na FAS/FAS-ligandom indukovanu apoptozu.
[0259]Pokazano je da kancerske matične ćelije dojke imaju važnu ulogu u invaziji tumora i u metastazi (Croker i sar., J Cell Mol. Med. 2008, Charafe-Jauffret i sar., Cancer Res. 69:1302-1313.). Ovde je pokazano da IL-8 i CXCR1 igraju važne uloge i u ovim procesima. Efekti blokade CXCR1 analizirani su u pogledu formiranja eksperimentalnih metastaza. Pokazano je da blokada CXCR1 redukuje nastanak metastaza kada se ona izvrši neposredno nakon intrakardijačne injekcije kancerskih ćelija dojke.
[0260] Kliničke studije u primeni repertaksina pokazale su nedostatak toksičnosti. Strategije koje interferiraju sa regulatornom petljom citokina, kao što su IL-8 i CXCR1, predstavljaju postupke za ciljano delovanje na kancerske matične ćelije.

Claims (10)

1. Antagonist CXCR1 receptora, za primenu u postupku terapije subjekta sa tumorom, naznačen time da postupak dalje uključuje administraciju nekog hemoterapeutskog agensa.
2. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 1, naznačen time da je navedeni antagonist CXCR1, Repertaksin ili derivat repertaksina.
3. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 1, naznačen time da antagonist CXCR1 uključuje antitelo ili fragment antitela.
4. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 1, naznačen time da je hemoterapeutski agens neki anti-mitotički agens.
5. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 4, naznačen time da je navedeni anti-mitotički agens izabran iz grupe koju čine: docetaksel, doksorubicin, paklitaksel, fluorouracil, vinkristin, vinblastin, nokodazol, kolhicin, podofilotoksin, steganacin i kombretastatin.
6. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 5, naznačen time da je anti-mitotički agens paklitaksel.
7. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 1, naznačen time da navedeni tumor uključuje kancerske matične ćelije izabrane iz grupe koju čine: kancerske matične ćelije prostate, kancerske matične ćelije jajnika, kancerske matične ćelije dojke, kancerske matične ćelije kože, matične ćelije ne-sitnoćelijskog kancera pluća, matične ćelije sitnoćelijskog kancera pluća i matične ćelije adenokarcinoma jednjaka.
8. Antagonist CXCR1 receptora za primenu saglasno Zahtevu 1, naznačen time da je navedeni antagonist CXCR1 receptora Repertaksin i naznačeno time da je navedeni hemoteraputski agens Paklitaksel.
9. Antagonista CXCR1 receptora za primenu saglasno zahtevu 8, naznačen time da je navedeni tumor, kancerski tumor dojke.
10. Antagonost CXCR1 receptora za primenu saglasno zahtevu 9, naznačen time da navedeni kancerski tumor dojke uključuje kancerske matične ćelije dojke.
RS20170301A 2008-11-11 2009-11-11 Anti-cxcr1 kompozicije i postupci RS55784B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11345808P 2008-11-11 2008-11-11
EP09826676.0A EP2356462B1 (en) 2008-11-11 2009-11-11 Anti-cxcr1 compositions and methods
PCT/US2009/064041 WO2010056753A1 (en) 2008-11-11 2009-11-11 Anti-cxcr1 compositions and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55784B1 true RS55784B1 (sr) 2017-07-31

Family

ID=42170302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170301A RS55784B1 (sr) 2008-11-11 2009-11-11 Anti-cxcr1 kompozicije i postupci

Country Status (26)

Country Link
US (3) US8940301B2 (sr)
EP (2) EP3153862A1 (sr)
JP (3) JP5716180B2 (sr)
KR (3) KR20110093893A (sr)
CN (3) CN102272599B (sr)
AU (1) AU2009314141B2 (sr)
BR (1) BRPI0921150B1 (sr)
CA (1) CA2743305C (sr)
CY (1) CY1118933T1 (sr)
DK (1) DK2356462T3 (sr)
EA (1) EA023466B1 (sr)
ES (1) ES2623128T3 (sr)
HR (1) HRP20170463T1 (sr)
HU (1) HUE032623T2 (sr)
IL (1) IL212822A (sr)
LT (1) LT2356462T (sr)
MX (2) MX2011005007A (sr)
NZ (2) NZ602369A (sr)
PL (1) PL2356462T3 (sr)
PT (1) PT2356462T (sr)
RS (1) RS55784B1 (sr)
SG (1) SG10201701954QA (sr)
SI (1) SI2356462T1 (sr)
SM (1) SMT201700181T1 (sr)
WO (1) WO2010056753A1 (sr)
ZA (1) ZA201103416B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110093893A (ko) 2008-11-11 2011-08-18 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간 항-ｃｘｃｒ１ 조성물 및 방법
GB201106870D0 (en) * 2011-04-26 2011-06-01 Univ Belfast Marker
US10598653B2 (en) * 2011-11-01 2020-03-24 Bionomics Inc. Methods of blocking cancer stem cell growth
CN103159649B (zh) * 2011-12-19 2016-03-09 天津市国际生物医药联合研究院 磺酰胺类化合物的制备及其应用
CN103159650B (zh) * 2011-12-19 2016-04-20 天津市国际生物医药联合研究院 芳香杂环磺酰胺类化合物的制备及其应用
US20150266961A1 (en) * 2012-03-29 2015-09-24 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Fridrich Miescher Institute Inhibition of interleukin-8 and/or its receptor cxcr1 in the treatment of her2/her3-overexpressing breast cancer
ES2728305T3 (es) * 2013-04-29 2019-10-23 Ogd2 Pharma Uso como diana del gangliosido GD2 O-acetilado como una nueva estrategia terapéutica y de diagnóstico para cáncer de células madre cancerosas
JP6683986B2 (ja) * 2013-07-10 2020-04-22 国立大学法人 東京大学 がん幹細胞分子マーカー
US11291641B2 (en) 2016-10-03 2022-04-05 The Children's Medical Center Corporation Prevention and treatment of diabetic nephropathy
KR102608922B1 (ko) * 2016-11-17 2023-12-01 난트바이오 인코포레이티드 추론된 항암 경로의 검증
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3554541B1 (en) 2016-12-14 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
US10100275B2 (en) 2017-03-16 2018-10-16 King Faisal Specialist Hospital & Research Centre Method for generating human multipotent mammary stem cells from normal primary breast luminal cells
EP3476390A1 (en) 2017-10-24 2019-05-01 Dompé farmaceutici S.p.A. Il-8 inhibitors for use in the treatment of sarcomas
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
RU2702910C2 (ru) * 2018-12-20 2019-10-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ снижения количества стволовых клеток рака молочной железы
WO2020172233A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Treatment of prostate cancer by androgen ablation and il-8 blockade
RU2700695C2 (ru) * 2019-02-27 2019-09-19 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы
CN115666704B (zh) 2019-12-13 2025-09-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
JP7772351B2 (ja) * 2020-01-10 2025-11-18 北京鋭瑟生物醫薬科技發展有限公司 癌化学療法に起因する耐性の除去および癌化学療法の効果の強化のための医薬組成物およびその使用
CN114075286A (zh) * 2020-08-21 2022-02-22 张家港博泽利斯生物技术有限公司 一种抗人cxcr1蛋白单克隆抗体的制备方法
WO2023032957A1 (ja) * 2021-08-30 2023-03-09 学校法人東京薬科大学 がんの予防および／または治療のための医薬組成物
CN116350787B (zh) * 2023-03-15 2025-04-01 复旦大学附属金山医院(上海市金山区眼病防治所、上海市金山区核化伤害应急救治中心) Rbm15的抑制剂在卵巢癌紫杉醇化疗耐药中的应用

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4109496A (en) 1977-12-20 1978-08-29 Norris Industries Trapped key mechanism
US4323546A (en) 1978-05-22 1982-04-06 Nuc Med Inc. Method and composition for cancer detection in humans
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4981785A (en) 1988-06-06 1991-01-01 Ventrex Laboratories, Inc. Apparatus and method for performing immunoassays
US4968103A (en) 1988-07-22 1990-11-06 Photofinish Cosmetics Inc. Method of making a brush
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5376313A (en) 1992-03-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Injection molding a plastic assay cuvette having low birefringence
WO1994010300A1 (en) 1992-10-30 1994-05-11 The General Hospital Corporation Interaction trap system for isolating novel proteins
US5639606A (en) 1993-04-06 1997-06-17 The University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5876978A (en) 1993-04-06 1999-03-02 Medical College Of Ohio Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5643765A (en) 1993-04-06 1997-07-01 University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5599677A (en) 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6156305A (en) 1994-07-08 2000-12-05 Baxter International Inc. Implanted tumor cells for the prevention and treatment of cancer
US6218166B1 (en) 1994-12-09 2001-04-17 John Wayne Cancer Institute Adjuvant incorporation into antigen carrying cells: compositions and methods
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1997018322A2 (de) * 1995-11-16 1997-05-22 Dahm Michael W Verfahren zur quantifizierung von tumorzellen in einer körperflüssigkeit und dazu geeignete testkits
CA2239957A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay diagnostic method
US5885529A (en) 1996-06-28 1999-03-23 Dpc Cirrus, Inc. Automated immunoassay analyzer
ATE229810T1 (de) 1996-10-11 2003-01-15 Univ California Krebs immuntherapie unter verwendung von tumorzellen kombiniert mit lymphozytmischungen
DE69837839T2 (de) 1997-03-07 2007-12-13 Clare Chemical Research LLC, Denver Fluorometrischer Nachweis mit sichtbarem Light
US8044259B2 (en) * 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6984522B2 (en) * 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US20020147312A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-10 O'keefe Theresa Hybrid antibodies and uses thereof
AU2002364537A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Regents Of The University Of Michigan Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
WO2004045526A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Morehouse School Of Medicine Anti-chemokine and associated receptors antibodies for inhibition of growth of neoplasms
CA2526274C (en) * 2003-05-30 2015-12-01 Agensys, Inc. Prostate stem cell antigen (psca) variants and subsequences thereof
US20060019256A1 (en) 2003-06-09 2006-01-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20050142136A1 (en) * 2003-10-23 2005-06-30 Lary Suva Anti-interleukin 8 therapy for tumor osteolysis
WO2005074633A2 (en) 2004-02-03 2005-08-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
WO2005103711A2 (en) * 2004-04-20 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with cxc chemokine receptor 1 (cxcr1)
CN1984899B (zh) * 2004-05-12 2011-07-27 先灵公司 Cxcr1和cxcr2趋化因子拮抗剂
GB0417740D0 (en) 2004-08-10 2004-09-08 Uc3 Methods and kit for the prognosis of breast cancer
CA2628255C (en) 2005-10-31 2016-04-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20070208074A1 (en) * 2006-01-24 2007-09-06 Bonni Azad M Methods and compositions for treating and preventing tumors
PL2009992T3 (pl) * 2006-04-21 2012-11-30 Glaxosmithkline Llc Antagoniści receptora IL-8
WO2008036419A2 (en) 2006-09-22 2008-03-27 The Regents Of The University Of Michigan Aldehyde dehydrogenase 1(aldh1) as a cancer stem cell marker
JP5311439B2 (ja) * 2006-12-27 2013-10-09 日本メナード化粧品株式会社 皮膚の状態を評価する方法及びその用途
CN101126758A (zh) * 2007-09-06 2008-02-20 江苏省肿瘤医院 流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法
WO2010009121A2 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Colon stem cells associated with colitis and colorectal cancer and methods of use
KR20110093893A (ko) 2008-11-11 2011-08-18 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간 항-ｃｘｃｒ１ 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110093893A (ko) 2011-08-18
US20150094362A1 (en) 2015-04-02
MX2011005007A (es) 2011-07-28
PL2356462T3 (pl) 2017-07-31
EA201100779A1 (ru) 2011-12-30
JP5716180B2 (ja) 2015-05-13
EP2356462A1 (en) 2011-08-17
HK1206421A1 (en) 2016-01-08
PT2356462T (pt) 2017-04-07
SG10201701954QA (en) 2017-05-30
EP2356462B1 (en) 2017-01-04
KR20140132412A (ko) 2014-11-17
LT2356462T (lt) 2017-03-10
HK1161350A1 (en) 2012-08-24
JP2016065082A (ja) 2016-04-28
CY1118933T1 (el) 2018-01-10
CN104634972B (zh) 2017-06-13
US10557850B2 (en) 2020-02-11
KR20150065930A (ko) 2015-06-15
US8940301B2 (en) 2015-01-27
JP2012508384A (ja) 2012-04-05
CN104623664B (zh) 2018-08-07
NZ602369A (en) 2015-02-27
SI2356462T1 (sl) 2017-05-31
DK2356462T3 (en) 2017-02-27
EA023466B1 (ru) 2016-06-30
AU2009314141B2 (en) 2013-11-07
BRPI0921150A2 (pt) 2020-11-17
IL212822A (en) 2017-05-29
US20150160227A1 (en) 2015-06-11
CN102272599B (zh) 2015-01-14
JP5909783B2 (ja) 2016-04-27
BRPI0921150B1 (pt) 2022-05-10
EP3153862A1 (en) 2017-04-12
JP2014037427A (ja) 2014-02-27
SMT201700181T1 (it) 2017-05-08
ZA201103416B (en) 2012-08-29
ES2623128T3 (es) 2017-07-10
HK1206256A1 (en) 2016-01-08
US20100136031A1 (en) 2010-06-03
MX351889B (es) 2017-11-01
WO2010056753A1 (en) 2010-05-20
CN104634972A (zh) 2015-05-20
CA2743305C (en) 2017-04-04
CN104623664A (zh) 2015-05-20
NZ625440A (en) 2016-01-29
HUE032623T2 (hu) 2017-10-30
EP2356462A4 (en) 2012-09-19
CA2743305A1 (en) 2010-05-20
CN102272599A (zh) 2011-12-07
US9606124B2 (en) 2017-03-28
HRP20170463T1 (hr) 2017-05-19
IL212822A0 (en) 2011-07-31
KR101588547B1 (ko) 2016-01-28
AU2009314141A1 (en) 2010-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5909783B2 (ja) 抗ｃｘｃｒ１組成物および方法
ES2379297T3 (es) Perfil de expresión de cáncer de próstata
US20050009067A1 (en) Expression profile of pancreatic cancer
US20140322234A1 (en) Analysis and Targeting of ROR2 in Cancer
US20060134708A1 (en) Detection and treatment of renal cancer
WO2009111644A2 (en) Compositions and methods for diagnosing and treating pancreatic cancer
AU2014200650B2 (en) Anti-CXCR1 compositions and methods
HK1206256B (zh) 抗cxcr1组合物和方法
HK1206421B (en) Anti-cxcr1 compositions and methods
HK1161350B (zh) 抗cxcr1组合物和方法
HK1236617A1 (en) Anti-cxcr1 compositions and methods