BRPI0921927B1 - Sensibilização de uma resposta imune - Google Patents

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Peter Johannes Holst
Allan Randrup Thomsen
Mirjana Grujic
Jan Pravsgaard Christensen
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Københavns Universitet (University Of Copenhagen)
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Abstract

sensibilização de uma resposta imune. a presente invenção se refere a uma tecnologia e método de sensibilização de uma resposta imune utilizando antígeno ligado a cadeia invariante, quando esses são utilizados para sensibilizar uma imunização de reforço subsequente utilizando qualquer vacina apropriada.

Description

Todas as referências de patente e não patente citadas no presente pedido são pelo presente incorporadas a titulo de referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a uma tecnologia e método de sensibilização de uma resposta imune utilizando antigeno ligado por cadeia invariante, quando esses são utilizados para sensibilizar uma imunização de reforço subsequente utilizando qualquer vacina apropriada. Antecedentes da Invenção
Vacinação é a administração de um material antigênico (uma vacina) a um sujeito para produzir imunidade a uma doença ou condição. Quando utilizada para estimular uma resposta imune, o antigeno é conhecido como imunógeno, e o processo é conhecido como imunização. As vacinações envolvem a administração de um ou mais imunógenos, que podem ser administrados em várias formas.
A vacinação requer o estabelecimento de uma resposta imune sólida. A resposta imune que é ativada por infecção ou vacinação depende da interação de vários tipos de célula, como células que apresentam antigeno, T, B, bem como várias moléculas diferentes, antigenos primários, moléculas de MHC, receptores de células T e B e muito mais.
Vacinas tradicionais ou vacinas de primeira geração se baseiam em cepas patogênicas atenuadas ou mortas. Essas frequentemente sofrem de infectividade reduzida e são frequentemente insuficientemente imunogênicas, resultando em proteção inadequada da vacinação.
O desenvolvimento de vacinas de segunda geração, ou vacinas de subunidade, com base em proteinas antigênicas individuais a partir dos organismos patogênicos revelou que peptideos puros ou carboidratos tendem a serem imunógenos fracos.
Vacinas de DNA, ou vacinas de terceira geração, têm a capacidade de induzir uma faixa mais ampla de tipos de respostas imunes, porém mantém a desvantagem potencial de ter baixa imunogenicidade em seres humanos.
Para todos os tipos de vacinas, programas de vacinação são confrontados com uma necessidade não atendida de potência aumentada de vacina, para superar as limitações mencionadas acima e fornecer um meio mais eficaz em termos de custo de estimular o sistema imune durante vacinação.
A presente invenção é direcionada a resolver o problema associado à baixa imunogenicidade de vacinas por fornecer uma solução para aumentar a potência de vacinas.
A presente invenção é direcionar a resolver o problema associado à baixa imunogenicidade de vacinas por fornecer uma solução para sensibilização de uma resposta imune.
A presente invenção é desse modo dirigida à sensibilização do sistema imune com um constructo de ácido nucléico que compreende cadeia invariante associada à classe II MHC/CD74 (aqui mencionado como cadeia invariante ou li) ou uma variante do mesmo e codificar pelo menos uma proteina antigênica ou um fragmento da proteina antigênica, seguido por uma vacinação de reforço subsequente para aumentar a potência da vacina.
Vacinas de acordo com a presente invenção podem ser dirigidas a um antigeno patogênico ou um antigeno cancerígeno.
Os dados apresentados aqui mostram que não é direto o desenvolvimento de regimes de reforço de sensibilização utilizando constructos de ácido nucléico que compreendem cadeia invariante ou variante da mesma.
De forma surpreendente, a presente invenção revela que o li-KEY (compreendendo residues de aminoácidos LRMK) e/ou parte do dominio li-CLIP a partir da cadeia invariante pode ser alterada sem reduzir os efeitos de sensibilização imune.
Referências do estado da técnica que trataram inadequadamente dessa questão são discutidas abaixo: WO 2007/062656 (Holst e outros) é dirigida ao desenvolvimento de vacinas de DNA aperfeiçoada para estimular a resposta imune em um modo que aumenta a cinética da resposta, simultaneamente tanto como aumento como aperfeiçoamento da resposta. Holst e outros verificaram que a fusão de um antigeno com a cadeia invariante aumentou dramaticamente as respostas de célula T CD4+ e CD8 + antivirais seguintes através de um mecanismo independente de célula T CD4 + .
Holmes e outros (J Clin Oncol. 10 de julho de 2008, 26(20): 3426-33) descrevem o primeiro experimento de fase humana I de uma vacina de peptideo hibrido li-key, em que o li-key compreende a sequência de quatro aminoácidos LRMK, uma porção central da proteina de cadeia invariante.
A descoberta de Kallinteris e outros (Expert Opin. Biol. Ther. 2006, 6(12): 1311, 1321) também é dirigida a utilização da fração li-key compreendendo os aminoácidos LRMK para aumentar a potência da vacina.
US 2008/0095798 (Humphreys e outros) revela um método para aumentar a potência de uma vacina contra um patógeno por primeiramente sensibilizar o sistema imune de um sujeito com umo constructo de peptideo hibrido li-Key compreendendo os residuos LRMK do peptideo li-key, e subseqüentemente administrar uma vacina contra um patógeno para reforçar a resposta imune criada na etapa de sensibilização.
Sumário da invenção
A presente invenção mostra que a sensibilização do sistema imune com um constructo de ácido nucléico compreendendo pelo menos uma cadeia invariante associada à classe I MHC/CD74 (aqui mencionado como cadeia invariante ou li) ou uma variante do mesmo e codificar pelo menos uma proteina antigênica ou um fragmento da proteina antigênica, seguido por uma vacinação de reforço subseqüente aumenta a potência da vacina.
Vacinas de acordo com a presente invenção podem ser dirigidas a um antigeno patogênico ou um antigeno cancerígeno.
De forma surpreendente, a presente invenção revela que o dominio li-KEY (compreendendo residues de aminoácido LRMK) e/ou parte do dominio li-CLIP pode ser parcialmente substituído ou omitido da cadeia invariante sem reduzir os efeitos da sensibilização.
Desse modo, a presente invenção resolveu o problema de estimular adequadamente a resposta imune criada por vacinação por empregar um regime de reforço de sensibilização de etapa dual, pelo que o sistema imune é primeiramente sensibilizado com um constructo de ácido nucléico que compreende cadeia invariante ou uma vacina do mesmo seguido por vacinação de reforço subsequente utilizando qualquer tipo de vacina apropriada, em um modo que aumenta a cinética da resposta, simultaneamente tanto com aumento como aperfeiçoamento da resposta. Em particular, um sistema novo para uma estimulação dirigida, especifica e rápida do sistema imune é pelo presente tornado disponível para aperfeiçoar os regimes de vacinação de todos os animais, como seres humanos.
Esse problema é resolvido pelas modalidades da presente invenção caracterizadas nas reivindicações. Pela presente invenção verificou-se que a sensibilização com umo construct© de ácido nucléico baseado em cadeia li aumenta significativamente a geração de células T CD8+ especificas de antigeno, células T CD4+ e/ou células B após reforço subsequente com uma vacina.
Desse modo é um aspecto da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende sequências codificando pelo menos uma cadeia invariante ou uma variante do mesmo operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que o constructo de ácido nucléico é capaz de sensibilizar o sistema imune para aumentar a imunização após administração de uma vacina subsequente em um sujeito.
A presente invenção em uma modalidade provê um constructo de ácido nucléico que compreende sequências codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que o constructo de ácido nucléico é capaz de sensibilizar imunização por administração de uma vacina subsequente em um sujeito.
Em uma modalidade, a cadeia invariante compreendida no constructo de ácido nucléico da presente invenção pode ser alterada de sua sequência do tipo selvagem sem reduzir o efeito de li.
Desse modo, em uma modalidade, o dominio li-KEY compreendendo os residues de aminoácido LRMK foi alterado por deleção ou substituição como mutação.
Em outra modalidade, parte do dominio li-CLIP foi alterada por deleção ou substituição como mutação. O dominio li-CLIP pode ser especificamente alterado por substituir Metionina na posição 91 e 99 para Alanina; isso aumenta surpreendentemente a apresentação de MHCII.
Em outra modalidade li pode ser especificamente alterado por deletar os 17 primeiros aminoácidos de li; isso aumenta surpreendentemente a resposta de memória.
Conclui-se que cada dessas alterações pode ocorrer separadamente ou em combinação.
Em uma modalidade, a cadeia invariante compreendida no constructo de ácido nucléico da presente invenção é alterada de sua sequência do tipo selvagem quando utilizada para sensibilizar a resposta imune de uma vacina dirigida a um virus, um microorganismo como uma bactéria ou um parasita.
Em outra modalidade, a cadeia invariante compreendida no constructo de ácido nucléico da presente invenção pode ou não ser alterada de sua seqüência do tipo selvagem quando utilizada para sensibilizar a resposta imune de uma vacina de câncer ou uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal.
Em outra modalidade, pelo menos uma parte do constructo de ácido nucléico utilizada para sensibilizar a resposta imune e a vacina subsequente utilizada para reforçar a resposta imune são idênticas. Pelo menos uma parte idêntica do iniciador e reforço pode ser li ou uma variante do mesmo, o peptideo antigênico ou parte do peptideo antigênico, ou um epitopo de célula-T auxiliar ubiquo.
É de modo semelhante um objetivo da presente invenção fornecer um veiculo de distribuição que compreende o construct© de ácido nucléico como detalhado aqui, em que o veiculo de distribuição é um veiculo à base de RNA, um vetor/veiculo baseado em DNA, um veiculo baseado em lipideo, um veiculo baseado em polimero ou um veiculo de RNA ou DNA derivado de modo virai.
Em uma modalidade preferida, o veiculo de distribuição compreende a formação de lipossomas, formação de microesferas de polimero biodegradáveis, revestimento do constructo de ácido nucléico sobre partículas de ouro coloidal ou incorporação em um vetor de RNA ou DNA derivado de forma virai.
Ainda em uma modalidade preferida, o constructo de ácido nucléico ou veiculo de distribuição é administrado por intermédio de injeção de agulha, pistola de gene, injeção de jato, eletroporação, ultra-som ou distribuição hidrodinâmica.
Desse modo, é um aspecto da presente invenção fornecer um meio de estimular uma resposta imune por um constructo de ácido nucléico que compreende sequências codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteína ou peptideo.
Um objetivo adicional provê meio de estimular dispersão intercelular do constructo de ácido nucléico das proteinas codificadas em quaisquer dessas ou quaisquer partes de quaisquer dessas.
É ainda um objetivo da presente invenção fornecer uma proteina quimérica como codificado pelo constructo de ácido nucléico descrita aqui.
É ainda um aspecto da presente invenção fornecer um anticorpo que reconhece a proteina quimérica codificada pelo constructo de ácido nucléico descrito aqui.
É um aspecto da presente invenção fornecer um método para aperfeiçoar a potência de uma vacina compreendendo administrar o constructo de ácido nucléico como detalhado aqui.
Especialmente relevante para a presente invenção é um constructo de ácido nucléico que compreende sequências codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo que é apropriado para sensibilização de uma resposta imune.
É ainda um aspecto da presente invenção fornecer um kit em partes, o kit compreendendo um constructo de ácido nucléico como descrito aqui juntamente com um instrumento médico ou outro meio de administrar o constructo de ácido nucléico, e/ou uma vacina apropriada, e instruções adicionais sobre como utilizar o kit em partes.
Conclui-se que a presente invenção provê meio para potenciar uma resposta imune em um animal, por administrar ao animal um constructo de ácido nucléico como detalhado abaixo.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Sensibilização de DNA com uma cadeia li baseada em vacina de DNA nu.
Figura 2: localização dos dominios e mutações testadas na sequência li.
Figura 3: li aumenta dramaticamente a apresentação de superficie de célula do epitopo derivado de OVA H- 2kb/SINFEKL.
Figura 4: li funciona somente em cis.
Figura 5: deleções e substituições de terminal-N não efetuam capacidade estimuladora li.
Figura 6: deleções e substituições de terminal-C não efetuam capacidade estimuladora li.
Figura 7: somente uma deleção de terminal N- e C reduz capacidade estimuladora li.
Figura 8: resposta de dose de vacinas Ad-GP e Ad-liGP.
Figura 9: comparação de Ad-GP, Ad-liGP e Ad-liCLIPGP para apresentação de classe II MHC.
Figura 10: comparação de Ad-GP, Ad-liGP, Ad-GPLamp-1 e Ad-liΔ17GP em um estudo de curso de tempo in vivo.
Figura 11: comparação de Ad-GP, Ad-liGP, Ad-liΔ17GP, Ad-liKEYGP, Ad-liCLIPGP, Ad-lil-117GP e Ad-lil-199GP em respostas in vivo.
Figura 12: Ad-GP é capaz de sensibilizar um reforço de Ad-liGP subsequente.
Figura 13: Ad-liGP não é capaz de sensibilizar um reforço Ad-liGP ou Ad-GP subsequente.
Figura 14: resposta de dose de vacinas Adli-Gp e Ad- GP.
Figura 15: o receptor de Manose acoplado a uma variante de cadeia invariante compreendendo residues 50 a 215 (1Í50-215), acoplado adicionalmente a uma proteina de fibra adenoviral.
Definições:
Adenovirus: um grupo de virus contendo DNA de fita dupla. Adenovirus podem ser geneticamente modificados fazendo os mesmos incompetentes de replicação ou incompetentes de replicação condicionalmente. Nessa forma, como constructos adenovirais ou adenovetores, podem ser utilizados como veiculos de distribuição de gene para vacinação ou terapia de gene.
Proteína de fibra adenoviral: uma proteína de fibra de qualquer sorotipo de adenovirus. Também é conhecido como knob de fibra adenoviral ou knob de fibra adenoviral com inserções de knob heterólogas.
Adjuvante: qualquer substância cuja mistura com umo constructo de ácido nucléico / antigeno / determinante imunogênico administrado aumente ou de outro modo modifique a resposta imune ao determinante.
Aminoácido: qualquer ácido carboxílico amino de ocorrência natural ou sintética, incluindo qualquer aminoácido que ocorre em peptídeos e polipeptídios incluindo proteínas e enzimas sintetizadas em vivo desse modo incluindo modificações dos aminoácidos. O termo aminoácido é aqui utilizado sinonimamente com o termo "resíduo de aminoácido" que pretende abranger aminoácidos como mencionados que foram reagidos com pelo menos outra espécie, como 2, por exemplo, 3, como mais de 3 outras espécies. O termo genérico aminoácido compreende aminoácidos tanto naturais como não naturais quaisquer dos mesmos podem estar na forma isomérica "D" ou "L". aminoácido pode ser abreviado 'aa'.
Anticorpo: moléculas de imunoglobulina e porções ativas de moléculas de imunoglobulina. Anticorpos são, por exemplo, moléculas de imunoglobulina intactas ou fragmentos das mesmas que retêm a atividade imunológica.
Antigeno: qualquer substância que pode se ligar a um receptor imune distribuído de modo clonal (receptor de célula T ou célula B) . normalmente, um peptideo, polipeptidio ou um polipeptidio multimérico. Antigenos são preferivelmente capazes de eliciar uma resposta imune.
Reforço: reforçar por uma dose ou injeção de reforço é dar uma ou mais doses adicionais de um agente de imunização, como uma vacina, dada em um tempo após uma dose inicial de uma substância utilizada para sensibilizar o sistema imune, manter ou aumentar a resposta imune eliciada pela dose anterior do mesmo agente (homologo) ou outro agente imunizante (heterólogo). transportador: entidade ou composto ao qual antigenos são acoplados para auxiliar na indução de uma resposta imune.
Proteina quimérica: uma proteina geneticamente construída que é codificada por uma seqüência de nucleotideo feita por uma junção de dois ou mais genes completos ou parciais ou uma série de ácidos nucléicos (não) aleatórios.
Complemento: uma série complexa de proteínas de sangue cuja ação "complementa" o trabalho de anticorpos. Complemento destrói bactérias, produz inflamação e regula reações imunes.
Citosina: modulador de diferenciação ou crescimento, utilizado não determinativo aqui, e não deve limitar a interpretação da presente invenção e reivindicações. Além das citosinas, moléculas de acessório ou adesão, ou qualquer combinação das mesmas, podem ser empregadas individualmente ou em combinação com as citosinas.
CTL: linfócitos T citotóxicos. Um subgrupo de células T que expressam CD8 juntamente com o receptor de célula T e, portanto capaz de responder a antigenos apresentados por moléculas de classe I.
Veiculo de distribuição: uma entidade pelo que uma sequência de nucleotideo ou polipeptidio ou ambos pode ser transportado de pelo menos um meio para outro.
Fragmento: utilizado para indicar uma parte de comprimento não total de um ácido nucléico ou polipeptidio. Desse modo, um fragmento é ele próprio também um ácido nucléico ou polipeptidio, respectivamente.
Reforço heterólogo ou reforço de sensibilização; em que a substância utilizada para reforçar o sistema imune é diferente da substância anteriormente utilizada para sensibilizar a resposta imune.
Reforço homólogo ou reforço de sensibilização: em que a substância utilizada para reforçar o sistema imune é igual àquela utilizada anteriormente para sensibilizar a resposta imune. Indivíduo: qualquer espécie ou subespécie de pássaro, mamífero, peixe, anfíbio, ou réptil, incluindo seres humanos.
Cadeia invariante: uma glicoproteína de proteína de membrana integral que associa com e estabiliza moléculas de MHC II no retículo endoplasmático e compartimentos celulares subsequentes. Aqui o termo cadeia invariante cobre todos os genes homólogos fragmentados ou de comprimento total de ocorrência natural ou artificialmente gerados e proteínas de certa similaridade à cadeia invariante humana. Cadeia invariante é pelo presente abreviada li.
Isolado: utilizado com relação a ácidos nucléicos, polipeptídios e anticorpos revelados aqui 'isolado' se refere a esses tendo sido identificados e separados e/ou recuperados de um componente de seu ambiente natural, tipicamente celular. Ácidos nucléicos, polipeptídios e anticorpos da invenção são preferivelmente isolados, e vacinas e outras composições da invenção compreendem preferivelmente ácidos nucléicos isolados, polipeptídios ou anticorpos isolados. MHC: complexo de histocompatibilidade principal, duas subclasses principais de MHC, classe I e Classe II existem.
DNA nu: DNA não associado a histonas; freqüentemente DNA rico em CpG e hipometilado. DNA nu pode ser circular ou linear, por exemplo, um plasmideo circular.
Ácido nucléico: uma cadeia ou seqüência de nucleotideos que transferem informações genéticas. Com relação a presente invenção o ácido nucléico pode ser um ácido desoxirribonucléico (DNA) ou qualquer do grupo que consiste em ácido ribonucléico (RNA), ácido nucléico travado (LNA), ácido nucléico de peptideo (PNA), ácido nucléico de intercalação (INA), ácido nucléico de intercalação torcido (TINA), ácidos nucléicos de hexitol (NA) , ácido arabinonucléico (ANA), ácidos nucléicos de cicloexano (CNA), ácido cicloexenil nucléico (CeNA), ácido nucléico de glicerol (GNA), ácido nucléico de treosila (TNA), Gap-mers, Mix-mers e Morfolinos.
Constructo de ácido nucléico: um ácido nucléico geneticamente construído. Tipicamente compreendendo vários elementos como genes ou fragmentos dos mesmos, promotores, intensificadores, terminadores, caudas poliA, ligadores, poliligadores, ligadores operativos, múltiplos sitios de clonagem (MCS), marcadores, códons de PARADA, outros elementos reguladores, sitios de entrada ribossômica internos (IRES) ou outros.
Ligador operativo: uma seqüência de nucleotideos ou resíduos de aminoácidos que ligam juntos duas partes de um polipeptidio (quimérico) ou constructo de ácido nucléico em um modo garantindo o processamento biológico do ácido nucléico ou polipeptidio.
Patógeno: um agente causativo específico de doença, especialmente um agente biológico como um vírus, bactéria, príon ou parasita que pode causar doença a seu hospedeiro, também mencionado como um agente infective.
Peptideo: pluralidade de resíduos de aminoácidos covalentemente ligados definindo uma seqüência e ligado por ligações de amida. O termo é utilizado analogamente com oligopeptídeo e polipeptidio. Os aminoácidos naturais e/ou não naturais podem ser ligados por ligações de peptideo ou por ligações não peptideo. O termo peptideo também abrange modificações pós-tradução introduzidas por reações catalisadas por enzima ou químicas, como são conhecidas na técnica. O termo pode se referir a uma variante ou fragmento de um polipeptidio.
Veículos farmacêuticos: também denominados excipientes, ou estabilizadores são não tóxicos para a célula ou indivíduo sendo exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídio de peso molecular baixo (menor do que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinil pirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação como EDTA; alcoóis de açúcar como manitol ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS™. Pluralidade: pelo menos dois.
Sensibilização: sensibilização inicial do sistema imune com, por exemplo, DNA para focalizar a resposta imune no imunógeno exigido.
Reforço de sensibilização: sensibilização inicial do sistema imune com, por exemplo, DNA para focalizar a resposta imune no imunógeno exigido, e reforço subsequente da resposta imune com uma vacina, levando a um aumento na resposta imune induzida pela vacina. Promotor: um sítio de ligação em uma cadeia de DNA na qual polimerase de RNA se liga para iniciar transcrição de RNA mensageiro por um ou mais genes estruturais próximos.
Peptideo de sinal: uma seqüência curta de aminoácidos que determina a localização eventual de uma proteina na célula, também mencionado como peptideo de separação.
Vacina apropriada: qualquer vacina para uso de acordo com a presente invenção, capaz de reforçar a resposta imune estimulada pela sensibilização inicial, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma parte do constructo de ácido nucléico utilizada para sensibilizar a resposta imune e a vacina subsequente utilizada para reforçar a resposta imune são idênticas. Pelo menos uma parte idêntica do iniciador e do reforço pode ser li ou uma variante da mesma, o peptideo antigênico ou parte do peptideo antigênico ou um epitopo de célula-T auxiliar ubiquo.
Tensoativo: um agente ativo superficial capaz de reduzir a tensão superficial de um liquido no qual é dissolvido. Também mencionada como uma composição imunogênica no presente texto. Uma resposta imune sendo uma resposta imune (humoral/anticorpo e/ou celular) induzindo memória em um organismo, resultando no agente infeccioso sendo encontrado por uma resposta secundária em vez de primária, desse modo reduzindo seu impacto sobre o organismo hospedeiro. Uma vacina da presente invenção pode ser dada como medicamento profilático e/ou terapêutico. A composição pode compreender um ou mais dos seguintes: antigeno(s), constructos de ácido nucléico compreendendo um ou mais antigenos operativamente ligados a li, veiculos, adjuvantes e veiculos farmacêuticos.
Variante: uma 'variante' de um ácido nucléico de referência dado ou polipeptidio se refere a um ácido nucléico ou polipeptidio que exibe certo grau de homologia/identidade de seqüência para o ácido nucléico de referência ou polipeptidio, porém não é idêntico ao ácido nucléico de referência ou polipeptidio. Dominio, região e motivo podem ser utilizados de forma intercambiável aqui.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a um constructo de ácido nucléico que compreende sequências codificando cadeia invariante ou uma variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou seqüências que codificam peptideo. 0 constructo de ácido nucléico é utilizado para sensibilização de uma resposta imune, para potenciar o efeito de uma vacinação de reforço subsequente. A resposta imune
Vacinas podem ser utilizadas profilaticamente: são dadas antes da ocorrência da infecção efetiva; ou terapeuticamente: onde eliciam ou aceleram uma resposta imune a um patógeno já no corpo. Os dois métodos de vacinação exigem o estabelecimento de uma resposta imune sólida. A resposta imune que é ativada por infecção ou vacinação depende da interação de vários tipos de células, como células T, B e que apresentam antigeno bem como várias moléculas diferentes, principalmente antigenos, moléculas de MHC, receptores de células T e B e muito mais.
Antigenos são fragmentos de peptideo apresentados na superficie de células que apresentam antigeno por moléculas de MHC. Antigenos podem ser de origem estrangeira, isto é, patogênica, ou se originam do próprio organismo, denominados auto-antigenos. As moléculas de MHC são representativas de uma familia de gene polimorfo codificada por uma região cromossômica especifica conhecida como o "complexo de histocompatibilidade principal", consequentemente MHC. Duas classes de moléculas MHC existem, MHC classe I (MHC-I) e MHC classe II (MHC-II).
Células auxiliares-T são estimuladas por antigenos apresentados pelas moléculas MHC classe II (MHC-II) residindo na superficie de células que apresentam antigeno. As moléculas de MHC-II são sintetizadas no reticulo endoplasmático. Durante sintese, combinam com cadeia invariante (li) em um modo que evita que as moléculas MHC- II sejam carregadas com auto-antigenos. A molécula MHC-II é por sequências de sinais na cadeia invariante, transportada para a superfície de célula em um compartimento celular especifico. À medida que o compartimento amadurece pelo processamento de seu conteúdo, progride de ser um lisossoma, para um endossoma tardio (após fusão com vesículas endocitóticas) para um compartimento MHC classe II (MIIC). A vesícula endocitótica contém antigeno estrangeiro, isto é, fragmentos de peptideo bacterianos proteoliticamente clivados. Esses fragmentos são por sua degradação preparados para serem carregados sobre a molécula MHC-II. A molécula MHC-II é liberada pela cadeia invariante em um processo de duas partes quando a cadeia invariante primeiramente é degradada proteoliticamente deixando somente um peptideo denominado CLIP no dominio de ligação MHC-II, em segundo lugar pela remoção de CLIP por uma molécula HLA-DM. A molécula MHC-II é então livre para ligar os antigenos estrangeiros e apresentar esses na superfície da célula após fusão da vesícula MIIC com a membrana de plasma. Isso inicia a resposta imune humoral visto que o antigeno apresentado estimula ativação de uma célula auxiliar-T que por sua vez por vários meios ativar uma célula B, que finalmente diferencia em uma célula de secreção a antigeno.
A resposta imune celular é iniciada quando o receptor de célula T de células citotóxicas T reconhece antigeno ligado à molécula MHC classe I em uma célula que apresenta antigeno. Moléculas de MHC-I não são associadas a uma molécula de uma funcionalidade como a cadeia invariante que associa a MHC-II. O processamento de MHC-I em uma molécula que apresenta antigeno difere adicionalmente daquele de moléculas MHC-II em que a molécula MHC-I é carregada com antigeno já no reticulo endoplasmático. Os antigenos apresentados pela molécula MHC-I são tipicamente fragmentos de peptideo clivados pela proteassoma de proteinas que foram sintetizadas pela própria célula que apresenta antigeno. Essas proteinas podem ser proteinas anormais codificadas no próprio DNA das células ou proteinas derivadas de virus ou outros patógenos que infectaram a célula e atuam como parasita em sua maquinaria de sintese de proteina. O sistema proteolitico relacionado à MHC classe I está presente virtualmente em todas as células.
As funções dos dois tipos de células T são significativamente diferentes, como indicado por seus nomes. Células T citotóxicas erradicam patógenos intracelulares e tumores por lise direta de células e por secretar citosinas como y-interferon. A célula T citotóxica predominante é a célula T CD8+, que também é especifica de antigeno. Células T auxiliares podem lisar também células, porém sua função primária é secretar citosinas que promovem as atividades de células B (células que produzem anticorpo) e outras células T e desse modo aumentam amplamente a resposta imune a antigenos estrangeiros, incluindo mecanismos de resposta mediada por célula T citotóxica e mediada por anticorpo. Células T CD4+ são o principal fenótipo de célula T auxiliar na resposta imune. Constructo de ácido nucléico
Um aspecto da presente invenção refere-se a constructos de ácido nucléico como constructos de DNA nu compreendendo seqüências que codificam pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em resumo um antigeno.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um constructo de ácido nucléico compreendendo seqüências que codificam pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que a cadeia invariante ou variante da mesma não compreende os residues de aminoácido LRMK da região KEY. constructo de ácido nucléico compreendendo seqüências que codificam pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que a cadeia invariante ou variante da mesma compreende uma variante da região CLIP.
Em outra modalidade, a invenção refere-se a um constructo de ácido nucléico que compreende seqüências codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que a cadeia invariante ou variante da mesma não compreende os 17 primeiros aminoácidos.
Ainda em outra modalidade, a invenção refere-se a um constructo de ácido nucléico que compreende seqüências que codificam pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que o constructo de ácido nucléico é utilizado para sensibilização de uma vacina de câncer.
Por constructo de ácido nucléico entende-se um ácido nucléico geneticamente construido. O constructo de ácido nucléico pode ser um ácido nucléico linear e de não replicação, um vetor de expressão circular ou um plasmideo de replicação autônoma. Um constructo de ácido nucléico pode compreender vários elementos como, porém não limitados a genes ou fragmentos dos mesmos, promotores, intensificadores, terminadores, caudas poli-A, ligadores, poliligadores, ligadores operativos, múltiplos sitios de clonagem (MCS), marcadores, códons de PARADA, sitios de entrada ribossômica internos (IRES) e seqüências homólogas hospedeiras para integração ou outros elementos definidos. Deve ser entendido que o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender todos ou um subconjunto de qualquer combinação dos elementos acima mencionados.
Os métodos para elaborar constructos de ácido nucléico são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook e outros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2a edição, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Além disso, constructos de ácido nucléico de acordo com a presente invenção podem ser sintetizados sem padrão, e podem ser obtidos de vários fornecedores comerciais (Por exemplo, Genscript Corporation).
Os residues de ácido nucléico compreendendo o constructo de ácido nucléico podem, em uma modalidade, ser modificados. A modificação pode ser selecionada do grupo que consiste em: acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação, ribosilação, sulfurização e outros.
O constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode, em uma modalidade, ser composto de DNA. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico pode ser composto de um ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA), ácido nucléico fechado (LNA), ácido nucléico de peptideo (PNA), ácido nucléico de intercalação (INA), ácido nucléico de intercalação torcido (TINA), ácidos nucléicos de hexitol (NA), ácido arabinonucléico (ANA), ácidos nucléicos de cicloexano (CNA), ácido cicloexenil nucléico (CeNA), ácido nucléico de glicerol (GNA), ácido nucléico de treosila (TNA), Gap-mers, Mix-mers e Morfolinos.
Como discutido acima, moléculas MHCII são associadas à cadeia invariante durante processamento, até que a cadeia invariante associada seja degradada para permitir carregamento de peptideos antigênicos estrangeiros sobre as moléculas de MHCII. Ao aplicar umo constructo de proteina "externa" compreendendo cadeia invariante - ligador - epitopo, em que a cadeia invariante compreende a região KEY (compreendendo residues de aminoácido LRMK), o constructo de proteina interagirá com a molécula MHCII - contendo urn antigeno - em um ponto quando a molécula MHCII é localizada na superficie extracelular da célula. Portanto, o efeito é externo e depende da capacidade do residuo-KEY de cadeia invariante do constructo de proteina (compreendendo residuos de aminoácido LRMK) para competir pelo carregamento sobre as moléculas MHCII. Em outras palavras, o antigeno já carregado sobre a molécula MHCII durante processamento intracelular deve ser 'despejado' ou removido da molécula MHCII na superficie celular e substituído pelo constructo de proteina compreendendo cadeia invariante - ligador - epitopo. Isso fornece um efeito '1:1' que não pode ser amplificado, e é invariavelmente dependente da presença dos residuos de aminoácido LRMK a partir da cadeia invariante.
O constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção refere-se à aplicação de um constructo de ácido nucléico 'interno' codificando cadeia invariante ou uma variante do mesmo e também codificando um peptideo antigênico ou epitopo, isto é, o constructo de ácido nucléico é transfectado no espaço intracelular de células em um sujeito. 0 constructo de ácido nucléico utilizará a máquina de tradução celular para produzir um produto de cadeia invariante - ligador - epitopo ou cadeia invariante - epitopo que interagirá com a molécula MHCII ou a molécula MHCI - não contendo um antigeno - em um ponto em que a molécula MHC é localizada dentro da célula, como em um endossoma ou MIIC. Portanto, o efeito é interno e não depende da capacidade do dominio KEY de cadeia invariante do constructo de proteina (compreendendo residues de aminoácidos LRMK) competir para carregamento sobre as moléculas MHC. Realmente, o efeito não depende da presença da região li-KEY e seus residuos LRMK. Além disso, isso fornece um efeito que pode ser amplificado, em que um constructo de ácido nucléico pode originar mais de um produto.
O uso 'interno' de um constructo de ácido nucléico tem várias vantagens em relação ao uso 'externo' de um constructo de proteina, como detalhado acima: 1) amplificação; introdução de uma pequena quantidade do constructo de ácido nucléico origina muitos produtos que podem todos se ligar às moléculas MHC, que também pode ser amplificada secundariamente em que os produtos ligados a MHC podem ser adicionalmente reciclados por internalização para aumentar finalmente sua exibição, 2) o uso do próprio sistema de processamento de antigeno das células assegura ligação correta e justa do epitopo à molécula MHC, 3) não há exigência para os residuos LRMK da região li-KEY e o dominio li-CLIP nativo.
Otimização de códon e seqüências de ácido nucléico degenerado A expressão de proteinas funcionais em hospedeiros heterólogos é à base de biotecnologia moderna. Infelizmente, muitas proteinas são dificeis de expressa fora de seus contextos originais. Podem conter elementos reguladores que limitam expressão, vir de organismos que utilizam códigos de nucleotideo não canônicos ou cheio de gene com códons raramente utilizados no hospedeiro desejado. Os aperfeiçoamentos na velocidade e eficiência de sintese de gene tornaram exeqüivel o redesenho de gene completo para expressão máxima de proteina. Por exemplo, a expressão de proteina pode melhorar dramaticamente quando a frequência de códon do gene em estudo é casada com aquela do sistema de expressão de hospedeiro. Por exemplo, uma estratégia de redesenho pode incluir não somente o uso de polarizações de códon ótimas, porém também a alteração de elementos estruturais de mRNA e a modificação de regiões de tradução e iniciação. As técnicas para otimização de códon são conhecidas por pessoa versada na arte, e podem ser executadas por fornecedores comerciais como GenScript Corporation. compreendendo cadeia invariante ou uma variante da mesma de acordo com a presente invenção pode ser otimizado em códon de algum modo de modo a produzir - por tradução na proteina, isto é, aminoácidos - uma seqüência de aminoácido compreendendo uma cadeia invariante que corresponde à seqüência de aminoácidos revelada na SEQ ID NO: 2 (li humano), ou variantes da mesma de acordo com a presente invenção.
De modo semelhante, o constructo de ácido nucléico compreendendo cadeia invariante de acordo com a presente invenção pode ser otimizado em códon de algum modo de maneira a produzir - por tradução para proteina, isto é, aminoácidos - uma seqüência de aminoácidos compreendendo uma cadeia invariante que corresponde à seqüência de aminoácidos de qualquer animal no qual o constructo de ácido nucléico pode ser utilizada para sensibilizar uma resposta imune; incluindo qualquer vertebrado, mamifero, peixe ou pássaro; ou variantes dos mesmos de acordo com a presente invenção.
Polarização de códon: polarização de códon foi identificada como o fator mais importante único em expressão de gene procariótico. O grau no qual um dado códon aparece no código genético varia significativamente entre organismos, entre proteinas expressas em niveis elevado e baixo e mesmo entre porções diferentes do mesmo operon. O motivo para isso é quase certamente porque códons preferidos correlacionam com a abundancia de tRNAs cognatos disponíveis na célula. Essa relação serve para otimizar o sistema de tradução e equilibrar a concentração de códon com concentração de tRNA isoaceptor.
Substituir códons utilizados não frequentemente: em geral, os códons mais raros que um gene contém, menos provável é que a proteina heteróloga será expressa em um nivel razoável naquele sistema hospedeiro especifico. Esses niveis se tornam ainda mais baixos se os códons raros aparecerem em clusters ou na porção terminal-N da proteina. A substituição de códons raros com outros que refletem mais estreitamente a polarização de códon do sistema hospedeiro sem modificar a seqüência de aminoácidos pode aumentar os niveis de expressão de proteina funcional.
Eliminar códons problemáticos: qualquer códon que um organismo utiliza menor do que 5% a 10% do tempo pode causar problemas, independente de onde o mesmo é. Novamente, códons próximos ou adjacentes podem ter mais efeito sobre a expressão de proteina do que poderiam separadamente. A eliminação de códons raros e códons que podem ser lidos como sinais de terminação pode evitar casos de expressão baixa ou não existente.
Expressar proteínas virais em hospedeiros mamíferos: mesmo genes virais podem ser expressos com sucesso em linhagens de células de mamiferos se o gene for adequadamente preparado. As cargas de informações densas de genes virais resultam freqüentemente em quadros de leitura de sobreposição. Muitos genes virais também codificam seqüências reguladoras negativas de atuação cis na seqüência de codificação genes virais podem ser sintetizados novamente não somente para expressar a proteina desejada como também para romper elementos reguladores, desse modo aumentando a produção de proteina. A otimização de códon virai é especialmente útil em pesquisa de vacina de DNA porque aumenta a imunogenicidade do alvo.
Outras limitações: embora polarização de códon desempenhe um grande papel em expressão de gene, a escolha de vetores de expressão e promotores de transcrição também é importante. As seqüências de nucleotideos que circundam a região de terminal-N da proteina são particularmente sensiveis, tanto em relação à presença de códons raros como às identidades dos códons imediatamente adjacentes a AUG de iniciação. Há também certa interação entre tradução e estabilidade de mRNA. Degeneração do código genético Conclui-se a partir do acima que o código genético tem redundância porém sem ambiguidade. Por exemplo, embora códons G7XA e GAG ambos especifiquem ácido glutâmico (redundância) , nenhum deles especifica qualquer outro 5 aminoácido (sem ambiguidade) (vide a tabela de códons abaixo para a correlação completa). Os códons que codificam um aminoácido podem diferir em qualquer de suas três posições. A degeneração do código genético é o que é responsável pela exigência de mutações silenciosas. A 10 degeneração resulta porque um código triplo de quatro bases designa 20 aminoácidos e um códon de parada.
Figure img0001
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A tabela mostra os 20 aminoácidos, códons de partida e parada e os 64 códons possiveis. A direção do mRNA é 5' a 3' .
Substituição sinônima
Mutações ou substituições silenciosas são mutações de DNA que não resultam em uma alteração na seqüência de aminoácidos de uma proteina. Podem ocorrer em uma região não codificação (fora de um gene ou em um intron), ou podem ocorrer em um exon em um modo que não altera a seqüência de aminoácidos final. A frase substituição ou mutação silenciosa é freqüentemente utilizada de forma intercambiável com a substituição ou mutação sinônima de frase; entretanto, mutações ou substituições sinônimas são uma subcategoria do anterior, ocorrendo somente em exons.
Entende-se que o constructo de ácido nucléico compreendendo cadeia invariante ou um variante da mesma de acordo com a presente invenção pode compreender uma substituição sinônima de modo a produzir - por tradução em proteina, isto é, aminoácidos - uma seqüência de aminoácido que compreende uma cadeia invariante que corresponde à seqüência de aminoácidos revelada na SEQ ID NO: 2 (li humano) ou variantes da mesma de acordo com a presente invenção.
De modo semelhante, o constructo de ácido nucléico compreendendo cadeia invariante de acordo com a presente invenção pode compreender uma substituição sinônima de modo a produzir - por tradução em proteina, isto é, aminoácido s- uma seqüência de aminoácido que compreende uma cadeia invariante que corresponde à seqüência de aminoácidos de qualquer animal no qual o constructo de ácido nucléico pode ser utilizado para sensibilizar uma resposta imune; incluindo qualquer vertebrado, mamifero, peixe ou pássaro; ou variantes dos mesmos de acordo com a presente invenção. Substituição não sinônima em aminoácidos sinônimos
Uma substituição não sinônima causa alteração no aminoácido. Entretanto, aminoácidos são agrupados de acordo com as propriedades do aminoácido, e a substituição de um aminoácido com outro aminoácido pode não ter impacto da função ou propriedades da proteina compreendendo o aminoácido se a substituição resultar em um aminoácido sinônimo. Tais substituições podem ser indicadas mutação ou substituição conservativa: uma alteração em uma seqüência de RNA ou DNA que leva à substituição de um aminoácido com um bioquimicamente similar.
Desse modo é entendido que o constructo de ácido nucléico compreendendo cadeia invariante ou uma variante da mesma de acordo com a presente invenção pode compreender uma substituição não sinônima de modo a produzir - por tradução em proteina, isto é, aminoácidos - uma seqüência de aminoácido compreendendo uma variante de cadeia invariante, em que a substituição não sinônima resulta na substituição de um ou mais aminoácidos que são sinônimos.
Substituições sinônimas podem compreender substituição de um aminoácido hidrofóbico com outro aminoácido hidrofóbico; substituição de um aminoácido hidrofilico com outro aminoácido hidrofilico; substituição de um aminoácido polar com outro aminoácido polar; substituição de um aminoácido não polar com outro aminoácido não polar; substituição de um aminoácido positivamente carreqado com outro aminoácido positivamente carregado; substituição de um aminoácido negativamente carregado com outro aminoácido negativamente carregado; substituição de um aminoácido neutro com outro aminoácido neutro; substituição de um aminoácido ambiguo com seu aminoácido carregado ambiguo de cópia como isoleucina e leucina, asparagina e ácido aspártico e glutamina e ácido glutâmico; substituição de um aminoácido aromático com outro aminoácido aromático; aminoácido alifático; ou a substituição de qualquer aminoácido com alanina. Essas substituições podem ser indicadas substituição de valor igual.
Variantes de junção
A junção alternativa é o mecanismo de variação de junção de RNA no qual os exons do transcrito de gene primário, o pré-mRNA, são separados e reconectados de modo a produzir arranjos de ribonucleotideo alternativos. Essas combinações lineares são então submetidas ao processo de tradução onde seqüências especificas e exclusivas de aminoácidos são especificadas, resultando em proteinas de isoforma ou variantes de junção. Desse modo, a junção alternativa utiliza expressão genética para facilitar a sintese de maior variedade de proteinas. Em eucariotas, a junção alternativa é uma etapa importante em direção à eficiência mais elevada, porque as informações podem ser armazenadas muito mais economicamente. Várias proteinas podem ser codificadas em uma seqüência de DNA cujo comprimento seria somente o suficiente para duas proteinas no modo de codificação de procariota.
O constructo de ácido nucléico da presente invenção pode, em uma modalidade, ser projetado de modo a originar múltiplos peptideos antigênicos de fragmentos de peptideos antigênicos e/ou múltiplas cadeias invariantes ou variantes dos mesmos. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 1, como 2, por exemplo 3, como 4, por exemplo 5, como 6, por exemplo 7, como 8, por exemplo 9, como 10, por exemplo 11, como 12, por exemplo 13, como 14, por exemplo 15, como 16, por exemplo 17 como 18, por exemplo 19, como 20 variantes de junção de um peptideo antigênico ou um fragmento do peptideo antigênico.
Mais de uma variante de junção de peptideo antigênico pode abranger peptideos antigênicos idênticos ou não idênticos. Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 1, como 2, por exemplo 3, como 4, por exemplo 5, como 6, por exemplo 7, como 8, por exemplo 9, como 10, por exemplo 11, como 12, por exemplo 13, como 14, por exemplo 15, como 16, por exemplo 17 como 18, por exemplo 19, como 20 variantes de junção de cadeia invariante ou variantes da mesma. Mais de uma variante de junção de cadeia invariante pode abranger cadeia invariante idêntica ou não idêntica ou variantes da mesma.
Em uma modalidade, pelo menos uma variante de junção de cadeia invariante compreende cadeia invariante de comprimento total nativo. Em outra modalidade, pelo menos uma variante de junção de cadeia invariante compreende uma variante de cadeia invariante. Ainda em outra modalidade, pelo menos uma variante de junção de cadeia invariante compreende uma variante de cadeia invariante em que li não compreende os residuos de aminoácidos LRMK da região li- KEY. Em outra modalidade, pelo menos uma variante de junção de cadeia invariante compreende uma variante de cadeia invariante em que li não compreende os residuos M91 e M99 do dominio CLIP. Conclui-se que a variante de junção pode compreender qualquer combinação de peptideos antigênicos idênticos ou não idênticos e/ou cadeia invariante idêntica ou não idêntica ou variantes da mesma.
Desse modo é possivel 'embaralhar' seqüências (exons) compreendendo dominios ou regiões diferentes de cadeia invariante, de modo a obter variantes de cadeia invariante por junção alternativa. Desse modo também é possivel 'embaralhar' seqüências (exons) compreendendo dominios ou regiões diferentes do(s) peptideo(s) antigênico(s), de modo a obter variantes do(s) peptideo(s) antigênico(s) por junção alternativa.
Cadeia invariante
A cadeia invariante (li) ou cadeia invariante associada à MHC classe II ou CD74 ou p31, é uma proteina de membrana integral do tipo não polimórfica II, vide as SEQ ID Nos: 2 e 4 para as seqüências de aminoácidos de li de ser humano e camundongo, respectivamente. Cadeia invariante tem múltiplas funções em maturação de linfócito e em respostas imunes adaptáveis, em particular alvejar compartimentos lisossomais onde a seqüência CLIP li pode ocupar moléculas de MHC classe II até serem fundidas com compartimentos endossomais Pieters J. 1997, Curr. Opin. Immunol., 9:8996). Adicionalmente, foi mostrado como funcionando como um companheiro MHC de classe I (Morris e outros, 2004, Immunol. Res. 30:171-179) e por sua seqüência de alvejar endossomal, para facilitar a proliferação de células T-CD4+, porém não CD8+ dirigidas contra antigeno ligado de forma covalente (Diebold e outros, 2001, Gene Ther. 8:487-493).
A proteina de cadeia invariante compreende vários dominios: um dominio citosólico que inclui um peptideo de separação ou sinal (também conhecido como a seqüência de alvejar lisossomal), um dominio de transmembrana, e um dominio luminal que ele próprio compreende uma região CLIP, região KEY (compreendendo os residuos LRMK), dominio de núcleo e dominio de trimerização. Esses dois dominios são flanqueados por regiões altamente flexíveis (Strumptner-
Cuvelette & Benaroch, 2002, Biochem. Biophys. Acta., 1542:1-13). A cadeia invariante foi caracterizada em vários organismos, incluindo vertebrados (por exemplo, galinha), mamiferos (por exemplo, vaca, cão, camundongo e rato) e ser humano.
A presente invenção refere-se a constructos de ácido nucléico compreendendo sequências em que pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma é especifica de organismo ou pode ser relacionada a um organismo especifico, preferivelmente, pelo menos uma cadeia invariante é de origem vertebrada, mais preferivelmente de origem mamifera e mais preferivelmente de origem humana. Em relação ao presente a seqüência definida por SEQ ID NO: 1 é a seqüência de ácido nucléico da cadeia invariante de ser humano. Em outra modalidade preferida, pelo menos uma cadeia invariante é de origem aviária, mais preferivelmente de Gallus gallus domesticus (galinha). Ainda em outra modalidade preferida, pelo menos uma cadeia invariante é derivada de peixe, mais preferivelmente de peixe que pode ser cultivado em uma fazenda de criação de peixe (como salmão ou truta). Ainda em outra modalidade preferida, pelo menos uma cadeia invariante é derivada de um furão.
A cadeia invariante empregada é preferivelmente a cadeia invariante do organismo que deve receber constructo de ácido nucléico. É um objetivo da presente invenção que a cadeia invariante e os organismos hospedeiros ou receptores do tratamento sejam da mesma espécie.
Em uma modalidade da invenção, o constructo de ácido nucléico compreendendo pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma com a condição de que quando o constructo de ácido nucléico compreende uma variante de pelo menos uma cadeia invariante, a cadeia invariante não compreende os residuos de aminoácidos LRMK da seqüência li-KEY. Em outra modalidade da invenção, o constructo de ácido nucléico compreendendo pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma é com a condição de que quando o constructo de ácido nucléico compreende uma variante de pelo menos uma cadeia invariante, a cadeia invariante compreende uma variante do dominio li-CLIP. A variante é em uma modalidade uma substituição de metionina em posições 91 e 99 com outro aminoácido. A variante é em outra modalidade uma mutação de ponto M91A M99A dupla (substituição do aminoácido metionina para alanina nas posições 91 e 99). Em outra modalidade, a variante li é uma deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li (Δ1711). Em uma terceira modalidade, a variante li compreende tanto uma substituição de metionina nas posições 91 e 99 como uma relação dos 17 primeiros aminoácidos de li.
Os inventores descobriram surpreendentemente que os residuos LRMK se o dominio li-KEY não são essenciais para sensibilização de uma resposta imune de acordo com a presente invenção.
Além disso, os inventores verificaram surpreendentemente que a substituição de metionina nas posições 91 e 99 deli aumenta a apresentação de MHCII.
Adicionalmente, os inventores verificaram que a deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li aumenta surpreendentemente a resposta da memória.
Os inventores verificaram ainda que uma parte central da cadeia invariante compreendendo residuos número 50 a 118 é essencial para obter o efeito total da mesma. Essa variante de li não tem um dominio de trimerização. Desse modo, em uma modalidade o constructo de ácido nucléico compreende pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma em que a cadeia invariante compreende residuos de aminoácidos número 50 a 118 acoplados a um dominio de trimerização de outra proteina. A outra proteina pode ser, por exemplo, uma proteina bacteriana ou uma proteina de fibra adenoviral.
A presente invenção também se refere a um constructo de ácido nucléico em que pelo menos uma cadeia invariante codificada é um fragmento da seqüência identificada na SEQ ID NO: 2 de pelo menos 40 aminoácidos e de pelo menos 85% de identidade do mesmo fragmento de SEQ ID NO: 2.
O fragmento é um fragmento de pelo menos 40 aminoácidos de qualquer parte da cadeia invariante como exposto na SEQ ID NO: 2. Isso inclui um fragmento incluindo residues 1 a 40, 10 a 50, 20 a 60, 25 a 65, 30 a 70, 35 a 75, 40 a 80, 45 a 85, 50 a 90, 55 a 95, 60 a 100, 65 a 105, 70 a 110, 75 a 115, 80 a 120, 85 a 125, 90 a 130, 95 a 135, 100 a 140, 105 a 145, 110 a 150, 115 a 155, 120 a 160, 125 a 165, 130 a 170, 135 a 175, 140 a 180, 145 a 185, 150 a 190, 155 a 195, 160 a 200,165 a 205, 170 a 210 e 175 a 216. Também inclui fragmentos como qualquer dos acima listados expandindo até 5 residues para qualquer lado do presente. Inclui ainda fragmento de pelo menos 50 residues, de pelo menos 60 residues, de pelo menos 70 residues, de pelo menos 80 residues, de pelo menos 90 residues, de pelo menos 100 residues, de pelo menos 110 residues, de pelo menos 120 residues, de pelo menos 130 residues, de pelo menos 140 residues, de pelo menos 150 residues, de pelo menos 160 residues, de pelo menos 17 0 residues, de pelo menos 180 residues, de pelo menos 190 residuos, de pelo menos 200 residues e de pelo menos 210 residues.
Quaisquer dos fragmentos descritos acima de pelo menos 85% de identidade de seqüência, por exemplo, pelo menos 91% de identidade de seqüência, como pelo menos 92% de identidade de seqüência, por exemplo, pelo menos 93% de identidade de seqüência, como pelo menos 94% de identidade de seqüência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de seqüência, como pelo menos 96% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 97% de identidade de seqüência, como pelo menos 98% de identidade de seqüência, por exemplo 99% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 2 são incluidos no escopo da presente invenção.
A identidade/homologia entre seqüências de aminoácidos pode ser calculado utilizando matrizes de marcação bem conhecidas como qualquer uma de BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, e BLOSUM 90.
Em uma modalidade a presente invenção é umo constructo de ácido nucléico em que pelo menos uma cadeia invariante codificada é um fragmento de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 186 aminoácidos. Isso inclui quaisquer dos fragmentos como definido acima, e que desse modo partilham identidade com a seqüência da cadeia invariante de SEQ ID NO: 2.
A presente invenção refere-se ainda a um constructo de ácido nucléico em que pelo menos uma cadeia invariante codificada é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 2.
Isso abrange que qualquer seqüência derivada da cadeia invariante como colocada na SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 90% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 92% de identidade de seqüência, como pelo menos 92% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 93% de identidade de seqüência, como pelo menos 94% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 95% de identidade de seqüência, como pelo menos 96% de identidade de seqüência, por exemplo pelo menos 97% de identidade de seqüência, como pelo menos 98% de identidade de seqüência, por exemplo 99% de homologia de seqüência com SEQ ID NO: 2 são incluidos no escopo da presente invenção. Isso inclui seqüências que são mais longas ou mais curtas do que a seqüência descrita na SEQ ID NO: 2.
Quaisquer das seqüências descritas acima independente de origem, identidade de seqüência ou comprimento são daqui em diante denominados variantes de cadeia invariante.
Conclui-se que está compreendido no escopo da presente invenção que uma variante de cadeia invariante de qualquer organismo pode ser uma variante de acordo com o acima, isto é, que a variante pode ser alterada na região li-KEY e/ou ser alterada na região li-CLIP e/ou ser um fragmento da cadeia invariante de um organismo e/ou ser pelo menos 85% idêntico à cadeia invariante sobre toda a seqüência da cadeia invariante ou no fragmento da mesma. A cadeia invariante também pode ser de uma espécie relacionada de organismos ou ser de uma espécie distantemente relacionada.
Outro aspecto da presente invenção refere-se à adição, remoção ou substituição de regiões, peptideos ou dominio de pelo menos uma cadeia invariante como codificado pelo constructo de ácido nucléico. A remoção de uma ou mais dessas regiões, peptideos ou dominios truncará a cadeia invariante resultante. A adição ou substituição de uma região, peptideo ou dominio inclui as opções de escolher essas seqüências de fontes conhecidas como proteínas ou polipeptidios de ocorrência natural ou de polipeptidios artificialmente sintetizados ou residuos de ácido nucléico que codificam os mesmos. A adição de regiões, dominio ou peptideos inclui a opção de adicionar um, dois ou mais de cada tipo ou de tipos diferentes de regiões, dominios, peptideos e um, dois, três ou mais dos ácidos nucléicos que codificam essas regiões, dominios e peptideos. Esses podem ser idênticos ou diferir entre si com base na seqüência. As regiões, peptideos e dominios não necessitam se originar do mesmo organismo como a cadeia invariante de armação.
A remoção de regiões, dominios ou peptideos inclui a opção de remover um, dois, três ou mais de cada tipo ou de tipos diferentes de regiões, dominios, peptideos e remover um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte ou mais dos residuos de aminoácidos codificando essas regiões, dominios e peptideos. É bem conhecido do estado da técnica a execução de adições, deleções e substituições de individuais bem como trechos de nucleotideos que codificarão o polipeptidio resultante.
O alinhamento de ácido nucléico e especialmente seqüências de proteina de genes homólogos ou proteinas de organismos diferentes pode ser de grande auxilio ao determinar quais substituições, deleções, rearranjos ou outras alterações seriam vantajosas para constructo. O alinhamento de seqüências de cadeia invariante humanas e de murinos como ilustrado abaixo, fornece uma indicação de quais residuos de aminoácidos podem ser de importância para a estrutura e função da cadeia invariante nesses organismos - esses são os residuos que são conservados entre as duas seqüências. De modo semelhante, os residuos presumivelmente menos importantes são aqueles nos quais as seqüências diferem. É de interesse em relação a presente invenção executar substituições e/ou deleções das regiões/residuos variantes. Ao tentar mudar ou deletar ou de outro modo alterar a seqüência, por exemplo, de cadeia invariante humana para aperfeiçoar sua capacidade de estimular resposta imune, pode ser também relevante examinar os residuos conservados e fazer, por exemplo, substituições homólogas (isto é, substituições onde os aminoácidos são considerados como sendo, por exemplo, da mesma qualidade estrutural, polaridade, hidrofobicidade ou outro).
Os residuos de aminoácidos LRMK das regiões KEY são sublinhados no alinhamento abaixo da proteina de cadeia invariante derivada de ser humano e camundongo. humano 1 MDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQG murino 1 MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPE-RCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQG humano 61 RLDKLTVTSQNLQLENI^MKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGN murino 60 RLDKLTITSQNLQLESLRMKLPKSAKPVSQMRMATPLLMRPMSMDNMLLGPVKNVTKYGN humano 121 MTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRH murino 120 MTQDHVMHLLTRSGPLE-YPQLKGTFPENLKHLKNSMDGVNWKIFESWMKQWLLFEMSKN humano 181 SLEQK-PTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM murino 179 SLEEKKPTEAPPKEPLDMEDLSSGLGVTRQELGQVTL Região KEY
Uma modalidade preferida da presente invenção se refere à remoção, substituição ou recolocação da região KEY de pelo menos uma cadeia invariante. Como descrito acima, a adição ou substituição da região KEY inclui as opções de adicionar ou substituir a região KEY existente na variante da cadeia ou cadeias invariantes escolhidas, com regiões
KEY de cadeias invariantes dos mesmos ou de outros organismos ou de variantes das regiões KEY a partir dos mesmos ou de outros organismos. As regiões KEY variantes podem, como se conclui a partir de cima, ser versões mutantes especificamente geradas da região KEY, geradas por substituições, deleções ou adições de ácido nucléico individual ou múltiplo. Uma modalidade preferida compreende individualmente as sequências N-terminalmente ou C- terminalmente adjacentes à região KEY, porém sem a própria região KEY. Por adjacente quer se dizer quaisquer aminoácidos nos 10 residues da região KEY, nos 20 residues, nos 30 residues, nos 40 residues, nos 50 residuos, nos 75 residues ou nos 100 residuos da região KEY.
Uma modalidade mais preferida compreende uma ou mais substituições ou deleções da região KEY, resultando na substituição ou deleção de um, dois, três ou quatro residuos aminoácidos dos aminoácidos LRMK compreendidos na região KEY. Em uma modalidade, pelo menos um, como dois, por exemplo, três, como quatro dos aminoácidos LRMK compreendidos na região KEY são deletados. Em outra modalidade, pelo menos um, como dois, por exemplo, três, como quatro dos aminoácidos LRMK compreendidos na região KEY são substituídos por outros aminoácidos. Os aminoácidos podem ser qualquer aminoácido selecionado do grupo que consiste em: G (glicina), P (prolina), A (alanina), V (valina), L (leucina), I (isoleucina), M (metionina), C (cisteina), F (fenilalanina), Y (tirosina), W (triptofano), H (histidina), K (lisina), R (arginina), Q (glutamina), N (asparagina), E (ácido glutâmico), D (ácido aspártico), S (serina) e T (treonina).
Em uma modalidade especifica, os residuos de aminoácidos LRMK são individualmente substituídos com residuos de aminoácidos de alanina (A), desse modo a seqüência lê: AAAA. Em outra modalidade, os residuos de aminoácidos LRMK são substituídos com aminoácidos que compreendem substituições de valor igual ou sinônimos. Por exemplo, o residue de aminoácido L pode ser substituído com I, V, M ou F; R pode ser substituído com K, H, E ou D; M pode ser substituído com L, I, F ou V; e K pode ser substituído com H ou R.
Em uma modalidade da presente invenção, a região KEY pode compreender mais dos residuos LRMK, ou os residuos LRMK podem ser substituídos com uma seqüência de mais de quatro residuos de aminoácidos.
Uma modalidade da presente invenção refere-se a fragmentos de cadeia invariante como descrito acima sem a região KEY. Esses fragmentos podem ter pelo menos 5 residuos de aminoácidos de comprimento, pelo menos 10 resíduos, pelo menos 15 residuos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos, pelo menos 30 resíduos ou pelo menos 35 resíduos em comprimento. Outra modalidade refere- se a fragmentos de cadeia invariante em que o peptideo de sinal é removido e o fragmento de cadeia invariante tem pelo menos 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos 15 resíduos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos, pelo menos 30 resíduos, pelo menos 35 resíduos, pelo menos 50 resíduos, pelo menos 60 resíduos, pelo menos 70 resíduos, pelo menos 80 resíduos, pelo menos 90 resíduos, pelo menos 100 resíduos, pelo menos 110 resíduos, pelo menos 120 resíduos, pelo menos 130 resíduos, pelo menos 140 resíduos, pelo menos 150 resíduos, pelo menos 160 resíduos, pelo menos 170 resíduos, ou pelo menos 180 resíduos de comprimento.
Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma cadeia invariante codificada pelo constructo de ácido nucléico como descrito aqui não compreende os resíduos de aminoácidos LRMK da região li-KEY.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere desse modo a umo constructo de ácido nucléico compreendendo pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma, ligada a pelo menos uma proteína antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteína ou peptideo, em que a cadeia invariante ou variante da mesma não compreende os residuos de aminoácidos LRMK da região li-KEY.
Região CLIP
Outra modalidade da presente invenção se refere à remoção, adição ou substituição da região CLIP de pelo menos uma cadeia invariante. Como descrito acima, a adição ou substituição da região CLIP inclui as opções de adicionar ou substituir a região CLIP existente na variante da cadeia ou cadeias invariantes escolhidas, com as regiões CLIP de cadeias invariantes dos mesmos ou de outros organismos ou de variantes das regiões CLIP dos mesmos ou de outros organismos. As regiões CLIP variantes podem, como se conclui a partir de cima, ser versões mutantes especificamente geradas da região CLIP, geradas por substituições, deleções ou adições de ácido nucléico individual ou múltiplo. Uma modalidade preferida compreende a região CLIP individualmente ou a região CLIP juntamente com a seqüência N-terminalmente adjacente ou a seqüência C- terminalmente adjacente sem quaisquer outras regiões ou dominios de cadeia invariante. Outras modalidades preferidas compreendem individualmente as seqüências N- terminalmente ou C-terminalmente adjacentes à região CLIP, porém sem a própria região clip. Por adjacente quer se dizer quaisquer aminoácidos nos 10 residuos da região clip, nos 20 resíduos, nos 30 residuos, nos 40 residuos, nos 50 residuos, nos 75 residuos ou nos 100 resíduos da região CLIP.
Uma modalidade preferida compreende uma ou mais substituições ou deleções da região CLIP, resultando na substituição ou deleção de um, dois, três ou quatro resíduos aminoácidos compreendidos na região CLIP. Em uma modalidade, pelo menos um, como dois, por exemplo, três, como quatro ou mais dos aminoácidos compreendidos na região CLIP são deletados. Em outra modalidade, pelo menos um, como dois, por exemplo, três, como quatro ou mais dos aminoácidos compreendidos na região CLIP são substituídos por outros aminoácidos. Os aminoácidos podem ser qualquer aminoácido selecionado do grupo que consiste em: G (glicina), P (prolina), A (alanina), V (valina), L (leucina), I (isoleucina), M (metionina), C (cisteina), F (fenilalanina), Y (tirosina), W (triptofano), H (histidina), K (lisina), R (arginina), Q (glutamina), N (asparagina), E (ácido glutâmico), D (ácido aspártico), S (serina) e T (treonina).
Uma modalidade da presente invenção se refere a fragmentos de cadeia invariante como descrito acima sem a região CLIP. Esses fragmentos podem ter pelo menos 5 resíduos de aminoácido de comprimento, pelo menos 10 residuos, pelo menos 20 residuos, pelo menos 25 residuos, pelo menos 30 residuos ou pelo menos 35 residuos em comprimento. Outra modalidade refere-se a fragmentos de cadeia invariante em que o peptideo de sinal é removido e o fragmento de cadeia invariante tem pelo menos 10 residuos de aminoácidos de comprimento, pelo menos 15 residuos, pelo menos 20 residuos, pelo menos 25 residuos, pelo menos 30 residuos, pelo menos 35 residuos, pelo menos 50 residuos, pelo menos 60 residuos, pelo menos 70 residuos, pelo menos 80 residuos, pelo menos 90 residuos, pelo menos 100 residuos, pelo menos 110 residuos, pelo menos 120 residuos, pelo menos 130 residuos, pelo menos 140 residuos, pelo menos 150 residuos, pelo menos 160 residuos, pelo menos 170 residuos, ou pelo menos 180 residuos de comprimento.
Em uma modalidade especifica, os residuos de aminoácidos M nas posições 91 e 99 são individualmente substituidos com residuos de aminoácido de alanina (A) , desse modo a seqüência lê: M91A M99A. Em outra modalidade, os residuos de aminoácidos M nas posições 91 e 99 são substituidos com aminoácidos que compreendem substituições de valor igual ou sinônimo.
Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma cadeia invariante codificada pelo constructo de ácido nucléico como descrito aqui não compreende os residuos de aminoácido M nas posições 91 e 99 da seqüência li-CLIP.
Em uma modalidade, a presente invenção desse modo se refere a um constructo de ácido nucléico compreendendo pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma, ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo, em que a cadeia invariante ou variante da mesma não compreende os residuos de aminoácidos M nas posições 91 e 99 da região li-CLIP.
Alterações de terminal N ou C:
Uma modalidade da presente invenção se refere à remoção (deleção), substituição, ou recolocação das regiões terminais N ou C de pelo menos uma cadeia invariante. Como descrito acima, a adição ou substituição das regiões terminais N ou C inclui as opções de adicionar ou substituir as regiões terminais N ou C na variante da cadeia ou cadeias invariantes escolhidas, com regiões terminais N ou C de cadeias invariantes ou outras proteinas dos mesmos organismos ou de outros organismos ou de variantes de regiões terminais N ou C a partir dos mesmos ou de outros organismos. As regiões terminais N ou C variantes podem, como se conclui a partir de cima, ser versões mutantes especificamente geradas das regiões terminais N ou C, geradas por substituições, deleções ou adições de ácido nucléico único ou múltiplo.
Uma modalidade compreende a deleção dos primeiros aminoácidos (terminais-N) ou últimos (terminais-C) de li, como o primeiro ou último 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ou 150 aminoácidos de li.
Em uma modalidade especifica da presente invenção, a variante li compreende uma deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li (Δ1711).
Uma modalidade da presente invenção se refere a fragmentos de cadeia invariante como descrito acima sem as regiões terminais N ou C completas. Esses fragmentos podem ter pelo menos 5 residuos de aminoácido, pelo menos 10 residuos, pelo menos 15 residuos, pelo menos 20 residuos, pelo menos 25 residuos, pelo menos 30 residuos ou pelo menos 35 residuos em comprimento. Outra modalidade refere- se a fragmentos de cadeia invariante em que o peptideo de sinal é removido e o fragmento de cadeia invariante tem pelo menos 10 residuos de aminoácidos de comprimento, pelo menos 15 residuos, pelo menos 20 residuos, pelo menos 25 residuos, pelo menos 30 residuos, pelo menos 35 residuos, pelo menos 50 residuos, pelo menos 60 residuos, pelo menos 70 residuos, pelo menos 80 residuos, pelo menos 90 residuos, pelo menos 100 residuos, pelo menos 110 residuos, pelo menos 120 residuos, pelo menos 130 residuos, pelo menos 140 residuos, pelo menos 150 residuos, pelo menos 160 residuos, pelo menos 170 residuos, ou pelo menos 180 residuos de comprimento.
Em uma modalidade da presente invenção, todo ou parte do segmento de transmembrana de li pode ser substituído com o segmento correspondente de qualquer outra proteina, tal como o receptor de quimiocine CCR6 TM6.
Em outra modalidade da presente invenção, todo ou parte do segmento de transmembrana de li pode ser substituído com o segmento correspondente do receptor de quimiocine CCR6 TM6. Peptideo Sinal
Outra modalidade da presente invenção se refere à pelo menos uma cadeia invariante em que o peptideo de sinal é removido, substituído ou adicionado na seqüência codificando a cadeia invariante. Um peptideo sinal é uma seqüência curta de aminoácidos que determina a localização eventual de uma proteina na célula, também denominado como um peptideo de seleção. Peptideos sinais que determinam a localização de proteinas para compartimentos subcelulares como o reticulo endoplasmático, aparelho de golgi e os vários compartimentos compreendendo o aparelho de golgi, o núcleo, a membrana de plasma, mitocôndria e os vários espaços e membranas aqui, peroxisomas, lisossomas, endossomas e vesiculas secretoras entre outras são todos incluidos no escopo da presente invenção. Uma modalidade preferida compreende individualmente a seqüência de alvejamento lisossomal de cadeia invariante.
Antigeno
Quaisquer das variantes acima de cadeia invariante são abrangidas na presente invenção na forma em que pelo menos uma das variantes é operativamente ligada a pelo menos um antigeno como uma proteina antigênica ou peptideo ou um fragmento antigênico da proteina ou peptideo.
É um objetivo da presente invenção incluir porém não limitar as proteinas antigênicas ou peptideos ou fragmentos das proteinas ou peptideos a originar dos organismos patogênicos, polipeptidios específicos de câncer e antigenos, e proteinas ou peptideos associados a uma resposta fisiológica anormal.
Mais preferivelmente é um objetivo da presente invenção incluir um antigeno originado de quaisquer dos seguintes tipos de patógenos: virus, microorganismos e parasitas. Isso inclui patógenos de qualquer animal conhecido. É preferível ter um antigeno de um patógeno de mamifero, isto é, um patógeno que especificamente alveja animais mamíferos como um furão. Prefere-se ter um antigeno de um patógeno humano. Em geral, qualquer antigeno que se verificar estar associado a um patógeno humano ou doença pode ser utilizado.
Em outra modalidade, é preferível ter um antigeno de um patógeno de ave, isto é, um patógeno que especificamente alvejará pássaros ou aves. É mais preferido ter um antigeno de uma galinha (gallus gallus domesticus). Em geral, qualquer antigeno que se verifica ser associado a um patógeno de ave pode ser utilizado.
Ainda em outra modalidade, é preferivelmente ter-se um patógeno de peixe, isto é um patógeno que especificamente alveja peixe. É mais preferido ter-se um antigeno de um peixe que pode ser criado em uma fazenda de criação de peixes. Em geral, qualquer antigeno que se verifica estar associado a um patógeno de peixe pode ser utilizado. Antigenos virais Em uma modalidade preferida pelo menos um antigeno pode se originar de, porém não é limitado a quaisquer das seguintes familias de virus: Adenovirus, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, caliciviridae, coronaviridae, flaviviridae, herpesviridae, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, picornaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae, rhabdoviridae e togaviridae.
Mais especificamente pelo menos urn antigeno ou seqüência antigênica pode ser derivado de qualquer dos seguintes virus: influenza A como H1N1, H1N2, H3N2 e H5N1 (gripe aviária), influenza B, virus de Influenza C, virus de Hepatite A, virus de Hepatite B, virus de Hepatite C, virus de Hepatite D, virus de Hepatite E, Rotavirus, qualquer virus do grupo de virus Norwalk, adenovirus entérico, parvovirus, virus de febre de Dengue, virus da variola do macaco, Mononegavirales, Lyssavirus como virus da raiva, virus de morcego Lagos, virus Mokola, virus Duvenhage, virus de morcego europeu 1 & 2 e virus de morcego australiano, Efemerovirus, Vesiculovirus, virus de estomatite vesicular (VSV), virus de Herpes como virus de Herpes simplex tipos 1 e 2, varicella zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV), virus de herpes humano (HHV), virus de herpes humano tipo 6 e 8, virus de imunodeficiência humana (HIV), virus de papiloma, virus de herpes gama murino, arenavirus como virus de febre hemorrágica da Argentina, virus de febre hemorragia da Bolivia, virus de febre hemorrágica associado a Sabia, virus de febre hemorrágica da Venezuela, virus de febre Lassa, virus Machupo, virus de coriomeningite Linfocitica (LCMV), Bunyaviridiae como virus de febre hemorrágica da Criméia-Congo, Hantavirus, febre hemorrágica com virus que causa sindrome renal, virus de febre Rift Valley, Filoviridae (vilovirus) incluindo febre hemorrágica Ebola e febre hemorrágica Marburg, Flaviviridae incluindo virus de doença de Kaysanur Forest, virus de febre hemorrágica Omsk, virus que causa encefalite transmitido por carrapato e Paramyxoviridae como virus Hendra e virus Nipah, variola maior e variola menor (variola), alfavirus, como virus de encefalite equina de Venezuela, virus de encefalite eqüina do leste, virus de encefalite eqüina do oeste, coronavirus associado à SARS (SARS-CoV), virus de West Nile, qualquer virus que cause encefalite.
Em uma modalidade preferida da invenção pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo é de um virus selecionado do grupo de: HIV, virus de hepatite C, virus de influenza, virus de herpes, Lassa, Ebola, variola, gripe aviária, filovirus, Marbur, e virus de papiloma.
Em uma modalidade mais preferida da invenção pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo é selecionado do grupo de e/ou pode ser pelo menos um fragmento antigênico de qualquer um dos seguintes: glicoproteina de virus de estomatite vesicular (VSV-GP); Influenza A NS-1 (proteina não estrutural 1), Ml (proteina de matriz 1), NP (nucleoproteina) , NEP, M2, M2e, HA, NA, PA, PB1, PB2, PB1- F2; LCMV NP, LCMV GP; Ebola GP, Ebola NP; antigenos HIV tat, vif, rev, vpr, gag, pol, nef, env, vpu; antigenos SIV tat, vif, rev, vpr, gag, pol, nef, env; virus de herpes gama murino M2, M3 e ORF7 3 (como MHV-68 M2, M3 e ORF73) ; Ovalbumina de galinha (OVA); ou um epitopo de célula T auxiliar. Está compreendido no escopo da invenção combinar dois ou mais de quaisquer dos antigenos aqui mencionados.
Antigenos de microorganismos
Uma modalidade da presente invenção inclui pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento de uma proteina antigênica ou peptideo de um microorganismo. Mais especificamente pelo menos um antigeno pode ser derivado de um dos seguintes de uma lista não exaustiva: Antrax (Bacillus anthracis), Mycobacterium tuberculosis, Salmonella (Salmonella gallinarum, S. pullorum, S. typhi, S. enteridtidis, S. paratyphi, S. dublin, S. typhimurium), Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtherias, Bordetella pertussis, neoformans, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes, Leptospira species, Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Streptococcus espécie como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae, Vibrio species como Vibrio cholerae 01, V. cholerae non-01, V. parahaemolyticus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. furnissii, V. carchariae, V. hollisae, V. cincinnatiensis, V. metschnikovii, V. damsela, V. mimicus, V. fluvialis, V. vulnificus, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria & Aeromonas veronii, Plesiomonas shigelloides, Shigella espécie como Shigella sonnet, S. boydii, S. flexneri, e S. dysenteriae, Enterovirulent Escherichia coli EEC (Escherichia coli enterotoxigênico (ETEC), Escherichia coli enteropatogênico (EPEC), Escherichia coli 0157:H7 entero- hemorrágico (EHEC), Escherichia coli - enteroinvasivo (EIEC)), espécie de Staphylococcus, como S. aureus e especialmente a espécie resistente/intermediária a vancomicina (VISA/VRSA) ou a espécie resistente a multidrogas (MRSA), espécie de Shigella, como S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae, Cryptosporidium parvum, espécie de Brucella como B. abortus, B. melitensis, B.ovis, B. suis, e B. canis, Burkholderia mallei e Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Francisella tularensis, Rickettsia prowazekii, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis.
Em uma modalidade preferida da invenção pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo é de um microorganismo selecionado do grupo de: Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, espécie de Staphylococcus e espécie de Vibrio.
Antigeno parasitico
Uma modalidade da invenção refere-se a umo constructo de ácido nucléico, em que pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo codificado de um parasita.
Outra modalidade da presente invenção refere-se a umo constructo de ácido nucléico que compreende combinações de pelo menos duas proteinas antigênicas ou peptideos de quaisquer dos patógenos acima mencionados.
Preferivelmente o antigeno é derivado de, porém não limitado a, um parasita selecionado do grupo de: espécie de Plasmódio como Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Endolimax nana, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidum parvum, Blastocystis hominis, Trichomonas vaginalis, Toxoplasma gondii, Cyclospora cayetanensis, Cryptosporidium
Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania mexicana, espécie Acanthamoeba como Acanthamoeba castellanii, e A. culbertsoni, Naegleria fowleri , Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma brucei gambiense, Isospora belli, Balantidium coli, vermes redondos (Ascaris lumbricoides) , vermes tipo gancho (Necator Americanus, Ancylostoma duodenal) , vermes de pino (Enterobius vermicularis) , vermes redondos (Toxocara canis, Toxocara cati), verme do coração (Dirofilaria immitis), Strongyloides (Stronglyoides stercoralis), Trichinella (Trichinella spiralis), Filaria (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Loa loa, Mansonella streptocerca, Mansonella perstans, Mansonella ozzardi), e Anisakine larvae (Anisakis simplex) (verme de arenque,) , Pseudoterranova (Phocanema, Terranova) decipiens (verme de bacalhau ou focam), Contracaecum species, e Hysterothylacium (Thynnascaris species) Trichuris trichiura, tênia do gado (Taenia saginata) , tênia de porco (Taenia solium), parasita de peixe (Diphyllobothrium latum) , e parasita de cão (Dipylidium caninum), fasciola Intestinal (Fasciolopsis buski), fasciola de sangue (Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni) Schistosoma haematobium), fasciola hepática (Paragonimus westermani), e fasciola hepática de carneiro (Fasciola hepatica), Nanophyetus salmincola e N. schikhobalowi.
Em uma modalidade preferida da invenção pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo é de um parasita selecionado do grupo de: espécie de Plasmodium, espécie de Leishmania e espécie de Trypanosoma.
Pelo menos um antigeno da presente invenção pode ser Var2Csa de Plasmodium falciparum. Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos uma proteina ou peptideo antigênico ou fragmento de uma proteina ou peptideo antigeno é Var2Csa.
Antigeno de animal doméstico
Um aspecto da presente invenção refere-se a antigenos e/ou sequências antigênicas derivadas de doenças ou agentes que infectam animais domésticos, especialmente animais comercialmente relevantes como porcos, vacas, cavalos, carneiros, cabras, lhamas, coelhos, marta, camundongos, ratos, cães, gatos, furões, aves domésticas como galinhas, perus, faisões e outros, peixes como truta, salmão, bacalhau e outras espécies criadas em fazenda. Os exemplos de doenças ou agentes aqui dos quais pelo menos um antigeno ou seqüência antigênica pode ser derivada incluem, porém não são limitados a: doenças de espécie múltipla como:
Antrax, doença de Aujeszky, Bluetongue, Brucelose como: Brucella abortus, Brucella melitensis ou Brucella suis; febre hemorrágica da Criméia-Congo, Echinococcosis/hydatidosis, virus da familia Picornaviridae, gênero Aftovirus causando febre aftosa especialmente qualquer um dos sete sorotipos imunologicamente distintos: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asial, ou periocardite exsudativa dos ruminantes, encefalite japonesa, Leptospirose, larva do Mundo novo (Cochliomyia hominivorax) , larva do Mundo antigo (Chrysomya bezziana), Paratuberculose, febre Q, Raiva, febre de Rift Valley, Rinderpest, Trichinellosis, Tularemia, estomatite Vesicular ou febre de West Nile; doenças de gado como: anaplasmose bovina, babesiosis Bovina, campylobacteriose genital Bovina, encefalopatia espongiforme bovina, tuberculose bovina, diarréia virai bovina, pleuropneumonia bovina contagiosa, leucose bovina enzoótica, septicemia hemorrágica, rinotraqueite bovina infecciosa / vulvovaginite pustular infecciosa, doença de pele granulosa, febre catarral maligna, Theileriose, Trichomonose ou Tripanossomose (transmitida por tsé-tsé); doenças de carneiro e cabras como: artrite / encefalite caprina, agalactia contagiosa, pleuropneumonia caprina contagiosa, aborto enzoótico de ovelhas (clamidiose ovina),
Maedivisna, doença de carneiro de Nairobi, epididimite ovina (Brucella ovis), Peste des petits ruminants, Salmonellosis (S. abortusovis), Scrapie, Sheep pox e goat pox; doenças de equinos como: doença de cavalo africano, metrite contagiosa de equino, Dourine, encefalomielite equina (do leste), encefalomielite equina (do oeste), anemia infecciosa eqüina, Influenza equina, piroplasmose eqüina, rinopneumonite eqüina, arterite viral eqüina, Glanders, Surra (Trypanosoma evansi) ou encefalomielite eqüina venezuelana; doenças de suinos como: febre de suino africano, febre de suino clássica, encefalite de virus Nipah, cisticercose de porco, sindrome respiratória e reprodutiva de porcos, doença vesicular de suino ou gastroenterite transmissive!; doenças de aves como: clamidiose de ave, bronquite infecciosa de ave, laringotraqueite infecciosa de ave, micoplasmose de ave (M. gallisepticum), micoplasmose de ave (M. synoviae), hepatite de virus de pato, cólera de ave, tifóide de ave, influenza de ave altamente patogênica essa sendo qualquer virus de influenza A ou B e especialmente H5N1, doença bursal infecciosa (doença de Gumboro), doença de Marek, doença de Newcastle, doença de Pullorum ou rinotraqueite de peru; doenças de roedores de lagomorfo como: enterite de virus, Mixomatose ou doença hemorrágica de coelho; doenças de peixes como: necrose hematopoiética epizoótica, necrose hematopoiética Infecciosa, viremia de primavera de carpa, septicemia hemorrágica virai, necrose pancreática infecciosa, anemia infecciosa de salmão, sindrome ulcerativa epizoótica, doença de rim bacteriana (Renibacterium salmoninarum), Girodactilose (Gyrodactylus safaris), doença iridoviral de brema do Mar Vermelho; ou outras doenças como Camelpox ou Leishmaniose.
Em uma modalidade preferida da invenção pelo menos uma proteina ou peptideo antigênico é de doença de Aujeszky, febre aftosa, virus de estomatite vesicular, influenza aviária ou doença de Newcastle.
Ainda uma modalidade preferida da presente invenção refere-se à pelo menos uma proteina ou peptideo antigênico ou fragmento da proteina ou peptideo antigênico sendo um peptideo ou proteina antigênica com pelo menos 85% de identidade a quaisquer dos antigenos acima descritos. A homologia ou identidade entre aminoácidos pode ser calculada por qualquer das matrizes de marcação BLOSUM anteriormente mencionadas.
Antigenos cancerígenos
Muitas proteinas/glicoproteinas foram identificadas e ligadas a certos tipos de câncer; esses são mencionados como polipeptídios específicos de câncer, antigenos associados a tumor ou antigenos de câncer. Em geral, qualquer antigeno que se verificar ser associado a tumores de câncer pode ser utilizado. Um modo no qual antigenos específicos de câncer podem ser encontrados é por análises de subtração como várias análises de microarranjo como análise de microarranjo de DNA. Aqui o padrão de expressão de gene (como visto no nivel de RNA ou proteina codificada pelos genes) entre pacientes saudáveis e com câncer, entre grupos de pacientes com câncer ou entre tecido saudável e com câncer no mesmo paciente é comparado. Os genes que têm niveis de expressão aproximadamente iguais são "subtraídos" entre si deixando os genes / produtos de genes que diferem entre o tecido saudável e canceroso. Essa abordagem é conhecida na técnica e pode ser utilizada como um método de identificar novos antigenos de câncer ou para criar um perfil de expressão de gene especifico para um dado paciente ou grupo de pacientes. Antigenos desse modo identificados tanto de antigeno único como combinações nas quais os mesmos podem ser verificador estar compreendidos no escopo da presente invenção.
Preferivelmente pelo menos um antigeno da presente invenção é derivado de, porém não limitado a um polipeptidio especifico de câncer selecionado do grupo de: MAGE-3, MAGE-1, gplOO, gp75, TRP-2, tirosinase, MART-1, CEA, Ras, p53, B-Catenin, gp43, GAGE-1, BAGE-1, PSA, MUC-1, 2, 3, e HSP-70, TRP-1, gpl00/pmell7, beta-HCG, mutantes Ras, mutantes p53, antigeno de melanoma HMW, MUC-18, HOJ-1, cinase dependente de ciclina 4 (Cdk4), Caspase 8, HER- 2/neu, Bcr-Abl tirosine cinase, antigeno carcinoembriônico (CEA), telomerase, SV40 Large T,virus de papiloma humano HPV tipo 6, 11, 16, 18, 31 e 33; oncogene viral derivado de HPV E5, E6, E7 e Ll; Survivin, Bcl-XL, MCL-1 e Rho-C.
Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos uma proteina ou peptideo antigênico ou fragmento de uma proteina ou peptideo antigênico é de urn polipeptidio especifico de câncer selecionado do grupo de: oncogene viral derivado de HPV E5, E6, E7 e Ll; Survivin, Bcl-XL, MCL-1 e Rho-C.
Antigeno associado a uma resposta fisiológica anormal Uma modalidade da invenção se refere a um constructo de ácido nucléico, em que pelo menos uma proteina ou peptideo antigênico ou fragmento de uma proteina ou peptideo antigênico é de um polipeptidio associado a uma resposta fisiológica anormal. Tal resposta fisiológica anormal inclui, porém não é limitada a doenças auto-imunes, reações alérgicas, cânceres e doenças congênitas. Uma lista não exaustiva de exemplos da presente inclui doenças como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, psoriase e doença de Crohn.
Ligador operativo
Um aspecto da presente invenção refere-se a constructo de ácido nucléico em que a ligação operativa entre a cadeia invariante e a proteina ou peptideo antigênico ou fragmento de proteina ou peptideo antigênico é uma ligação direta ou uma ligação mediada por uma região espaçadora. Pelo termoligador operativo entende-se uma seqüência de nucleotideos ou residuos de aminoácidos que ligam juntas duas partes de constructo de ácido nucléico ou polipeptidio quimérico em um modo que garante o processamento biológico do ácido nucléico ou polipeptidio. Se o ligador operativo for uma ligação direta, os dois ácidos nucléicos cada codificando um quadro de leitura aberta ou um fragmento de um quadro de leitura aberta são colocados imediatamente adjacentes entre si e desse modo também no quadro. Se o ligador operativo for mediado por uma região espaçadora, uma série de nucleotideos é inserida entre os nucleotideos que codificam pelo menos uma cadeia invariante e pelo menos um peptideo antigênico, respectivamente. Está compreendido no escopo da presente invenção ter uma região espaçadora em que a região espaçadora meramente é uma série de nucleotideos ligando pelo menos dois elementos da presente invenção em um modo retendo os quadros de leitura aberta, ou a região espaçadora pode codificar um ou mais sinais ou elementos separados como definido abaixo. Em uma modalidade especifica a invenção compreende um ligador operativo, em que o ligador operativo é uma região espaçadora.
Em uma modalidade a invenção compreende uma região espaçadora que codifica pelo menos um epitopo auxiliar para moléculas MHC da classe II. Um exemplo de um epitopo auxiliar é um determinante imunogênico como toxina de Difteria, especialmente região terminal COOH de fragmento de toxina de difteria B foi mostrada como sendo imunogênica em camundongos. Além disso, HSP70, em parte ou totalmente, bem como outros peptideos imunogênicos, como influenza viral ou seqüências imunogênicas ou peptideos com um motivo de ancoragem para moléculas HLA classe I e classe II, também podem ser codificados na região espaçadora do constructo de ácido nucléico.
Em outra modalidade a região espaçadora do constructo de ácido nucléico codifica pelo menos um sitio de divagem de protease. Sitios de divagem de proteases lisossomais como catepsinas, proteases de aspartato e proteases de zinco bem como outras proteases intracelulares estão compreendidas no escopo da presente invenção. constructo de ácido nucléico pode compreender pelo menos uma seqüência de codificação de miRNA ou siRNA. siRNAs (RNAs interferentes pequenos) e miRNAs (microRNAs) alvejam RNAs endógenos, em um modo especifico, para degradação. Um siRNA ou miRNA codificado no constructo de ácido nucléico da presente invenção pode ser desse modo escolhido para alvejar um produto de gene indesejável.
Em outra modalidade o ligador operativo compreende pelo menos um poliligador ou sitio de clonagem múltiplo (MCS) . Poliligadores e MCS's são série de nucleotideos compreendendo seqüências de reconhecimento de enzima de restrição, isto é, sitios onde uma enzima de restrição corta o DNA em modo cego ou espalhado facilitando a subclonagem de outros fragmentos/seqüências de DNA no constructo de ácido nucléico. As seqüências de reconhecimento dos poliligadores/MCS' s são tipicamente exclusivas significando que não são encontradas em outra parte no constructo de ácido nucléico. O ligador operativo pode compreender ainda um ou mais códons de parada ou término que sinalizam a liberação do polipeptidio nascente a partir do ribossomo. O ligador operativo também pode compreender pelo menos um IRES (Sitio de entrada ribossômica interno) e/ou pelo menos um promotor. Um IRES é uma seqüência de nucleotideo que permite iniciação de tradução no meio de uma seqüência de RNA mensageiro (mRNA) como parte do maior processo de sintese de proteina. Um promotor é uma seqüência de DNA que permite que um gene seja transcrito. O promotor é reconhecido por polimerase RNA, que então inicia transcrição, vide abaixo. O promotor pode ser único ou bidirecional.
Em uma modalidade o ligador operativo que cobre a região entre a cadeia invariante e pelo menos um antigeno é um ligador operativo que compreende pelo menos um poliligador, e pelo menos um promotor, e opcionalmente também pelo menos um IRES. Esses elementos podem ser colocados em qualquer ordem. Em uma modalidade preferida adicional, o códon de PARADA da cadeia invariante foi deletado, e o poliligador foi clonado no vetor em um modo que conserva o quadro de leitura aberto permitindo leitura de quadro de pelo menos um antigeno que é inserido no poliligador. Isso tem a vantagem de facilitar subclonagem de múltiplos antigenos no mesmo constructo em uma etapa ou em múltiplas etapas de clonagem e permitir a expressão simultânea de múltiplos antigenos no mesmo quadro que a cadeia invariante. Um códon de PARADA pode ser inserido após o poliligador para término de tradução. Essa modalidade pode ser combinada com qualquer dos epitopos auxiliares acima, mi/siRNAs ou qualquer dos outros elementos aqui descritos.
Uma modalidade da presente invenção se refere à colocação do ligador operativo em relação à pelo menos uma cadeia invariante e pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina ou peptideo, em que pelo menos um peptideo antigênico que codifica seqüências é colocado: na seqüência de cadeia invariante, na extremidade frontal da seqüência de cadeia invariante, na parte terminal da seqüência de cadeia invariante. Isso é feito em um modo que assegura a capacidade de leitura do quadro de leitura aberta do constructo, de modo que o peptideo antigênico é: precedido, circundado ou arredondado por pelo menos um ligador operativo.
Outra modalidade da presente invenção refere-se ainda à colocação do ligador operativo em relação à pelo menos uma cadeia invariante e pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina ou peptideo, em que pelo menos um peptideo antigênico que codifica seqüência é preferivelmente colocado na parte terminal da cadeia invariante e um ligador operativo é inserido aqui entre: a parte terminal sendo o primeiro ou último residue da cadeia invariante ou fragmento do presente.
Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico não compreende um ligador operativo; em vez disso, pelo menos um peptideo antigeno que codifica seqüência é amarrada diretamente à cadeia invariante. Pelo menos um peptideo antigênico que codifica seqüências pode ser colocado: na seqüência de cadeia invariante, na extremidade frontal da seqüência de cadeia invariante, na parte terminal, da seqüência de cadeia invariante. Isso é feito em um modo assegurando a capacidade de leitura do quadro de leitura aberto do constructo.
Há vantagens para as duas possibilidades de incluir ou excluir um ligador operativo; excluir o ligador pode em uma modalidade reduzir a possibilidade de sensibilizar uma reposta imune contra o ligador em vez de sensibilizar um imune contra o peptideo antigênico.
Combinações
Está compreendido dentro do escopo da presente invenção que o constructo de ácido nucléico codifica uma pluralidade de elementos. Os elementos sendo pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma e pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina ou peptideo. Portanto está compreendido dentro do escopo da presente invenção ter uma pluralidade de cadeias invariantes ou variantes das mesmas cada dessas sendo operativamente ligadas entre si e a uma pluralidade de proteinas antigênicas ou peptideos ou fragmentos de proteinas antigênicas ou peptideos, em que esses também são operativamente ligados. Os elementos do constructo de ácido nucléico devem ser desse modo operativamente ligados entre si. Várias séries de cadeias invariantes ou variantes das mesmas cada operativamente ligada a uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina ou peptideo, cada dessas séries sendo operativamente ligada entre si são abrangidas na presente invenção.
As vantagens e aspectos muito importantes da presente invenção se referem ao fato de que qualquer tipo de resposta imune, por exemplo, respostas mediadas por anticorpo e mediadas por célula T, podem ser iniciadas, tanto com epitopos conhecidos como sendo antigenos fracos, como polipeptidios de propriedades antigênicas desconhecidas e com múltiplos epitopos/antigenos simultaneamente.
Portanto, é também compreendido dentro do escopo da presente invenção que uma modalidade preferida seja um constructo de ácido nucléico codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a uma pluralidade de proteinas antigênicas ou peptideos ou fragmento de proteinas ou peptideos, como duas, três, quatro, cinco, seis, oito, dez, doze ou mais proteinas antigênicas ou peptideos ou fragmento de proteinas ou peptideos.
O constructo de ácido nucléico pode compreender elementos adicionais. Esses incluem, porém não são limitados a: sitios de entrada ribossômica interna (IRES); genes que codificam proteinas relacionadas à apresentação de antigeno como LAMP, calreticulim Hsp 33, Hsp 60, Hsp70, Hsp90, HsplOO, sHSP (proteina de choque térmico pequeno) e proteinas de ligação de choque térmico como dominio de ligação de Hsp73 homólogo a DNAJ de residuo 77; genes que codificam proteinas que são relacionadas à dispersão intracelular como VP22, HIV Tat, Cx43 ou outras conexinas e constituintes de junção gap intercelular; genes codificando moléculas de ativação de célula killer natural (célula NK) como H60 e citosinas, ovalbumina de galinha, ou qualquer epitopo de célula auxiliar T.
Em uma modalidade preferida da presente invenção o constructo de ácido nucléico compreende pelo menos um gene que codifica uma proteina relacionada à apresentação de antigeno como LAMP, LIMP, calreticulim Hsp 33, Hsp 60, Hsp70, Hsp90, HsplOO, sHSP (proteina de choque térmico pequeno) ou dominio de ligação de Hsp73 homólogo a DNAJ de residuo 77.
Ainda em uma modalidade preferida da presente invenção o constructo de ácido nucléico compreende pelo menos um gene que codifica uma proteina relacionada à dispersão intracelular como VP22, Cx43, HIV Tat, outras conexinas ou constituintes de junção de gap intercelular. Promotor
O termo promotor será utilizado aqui para se referir a um grupo de módulos de controle de transcricional que são agrupados em torno do sitio de iniciação para RNA polimerase II. Grande parte do pensamento sobre como os promotores são organizados deriva de análises de vários promotores virais, incluindo aqueles para a timidina cinase (tk) HSV e unidades de transcrição prematura de SV40. Esses estudos aumentados por trabalho mais recente, mostraram que promotores são compostos de módulos funcionais discretos, cada consistindo em aproximadamente 7-20 bp de DNA, e contendo um ou mais sitios de reconhecimento para proteinas de ativador de transcrição. Pelo menos um módulo em cada promotor funciona para posicionar o sitio de partida para sintese RNA. 0 exemplo mais conhecido disso é o quadrado TATA, porém em alguns promotores não tendo um quadrado TATA, como o promotor para o gene de desoxinucleotidil transferase e o promotor para os genes tardios SV 40, um elemento discreto sobrepondo o próprio sitio de partida ajuda a fixar o lugar de iniciação.
Elementos promotores adicionais regulam a frequência de iniciação de transcrição. Tipicamente, esses são localizados na região 30-110 bp à montante do sitio de partida, embora um número de promotores tenha sido recentemente mostrado como contendo elementos funcionais a jusante do sitio de partida também. O espaçamento entre elementos é flexivel, de modo que a função de promotor seja preservada quando elementos são invertidos ou movidos um em relação ao outro. No promotor tk, o espaçamento entre elementos pode ser aumentado para 50 bp de separação antes da atividade começar a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar cooperativamente ou independentemente para ativar a transcrição. Qualquer promotor que pode dirigir a iniciação de transcrição das sequências codificadas pelo constructo de ácido nucléico pode ser utilizado na invenção.
Um aspecto da presente invenção compreende o constructo de ácido nucléico em que pelo menos uma cadeia invariante operativamente ligada e proteina antigênica ou peptideo codificando seqüência é precedida por um promotor que permite expressão do constructo.
É um aspecto adicional que o promotor seja selecionado do grupo de promotores constitutivos, promotores induziveis, promotores específicos de organismo, promotores específicos de tecido, promotores específicos de tipo de célula e promotores específicos de inflamação.
Os exemplos de promotores incluem, porém não são limitados a: promotores constitutivos como: promotor prematuro de vírus de símio 40 (SV40), um promotor de vírus de tumor mamário de camundongo, um promotor de repetição terminal longo de vírus de imunodeficiência humana, um promotor de vírus Moloney, um promotor de vírus de leucemia de ave, um promotor prematuro imediato de vírus de Epstein- Barr, um promotor de vírus de sarcoma de Rous (RSV) , um promotor de actina humana, um promotor de miosina humana, um promotor de hemoglobina humana, promotor de citomegalovírus (CMV) e um promotor de creatina de músculo humano, promotores induzíveis como: um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticóide, um promotor de progesterona, e um promotor de tetraciclina (tet-on ou tet-off), promotores específicos de tecido como: promotor HER-2 e promotor associado à PSA e promotores bidirecionais, que são capazes de iniciar transcrição em qualquer direção a partir do promotor.
As vantagens de utilizar um promotor induzível incluem a opção de fornecer um constructo de ácido nucléico "dormente" que pode ser ativado à vontade. Isso pode ser de uso se a sensibilização de uma resposta imune preferivelmente for somente induzida localmente VS.
Sistemicamente em um corpo (por exemplo, em casos envolvendo câncer) ou a sensibilização de uma resposta imune for prejudicial para a saúde do receptor no momento de administração.
Em uma modalidade preferida o constructo de ácido nucléico compreende um promotor selecionado do grupo de: promotor CMV, promotor SV40 e promotor RSV.
Veiculo de distribuição
Um aspecto da presente invenção compreende o constructo de ácido nucléico como descrito em qualquer dos acima, compreendido em um veiculo de distribuição. Um veiculo de distribuição é uma entidade pelo que uma seqüência de nucleotideos ou polipeptidio ou ambos pode ser transportado de pelo menos um meio para outro. Veiculos de distribuição são genericamente utilizadas para expressão das sequências codificadas no constructo de ácido nucléico e/ou para a distribuição intracelular do constructo ou polipeptidio codificado na mesma.
O constructo de ácido nucléico pode ser transferida para células in vivo ou ex vivo; o último por remover o tecido alvo (isto é, células de figado ou leucócitos) a partir do paciente, transferir o constructo in vitro e então replantar as células transduzidas no paciente.
Os métodos de distribuição não virai incluem abordagens física (distribuição isenta de veiculo) e química (distribuição baseada em vetor sintético).
Abordagens físicas, incluindo injeção de agulha, pistola de gene, injeção de jato, eletroporação, ultra-som, e distribuição hidrodinâmica, empregam uma força física que permeia a membrana de célula e facilita transferência de gene intracelular. A força física pode ser elétrica ou mecânica.
As abordagens químicas utilizam compostos de ocorrência sintética ou natural como veículos para distribuir o transgene em células. A estratégia mais frequentemente estudada para distribuição de gene não virai é a formulação de DNA em partículas condensadas utilizando lipídeos catiônicos ou polímeros catiônicos. As partículas contendo DNA são subsequentemente absorvidas por células através de endocitose, macropinocitose, ou fagocitose na forma de vesículas intracelulares, das quais uma pequena fração do DNA é liberada no citoplasma e migra para o núcleo, onde a expressão de transgene ocorre.
Está compreendido no escopo da presente invenção que o veículo de distribuição é um veículo selecionado do grupo de: veículos baseados em RNA, veículos/vetores baseados em DNA, veículos baseados em lipídeo, veículos baseados em polímero e veículos de RNA ou DNA derivados de forma virai.
Uma modalidade preferida da presente invenção se refere à distribuição do constructo de ácido nucléico por técnicas mecânicas ou elétricas. • Fisica > Injeção: uma modalidade preferida se refere à injeção simples do constructo de ácido nucléico em solução. A injeção é normalmente realizada por via intramuscular (IM) em músculo esqueletal, por via intradérmica (ID) ou no figado, com o constructo de ácido nucléico sendo distribuída aos espaços extracelulares. A distribuição por injeção pode ser auxiliada por eletroporação; por utilizar soluções hipertônicas de solução salina ou sacarose; por danificar temporariamente fibras de músculo com miotoxinas como bupivacaina; ou por adicionar substâncias capazes de aumentar a eficiência de internalização de DNA por células alvo como transferrina, solventes imisciveis em água, polímeros não iônicos, tensoativos ou inibidores de nuclease. > Pistola de gene: a pistola de gene do Sistema de Distribuição de particulas Biolistico é um dispositivo para injetar células com informação genética. A carga útil é uma partícula elementar de um metal pesado como ouro, prata ou tungsténio revestido com, por exemplo, DNA de plasmideo. Essa técnica é frequentemente simplesmente mencionada como biolística. Hélio comprimido pode ser utilizado como o propelente. Especialmente o revestimento do constructo de ácido nucléico sobre particulas de ouro, como particulas de ouro coloidal, é uma modalidade favorecida. > Injeção pneumática (jato): nenhuma particula necessária, solução aquosa. > eletroporação, ou eletropermeabilização, é um aumento significativo na condutividade elétrica e permeabilidade da membrana de plasma de célula causado por um campo elétrico externamente aplicado. > Transferência de gene facilitada por ultra-som: ultra-som cria poros de membrana e facilita transferência de gene intracelular através de difusão passiva de DNA através dos poros de membrana. A eficiência pode ser intensificada pelo uso de agentes de contraste ou condições que tornam as membranas mais fluidicas. > Distribuição hidrodinâmica de gene: a distribuição hidrodinâmica de gene é um método simples que introduz DNA de plasmideo descoberto em células em órgãos internos altamente perfundidos (por exemplo, o figado). Em roedores, a injeção rápida de veia de cauda de um grande volume de solução de DNA causa um transbordamento transiente de solução injetada na veia cava inferior que excede o débito cardiaco. Como resultado, a injeção induz um fluxo de solução de DNA em retrograde para dentro do fígado, uma elevação rápida de pressão intra-hepática, expansão de fígado, e ruptura reversível de fenestra de fígado.
Química
Distribuição de gene mediada por lipídeo catiônico: embora alguns lipídeos catiônicos individualmente apresentem boa atividade de transfecção, são frequentemente formulados com um fosfolipídeo não carregado ou colesterol como um lipídeo auxiliar para formar lipossomas. Após misturar com lipossomas catiônicos, DNA de plasmídeo é condensado em partículas quase estáveis pequenas denominadas lipoplexos. DNA em lipoplexos é bem protegido de degradação de nuclease. Lipoplexos são capazes de acionar absorção celular e facilitar a liberação de DNA a partir das vesículas intracelulares antes de atingir compartimentos lisossomais destrutivos.
Transferência de geme mediada por polímero catiônico: a maioria dos polímeros catiônicos compartilham a função de condensar DNA em partículas pequenas e facilitar absorção celular via endocitose através de interação carga-carga com sítios aniônicos em superfícies de células. Veículos de DNA de polímero catiônico incluem polietilenoimina (PEI), dendrímeros de poliamidoamina e polipropil amina, polialil amina, dextrano catiônico, quitosana, proteínas catiônicas (polilisina, protamina, e histonas) e peptideos catiônicos.
Sistema hibrido de polimero-lipideo: DNA pré- condensado com policátions, então revestido com lipossomas catiônicos, lipossomas aniônicos, ou polimeros anfifilicos com ou sem lipideos auxiliares.
Os exemplos de veiculos de distribuição quimica incluem, porém não são limitadas a: microesferas de polimero biodegradáveis, formulações baseadas em lipideos como veiculos de lipossoma, moléculas cationicamente carregadas como lipossomas, sais de cálcio ou dendrimeros, lipopolissacarideos, polipeptidios ou polissacarideos.
Métodos de distribuição fisica alternativos podem incluir instilação por aerossol de umo constructo de ácido nucléico descoberto em superficies de mucosa, como a mucosa nasal e de pulmão; administração tópica do constructo de ácido nucléico nos tecidos de mucosa e de olho; e hidratação como hidratação estromal pela qual solução salina é forçada para dentro do estroma de córnea do olho.
Outra modalidade da presente invenção compreende um vetor que aqui é indicado um vetor virai (isto é, não um virus) como um veiculo de distribuição. Vetores virais de acordo com a presente invenção são feitos de um genoma viral modificado, isto é, o DNA efetivo ou DNA que forma o genoma virai, e introduzidos em forma descoberta. Desse modo, quaisquer estruturas de revestimento circundando o genoma virai feito de proteinas virais ou não virais não fazem parte do vetor virai de acordo com a presente invenção.
O virus do qual o vetor virai é derivado é selecionado do grupo não exaustivo de: adenovirus, retrovirus, lentivirus, virus adeno-associados, virus de herpes, virus de vacinia, virus espumoso, citomegalovirus, virus de Semliki Forest, virus de pox, vetor de virus de RNA e vetor de virus de DNA. Tais vetores virais são bem conhecidos na técnica.
Célula Recombinante
Um aspecto da presente invenção refere-se a uma célula que compreende o constructo de ácido nucléico como definido em qualquer dos acima. Tal célula recombinante pode ser utilizada como ferramenta para pesquisa in vitro, como um veiculo de distribuição para o constructo de ácido nucléico ou como parte de um regime de terapia de gene. O constructo de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser introduzida em células por técnicas bem conhecidas na arte e que incluem microinjeção de DNA no núcleo de uma célula, transfecção, eletroporação, fusão de lipofecção/lipossoma e bombardeio de particulas. Células apropriadas incluem células autólogas e não autólogas, e podem incluir células xenogeneicas.
Em uma modalidade preferida o constructo de ácido nucléico da presente invenção é compreendida em uma célula que apresenta antigeno (APC). Qualquer célula que apresenta antigenos em sua superficie em associação a uma molécula de MHC é considerada uma célula que apresenta antigeno. Tais células incluem, porém não são limitadas a macrófagos, células dendriticas, células B, APCs hibridas, e APCs de criação. Os métodos de fazer APCs hibridos são bem conhecidos na arte.
Em uma modalidade mais preferida o APC é uma célula que apresenta antigeno profissional e mais preferivelmente o APC é uma célula que expressa MHC-I e/ou MHC-II.
A APC de acordo com qualquer um dos acima pode ser uma célula tronco obtida de um paciente. Após introduzir o constructo de ácido nucléico da invenção, a célula tronco pode ser reintroduzida no paciente em uma tentativa para tratar o paciente de uma condição médica. Preferivelmente, a célula isolada do paciente é uma célula tronco capaz de diferenciar em uma célula que apresenta antigeno.
É incluido adicionalmente dentro do escopo da presente invenção que a célula que apresenta antigeno compreendendo o constructo de ácido nucléico da presente invenção não expressa nenhum sinal co-estimulador e a proteina antigênica ou peptideo ou fragmento antigênico da proteina ou peptideo é um auto-antigeno.
Anticorpos e proteinas quiméricas
Um objetivo da presente invenção é a proteina quimérica codificada pelos constructos de ácido nucléico como descrito acima, compreendendo pelo menos uma cadeia invariante operativamente ligada ou variantes da mesma e pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina antigênica ou peptideo. Por proteina quimérica é entendida uma proteina geneticamente construida que é codificada por uma seqüência de nucleotideos feita por junção de dois ou mais genes completos ou parciais ou uma série de ácidos nucléicos (não) aleatórios.
Um aspecto da presente invenção se refere a um anticorpo que pode reconhecer a proteina quimérica como definido acima. Pelo termo anticorpo é entendido moléculas de imunoglobulina e porções ativas de moléculas de imunoglobulina. Anticorpos são, por exemplo, moléculas de imunoglobulina intactas ou fragmentos das mesmas retendo a atividade imunológica. Tais anticorpos podem ser utilizados para a imunização passiva de um animal, ou para uso em um ensaio para detectar proteinas às quais o anticorpo se liga. Composições de constructo de ácido nucléico
Um aspecto da presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica pelo menos uma cadeia invariante ou variantes da mesma operativamente ligada a pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento da proteina antigênica ou peptideo. A composição pode compreender desse modo um constructo de ácido nucléico como definido em qualquer do acima. A composição pode ser adicionalmente utilizada como medicamento.
A composição de constructo de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos como pela mistura de um ou mais veiculos farmaceuticamente aceitáveis, também excipientes ou estabilizadores conhecidos com o agente ativo. Esses excipientes podem ser aceitáveis para administração em qualquer individuo/animal, preferivelmente em vertebrados e mais preferivelmente em seres humanos visto que são não tóxicos para a célula ou individuo sendo exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o veiculo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Os exemplos de tais excipientes, veiculos e métodos de formulação podem ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Os exemplos de veiculos fisiologicamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptidios de baixo peso molecular (menor do que aproximadamente 10 residuos); proteinas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polimeros hidrofilicos como polivinil pirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarideos, dissacarideos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação como EDTA; alcoóis de açúcar como manitol ou sorbitol; contra-ions de formação de sal como sódio; e / ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS™.
Para formular uma composição farmaceuticamente aceitável apropriada para administração eficaz, tais composições de acordo com a invenção, conterão uma quantidade eficaz do constructo de ácido nucléico, o constructo de ácido nucléico compreendida em um veiculo de distribuição ou a proteina quimérica codificada no constructo de ácido nucléico como descrito aqui. Frequentemente, se a sensibilização da resposta imune com proteina ou polipeptidios como codificado pelo constructo de ácido nucléico da presente invenção, um veiculo será utilizado como armação por acoplar as proteinas ou peptideos à mesma e desse modo auxiliar na indução de uma resposta imune. A proteina veiculo pode ser qualquer veiculo convencional incluindo qualquer proteina apropriada para apresentar determinantes imunogênicos. Veiculos apropriados são tipicamente macromoléculas lentamente metabolizadas, grandes como proteinas, polissacarideos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicolicos, aminoácidos poliméricos, copolimeros de aminoácidos, agregados de lipideos (como goticulas de óleo ou lipossomas), e particulas de virus inativo. Tais veiculos são bem conhecidos por aqueles com conhecimentos comuns na técnica, adicionalmente, esses veiculos podem funcionar como agentes imunoestimuladores ("adjuvantes") . A imunização do animal pode ser realizada com adjuvantes e/ou veiculos farmacêuticos. Proteinas de veiculo convencionais incluem, porém não são limitadas a, hemocianina de lapa californiana, proteinas de soro como transferrina, albumina de soro bovino, ou albumina de soro humano, uma ovalbumina, imunoglobulinas, ou hormônios como insulina. O veiculo pode estar presente juntamente com um adjuvante ou independentemente do mesmo.
A seguir, a composição ou composições de constructo de ácido nucléico pretendem abranger composições úteis para uso profilático e terapêutico, incluindo estimular uma resposta imune em um paciente. É adicionalmente considerado que a composição da invenção não induz qualquer reação de toxicidade local ou sistêmica ou quaisquer outros efeitos colaterais.
Em uma modalidade preferida, a frase 'composição' como utilizado aqui se refere a uma composição para sensibilizar uma resposta imune.
Em uma modalidade preferida o constructo de ácido nucléico é acondicionado. Acondicionamento significa que o constructo de ácido nucléico inclui meio selecionado de, porém não limitado ao grupo de: vetores baseados em DNA ou baseados em RNA, veiculos baseados em lipideo, vetores de expressão virai, vetores de distribuição virai, revestimento de particulas de ouro coloidais e microesferas de polimero biodegradáveis. Quaisquer dos meios de distribuição anteriormente mencionados podem ser desse modo utilizados para fins de embalagem para uso em uma composição.
Em uma modalidade o meio de acondicionamento do constructo de ácido nucléico é um vetor de expressão virai selecionado de, porém não limitado ao grupo de: adenovirus, retrovirus, lentivirus, virus adeno-associado, virus de herpes, virus de vacinia e vetor de virus de DNA. O vetor viral pode ser um vetor viral deficiente em replicação ou condicionalmente deficiente em replicação.
Um aspecto da invenção se refere a uma composição que compreende pelo menos dois vetores. Isso abrange que qualquer uma ou duas constructos de ácido nucléico diferentes como descrito pode ser acondicionada pelo menos em dois vetores, esses vetores sendo de um tipo como descrito em qualquer dos acima. A invenção refere-se ainda a uma composição compreendendo três, quatro, cinco ou seis vetores. Novamente, esses vetores podem diferir entre si ou não, e podem conter constructos de ácido nucléico idênticas ou diferentes como descrito acima. Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos uma proteina quimérica como codificado por qualquer um dos constructos de ácido nucléico descritos aqui. Quando uma proteina ou polipeptidio quimérico deve ser utilizado como imunógeno, pode ser produzido por expressão de qualquer uma ou mais dos constructos de ácido nucléico descritas acima em uma célula recombinante ou pode ser preparado por sintese quimica por métodos conhecidos na arte. Como descrito acima, tais proteinas quiméricas e/ou peptideos podem ser acoplados a veiculos para aumentar a resposta imunológica às proteinas/peptideos e podem ser administradas com ou sem um adjuvante e/ou excipiente.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se ao uso do constructo de ácido nucléico como descrito aqui para a produção de uma composição.
Intensificação de uma resposta imune: adjuvantes tradicionais Adjuvantes podem ser incluidos na composição para intensificar a resposta imune especifica. Desse modo, é particularmente importante identificar um adjuvante que quando combinado com o(s) antigeno(s)/constructos de ácido nucléico e/ou veiculos de distribuição (qualquer um dos quais pode ser também referido como determinante imunogênico) resulta em uma composição capaz de induzir uma resposta imunológica especifica forte. O determinante imunogênico pode ser também misturado com dois ou mais adjuvantes diferentes antes da imunização. As composições são também mencionadas como composições imunogênicas no presente texto.
Um grande número de adjuvantes foi descrito e utilizado para a geração de anticorpos em animais de laboratório, como camundongo, ratos e coelhos. Em tal cenário a tolerância de feito colateral é bem elevada visto que o principal objetivo é obter uma resposta forte de anticorpo. Para uso e para aprovação para uso em produtos farmacêuticos, e especialmente para uso em seres humanos é necessário que os componentes da composição, incluindo o adjuvante, sejam bem caracterizados. É adicionalmente exigido que a composição tenha risco minimo de qualquer reação adversa, como granuloma, abscessos ou febre.
Uma modalidade da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um adjuvante. Em uma modalidade preferida a composição é apropriada para administração a um mamifero, como um ser humano. Portanto, o adjuvante preferido é apropriado para administração a um mamifero e mais preferivelmente é apropriado para administração a um ser humano.
Em outra modalidade preferida a composição é apropriada para administração a um pássaro ou peixe, e mais preferivelmente a uma galinha (Gallus gallus domesticus). Portanto, o adjuvante preferido é apropriado para administração a um pássaro ou um peixe.
A escolha de adjuvante pode ser adicionalmente selecionada por sua capacidade em estimular o tipo de resposta imune desejada, ativação de célula B ou/e célula T e a composição pode ser formulada para otimizar distribuição e apresentação para os tecidos linfáticos relevantes.
Adjuvantes pertinentes a presente invenção podem ser agrupados de acordo com sua origem, seja mineral, bacteriana, de planta, sintética ou produto hospedeiro. O primeiro grupo de acordo com essa classificação são os adjuvantes minerais, como compostos de aluminio. Antigenos precipitados com sais de aluminio ou antigenos misturados com ou adsorvidos a compostos de aluminio realizados foram utilizados extensamente para aumentar respostas imunes em animais e seres humanos. Partículas de aluminio foram demonstradas em linfonodos regionais de coelhos sete dias após imunização, e pode ser que outra função significativa seja dirigir antigeno para áreas contendo célula T nos próprios nodos. A potência de adjuvante foi mostrada como correlacionando com insinuação dos linfonodos de drenagem. Embora muitos estudos confirmassem que antigenos administrados com sais de aluminio levam à imunidade humoral aumentada, a imunidade mediada por célula parece ser somente levemente aumentada, como medido por hipersensibilidade do tipo retardada. Hidróxido de aluminio também foi descrito como ativando a via de complemento. Esse mecanismo pode desempenhar um papel na resposta inflamatória local bem como produção de imunoglobulina e memória de célula B, além disso, hidróxido de aluminio pode proteger o antigeno de catabolismo rápido. Principalmente devido ao seu excelente registro de segurança, compostos de alumínio são atualmente os únicos adjuvantes utilizados em seres humanos.
Outro grande grupo de adjuvantes é aquele de origem bacteriana. Adjuvantes com origem bacteriana podem ser purificados e sintetizados (por exemplo, dipeptídeos de muramila, lipídeo A) e mediadores hospedeiros foram clonados (interleucina 1 e 2) . A última década trouxe progresso significativo na purificação química de vários adjuvantes de componentes ativos de origem bacteriana: Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, lipopoli- sacarideo, adjuvante completo de Freund (FCA) e adjuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) e Adjuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Adicionalmente, adjuvantes apropriados de acordo com a presente invenção são, por exemplo, adjuvante clássico Titermax (SIGMA-ALDRICH), ISCOMS, Quil A, ALUN, vide US 58767 e 5.554.372, derivados de lipídeo A, derivados de coleratoxina, derivados de HSP, derivados de LPS, matrizes de peptideo sintético, GMDP e outro bem como combinado com imunoestimuladores (US 5.876.735). B. pertussis é de interesse como adjuvante no contexto da presente invenção devido a sua capacidade em modular imunidade mediada por célula através da ação sobre populações de linfócito-T. para lipopolissacarídeo e adjuvante completo de Freund, frações ativas de adjuvante foram identificadas e sintetizadas que permitem estudo de relações de função- estrutura. Esses são também considerados para inclusão em composições imunogênicas de acordo com a presente invenção.
Verificou-se que lipopolissacarideo (LPS) e seus vários derivados, incluindo lipideo A, são adjuvantes poderosos em combinação com lipossomas ou outras emulsões de lipideo. Não é certo ainda se derivados com toxicidade suficientemente baixa para uso geral em seres humanos podem ser produzidos. Adjuvante completo de Freund é o padrão na maioria dos estudos experimentais.
Óleo mineral pode ser adicionado à composição imunogênica para proteger o antigeno de catabolismo rápido.
Muitos outros tipos de materiais podem ser utilizados como adjuvantes em composições imunogênicas de acordo com a presente invenção. Incluem produtos de planta como saponina, produtos de animais como quitina e inúmeros produtos quimicos sintéticos.
Adjuvantes, de acordo com a presente invenção, podem ser também categorizados por seus mecanismos de ação propostos. Esse tipo de classificação é necessariamente de certo modo arbitrário porque a maioria dos adjuvantes parece funcionar por mais de um mecanismo.
Adjuvantes podem atuar através de localização e distribuição de antigeno ou por efeitos diretos sobre células que compõem o sistema imune, como macrófagos e linfócitos. Outro mecanismo pelo qual adjuvante de acordo com a invenção intensificam a resposta imune é por criação de um depósito de antigeno. Isso parece contribuir para a atividade de adjuvante de compostos de aluminio, emulsões de óleo, lipossomas, e polimeros sintéticos. A atividade de adjuvante de lipopolissacarideos e dipeptideos de muramila parece ser mediada principalmente através da ativação do macrófago, ao passo que B. Pertussis afeta tanto macrófagos como linfócitos. Exemplos adicionais de adjuvantes que podem ser úteis quando incorporados em composições imunogênicas de acordo com a presente invenção são descritos em US 5.554.372.
Adjuvantes úteis em composições de acordo com a presente invenção podem ser desse modo sais minerais, como hidróxido de alumino e géis de fosfato de cálcio ou aluminio, emulsões de óleo e formulações baseadas em tensoativo como QS21 (saponina purificada), AS02 (SBAS2, emulsão de óleo em água + lipideo monofosforila A (MPL) + QS21), Montanide ISA 51 e ISA-720 (emulsão de água em óleo estabilizada), Adjuvante 65 (contendo óleo de amendoim, monooleato de manide e monoestearato de aluminio), RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Utah), adjuvantes em partículas, como virosomas (veiculos lipossomais unilamelares incorporando hemaglutina de influenza), AS04 (sal de Al com MPL), ISCOMS (complexo estruturado de saponinas e lipídeos (como colesterol), co-glicolide de poliactide (PLG), derivados microbianos (naturais e sintéticos) como lipídeo A de monofosforila (MPL), Detox (MPL + esqueleto de parede de célula M. Phlei), AGP (RC-529 (monossacarídeo acrilado sintético)), DC_chol (imunoestimuladores lipoidais capazes de auto-organizar-se em lipossomas), OM-174 (derivado de lipídeo A), motivos CpG (oligonucleotídeos sintéticos contendo motivos CpG imunoestimuladores), toxinas bacterianas modificadas, LT e CT, com efeitos adjuvantes não tóxicos, imunomoduladores humanos endógenos, por exemplo, hGM-CSF ou hIL-12 ou Immudaptin (conjunto tandem C3d), veículos inertes como partículas de ouro.
Exemplos adicionais de adjuvantes compreendem: emulsões de óleo imunoestimuladoras (por exemplo, água em óleo, óleo em água, água em óleo em água como, por exemplo, adjuvante incompleto de Freund, como Montanide®, Specol, sais minerais como, por exemplo, A1(OH)3, AIPO4, produtos microbianos, Saponinas como Qual A, produtos sintéticos, bem como formulações adjuvantes, e complexos estimuladores inativadas por calor, nanocontas, LPS, LTA. Uma lista de outros adjuvantes comumente utilizados é revelada nas páginas 6-8 em WO 2003/089471, a lista sendo pelo presente incorporada a titulo de referência.
Composições imunogênicas de acordo com a invenção também podem conter diluentes como tampões, antioxidantes como ácido ascórbico, polipeptídios de baixo peso molecular (menor do que aproximadamente 10 residuos), proteinas, aminoácidos, carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes de quelação como EDTA, glutationa e outros estabilizadores e excipientes. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro não especifica são diluentes apropriados exemplares.
Adjuvantes são genericamente incluidos nas composições imunogênicas em uma quantidade de acordo com as instruções do fabricante. Intensificação de uma Resposta Imune: adjuvantes não tradicionais
Modulação de citosina
Para uma vacina ser eficaz, deve induzir uma resposta imune apropriada para um dado patógeno. Isso pode ser realizado por modificações na forma de antigeno expresso (isto é, intracelular VS. Secretado), o método e via de distribuição, e a dose de DNA distribuída. Entretanto, também pode ser realizado pela co-administração de DNA de plasmideo (pDNA) codificando moléculas reguladores imunes, por exemplo, citosinas, linfocinas ou moléculas co- estimuladoras. Esses "adjuvantes genéticos", juntamente com quaisquer dos 'adjuvantes tradicionais' ou 'outros adjuvantes imunoestimuladores' como delineado aqui, podem ser administrados em diversos modos: . como uma mistura de 2 plasmideos separados, um codificando o imunógeno e o outro codificando a citosina; . como um vetor bi- ou policistrônico único, separado por regiões espaçadoras; ou . como uma quimera codificada por plasmideo, ou proteina de fusão; ou em sua forma nativa, isto é, uma proteina ou nucleotideo.
Em geral, a co-administração de agentes pró- inflamatórios (como várias interleucinas, fator de necrose tumoral e GM-CSF) mais citosinas que induzem TH2 aumentam as respostas de anticorpo, ao passo que agentes pró- inflamatórios e citosinas que induzem TH1 diminuem respostas humorais e aumentam respostas citotóxicas (que é mais importante em proteção virai, por exemplo). As moléculas co-estimuladoras como B7-1, B7-2 e CD40L são também utilizadas às vezes.
Esse conceito foi aplicado com sucesso em administração tópica de pDNA codificando IL-10. B7-1 codificado por plasmideo (um ligando em APCs) aumentou com sucesso a resposta imune em modelos anti-tumor, e a mistura de plasmideos codificando GM-CSF e a proteina circunsporozoite de P. yoelii (PyCSP) aumentou a proteção contra desafio subsequente (ao passo que PyCSP codificada por plasmideo individualmente não aumentou). GM-CSF pode fazer com que células dendriticas apresentem antigeno mais eficientemente, e aumentem a produção de IL-2 e ativação de célula TH, desse modo acionando a resposta imune aumentada. -Isso pode ser adicionalmente aumentado por primeiramente sensibilizar com uma mistura de pPyCSP e pGM-CSF, e posteriormente reforçar com um PyCSP que expressa poxvirus recombinante. Entretanto, a co-injeção de plasmideos codificando Gm-CSF (ou IFN-y ou IL-2) e uma proteina de fusão de proteina de superficie de merozoite P.chabaudi 1 proteina de superficie de virus de hepatite B (Extremidade- C) (PcMSPl-HBs) na realidade aboliu proteção contra desafio, em comparação com proteção adquirida por distribuição de pPcMSP-l-HBs individualmente.
Outros adjuvantes imunoestimuladores
Em uma modalidade, qualquer um dos seguintes pode ser utilizado como um adjuvante imunoestimulador para o constructo de ácido nucléico ou composição de acordo com a presente invenção: LPS (lipopolissacarideo) , Poli-IC (poli-inositol citosina) ou qualquer outro adjuvante que lembre RNA de fita dupla, LL37, RIG-1 helicase, IL-12, IL-18, CCL-1, CCL- 5, CCL-19, CCL-21, GM-CSF, CX3CL, CD86, PD-1, PD-1 secretado, IL10-R, IL10-R secretado, IL21, ICOSL, 41BBL, CD40L e qualquer outra proteina ou seqüência de ácido nucléico que estimule uma resposta imune.
Em uma modalidade, o adjuvante imunoestimulador é fundido com uma proteina de fibra adenoviral. Por exemplo, CX3CL pode ser fundido com proteinas de fibra adenoviral. Motifes imunoestimuladores CpG
O próprio DNA plasmidico parece ter um efeito adjuvante no sistema imune. Verificou-se que DNA de plasmideo derivado de bactérias desencadeia mecanismos de defesa imune inatos, a ativação de células dendriticas, e a produção de citosinas TH1. Isso se deve ao reconhecimento de certas seqüências de dinucleotideo CpG que são imunoestimuladoras. Seqüências estimuladoras de CpG (CpG-S) ocorrem vinte vezes mais freqüentemente em DNA derivado bacterianamente do que em eucariotas. Isso é porque eucariotas apresentam "supressão de CpG" - isto é, pares de dinucleotideo de CpG ocorrem muito menos freqüentemente do que esperado. Adicionalmente, sequências de CpG-S são hipometiladas. Isso ocorre freqüentemente em DNA bacteriano, enquanto motivos CpG ocorrendo em eucariotas são todos metilados no nucleotideo de citosina. Ao contrário, sequências de nucleotideo que inibem a ativação de uma resposta imune (denominada neutralização de CpG ou CpG-N) são representadas em excesso em genomas eucarióticos. Verificou-se que a seqüência imunoestimuladora ótima é um dinucleotideo de CpG não metilado flanqueado por duas purinas 5' e duas pirimidinas 3' . Adicionalmente, regiões de flanquear fora desse hexâmero imunoestimulador são opcionalmente ricos de guanina para assegurar ligação e absorção em células alvo.
O sistema imune inato trabalha sinergisticamente com o sistema imune adaptável para montar uma resposta contra a proteina codificada por DNA. Seqüências de CpG-S induzem ativação de célula-B policlonal e a regulação ascendente de expressão e secreção de citosina. Macrófagos estimulados secretam IL-12, IL-18, TNF-oc, IFN-α, IFN-β e IFN-y, enquanto células B estimuladas secretam IL-6 e um pouco de IL-12. A manipulação de seqüências de CpG-S e CpG-N na espinha dorsal de plasmideo de vacinas de DNA pode assegurar o sucesso da resposta imune ao antigeno codificado, e acionar a resposta imune em direção a um fenótipo TH1. Isso é útil se um patógeno exigir uma reposta TH para proteção. Seqüências de CpG-S foram também utilizadas como adjuvantes externos tanto para DNA como vacinação de proteina recombinante com taxas de sucesso variáveis. Outros organismos com motivos CpG hipometilados também demonstraram a estimulação de expansão de célula B policlonal. Entretanto, o mecanismo por trás disso pode ser mais complicado do que metilação simples - não se verificou que DNA de murino hipometilado monte uma resposta imune. Formulações de DNA
A eficiência de imunização de DNA pode ser aperfeiçoada por estabilizar DNA contra degradação, e aumentar a eficiência de distribuição de DNA em células que apresentam antigeno. Isso pode ser obtido por revestir microparticulas catiônicas biodegradáveis (como poli(lactide-co-glicolide) formuladas com brometo de cetil trimetil amónio) com DNA. Tais microparticulas revestidas com DAN podem ser tão eficazes em elevar CTL quanto virus de vacinia recombinante, especialmente quando misturado com alum. Particulas com 300 nm de diâmetro parecem ser mais eficientes para absorção por células que apresentam antigeno.
Administração
Constructos de ácido nucléico e composições de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo em quantidades terapeuticamente eficazes. A quantidade eficaz pode variar de acordo com uma variedade de fatores como a condição do indivíduo, peso, sexo e idade. Outros fatores incluem o modo de administração.
Em uma modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser distribuída a um sujeito na forma de DNA, RNA, LNA, PNA, INA, TINA, HNA, ANA, CNA, CeNA, GNA, TNA, Gap-mers, Mix-mers, Morfolinos ou qualquer combinação dos mesmos.
Em uma modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser distribuído a um sujeito na forma de DNA.
Em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser distribuído a um sujeito na forma de DNA. Desse modo, o constructo de ácido nucléico pode ser transcrito em RNA antes da administração.
Ainda em outra modalidade, o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser distribuído a um sujeito na forma de proteína. Desse modo, o constructo de ácido nucléico pode ser traduzido em proteína antes da administração.
Na modalidade na qual o constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é distribuído a um sujeito na forma de uma proteína, a proteína pode ter sido modificada para aumentar a estabilização e/ou otimizar a distribuição na célula. A proteína pode ter estabilidade aumentada devido à presença de ligações de dissulfeto (por exemplo, US 5,102,985 soluções tratadas de proteínas em forma reduzida com peróxido de hidrogênio para gerar proteínas tendo uma ponte de dissulfeto intramolecular em 90 - 96% de rendimento), um aumento em resíduos polares, otimização de carga de superfície, pontes de sal de superfície, encapsulação (por exemplo, com silicato mesoporoso) ou a proteína pode ser ligada a proteínas de choque térmico (como Hsp-60, Hsp-70, Hsp-90, Hsp20, Hsp-27, Hsp-84 e outros), domínio de translocação tat HIV, proteínas de fibra adenoviral ou quaisquer outras proteínas ou domínios.
As composições farmacêuticas ou veterinárias podem ser fornecidas ao indivíduo por uma variedade de vias como subcutânea (sc ou s.c.), tópica, oral e intramuscular (im ou i.m.) a administração de composições farmacêuticas é realizada por via oral ou parenteral. Os métodos de distribuição parenteral incluem administração tópica, intra-arterial (diretamente no tecido), intramuscular, intracerebral (ic ou i.c.), subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa (iv ou i.v.), intraperitoneal ou intranasal. A presente invenção também tem o objetivo de fornecer formulações farmacêuticas tópicas, orais, sistêmicas e parenterais, apropriadas, para uso nos métodos de sensibilizar uma resposta imune com a composição.
Por exemplo, as composições podem ser administradas em tais formas de dosagem oral como tabletes, cápsulas (cada incluindo liberação regulada e formulações de liberação controlada), pilulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, soluções, suspensões, xaropes e emulsões ou por injeção. De modo semelhante, também podem ser administrados em forma intravenosa (tanto bolo como infusão), intraperitoneal, subcutânea, tópica com ou sem oclusão, ou intramuscular, todas utilizando formas bem conhecidas por aqueles com conhecimentos comuns na técnica farmacêutica. Uma quantidade eficaz, porém não tóxica da composição, compreendendo qualquer um dos compostos aqui descrito pode ser empregada. Além disso, todas e quaisquer formas de dosagem convencionais que são conhecidas na arte como sendo apropriadas para formular composição de peptideo imunogênica injetável são abrangidas, como formas e soluções liofilizadas, suspensões ou formas de emulsão contendo, se necessário, veiculos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, diluentes, preservativos, adjuvantes, componentes de tampão, etc.
Em uma modalidade, a composição para sensibilização e/ou vacina de reforço subsequente é dada como uma formulação de liberação lenta ou controlada.
Modos de administração preferidos do constructo ou composição de ácido nucléico de acordo com a invenção incluem, porém não são limitadas à administração sistêmica, tal como, administração intravenosa ou subcutânea, administração intradérmica, administração intramuscular, administração intranasal, administração oral, administração retal, administração vaginal, administração pulmonar e genericamente qualquer forma de administração de mucosa. Além disso, está compreendido no escopo da presente invenção que o meio para qualquer das formas de administração mencionadas aqui é incluido na presente invenção.
Um constructo de ácido nucléico ou composição de acordo com a presente invenção pode ser administrado de uma vez, ou qualquer número de vezes como duas, três, quatro ou cinco vezes.
Em uma modalidade preferida, o constructo de ácido nucléico ou composição é administrado uma vez, seguido por administração de uma vacina apropriada.
Em outra modalidade preferida, o constructo de ácido nucléico ou composição é administrado como uma série de administrações antes da administração da vacina. Tal série pode compreender administrar o constructo de ácido nucléico ou composição diariamente, cada segundo dia, cada terceiro dia, cada quarto dia, cada quinto dia, cada sexto dia, semanalmente, bi-semanalmente, ou a cada terceira semana para um total de uma, duas, três, quatro ou cinco vezes.
Em uma modalidade, o periodo de tempo entre a primeira administração do constructo de ácido nucléico ou composição para sensibilizar o sistema imune e em segundo lugar a vacina para reforço é separado pelo menos em um dia, como separado pelo menos em dois dias, por exemplo, separado em três dias, como pelo menos separado em quatro dias, por exemplo separado em cinco dias, como separado pelo menos em seis dias, por exemplo, separado em sete dias, como pelo menos separado em oito dias, por exemplo separado em nove dias, como pelo menos separado em dez dias, por exemplo separado em quinze dias, como pelo menos separado em vinte dias, por exemplo, separado em vinte e cinco dias.
A sensibilização com o constructo de ácido nucléico ou composição é desse modo destinada a ser adicionalmente reforçada por administrar uma vacina. A administração pode estar em uma forma ou parte de corpo diferente da administração anterior ou similar à administração anterior.
A injeção de reforço é uma injeção de reforço homóloga ou heteróloga. Uma injeção de reforço homóloga é onde a primeira administração e administrações subseqüentes compreendem os mesmos constructos e mais especificamente o mesmo veiculo de distribuição. Uma injeção de reforço heteróloga é onde constructos idênticos são compreendidos em vetores diferentes.
Uma forma de administração preferida da composição de acordo com a presente invenção é administrar a composição na área do corpo, dentro ou fora, mais provável de ser o receptáculo de uma dada infecção. O receptáculo de infecção é a área do corpo na qual a infecção é recebida, por exemplo, em relação à influenza, o receptáculo de infecção são os pulmões.
O constructo de ácido nucléico ou composição da presente invenção pode ser administrado em qualquer organismo ao qual pode ser vantajoso, especialmente qualquer animal como um animal vertebrado. Está compreendido dentro do escopo da presente invenção que o meio e modos de administração da composição são adaptados ao receptor.
Um receptor preferido da composição é um mamifero e o mamífero é em uma modalidade mais preferida da presente invenção selecionado do grupo de vacas, porcos, cavalos, carneiros, cabras, lhamas, camundongos, ratos, macacos, cães, gatos, furões e seres humanos. Na modalidade mais preferida o mamífero é um ser humano.
Outro receptor preferido da composição é qualquer vertebrado da classe de aves (pássaro), como Gallus gallus domesticus (galinha). Uma modalidade da presente invenção inclui uma composição compreendendo ainda um segundo ingrediente ativo. O segundo ingrediente ativo é selecionado de, porém não limitado ao grupo de adjuvantes, antibióticos, quimioterapêuticos, anti-alergênicos, citosinas, fatores de complemento e moléculas co-estimuladoras do sistema imune.
Outra modalidade da presente invenção compreende um kit e partes, em que o kit inclui pelo menos um constructo de ácido nucléico ou composição de acordo com qualquer um do acima, um meio para administrar o constructo de ácido nucléico ou composição e a instrução sobre como fazer isso. Está compreendido dentro do escopo da presente invenção incluir múltiplas dosagens da mesma composição ou várias composições diferentes. Em uma modalidade preferida o kit de partes compreende ainda um segundo ingrediente ativo. Em uma modalidade mais preferida, o segundo ingrediente ativo é uma vacina apropriada, isto é, uma vacina capaz de reforçar a resposta imune criada por sensibilização anterior da resposta imune.
A presente invenção compreende ainda um método para potenciar uma resposta imune em um animal, compreendendo administrar ao animal um constructo de ácido nucléico ou composição de acordo com qualquer um dos acima, seguido por administrar uma vacina apropriada, desse modo sensibilizando e reforçando o sistema imune de um sujeito.
A resposta imune pode ser, porém não é limitada a, qualquer um dos seguintes tipos de respostas: uma resposta dependente de MHC-I, uma resposta dependente de MHC-I e/ou MHC-II, uma resposta dependente de célula T, uma resposta dependente de célula T CD4 + , uma resposta independente de célula T CD4 + , uma resposta dependente de célula T CD8+ e uma resposta imune dependente de célula B. vacinas apropriadas são aquelas que são capazes de reforçar o sistema imune subsequente à sensibilização do sistema imune com o constructo de ácido nucléico ou composição de acordo com a presente invenção.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um individuo necessitando da mesma, compreendendo administrar a composição com descrito aqui acima para tratar uma condição clínica no indivíduo.
Aumento da potência de uma vacina Uma modalidade da invenção se refere a um constructo de ácido nucléico que codifica pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma e pelo menos uma proteína antigênica ou peptideo ou fragmento de 1 ima proteína antigênica ou peptideo, em que pelo menos uma proteína antigênica ou peptideo ou fragmento de uma proteína antigênica ou peptideo é de um vírus, bactéria ou parasita.
Dados apresentados aqui mostram que não é simples desenvolver regimes de reforço de sensibilização utilizando constructos de ácido nucléico compreendendo cadeia invariante ou variante da mesma. Desse modo, como apresentado na figura 1, um constructo de DNA nu compreendendo cadeia invariante e um antigeno (DNA-liGP) é capaz de sensibilizar uma resposta imune, ao passo que um constructo de DNA nu compreendendo um antigeno porém não cadeia invariante (DNA-GP) não é capaz de sensibilizar uma resposta imune. Além disso, os dados apresentados na figura 12 mostram quem um vetor adenoviral compreendendo um antigeno (AdGP) é capaz de sensibilizar certas (Ad-liGP) porém não todas as respostas imunes (Ad-GP), ao passo que dados apresentados na figura 13 mostram que um vetor adenoviral compreendendo cadeia invariante com um antigeno (Ad-liGP) não é capaz de sensibilizar quaisquer respostas imunes (Ad-liGP e Ad-GP) sob regimes de tratamento e dosagem normais. Entretanto, é possivel otimizar sensibilização Ad-liGP de um reforço Ad-liGP utilizando doses mais baixas de Ad-liGP para sensibilização (como mostrado na figura 14).
É um objetivo da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico codificando pelo menos uma cadeia invariante e um antigeno virai, bacteriano ou parasitico ou um fragmento do mesmo, em que a cadeia invariante é uma variante de cadeia invariante, para sensibilizar uma resposta imune, em que a sensibilização é seguida por uma vacinação de reforço subsequente com uma vacina de câncer. O variante de cadeia invariante pode ser qualquer variante como especificado em outro lugar aqui, compreendendo cadeia invariante em que os residuos de aminoácidos li-KEY LRMK foram alterados, por exemplo, por deleção ou substituição, ou em que parte da região CLIP foi alterada, por exemplo, por deleção ou substituição.
Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para aumentar a potência de uma vacina.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende cadeia invariante ou um variante da mesma e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) , desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada,
Em que a variante de cadeia invariante compreende alteração dos residuos de aminoácido LRMK li-KEY, por exemplo, por deleção ou substituição.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração da região CLIP, por exemplo, por deleção ou substituição.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada, Em que a variante de cadeia invariante não compreende os 17 primeiros aminoácidos.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para sensibilização de uma resposta imune.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta imune compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante ou um variante da mesma e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta imune compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração dos residuos de aminoácido LRMK li-KEY, por exemplo, por deleção ou substituição.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração da região CLIP, por exemplo, por deleção ou substituição.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende um variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada, em que a variante de cadeia invariante não compreende os 17 primeiros aminoácidos.
Aumento da potência de uma vacina contra câncer Uma modalidade da invenção refere-se a um constructo de ácido nucléico codificando pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma e pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento de uma proteina antigênica ou peptideo, em que pelo menos uma proteina antigênica ou peptideo ou fragmento de uma proteina antigênica ou peptideo é de um antigeno de câncer ou polipeptidio especifico de câncer.
É um objetivo da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico que codifica pelo menos uma cadeia invariante e um antigeno de câncer ou um fragmento do mesmo, em que a cadeia invariante está em sua forma nativa, do tipo selvagem, para sensibilizar uma resposta imune, em que a sensibilização é seguida por uma vacinação de reforço subsequente com uma vacina contra câncer.
Também é um objetivo da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico que codifica pelo menos uma cadeia invariante e um antigeno de câncer ou um fragmento do mesmo, em que a cadeia invariante é uma variante de cadeia invariante, para sensibilizar uma resposta imune, em que a sensibilização é seguida por uma vacinação de reforço subsequente com uma vacina contra câncer. A variante de cadeia invariante pode ser qualquer variante como especificado em outro lugar aqui, compreendendo cadeia invariante em que os residuos de aminoácidos LRMK li-KEY foram alterados, por exemplo, por deleção ou substituição, ou em que parte da região CLIP foi alterada, por exemplo, por deleção ou substituição ou em que os 17 primeiros aminoácidos foram deletados.
Conclui-se que quando a vacina subseqüentemente administrada utilizada para reforçar uma resposta imune é uma vacina contra câncer, a cadeia invariante codificada pelo constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode estar em sua forma de tipo selvagem, nativa, ou pode ser uma variante de cadeia invariante.
Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para aumentar a potência de uma vacina contra câncer.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina contra câncer compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante ou uma variante da mesma e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina contra câncer compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada, em que a cadeia invariante está em sua forma de tipo selvagem, nativa.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina contra câncer compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração dos residuos de aminoácidos LRMK li-KEY por, por exemplo, deleção ou substituição e/ou alteração de parte da região CLIP por, por exemplo, deleção ou substituição e/ou deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para sensibilização de uma resposta imune.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta imune compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante ou uma variante da mesma e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta imune compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada,
Em que a cadeia invariante está em sua forma do tipo selvagem, nativa.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para sensibilização de uma resposta imune compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico especifico de câncer ou fragmento do mesmo, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina contra câncer apropriada, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração dos residuos de aminoácido LRMK li-KEY por, por exemplo, deleção ou substituição e/ou alteração de parte da região CLIP por, por exemplo, deleção ou substituição, e/ou deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li.
Aumentar a potência de uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal É um objetivo da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico codificando pelo menos uma cadeia invariante e um polipeptidio associado a uma resposta fisiológica anormal ou um fragmento do mesmo, em que a cadeia invariante está em sua forma do tipo selvagem, nativa para sensibilizar uma resposta imune, em que a sensibilização é seguida por uma vacina de reforço subsequente com uma vacina dirigida na resposta fisiológica anormal.
Também é um objetivo da presente invenção fornecer um constructo de ácido nucléico codificando pela menos uma cadeia variante e um polipeptidio associado a uma resposta fisiológica anormal ou um fragmento da mesma, em que a cadeia invariante é uma variante de cadeia invariante, para sensibilizar uma resposta imune, em que a sensibilização é seguida por uma vacinação de reforço subseqüente com uma vacina dirigida na resposta fisiológica anormal. A variante de cadeia invariante pode ser qualquer variante como especificado em outro lugar aqui, compreendendo cadeia invariante em que os residuos de aminoácidos LRMK li-KEY foram alterados, por exemplo, por deleção ou substituição, ou em que parte da região CLIP foi alterada, por exemplo, por deleção ou substituição, ou em que os 17 primeiros aminoácidos de li foram deletados.
Conclui-se que quando a vacina subseqüentemente administrada utilizada para reforço de uma resposta imune é uma vacina dirigida na resposta fisiológica anormal, a cadeia invariante codificada pelo constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode estar em sua forma do tipo selvagem, nativa, ou pode ser uma variante de cadeia invariante.
Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para aumentar a potência de uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida ao uso de um constructo de ácido nucléico para sensibilização de uma resposta imune.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante ou uma variante da mesma e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo associado a uma resposta fisiológica anormal, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada dirigida em uma resposta fisiológica anormal.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo associado a uma resposta fisiológica anormal, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada dirigida em uma resposta fisiológica anormal, em que a cadeia invariante está em sua forma do tipo selvagem, nativa.
Em uma modalidade, a presente invenção revela um método para aumentar a potência de uma vacina dirigida em uma resposta fisiológica anormal compreendendo as etapas de: a) Fornecer um constructo de ácido nucléico que compreende uma variante de cadeia invariante e um peptideo antigênico ou fragmento do mesmo associado a uma resposta fisiológica anormal, b) Sensibilizar o sistema imune de um sujeito por administrar o constructo de ácido nucléico da etapa (a) desse modo estimulando uma resposta imune no sujeito, e c) Reforçar a resposta imune da etapa (b) por administrar uma vacina apropriada dirigida em uma resposta fisiológica anormal, em que a variante de cadeia invariante compreende alteração dos residuos de aminoácidos LRMK de li-KEY por, por exemplo, deleção ou substituição e/ou alteração de parte da região CLIP por, por exemplo, deleção ou substituição, e/ou deleção dos 17 primeiros aminoácidos de li.
Tipos de vacina
Um aspecto da presente invenção se refere à sensibilização de uma resposta imune em um sujeito por administrar um constructo de ácido nucléico compreendendo antigeno ligado em li, seguido por um reforço subsequente obtido por administrar ao mesmo sujeito uma vacina apropriada.
Vacinas apropriadas de acordo com a presente invenção têm pelo menos uma característica idêntica em comum com o constructo de ácido nucléico utilizada para sensibilização de uma resposta imune. A característica idêntica pode ser compreendida em parte ou total de uma cadeia invariante, a parte ou toda de um peptideo antigênico, parte ou toda de uma estrutura de espinha dorsal como parte ou toda de uma região promotora, parte ou toda de um intensificador, parte ou toda de um terminador, parte ou toda de uma cauda poli- A, parte ou toda de um ligador, parte ou toda de um poliligador, parte ou toda de um ligador operativo, parte ou toda de um sitio de clonagem múltiplo (MCS) , parte ou todo de um marcador, parte ou todo de um códon de PARADA, parte ou todo de um sitio de entrada ribossômico interno (IRES) e parte ou todo de uma seqüência homóloga hospedeira para integração ou outros elementos definidos.
Em uma modalidade preferida, a característica idêntica é parte ou todo de um peptideo antigênico ou um epitopo de célula T auxiliar ubiquo. Em uma modalidade mais preferida, a característica idêntica é parte ou toda de um peptideo antigênico.
Em outra modalidade preferida, a característica idêntica é parte ou toda de cadeia invariante. Vacinas podem ser consideradas como tradicionais ou inovadoras. Quaisquer dos tipos acima citados de vacinas podem ser utilizadas na etapa de reforço subseqüente de acordo com a presente invenção.
Vacinas tradicionais ou vacinas de primeira geração se baseiam em organismos inteiros; cepas patogênicas que foram mortas, ou cepas com patogenicidade atenuada.
Técnicas biológicas moleculares foram utilizadas para desenvolver novas vacinas, vacinas de segunda geração, com base em proteinas antigênicas individuais a partir dos organismos patogênicos. De forma conceptual, o uso de peptideos antigênicos em vez de organismos inteiros evitaria patogenicidade enquanto fornece uma vacina contendo os antigenos mais imunogênicos. Esses incluem vacinas à base de toxóide com base em composto tóxico inativado são bem conhecidos, e vacinas de subunidade com base em um fragmento de uma cepa patogênica atenuada ou inativada.
Vacinas conjugadas: certas bactérias têm revestimentos externos de polissacarideos que são pouco imunogênicos. Por ligar esses revestimentos externos com proteinas (por exemplo, toxinas), o sistema imune pode ser levado a reconhecer o polissacarideo como se fosse um antigeno de proteina.
Vacina de vetor recombinante: por combinar a fisiologia de um microorganismo e o DNA do outro, imunidade pode ser criada contra doenças que têm processos de infecção complexos.
Vacinas sintéticas são compostas principalmente ou totalmente de peptideos sintéticos, carboidratos ou antigenos.
Vacinas de DNA (ou genéticas), ou vacinas de terceira geração são candidatos novos e promissores para o desenvolvimento de vacinas tanto profiláticas como terapêuticas, vacinas de DNA são compostas de um pequeno pedaço circular de DNA (um plasmideo) que foi geneticamente construído para produzir um ou mais antigenos de um microorganismo. O DNA de vacina é injetado nas células do corpo, onde a "maquinaria interna" das células hospedeiras "lê" o DNA e converte o mesmo em proteinas patogênicas. Como essas proteinas são reconhecidas como estrangeiras, são processadas pelas células hospedeiras e exibidas em sua superficie, para alertar o sistema imune, que então aciona uma gama de respostas imunes. A resistência da resposta imune seguinte é determinada através de uma combinação da potência do vetor (isto é, DNA nu, vetores virais, virus atenuado vivo, etc.), o nivel de expressão do antigeno, e o próprio antigeno recombinante (Isto é, aglutinantes de MHC de elevada ou baixa afinidade, determinantes estruturais selecionando por repertório de célula T ou B mais ou menos limitado, etc.). É genericamente considerado verdadeiro que a indução eficiente de memória imunológica requer ou beneficia das interações de células T CD4+ (célula auxilia) com células T CD8+ (citotóxicas) e células B que mediam muitos dos efeitos de memória imune.
Em uma modalidade da presente invenção, a sensibilização de uma resposta imune com um constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é seguida pela administração subseqüente de uma vacina de primeira geração ou tradicional para reforçar a resposta imune.
Em uma modalidade da presente invenção, a sensibilização de uma resposta imune com um constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é seguida pela administração subsequente de uma vacina de segunda geração para reforçar a resposta imune.
Em uma modalidade da presente invenção, a sensibilização de uma resposta imune com um constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é seguida pela administração subsequente de uma vacina de terceira geração ou DNA para reforçar a resposta imune.
O uso de cadeia invariante em constructos de vacina de DNA para aumentar imunogenicidade é bem conhecido no estado da técnica. Em uma modalidade da presente invenção, a sensibilização de uma resposta imune com um constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é seguida pela administração subsequente de uma vacina de DNA compreendendo cadeia invariante ou uma variante da mesma para reforçar a resposta imune.
Em uma modalidade da presente invenção, a sensibilização de uma resposta imune com um constructo de ácido nucléico de acordo com a presente invenção é seguida pela administração subsequente de uma vacina adenoviral para reforçar a resposta imune.
Vacinas podem ser adicionalmente monovalentes (também chamadas univalentes) ou multivalentes (também chamadas polivalentes). Uma vacina monovalente é projetada para imunizar contra um antigeno único ou microorganismo único. Uma vacina multivalente ou polivalente é projetada para imunizar contra duas ou mais cepas do mesmo microorganismo, ou contra dois ou mais microorganismos.
Descrição Detalhada dos Desenhos
A Figura 1 mostra a sensibilização de DNA com uma vacina de DNA nu à base de cadeia li aumenta significativamente a geração de células CD8+T especificas de virus após reforço subsequente com um vetor virai altamente eficiente. Os camundongos foram imunizados por pistola de genes duas vezes com 3 semanas de separação com DNA-liGP, DNA-GP ou deixados não tratados. Três semanas após a última imunização, todos os camundongos foram injetados na pata da perna direita com 2xl07 IFU Ad5-liGP, e 4 semanas após os animais foram sacrificados, e esplenócitos foram analisados como descrito na figura 1. números de células T CD8+ de IFN-y específicos de epitopo são apresentadas como média ± SE (n=5 camundongos/grupo). * indica significância estatística relativa a camundongos vacinados com Ad5-liGP somente (testes de soma de classificação Mann-Whitney). Os resultados de um de dois experimentos similares são representados.
A Figura 2 mostra a localização dos dominios e as mutações testadas na seqüência li. Dominios em WT li são representados acima da barra. ESS; sinal de separação endossomal, TM; dominio de transmembrana, KEY; região de aumentar apresentação de peptideo, CLIP; peptideo de cadeia invariante associada a classe II, TRIM; dominio de trimerização. Extensão de mutações de deleção e substituições em li é marcada baixo da barra. A; Ad- Δ17HGP, b; Ad-IiLTMGP, c; Ad-IiUTMGP, d; Ad-Δ50IiGP, e; Ad-Iil-201GP, f; Ad-Iil-118GP, g; Ad-Iil-105GP, h; Ad- liCLIPGP, i; Ad-IiKEYGP, j; Ad-Ii51-118GP.
A Figura 3 mostra que li aumenta dramaticamente a apresentação superficial de célula do epitopo derivado de SIINFEKL/H-2kb OVA. Células dendriticas derivadas de medula óssea foram transfectadas com Ad-OVA, Ad-liOVA ou Ad-liGP (controle negativo) , e coloridas superficialmente para MHC classe II (colore células dendriticas maduras) e com um anticorpo especifico de SIINFEKL/H-2kb (epitopo de OVA) .
A Figura 4 mostra que li trabalha somente em is. A) expressão de li a partir de vetores Ad-liGP e Ad-li + G; expressão de li foi normalizada para GAPDH em células COS7 infectadas com 50 moi de Ad-liGP e Ad-li + GP. B) proliferação de célula T restrita em GP33 TCR318 em respostas a Ad-GP, Ad-liGP ou Ad-li + BMDCs transduzidos por GP (célula dendritica derivada de medula óssea).
A Figura 5 mostra que deleções de N-terminal e substituições não efetuam a capacidade estimuladora de li. Proliferação de células T restritas a GP33 TCR 318 em resposta a Ad-GP, Ad-liGP, Ad-Δ17IiGP, Ad-IiLTMGP, Ad- liUTMGP, BMDCs transduzidos de Ad-Δ50IiGP (célula dendritica derivada de medula óssea).
A Figura 6 mostra que deleções de C-terminal e substituições não efetuam capacidade estimuladora de li. Proliferação de células T restritas a GP33 TCR 318 em resposta a Ad-GP, Ad-liGP, Ad-lil-205GP, Adlil-118GP e BMDCs transduzidos de Ad-lil—105GP (célula dendritica derivada de medula óssea) .
A Figura 7 mostra que somente uma deleção de N- e C- terminal reduz capacidade estimuladora de li. Proliferação de células T restrita de TCR 318 GP33 em resposta a Ad-GP, Ad-liGP, Ad-liCLIPGP, Ad-liKEYGP e BMDCs transduzidos por Ad-1151-118GP (sistema de cultura de célula dendritica derivada de medula óssea).
A Figura 8 mostra resposta de dose de vacinas Ad-GP e Ad-llGP. Grupos de camundongos foram vacinados com as vacinas indicadas nas cepas indicadas. 14 dias após vacinação os camundongos foram sacrificados, e esplenócitos estimulados com os epitopos indicados. O número total de esplenócitos CD8+ específicos foi determinado por coloração intracelular e análise FACS. Os dados mostram que Ad-liGP induz respostas em dosagens muito baixas, e desse modo a sensibilização com um Ad-liGP de dose baixa (ou qualquer antigeno) e reforço subsequente com uma dose mais elevada Ad-liGP (ou qualquer antigeno) pode ser aplicável para regimes de reforço de sensibilização homóloga.
A Figura 9 mostra uma comparação de Ad-GP, Ad-liGP e Ad-liCLIPGP para apresentação de MHC classe II (estimulação de células T CD4+). Proliferação de células T restritas a GP61-80 SMARTA em resposta a Ad-GP, Ad-liGP e BMDCs transduzidos por Ad-liCLIPGP mostram uma apresentação de antigeno MHCII aumentada de Ad-liCLIPGP.
A Figura 10 mostra uma comparação de Ad-GP, Ad-liGP, Ad-GPLamp-1 e Ad-IiA17GP em um estudo de curso de tempo in vivo.
A Figura 11 mostra uma comparação de Ad-GP, Ad-liGP, Ad-IiΔ17GP, Ad-IiKEYGP, Ad-liCLIPGP, Ad-Iil-117GP e Ad-Iil- 199GP respostas in vivo.
A Figura 12 mostra que Ad-GP é capaz de sensibilização de um reforço Ad-liGP subsequente. 3 grupos de camundongos C57BL/6 foram vacinados com Ad-GP. 60 dias após esses camundongos foram deixados sem serem incomodados, vacinados com Ad-GP ou vacinados com Ad-liGP. Um 4o grupo de camundongos foi incluido que foram vacinados com Ad-GP. 120 dias após as primeiras vacinações, camundongos foram sacrificados e células especificas de antigeno reconhecendo os epitopos indicados foram quantificadas por reestimulação ex vivo com os peptideos e coloração intracelular para produção de interferon-y.
A Figura 13 mostra que Ad-liGP não é capaz de sensibilizar um reforço de Ad-GP ou Ad-liGP subsequente. 3 grupos de camundongos C57BL/6 foram vacinados com Ad-liGP. 60 dias após esses camundongos foram deixados sem serem incomodados, vacinados com Ad-GP ou vacinados com Ad-liGP. Um 4o grupo de camundongos foi incluido que foram vacinados com Ad-liGP. 120 dias após as primeiras vacinações, os camundongos foram sacrificados e células especificas de antigeno reconhecendo os epitopos indicados foram quantificadas por reestimulação ex vivo com os peptideos e coloração intracelular para produção de interferon-y. Isso mostra que sensibilização de Ad-liGP pode não ser reforçado com Ad-liGP, ao passo que a sensibilização de DNA-liGP pode ser reforçada com Ad-liGP (vide a figura 1).
A Figura 14 mostra uma resposta de dose de vacinas de Ad-GP e Adli-GP. Grupos de camundongos foram vacinados com a vacina indicada nas cepas indicadas. 14 dias após vacinação os camundongos foram sacrificados, e esplenócitos estimulados com os epitopos indicados. O número total de esplenócitos de CD8+ foi determinado por coloração intracelular e análise FACS.
A Figura 15 mostra o receptor Mano acoplado a uma variante de cadeia invariante compreendendo residuos 50 a 215 (1150-215), adicionalmente acoplado a uma proteina de fibra adenoviral. A proteina de fibra adenoviral (fibra Ad) pode originar de qualquer sorotipo de adenovirus. O receptor de manose pode ser um ou mais dominios do receptor de Manose. O li pode ser um variante de ou li de comprimento total. Ag = antigeno. Exemplos da Invenção
A invenção será adicionalmente ilustrada com referência aos seguintes exemplos. Será reconhecido que o que segue é somente exemplo e que modificações em detalhe podem ser feitas enquanto ainda estão compreendidas no escopo da invenção.
Exemplo 1: Sensibilização com uma vacina de DNA nu baseada em cadeia li significativamente aumenta a geração de células T CD8+ especificas de vírus após reforço subseqüente com um vetor virai otimizado.
A sensibilização com uma vacina de DNA nu (isto é, um constructo de ácido nucléico) é mostrada para aumentar a resposta imune criada por imunização subseqüente com vetor glicoproteína (GP) de LCMV (vírus de coriomeningite linfocítico) que expresso constructo de DNA-liGP (DNA fundida com cadeia invariante (li)) é aqui demonstrada para aumentar significativamente a resposta de célula T CD8§ induzida pelo mesmo constructo de gene distribuída em um vetor de adenovirus sorotipo 5 (Ad5-liGP) , fornecendo um forte argumento para a inclusão de constructos de DNA baseadas em cadeia li em protocolos de imunização heterólogos futuros ("reforço de sensibilização").
O estudo dos requerentes mostra que o efeito de imunointensificação de ligação de cadeia li não é limitado ao vetor Ad5, porém é relevante em uma plataforma de DNA também. Além disso, dado o fato de que cadeia li aumenta a apresentação de mais de um epitopo, isso coloca vacinas de DNA baseadas em cadeia li como candidatos muito promissores para vários regimes de reforço de sensibilização heterólogos. Resultados & Discussão
Um modo para aperfeiçoar a memória de célula T induzida é através de regime de reforço de sensibilização heterólogo, por exemplo, sensibilização de DNA nu seguido por um reforço de vetor. Desse modo tendo no laboratório dos requerentes o vetor apropriado, adenovirus deficiente em replicação que expressa LCMV GP fundido com cadeia li p31 (Ad5-liGP) essa possibilidade foi testada experimentalmente. Em primeiro lugar, os requerentes realizaram vacinação de DNA padrão, vacinação de pistola de genes duas vezes com 3 semanas de separação com DNA-liGP ou DNA-GP. Três semanas após a segunda vacinação de DNA, os dois grupos de camundongos e controles casados foram imunizados por inoculação de 2xl07 IFU Ad5-liGP na pata da perna direita, e 4 semanas após o número de células T CD8+ especificas de virus no baço foram enumeradas por meio de ICCS para IFN-y e citometria de fluxo. Os camundongos sensibilizados com o constructo de DNA fundida continham significativamente mais células T CD8+ IFN-y especificas de GP33-42 e GP276-286 do que os camundongos não sensibilizados, e uma tendência similar foi observada para células especificas de GP92-101, embora nesse caso a diferença não fosse estatisticamente significativa. Ao contrário, a sensibilização com DNA nu codificando GP na ausência de li teve pouco efeito sobre o nivel de células T CD8+ de memória especifica de GP induzidas por imunização subseqüente com Ad5-liGP (figura 1). Deve ser observado que o efeito observado de incluir li não reflete aumento não especifico da imunorreatividade de camundongos vacinados, visto que sensibilização de DNA com um vetor incluindo somente li, porém sem GP, não teve efeito sobre o nivel de células T CD8+ especificas de GP em camundongos subsequentemente inoculados com o vetor adenoviral (dados não mostrados).
Os requerentes mostraram que o uso do vetor de DNA aperfeiçoado como parte de um regime de reforço de sensibilização heterólogo aumentará significativamente a resposta induzida por um vetor virai já otimizado (Holst e outros, 2008) . Isso indica fortemente que mesmo imunização baseada em vetor muito imunogênico pode ser adicionalmente aperfeiçoada através de sensibilização inicial do hospedeiro com uma vacina de DNA nu baseada em cadeia li. No total, uma vez que a fusão de cadeia li com o antigeno levará à sensibilização para uma resposta de célula T CD8+ ampla, vacinas de DNA baseadas em cadeia li devem representar uma vantagem clara com relação à estratégias de prevenção contra virus de mutação rápida como parte de regimes de reforço de sensibilização heteróloga.
Materiais e Métodos
Camundongos. Camundongos do tipo selvagem C57BL/6 (B6) foram obtidos da Taocnic M&B (Ry, Dinamarca). Camundongos B6 deficientes em perforin foram criados localmente de pares de reprodutores originalmente obtidos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Camundongos com sete a 10 semanas de idade foram utilizados em todos os experimentos, e animais de fontes externas foram sempre deixados aclimatar com o ambiente local por pelo menos 1 semana antes do uso. Todos os animais foram alojados sob condições isentas de patógeno especifico como validado por classificação de sentinelas. Todos os experimentos de animais foram realizados de acordo com diretrizes nacionais.
Procedimento de imunização e constructo de vacina DNA. As vacinas de DNA são produzidas utilizando o vetor de expressão eucariótica pACCMV.pLpA contendo a cadeia invariante de murino seguido por GP de LCMV ou LCMV GP sozinho. Os constructos foram gerados como recentemente descrito (Holst e outros, 2008). A cepa de E. coli XLl-azul (Stratagene, EUA) foi transformada com os constructos por eletroporação. Seqüenciamento de DNA utilizando seqüenciamento ciclico, Terminador Big Dye e analisador genético AB1310 (ABIprims, EUA) identificaram clones positivos. Os primers foram obtidos de TAG, Copenhague, Dinamarca. Preparações de DNA em grande escala foram produzidas utilizando Qiagen Maxi Prep (Qiagen, EUA) . Imunização de pistola gênica.
O DNA foi revestido em 1.6 nm de partículas de ouro em uma concentração de 2 μg DNA/mg de ouro, e os complexos de ouro/DNA foram revestidos sobre tubos de plástico de tal modo que 0,5 mg de ouro foi distribuído para o camundongo pr injeção (1 μg DNA pr. Injeção). Esses procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (Biorad, CA, EUA) (Bartholdy e outros, 2003) . Os camundongos foram imunizados na pele abdominal utilizando um dispositivo de pistola de gene portátil empregando Hélio comprimido (400 psi) como a força motriz de partícula. A menos que de outro modo mencionado, os camundongos foram imunizados duas vezes com um intervalo de 3-4 semanas e então deixados descansar por 3 semanas antes de desafio/pesquisa adicional.
Vírus. LCMV do clone de cepa Armstrong 13 foi utilizado na maioria dos experimentos. A menos que de outro modo mencionado, os camundongos a serem infectados receberam uma dose de 105 pfu de clone 13 em uma injeção i.v. de 0,3 ml, ou 20 pfu em 0,03 ml na pata da perna direita (f.p.). Para injeção i.c. os camundongos receberam 20 pfu de clone Armstrong neurotrópico 53b em um volume de 0,03 ml. GP ligado por cadeia invariante que codifica adenovirus deficiente em replicação (Ad5-liGP) foi produzido e titulado como recentemente descrito (Holst e outros, 2008). Titulação de vírus. Títulos de virus de órgão foram ensaiados por um ensaio de foco imune como anteriormente descrito (Battegay e outros, 1991). Esgotamento in vivo de células T CD4+ e CD8+.
Os mAbs anti-CD4 (clone GK1.5) e anti-CD8 (clone 53.6.72) foram utilizados. Os camundongos a terem as células esgotadas receberam uma dose de 200 μg em um volume de 0,3 ml de PBS por via intraperitoneal nos dias -1 e 0 em relação à infecção; para tratamento simulado IgG de rato purificado (Jackson ImmunoResearch) foi utilizado em vez disso. A eficiência de esgotamento de célula foi verificada por citometria de fluxo.
Estudo de sobrevivência. A mortalidade foi utilizada para avaliar a gravidade clínica de meningite induzida por LCMV aguda. Os camundongos foram verificados duas vezes por dia por um período de 14 dias ou até atingir 100% de mortalidade.
Ensaio de reação de inchaço de pata específico de LCMV. Os camundongos foram infectados localmente na pata da perna direita como descrito acima, e a reação de inchaço local foi seguida até o dia 14 p.i. A espessura da pata foi medida com um compasso de calibre de dial (Mitutoyo 7309, Mitutoyo Co., Tóquio, Japão), e inchaço específico de vírus foi determinado como a diferença em espessura da pata direita infecta e esquerda não infectada (Christensen e outros, 1994).
Preparações de células.
Baços de camundongos foram assepticamente removidos e transferidos para solução de sal equilibrada de Hanks (HBSS). As suspensões de células únicas foram obtidas por pressão dos órgãos através de uma malha de aço estéril fina. As células foram lavadas duas vezes com HBSS, e a concentração de células foi ajustada em RPMI 1640 contendo 10% de soro de vitelo fetal (FCS) , suplementado com 2- meracaptoetanol, L-glutamina, e solução de estreptomicina- penicilina. mAb para citometria de fluxo.
Os seguintes mAbs foram todos adquiridos de PharMingen(San Diego, CA) como anticorpos anti-camundongo de rato: anti-CD44 conjugado com FITC, anti-CD8a conjugado com Cy-Chrome, anti-CD4 conjugado com Cy-Chrome e antilFN- yC conjugado com ficoeritrina (PE). Analise citométrica de fluxo.
Para visualização de células CD8+/CD4+ especificas de LCMV, (produzindo interferon-y) , 1-2 x 106 esplenócitos foram suspensos novamente em 0,2 ml de meio RPMI completo suplementado com 10 unidades de IL-2 recombinante de murino (R&D Systems Europe Ltd;.. Abingdon, RU) , 3 uM monensina (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, MO) e 1 ug/ml de peptideo relevante e incubado por 5 horas a 37 °C. os seguintes peptideos foram utilizados para células CD8+ GP33-41, GP276-86, GP92-101, GP118-125, e NP396-404 para controle; para células T CD4+ GP61-80. Após incubação, as células foram coloridas superficialmente, lavadas, permeabilizadas e coloridas com mAb especifico de IFN-y como descrito anteriormente (Andreasen e outros, 2000; Christensen e outros, 2003) . Anticorpo com isotipo casado serviu como controle para coloração não especifica. As células foram analisadas utilizando um FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) e pelo menos 104 células vivas foram gated utilizando uma combinação de ângulo baixo e dispersão lateral para excluir células mortas e residuos. A análise de dados foi realizada utilizando software Cell-Quest.
Exemplo 2: Ativação de célula T CD8+ aumentada de antigeno ligado por li é independente de li nativo.
A seqüência li contém múltiplas regiões com funções em processamento de antigeno incluindo: um dominio de separação citoplásmica e dominio de trimerização, um dominio de sinalização de membrana próxima e citoplásmica, dominios de trimerização citoplástica, intramembrana e periplasmica o motivo "chave" envolvido em destravar as moléculas MHC para facilitar ligação de peptideos exógenos, ligar motivos para MHC classe I e II na região CLIP, um sitio de glicosilação periplasmica bem como uma região estruturalmente não identificada de interação com CD44 e Fator de inibição de migração de macrófago (MIF) (figura 2) . A ligação li aumenta a apresentação de antigeno tanto em MHC classe I como em classe II. Utilizando Ad-liOVA (OVA é albumina) ou transdução de Ad-OVA de células dendriticas derivadas de medula óssea (BMDC), os requerentes verificaram que ligação li realmente induziu um aumento dramático em apresentação de antigeno restrito a MHC classe I, como medido por coloração direta com um anticorpo dirigido contra o epitopo OVA SIINFEKL apresentado em H-2Kb (figura 3). A expressão de antigeno restrito de MHC classe I aumentada a partir das seqüências ligadas em li trabalha diretamente na APC independente de células T CD4+ de MHC classe II e qualquer outro tipo de célula e pode ser diretamente medida em culturas de célula dendritica. Li eia cis
Para estabelecer se li trabalha somente em cis ou também em trans, um quadro de leitura adicional no vetor adenoviral foi estabelecido por sintetizar um promotor de fosfoglicerato cinase (pGK) com um sinal de poliadenilação de β-globina e a clonagem disso na região E3 da espinha dorsal adenoviral. Esse vetor pode ser então utilizado para recombinação com o vetor secundário utilizado para criar o vetor Ad-GP (que expressa LCMV GP a partir do quadro de leitura El sob controle do promotor CMV humano e poliA SV40). O vetor novo expressa LCMV GP a partir da região El adenoviral e li da região E3 (Ad-li+GP) . O promotor foi verificado para a indução de células fluorescentes verdes por transfecção em células COS7, e uma medição de expressão de mRNA li células COS7 infectadas com Ad-li+GP e Ad-liGP confirma que li é pelo menos tão eficientemente expresso a partir do promotor pGK como do promotor CMV (figura 4A). a comparação das células TCR318 estimulada com BMDC infectada com Ad-GP, Ad-liGP e Ad-li+GP mostra claramente que li deve ser ligado ao antigeno para ter algum efeito (figura 4B) . Teria sido surpreendente se a expressão de li em trans tivesse mostrado eficácia como as culturas de BMDC utilizadas para a estimulação já expressam li.
Alterações de N-terminal:
Iniciando a partir do terminal-N, os requerentes fizeram 1) uma deleção dos 17 primeiros aminoácidos (Ad- Δ17HGP) que remover os sinais de separação endossomal baseados em Leucina, 2) uma substituição da primeira metade do segmento de transmembrana (Ad-liL TMGP), com o segmento correspondente do receptor de quimiocine CCR6 TM6, 3) uma substituição da segunda metade do segmento de transmembrana com o segmento CCRβ TM6 correspondente (Ad-liUTMGP), e finalmente 4) deleção completa dos 50 primeiros aminoácidos (Ad-Δ501iGP). A deleção mencionada por último removeu o citosólico inteiro, TM e região proximal de membrana. Nenhuma dessas mutações teve nenhum efeito sobre a capacidade da seqüência li restante aumentar a estimulação de células T CD8t (figura 5).
Alterações de C-terminal: A partir da extremidade C os requerentes fizeram deleções do último 14 aa (Ad-lil-201GP, isso remove o sinal de glicosilação de terminal-C), o último 97 aa (Ad-lil- 118GP) e o último 110 aa (Ad-lil-105GP) . Nenhum efeito sobre a capacidade da seqüência de li restante aumentar a estimulação de células T CD8+ foi observado pelo 1-201, ao passo que somente tendências incompatíveis e menores de reduções puderam ser vistas a partir da mutação 1-105 e das mutações 1-118 (figura 6). Mutações:
Os requerentes também tentaram fazer mutações de ponto no sitio de ligação de MHC classe I relatado da região CLIP (Ad-liCLIPGP: um M duplo para mutação de ponto A - M91A M99A - projetado para abolir interação li com moléculas de MHC classe I), e o motivo KEY (Ad-liKEYGP: uma mutação de ponto quádruplo AAAA que destruiria o segmento de li-Key). Nenhuma dessas mutações eram key para a estimulação intensificada mediada por li de células T CD8+. Os únicos dados interessantes vieram quando os requerentes combinaram truncamentos de terminal C e N. desse modo quando os requerentes testaram uma variante de 51-118 (Ad- 1Í51-118GP), uma redução acentuada na capacidade estimuladora de células T CD8+ foi observada, porém o mutante era ainda superior ao Ad-GP (figura 7).
Exemplo 3
Em uma modalidade da invenção, uma glicosiltransferase não humana combinada com proteinas de ligação de glicosila acopladas a li é fornecida. Li pode ser em comprimento total ou uma variante, em que a variante pode ser uma versão truncada de li compreendendo residuos números 50 a 215. Essa variante tem atividade total apesar da falta de um dominio de transmembrana. Opcionalmente, um adjuvante ou um ou mais dominio de translocação pode ser adicionalmente fornecido. Na figura 15 é fornecido um desenho esquemático de uma modalidade em que o receptor de Manose (uma lectina dependente de cálcio frequentemente alvejada em vacinas) é acoplado a uma variante de cadeia invariante compreendendo residuos 50 a 215 (1Í50-215), adicionalmente acoplada a uma proteina de fibra adenoviral. A proteina de fibra adenoviral (fibra Ad) pode originar de qualquer sorotipo de adenovirus. O receptor de manose pode ser um ou mais dominios do receptor de Manose.
Em um exemplo especifico, um adenovirus expressando Egghead (uma proteina de Drosófila) em um quadro de leitura, e expressando o receptor de Manose (ou dominios do receptor de Manose) acoplado a uma variante de li tendo atividade total sem uma região de transmembrana como a variante 1Í50-215 adicionalmente acoplada a e proteina de fibra adenoviral em outro quadro de leitura é fornecido.
A glicosiltransferase como Egghead e as proteinas de ligação de glicosila como receptor de Manose podem ser expressos de quadros de leitura diferentes no mesmo vetor Adenoviral, ou a glicosiltransferase como Egghead e as proteinas de ligação de glicosil como receptor de Manose podem ser expressas de vetores Adenovirais diferentes administrados simultaneamente.
Egghead acopla Manose em todas as proteinas ER (reticulo endoplasmático) glicosiladas. A manosilação de proteinas secretadas pode causar desse modo a ligação de proteina manosilada ao complexo de fibra Ad-li-receptor de Manose (como mostrado na figura 15) . A fibra adenoviral do complexo faz com que as proteinas secretadas ligadas ao complexo sejam absorvidas por outras células, ativando essas a se tornarem imune-estimulantes e fornecendo acesso do complexo ao citosol onde li pode exercer seus efeitos.
Essa tecnologia pode ser utilizada para construir uma vacina que pode ser administrada diretamente em, por exemplo, cânceres. Lista de Referências Andreasen, S. O., Christensen, J. E., Marker, O. & Thomsen, A. R. (2000) . Role of CD40 ligand and CD28 in induction and maintenance of antiviral CD8+ effector T cell responses. J Immunol 164, 3689-3697. Bartholdy, C., Stryhn, A., Hansen, N. J., Buus, S. & Thomsen, A. R. (2003). Incomplete effector/memory differentiation of antigen-primed CD8+ T cells in gene gun DNA-vaccinated mice. Eur J Immunol 33, 1941-1948. Battegay,M., Cooper,S., Althage,A., Banziger,J., Hengartner, H. , e Zinkernagel,R.M. (1991). Quantification of lymphocytic choriomeningitis virus with an immunological focus assay in 24- or 96-well plates. J.Virol.Methods 33:191-198. Becker,T.C., Noel,R.J., Coats,W.S., Gomez-Foix,A.M., Alam,T., Gerard,R.D., e Newgard,C.B. (1994). Use of recombinant adenovirus for metabolic engineering of mammalian cells. Methods Cell Biol. 43 Pt A:161-189. Christensen, J. P., Marker, 0. & Thomsen, A. R. (1994). The role of CD4+ T cells in cell-mediated immunity to LCMV: studies in MHC class I and class II deficient mice. Scand J Immunol 40, 373-382. Christensen, J. P., Kauffmann, S. 0. & Thomsen, A. R. (2003) . Deficient CD4+ T cell priming and regression of CD8+ T cell functionality in virus-infected mice lacking a normal B cell compartment. J Immunol 171, 4733-4741. Diebold, S. S., M. Cotten, N. Koch, and M. Zenke. (2001). MHC class II presentation of endogenously expressed antigens by transfected dendritic cells. Gene Ther. 8:487- 493. Holmes JP, Benavides LC, Gates JD, Carmichael MG, Hueman MT, Mittendorf EA, Murray JL, Amin A, Craig D, von Hofe E, Ponniah S, Peoples GE. (2008). Results of the first phase I clinical trial of the novel Il-key hybrid preventive HER-2/neu peptide (AE37) vaccine. J Clin Oncol. Jul 10;26 (20) :3426-33. Holst, P. J., Sorensen, M. R., Mandrup Jensen, C. M., Orskov, C., Thomsen, A. R. & Christensen, J. P. (2008). MHC Class Il-Associated Invariant Chain Linkage of Antigen Dramatically Improves Cell-Mediated Immunity Induced by Adenovirus Vaccines. J Immunol 180, 3339-3346. Kallinteris NL, Lu X, Blackwell CE, von Hofe E, Humphreys RE, Xu M. (2006) . Ii-Key/MHC class II epitope hybrids: a strategy that enhances MHC class II epitope loading to create more potent peptide vaccines. Expert Opin. Biol. Ther. 6 (12):1311-1321. Morris, C. R. , A. J. Reber, J. L. Petersen, S. E. Vargas, and J. C. Solheim. (2004). Association of intracellular proteins with folded major histocompatibility complex class I molecules. Immunol.Res. 30:171-179. Pieters, J. (1997). MHC class II restricted antigen presentation. Curr.Opin.Immunol. 9:89-96. Sambrook e outros, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2a edição, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Strumptner-Cuvelette, P., e P. Benaroch. (2002). Multiple roles of the invariant chain in MHC class II function. Biochem. Biophys. Acta., 1542:1-13. WO 2007/062656 US 2008/0095798 WO 2003/089471 US 5,554,372 US 5,876,735 US 5,102,985

Claims (6)

1. Constructo de ácido nucleico caracterizado pelo fato de compreender sequências que codificam a. Pelo menos uma cadeia invariante ou variante da mesma operativamente ligada a b. Pelo menos uma proteína ou peptídeo antigênico ou um fragmento antigênico da referida proteína ou peptídeo, em que a sequência de ácido nucleico da pelo menos uma cadeia invariante ou variante compreende sozinha os nucleotídeos 1 a 327 da SEQ ID NO: 1, na ausência dos nucleotídeos 328 a 339 ou degenerados da mesma que codificam os aminoácidos 1 a 76 da SEQ ID NO: 2, mas na ausência dos aminoácidos 77 a 80.
2. Constructo de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína ou peptídeo antigênico ou um fragmento antigênico da referida proteína ou peptídeo de um organismo patogênico é selecionado do grupo de patógenos que compreendem: vírus, micro-organismos e parasitas.
3. Constructo de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma proteína ou peptídeo antigênico ou um fragmento antigênico da referida proteína ou peptídeo é de um polipeptídio específico de câncer.
4. Constructo de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ligante operativo entre a pelo menos uma cadeia invariante ou variante e a proteína ou peptídeo antigênica ou um fragmento antigênica da proteína ou peptideo é uma ligação direta.
5. Constructo de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ligante operativo entre a pelo menos uma cadeia invariante ou variante e a proteína ou peptídeo antigênica ou um fragmento antigênica da proteína ou peptídeo é uma região espaçadora.
6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um constructo de ácido nucléico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para uso como medicamento.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2552842T3 (es) 2007-02-19 2015-12-02 Marine Polymer Technologies, Inc. Composiciones hemostáticas y regímenes terapéuticos
US9061066B2 (en) * 2010-06-04 2015-06-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Immunoadjuvant compounds and uses thereof
GB201115095D0 (en) 2011-09-01 2011-10-19 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting nucleosomes containing nucleotides
EP2766385A2 (en) * 2011-10-12 2014-08-20 Novartis AG Cmv antigens and uses thereof
JP6263474B2 (ja) 2011-12-07 2018-01-17 シンガポール ボリション ピーティーイー リミテッド ヌクレオソームアダクト検出法
AU2013295647B2 (en) * 2012-07-26 2018-02-08 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Multimeric fusion protein vaccine and immunotherapeutic
US9522876B2 (en) 2013-03-15 2016-12-20 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
US10576143B2 (en) 2013-03-15 2020-03-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Poxviral vaccines
AU2014310933B2 (en) 2013-08-21 2020-05-14 CureVac SE Method for increasing expression of RNA-encoded proteins
GB201321384D0 (en) * 2013-12-04 2014-01-15 Isis Innovation Molecular adjuvant
SG11201605260VA (en) * 2013-12-27 2016-07-28 Zymeworks Inc Var2csa-drug conjugates
ES2916722T3 (es) 2013-12-27 2022-07-05 Zymeworks Inc Sistemas de enlace que contienen sulfonamida para conjugados de fármacos
EP3194421B1 (en) 2014-09-17 2021-11-03 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
WO2017025782A1 (en) 2014-09-17 2017-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Improved poxviral vaccines
AU2016339924B2 (en) 2015-10-12 2020-01-02 Nantomics, Llc Compositions and methods for viral cancer neoepitopes
KR102883915B1 (ko) 2015-12-16 2025-11-18 시애틀 프로젝트 코포레이션 신생항원 동정, 제조, 및 용도
EP3504230A1 (en) * 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
EP3518966A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
US10517958B2 (en) 2016-10-04 2019-12-31 Zymeworks Inc. Compositions and methods for the treatment of platinum-drug resistant cancer
GB201620968D0 (en) 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
GB201704417D0 (en) * 2017-03-20 2017-05-03 Univ Copenhagen Improved li vaccine adjuvant
BR112020000581A2 (pt) * 2017-07-12 2020-07-14 Nouscom Ag polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, coleção de um ou mais vetores de expressão, composição compreendendo uma vacina e kit de vacinação
WO2019075112A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Gritstone Oncology, Inc. IDENTIFICATION OF NEO-ANTIGENS USING HOT POINTS
EP3703744A1 (en) * 2017-11-03 2020-09-09 Nouscom AG Vaccine t cell enhancer
KR20260008173A (ko) 2017-11-22 2026-01-15 시애틀 프로젝트 코포레이션 신생항원에 대한 접합 에피토프 제시 감소
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
CN108285885A (zh) * 2017-12-28 2018-07-17 中国农业大学 一种霍乱弧菌菌影制备方法及其在家禽疫苗中的应用
CN112638936A (zh) 2018-06-12 2021-04-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 腺病毒多核苷酸和多肽
BR112021003499A2 (pt) * 2018-10-19 2021-05-18 Nouscom Ag polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, coleção de dois ou mais vetores, composição farmacêutica e kit
EP3897846A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of inducing an immune response
RU2725493C2 (ru) * 2018-12-28 2020-07-02 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Система для стабильной экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов на основе лентивирусного вектора
CN113573730A (zh) 2019-03-05 2021-10-29 葛兰素史密斯克莱生物公司 乙型肝炎免疫方案和组合物
CN111729093B (zh) * 2020-06-29 2022-05-24 南京超维景生物科技有限公司 一种造影剂成膜剂组合物、造影剂成膜脂液、造影剂及其制备方法
EP4137153A1 (en) 2021-08-18 2023-02-22 Sirion Biotech GmbH Therapeutic papilloma virus vaccines
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US587673A (en) 1897-08-03 higgins
US58767A (en) 1866-10-16 John brougjbton
US5554372A (en) 1986-09-22 1996-09-10 Emory University Methods and vaccines comprising surface-active copolymers
JP2682061B2 (ja) 1988-10-07 1997-11-26 藤沢薬品工業株式会社 ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法
US5559028A (en) * 1993-05-19 1996-09-24 Antigen Express, Inc. Methods of enhancing or antigen presentation to T cells inhibiting
US5876735A (en) 1994-04-22 1999-03-02 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
US6245904B1 (en) * 1995-09-14 2001-06-12 The University Of Tubingen Recombinant polypeptide based on the primary sequence of the invariant chain with at least one primary sequence of a specific T-cell epitope or a protein derivative and nucleic acids coding for this recombinant polypeptide
AU3307497A (en) * 1996-06-26 1998-01-14 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
US6534482B1 (en) * 1998-05-13 2003-03-18 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US6432409B1 (en) * 1999-09-14 2002-08-13 Antigen Express, Inc. Hybrid peptides modulate the immune response
US20030235594A1 (en) * 1999-09-14 2003-12-25 Antigen Express, Inc. Ii-Key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
GB0208817D0 (en) 2002-04-17 2002-05-29 European Molecular Biology Lab Embl Method for producing monoclonal antibodies
US7179645B2 (en) * 2002-09-24 2007-02-20 Antigen Express, Inc. Ii-Key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
EP1957528B1 (en) * 2005-11-30 2012-11-07 University of Copenhagen A nucleotide vaccine
US20080095798A1 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 Robert Humphreys Ii-key enhanced vaccine potency
US9085638B2 (en) * 2007-03-07 2015-07-21 The Johns Hopkins University DNA vaccine enhancement with MHC class II activators
WO2010027973A1 (en) * 2008-09-02 2010-03-11 Antigen Express, Inc. Human papillomavirus / li-key hybrids and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
IL233176A0 (en) 2014-07-31
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BRPI0921927B8 (pt) 2021-08-31
IL233175A0 (en) 2014-07-31
CA2743229A1 (en) 2010-05-27
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JP2017131220A (ja) 2017-08-03
JP2019146588A (ja) 2019-09-05

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Morein et al. Immunomodulation by iscoms, immune stimulating complexes
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