ES2552842T3

ES2552842T3 - Composiciones hemostáticas y regímenes terapéuticos

Info

Publication number: ES2552842T3
Application number: ES08725771.3T
Authority: ES
Inventors: Sergio Finkielsztein; John N. Vournakis
Original assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Current assignee: Marine Polymer Technologies Inc
Priority date: 2007-02-19
Filing date: 2008-02-19
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2028-02-19
Also published as: EP2478922A1; ES2918452T3; JP2016165476A; HK1223045A1; DK2121048T3; US9139663B2; US20160193379A1; EP3000487B8; IL220618B; EP2121048B1; JP2010518917A; AU2008219065B2; US8871247B2; US20140051849A1; HK1137370A1; JP2014237031A; EP2121048B9; WO2008103345A3; JP6407911B2; ES2552842T9

Abstract

Una composición de poli-ß-1→ 4-N-acetilglucosamina que comprende fibras de poli-ß-1→ 4-N-acetilglucosamina, en donde (i) la mayoría de las fibras irradiadas tienen menos de aproximadamente 15 μm de longitud, y (ii) la composición (a) aumenta la tasa metabólica de células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano privadas de suero en un análisis con MTT y/o no libra de la apoptosis a las células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusión de azul de tripano, y (b) no es reactiva cuando se ensaya en una prueba de implantación intramuscular.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones hemostaticas y regfmenes terapeuticos

1. Campo

La solicitud se refiere en general al campo de la hemostasia, incluidos los metodos, composiciones y dispositivos que pueden emplearse para conseguir hemostasia a una tasa mayor o en un penodo reducido. Mas espedficamente, la solicitud describe composiciones hemostaticas que pueden aplicarse a las heridas y regfmenes terapeuticos para el tratamiento de heridas. Las composiciones hemostaticas pueden comprender uno o mas polfmeros o fibras biocompatibles, tales como vendajes de poli p-1^4-N-acetilglucosamina. Opcionalmente, los vendajes de poli p-1^4-N-acetilglucosamina comprenden poli p-1^4-N-acetilglucosamina irradiada de peso molecular y longitud reducidos.

2. Antecedentes

La curacion de heridas, o reparacion de heridas, es el proceso natural de regeneracion del tejido dermico y epidermico del cuerpo. Despues de producirse una herida, tiene lugar una serie de episodios bioqmmicos complejos en cascada estrechamente organizada para reparar el dano. Estos episodios se solapan en el tiempo y pueden clasificarse artificialmente en etapas independientes: las fases inflamatoria, proliferativa, de maduracion y de remodelacion. En la fase inflamatoria, las bacterias y desechos son fagocitados y eliminados, y se liberan factores que causan la migracion y la division de las celulas que participan en la fase proliferativa. La fase proliferativa se caracteriza por la angiogenia (formacion de nuevos vasos sangumeos a partir de celulas endoteliales), fibroplasia, deposicion de colageno, formacion de tejido de granulacion, epitelizacion y contraccion de la herida. En la fase de maduracion y remodelacion, el colageno se remodela y realinea a lo largo de lmeas de tension y las celulas que ya no son necesarias se eliminan por apoptosis.

Hay dos tipos de heridas, abiertas y cerradas. Las heridas abiertas se clasifican segun el objeto que causo la herida. Por ejemplo, incisiones o heridas incisas (incluidas las heridas quirurgicas) son causadas por un objeto limpio, de bordes afilados tal como un cuchillo, una navaja o una esquirla de vidrio. Las laceraciones son heridas irregulares causados por un impacto contundente a tejido blando que se encuentra sobre tejido duro {p. ej., laceracion del la piel que cubre el craneo) o desgarro de la piel y otros tejidos tal como causada por el parto. Las abrasiones o rasgunos son heridas superficiales en las que se raspa la capa superior de la piel (la epidermis). Las heridas punzantes son causadas por un objeto punzante a la piel, tal como un clavo o aguja. Las heridas penetrantes son causadas por un objeto, tal como un cuchillo al introducirse en el cuerpo. Heridas de bala son causados por una bala o proyectil similar que se dirige (p. ej., herida de entrada) y/o a traves del cuerpo (p. ej., herida de salida). En un contexto medico, todas las heridas de arma blanca y heridas de bala se consideran heridas importantes. Las heridas abiertas tambien incluyen heridas de quemaduras producidas por lesion termica, qmmica o electrica.

Las heridas cerradas incluyen las contusiones (mas frecuentemente conocidas como un moreton, causadas por traumatismo por fuerza contundente que dana el tejido bajo la piel), hematoma (denominado tambien tumor sangumeo, causado por el dano a un vaso sangumeo que a su vez hace que la sangre se recoja bajo la piel), y lesiones por aplastamiento (causada por una gran o extrema cantidad de fuerza aplicada durante un largo penodo).

Las heridas cronicas son heridas que no han podido proceder mediante una serie ordenada y oportuna de episodios a producir un cierre estructural, funcional y estetico duradero. Muchas heridas cronicas son heridas o ulceras cutaneas, causadas por factores tales como la diabetes, la estasis venosa, la insuficiencia arterial, o la presion. Determinadas heridas cutaneas son las heridas por quemaduras, producidas por lesiones termicas, qmmicas o electricas. Las heridas cronicas son origen de dolor y sufrimiento significativos. Si se deja sin tratamiento pueden causar complicaciones que ponen en riesgo la vida, reducir la tasa de recuperacion o empeorar otros estados de salud. El tratamiento intensivo y eficaz puede ayudar a restaurar la integridad de la piel, y evitar problemas de salud no deseados. Mientras que estas heridas son infligidos por diferentes causas, el proceso de cicatrizacion de heridas y las estrategias de tratamiento de heridas son similares en muchos aspectos.

Las escaras de decubito son un tipo de ulceras de decubito que pueden reducir de manera significativa la calidad de vida y afectar negativamente el pronostico general. Las escaras de decubito son areas localizadas de lesiones en la piel que se desarrollan cuando el tejido blando es comprimido entre una prominencia osea y una superficie dura durante un tiempo prolongado. Las escaras de decubito generalmente se desarrollan al estar echado o sentado durante un penodo prolongado sin cambiar la postura del cuerpo. Para los que estan postrados en cama, las escaras de decubito son mas propensas a formarse en o alrededor de los talones, el hueso de la cadera y la parte inferior de la espalda o coxis. Las ulceras de decubito tambien pueden desarrollarse en varias otras areas, incluidas la columna vertebral, los tobillos, las rodillas, los hombros y la cabeza, dependiendo de la posicion del paciente. Si se dejan sin tratamiento, las escaras de decubito puede degenerar en la etapa de descomposicion de tejido epitelial, con inflamacion, infeccion bacteriana y otras complicaciones graves. La respuesta del cuerpo a la infeccion a menudo produce fiebre, escalofnos, cambios en el estado mental, pulso rapido yfrecuencia respiratoria.

Los vendajes temporales, incluidos los vendajes temporales interactivos, estan destinados a proporcionar cuidados de apoyo hasta que pueda conseguirse el cierre definitivo. Cabe esperar que los vendajes temporales funcionen

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como barrera, al igual que la piel humana. Los vendajes para heridas disponibles son eficaces hasta determinado punto, pero adolecen de importantes deficiencias, tales como la alta frecuencia de cambios de vendaje, el secado de la herida o la adherencia del vendaje, los altos costes de tratamiento, el desarrollo de una reaccion al cuerpo extrano, y una baja tasa de mejora, especialmente en pacientes de edad avanzada. La reaccion al cuerpo extrano comienza como cicatrizacion de heridas, incluidas la acumulacion de exudado en el sitio de la lesion, la infiltracion de celulas inflamatorias para desbridar la zona, y la formacion de tejido de granulacion. Sin embargo, la presencia persistente de un cuerpo extrano puede inhibir la curacion completa. En lugar de la reabsorcion y la reconstruccion que se produce en la cicatrizacion de heridas, la reaccion al cuerpo extrano se caracteriza por la formacion de celulas gigantes en el cuerpo extrano, encapsulacion del objeto extrano e inflamacion cronica. La encapsulacion se refiere a la firme, capa de colageno generalmente avascular depositada alrededor de un cuerpo extrano, aislandolo eficazmente de los tejidos del huesped. Esta respuesta se desarrollo como una medida de proteccion. La reaccion al cuerpo extrano puede conducir a dolor cronico.

El tiempo de curacion de una herida cronica puede variar desde unas pocas semanas a un ano, dependiendo del tamano y el tipo de herida. El tratamiento de heridas conlleva muchos costes directos e indirectos. Segun el International Commitee on Wound Management (ICWM), los vendajes para heridas comprenden solo el 10 por ciento al 15 por ciento del coste de tratamiento directo total (International Commitee on Wound Management, 1994, Wounds 6 (3):94-100).En cambio, un porcentaje significativo del costo total se atribuye en cuidar de proveer de salarios y gastos de personal (International Commitee on Wound Management, 1994, Wounds 6 (3):94-100).

Hay necesidad en la tecnica de vendajes para heridas que no provocan reacciones al cuerpo extrano o lo hacen en una tasa menor que los vendajes tradicionales. Dichos vendajes para heridas necesitanan ser cambiados con menos frecuencia y reducir el tiempo de curacion para cerrar, y por lo tanto puede traducirse en un tratamiento mas eficaz para el paciente y un menor costo de atencion.

3. Compendio

La aplicacion se basa, en parte, en el descubrimiento de los inventores de la mejora de la cicatrizacion de heridas y la menor necesidad de cambios de vendaje para heridas cuando se administra a las heridas poli-p-1 —^4-N- acetilglucosamina ("pGlcNAc" o "NAG") en un modelo de raton diabetico. Estos estudios indican que pGlcNAc puede utilizarse ventajosamente como un vendaje para las heridas sin necesidad de los cambios frecuentes de los vendajes que requieren otros vendajes que se estan utilizando actualmente. Otros polfmeros o fibras con caractensticas similares a pGlcNAc tambien se pueden utilizar de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria.

Las caractensticas de la mejora de la curacion de heridas de pGlcNAc junto con la menor necesidad de cambios de vendaje con pGlcNAc son especialmente pronunciadas cuando se irradia pGlcNAc para reducir su peso molecular y longitud. Los inventores han descubierto que la irradiacion reduce el peso molecular y la longitud de pGlcNAc sin afectar la microestructura de las fibras, de manera que el espectro infrarrojo de la pGlcNAc irradiada es sustancialmente similar o equivalente al de la pGlcNAc no irradiada.

Esta pGlcNAc de peso molecular reducido, denominada en la presente memoria "sNAG" (para abreviar N-acetil- glucosamina), presenta una actividad mejorada al activar la cicatrizacion de heridas y sin reaccion detectable de cuerpos extranos en los animales tratados. Por lo tanto, este polfmero o fibra es particularmente util para el tratamiento de heridas con una eficacia mayor y coste reducido.

Por consiguiente, en la presente memoria se describen metodos para el tratamiento de una herida en un paciente, preferiblemente un ser humano, comprendiendo dicho metodo la aplicacion topica de un vendaje a una herida en el paciente, tratando de este modo la herida en el paciente. Preferiblemente, la aplicacion se repite cada 3 a 35 dfas (una mejora significativa sobre los metodos que se utilizan actualmente en la clmica, en los que la aplicacion se repite cada 2 dfas). Los materiales de vendaje son preferiblemente polfmeros o fibras, tal como se describe en el apartado 5.2 a continuacion. Preferiblemente, los polfmeros o fibras son irradiados para mejorar su eficacia, como se describe en el apartado 5.3 a continuacion. Preferiblemente, el vendaje es un vendaje de poli-p-1—4-N- acetilglucosamina biocompatible y/o inmunoneutra o un derivado de la misma, tal como se describe en el apartado

5.2.1 a continuacion. Frecuencias alternativas de cambios o reaplicaciones de vendajes se describen en el apartado 5.4 a continuacion.

La invencion se refiere a una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina que comprende fibras de poli-p-1—4- N-acetilglucosamina, en donde (i) la mayona de las fibras tienen una longitud menor de aproximadamente 15 pm, en donde las fibras se han irradiado para reducir su longitud, y (ii) la composicion (a) aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en un analisis con MTT y/o no libra de la apoptosis a las celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en una prueba de exclusion con azul de tripano, y (b) no es reactivo cuando se ensaya en una prueba de implantacion intramuscular. En determinadas realizaciones, la composicion aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en un analisis con MTT y no libra de la apoptosis a las celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano. En una realizacion, la mayona de las fibras tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras. En una

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realizacion, la mayona de las fibras tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 pm. En una realizacion, al menos el 50% de las fibras tienen aproximadamente 4 pm de longitud. En una realizacion la mayona de las fibras tienen menos de aproximadamente 10 pm de longitud. En una determinada realizacion la mayona de las fibras tienen entre aproximadamente 2 a 15 pm de longitud. En determinadas realizaciones al menos el 70% de monosacaridos de N-acetilglucosamina de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina estan acetilados. En determinadas realizaciones el 100% de monosacaridos de N-acetilglucosamina de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina estan acetilados.

En otro aspecto la invencion se refiere a un metodo para producir una composicion de poli-p-1 —^4-N- acetilglucosamina, dicho metodo comprende la irradiacion de fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina, de tal manera que (i) la mayona de las fibras irradiadas tienen menos de aproximadamente 15 pm de longitud, y (ii) la composicion (a) aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un analisis con MTT y/o no libra de la apoptosis a las celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano, y (b) no es reactiva cuando se ensaya en una prueba de la implantacion intramuscular, produciendo de este modo la composicion de poli-p-1—4-N- acetilglucosamina. En determinadas realizaciones, las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina estan irradiadas en forma de fibras secas, una membrana de fibra seca o un material liofilizado seco. En una realizacion, las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian mediante irradiacion gamma a 500-2.000 kgy. En otras determinadas realizaciones, las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian en forma de fibras mojadas. En una realizacion, las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se formulan en forma de suspension, lechada o torta humeda para irradiacion. En una realizacion, las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian mediante irradiacion gamma a de 100-500 kgy. En una realizacion, una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina puede obtenerse por un metodo segun la invencion.

La invencion se refiere a la composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina segun la invencion para su uso en un metodo para el tratamiento de una herida en un ser humano, en donde el metodo comprende la etapa de preparacion de un vendaje para ser aplicado por via topica a una herida en un ser humano que lo necesita. En una realizacion el metodo comprende la etapa de preparacion de un vendaje para la aplicacion repetida cada 5 a 35 dfas.

En otro aspecto, la invencion se refiere a la composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina segun la invencion para su uso en un metodo para el tratamiento de una herida en un ser humano, que comprende: (a) aplicar por via topica un vendaje a una herida en un ser humano que lo necesita, en donde el vendaje comprende poli-p-1—4-N- acetilglucosamina biocompatible, y (b) repetir dicha aplicacion cada 5 a 35 dfas, tratando de este modo la herida en dicho ser humano, en donde el ser humano es un diabetico, un fumador, un hemofflico, una persona infectada con el VIH, una persona obesa, una persona sometida a radioterapia o una persona con ulcera venosa por estasis. En determinadas realizaciones, el ser humano es una persona con ulcera venosa por estasis. En una realizacion, la herida es una herida cronica. En determinadas realizaciones, la herida cronica es una ulcera diabetica, una ulcera venosa por estasis, una ulcera por insuficiencia arterial o una ulcera de decubito. En una realizacion, la herida cronica es una ulcera venosa por estasis. En otras realizaciones, la herida es una herida quirurgica o una herida por quemadura.

En determinadas realizaciones, el vendaje de la etapa (a) se retira antes de la etapa (b). En otras determinadas realizaciones, el vendaje de la etapa (a) no se retira antes de la etapa (b).

En determinadas realizaciones, la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina es una poli-p-1—4-N-acetilglucosamina de microalgas. En determinadas realizaciones, la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina no es una poli-p-1—4-N- acetilglucosamina de crustaceos.

En determinadas realizaciones, la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina comprende fibras, y en donde las fibras de poli-p- 1—4-N-acetilglucosamina se han irradiado para reducir la longitud.

En determinadas realizaciones, al menos el 75% del vendaje consiste en poli-p-1—4-N-acetilglucosamina . En una realizacion el vendaje comprende la composicion segun la invencion.

En determinadas realizaciones, la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina comprende poli-p-1—4-N-acetilglucosamina desacetilada. En una realizacion, la poli- p-1—4-N-acetilglucosamina desacetilada esta 20-70% desacetilada.

4. Breve descripcion de las figuras

Fig. 1. Analisis del cierre de heridas de heridas tratadas y no tratadas con pGlcNAc. Se tomaron fotograffas estandarizadas el dfa de la herida (dfa 0) y dos veces a la semana durante el seguimiento. La contraccion de la herida (C), la reepitelizacion (E) y la herida abierta (O) se estudiaron como porcentaje del area de la herida original.

Fig. 2. pGlcNAc provoco cierre de la herida mas rapido. (A) La aplicacion del parche de pGlcNAc durante 1 hora provoco reduccion mas rapida de la superficie en bruto. (B) El grupo de 1 h alcanzo el 90% de cierre de la herida mas rapido que el grupo Nt. (C) La reepitelizacion se acentuo despues de 1 h de la aplicacion del parche. (D) El grupo 1 h presentaba reepitelizacion acentuada el 14° dfa. (E) La aplicacion del parche durante 24 h disminuyo la

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contraccion de la herida en comparacion con las heridas no tratadas. Se muestran los valores medios y las desviaciones tipicas. *p <0,01.

Fig. 3. Sistema de estadificacion Wound Watch. (A) Tincion Ki-67: el grupo 1 h presentaba aumento de la proliferacion celular el 10° dfa en comparacion con los demas grupos. (B) Tincion PECAM-1: el grupo 1 h presentaba aumento de la neovascularizacion el 10° dfa en comparacion con los demas grupos. (C) El grafico combina la cuantificacion de los dos marcadores inmunohistoqmmicos, que muestra visualmente la diferencia entre los grupos en el estudio. El grupo 1 h difena drasticamente de ambos grupos de 24 h y NT. Se muestran los valores medios y las desviaciones tfpicas. *p <0,01.

Fig. 4. Efecto de la irradiacion sobre la estructura qmmica y ffsica de las fibras pGlcNAc. (A) Correlacion entre el peso molecular de pGlcNAc y la cantidad de irradiacion. (B) Espectro infrarrojo (IR) de la suspension de pGlcNAc no irradiada (lmea superior), suspension de pGlcNAc irradiada a 100 kGy (lmea inferior), y suspension de pGlcNAc irradiada a 200 kGy (lmea media). (C) Analisis al microscopio electronico de barrido (SEM) de pGlcNAc. (D) Analisis al microscopio electronico de barrido (SEM) de sNAG.

Fig. 5. Analisis de cierre de la herida de heridas tratada y sin tratar de referencia de la membrana de sNAG (pGlcNAc irradiado, veanse los apartados 5.3 y 6.2.1 mas adelante). Las fotograffas estandarizadas se tomaron los dfas 0, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 25, y 28. La contraccion de la herida (C), la reepitelizacion (E) y la herida abierta (O) se estudiaron en un porcentaje del area original de la herida.

Fig. 6-10. Fotograffa macroscopica de una herida de unos ratones tratados con membrana de sNAG y de una herida de una ratones no tratados de referencia el dfa 0 (Fig. 6), 4° (Fig. 7), 10° (Fig. 8), 17° (Fig. 9) y 28° (Fig. 10).

Fig. 11-15. sNAG provoco el cierre de heridas mas rapido. La aplicacion de la membrana de sNAG provoco una reduccion mas rapida de la superficie en bruto (Fig. 1 1). Los ratones tratados con membrana de sNAG consiguieron el 50% (Fig. 12) y 90% (Fig. 13) de cierre de la herida mas rapido que los ratones de referencia no tratados. Los ratones tratados con membrana de sNAG presentaron aumento de reepitelizacion los dfas 4°, 7° y 10° (Fig. 14). Los ratones tratados con membrana de sNAG presentaron mayor contraccion de la herida los dfas 14° y 17° (Fig. 15).

Fig. 16-17. Histologfa del borde de la herida en un raton tratado con membrana de sNAG (Fig. 17) y un raton de referencia no tratado (Fig. 16).

Fig. 18. Tincion Ki-67: los ratones tratados con membrana de sNAG presentaron aumento de la proliferacion celular el 10° dfa en comparacion con los ratones de referencia no tratados.

Fig. 19. Tincion PECAM-1: los ratones tratados con membrana de sNAG presentaron aumento de neovascularizacion el 10° dfa en comparacion con los ratones de referencia no tratados.

Fig. 20. Grado de reepitelizacion de las heridas de los ratones tratados con membrana de sNAG y de los ratones de referencia no tratados medido el 10° dfa.

Fig. 21. Grado de formacion de tejido de granulacion para los ratones tratados con membrana sNAG y los ratones de referencia no tratados medido el 10° dfa.

Fig. 22. Analisis histologico de referencia no tratada comparada con herida tratada con membrana de sNAG el 10° dfa. Observese que no hay una reaccion al cuerpo extrano en los ratones tratados con membrana de sNAG.

Fig. 23. Tincion de colageno de referencia no tratada comparada con herida tratada con membrana de sNAG el 10° dfa. No pueden observarse encapsulaciones del cuerpo extrano en los ratones tratados con membrana de sNAG.

Fig. 24. Celulas endoteliales (CE) de la vena umbilical humana protegidas con pGlcNAc de la muerte celular provocada por la privacion de suero. Para cada penodo (es decir, a las 24, 48 y 72 horas), la identidad de cada una de las cinco barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS), VEGF y pGlcNAc (NAG) a 50, 100 y 250 |jg/ml.

Fig. 25. pGlcNAc no afecto a la tasa metabolica. Para cada periodo (es decir, a las 24 y 48 horas), la identidad de cada una de las cuatro barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS), VEGF y pGlcNAc (NAG) a 50 y 100 jg/ml.

Fig. 26. pGlcNAc aumento la migracion celular.

Fig. 27. pGlcNAc produjo un aumento de migracion hacia la fibronectina. La identidad de cada una de las cinco barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS), VEGF, pGlcNAc (NAG) a 50, 100 y 250 g/ml y NAG/VEGF.

Fig. 28. pGlcNAc aumento la formacion de cordon umbilical.

Fig. 29. Efectores inducidos por pGlcNAc implicados en la motilidad celular (A) El tratamiento con pGlcNAc estimulo

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la expresion de Ets1, metalotionema 2A (MT), Akt3 y Edg3. (B) PCR en tiempo real demuestra que el tratamiento con pGlcNAc produjo aproximadamente el doble de Ets1. (C) El aumento de Ets1 en el mensaje fue acompanado por una mayor expresion de protemas como se muestra en el analisis de inmunotransferencia Western.

Fig. 30. Induccion por pGlcNAc de fosfo-MAPK estaba en funcion de VEGFR2 (A) el tratamientocon pGlcNAc dio lugar a un aumento notable en la fosforilacion de MAPK. (B) La induccion por pGlcNAc de fosforo-MAPK estaba en funcion de VEGFR2.

Fig. 31. pGlcNAc no activo a VEGFR2.

Fig. 32. La migracion inducida por pGlcNAc estaba en funcion de Ets1. (A) La inhibicion de la actividad de Ets1 en CE dio lugar a una notable disminucion en la migracion de CE en respuesta a pGlcNAc. (B) La expresion de la protema Ets1 disminuye con la cantidad de montaje dn-Ets. (C) Los niveles de expresion resultantes de Ets1 en CE se transfectaron con 2 cantidades de ARNi que contiene plasmido dirigido contra Ets1.

Fig. 33. La motilidad celular provocada por pGlcNAc requena integrina. (A) Los resultados cuando se utilizan anticuerpos dirigidos contra integrina aVp3 o a5pi (CD49e) en ensayos de migracion hacia fibronectina (el receptor aVp3). (B) Un experimento similar que en (A) utilizando anticuerpos dirigidos contra aVp3 o aspi (CD49e) en transwells recubiertos con vitronectina.

Fig. 34. Motilidad celular provocada por pGlcNAc y activacion de FAK con intervencion de integrina.

Fig. 35. pGlcNAc puede activar una ruta integrina^-Etsi que conduce a angiogenia en un modelo de curacion para heridas. (A) El bloqueo de anticuerpos de integrina aspi dio lugar a una reduccion en la expresion de Etsi provocada por pGlcNAc. (B) Esta inhibicion de la expresion de Etsi que utiliza un bloqueo de integrina aspi se repite en el ambito de protemas.

Fig. 36. pGlcNAc provoco la expresion de VEGF e IL-i. (A) pGlcNAc aumento la expresion tanto de VEGF como de IL-i.(B) El tratamiento de CE con su inhibidor bloqueo la induccion de VEGF por Etsi pero no tuvo efecto sobre la induccion de Etsi por pGlcNAc.

Fig. 37. sNAG provoco la expresion de FGFi, FGFR3, estabilina, IFNg, ColagenoAi8 y CXCL9.

Fig. 38. sNAG aumento la migracion celular. La identidad de cada una de las cuatro barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS) y sNAG a 50 y i00 pg/ml.

Fig. 39. sNAG provoco notable aumento en la tasa metabolica. La identidad de cada una de los cinco barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS), VEGF y sNAG a 50, i00 y 200 pg/ml.

Fig. 40. sNAG no protegio CE de la muerte celular provocada por la privacion de suero. Para cada periodo (es decir, a las 24 y 48 horas), la identidad de cada una de las cinco barras (de izquierda a derecha) es la siguiente: privacion de suero (SS), VEGF y sNAG a 50, i00 y 200 pg/ml.

Fig. 4i. sNAG provoco la expresion de VEGF e IL-i

5. Descripcion detallada

Los apartados 6.i y 6.2 mas adelante demuestran claramente que la aplicacion de pGlcNAc y, en particular sNAG, a las heridas en un modelo de raton diabetico para la cicatrizacion danada de heridas acorta significativamente el tiempo de cierre de la herida, reepitelizacion de la herida y contraccion de la herida. El tejido de reepitelizacion y de granulacion tambien han aumentado en un tiempo mas corto para ratones tratados con membrana de sNAG. La aplicacion de la membrana de sNAG tambien dio lugar al cierre de todas las heridas en los animales tratados en 28 dfas, en comparacion con 85% en las referencias no tratadas. Los datos inmunohistologicos son coherentes con el aumento de proliferacion celular y la aparicion de nuevos vasos sangumeos (angiogenia) en los ratones tratados con membrana de sNAG. No se observo ninguna respuesta al cuerpo extrano durante todo el estudio en ningun animal tratado con la membrana de sNAG.

Estos hallazgos sugieren que la membrana de pGlcNAc y sNAG tiene aplicaciones clmicas en el tratamiento de heridas cronicas incluidas las ulceras diabeticas, ulceras venosas por estasis, ulceras por insuficiencia arterial y ulceras de decubito. Las membranas de pGlcNAc y sNAG tambien tienen utilidades clmicas en el tratamiento de otras heridas abiertas, tales como, pero no limitadas a, las heridas quirurgicas y heridas por quemaduras.

5.i Lesiones para el tratamiento por los presentes metodos y composiciones

Los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son utiles para el tratamiento de heridas, tales como heridas abiertas causadas por incision (es decir, incision o herida incisa), laceracion, abrasion, puncion, penetracion, por arma de fuego, quemaduras, etc. Los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son particularmente utiles para el tratamiento de heridas cronicas o pacientes que no pueden cicatrizar con normalidad, o de una manera ordenada y oportuna como en otros seres humanos.

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Una herida cronica es una herida que no ha podido proceder a traves de una serie ordenada y oportuna de episodios para producir un cierre estructural, funcional y estetico duradero. Las heridas cronicas pueden ser cualquier herida que no cicatriza adecuadamente, incluidas una herida quirurgica (p. ej., un sitio donante de injerto de piel), una ulcera cutanea (p. ej., una ulcera diabetica, una ulcera venosa por estasis, una ulcera por insuficiencia arterial, o una ulcera de decubito) o una herida por quemadura.

La identificacion del tipo de herida cronica que se esta tratando (p. ej., diabetica, estasis venosa, insuficiencia arterial y de decubito) por lo general se puede determinar considerando los antecedentes del paciente y la realizacion de un examen ffsico. Las herramientas objetivas para confirmar el diagnostico pueden incluir la ecograffa Doppler para cualificar y cuantificar la insuficiencia vascular: arterial o venosa (profundo, superficial o mixto); mediciones transcutaneas de tension de oxfgeno (tcpO2); rndice tobillo/brazo; pruebas de filamento para cuantificar la neuropaffa sensorial; medicion de marcadores de laboratorio para la diabetes mellitus; histopatolog^a de biopsias de ulceras. Ademas, hay criterios ampliamente aceptados utilizados para clasificar las etapas de ulceras (p. ej., National Pressure Ulcer Advisory Panel (NPUAP) for Pressure Ulcers: NPUAP Classification, Wagner's Classification for foot ulcers). Dichos metodos los pone en practica de forma rutinaria el experto en la tecnica.

La identificacion de un paciente que no puede curarse normalmente, o de una manera ordenada y oportuna como en otros seres humanos puede determinarse de forma rutinaria, por ejemplo, teniendo en cuenta los antecedentes del paciente y la realizacion de un examen ffsico. Dichas determinaciones las realiza de forma rutinaria el experto en la tecnica.

5.2 Materiales de composicion hemostatica

Las composiciones hemostaticas se formulan preferiblemente en vendajes para heridas. Los vendajes para heridas pueden estar hechas de cualquier poffmeros o fibras naturales o sinteticas adecuadas. Ejemplos de poffmeros o fibras adecuadas a partir de los cuales se pueden preparar vendajes para la puesta en practica de los metodos y composiciones descritos en la presente memoria incluyen poffmeros de celulosa, xantano, poliaramidas, las poliamidas, poliimidas, poliamida/imidas, pollamidahidrazidas, polihidrazidas, poliimidazoles, polibenzoxazoles, poliester/amida, poliester/imida, policarbonato/amidas, imidas, policarbonato/polisulfona/amidas, polisulfona imidas y similares, copoffmeros y una de sus mezclas. Otras clases adecuadas de poffmeros o fibras incluyen fluoruros de poliviniledeno y poliacrilonitrilos. Ejemplos de estos poffmeros o fibras incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. n° RE 30.351.; n° 4.705.540, n° 4.717.393; n° 4.717.394; n° 4.912.197; n° 4.838.900; n° 4.935.490; n° 4.851.505; n° 4.880.442; n° 4.863.496; n° 4.961.539; y solicitud de patente europea n° 0 219 878.

Los poffmeros o fibras pueden incluir al menos uno de cualquiera de los poffmeros de celulosa, poliamidas, poliaramidas, poliamida/imidas o poliimidas. En determinadas realizaciones, los poffmeros o fibras incluyen poliaramidas, poliester, uretano y politetrafluoroetileno. En realizaciones preferidas, se utilizan fibras de N- acetilglucosamina polimerizada o uno de sus derivados. En una realizacion mas preferida, el poffmero o fibra es poffmero o fibra poli-N-acetilglucosamina o uno de sus derivados. En determinadas realizaciones, el poffmero o fibra poli-N-acetilglucosamina presenta una configuracion p-1^4. En otras realizaciones, el poffmero o fibra poli-N- acetilglucosamina tiene una configuracion a-1^4.

En realizaciones espedficas, el poffmero o fibra es quitina, quitosano, celulosa, nilon o PET (tereftalato de polietileno).

En una realizacion preferida, el poffmero o fibra es biocompatible y/o biodegradable. La biocompatibilidad puede determinarse mediante una variedad de tecnicas, incluidas, pero no limitadas a procedimientos tales como el ensayo de elucion, la implantacion intramuscular o la inyeccion intracutanea o generalizada en animales. Dichas pruebas se describen en la patente de EE.UU. n° 6.686.342. Los poffmeros biodegradables se degradan preferiblemente en aproximadamente 1 dfa, 2 dfas, 5 dfas, 8 dfas, 12 dfas, 17 dfas, 25 dfas, 30 dfas, 35 dfas, 40 dfas, 45 dfas, 50 dfas, 55 dfas, 60 dfas, 65 dfas, 70 dfas, 75 dfas, 80 dfas, 85 dfas, 90 dfas, 95 dfas o 100 dfas despues de la administracion o implantacion en un paciente.

En determinados aspectos, el poffmero o fibra es inmunoneutro, por que no provocan una respuesta inmunitaria.

En general, los poffmeros o fibras no son reactivos en una prueba de implantacion intramuscular. En determinadas realizaciones, las composiciones comprenden fibras como se describe en este apartado, en donde las fibras aumentan la tasa metabolica de celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de MTT y/o no libran de la apoptosis las celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en una prueba de exclusion con azul de tripano, y no es reactivo cuando se prueba en una prueba de implantacion intramuscular. En determinadas realizaciones, las fibras aumentan la tasa metabolica de celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de MTT y no libran de la apoptosis a las celulas endoteliales de vena de cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano, y no es reactivo cuando se prueba en una prueba de implantacion intramuscular.

En una realizacion, las composiciones hemostaticas comprenden poffmeros o fibras purificados, que pueden ser aproximadamente 100%, 99,9%, 99,8%, 99,5%, 99%, 98%, 95%, 90% , 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% o 20% puros. En una realizacion preferida, los poffmeros o fibras utilizados en las composiciones y metodos descritos en la

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presente memoria son 90-100% puros.

En determinadas realizaciones, el poKmero o fibra que se utiliza en un vendaje para heridas no es uno o mas de los siguientes: un hidrogel sintetico ionico tal como, pero no limitado a, poli(acido AAn-acnlico) reticulado y poli(metacrilato de AAm-dimetilaminoetilo), poli(alcohol vimlico) (PVA), poli(etilenglicol) (PEG), poli(N-vinil pirrolidona), poli(metoxi-PEG metacrilato). En determinadas realizaciones, el polfmero o fibra no es uno o mas de los siguientes: un acido poli-L-amino, tal como poli-L-lisina, poli-L-arginina, acido poli-L-glutamico, poli-L-histidina, acido poli-D-glutamico o una de sus mezclas. En determinadas realizaciones, el polfmero o fibra no es uno o mas de los siguientes: un polfmero de alginato, tal como alginato de sodio, alginato de calcio, alginato de estroncio, alginato de bario, alginato de magnesio o cualquier otro alginato o una de sus mezclas. En determinadas realizaciones, el polfmero o fibra no se obtiene de uno o mas de los siguientes: un molusco, un crustaceo, insectos, hongos o levaduras. En determinadas realizaciones, las composiciones no comprenden fibras de colageno. En determinadas realizaciones, las composiciones no comprenden fibras de elastina. En otras realizaciones, estos polfmeros o fibras estan incluidos en las composiciones.

Los polfmeros descritos en la presente memoria estan generalmente en forma de fibras que comprenden, polfmeros descritos en la presente memoria. Por lo tanto, los polfmeros descritos en la presente memoria pueden estar en forma de fibras. Las fibras tienen preferiblemente una longitud media de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 micras determinada por microscopia electronica, o cualquier intervalo entre estas (p. ej., 10-150 micras, 20-100 micras o 50-120 micras de promedio). Las fibras son preferiblemente nanofibras, con unas dimensiones promedio de 0,5 a 100 nm de espesor y/o diametro determinado por microscopia electronica. En realizaciones espedficas, las nanofibras son aproximadamente de 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 o 100 nm de espesor y/o diametro de promedio, o cualquier intervalo entre estos (p. ej., 0,5-4 nm, 0,5-5 nm, 1-4 nm, 1-5 nm, 1-10 nm, 2-20 nm, 4-15 nm, 5-15 nm, 4-20 nm, 5-20 nm, 5-50 nm, etc.). En otras realizaciones, las fibras son preferiblemente microfibras, con dimensiones de aproximadamente 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,75, 0,85 y 1 micra de espesor y/o diametro de promedio, o cualquier intervalo entre estos (p. ej., 0,2-0,5 micras, 0,3-0,75 micras, 0,5-1 micras, y asf sucesivamente en adelante). Como se emplea en la presente memoria, el termino "aproximadamente" sena facilmente apreciado por los expertos en la tecnica; generalmente, el termino tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un intervalo de valores 10% mayores que y 10% menores que el valor indicado.

En realizaciones espedficas, la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9% o 100%) de las fibras son menores de aproximadamente 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, o 3 micras de longitud. En realizaciones espedficas, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8% o 99,9% de las fibras son inferiores a aproximadamente 15 micras de longitud. En realizaciones espedficas, todas (100%) las fibras son inferiores a aproximadamente 15 micras de longitud. En realizaciones espedficas, la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, o 100%) de la fibras son aproximadamente de 5, 4, 3, 2 o 1 micras de longitud. En realizaciones espedficas, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, o 99,9% de las fibras son menores de aproximadamente 4 micras de longitud. En realizaciones espedficas, todas (100%) las fibras son aproximadamente de 4 micras de longitud.

Las fibras son preferiblemente de aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 8 o 10 micras de espesor o diametro medio determinado por microscopia electronica, o cualquier intervalo entre estos (p. ej., 0,1-10 micras, 0,5-5 micras o 1-2 micras en promedio). En realizaciones espedficas, la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, o 100%) de la fibras tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras. En realizaciones espedficas, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, o 99,9% de las fibras tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras. En realizaciones espedficas, todas (100%) las fibras tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras.

En determinadas realizaciones, la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, o 100% ) de las fibras son menores de aproximadamente 15 micras de longitud y tienen un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras.

En determinadas realizaciones preferidas, los polfmeros o fibras se formulan como vendajes para heridas, que pueden ser en forma de barreras, membranas o pelfculas. Alternativamente, los polfmeros o fibras se anaden a soportes de vendajes, tales como barreras, membranas o pelfculas. Una barrera, membrana o pelfcula puede suministrarse en una variedad de tamanos tfpicos, que se pueden cortar y dimensionar para la zona que se esta tratando. El soporte puede ser un material de vendaje convencional, tal como una venda o gasa al que se anade o se recubre de un polfmero o fibra, antes de la aplicacion al paciente. Alternativamente, el polfmero o fibra pueden formularse como una barrera, membrana o pelfcula hecha de hilos, microperlas, microesferas o microfibrillas, o la composicion puede formularse como una estera formadora de barrera. Como se ha senalado en la presente memoria, los polfmeros pueden estar presentes en forma de fibras. Como tal, en toda la memoria, ya sea o no mencionado explfcitamente, se entiende que cualquier referencia a realizaciones referentes a los polfmeros descritos en la presente memoria, los polfmeros pueden estar presentes en forma de fibras.

En determinadas realizaciones, al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de un vendaje se compone de uno o mas de los polfmeros enumerados anteriormente.

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En determinados aspectos, un vendaje no contiene un material de vendaje convencional, tal como una gasa o venda. En dichas realizaciones, el propio poKmero se formula como vendaje para heridas.

En una realizacion, las composiciones descritas en la presente memoria comprenden mas de un tipo de poKmero (p. ej., poli-p-1—4-N-acetilglucosamina y celulosa).

En determinados aspectos, el polfmero (p. ej., la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina o uno de sus derivados) es el unico ingrediente activo en un vendaje. En otras realizaciones, el vendaje comprende mas ingredientes activos para favorecer la cicatrizacion de heridas, tales como factores de crecimiento. En realizaciones espedficas, el factor de crecimiento es PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, FGF-1, FGF-2, FGF-5, FGF-7, FGF-10, EGF, TGF-a, (HB-EGF), anfirregulina, epirregulina, betacelulina, neurregulinas, epigen, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, factor de crecimiento de placenta (PLGF), angiopoyetina-1, angiopoyetina-2, IGF-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o protema estimulante de macrofagos (MSP).

Sin embargo, en otros aspectos, un vendaje no comprende una cantidad significativa de material proteico. En realizaciones espedficas, el contenido de protemas de un vendaje no es mayor que 0,1%, 0,5% o 1% en peso. En otras realizaciones, el contenido de protemas de un vendaje es indetectable portincion con Coomassie.

Un vendaje puede contener colageno, aunque en determinados aspectos un vendaje no contiene colageno.

El vendaje tambien puede contener agentes antimicrobianos para prevenir la infeccion de las heridas.

En una realizacion preferida, el cinc tambien se incluye en un vendaje. Ademas de sus propiedades antimicrobianas, el cinc tambien desempena una funcion en la cicatrizacion de heridas (vease Andrews et al., 1999, Adv. Wound Care 12: 137-8). El cinc se anade preferiblemente en forma de sal, tal como oxido de cinc, sulfato de cinc, acetato de cinc o gluconato de cinc.

Este apartado se refiere a las patentes de EE.UU. n° 5.622.834.; n° 5.623.064; n° 5.624.679; n° 5.686.115; n° 5.858.350; n° 6.599.720; n° 6.686.342; y n° 7.115.588 que describen en detalle la estructura del polfmero poli-p- 1—4-N-acetilglucosamina.

En realizaciones preferidas, la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se obtiene por un procedimiento que comprende a) el tratamiento de una microalga que comprende un cuerpo celular y una fibra de polfmero poli-p-1 —»4-N- acetilglucosamina con un agente biologico (tal como fluorhndrico) capaz de separar la fibra de polfmero N- acetilglucosamina procedente del cuerpo celular durante un tiempo suficiente de manera que la fibra de polfmero poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se libera del cuerpo celular; b) segregacion de la fibra de polfmero poli-p-1—4-N- acetilglucosamina del cuerpo celular; y c) eliminacion de los contaminantes de la fibra de polfmero poli-p-1—4-N- acetilglucosamina segregada, de modo que polfmero poli-p-1— 4-N-acetilglucosamina se afsla y purifica.

Tal como se emplea en la presente memoria los derivados de un polfmero poli-p1—4-N-acetilglucosamina incluyen: una forma semicristalina de un polfmero poli-p1—4-N-acetilglucosamina; un polfmero poli-p-1—4-N- acetilglucosamina que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 150.000 monosacaridos de N- acetilglucosamina unidos por enlaces covalentes en una configuracion p-1—4, y dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 30 millones de daltons; un polfmero poli-p-1—4- N-acetilglucosamina que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 50.000 monosacaridos de N- acetilglucosamina unidos por enlaces covalentes en una configuracion p-1—4, y dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 10 millones de daltons; un polfmero poli-p1—4- N-acetilglucosamina comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 monosacaridos de N- acetilglucosamina unidos por enlaces covalentes en una configuracion p-1—4, y dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 2 millones de daltons; un polfmero poli-p1—4-N- acetilglucosamina que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 4.000 monosacaridos de N- acetilglucosamina unidos por enlaces covalentes en una configuracion p-1—4, y dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 800.000 daltons; un polfmero semicristalino poli- p-1—4-N-acetilglucosamina que comprende al menos un monosacarido de N-acetilglucosamina que esta desacetilado, y en donde al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de dichos monosacaridos de N-acetilglucosamina estan acetilados; y un polfmero semicristalino poli-p-1—4-N- acetilglucosamina que comprende al menos un monosacarido de N-acetilglucosamina que esta desacetilado, y en donde al menos los monosacaridos estan desacetilados.

Los derivados de un polfmero poli-p-1—4-N-acetilglucosamina tambien incluyen composiciones que son 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o menos poli-p-1—4-N-acetilglucosamina.

En la composicion descrita en la presente memoria tambien se pueden utilizar otros derivados de poli-p-1—4-N- acetilglucosamina. Por ejemplo, pueden utilizarse los derivados sulfatados de poli-beta-1—4-N-acetilglucosamina, derivados fosforilados de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina o los derivados nitrados de poli-p-1—4-N- acetilglucosamina. Ademas, una o mas de las unidades de monosacarido de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina pueden contener uno o mas grupos sulfonilo uno o mas grupos O-acilo. Ademas, uno o mas de los monosacaridos de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina desacetilada puede contener un grupo N-acilo. Uno o mas de los

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monosacaridos de la poli-p-1^4-N-acetilglucosamina o de su derivado desacetilado, puede contener un grupo O- alquilo. Una o mas de las unidades de monosacarido de la poli-p-1^4-N-acetilglucosamina puede ser un derivado alcalino. Una o mas de las unidades de monosacarido del derivado desacetilado de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina puede contener un grupo N-alquilo. Una o mas de las unidades de monosacarido del derivado desacetilado de poli- p-1^4-N-acetilglucosamina puede contener al menos un derivado desoxihalogenado. Una o mas de las unidades de monosacarido del derivado desacetilado de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina puede formar una sal. Una o mas de las unidades de monosacarido del derivado desacetilado de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina pueden formar un quelato metalico. Preferiblemente, el metal es cinc. Una o mas de las unidades de monosacarido del derivado desacetilado de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina puede contener un grupo N-alquilideno o un N-arilideno. Los metodos de fabricacion de dichos derivados se describen en la patente de EE.UU. n° 5.623.064.

5.3 Irradiacion para reducir el peso molecular y la longitud

Los polfmeros o fibras pueden estar en polfmeros o fibras o membranas de polfmero o de fibra, tanto irradiados como secos, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los polfmeros o fibras pueden irradiarse cuando estan humedos.

En realizaciones preferidas, los polfmeros o fibras se formulan en una suspension/lechada o torta humeda para su irradiacion. La irradiacion puede llevarse a cabo antes, simultaneamente o despues de la formulacion de los polfmeros o fibras en un vendaje. Generalmente, el contenido de polfmero o fibra de suspensiones/lechadas y tortas humedas puede variar, por ejemplo desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 50 mg de polfmero o fibra por ml de agua destilada para lechadas y desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 1.000 mg de polfmero o fibra por ml de agua destilada para formulaciones de torta humeda. El polfmero o fibra pueden liofilizarse en primer lugar, congelarse en nitrogeno lfquido y pulverizarse, para hacerlo mas susceptible a la formacion de una suspension/lechada o torta humeda. Ademas, las suspensiones/lechadas pueden filtrarse para eliminar el agua de tal manera que se forma una torta humeda. En determinados aspectos, el polfmero o fibra se irradia en forma de una suspension que comprende aproximadamente 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 12 mg, 15 mg, 18 mg, 20 mg, 25 mg o 50 mg de polfmero o fibra por ml de agua destilada, o cualquier intervalo entre las realizaciones anteriores (p. ej., 1-10 mg/ml, 5-15 mg/ml, 2-8 mg/ml, 20-50 mg/ml, etc.). En otros aspectos, el polfmero o fibra se irradia en forma de una torta humeda, que comprende aproximadamente 50-1.000 mg de polfmero o fibra por ml de agua destilada. En realizaciones espedficas, la torta humeda comprende aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000 mg de polfmero o fibra por ml de agua destilada, o cualquier intervalo entre (p. ej., 100 -500 mg/ml, 300-600 mg/ml, 50-1000 mg/ml, etc.).

La irradiacion esta preferiblemente en forma de radiacion gamma, radiacion de haz de electrones o rayos x. Se prefieren dos fuentes de irradiacion: nucleidos radiactivos y electricidad. En una realizacion espedfica, los nucleidos radiactivos son el cobalto-60 y cesio-137. Ambos nucleidos emiten rayos gamma, que son fotones que no contienen masa. Los rayos gamma tienen energfas de 0,66 a 1,3 MeV. Utilizando electricidad, los electrones se generan y se aceleran a energfas de hasta 10 MeV o mayores. Cuando se irradian e polfmeros o fibras para reducir su tamano, una consideracion a tener en cuenta es que la profundidad de penetracion de materiales con densidades similares al agua por electrones de 10 MeV se limita a alrededor de 3,7 cm con exposicion en una cara o aproximadamente 8,6 cm con exposicion a dos caras. La profundidad de penetracion disminuye a energfas de electrones inferiores. Energfa de electrones se puede convertir en rayos X colocando un metal (por lo general de tungsteno o tantalo) objetivo en la trayectoria del haz de electrones. Conversion a rayos X esta limitada a electrones con energfas de hasta 5 MeV. Los rayos X son fotones sin masa y pueden penetrar polfmeros o fibras similares a los rayos gamma. Hay solo aproximadamente el 8% de eficiencia en la conversion de energfa de los electrones a la energfa de rayos x. Se necesitan maquinas de haz de electrones de alta potencia en las instalaciones de produccion de rayos x para tener en cuenta la baja eficiencia de conversion.

Preferiblemente, la irradiacion es irradiacion gamma.

La dosis absorbida de radiacion es la energfa absorbida por unidad de peso del producto, medida en gris (gy) o kilogray (kgy). Para los polfmeros o fibras secos, la dosis absorbida preferida es 500-2.000 kgy de radiacion, mas preferiblemente 750-1.250 kgy de radiacion, mientras que para polfmeros o fibras humedas, la dosis absorbida preferida es aproximadamente de 100-500 kgy de radiacion, aun mas preferiblemente de aproximadamente 50-250 kgy de radiacion.

La dosis de radiacion puede describirse desde el punto de vista de su efecto sobre la longitud de los polfmeros o fibras. En realizaciones espedficas, la dosis de radiacion utilizada preferiblemente reduce la longitud del polfmero o fibra en cualquier parte de aproximadamente 10% a 90% de la longitud inicial del polfmero o fibra, respectivamente. En realizaciones espedficas, la longitud media se reduce en aproximadamente un 10%, en aproximadamente un 20%, en aproximadamente un 30%, en aproximadamente un 40%, en aproximadamente un 50%, en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 80%, o en aproximadamente 90%, o cualquier intervalo entre (p. ej., 20-40%, 30-70%, y asf sucesivamente en adelante). Alternativamente, la dosis de radiacion utilizada preferiblemente reduce la longitud del polfmero o de la fibra en cualquier parte de 30 a 100 micras. En realizaciones espedficas, y dependiendo de la longitud de la fibra inicial, la longitud media del polfmero o fibra se reduce a menos de aproximadamente 15 micras, menos de aproximadamente 14 micras, menos

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de aproximadamente 13 micras, menos de aproximadamente 12 micras, menos de aproximadamente 11 micras, menos de aproximadamente 10 micras, menos de aproximadamente 5 micras, menos de aproximadamente 4 micras, menos de aproximadamente 3 micras, menos de 2 micras, o menos de 1 micra. En determinadas realizaciones, la longitud de la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, o 100%) de los polfmeros o fibras se reduce a no mayor de 40 micras, no mayor de aproximadamente 30 micras, no mayor de aproximadamente 20 micras, no mayor de aproximadamente 15 micras, no mayor que aproximadamente 10 micras, o no mayor de aproximadamente 5 micras. Cualquier intervalo entre las longitudes anteriores tambien estan incluidos; por ejemplo, en determinadas realizaciones, la irradiacion de los polfmeros o fibras reduce la longitud de la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% , 99,8%, 99,9% o 100%) de las fibras a cualquier parte entre aproximadamente 1 a 20 micras, entre aproximadamente 2 a 15 micras, entre aproximadamente 4 a 10 micras, y asf sucesivamente en adelante.

La dosis de radiacion puede tambien describirse desde el punto de vista de su efecto sobre el peso molecular del polfmero o fibra. En realizaciones espedficas, la dosis de radiacion utilizada preferiblemente reduce el peso molecular del polfmero o fibra en cualquier parte desde aproximadamente 10% a 90% del peso inicial del polfmero o fibra. En realizaciones espedficas, el peso molecular medio se reduce en aproximadamente un 10%, en aproximadamente un 20%, en aproximadamente un 30%, en aproximadamente un 40%, en aproximadamente un 50%, en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 80%, o en aproximadamente 90%, o cualquier intervalo entre estos (p. ej., 20-40%, 30-70%, y asf sucesivamente en adelante). Alternativamente, la dosis de radiacion utilizada preferiblemente reduce el peso molecular del polfmero o fibra a cualquier parte de 1.000 a 1.000.000 daltons. En realizaciones espedficas, y en funcion del peso molecular inicial, el peso molecular promedio del polfmero o fibra se reduce a menos de 1.000.000 daltons, menos de 750.000 daltons, menos de 500.000 daltons, menos de 300.000 daltons, menos de 200.000 daltons, menos 100.000 daltons, menos de 50.000 daltons, menos de 25.000 daltons, menos de 10.000 daltons, o menos de 5.000 daltons. En determinadas realizaciones, el peso molecular promedio se reduce a no menos de 500 daltons, no menos de 1.000 daltons, no menos de 2.000 daltons, no menos de 3.500 daltons, no menos de 5.000 daltons, no menos de 7.500 daltons, no menos de 10.000 daltons, no menos de 25.000 daltons, no menos de 50.000 daltons o no menos de 100.000 daltons. Cualquier intervalo entre los pesos moleculares medios anteriores esta tambien incluido; por ejemplo, en determinadas realizaciones, la irradiacion del polfmero o fibra reduce el peso molecular medio a cualquier parte entre 10.000 a 100.000 daltons, entre 1.000 y 25.000 daltons, entre 50.000 y 500.000 daltons, y asf sucesivamente en adelante.

En realizaciones preferidas, la irradiacion utilizada es la irradiacion gamma.

Despues de la irradiacion, las lechadas pueden filtrarse y se secarse, y las tortas humedas pueden secarse, para formar vendajes que son utiles en la practica descrita en la presente memoria.

5.3.1 Poli-p-1—4-N-acetilglucosamina acortada ("sNAG")

La poli-p-1—4-N-acetilglucosamina descrita en el apartado 5.2 anterior esta sometida a irradiacion como se describe en el apartado 5.3 anterior para reducir la longitud de sus fibras para formar poli-p-1 —»4 N-acetilglucosamina acortada, y reduciendo asf su peso molecular sin afectar su microestructura. El espectro infrarrojo (IR) de la poli-p- 1—4-N-acetilglucosamina acortada (sNAG) es sustancialmente similar o equivalente al de la poli-p-1—4-N- acetilglucosamina no irradiada (NAG).

En determinadas realizaciones, la mayona (mas del 50%, p. ej., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9% o 100% ) de las fibras de sNAG tiene menos de 15 micras de longitud. En un aspecto, la mayona de las fibras de sNAG tiene un espesor o diametro de aproximadamente 1-2 micras. La longitud de las fibras se puede medir por cualquier metodo conocido para un experto en la tecnica, por ejemplo, por microscopia electronica de barrido (SEM).

En un aspecto, sNAG aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales (CE) de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de MTT. Un ensayo de MTT es un analisis de laboratorio y un ensayo colorimetrico estandar (un ensayo que mide los cambios de color) para medir la proliferacion celular (crecimiento celular). En resumen, el MTT amarillo (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, un tetrazol) se reduce a formazan purpura en las mitocondrias de las celulas vivas. Esta reduccion tiene lugar solo cuando las enzimas reductasa mitocondriales estan activas, y por lo tanto la conversion puede estar directamente relacionada con el numero de celulas viables (vivas). La tasa metabolica de celulas puede determinarse por otras tecnicas comunmente conocidas por el experto en la tecnica.

En otro aspecto, sNAG no libra de la apoptosis de las CE privadas de suero en una prueba de exclusion con azul de tripano. Una prueba de exclusion con azul de tripano es una prueba de exclusion del colorante utilizada para determinar el numero de celulas viables presentes en una suspension celular. Se basa en el principio de que las celulas vivas poseen membranas celulares intactas que excluyen determinados colorantes, tal como el azul de tripano, eosina o propidio, mientras que las celulas muertas no lo hacen. La viabilidad de las celulas puede determinarse mediante otras tecnicas comunmente conocidas por el experto en la tecnica.

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En un aspecto, una prueba de la implantacion intramuscular es una prueba ISO de implantacion intramuscular de 4 semanas de la implantacion, tal como se describe en el apartado 6.4.2 mas adelante.

sNAG (i) comprende fibras, en donde la mayona de las fibras tienen menos de aproximadamente 15 micras de longitud, y (ii) (a) aumenta la tasa metabolica de CE privadas de suero en un ensayo de MTT y/o no libra de la apoptosis de las CE privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano, y (b) no es reactivo cuando se prueba en una prueba de implantacion intramuscular.

5.4 Metodos de utilizacion de las composiciones hemostaticas

En la presente memoria se describen metodos para el tratamiento de una herida en los pacientes. Los metodos comprenden generalmente la aplicacion de un vendaje a una herida en un paciente, en donde el vendaje comprende o consiste en cualquiera de los polfmeros o fibras enumerados en los apartados 5.2 y 5.3 anteriores.

El paciente es preferiblemente un mairnfero, aun mas preferiblemente un ser humano.

En determinadas realizaciones, el paciente es un adulto, un adolescente o un nino. En una realizacion, el paciente es un ser humano mayor de 45 anos de edad . En una realizacion, el paciente es una mujer que no esta embarazada.

En determinadas realizaciones, el marnffero es un mamffero de ganadena (p. ej., una vaca, una oveja o un cerdo) o un animal domestico (p. ej., un gato o un perro).

En determinadas realizaciones, se describen metodos en la presente memoria para el tratamiento de una herida en pacientes que normalmente no se curan de una manera ordenada y oportuna como otros seres humanos. El paciente es preferiblemente un ser humano, tal como un diabetico, un fumador, un hemofflico, una persona infectada con el VIH, una persona obesa, una persona sometida a radioterapia o una persona con ulcera venosa por estasis. En un aspecto, el paciente es una persona con ulcera venosa por estasis. En determinados aspectos, la herida es una herida quirurgica o una quemadura. En determinados otros aspectos, la herida es una herida cronica, como una ulcera diabetica, una ulcera venosa por estasis, una ulcera por insuficiencia arterial o una ulcera de decubito.

En determinadas realizaciones, se describen metodos en la presente memoria para el tratamiento de una herida cronica en pacientes, en donde la herida cronica no se cura de una manera ordenada u oportuna. En determinadas realizaciones, la herida es una herida cronica tal como una ulcera diabetica, una ulcera venosa por estasis, una ulcera por insuficiencia arterial o una ulcera de decubito. En un aspecto, la herida cronica es una ulcera venosa por estasis.

Las composiciones hemostaticas y los metodos descritos en la presente memoria reducen ventajosamente la mano de obra y el coste de la atencion de enfermena relacionados con heridas, especialmente heridas cronicas. Los vendajes disponibles actualmente en el mercado requieren cambios cada dos dfas aproximadamente; por el contrario, en los presentes metodos los vendajes se cambian o se vuelven a aplicar cada 3-35 dfas. En realizaciones espedficas, los vendajes se cambian o se vuelven a aplicar cada 4-35 dfas, cada 5-35 dfas, cada 6-35 dfas o cada 7-35 dfas. En determinado aspecto, los vendajes se cambian o se vuelven a aplicar cada 3-10 dfas, cada 4-14 dfas, cada 5-12 dfas, cada 7-14 dfas, cada 7-28 dfas, cada 7-21 dfas, cada 14-28 dfas, o cualquier intervalo entre 3, 4, 5, 6, o 7 dfas en el extremo inferior de cada 8, 9, 10, 12, 14, 18, 21, 24, 28, 30 o 35 dfas en el extremo superior. En un aspecto, los vendajes para heridas se cambian o se vuelven a aplicar solo una vez al comienzo del tratamiento. En otro aspecto, los vendajes para heridas se cambian o se vuelven a aplicar una vez por semana durante el tratamiento. En otro aspecto, los vendajes para heridas se cambian o se vuelven a aplicar cada dos semanas durante el tratamiento. En otro aspecto, los vendajes se cambian o se vuelven a aplicar cada dos semanas, tres semanas o cuatro semanas durante el tratamiento. Los presentes metodos reducen la frecuencia de los cambios de vendaje de la herida por lo menos el 50%, y pueden reducir la frecuencia de los cambios de vendaje de la herida el 100%, 200%, 500% o incluso mas. La frecuencia espedfica para cambiar o volver a aplicar los vendajes para heridas puede variar dependiendo de las necesidades del individuo; es decir, dependiendo del tamano, la clasificacion y la capacidad de respuesta de la herida al vendaje. La frecuencia puede determinarse mediante tecnicas clmicas tfpicas, y no tiene que ser a intervalos fijos. Mas bien, la frecuencia se puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, a medida que una herida cronica comienza a cicatrizar, la frecuencia de los cambios o reaplicaciones de vendajes para heridas se reduce.

En determinados aspectos, el vendaje para heridas se aplica a la herida, donde puede permanecer hasta que se retira o se biodegrada. Mas preferiblemente, el vendaje de la herida se vuelve a aplicar (sin quitar el vendaje para heridas anterior) o se cambia (retirando el vendaje anterior y aplicando un nuevo vendaje) al menos una vez, pero puede volver a aplicarse o cambiarse a las frecuencias descritas anteriormente mientras dure la herida. Preferiblemente, el vendaje se vuelve a aplicar o se cambia al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces o mas. Los regfmenes terapeuticos se pueden realizar durante un penodo de unas pocas semanas (p. ej., 2-8 semanas) a varios meses (p. ej., a partir de 2-4 meses hasta 6-12 meses o mas, y cualquier intervalo entre estos).

De manera ventajosa, los vendajes tambien reducen el tiempo total de cicatrizacion de la herida. Por ejemplo, en el

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modelo de raton diabetico descrito en el apartado 6 mas adelante, el vendaje de pGIcNAc redujo el tiempo para conseguir el cierre de la herida una semana mas rapido que en los ratones de referencia. Por lo tanto, ademas de reducir el numero de cambios de vendaje para una herida dada, los metodos descritos en la presente memoria son utiles para reducir el tiempo de cierre de la herida. Por consiguiente, en determinados aspectos, se proporcionan metodos para reducir el tiempo de cierre de la herida de una herida cronica, que comprenden la aplicacion topica de un vendaje a una herida cronica en un paciente, en donde el vendaje comprende o se compone de uno o mas de los polfmeros enumerados en los apartados 5.2 y 5.3 anteriormente. Opcionalmente, la aplicacion se repite una o mas veces de acuerdo con los regfmenes terapeuticos descritos en este apartado. En determinados aspectos, el tiempo de cierre de la herida se reduce en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50%.

Mas preferiblemente, el polfmero del que esta hecho un vendaje es un polfmero biocompatible y/o inmunoneutro, incluido, pero no limitado a, poli-p-1^4-N-acetilglucosamina o uno de sus derivados. En una realizacion preferida, la poli-p-1^4-N-acetilglucosamina o uno de sus derivados es un poli-p-1^4-N-acetilglucosamina de microalgas o uno de sus derivados. En determinados aspectos, la poli-p-1^4-N-acetilglucosamina o uno de sus derivados no procede de marisco o crustaceos.

Los metodos mencionados anteriormente pueden utilizarse juntamente con otros procedimientos de asistencia convencionales para las heridas cronicas. Por ejemplo, los metodos se pueden utilizar conjuntamente con uno o mas de los siguientes tratamientos para la terapia de ulceras cutaneas: eliminacion de tejido necrotico o infectado (desbridamiento); descarga; tratamiento de compresion para ulceras venosas por estasis; establecimiento de la circulacion sangumea adecuada; mantenimiento de un ambiente humedo en la herida; tratamiento de la infeccion de la herida; limpieza de la herida; apoyo alimenticio, incluidos el control de la glucemia para pacientes con ulceras diabeticas; el cuidado intestinal y de la vejiga para individuos con ulceras de decubito en situacion de riesgo de contaminacion.

Para las heridas por quemaduras, los procedimientos tfpicos de atencion que pueden utilizarse juntamente con los metodos descritos en la presente memoria incluyen: la reanimacion hemodinamica; tratamiento de comorbilidades; desbridamiento y escision oportunos de quemaduras; cierre de heridas; tratamiento de la infeccion de heridas; control del dolor; apoyo alimenticio; medidas para inhibir la formacion excesiva de cicatrices; y rehabilitacion, incluida la amplitud de movimiento pasivo cuando las quemaduras recubren las articulaciones.

5.5 Kits

Ademas se proporciona un kit que comprende cualquiera de los materiales de vendaje descritos anteriormente. El vendaje esta contenido preferiblemente dentro de un paquete sellado, impermeable, esteril que facilita la eliminacion de la composicion sin contaminacion. Los materiales de los que pueden hacerse los recipientes incluyen papel de aluminio, plastico, u otro material convencional que se esteriliza facilmente. El kit puede contener un unico vendaje o varios vendajes, preferiblemente en donde cada uno se proporciona en un paquete independiente, impermeable y esteril. El vendaje puede comprender ademas agentes de cicatrizacion de heridas o antimicrobianos, como se ha descrito en los apartados 5.2 y 5.3 anteriores.

En otra realizacion, se proporciona un recipiente que tiene dos compartimientos. Un primer compartimiento contiene el vendaje, mientras que el segundo compartimento contiene un agente activo tal como un factor de crecimiento o un agente antimicrobiano. En el campo o la clmica, el vendaje se puede sumergir facilmente en el agente activo aplicado posteriormente a la herida.

Un kit puede comprender una nota relativa a la aprobacion por la FDA y/o instrucciones de uso.

Ademas, un kit disenado para emergencias o uso militar puede contener ademas instrumentos preesterilizados desechables, tales como tijeras, bistun, pinza, torniquete, vendas elasticas o inelasticas, o similares.

6. Ejemplos

6.1 Ejemplo 1. Efectos del parche de poli-N-acetilglucosamina (pGlcNAc) en la cicatrizacion de heridas en raton db/db.

6.1.1 Materiales y Metodos

Preparacion del parche de pGlcNAc. El parche SyvekPatch™ de pGlcNAc (Marine Polymer Technologies, Inc., Danvers, MA) consiste en nanofibras obtenidas de microalgas producidas como se ha descrito previamente (vease Vournakis et al. patentes de EE.UU. n° 5.623.064; y n° 5.624.679, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad). En resumen, se cultivaron microalgas en condiciones de biorreactor unico empleando un medio de crecimiento definido. Despues de la recoleccion de microalgas de cultivos de alta densidad, se aislaron nanofibras mediante un procedimiento de separacion y purificacion paso a paso que produce lotes de nanofibras puras en suspension en agua para inyectables (api). Las fibras se formularon en parches por concentracion y secado en estufa, y se envasaron y se esterilizaron por irradiacion gamma. Dimensiones medias de las nanofibras 20-50 nm x 1-2 nm x ~ 100 pm. Se controlo la calidad de cada uno de los lotes de fibras utilizando

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parametros de analisis qmmicos y ffsicos, y cada lote reuma criterios estrictos de pureza antes de su liberacion. A los lotes finales se les exigfa estar sustancialmente exentos de protemas, iones metalicos y otros componentes.

Modelo de herida y diseno del estudio. Se utilizaron ratones macho Lep/r - db/db (cepa C57BL/KsJ-Leprdb) homocigoticos, geneticamente diabeticos de 8-12 semanas de edad, en virtud de un protocolo animal aprobado en un centro acreditado Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). El dfa antes de la intervencion quirurgica, se les corto el pelo y se les depilo (Nair®, Church & Dwight Co., Princeton, NJ). El dfa de la intervencion quirurgica, los animales se pesaron y anestesiaron con 60 mg/kg de Nembutal (Pentobarbital). Un area de piel dorsal de 1,0 cm2 y pamculo carnoso se extirpo y se fotografiaron las heridas. Las heridas se cubrieron con el parche de pGlcNAc durante 1 hora (grupo 1 h, n = 15), 24 horas (grupo 24 h, n = 15), o se dejaron sin tratar (grupo NT, n = 15). Todas las heridas se cubrieron con vendajes semioclusivos de poliuretano (Tegaderm®, 3M, St. Paul, MN). Los dfas 10° y 21°, 7-8 animales por grupo se sacrificaron y las heridas se fotografiaron, se extirparon y se fijaron en solucion de formalina neutra tamponada al 10%. N = 15 por grupo se observaron desde el 1er dfa al 10°, y n = 7-8 por grupo se observaron desde el 14° dfa al 21° dfa.

Analisis de cierre de la herida. Tres observadores independientes a ciegas compararon fotograffas digitales tomadas dos veces a la semana con fotograffas iniciales en dfa 0 utilizando metodos planimetricos. El cierre de la herida se cuantifico midiendo la contraccion (C), la reepitelizacion (E) y la herida abierta (O) como porcentaje del area de la herida original. La suma de las areas de las heridas contrafdas, reepitelizadas y abiertas es igual al 100% del tamano original de la herida (Fig. 1) (vease Yannas I. Tissue and Organ Regeneration in adults. Nueva York: Springer; 2001).

Se incorporaron en parafina secciones transversales de la herida central, se seccionaron y tineron segun los protocolos de rutina para Hematoxilina y Eosina (H&E). Se prepararon imagenes digitales panoramicas de la seccion transversal de cada herida empleando Adobe Photoshop CS Software (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) con el fin de analizar el area y espesor del tejido de granulacion con planimetna digital (Image J, NIH, Bethesda, MD).

Inmunohistoqmmica. Se rehidrataron secciones incorporadas en parafina y se llevo a cabo la recuperacion de antfgenos para el marcador inmunohistoqmmico de proliferacion Ki-67 mediante microondas en citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) durante diez minutos. Las secciones congeladas se fijaron con acetona y se tineron para el marcador inmunohistoqmmico de vascularizacion la molecula uno de adhesion de celulas endoteliales y plaquetas (PECAM-1). El anticuerpo primario Ki-67 (Lab Vision, Freemont, CA) se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente, mientras que el anticuerpo primario PECAM-1 (Pharmingen, San Jose, CA) se incubo a 4°C durante la noche. La senal de PECAM-1 se intensifico utilizando el sistema de amplificacion de tiramida (Perkin Elmer, Boston, MA).

Cuantificacion de la densidad de vasos sanguneos. Se procesaron previamente imagenes digitales en color de las secciones de la herida antes de la cuantificacion para asegurar el contraste uniforme de las areas positivas de PECAM-1 en relacion con el fondo. Se creo una mascara de tincion positiva utilizando la funcion de mascara de color del programa Corel PhotoPaint v. 10 (Corel Corporation, Ottawa, Ontario, Canada) tomando muestras de cinco tonos de color cromogeno diferentes representados en zonas manchadas positivamente. Las areas de los vasos enmascarados se convirtieron en negro puro mientras que el fondo se volvio blanco puro. Las representaciones en blanco y negro se utilizaron para la zona de cuantificacion en el programa informatico IPLab (BD Biosciences Bioimaging, Rockville, MD) aplicando la funcion de segmentacion. Se definieron regiones tisulares proyectando la imagen H&E original sobre la imagen procesada. La densidad de vasos sangumeos, cuantificados en toda la imagen, se expreso como la relacion del area de los vasos al area total de tejido de granulacion. Se utilizaron entre 4 y 7 campos microscopicos (20x) para evaluar la densidad de vasos para cada herida y modalidad de tratamiento.

Cuantificacion de la proliferacion celular. Se analizo la proliferacion celular en heridas utilizando analisis de imagenes de secciones tenidas con Ki-67 de manera similar al metodo de cuantificacion de la densidad de los vasos. Las imagenes digitales de alta potencia de secciones de heridas tenidas con Ki-67 se utilizaron para medir el numero de celulas positivas a Ki-67 con respecto al numero total de nucleos. El grado de proliferacion se cuantifico en la seccion de la herida completa utilizando 4-6 campos con un aumento 20x y se expreso como una relacion de nucleos proliferantes (positivos a Ki-67) a nucleos totales.

Analisis estadfstico. Los valores se expresaron en medias ± desviacion tfpica en el texto y figuras. El analisis de una via de la variancia y pruebas espedficas con LSD se utilizaron para determinar la significacion de las diferencias entre los modos de tratamiento. Se realizo un analisis multifactorial utilizando Statistica v7.0 (Statsoft, Inc, Tulsa, OK).

6.1.2 Resultados

Analisis estadfstico. Los valores se expresan como media ± desviacion tfpica en el texto y cifras. Una forma de analisis de variancia y pruebas ad hoc LSD se utilizaron para determinar la significacion de las diferencias entre los modos de tratamiento. Se realizo un analisis multifactorial utilizando Statistica v7.0 (Statsoft, Inc, Tulsa, OK).

Cinetica de cicatrizacion de heridas alterada con parche de pGlcNAc. El tratamiento con pGlcNAc provoco el cierre de heridas mas rapido a lo largo del tiempo en comparacion con la ausencia de tratamiento. El grupo 1 h presento

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disminucion mas rapida (p <0,01) de la superficie en bruto (parte abierta de la herida), en comparacion con el grupo NT los dfas 7°, 14° y 17° (Fig. 2A). El grupo 1 h tambien consiguio el 90% de cierre de promedio en 16,6 dfas, lo que es nueve dfas mas rapido (p<0,01) que el grupo NT (25,6 dfas) (Fig. 2B). El grupo 24 h consiguio el 90% de cierre en 18,2 dfas (Fig. 2B).

El grupo 1 h presento aumento de reepitelizacion (p<0,01), en comparacion con el grupo NT los dfas 4°, 7°, 14° y 21° (Fig. 2C, 2D). El grupo 24 h presento aumento de reepitelizacion (p<0,01), en comparacion con el grupo NT los dfas 4° y 21° (Fig. 2C).

El grupo 24 h presento disminucion (p<0,01) de la contraccion, en comparacion con el grupo NT los dfas 4° y 17°; y disminucion (p<0,01) de la contraccion, en comparacion con el grupo 1 h el 7° dfa (Fig. 2E). El grupo 1 h presento disminucion (p<0,01) de la contraccion, en comparacion con el grupo NT el dfa 14° (Fig. 2E).

Mayor densidad y proliferacion de vasos sangumeos con el parche de pGIcNAc. 1 cm2, de espesor total, de heridas sin tratar en raton db/db alcanzo el 50% de cierre entre los dfas 8°-12° despues de la operacion (Chan et al. Effect of recombinant platelet-derived growth factor (Regranex) on wound closure in genetically diabetic mice. J. Burn. Care Res. 2006; 27(2):202-5). Se eligio el 10° dfa como punto de tiempo intermedio para la estadificacion de la cicatrizacion de heridas despues de los tratamientos.

Se tineron celulas proliferantes para Ki-67 (Fig. 3A). Se selecciono PECAM-1 (CD31) para tenir celulas endoteliales y cuantificar la densidad de vasos sangumeos en el tejido de granulacion (Fig. 3B). El grupo 1 h presento aumentos significativos en la densidad de vasos sangumeos y la proliferacion celular, en comparacion tanto con el grupo NT como con el de 24 h (Fig. 3A, 3B). Se representaron los resultados de PECAM-1 y Ki-67, en conjunto dan la correlacion visual de la angiogenia y la proliferacion entre los diferentes tratamientos (Fig. 3C).

El area y el espesor del tejido de granulacion se midieron en microfotograffas con un aumento de 4x (n = 7-8 por grupo) para evaluar el nivel de cobertura por el tejido recien formado en respuesta a lesiones y modalidad de tratamiento, como se muestra a continuacion:

Area media del tejido de granulacion ±

desviacion tfpica

(pixels)

Espesor medio del tejido de granulacion ±

desviacion tfpica

(pixels)

5,5x105 ± 5,3x105

3,5x102 ± 3,6x102

NT

1,1x106 ± 6,0x105

7,9x102 ± 3,9x102

1 h

8,6x105 ± 2,7x105

5,7x102 ± 2,5x102

24 h

No se observaron diferencias significativas entre los grupos NT, 24 h y 1 h en la cantidad y distribucion del tejido de granulacion.

Tiempo de aplicacion de la respuesta al cuerpo extrano modulada por parche de pGIcNAc. Para estudiar los efectos de una exposicion prolongada de la base de la herida a las fibras insolubles, el parche se dejo inicialmente en su lugar durante todo el penodo de seguimiento (tres semanas). La presencia prolongada de las largas fibras insolubles del parche provoco la formacion de una respuesta al cuerpo extrano, caracterizada por aumento de la formacion de tejido de granulacion y celulas gigantes multinucleadas. La aplicacion del parche durante 1 o 24 horas no provoco ninguna reaccion al cuerpo extrano.

6.2 Ejemplo 2. Efectos de la membrana de poli-N-acetilglucosamina acortada (sNAG) en la cicatrizacion de heridas en el raton db/db.

6.2.1 Materiales y Metodos

Preparacion de la membrana de sNAG. La membrana de sNAG consiste en nanofibras obtenidas de microalgas producidas como se ha descrito en el apartado 6.1 anteriormente, en la que las fibras se acortan por irradiacion. En resumen, el material inicial contema 60 g de suspension de pGlcNAc a una concentracion de 1 mg/ml. La concentracion de la suspension de pGlcNAc se confirmo filtrando 5 ml en un filtro de 0,2 pm. Se filtraron 15 l de la lechada de pGlcNAc que contema 15 g de pGlcNAc hasta la formacion de una torta humeda. La torta humeda se transfirio a continuacion a un bolsa de papel de aluminio, que es un recipiente compatible con la radiacion gamma, y se sometio a radiacion gamma de 200 kGy. Se ensayaron otras condiciones de irradiacion para determinar sus efectos sobre composiciones de pGlcNAc, como se refleja en la Fig. 4A.

Modelo de herida y diseno del estudio. El modelo de raton geneticamente descrito en el apartado 6.1 anterior se utilizo para probar el efecto de las membranas sNAG en la cicatrizacion de heridas.

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Analisis del cierre de la herida. El analisis de cierre de la herida se realizo sustancialmente como se ha descrito en el apartado 6.1. La suma de las areas de heridas con^das, reepitelializadas y abiertas es igual a 100% del tamano original de la herida (Fig. 5) (vease Yannas I. Tissue and Organ Regeneration in adults. Nueva York: Springer; 2001.).

Inmunohistoqumica. La inmunoqmmica se realizo sustancialmente como se describio anteriormente en el apartado 6.1.

Cuantificacion de la densidad de los vasos. La cuantificacion de la densidad de los vasos se realizo sustancialmente como se describio anteriormente en el apartado 6.1.

Cuantificacion de la proliferacion celular. La cuantificacion de la proliferacion celular se realizo sustancialmente como se describio anteriormente en el apartado 6.1.

Tincion con colageno. Las heridas se tineron para el contenido de colageno utilizando metodos rutinarios.

Analisis estad^stico. El analisis estadfstico de cierre de la herida se realizo sustancialmente como se describio anteriormente en el apartado 6.1.

6.2.2 Resultados

Efecto de la irradiacion en las membranas de pGlcNAc. Mientras que la irradiacion reduce el peso molecular de pGlcNAc, la irradiacion no afecta la microestructura de las fibras. Se irradio pGlcNAc en diferentes condiciones: como un material seco, liofilizado; como una membrana seca; como una lechada concentrada (30:70 en peso por volumen); y como una suspension diluida (5 mg/ml). Se logro una reduccion de peso molecular adecuada (a un peso molecular de 500.000-1.000.000 daltons) a una dosis de irradiacion de 1.000 kgy para polfmero seco y 200 kgy para polfmero humedo (Fig. 4A).

La estructura qmmica y ffsica de las fibras se mantuvo durante la irradiacion segun se verifico por espectro infrarrojo (IR) (Fig. 4B), analisis elemental, y analisis al microscopio electronico de barrido (SEM). La observacion al microscopio de las fibras irradiadas mostro una disminucion en la longitud de partfcula (Fig. 4C y 4D). La mayona de las fibras tienen menos de aproximadamente 15 pm de longitud, con una longitud media de aproximadamente 4 pm.

Cinetica de cicatrizacion de heridas alterada con membrana sNAG. Fotograffas macroscopicas demuestran que las heridas de ratones tratados con membrana de sNAG cicatrizaron mas rapido que las heridas de los ratones de referencia no tratados (vease las Fig. 6-10). El tratamiento con sNAG provoco el cierre de heridas mas rapido a lo largo del tiempo en comparacion con la ausencia de tratamiento. Los ratones tratados con la membrana de sNAG presentaban disminucion mas rapida (p<0,05) de la superficie en bruto (parte abierta de la herida), en comparacion con los ratones de referencia sin tratar los dfas 4°, 7°, 10°, 14°, 17°, 21° y 25° (Fig. 11).

Los ratones tratados con la membrana de sNAG tambien consiguieron el 50% de cierre de promedio en un poco mas de 8 dfas, que es cuatro dfas mas rapido (p<0,01) que los ratones de referencia sin tratar (mas de 12 dfas) (Fig. 12).

Los ratones tratados con la membrana de sNAG tambien consiguieron el 90% de cierre de promedio en menos de 15 dfas, que es ocho dfas mas rapido (p<0,01) que los ratones de referencia sin tratar (aproximadamente 23 dfas) (Fig. 13).

El dfa 28°, todas (100%) las heridas cerraron en los ratones tratados con membrana de sNAG, mientras que solo el 85% heridas cerraron en los ratones de referencia sin tratar.

Los ratones tratados con la membrana de sNAG mostraron aumento (p<0,05) de reepitelizacion, en comparacion con los ratones de referencia sin tratar los dfas 14° y 17° (Fig. 14).

Los ratones tratados con la membrana de sNAG mostraron disminucion (p<0,01) de la contraccion, en comparacion con los ratones de referencia sin tratar el 4°, 7° y 10° dfa (Fig. 15).

Mayor densidad y proliferacion de vasos sanguneos con membrana sNAG. 1 cm2, de espesor total, de heridas sin tratar en raton db/db alcanzo el 50% de cierre entre los dfas 8°-12° despues de la operacion (Chan et al. Effect of recombinant platelet-derived growth factor (Regranex) on wound closure in genetically diabetic mice. J. Burn. Care Res. 2006; 27(2):202-5). Se eligio el 10° dfa como punto de tiempo intermedio para la estadificacion de la cicatrizacion de heridas despues de los tratamientos.

La histologfa del borde de la herida en un raton de referencia no tratado en comparacion con un raton tratado con membrana de sNAG se muestra en las Fig. 16 y 17, respectivamente. Se tineron celulas proliferantes para Ki-67 (Fig. 18). Se selecciono PECAM-1 (CD31) para tenir celulas endoteliales y cuantificar la densidad de vasos

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sangumeos en tejido de granulacion (Fig. 19). Los ratones tratados con membrana de sNAG presentaron aumentos significativos en la densidad de los vasos sangumeos y la proliferacion celular, en comparacion con los ratones de referencia no tratados (Fig. 16, 17).

Se midieron las areas de reepitelizacion y tejido de granulacion en microfotograffas con un aumento de 4x (n = 7-8 por grupo) para evaluar el nivel de cobertura por el tejido recien formado en respuesta a la lesion y modalidad de tratamiento, como se muestra en las Fig. 20 y 2l.

Tiempo de aplicacion de la respuesta al cuerpo extrano modulada por la membrana de sNAG. Para estudiar los efectos de una exposicion prolongada de la base de la herida a las fibras de sNAG, se deja la membrana en su lugar durante todo el experimento (cuatro semanas). La Fig. 22 muestra la falta de reaccion al cuerpo extrano a los 10 dfas. Por otra parte, no se observo ninguna reaccion al cuerpo extrano durante todo el estudio en ninguno de los ratones tratados con membrana de sNAG.

Formacion/construccion de colageno modulada por la membrana de sNAG. La tincion de colageno se observo tanto en ratones tratados como no tratados con sNAG, pero los haces de colageno eran mas densos y mas uniformes en los ratones tratados, lo que sugiere aumento de la estimulacion de los fibroblastos de la herida y la cicatrizacion de heridas mas avanzada en los ratones tratados (Fig. 22).

6.3 Ejemplo 3. Efectos de poli-N-acetilglucosamina (pGlcNAc) y sNAGs en el movimiento de las celulas endoteliales (CE) y la angiogenia

6.3.1 Materiales y Metodos

Cultivo tisular, factores de crecimiento y transfeccion. Las celulas endoteliales (celula) mezcladas de la vena del cordon umbilical humano (Cambrex) de multiples donantes se mantuvieron a 37°C con 5% de CO2 en medio basal endotelial 2 (Cambrex) enriquecido con medio de crecimiento de CE 2 SingleQuots como se describe en procedimientos Cambrex. La privacion de suero se realizo a 80-90% de confluencia en RPMI-1640 enriquecido con 0,1% de suero fetal bovino (Gibco BRL) durante 24 h seguido de estimulacion con VEGF 165 (20 ng/ml, R&D Systems) o con nanofibras de pGlcNAc muy purificadas o nanofibras de sNAG en agua esteril (proporcionadas por Marine Polymer Technologies, Inc., Danvers, Mass., EE.UU.) con las cantidades indicadas en el texto. Para la inhibicion que utiliza el inhibidor SU5416 de VEGFR; (10 |jM; R&D Systems) las celulas se trataron previamente durante 15 minutos antes de la estimulacion con VEGF, pGlcNAc o sNAG.

Las CE de la vena del cordon umbilical humano se transfectaron usando el sistema Amaxa Nucleofector en los procedimientos descritos por el fabricante, obteniendo eficiencias de transfeccion de hasta el 80%. Todas las transfecciones se controlaron mediante la expresion de la protema verde fluorescente (GFP) utilizando un vector de expresion GFP (pFP-C1; Clontech) o un ARN de interferencia (RNAi; Amaxa) dirigido contra GFP. El ARNi plasmido dirigido espedficamente contra Ets1 se adquirio en Pandomics, Inc., y el montaje Ets dominante negativo (dn-Ets) contiene el dominio de union al ADN de Ets2 clonado en un vector de expresion pcDNA3.

Anticuerpos y analisis de inmunotransferencia Western. Los anticuerpos utilizados para el analisis de inmunotransferencia Western son los siguientes: subunidad anti-p85 de PI3K (Upstate Biotechnology), anti-VEGFR2 fosfoespedfico (Cell Signaling), VEGFR2 (Santa Cruz), anti-p42/p44 fosfoespedfico (Promega), y anti-VEGFR2 fosfo-espedfico (BD Biosciences, Inc.), anti-p42/p44 Erk1/2, anti-VEGFR2 y anti-Ets1 (Santa Cruz).

Las celulas tratadas se lavaron una vez con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en tampon de lisis 1 x RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, SDS al 0,1%, desoxicolato de sodio al 1%, NaF 40 mM), enriquecido con inhibidores de la proteasa completos sin EDTA (Roche) y orto vanadato de sodio 200 jM. Las concentraciones de protemas se determinaron por un analisis de protemas en acido bicincomnico (Pierce) resuelto por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno Immobilon-P (Millipore). Analisis Western seguidos de procedimientos convencionales. Las protemas se visualizaron usando el reactivo Luminol (Santa Cruz).

Ensayos de motilidad y proliferacion celular. Para los ensayos de cierre de heridas por "aranazos", las CE se cultivaron hasta confluencia en placas de plastico de cultivo tisular y se produjo una sola 'herida' usando una punta de pipeta. Se incubaron celulas en medios sin suero enriquecidos con o sin VEGF (20 ng/ml), pGlcNAc o sNAG en las cantidades indicadas en el texto durante 16-18 h. Las celulas se lavaron una vez con PBS, se fijaron durante 10 min en metanol, se tineron con violeta cristal al 0,1% durante 10 min y se enjuagaron a fondo con agua. Los ensayos en heridas se fotografiaron a 10 aumentos de ampliacion utilizando un microscopio optico Olympus equipado con procesado de imagenes digitales, y se midio la distancia migrada.

Para los ensayos transwell modificados, CE transfectadas o no transfectadas se sembraron en camaras de invasion de 8 jm de tamano de poro recubiertas previamente con fibronectina o vitronectina a 20 jg/l (Sigma), 5 x 104 celulas por camara en 500 jl de los medios sin suero y 500 jl de medio sin suero se anadieron al pocillo. Se anadio VEGF (20 ng/ml), pGlcNAc o sNAG a la camara superior. Se incubaron las celulas durante 12 h a 37°C en presencia de CO2 al 5%. Las celulas que no migraron se retiraron limpiando la parte superior de cada membrana con un hisopo de algodon. Las celulas migradas se fijaron en metanol durante 10 min y se tineron con 0,1 mg/ml de bromuro de etidio

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en PBS. Las celulas migradas se contaron utilizando un microscopio Leica de fluorescencia. Cada ensayo se realizo por triplicado al menos 3 veces independientes, y se contaron por lo menos 6 campos por ensayo transwell.

Para los ensayos de angiogenia in vitro, se sembraron CE en placas en la matriz Matrigel con factor de crecimiento reducido (BD Laboratory) a 1,6 x 104 celulas/50 pl por pocillo de una placa de 96 pocillos en medio sin suero en presencia o ausencia de VEGF (20 ng/ml), pGlcNAc o sNAG. la formacion de cordon umbilical se evaluo durante un maximo de 8 h despues de la siembra. Las celulas se fijaron y se fotografiaron cuando las celulas tratadas con VEGF, pGlcNAc y sNAG comenzaron a formar cordones, mientras que las referencias reteman una sola capa de celulas. Los ensayos se realizaron por duplicado y se repitieron 2 veces independientes.

Para la evaluacion de la proliferacion/viabilidad celular, se utilizaron 2 ensayos diferentes: exclusion del azul de tripano por recuentos directos de celulas con un hemocitometro y un ensayo con MTT [bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] en los procedimientos descritos por el fabricante (Promega).

Bloqueo de anticuerpos. Para bloquear la motilidad celular y la senalizacion de celulas en las que actua como mediadora la integrina, se incubaron previamente CE durante 15 min con anticuerpos de bloqueo, a concentraciones determinadas empmcamente (1 pg/ml), dirigidos contra aVp3 o a5p1 (CD49e) adquiridos de Chemicon International o contra la subunidad a5 (Santa Cruz) antes de la estimulacion con pGlcNAc o sNAG. Como referencia negativa se utilizo suero normal de conejo. Para la inhibicion de la migracion celular que utiliza el anticuerpo aVp3, los transwells se recubrieron previamente con vitronectina (Sigma) en lugar de con fibronectina (20 pg/pl). Para bloquear la activacion de VEGFR, se incubaron previamente CE durante 15 min con inhibidor, SU5416 (SU) a una concentracion de 10 pg/ml.

Reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa. Para la reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa semicuantitativa (RT-PCR), se sintetizo ADNc a partir de ARN completo de (2-5 pg), se aislo utilizando RNA STAT-60 (Tel-Test, Inc.) en los procedimientos descritos por el fabricante, con un Superscrpt First- Strand Syntesis Kit adquirido en Gibco BRL utilizando oligo(dT) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR conteman cantidades iguales de ADNc y 1,25 pM del par de cebadores adecuado (Proligo, Inc.). Las secuencias de los cebadores son las siguientes: Ets1, 5'-TTCTCAGAGCCCAGCTTCAT-3' directo, 5'- AAAGTTTGAATTCCCAGCCAT-3' inverso; metalotionema 2A, 5'-CAACCTGTCCCGACTCTAGC-3' directo

inverso; S26, 5'-CTCCGGTCCGTGCCTCCAAG-3' directo, inverso; VEGF, 5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3' directo,

inverso; IL-1, 5'-CTGCGCCAACACAGAAATTA-3' directo,

inverso; IL-8,

AGGAGCAACTCCTGTCCTGA-3'

CAGAGAATAGCCTGTCTTCAG-3

TGGTGATGTTGGCTCCTCA-3'

ATTGCATCTGGCAACCCTAC-3'

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directo,

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GCTACAAGTGCGTCGTCAAA-3' inverso. Las condiciones de ciclacion fueron: 94°C durante 5 min; 20-35 ciclos de 94°C durante 1 min, 50-65°C (basadas en el cebador T m) durante 1 min, 72°C durante 1 min y 45 s + 2 s/ciclo; 72°C durante 7 min y se enfrio a 4°C. El numero de ciclos se determino empmcamente que estaba dentro del intervalo lineal del ensayo para cada par de cebadores utilizado. Todos los RTPCR semicuantitativos se realizaron en tandem con los cebadores S26 como una referencia interna. Los productos se introducen en geles de agarosa al 1-1,5% (basandose en el tamano del producto) y se visualizaron en un Molecular Imaging System de BioRad.

Se llevo a cabo la PCR en tiempo real utilizando un kit de PCR cuantitativa verde Brilliant CYBR (QPCR) en combinacion con un sistema de PCR en tiempo real Mx3000P, ambos adquiridos en Stratagene. El tiempo real se llevo a cabo por triplicado al menos 2 veces independientes. Se utilizaron cebadores de referencia interna que detectan la subunidad S26 de protema ribosomica.

6.3.2 Resultados

6.3.2.1 pGlcNAc

pGlcNAc protegio las CE de la muerte celular provocada por privacion de suero. Para probar si las fibras de pGlcNAc teman un efecto directo sobre CE, celulas CE privadas de suero se trataron con VEGF o con diferentes concentraciones de fibras de pGlcNAc. Como se muestra en la Fig. 24 a las 48 h y 72 h despues de la privacion de suero, en comparacion con el numero total de celulas cultivadas en placas (referencia), hubo una reduccion de aproximadamente el doble en el numero de celulas despues de 48 h o 72 h. A las 48 h, esta disminucion en el numero de celulas se libro mediante la adicion de VEGF o mediante la adicion de fibras de pGlcNAc a 50 o 100 pg/ml. A las 72 h, la disminucion en el numero de celulas se libro mediante la adicion de VEGF o en gran medida se libro mediante la adicion de fibras de pGlcNAc a razon de 100 pg/ml. Estos resultados indicaron que como VEGF, el tratamiento con fibras de pGlcNAc evito la muerte celular provocada por la privacion de suero.

pGlcNAc no afecto la tasa metabolica. Como se muestra en la Fig. 25, pGlcNAc no produjo una tasa metabolica mayor medida por ensayos de MTT, lo que indica que este material polimerico no estaba causando un incremento notable en la proliferacion celular, pero estaba librandose de la muerte celular por privacion de suero.

pGlcNAc aumento la migracion celular. Para probar si el tratamiento de CE con fibras de pGlcNAc produda cambios en la motilidad celular, se utilizo el ensayo de cierre de la herida por "aranazo". La migracion de las celulas en el area herida fue significativamente mayor en presencia de pGlcNAc tanto a 50, 100 como a 250 mg/ml. Como se muestra en la Fig. 26, cierre de la herida fue similar al observado para el tratamiento con VEGF. Estos resultados

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indicaron que el tratamiento con pGIcNAc produda un aumento en el movimiento de las CE.

pGIcNAc provoco un aumento de la migracion hacia fibronectina. Para determinar si este aumento de la motilidad celular se correlaciona con un aumento en la invasion celular, se midio la motilidad de CE utilizando ensayos transwell en donde las membranas se recubrieron previamente con la protema de la matriz extracelular, fibronectina. Como se muestra en la Fig. 27, el tratamiento con pGlcNAc produjo un incremento de al triple en la migracion hacia la fibronectina que aumento por la adicion de VEGF (4 veces).

pGlcNAc aumento la formacion de cordon umbilical. La estimulacion de la migracion celular es un requisito previo para el aumento de la angiogenia. Para probar, in vitro, si pGlcNAc era proangiogeno, se realizaron ensayos con Matrigel. Se sembraron placas con CE en Matrigel reducida en factor de crecimiento en condiciones de privacion de suero y se evaluo para la formacion de cordon umbilical en presencia o ausencia de fibras de VEGF o pGlcNAc en 6 h. Como se muestra en la Fig. 28, el tratamiento tanto con VEGF como con pGlcNAc dio lugar a aumento de formacion de cordon umbilical en Matrigel. Estos resultados indican que pGlcNAc es proangiogeno.

pGlcNAc produjo efectores involucrados en la motilidad celular. Se aislo ARN completo a partir de CE privadas de suero (SS); SStratadas con VEGF, pGlcNAc, Sphingosiing 1-fosfato (S1P), o Zn; sS pretratadas con VEGF o S1P a continuacion despues del tratamiento con pGlcNAc; SS pre tratadas con VEGF o pGlcNAc luego siguiendo el tratamiento del inhibidor de VEGFR, SU5416 (Su). Como se muestra en la Fig. 29A, el tratamiento con pGlcNAc estimulo la expresion del factor de transcripcion Ets1, que es un regulador importante del movimiento de CE, y metalotionema 2A (MT), y Akt3 Edg3.Como se muestra en la Fig. 29B, PCR en tiempo real indica que Ets1 se provoco aproximadamente 2 veces por tratamiento con pGlcNAc. Este aumento de Ets1 en mensaje fue acompanado por una mayor expresion de la protema como se muestra en el analisis de inmunotransferencia Western en la Fig. 29C. La Fig. 29A tambien indico que la expresion de MT estimulada por pGlcNAc estaba en funcion de VEGFR.

La induccion por pGlcNAcc de fosforo-MAPK estaba en funcion de VEGFR2. Para probar si el tratamiento con pGlcNAc daba lugar a la activacion de las vfas previamente mostradas aguas abajo de la senalizacion de VEGFR, las CE se trataron con VEGF o pGlcNAc. Como se muestra en la Fig. 30A, el tratamiento con pGlcNAc dio como resultado un marcado incremento en la fosforilacion de MAPK. Para probar si este aumento estaba en funcion de VEGFR2, las CE se pretrataron con el inhibidor de VEGFR, despues del tratamiento con VEGF o pGlcNAc. Los resultados indicaron que la induccion por pGlcNAc de fosforo-MAPK estaba en funcion de VEGFR2 (vease tambien la Fig. 30B).

pGlcNAc no activo VEGFR2. Para probar si pGlcNAc activaba el VEGFR, se realizaron una serie de inmunotransferencias Western utilizando un anticuerpo dirigido contra la forma fosforilada de VEGFR2. Como se muestra en la Fig. 31, el tratamiento con VEGF produjo una rapida fosforilacion de VEGFR, acompanada por la renovacion de las cantidades totales de protema VEGFR2, mientras que pGlcNAc no tuvo ningun efecto, ya sea en estos puntos de tiempo iniciales mostrados, o hasta 6 h despues del tratamiento (datos no mostrados).

La migracion inducida por pGlcNAc estaba en funcion de Ets. Para probar si se requena Ets1 para la motilidad inducida por pGlcNAc, se inhibio Ets1 utilizando tanto un enfoque negativo dominante asf como mediante ARNi. Un montaje dn-Ets que expresa el dominio de union al ADN Ets conservado se transfecto en las CE. Despues de 24 h para permitir la expresion del dn-Ets, las celulas se evaluaron los cambios en la migracion celular hacia la fibronectina en ensayos transwell despues del tratamiento con pGlcNAc. Como se muestra en la Fig. 32A, la inhibicion de la actividad de Ets1, asf como de otros miembros de la familia expresados en CE dio como resultado una notable disminucion en la migracion de CE en respuesta a pGlcNAc. Como referencia para la actividad del dn- Ets, la Fig. 5B demuestra que la transfeccion de cantidades crecientes de dn-Ets da como resultado una disminucion de la protema completa Ets1. La expresion de Ets1 puede ser controlada no solo por otro miembro de la familia, sino tambien puede ser autorregulada. La inhibicion de la Ets1 espedficamente por ARNi tambien dio lugar a una disminucion de la motilidad celular provocada por pGlcNAc sobre fibronectina (Fig. 32A, lado derecho). Como se muestra en la Fig. 32B, en las celulas transfectadas con plasmido de expresion dn-Ets, la expresion de la protema Ets1 disminuyo con la cantidad de plasmido en aumento. Como referencia para el experimento con ARNi, la Fig. 32C muestra los niveles de expresion resultantes de Ets1 en CE transfectadas con 2 cantidades de ARNi que contiene plasmido dirigido contra Etsl.La expresion de dn-Ets dio como resultado una reduccion mas sustancial en la migracion celular que el ARNi de Ets1, probablemente debido a su bloqueo de otros miembros de la familia expresados en la CE. Estos hallazgos apoyan una funcion para Ets1 en la induccion de la motilidad celular por pGlcNAc.

La motilidad celular provocada por pGlcNAc requena integrina. Para probar si los efectos de pGlcNAc dependen de integrina, se utilizaron anticuerpos de bloqueo para interrumpir la senalizacion en la que interviene como mediadora la integrina en CE. El efecto de estos anticuerpos sobre la migracion celular provocada por pGlcNAc se evaluo mediante ensayos Transwell. La Fig. 33A muestra los resultados al usar anticuerpos dirigidos contra integrina aVp3 o aspi (CD49e) en ensayos de migracion hacia la fibronectina (el receptor aVp3). La Fig. 33B muestra un experimento similar utilizando anticuerpos dirigidos contra aVp3 o aspi (CD49e) en transwells recubiertos con vitronectina. El bloqueo de anticuerpos de cualquier subtipo de integrina dio como resultado la inhibicion de la motilidad celular provocada por pGlcNAc en sus sustratos afines. Estos resultados indican que pGlcNAc estimula la motilidad celular

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mediante la activacion de la integrina. Los resultados tambien son coherentes con pGIcNAc que estimula la angiogenia mediante activacion de la integrina.

La motilidad celular provocada por pGIcNAc puede implicar la activacion de FAK con la participacion de integrina. FAK se fosforila en respuesta a la agrupacion y activacion de integrinas. FAK es un regulador clave de la integrina y de la motilidad y la invasion celular en las que interviene como mediador el factor de crecimiento. Para probar la activacion de la integrina por pGlcNAc se trataron, las CE con fibras de pGlcNAc durante cantidades crecientes de tiempo y se ensayaron los cambios en el nivel de fosforilacion de FAK. Como se muestra en la Fig. 34, el tratamiento con pGlcNAc dio como resultado la fosforilacion de FAK a los 15 min de tratamiento. Estos resultados indican que la motilidad celular provocada por pGlcNAc puede implicar la activacion de FAK mediante la participacion de la integrina.

pGlcNAc activa una ruta integrina^Etsl lo que conduce a la angiogenia en un modelo de cicatrizacion de heridas. Se ha descrito una funcion para Ets1 en la regulacion de la transcripcion de un numero de subunidades de integrina, colocando a Ets1 aguas arriba de las integrinas. El descubrimiento de que la motilidad provocada por pGlcNAc depende tanto de las integrinas como de Ets1 implica que Ets1 puede regularse aguas abajo de las integrinas. Para confirmar que los resultados de activacion de la integrina en la regulacion de la expresion Ets1, se utilizaron anticuerpos bloqueadores dirigidos contra a5p1 (receptor de fibronectina) o aVp3 (receptor de vitronectina) para inhibir las integrinas or pGlcNAc. La Fig. 35A demuestra que el bloqueo de anticuerpos de la integrina a5p1 da lugar a una reduccion en la expresion de Ets1 provocada por pGlcNAc. Esta inhibicion de la expresion de Ets1 que utiliza un bloqueo de la integrina a5p1 se repite en el ambito de protema (Fig. 35B). Sin embargo, aunque el anticuerpo integrina a5p3 bloqueo la motilidad en vitronectina, no afecto a la expresion de Ets1 provocada por pGlcNAc (Fig. 35), lo que indica que la motilidad celular provocada por pGlcNAc en vitronectina puede ser independiente de Ets1. Considerados en conjunto, estos resultados situan a Ets1 aguas abajo de determinadas integrinas en las CE primarias e indican la especificidad potencial en la senalizacion de integrinas con respecto a la expresion de Ets1 en las CE primarias. Estos resultados, por lo tanto, indican que pGlcNAc puede activar una ruta integrina^Etsl que conduce a angiogenia en un modelo de cicatrizacion de heridas.

Expresion de VEGF e IL1 provocada por pGlcNAc. Para probar si el tratamiento con pGlcNAc provoco la expresion de factores de crecimiento o citocinas conocidas por ser segregadas por CE activadas, CE privadas de suero se trataron con pGlcNAc durante 12 h y se evaluaron los cambios en la expresion de VEGF,IL-1 y IL-8. Como se demuestra por RT-PCR y QPCR (Fig. 36A), el tratamiento con pGlcNAc dio lugar a un aumento de la expresion tanto de VEGF como de IL-1. Estos resultados tambien indicaron que la respuesta de las CE a pGlcNAc es espedfica ya que no hubo cambios en la expresion de otra interleucina, IL-8. Para probar la induccion dependiente de pGlcNAc de la expresion de Ets1, un factor de transcripcion conocido por estar regulado por VEGF, secundario al efecto de pGlcNAc sobre la expresion de VEGF, se bloqueo la activacion de VEGFR utilizando el inhibidor farmacologico, SU5416 (SU), antes del tratamiento con pGlcNAc. Como se demuestra por QPCR (Fig. 36B), el tratamiento de CE con este inhibidor bloqueo la induccion de VEGF por Ets1 pero no tuvo efecto sobre la induccion de Ets1 por pGlcNAc.

Expresion de FGF1 y FGFR3 provocada por pGlcNAc. Para probar si el tratamiento pGlcNAc provocaba la expresion de factores relacionados con la angiogenia, las CE se trataron con pGlcNAc y se evaluaron los cambios en la expresion de FGF1, FGF2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, Estabilina, IFNg, ColagenoAl8. Como se muestra en la figura. 37, el tratamiento con pGlcNAc dio lugar a un aumento de la expresion de Estabilina y ColagenoA18.

6.32.2 sNAG

Aumento de la migracion celular por sNAG. Para probar si el tratamiento con fibras de sNAG de las CE daba lugar a cambios en la motilidad celular, se utilizo el ensayo de cierre de heridas por "aranazo". La migracion de las celulas en el area de la herida aumentaba significativamente en presencia de sNAG tanto a 50 como a 100 mg/ml. El cierre de la herida fue similar al observado para el tratamiento con pGlcNAc (vease la Fig. 38). Estos resultados indicaron que el tratamiento con sNAG daba lugar a un aumento en el movimiento de las CE.

sNAG provoco un aumento notable en la tasa metabolica. Como se midio mediante ensayos de MTT, sNAG a 50, 100 o 200 mg/ml dio lugar a una tasa metabolica mayor de las CE que VEGF (Fig. 39).

sNAG no protegio las CE de la muerte celular provocada por la privacion de suero. Para probar si las fibras de sNAG tuvieron un efecto directo en las CE, las celulas CE privadas de suero se trataron con VEGF o con diferentes concentraciones de fibras sNAG. Como se muestra en la Fig. 40, a las 48 h despues de la privacion de suero, en comparacion con el numero total de celulas cultivadas en placas (referencia), hubo una reduccion del numero de celulas de aproximadamente el doble. De esta disminucion del numero de celulas se libro por adicion de VEGF, pero no por adicion de fibras sNAG a 50, 100 o 200 pg/ml. Estos resultados indicaron que a diferencia de VEGF, el tratamiento con fibras de sNAG no impidio la muerte celular provocada por la privacion de suero.

Expresion de VEGF e IL1 provocada por sNAG. Para probar si el tratamiento con sNAG provocaba la expresion de factores de crecimiento o citocinas que se sabe que son segregadas por las CE activadas y comparar el efecto con pGlcNAc, las CE privadas de suero se trataron con pGlcNAc o sNAG durante 12 h y se evaluaron los cambios en la

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expresion de VEGF,IL-1 e IL-8. Como se muestra en la figura. 41, el tratamiento con sNAG dio como resultado un aumento de expresion tanto de VEGF como de IL-1. Estos resultados tambien indicaban que la respuesta de las CE a sN AG es espedfica ya que no hubo ningun cambio en la expresion de otra interleucina, IL-8.

Expresion de FGF1 y FGFR3 inducida por sNAG. Para probar si el tratamiento con sNAG provocaba la expresion de factores relacionados con la angiogenia, las CE se trataron con sNAG y se evaluaron los cambios en la expresion de FGF1, FGF2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, Estabilina, IFNg, ColagenoAl8. Como se demuestra por RT-PCR (Fig. 37), el tratamiento con sNAG dio lugar a un aumento de la expresion de FGF1 y FGFR3.

Los resultados anteriores demuestran que tanto pGlcNAc y sNAG inducidos motilidad CE, y que ambos pGlcNAc y sNAG inducen la expresion de VEGF eIL-1.

Los resultados anteriores demuestran tambien que sNAG aumenta la tasa metabolica de CE privadas de suero en un ensayo de MTT y no se libran de la apoptosis de las CE privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano.

6.4 Ejemplo 4. Pruebas de sNAG con animales

6.4.1 Producto experimental

Se utilizo un producto experimental que comprende sNAG producido como se ha descrito anteriormente en el apartado 6.2.1. El producto experimental fue suministrado esteril por Marine Polymer Technologies, Inc.

6.4.2 Pruebas de biocompatibilidad - Prueba de elucion L929 MEM - ISO 10993-5

La biocompatibilidad del producto experimental se probo en celulas de mairnfero L929 fibroblastos de raton. No se observo reactividad biologica (Grado 0) en las celulas L929 a las 48 horas, tras la exposicion posterior al producto experimental. La respuesta celular observada obtenida del producto de referencia positiva (Grado 4) y del producto de referencia negativa (Grado 0) confirmo la idoneidad del sistema de prueba. Sobre la base de los criterios del protocolo, el producto experimental se considera atoxico y cumple los requisitos de la prueba de elucion, la Organizacion Internacional de Normalizacion (ISO) normas 10993-5. Vease la Tabla I a continuacion.

Tabla I

GRADOS DE REACTIVIDAD

Tiempo: Producto experimental Referencias

Media: Negativa Positiva

A: B C A B C A B C A B C

0 horas: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 horas: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 3

48 horas: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 4

Grado: Reactividad Descripcion de la zona de reactividad

0: ninguna Granulos intracitoplasmicos discretos; sin lisis celular

1: ligera Menos del 20% de las celulas son redondas, ligeramente unidas y sin granulos intracitoplasmicos; algunas veces estan presentes celulas lisadas

2: debil Menos del 50% de las celulas son redondas y desprovistas de granulos intracitoplasmicos; lisis celular reducida y areas vadas entre las celulas

3: moderada Menos del 70% de las capas celulares contienen celulas redondeadas o estan lisadas

4: fuerte Destruccion casi completa de las capas celulares

5

10

15

20

25

30

35

40

45

6.4. 3 Prueba de implantacion intramuscular - ISO - 4 semanas de implantacion

6.4.2.1 Materiales y Metodos

Para evaluar el potencial del producto experimental para provocar efectos toxicos locales, se utilizo la Prueba de implantacion intramuscular - ISO - 4 semanas de implantacion ("prueba de implantacion intramuscular"). En resumen, el producto experimental se implanto en el tejido del musculo paravertebral de conejos White de Nueva Zelanda durante un penodo de 4 semanas. El producto experimental se evaluo a continuacion por separado usando dos productos de referencia: Surgicel de referencia positiva (Johnson y Johnson, NJ) y polietileno de altadensidad de referencia negativa (plastico de referencia negativa).

Preparacion de la prueba y productos de referenda. El producto experimental midio aproximadamente 1 mm de ancho y a 10 mm de longitud. Se prepararon los dos productos de referencia. La referencia positiva, Surgicel (C1), midio aproximadamente 1 mm de ancho por 10 mm de longitud y se recibio esteril. El plastico de referencia negativa (C2), midio aproximadamente 1 mm de ancho por 10 mm de longitud y se esterilizo sumergiendolo en etanol al 70%.

Procedimiento previo a la dosis. Cada animal se peso antes de la implantacion. El dfa de la prueba, se corto el pelo en los dorsos de los animales y el pelo suelto se elimino al vado. Se anestesio apropiadamente a cada animal. Antes de la implantacion, el area se limpio con una solucion de preparado quirurgico.

Administracion de la dosis. Se implantaron quirurgicamente 4 tiras de producto experimental en cada uno de los musculos paravertebrales de cada conejo, aproximadamente 2,5 cm de la lmea media y paralelas a la columna vertebral y aproximadamente 2,5 cm entre sf. Se implantaron tiras de producto experimental en un lado de la columna vertebral. De manera similar, se implantaron tiras de producto de referencia positiva (Surgicel) en el musculo contralateral de cada animal. Se implantaron en la zona caudal (hacia la cola) dos tiras de referencia negativa (plastico de referencia negativa) al producto experimental y a los sitios de implante de C1 de referencia a cada lado de la columna vertebral (total de cuatro tiras). Se requiere un total de al menos ocho tiras de producto experimental y ocho tiras de cada producto de referencia para su evaluacion.

Procedimientos despues de la dosis. Los animales se mantuvieron durante un penodo de 4 semanas. Los animales se observaron diariamente durante este penodo para asegurar la cicatrizacion adecuada de los sitios de implante y las senales clmicas de toxicidad. Las observaciones inclrnan todas las manifestaciones clmicas. Al final del penodo de observacion, se pesaron los animales. Cada animal fue sacrificado con un barbiturico inyectable. Se dejo transcurrirtiempo suficiente para que el tejido se cortara sin sangrado.

Observaciones macroscopicas. Los musculos paravertebrales en los que se implantan en los productos de prueba o de referencia se escindieron totalmente de cada animal. El tejido muscular se elimino cortando en secciones cuidadosamente alrededor de los sitios de implante con un bistun y levantar el tejido. Los tejidos extirpados de implantes se examinaron macroscopicamente, pero sin necesidad de utilizar excesivos procedimientos invasivos que podna haber alterado la integridad de este tejido para evaluacion histopatologica. Los tejidos se colocaron en recipientes etiquetados correctamente que conteman 10% de formalina tamponada neutra.

Histopatolog^a. Despues de la fijacion en formalina, cada uno de los sitios de implante se extirpo de la masa mas grande de tejido. El sitio del implante, que contema el material implantado, se examino macroscopicamente. En cada sitio se examinaron las senales de inflamacion, encapsulacion, hemorragias, necrosis y decoloracion utilizando la escala siguiente:

0 = Normal

1 = Pequena

2 = Moderada

3 = Fuerte

Despues de la observacion macroscopica, el material de implante se dejo in situ y se proceso una seccion de tejido que contiene el sitio del implante. Se prepararon extensiones histologicas de secciones tenidas con hematoxilina y eosina de Toxikon. Se evaluaron y puntuaron las extensiones por examen al microscopio optico.

Evaluacion patologica de los efectos del implante. Se evaluaron las siguientes categonas de reaccion biologica por observacion microscopica para cada zona del implante:

5

10

15

20

25

30

35

40

1. respuestas inflamatorias:

a. Leucocitos polimorfonucleares

b. Linfocitos

c. Eosinofilos

d. Plasmocitos

e. Macrofagos

f. Celulas gigantes

g. Necrosis

h. Degeneracion

2. Respuestas de cicatrizacion:

a. Fibrosis

b. Infiltrado graso

Cada categona de respuesta se puntuo utilizando la escala siguiente:

0 = normal

0,5 = muy ligera

1 = pequena

2 = moderada

3 = fuerte

El tamano relativo del area afectada se puntuo evaluando la anchura del area desde la interfase implante/tejido a las areas no afectadas que tienen las caractensticas de tejido normal y vascularizacion normal. El tamano relativo del area afectada se puntuo utilizando la escala siguiente:

0 = 0 mm, ningun sitio

0,5 = hasta 0,5 mm, muy ligera

1 = 0,6 - 1,0 mm, pequeno

2 = 1,1-2,0 mm, moderado

3 = > 2,0 mm, marcado

La prueba de implantacion intramuscular se realizo en base a las referencias siguientes:

1. ISO 10993-6, 1994, Evaluacion biologica de productos sanitarios - Parte 6: Pruebas para efectos locales despues de la implantacion.

2. ISO 10993-12, 2002, Evaluacion biologica de dispositivos sanitarios - Parte 12: Preparacion de muestras y materiales de referencia.

3. ASTM F981-04 2004, Practica estandar para la evaluacion de la compatibilidad de biomateriales para implantes quirurgicos con respecto al efecto de los materiales en musculos y huesos.

4. F763-04 ASTM 2004, Practica estandar para la deteccion a corto plazo de materiales de implante.

5. ISO/IEC 17025, 2005, Requisitos Generales para la competencia de Laboratorios de Ensayo y Calibracion.

Los resultados de la prueba de implantacion intramuscular se evaluaron en base a los siguientes criterios:

1. Puntuacion calculada: Para cada sitio implantado, se determina una puntuacion total. La puntuacion media de los sitios de prueba para cada animal se compara con la puntuacion media de los sitios de referencia para ese animal. Se calcula la diferencia media entre los sitios de ensayo y de referencia para todos los animales y la puntuacion de biorreactividad inicial se asigna de la manera siguiente:

0-1,5 Sin reaccion*

> 1,5-3,5 reaccion debil

> 3,5-6,0 reaccion moderada

> 6,0 reaccion fuerte

5 * Un calculo negativo se presenta como cero (0).

2. Modificacion de la puntuacion: El observador de la patologfa resena el nivel de biorreactividad calculado. En base a la observacion de todos los factores (p. ej., el tamano relativo, modelo de respuesta, inflamatoria frente a resolucion), el observador de la patologfa puede revisar la puntuacion de la biorreactividad. La justificacion de la modificacion a la puntuacion se presenta en el informe narrativo (Un informe narrativo descriptivo sobre la 10 biocompatibilidad del material de prueba lo proporciona el observador de la patologfa).

6.4.2.2 Resultados

Los resultados indicaron que el producto experimental no era reactivo cuando se implantaba durante 4 semanas (Puntuacion de biorreactividad de 0,2) en comparacion con la referencia positiva Surgicel; y no reactiva (Puntuacion de biorreactividad de 0,0) en comparacion con el referencia negativa de polietileno de alta densidad (plastico de 15 referencia negativa).

Observacion clmica. La Tabla II a continuacion muestra los resultados de la evaluacion macroscopica del producto experimental y los sitios de implante de referencia no indicaban senales significativas de inflamacion, encapsulacion, hemorragia, necrosis ni decoloracion en el periodo de 4 semanas. Algunos sitios de la prueba y la mayona de referencias positivas, Surgicel, no se observaron macroscopicamente y secciones en serie se sometieron a 20 evaluacion microscopica.

Sitio del tejido: T1 T2 T3 T4 Promedio de la prueba C1-1 C1-2 C1-3 C1-4 Promedio de C1 de referencia C2-1 C2-2 C2-3 C2-4 Promedio de C2 de referencia

Inflamacion: 0 NSF 0 NSF 0 NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Encapsulation: 0 NSF 0 NSF 0 NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Hemorragia: 0 NSF 0 NSF 0 NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Necrosis: 0 NSF 0 NSF 0 NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Decoloration: 0 NSF 0 NSF 0 NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Total: 0 N/A 0 N/A N/A N/A N/A N/A 0 0 0 0

5

Animal n°: 60961

Inflamacion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 NSF 0 0

Encapsulacion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 NSF 0 0

Hemorragia: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 NSF 0 0

Necrosis: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 NSF 0 0

Decoloracion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 NSF 0 0

Total: N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 0 0 N/A 0

Animal n°: 60968

Inflamacion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Encapsulacion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Hemorragia: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Necrosis: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Decoloracion: NSF NSF NSF NSF N/A NSF NSF NSF NSF N/A 0 0 0 0 0

Total: N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 0 0 0 0

10

T = zona de la prueba (se sometieron secciones representativas a evalucion microscopica)

C1 = Surgicel (Debido a la naturaleza del material, se sometieron secciones representativas a evalucion microscopica)

C2 = Polietileno de alta densidad de referencia negativa (Plastico de referencia negativa)

15 Escala de puntuacion

0 = sin reaccion 2 = reaccion moderada NSF = ningun sitio encontrado

1 = reaccion debil 3 = reaccion fuerte N/A = no aplicable

Observaciones del sitio de implantacion (microscopicas). La Tabla III a continuacion muestra los resultados de la evaluacion microscopica de los sitios de implante del producto experimental indicados sin senales significativas de inflamacion, fibrosis, hemorragia, necrosis o degeneracion en comparacion con cada uno de los sitios del producto 5 de referencia. La puntuacion de la biorreactividad para el periodo de 4 semanas (promedio de tres animales) fue de 0,2, (C1 - Surgicel) y 0,0 (C2 - Plastico de referencia negativa) indicando que no hay reaccion en comparacion con cualquiera de los sitios de implante de referencia. El patologo senalo que habfa un infiltrado polimorfico e histiocftico (macrofagos) moderado en todo el producto experimental in situ que no fue inesperado dada la naturaleza del material de ensayo.

10 Tabla III

Observaciones macroscopicas Implantacion en 4 semanas

Animal n°: 60959

Categorias: Sitios de la prueba** Sitios de referencia

Reaccion: T1 T2 T3 C1-1 C1-2 C1-3 C1-4 C2-1 C2-2 C2-3 C2-4

Restos extranos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Tamano relativ. del area afectada: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Polimorfos: 0,5 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Linfocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Eosinofilos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Plasmocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Macrofagos: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Celulas gigantes: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Degeneracion: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Necrosis: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Fibrosis: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Infiltrado graso: 0,0 0,0 0,5 0,0 0,5 0,0 0,5 0,5 0,5 0,0 0,5

Total: 1,5 2,0 2,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,5

15 T = Zona de la prueba C1 = Surgicel

C2 = Polietileno de alta densidad de referencia negativa (Plastico de referencia negativa) Puntuacion del animal de la prueba (Promedio*) = 2,0 Puntuacion del animal con C1 (Promedio*) = 1,5 20 Puntuacion del animal con C2 (Promedio*) = 1,4

Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C1) = 0,5 Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C2) = 0,6 * Utilizado en el calculo de puntuacion de la biorreactividad.

** Ningun sitio encontrado en T4.

Categorlas: Sitios de la prueba** Sitios de referencia**

Reaccion: T1 T2 T3 C1-1 C1-3 C1-4 C2-1 C2-2 C2-3

Restos extranos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Tamano relativ. del area afectada: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Polimorfos: 0,0 0,0 0,5 0,5 0,0 0,5 0,5 0,5 0,5

* Linfocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Eosinofilos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Plasmocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Macrofagos: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Celulas gigantes: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Degeneracion: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0

* Necrosis: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Fibrosis: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Infiltrado graso: 0,0 0,5 0,0 0,5 0,0 0,5 0,5 0,5 0,5

Total: 1,5 2,0 2,0 2,5 1,5 2,5 2,5 2,5 2,5

5

T = Zona de la prueba C1 = Surgicel

C2 = Polietileno de alta densidad de referencia negativa (Plastico de referencia negativa) Puntuacion del animal de la prueba (Promedio*) = 1,8 10 Puntuacion del animal con C1 (Promedio*) = 2,2 Puntuacion del animal con C2 (Promedio*) = 2,5

Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C1) = -0,4 Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C2) = -0,7 * Utilizado en el calculo de puntuacion de la biorreactividad.

15 ** Ningun sitio encontrado en T2, C1-2 ni C2-4.

Categorlas: Sitios de la prueba** Sitios de referencia**

Reaccion: T1 T2 T3 T4 C1-1 C1-2 C1-3 C2-1 C2-2 C2-3 C2-4

Restos extranos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Polimorfos: 0,0 0,5 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,5 0,5 0,0 0,5

* Linfocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Eosinofilos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Plasmocitos: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Macrofagos: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Celulas gigantes: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Degeneracion: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Necrosis: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

* Fibrosis: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

* Infiltrado graso: 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Total: 2,0 2,5 2,0 2,5 2,0 1,5 2,0 2,5 2,5 2,0 2,5

5

T = Zona de la prueba C1 = Surgicel

C2 = Polietileno de alta densidad de referencia negativa (Plastico de referencia negativa) Puntuacion del animal de la prueba (Promedio*) = 2,3 10 Puntuacion del animal con C1 (Promedio*) = 1,8 Puntuacion del animal con C2 (Promedio*) = 2,4

Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C1) = 0,5 Puntuacion del animal (Puntuacion promedio de la prueba - Puntuacion promedio de C2) = -0,1 * Utilizado en el calculo de puntuacion de la biorreactividad.

15 ** Ningun sitio encontrado en C1-4.

C1 C2

Puntuacion del animal 60759 = 0,5 0,6

Puntuacion del animal 60961 = -0,4 -0,7 Puntuacion del animal 60968 = 0,5 -0,1

20 Puntuacion de la biorreactividad = 0,2 = sin reaccion Puntuacion de la biorreactividad = -0,1 = sin reaccion

6.4.4 Prueba de Inyeccion intracutanea - ISO 10993-10

Se evaluo el potencial del cloruro de sodio (NaCl) para inyectables al 0,9% de USP y de extractos de aceite de semillas de algodon (ASA) del producto experimental para producir irritacion despues de la inyeccion intradermica en conejos White de Nueva Zelanda. Los sitios del producto experimental no mostraron una reaccion biologica 5 significativamente mayor que los sitios inyectados con el producto de referencia. Sobre la base de los criterios del protocolo, el producto experimental se considera un irritante insignificante y cumple los requisitos de las normas ISO 10993-10. Los resultados se muestran a continuacion en la Tabla IV.

Tabla IV

Puntuaciones de la reaccion en la piel de la prueba intradermica 10 Extracto en NaCl

Animal n°: Vehfculo Tiempo Cifras de puntuacion de los sitios (ER/ED)



: T-1 T-2 T-3 T-4 T-5 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5


: 0 horas+ 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

61917: NaCl 24 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 48 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 72 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 0 horas+ 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

61919: NaCl 24 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 48 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 72 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Total: 0,0 0,0

+ = Inmediatamente despues de la inyeccion, no utilizado para los criterios de evaluacion.

Puntuacion media total* para el producto experimental = 0,0 Puntuacion media total* para el producto de referencia = 0,0

Diferencia entre la puntuacion media total del producto experimental y el producto de referencia = 0,0 - 0,0 = 0,0

15

Extracto en ASA

Animal n°: Vetnculo Tiempo Cifras de puntuacion de los sitios (ER/ED)



: T-1 T-2 T-3 T-4 T-5 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5


: 0 horas+ 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

61917: ASA 24 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 48 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 72 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 0 horas+ 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

61919: ASA 24 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 48 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0


: 72 horas 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Total: 0,0 0,0

+ = Inmediatamente despues de la inyeccion, no utilizado para los criterios de evaluacion. Puntuacion media total* para el producto experimental = 0,0 Puntuacion media total* para el producto de referencia = 0,0

5 Diferencia entre la puntuacion media total del producto experimental y el producto de referencia = 0,0 - 0,0 = 0,0 ER = Eritema; ED = Edema; T = Sitios de prueba; C = Sitios de referencia * Puntuacion media total = Puntuaciones totales de eritema mas edema divididas por 12

(2 animales x 3 periodos de puntuacion x 2 categonas de puntuacion)

6.4.5 Prueba de maximizacion de Kligman - ISO 10993-10

10 Cloruro de sodio (NaCl) para inyectables al 0,9% de USP y extractos de aceite de semillas de algodon (ASA) del producto experimental no provocaron ninguna reaccion intradermica en cobayas Hartley en la prueba de provocacion (0% de sensibilizacion), despues de una fase de provocacion. Por lo tanto, tal como se define en el sistema de puntuacion de Kligman, esta es una reaccion de grado I y el producto experimental se clasifica como con potencial alergenico debil. Sobre la base de los criterios del protocolo, una tasa de sensibilizacion de grado I no se 15 considera significativa y el producto experimental cumple con los requisitos de las normas ISO 10993-10. Los resultados se muestran a continuacion en la Tabla V.

Datos del examen de la piel

Grupo: Animal n° Sexo 03 o LO CM Puntuaciones 26° dfa 27° dfa Porcentaje de animales sensibilizados Potencial alergenico

: 1 Macho 0 0 0

: 2 Macho 0 0 0

: 3 Macho 0 0 0

: 4 Macho 0 0 0

Producto: 5 Macho 0 0 0 0% Debil

experimental: 6 Hembra 0 0 0

(Extracto de NaCl): 7 Hembra 0 0 0

: 8 Hembra 0 0 0

: 9 Hembra 0 0 0

: 10 Hembra 0 0 0

: 11 Macho 0 0 0

: 12 Macho 0 0 0

: 13 Macho 0 0 0

Producto: 14 Macho 0 0 0

experimental: 15 Macho 0 0 0 0% Debil

(Extracto de ASA): 16 Hembra 0 0 0

: 17 Hembra 0 0 0

: 18 Hembra 0 0 0

: 19 Hembra 0 0 0

: 20 Hembra 0 0 0

: 21 Macho 0 0 0

: 22 Macho 0 0 0

Referencia: 23 Hembra 0 0 0 0% Debil

negativa (NaCl): 24 Hembra 0 0 0

: 25 Hembra 0 0 0

: 26 Macho 0 0 0

: 27 Macho 0 0 0

Referencia: 28 Hembra 0 0 0 0% Debil

negativa (ASA): 29 Hembra 0 0 0

: 30 Hembra 0 0 0

: 31 Macho 2 1 0

Referencia: 32 Macho 2 2 1

positiva (DNCB): 33 Hembra 3 2 1 100% Extremo

: 34 Hembra 3 2 1

: 35 Hembra 3 3 2

Tasa de sensibilizacion: Grado Clase

0-8: I Debil

9-28: II Leve

29-64: III Moderada

65-80: IV Fuerte

81-100: V Extrema

5 Los resultados de la prueba se interpretan en base al porcentaje de sensibilizacion observado.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina que comprende fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina, en donde (i) la mayona de las fibras irradiadas tienen menos de aproximadamente 15 pm de longitud, y (ii) la composicion (a) aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un analisis con MTT y/o no libra de la apoptosis a las celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano, y (b) no es reactiva cuando se ensaya en una prueba de implantacion intramuscular
2. La composicion segun la reivindicacion 1, en donde la mayona de las fibras tienen un espesor o diametro de 1-2 pm.
3. La composicion segun la reivindicacion 1, en donde la mayona de las fibras tienen menos de aproximadamente 10 pm de longitud.
4. La composicion segun la reivindicacion 1, en donde al menos el 50% de las fibras tienen aproximadamente 4 pm de longitud.
5. La composicion segun la reivindicacion 1 o 2, en donde la mayona de las fibras tienen entre aproximadamente 2 y 15 pm de longitud.
6. La composicion segun cualquier de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos el 70% de monosacaridos de N- acetilglucosamina de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina estan acetilados.
7. La composicion segun cualquier de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el 100% de monosacaridos de N- acetilglucosamina de la poli-p-1—4-N-acetilglucosamina estan acetilados.
8. Un metodo para producir una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina, dicho metodo comprende la irradiacion de fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina, de tal manera que (i) la mayona de las fibras irradiadas tienen menos de aproximadamente 15 pm de longitud, y (ii) la composicion (a) aumenta la tasa metabolica de celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un analisis con MTT y/o no libra de la apoptosis a las celulas endoteliales de la vena del cordon umbilical humano privadas de suero en un ensayo de exclusion de azul de tripano, y (b) no es reactiva cuando se ensaya en una prueba de implantacion intramuscular, produciendo de este modo la composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina.
9. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian como fibras secas, una membrana de fibras secas o un material liofilizado seco.
10. El metodo segun la reivindicacion 9, en donde las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian por irradiacion gamma a 500-2.000 kgy.
11. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se formulan como una suspension, una lechada o una torta humeda para irradiacion.
12. El metodo segun la reivindicacion 11, en donde las fibras de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina se irradian por irradiacion gamma a 100-500 kgy.
13. Una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina que puede obtenerse por el procedimiento segun una de las reivindicaciones 8 a 12.
14. Una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 13 para su uso en un metodo para el tratamiento de una herida en un ser humano, en donde el metodo comprende la etapa de preparacion de un vendaje para ser aplicado por via topica a una herida en un ser humano que lo necesita.
15. La composicion para su uso segun la reivindicacion 14, en donde el metodo comprende la etapa de preparacion de un vendaje para la aplicacion repetida cada 5 a 35 dfas.
16. Una composicion de poli-p-1—4-N-acetilglucosamina como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 13 para su uso en un metodo para el tratamiento de una herida en un ser humano, en donde el metodo comprende la aplicacion por via topica de un vendaje que comprende dicha composicion de poli-p-1 —»4- N-acetilglucosamina a una herida en un ser humano que lo necesita y repetir la aplicacion cada 5 a 35 dfas.
17. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 16, en donde el ser humano es un diabetico, un fumador, un hemofflico, una persona infectada con el VIH, una persona obesa, una persona sometida a radioterapia o una persona con ulcera venosa por estasis.
18. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 16, en donde el ser humano es una persona con ulcera venosa por estasis.

5

10

15

20

25
19. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 18, en donde la herida es una herida cronica, una herida quirurgica o una herida por quemadura.
20. La composicion para su uso segun las reivindicacion 19, en donde la herida cronica es una ulcera diabetica, una ulcera venosa por estasis, una ulcera por insuficiencia arterial o una ulcera de decubito.
21. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 20, en donde el vendaje se prepara para ser retirado antes de la aplicacion repetida.
22. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 20, en donde el vendaje se prepara para no ser retirado antes de la aplicacion repetida.
23. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 22, en donde la poli-p-1^4-N-acetilglucosamina es una poli-p-1^4-N-acetilglucosamina de microalgas o no es una poli-p-1^4-N-acetilglucosamina de crustaceo.
24. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 14 a 22, en donde al menos el 75% del vendaje consiste en poli-p-1^4-N-acetilglucosamina.
25. Un vendaje que comprende la composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 13.
26. La composicion segun la reivindicacion 13, o el metodo segun las reivindicaciones 8 a 12, en donde la mayona de las fibras estan comprendidas entre aproximadamente 2 a 15 pm de longitud.
27. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 13 o 26, o el vendaje segun la reivindicacion 25, o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 o 26, en donde la longitud de las fibras se determina por microscopia electronica de barrido (SEM).
28. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 13, 26 o 27, o el vendaje segun la

reivindicacion 25 o 27, o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, 26 o 27, en donde el espectro

infrarrojo de las fibras de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina irradiada es sustancialmente similar o equivalente al de las fibras de poli-p-1^4-N-acetilglucosamina no irradiada.
29. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 13, 26 o 28, o el vendaje segun la

reivindicacion 25, 27 o 28, o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, o 26 a 28, en donde la

prueba de implantacion intramuscular es un implantacion de 4 semanas en el tejido del musculo paravertebral de un conejo basada en la Organizacion Internacional para la Normalizacion de las Directrices.