BRPI0922410B1 - Microrganismo recombinante geneticamente modificado para converter 5aminopentanoato em um polímero ou copolímero de polihidroxialcanoato (pha) do mesmo compreendendo 5-hidróxi-valerato, e método para a produção de polímeros ou copolímeros de polihidroxialcanoato (pha) com base em carbonos dos mesmos - Google Patents

Abstract

ORGANISMO RECOMBINANTE GENETICAMENTE MODIFICADO PARA CONVERTER SEMIALDEÍDO DE GLUTARATO OU 5-AMINOPENTANOATO EM UM MONÔMERO, POLÍMERO OU COPOLÍMERO COM 5 CARBONOS DO MESMO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE MONÔMEROS COM BASE EM 5 CARBONOS, POLÍMEROS OU CO-POLÍMEROS DOS MESMOS, MÉTODO PARA A SUPER PRODUÇÃO DE GLUTARATO A PARTIR DE SUBSTRATOS DE CARBONO RENOVÁVEIS, 1,5-PENTANODIOL Trata-se de hospedeiros recombinantes para a produção de poli(hidróxi alcanoatos) e de métodos de produção de poli(hidróxi alcanoatos) a partir de substratos de carbono renováveis. Também são apresentados determinados hospedeiros recombinantes que produzem substâncias químicas com 5 carbonos como o 5-amino-pentanoato (5AP), 5-hidróxi-valerato (5HV), glutarato e 1,5-pentanodiol (PDO). Uma modalidade confere um hospedeiro recombinante expressando um gene que codifica uma enzima heteróloga selecionada do grupo que consiste em uma poli(hidróxi alcanoato) sintetase e uma 5-hidróxi-valerato-CoA (5HV-CoA) transferase, em que o hospedeiro produz um polímero que contém 5-hidróxi-valetato. Preferencialmente, o hospedeiro expressa tanto uma poli (hidróxi alcanoato) sintetase quanto uma 5HV-CoA transferase. O hospedeiro pode ser procariítico ou eucariótico. Um hospedeiro procariótico preferencial é a E. coli. Os polímeros produzidos pelos hospedeiros recombinantes podem ser homopolímeros ou copolímeros de 5-hidróxi-valerato. Um copolímero preferencial é o poli(3-hidróxi-butirato-(...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, em geral, a organismos trangênicos que produzem poli(hidróxi-alcanoatos) e a co-polímeros do mesmo que contêm 5- hidróxi-valerato e intermediários químicos que contêm cinco átomos de carbono (substâncias químicas C5).

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica o benefício da prioridade para o pedido de patente provisório no US 61/122.250, depositado em 12 de dezembro de 2008 e incorporado ao presente a título de referência a níveis admissíveis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os poli(hidróxi alcanoatos) (PHAs) são plásticos biodegradáveis que podem ser utilizados para produzir, sem limitação, filmes (por exemplo, filme de embalagem, filme agrícolas, filme palhagem), pinos de golfe, capas e invólucros, suportes agrícolas e estacas, papel e revestimentos de placa (por exemplo, para copos, pratos, caixas, etc), produtos termomoldados (por exemplo, bandejas, recipientes, potes de iogurte, potes de planta, tigela de macarrão, moldes, etc.), armações (por exemplo, para itens eletrônicos), sacolas (por exemplo, sacola de lixo, sacolas de mercearia, sacolas de comida, sacolas compostas, etc.), artigos de higiene (por exemplo, fraldas, produtos de higiene feminina, produtos de incontinência, lenços descartáveis, etc.) e revestimentos para produtos pelotizados (por exemplo, fertilizante pelotizado, herbicidas, pesticidas, sementes, etc.).

PHAs têm sido também utilizados para desenvolver dispositivos biomédicos incluindo sutures, dispositivos de reparo, emplastros de reparo, lingas, emplastros cardiovasculares, pinos ortopédicos, barreiras de adesão, endopróteses expansíveis (stents), dispositivos de reparo/regeneração de tecido guiados, dispositivos de reparo de cartilagem articular, guias de nervos, dispositivos de reparo de tendão, suportes de medula óssea e curativos de feridas.

Os Poli(hidróxi alcanoatos) podem ser produzidos por um processo de fermentação. Os métodos de fermentação existentes para a produção de poli(hidróxi alcanoatos) utilizam microrganismos do tipo selvagem ou transgênicos cultivados em substratos específicos a fim de produzir a composição de polímero PHA desejada. Em muitos casos os polímeros de interesse são copolímeros do (D)-isômero de 3-hidróxi-butirato copolimerizado com outros 3, 4 ou 5- hidroxiácidos. Esses copolímeros são produzidos como inclusões granulares dentro das células e são copolímeros aleatórios. O copolímero poli(3-hidróxi- butirato-co-5-hidróxi-valerato) (PHB5HV) e o homopolímero poli(5-hidróxi- valerato) (P5HV) são industrialmente utilizáveis como materiais e plásticos com a vantagem de que são materiais biodegradáveis e bioreabsorvíveis. Para datar esses materiais têm sido produzidos alimentando-se petróleo derivado de substratos de 5 carbonos como ácido 5-hidróxi valérico (5HV) ou 1,5-pentanodiol a um microrganismo que tem a capacidade de metabolizar essas substâncias para o 5HV-Coenzima A de monômero ativado e polimeralizar este pela ação de uma polimerase PHA para formar os polímeros PHB5HV ou P5HV, os polímeros PHB5HV e P5HV produzidos por esses métodos são somente parcialmente feitos a partir de recursos renováveis e são custosos devido ao alto custo dos substratos de petróleo de 5 carbonos. É altamente desejável usar substratos de carbono renováveis de não petróleo como matéria-prima para a produção de polímeros PHV5HV e P5HV ambos a custo inferior e fornecer materiais que sejam inteiramente feitos a partir de recursos renováveis. É também desejável desenvolver processos para a produção desses polímeros que reduzam a produção de fases do efeito estufa. Recursos renováveis adequados incluem matérias-primas de carboidrato disponíveis da agricultura incluindo uma ou mais matérias-primas selecionadas dentre: amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose, arabinose e matérias-primas de aminoácidos incluindo lisina e prolina.

Sendo assim, é um objetivo da invenção fornecer os organismos recombinantes e processos através dos quais genes podem ser introduzidos em produtores de poli(hidróxi alcanoato) do tipo selvagem ou geneticamente modificado para criar novas cepas que sintetizam monômeros, como 5-hidróxi- valerato, que são produzidos a partir de substratos que não são derivados de petróleo.

Um objetivo adicional da invenção é fornecer técnicas e procedimentos para projetar estavelmente os organismos recombinantes que sintetizam PHAs que contém 5-hidróxi-valerato tanto como constituinte único quanto como um co- monômero.

É outro objetivo da invenção fornecer técnicas e procedimentos para projetar de forma estável os organismos recombinantes que sintetizam substâncias químicas com 5 carbonos como 5-aminopentanoato (5AP), glutarato e 1,5 pentanodiol (PDO).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 5HV que contém Biopolímeros PHA

Hospedeiros recombinantes para a produção de poli(hidróxi alcanoatos) (PHAs) que compreendem monômeros 5-hidróxi-valerato (5HV) e métodos de produção PHAs que compreendem monômeros 5HV a partir de substratos de carbono renováveis são fornecidos. Determinados hospedeiros recombinantes que produzem substâncias químicas com 5 carbonos como 5~aminopentanoato (5AP), 5HV, glutarato e 1,5 pentanodiol (PDO) são também fornecidos.

Uma modalidade confere um hospedeiro recombinante que expressa genes que codificam a poli(hidróxi alcanoato) (PHA) sintetase e a 5-hidróxi- valerato-CoA (5HV-CoA) transferase ou 5HV-CoA sintetase e pelo menos um transgene que codificam uma enzima heteróloga envolvidas nas in trajetórias catabólicas da lisina em que o hospedeiro produz um polímero PHA que contém monômeros de 5HV quando o organismo é fornecido com um substrato de carbono renovável selecionado dentre: lisina, amido, sacarose, glicose, lactose, frucrose, xilose, maltose, arabinose ou combinações das mesmas e o nível de monômero de 5HV produzido é mais alto na ausência de expressão de ditos transgene(s). Um hospedeiro exemplificativo expressa um ou mais genes que codificam lisina 2-monooxigenase, 5-aminopentanomidase, 5-aminopetanoate transaminase, semialdeído de glutarato reductase, 5-hidróxi-valerato CoA- transferase e poli(hidróxi alcanoato) sintetase a fim de produzir um polímero PHA que contém monômeros de 5HV. Preferencialmente o hospedeiro tem deleções ou mutações em genes que codificam semialdeído de glutarato desidrogenase e/ou um exportador de lisina que codificam genes. Hospedeiros particularmente adequados também têm a capacidade à super produção de lisina e são resistentes a análogos da lisina tóxicos, como S~(2-aminoetil) cisteina.

Em uma modalidade adicional um ou mais dos genes que codificam PHA sintetase, 5HV-CoA transferase ou 5HV-CoA sintetase são também expressos a partir de um transgene.

Em outra modalidade, o organismo recombinante alimenta lisina em combinação com um ou mais substratos de carbono renováveis selecionados dentre: amido, sacarose, glicose, lactose, frucrose, xilose, maltose, arabinose ou combinações das mesmas de tal modo que um 5HV que contém um polímero PHA seja produzido e o polímero seja recuperado a partir das células.

Em outra modalidade, o organismo recombinante alimenta um ou mais substratos de carbono renováveis selecionados dentre: amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose, arabinose ou combinações das mesmas de tal modo que um 5HV que contém polímero PHA seja produzido e o polímero seja recuperado a partir das células.

Os polímeros produzidos pelos hospedeiros recombinantes podem ser homopolímeros ou copolímeros de monômeros de 5HV. Um copolímero preferencial é PHB5HV. Outros polímeros utilizáveis produzidos pelos hospedeiros recombinantes são os copolímeros poli(3-hidróxi-propionato-co-5- hidróxi-valerato) e poli(4-hidróxi-butirato-co-5-hidróxi-valerato) e o homopolímero P5HV.

O hospedeiro pode ser procariótico ou eucariótico. Hospedeiros procarióticos preferenciais são E. coli, Ralstonia eutropha, Alcaligenes lotus e C. glutamicum.

Os hospedeiros recombinantes para a produção de PHA polímeros a partir de lisina, ou um ou mais substrato de carbono renovável selecionado a partir de amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose, arabinose ou uma combinações das mesmas são também fornecidos. Um hospedeiro exemplificative expressa lisina 2-monooxigenase, 5-aminopentanomidase, 5- aminopetanoate transaminase, semialdeído de glutarato reductase, 5-hidróxi- valerato CoA-transferase e poli(hidróxi alcanoato) sintetase a fim de produzir um polímero que inclui 5HV. O polímero é produzido com uso de lisina e um ou mais substratos de carbono renovável selecionados dentre amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose e arabinose como uma matéria-prima. Preferencialmente, o hospedeiro tem deleções em semialdeído de glutarato desidrogenase e uma exportação de lisina que codificam genes.

Produção de 1,5-Pentanediol

Outro hospedeiro recombinante é geneticamente modificado para sobrexpressar 5-hidróxi-valerato CoA transferase, propionaldeído desidrogenase CoA dependente e 1,3-propanodiol desidrogenase a fim de produzir 1,5 pentanodiol. O 1,5 pentanediol é produzido com uso de 5-hidróxi-valerato, lisina amido, sacarose, glicose, lactose, trucrose, xilose, maltose e arabinose sozinhas ou em combinações como matéria-prima. Preferencialmente, o hospedeiro recombinante tem deleções em adhE, idhA e ackA-pta e expressa lisina 2- monooxigenase, 5-aminopentanamidase, 5-aminopetanoate transaminase e um ou mais glutarato ou succinato-semialdeído reductase que codificam genes. Hospedeiros particularmente adequados têm a capacidade de uma super produção de lisina e são resistentes a análogos da lisina tóxicos, como S-(2- aminoetil) cisteina. Preferencialmente, o organismo tem uma a atividade reduzida ou nenhuma atividade de desidrogenase do semialdeído de glutarato.

Um método para a produção de 1,5-pentanodiol a partir de substratos de carbono renováveis é fornecido onde um organismo recombinante alimenta um substrato de carbono renovável e 1,5-pentanodiol é produzido, secretado ao meio e recuperado a partir do mesmo.

Em outra modalidade a invenção fornece 1,5-pentandiol produzido a partir de recursos renováveis.

Produção de Ácido Glutárico

Hospedeiros recombinantes para a super produção glutarato (ácido glutárico) a partir de lisina, ou um ou mais substratos de carbono renovável selecionado dentre amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose e arabinose, ou uma combinação do mesmo são também fornecidos. Um hospedeiro exemplificative expressa lisina 2-monooxigenase, 5- aminopentanamtdase, 5-aminopetanoate transaminase e um ou mais semialdeídos de glutarato desidrogenase que codificam genes. Hospedeiros particularmente adequados têm a capacidade para a super produção de lisina e são resistentes a análogos da lisina tóxicos, como S-(2-aminoetil) cisteina.

Um método para a super produção glutarato a partir de substratos de carbono renováveis é fornecido onde um organismo recombinante alimenta um substrato de carbono renovável selecionado a partir de lisina, amido, sacarose, glicose, lactose, frucrose, xilose, maltose e arabinose, ou combinações das mesmas e glutarato produzido em excesso, secretado ao meio e recuperado a partir do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra as várias moléculas de 5 carbonos que podem ser produzidas biologicamente a partir de recursos renováveis em algumas instâncias essas moléculas baseadas em recurso renovável podem ser interconvertidas com uso de química padrão e utilizadas para produzir polímeros etc. por processos de polimerização química.

A Figura 2A é um diagrama esquemático que mostra trajetórias bioquímicas para 5-hidróxi-valerato que contém poli(hidróxi alcanoato) polímeros e substâncias químicas com 5 carbonos como 5-aminopentanoato (5-APO), glutarato, δ-valero lactona (DVL) e 1,5 pentanodiol. São também mostradas trajetórias metabólicas concorrentes que podem ter que ser removidas ou as atividades reduzidas (conforme indicado por um xis (X)) para alcançar fluxo de carbono ideal para os produtos desejados listados anteriormente. A Figura 2 B mostra enzimas que catalisam as reações biossintéticas: (1) lisina 2- monooxigenase, EC 1.13.12.2; (2) 5-aminopentanomidase (conhecido, ainda, como δ-aminovaleramidase), EC 3.5.1.30; (3) 5-aminopentanoato transaminase (conhecido, ainda, como δ-aminovalerato transaminase), EC 2.6.1.48; (4) succinato-semialdeído reductase (conhecido, ainda, como 5-oxopentanoate reductase), EC 1.1.1.61 ; (5) CoA-transferase, EC 2.8.3.n; (6) Acil-CoA sintetase, EC 6.2.1.3; (7) PHA sintetase, EC 2.3. Ln; (8) β-ceto acil-CoA tiolase, EC 2.3.1.9; (9) acetoacetil-CoA reductase, EC 1.1.1.36; (10) glutarato-semialdeído desidrogenase, EC 1.2.1.20.

A Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra as trajetórias bioquímicas de uma rota alternativa de L-lisina a 5-aminopentanoato através da cadaverina e 5-aminopentanal.

A Figura 4 é um diagrama esquemático que mostra trajetórias bioquímicas de L-prolina a 5-aminopentanoato.

A Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra trajetórias bioquímicas de alfa-cetoglutarato a semialdeído de glutarato, um intermediário metabólico a fim de produzir 5-hidróxi-valerato e seus derivados e glutarato.

A Figura 6 é um diagrama esquemático que mostra trajetórias bioquímicas de oxaloacetato, um intermediário do ciclo TCA, a L-lisina.

A Figura 7 é um diagrama esquemático que mostra trajetórias bioquímicas a 1,5 pentanodiol.

A Figura 8A é uma cromatografia que mostra tempo (minutos) versus abundância total de íons da cultura de célula processada da cepa 3291. A Figura 8B é um espectro de íon da cultura de célula processada da cepa 3291 que mostra a taxa de massa para carga "m/z" versus sua abundância de íon (unidades relativas).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

São empregados na presente invenção vários termos que são definidos e esclarecidos na seção a seguir.

O termo "copolímero PHA" refere-se a um polímero composto de pelo menos dois monômeros diferentes do ácido hidróxi-alcanóico.

O termo "PHA homopolímero" refere-se a um polímero que é composto de um único monômero do ácido hidróxi-alcanóico.

Conforme o uso na presente invenção, um "vetor" é uma replicação, como um plasmídeo, fago, ou cosmídeo, em cada outro segmento de DNA pode ser inserido de forma que viabilize a réplica do segmento inserido. Os vetores podem ser vetores de expressão.

Conforme o uso na presente invenção, um "vetor de expressão" é um vetor que inclui uma ou mais sequências de controle de expressão.

Conforme o uso na presente invenção, uma "sequência de controle de expressão" é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e/ou tradução de outra sequência de DNA.

Conforme o uso na presente invenção, "ligados de forma operacional” significa incorporados em uma construção genética para que as sequências de controle de expressão de uma sequência de código de interesse.

Conforme o uso na presente invenção, "transformado" e "transfectado" abrangem a introdução de um ácido nucléico em uma célula por várias técnicas conhecidas na área.

Conforme o uso na presente invenção "produzido excessivamente" significa que o composto particular é produzido a uma quantidade alta no organismo modificado comparado ao organismo não modificado.

Conforme o uso na presente invenção os termos "matéria-prima renovável", "substrato de carbono renovável" e "substrato renovável" são todos usados de modo passível de mudança.

Os "Plasmídeos" são designados pela letra "p" em caixa baixa precedidos e/ou seguidos por letras maiusculas e/ou números.

Conforme o uso na presente invenção o termo "heterólogo" significa a partir de outro hospedeiro. O outro hospedeiro pode ser de espécies iguais ou diferentes.

II. Trajetórias Metabólicas para a Produção de Polihidróxialcanoatos e Substâncias Químicas com 5 Carbonos

Os organismos recombinantes que têm enzimas para as trajetórias bioquímicas para produção de 5-hidróxi-valerato que contém polímeros de polihidróxialcanoato e substâncias químicas com 5 carbonos como 5- aminopentanoato (5AP), 5-hidróxi-valerato (5HV), glutarato e 1,5 pentanodiol (PDO) são fornecidos. Os hospedeiros procarióticos ou eucarióticos são geneticamente modificados a fim de expressar as enzimas necessárias a fim de produzir 5-hidróxi-valerato, polímeros do mesmo, ou as substâncias químicas com 5 carbonos reveladas das matérias-primas baseadas em fontes renováveis. As trajetórias enzimáticas para a produção dos produtos desejados são fornecidas abaixo.

A. 5-aminopentanoato

O 5-aminopentanoato (5AP) pode ser produzido em duas etapas enzimáticas da L-lisina, um a-aminoácido, com 5-aminopentanamida como o intermediário (Figura 2). A primeira destas enzimas, a lisina 2-monooxigenase é a primeira etapa enzimática na trajetória de degradação da lisina de várias cepas pseudomonas (Takeda e Hayaishi, J. Biol. Chem. 241:2.733 a 2.736; (1966); Hayaishi, Bacteriol. Rev. 30:720 a 731 (1966); Reitz e Rodwell, J. Biol Chem. 245: 3.091 a 3.096 (1970); Flashner e Massey, J. Biol. Chem. 249: 2.579 a 2.586 (1974)). O gene que codifica a lisina 2-monooxigenase foi identificado em Pseudomonas putida e chamado de davB (Revelles et ai., J. Bacteriol. 187:7.500 a 7.510 (2005)). A segunda etapa enzimática converte 5-aminopentanamida em 5AP e é catalisada por 5-aminopentanomidase (Reitz et al., Anal. Biochem. 28:269 a 272 (1969); Reitz e Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3.091 a 3.096 (1970)), que é codificada por davA em P. putida (Revelles et al., J. Bacteriol. 187:7.500 a 7.510(2005)).

Como mostrado na Figura 3, uma trajetória alternativa pode ser utilizada para converter L-lisina em 5 AP em três reações enzimáticas que incluem uma lisina descarboxilase a fim de produzir cadaverine, a putrescina transaminase para formar 5-aminopentanal e um y-aminobutiraldeído desidrogenase para biossintetizar 5AP.

Como esquematizado na Figura 4, 5AP pode também ser produzido da L- prolina, ao invés da L-lisina, em duas reações enzimáticas quem incluem uma prolina racemase para biossintetizar D-prolina e uma prolina redutase para formar 5 AP.

B. 5-hidróxi-valerato

A biossíntese de outro elemento químico com 5 carbonos, 5HV, pode ocorrer do 5AP com 2 etapas enzimáticas como esquematizado na Figura 2. O 5AP é convertido em semialdeído de glutarato pela transaminase de 5AP (Reitz e Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3.091 a 3.096 (1970)) e um gene da P. putida que foi identificado e nomeado davT (Espinosa-Urgel e Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67:5.219 a 5.224 (2001)). Como esquematizado no Exemplo 7, diversos genes recombinantes de redutase semialdeído foram clonados e testados para investigar qual enzima codificada converteu de forma eficaz semialdeído de glutarato em 5HV. A proteína hipotética ATEG_00539 foi descoberta para catalisar de forma eficaz essa reação e foi, portanto, renomeada de gsaR para redutase semialdeído de glutarato.

Em algumas bactérias termofílicas e fungos inferiores incluindo leveduras, a lisina é sintetizada através da trajetória do α-aminocetoadipato (Xu, Cell Biochem. Biophys. 46:43-64 (2006)) em que o 2-cetoadipato é o quarto intermediário e portanto um precursor em potencial para as substâncias químicas C5 como glutarato e 5HV, assim como parar 5HV que contém polímeros PHA. Esta trajetória inicia-se do a-aminocetoadipato e acetil-CoA para biossintetizar 2- cetoadipato como mostrado na Figura 5. As cepas hospedeiras de E. coli recombinante que expressam estas quatro enzimas foram mostradas a fim de produzir 2-cetoadipato (Andi et al, Biochem. 43:11.790 a 11.795 (2004); Jia et al., Biochem. J. 396:479 a 485 (2006); Miyazaki et al, J. Biol. Chem. 278:1.864 a 1871 (2003)). O 2-cetoadipato pode ser convertido por um a-aminocetoadipato desidrogenase em glutaril-CoA devido à similaridade estrutural de a- aminocetoadipato e 2-cetoadipato. O Glutaril-CoA pode ser convertido por um semialdeído sucínico (SSA) desidrogenase como sucinil-CoA sintetase (SucD) (Sôhling e Gottschalk J. Bacterid. 178:871 a 880 (1996)), novamente devido à similaridade estrutural do sucinil-CoA e glutaril-CoA.

C. glutarato

A biossíntese da substância química com 5 carbonos, glutarato, procede do semialdeído de glutarato através de uma reação de desidrogenase (Ischihara et al, J. Biochem. (Tokyo) 49:154 a 157 (1961); Reitz e Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3091-3096 (1970)) como esquematizado na Figura 2. O gene davD foi identificado para codificar tal atividade de desidrogenase do semialdeído de glutarato em P. putida (Espinosa-Urgel e Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67:5.219 a 5.224 (2001); Revelles et al., J. Bacterid. 186:3.439 a 3.446 (2004)). O glutarato é utilizável para a produção de polímeros como poliésteres, poliéster polióis e poliamidos. O número ímpar de átomos de carbono (isto é, 5) é utilizável em, por exemplo, diminuir a elasticidade do polímero. Em adição, o 1,5-pentanodiol é um plastificante comum e precursor para poliésteres que é manufaturado por hidrogenação glutarato e seus derivados (Werle e Morawietz, "Alcohols, Polyhydric" in: Ulhnann's Encyclopedia of Industrial Chemistry: 2002, Wiley-VCH: Weinheim. DOI 10.1002/14356007.a01_305).

D. poli (5-hidróxi-valerato)

A biossintese de um homopolimero que consiste de poli (5-hidróxi-valerato) (conhecido, ainda, como P(SHV)) PHA pode proceder de 5HV por meio de 5- hidróxivalerate-CoA. Duas reações enzimáticas diferentes podem catalisar a primeira etapa, isto é,tanto por uma CoA-transferase conforme descrito por Huisman et al. (Patente n° U.S. 7.229.804), Sõhling e Goltschalk (J. Bacterid. 178:871-880 (1996)) e Eikmanns e Buckel (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371 :1077- 1082 (1990)), ou por uma CoA-sintetase conforme descrito por van Beilen et al. (Molec. Microbiol. 6:3121-3136 (1992)). A polimerização de 5-hidróxi-valerato-CoA pode ser catalisada por PHA polimerase como codificada pela Ralstonia eutropha phaCI (Peoples e Sinskey, J. Biol. Chem. 264:15.298 a 15.303 (1989)). Alternativamente, a proteína de fusãoPhaC3/C5 sintetase pode ser empregada conforme descrito por Huisman et al. (Patente N° U. S 6.316.262).

E. poli (3-hidróxi-butirato-co-5-hidróxivalerato)

A biossintese de um copolímero que inclui poli (3-hidróxi-butirato-co-5- hidróxi-valerato) (conhecido, ainda, como P(3HB-co-5HV)) pode ocorrer por suprimento de moléculas precursoras de 3-hidróxi-butiril-CoA (3HB-CoA) e monômero de 5-HV-CoA. Conforme esquematizado Figura 2, a 3HB-CoA pode ser biossintetizada a partir de acetil-CoA por meio de 2 etapas enzimáticas: (i.) uma reação de β-cetoacil-CoA tiolase que converte acetil-CoA em acetoacetil- CoA (Nishimura et al., J. Biol. Chem. 116:21-27 (1978)) com uso de genes adequados como, mas não limitado a, bktB de Ralstonia eutropha (Slater et al5 J. Bacteriol. 180(8):1.979 a 1.987 (1998)) e (ii.) uma reação de acetoacetil-CoA reductase que converte acetoacetil-CoA em 3HB-CoA (Fukui et al., Biochim. Biophys. Acta 917:365-371 (1987)) com uso de genes adequados como, mas não limitado a, phaB de Bacillus megaterium (McCool e Cannon, J. Bacteriol. 181(2):585 a 592 (1999)). Conforme esquematizado anteriormente, o co-polímero PHA pode ser sintetizado por várias sintetases de PHA.

F. Lisina

A Figura 6 representa a trajetória biossintética do metabolismo de lisina em E. coli. As linhas pontilhadas e sólidas no centro do diagrama indicam inibição de reação alostérica e repressão transcripcional por L-lisina, respectivamente, que fornece alvos para modificações genéticas necessárias para aumentar a produção de L-lisina em células de hospedeiro recombinante como E. coli.

G. 1,5-pentanediol

A Figura 7 fornece uma vista geral da produção de 1,5-pentanodiol (PDO) de 5HV. O 5HV pode ser convertido em 5HV-CoApor uma CoA-transferase conforme descrito por Huisman et al. (Patente n° 7.229.804), Sõhling e Gottschalk (J. Bacterid. 178:871 a 880 (1996)) e Eikmanns e Buckel (BiolChem. Hoppe- Seyler 371:1.077 a 1.082 (1990)), ou por uma CoA-sintetase conforme descrito por van Beilen et al. (Molec, Microbiol. 6:3.121 a 3.136 (1992)). O 5HV pode ser convertido em 5-hidróxipentenal por um propionaldeído desidrogenase ou álcool desidrogenase como pduP de Salmonella typhimurium (Leal, Arch. Microbiol. 180:353 a 361 (2003)) ou eutE de E. coli (Skraly, Patente n° WO 2004/024876). O 5-Hidróxipentenal pode ser convertido em PDO por1,3-propanodiol desidrogenase ou álcool desidrogenase como dhaT de Klebsiella pneumoniae (Tong et al., Appl. Environ. Microbiol. 57(12):3.541 a 3.546 (1991)).

H. 5-hidróxi-valerato-co-3-hidróxi-propionato

Um copolimero que contém 5-hidróxi-valerato-co-hidróxiproprionato pode ser produzido a partir de cepas 5HV. E. coli K12 que foram fadR+ (degradação de ácido graxo reprimido (FAD)) ou fadR+ (FAD constitutivo) são transfectados com ácidos nucléicos que expressão poli(hidróxi alcanoato) e 5-hidróxi-valerato transferase CoA. As cepas E. coli preferenciais incluem MG 1655 e LS5218 (Spratt et al., J. Bacteriol 146(3): 1166-1169 (1981)). Como mostrado na Tabela 6, a análise GC-FID indicou que LS5218 [pMS93] produziu 6,4%dcw PHA, com uma composição de polímero de 52% 5HV e 48% 3HP. MG1655 [pMS93], por outro lado, fez 63,1 %dcw PHA que consistia em apenas 5HV. Além disso, a análise GC-MSde LS5218 [pMS93] confirmou a presença de 3HP na amostra de polímero. Desse modo, o sistema ativo FAD em LS5218 é capaz de sintetizar 3HP a partir de NaSHV.

III. Produção de Organismos trangênicos para a produção de Poli(hidróxi alcanoatos) e substâncias químicas com 5 carbonos

Organismos trangênicos para a produção de poli(hidróxi alcanoatos) e substâncias químicas com 5 carbonos são produzidos usando técnicas convencionais conhecidas na técnica.

A. Genes para a produção de Produtores Transgênicos P(SHV)

Os genes clonados e/ou avaliados por cepas hospedeiras que produzem 5HV-que contém PHA e 5-produtos químicos são apresentados abaixo na Tabela 1A, junto com o Número de Comissão de Enzimas apropriado (número EC) e com 5 as referências. Como discutido adicionalmente abaixo, alguns genes foram sintetizados para otimização de códons, enquanto outros foram clonados através de PCR do DNA genômico do organismo nativo ou de ocorrência natural.Tabela 1A. Genes em cepas hospedeiras microbianas produzindo 5HV-que contém PHA e 5-produtos químicos.

Outras proteínas capazes de catalisar as reações listadas na Tabela 1A podem ser descobertas através da consulta de literatura científica, patentes ou através de buscas BLAST contra, por exemplo, nucleotídeo ou base de dados de proteína em NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os genes sintéticos podem ser 5 criados para fornecer uma rota fácil a partir da base de dados de sequência para DNA físico. Tais genes sintéticos são projetados e fabricados a partir da base, usando códons para aperfeiçoar expressão de proteína heteróloga, otimizar características necessárias para o sistema de expressão e hospedeiro. Companhias como, por exemplo, DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025, USA) 10 fornecerão tal serviço de rotina. As proteínas que podem catalisar as reações bioquímicas listadas na Tabela 1A são fornecidas nas Tabelas 1B-1AA.Tabela 1B. Homólogos adequados para a proteína DavB (lisina 2- monooxigenase, de Pseudomonas putida KT2440, EC N-, 1,13,12,2, que age em

Uma modalidade fornece um transgênico ou organismo recombinante para produzir P(5HV) ou outros PHAs que contém monômeros 5HV. O organismo pode ser procariótico ou eucariótico. Procariotos adequados incluem mas não estão limitados a bactérias, por exemplo E. coli.

B. Métodos e Materiais para produzir Organismos Recombinantes ou Células 1. Organismos ou Células a serem Modificados

Organismos ou células que podem ser modificados para produzir 5HV que contém biopolímeros PHA, 5-aminopentanoato (5 AP), 5-hidróxi-valerato (5HV), glutarato e 1,5-pentanodiol (PDO) inclui eucariotas e procariotos. Procariotos adequados incluem bactérias. Inúmeras bactérias podem ser geneticamente modificadas a fim de produzir poli(hidróxi alcanoatos). Exemplos incluem E. coli, Alcaligenes lotus, Alcaligenese eutrophus, Azotobacter, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, Salmonella, Klebsiella, Corynebacterium glutamicum, Rhodoccocus e Brevibacterium lactofermentum. Procariotos adicionais incluem, mas não estão limitados a, eubactéria, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Diversas cepas de E. coli estão disponíveis publicamente, como a cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coliXl 776 (ATCC 31.537); (ATCC 27.325) e K5772 (ATCC 53.635).

Estes incluem organismos que já produzem poli(hidróxi alcanoatos), modificados para utilizar substratos alternativos ou incorporar monômeros adicionais, ou a fim de aumentar a produção, e organismos não produzem poli(hidróxi alcanoatos), mas que expressam nada para algumas das enzimas necessárias para a produção de poli(hidróxi alcanoatos). R. eutropha é um exemplo de um organismo que produz PHAs naturalmente. E. coli e C. glutamicum são exemplos de organismos em que seria necessário de introduzir transgênicos que encodificam as enzimas para produção de PHA.

Para a produção das substâncias químicas C5 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidróxi-valerato (5HV), glutarato e 1,5-pentanodiol, em que as mesmas não são polimerizadas para 5-hidróxi-valerato que contem PHAs mas secretados no meio de crescimento, então as mesmas são úteis para usar microorganismos industriais que são utilizados para manufaturar lisina. Corynebacterium glutamicum, incluindo suas subespécies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium efficiem e Brevibacterium divaricatum, que foram usadas para a produção industrial de L- lisina (Microbiol. Monogr.5:39 a 70 (2007)), é um exemplo dos microorganismos que podem ser desenvolvidos para a produção de glutarato, 1,5-pentandiol, 5- hidróxi-valerato e outros produtos que podem ser produzidos a partir de lisina via trajetórias de degradação de lisina descritas nesta invenção. E. coli modificado também tem sido usado para a produção de lisina. Os procedimentos para obter cepas de C. glutamicum para a produção de L-lisina como mutagênese aleatória e subsequente seleção do mutante que resistiu aos tóxicos análogos da lisina, como S-(2-aminoetila) cistina e introdução de alelos mutantes de alvos do gene como lysC e horn que encodificam aspartato quinase e homoserina desidrogenase, respectivamente, são bem estabelecidos e foram descritos (Curr. Opin. Microbiol. 9:268 a 274 (2007)). Aspartato quinase está sujeito a uma inibição de reação por treonina e lisina e a liberação desta enzima proveniente da inibição de reação é estimada como uma das características chave para desenvolver cepas produtoras de lisina. Outro alvo de engenharia para o desenvolvimento das cepas capazes de produzir materiais químicos derivados a partir de trajetórias de degradação de lisina é a exportação de lisina como LysE em C. glutamicum. A mutagênese do gene lysE da produção de cepas de C. glutamicum L-lisina irão prevenir a excreção de lisina proveniente do citoplasma e portanto aumenta o rendimento de produtos via trajetória criada para converter lisina em produto. Métodos para construir cepas de C glutamicum para a produção de PHAs como PHB também são conhecidas na técnica (Jo, S-J et. Al., 2006. J. Bioscience e Bioengineering 102: 233 a 236).

Organismos eucarióticos ou células adequadas incluem fungos como fungos filamentosos ou levedura. O Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado.

2. Métodos para Geração de Organismos Trangênicos i. Transfecção extracromossômica

DNA vetorial pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas via transformação convencional ou técnicas de transfecção. Conforme o uso na presente invenção, os termos "transformação" e "transfecção" são destinados para referirem-se a uma variedade de técnicas reconhecidas pela técnica para a introdução de um ácido nucléico estrangeiro (por exemplo, um DNA) em uma célula hospedeira, incluindo uma transformação química como a coprecipitação do fosfato de cálcio ou do cloreto de cálcio, DEAE-dextrano-mediado transfecção, lipofecção, ou eletroporação. Técnicas de transformação convencional são descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Transformações em levedura são tipicamente executadas de acordo com o método de Van Solingen et al. J Bact, 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sd. (USA), 76:3829 (1979).

ii. Integração Cromossômica

Métodos para a incorporação de construções planejadas de gene em um DNA cromossômico de células bacterianas de Gram negativo e de Gram positivo são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Mecanismos de integração típicos incluem recombinação homóloga usando DNA linearizado em cepas recBC ou recD followed by transdução P1 (Miller 1992, A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual & Handbook for Escherichia coli e Related Bacteria. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) plasmideos especiais (Hamilton et al., J Bacteriol. 171 :4617 (1989); Metcalf et al., Plasmid 35: 1 (1996); documento de patente U.S.N0 5,470,727 para Mascarenhas et al.), ou por inserção aleatória usando sistemas baseados em transposão (Herrero et al. J Bacteriol. 172:6557 (1990); Peredelchuk & Bennett, Gene 187:231 (1997); Documento de patente U.S. N° 5,595,889 para Richaud et al.;) O Documento de patente U.S. N° 5,102,797 to Tucker et al.). Em geral, as cepas microbianas que contém uma inserção são selecionadas com base de uma gene de resistência antibiótica adquirida que é suprida pela construção integrada. No entanto, a complementação de mutantes auxotróficos também pode ser usada. Os mesmos métodos podem ser utilizados para introduzir quaisquer dos transgenes codificando as várias trajetórias metabólicas descritas neste documento. Alguns desses métodos são descritos em maiores detalhes abaixo com respeito aos genes pha.

A expressão dos genes de interesse para uma integração cromossômica pode ser alcançado pela inclusão de uma sequência ativadora de transcrição (promotor) na construção de DNA a ser integrada. Direcionada ao local, a recombinação homóloga pode ser combinada com uma amplificação de expressão dos genes de interesse, conforme descrito pelo documento de patente U.S. N° 5.000.000 para Ingram et al.

A integração cromossômica também pode ser alcançada pelos métodos de Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6640-6645 (2000)) e como usado no Exemplo 7, abaixo.

Uma série de cassetes de expressão foi desenvolvida para inserir genes heterólogos em cromossomos bacterianos. Esses cassetes são baseados no sistema de distribuição de transposão conforme descrito por Herrero et al., J Bacteriol. 172:6557-67 (1990); de Lorenzo et al., J Bacteriol. 172:6568 (1990). Embora esses sistemas especifiquem transferência conjugada mediada por RP4 e usa apenas a transposão Tn10 e Tn5, e qualquer combinação de extremidades de transposão e de sistemas de distribuição pode ser adaptada para a tecnologia descrita, resultando em uma produção de PHA homogênea e prolongada.

A seguinte aproximação geral é usada para a geração de produtores de PHB E. coli transgênico: (1) um gene (abr) de resistência antibiótica sem promotor é clonado no poliligante de um plasmídeo adequado como pUC18Notl ou pUC18Sfil de forma que maior parte do poliligante é à montante de abr, (2) genes pha, genes que codificam uma transaminase GABA, um succínico semi-aldeído redutase e uma 4-hidróxi-butirato-CoA transferase são subsequentemente clonadas à montante de e na mesma orientação que o gene abr, (3) o cassete pha-abr é excisado como um fragmento Not\ ou Avril (Avrll reconhece o local Sf/1 em pUC18S/7l) e clonado nos locais correspondentes de qualquer plasmídeo como aqueles das séries pUT ou pLOF; (4) os plasmídeos resultantes são mantidos em cepas de E. coli Á pir e eletroporado ou conjugado na cepa escolhida de E. coli em que esses plasmídeos não se replicam; e (5) novas cepas em que o cassete pha-abr tenha se integrado com sucesso no cromossomo, são selecionadas em um meio seletivo para o hospedeiro (por exemplo, o ácido nalidíxico quando o hospedeiro é resistente ao ácido nalidíxico) e para o cassete (por exemplo, cloranfenicol, canamicina, tetraciclina, cloreto mercúrio, bialafos). Os integrantes pha resultantes são triados em meio mínimo na presença de glicose para crescimento e formação PHB.

Diversas modificações deste procedimento podem ser feitas. Se o marcador de resistência antibiótica sem promotor não é o usado, a inserção dos genes pha é selecionada baseada em um marcador presente no vetor e cepas integradas produzindo o nível desejado de PHA são detectadas por triagem para produção de PHA. Os genes pha podem ter,mas não precisam, de sequências de transcrição endógena, como sequências ativadoras à montante, local aglutinante de polímeroase RNA, e/ou sequências de operador, Se os genes pha não tenham tais sequências, a aproximação descrita é limitada ao uso de vetores como as séries pUT em que a transcrição pode proceder através das sequências de inserção. Essa limitação é devida a inabilidade da polímeroase RNA em ler através das regiões flanqueadoras Tn10 dos plasmídeos pLOF. O gene abr pode carregar suas próprias sequências de expressão se for assim desejado. Ao invés de um gene abr, a construção pode ser projetada de forma que um gene essencial sirva como um marcador seletivo quando a cepa hospedeira tem uma mutação no tipo de gene selvagem correspondente. Exemplos de genes úteis para esse propósito são geralmente conhecidos na técnica. Construções Diferentes podem ser integradas em um hospedeiro, ou subsequentemente ou simultaneamente, enquanto ambas construções carreguem diferentes genes marcadores. Usando eventos de integração múltipla, genes pha podem ser integrados separadamente, por exemplo, o gene polímeroase PHB é integrado primeiro como um phaC-cat, seguido por uma integração de genes de tiolase e redutase como um cassete phaAB-kan. Alternativamente, um cassete pode conter todos os genes pha enquanto que outro cassete contém apenas alguns genes pha requeridos a fim de produzir um polímero desejado PHA.

Em alguns casos um vetor de integração de transposão como pJMS11 (Panke et al. Appl. Enviro, Microbiol 64: 748-751) pode ser usado de tal modo que um marcador selecionável possa ser excisado do cromossomo da cepa integrada. Isso é útil por muitas razões incluindo fornecer um mecanismo para inserir construções de transposão múltipla usando o mesmo gene marcador excisado o marcador seguindo cada evento de inserção.

3. Fontes de pha e Outros Genes Envolvidos na Formação PHA

Uma referência geral para genes envolvidos na formação PHA é Madison e Huisman, 1999, Microbiology e Molecular Biology Reviews 63: 21-53. Os genes pha podem ser derivados de diferentes fontes e combinados em um único organismo, ou da mesma fonte.

i. Redutase de Genes Codificadores

A Redutase de Genes Codificadores foi isolada de A. latus, R, eutropha (Peoples & Sinskey, J Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); Acinetobacter sp. (Schembri, et al., J Bacteriol. 177(15):4501-7 (1995)), C. vinosum (Liebergesell & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), P. acidophila, P. denitriflcans (Yabutani, et al., FEMS Microbiol. Lett. 133 (l-2):85-90 (1995)), R. meliloti (Tombolini, et al., Microbiology 141 :2553-59 (1995)) e Z ramigera (Peoples, et al., J. Biol. Chem. 262(l):97-102 (1987)). O documento de patente U.S. N° 7,229,804 expõe organismos trangênicos que produzem P4HB usando o gene 4HbD que codifica o 4-hidróxi-butirato desidrogenase de C kluyveri (Sohling e Gottschalk, J Bacteriol 178, 871 880 (1996)). 4hbD requer NADH. Redutases preferenciais incluem, mas não estão limitadas a aquelas que não requerem NADH. Redutases exemplificadoras incluem AKR7A5 de Mus musculus (Genlnfo identificador N° :27659727 )(Hinshelwood, A. et al. FEBS Letters 523:213-218 (2002), GHBDH de Arabidopsis thaliana (GI: 145338934) (Breitkreuz, K. et al. J. Biol Chem. 278:41552-41556, ATEGJ) 0539 de Aspergillus terreus (GI: 115491994).

ii. Transferase CoA e Sintetase CoA

Transferases CoA adequadas (EC 2.8.3.n) incluem mas não estão limitadas a orfZ de C. kluyveri. A sequência de orfZ é fornecida no documento de patente U.S. Na. 7,229,804 para Huisman et ai. e é incorporada como referência em sua totalidade. Outra transferase CoA adequada inclui abjT de C. aminobutyricum (Gerhardt et al., Arch Microbiol 74:189-199 (2000)). Outras enzimas que poderiam produzir Acil-CoA inclui sintetases CoA (EC 6.2.1.3). Essas enzimas usam ATP e liberam o CoA para catalisar a adição covalente de CoA ao ácido carboxílico e tem sido descritos em van Beilen et al. (Molec Microbiol (1992) 6:3121-3136) e Aquin et al, (WO 02/40690 A2).

iii. Genes codificadores de polímeroase PHA

Genes codificadores de polímeroase PHA tem sido isolados de Aeromonas caviae (Fukui & Doi, J Bacteriol. 179(15):4821-30 (1997)), A. latus, R. eutropha (Peoples & Sinskey, J Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); Acinetobacter (Schembri, et al., J Bacteriol. 177(15):4501-7 (1995)), C vinosum (Liebergesell & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), Methylobacterium extorquens (Valentin & Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol 39(3):309-17 (1993)), Nocardia corallina (GenBank Ace. No. AF019964), Nocardia salmonicolor, P. acidophila, P. denitrificans (Ueda, et al., J. Bacteriol 178(3):774- 79 (1996)), Pseudomonas aeruginosa (Timm & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 15-30 (1992)), Pseudomonas oieovorans (Huisman, et al., J Biol. Chem. 266:2191-98 (1991)), Rhizobium etli (Cevallos, et al, J Bacteriol 178(6): 1646-54 (1996)), R. meliloti (Tombolini, et al., Microbiology 141 (Pt 10):2553-59 (1995)), Rhodococcus ruber (Pieper & Steinbuchel, FEMS Microbiol Lett. 96(l):73-80 (1992)), Rhodospir[rilum rubrum (Hustede, et al., FEMS Microbiol. Lett. 93:285-90 (1992)), Rhodobacter sphaeroides (Steinbuchel, et al., FEMS Microbiol. Rev. 9(2- 4):217-30 (1992); Hustede, et al., Biotechnol Lett. 15:709-14 (1993)), Synechocystis sp. (Kaneko, DNA Res. 3(3): 109-36 (1996)), T. violaceae (Liebergesell & Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38(4: 493-501 (1993)) e Z ramigera (GenBank Ace. No. U66242).

Outros genes que não foram envolvidos na formação PHA, mas que compartilham homologia significativa com os genes pha e/ou produtos de gene correspondentes, também podem ser usados. Genes com homologia significativa ao gene phaB que codificam acetoacetil CoA reductase foram isolados de diversos organismos, incluindo Azospirillum brasiliense (N— de Acesso NCBI X64772, X52913) Rhizobium sp. (N~ de Acesso NCBI U53327, Y00604), E. coli (N° de Acesso NCBI D90745), Vibrio harveyi (N° de Acesso NCBIU39441), H. influenzae (N° de Acesso NCBIU32701), B. subtilis (N° de Acesso NCBI U59433), P. aeruginosa (N° de Acesso NCBI U91631), Synechocystis sp. (N° de Acesso NCBI D90907), H. pylori (N° de Acesso NCBI AE000570), Arabidopsis thaliana (N° de Acesso NCBI X64464), Cuphea lanceolata (N° de Acesso NCBI X64566) e Mycobacterium smegmatis (N° de Acesso NCBI U66800)

III. Métodos de produção PHAs que contém 5HV e Substâncias químicas C5

Métodos para a produção de poli(hidróxi alcanoatos) usando fontes de carbono renovável conforme matéria-prima é fornecida. Em uma modalidade preferencial, bactérias são transformadas ou transfectadas com um ou mais construtos de ácido nucléico que codificam os genes necessários para a produção de 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidróxi-valerato (5HV), glutarato e 1,5-pentanodiol (PDO) e polímeros do mesmo a partir de fontes renováveis.

IV. Métodos de uso

Os organismos transgênicos apresentados podem ser utilizados para produzir substâncias químicas C5 como 5-arninopentanoatlo (5AP), 5-hidróxi- valerato (5HV), glutarato e 1,5-pentanodiol (PDO) assim como biopolímeros de PHA que compreendem monômeros de 5HV. No caso da produção de substâncias químicas C5, o organismo recombinante que expressa o(s) transgene(s) apropriado(s), incluindo, opcionalmente, os genes que codificam trajetórias de competição inativadas ou excluídas, é cultivado em um substrato de fermentação renovável. O substrato é selecionado a partir de carboidratos, lisina, óleos vegetais de prolina, ácidos graxos ou combinações dos mesmos. Uma combinação útil para algumas modalidades seria uma mistura de glicose e lisina. Outra combinação adequada seria sacarose e lisina. Preferencialmente, a matéria-prima compreende predominantemente um substrato, por exemplo, glicose ou sacarose. Substratos de carboidrato adequados compreendem um ou mais açúcares selecionados a partir de glicose, frutose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e maltose. Para a produção de substâncias químicas C5, o organismo recombinante é cultivado no substrato renovável até que o produto final desejado acumule no meio de crescimento, em cujo momento as células são removidas por floculação, sedimentação, centrifugação ou filtração e o produto é recuperado a partir do meio isento de célula por procedimentos padrões. Tais procedimentos são conhecidos na técnica pela recuperação de outros ácidos e dióis produzidos por fermentação, como ácido láctico, ácido succínico, ácido 3- hidróxipropiônico, 1,3-propanodiol e 1,4-butanediol.

Os organismos recombinantes podem ser usados para a produção de fermentação de 5HV que contém biopolímeros de PHA incluindo os homopolímeros P5HV e 5HV que contêm copolímeros de PHA ao cultivar os organismos na presença de fontes de carbonos renováveis, como glicose, lisina, etc. e outros substratos selecionados para fornecer um polímero ou copolímero desejados. Os organismos recombinantes são cultivados nos substratos até que os polímeros de PHA acumulassem dentro das células em cujo momento os polímeros de PHA são extraídos das células por métodos conhecidos a aqueles versados na técnica. O 5HV que contém polímeros de PHA obtidos a partir dos organismos pode ser usado em uma faixa ampla de aplicações de plástico industrial, como para filmes, fibras, espumas, bens moldados por injeção, garrafas moldadas a sopro, revestimento de papel e similares. Eles também podem ser usados para aplicações biomédicas, incluindo aumento de tecido, a fim de produzir válvulas de coração, como suturas e a fim de produzir enxertos vasculares. Co-polímeros exemplificadores incluem, mas não se limitam a, PHB5HV e p(3-hidróxi-propionato-co-5-hidróxi-valerato) p(4-hidróxi butirato-co-5- hidróxi-valerato). Os organismos recombinantes podem ser geneticamente modificados para incluir genes adicionais como β-cetotiolase e acetoacetil-CoA reductase conforme necessário para a produção de copolímeros.

A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme compreendido comumente por aquele versado na técnica ao qual a invenção apresentada pertence. .

Exemplos Exemplo 1: Biosíntese de P(5HV) homopolímero a partir de 5-hidróxi- valerato de sódio

Como uma primeira demonstração da habilidade de sintetizar 5HV-que contém PHAs, 5-hidróxi-valerato de sódio (Na5HV) foi fornecido como alimento a cepas de E. coli que expressam ambas uma CoA transferase ou CoA sintetase e uma PHA sintetase, para determinar se o monômero de 5HV fornecido como alimento seria aceito e incorporado diretamente no P(5HV) homopolímero. Na5HV foi sintetizado através de hidrólise de base de δ-valero lactona (DVL). Esse procedimento envolvei adicionar 0,1 mol de NaOH a 50 ml de metanol com agitação até que dissolvido. A isto, 0,1 mol de DVL foi adicionado com agitação vigorosa. O precipitado resultante foi seco, dissolvido em água, ajustado ao pH a 8,5 e esterilizado por filtro com um filtro de 0,2 μM. A análise de solução salínea foi realizada em um HPLC de Waters Alliance para confirmar que todo o DVL foi saponificado.

Combinações diferentes de genes de CoA transferase/sintetase e PHA sintetase foram testadas para encontrar a melhor combinação adequada para a produção de P(5HV). As CoA transferases/sintetases testadas foram C. kluyverí orfZ e P. oleovorans alkK e as PHA sintetases foram R. eutrophaphaC e T. pfenigii phaEC (Tabela 1A). Todas as cepas usadas nessa experiência foram derivadas de MG1655 (Jensen, J. Bacteriol, 175(11):3.401 a 3.407 (1993)). Quatro plasmídeos de expressão (pFS92, pMS96; pMS93 e pMS102), que contêm, cada um, combinações diferentes de CoA transferase/sintetase e PHA sintetase, foram construídos conforme descrito nos parágrafos seguintes.

Construção de Plasmídeo

O plasmídeo pFS30 foi construído pela digestão de pAET41 (Peoples e Sinskey, J. Biol Chem. 264(26): 15.298 a 15.303 (1989)) com Xmal e Stul para remover um fragmento que contém R. eutropha phaC e seu promotor nativo (PRe). Plasmídeo pAET41 é um vetor pUC18 (N° de Acesso L08752) que contém um fragmento cromossômico de R. eutropha H16 englobando o gene phaC. O plasmídeo pFS16 (Skraly e Peoples, Patente U.S. N° 6.323.010), que é um derivado de pTrc99a (Pharmacia, Uppsala, Suécia) que contém o gente orfZ de C. kluyveri (Tabela 1A) sob o promotor PTFC, foi digerido com BamHI, embotado com T4 polimerase e digerido uma segunda vez com Xmnl anteriormente à ligação com o fragmento PR6 -phaC Xmal-Stul. O plasmídeo resultante foi designado pFS30 e continha a fusão de operon phaC-orfZ sob o promotor contitutivamente expresso PRe.

O plasmídeo pFS92 foi feito em um processo de múltiplas etapas. Primeiro, T. pfenigii phaE foi amplificado a partir de pMON25893 (Reiser et al., Appl. Microbiol, Biotechnol 53(2):209 a 218 (2000)) com iniciadores FS-E5' e FS-E3', que contêm os sítios de restrição EcoRI e Acc65l modificados. O produto de PCR phaE foi, então, digerido com as enzimas de restrição enzymes EcoRI e Acc65l e ligado ao pTrcN digerido de maneira similar (Gerngross et al, Biochemistry 33:9.311 a 9.320 (1994)) para formar pFS89. A sequência de iniciador para FS- E5' é (5')-GGAATTCAGGAGGTTTTTATGAACGATACGGCCAACAAGACCAGC (SEQ ID NO:1) e a sequência de iniciador para FS-E3' é (5')- GGGGTACCTCACTGGCCGGTGGTGGGCTTGGTGGTCTTGCGGCG (SEQ ID NO:2). A seguir, T. pfenigii phaC foi ampliado a partir de pMON25894 (Reiser et al., Appl, Microbiol. Biotechnol. 53(2):209 a 218 (2000)) com os iniciadores FS-C5' e FS-C3', que contêm os sítios de restrição Acc65l e BamHI modificados. O produto de PCR phaC foi, então, digerido com as enzimas de restrição Acc65l e BamHI e ligado a pTrcN digerida de maneira particular para formar pFS90. A sequência de iniciador para FS-C5' é (5‘)- GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCG (SEQ ID NO:3) e a sequência de iniciador para FS-C3' é (5’)- CGGGATCCTCAGCCGCGTTCGTTCAGCCAGCGGCCGATCGCCG (SEQ ID NO:4). Posteriormente, T, pfenigii phaE e phaC foram clonados individualmente em pTrcN para formar pFS89 e pFS90, respectivamente, phaE foi clonado a montante de phaC ao digerir pFS89 com Mlul e Acc65l, isolando o fragmento que contém phaE e ligando-o a uma preparação digerida de maneira similar de pFS90. O plasmídeo resultante, pFS91, continha a fusão de operon phaEC sob o promotor PTI-C- Finalmente, pFS92 foi criado ao ligar um fragmento de MIul-BamHI de pFS91 que contém phaEC ao pFS16 que havia sido digerido com Mlul e BamHI. O plasmídeo pFS92 contém a fusão de operon phaEC-orfZ sob o promotor PTI-C-

O plasmídeo pMS96 foi feito por clonagem de alkK (ver Tabela 1A) em pFS91 a jusante de phaEC. Primeiramente, alkK foi ampliado por PCR a partir do DNA genômico de P. oleovorans com o uso dos iniciadores K5-1 e K3-1, que foram modificados para incorporar sítios de BamHI nas extremidades do produto de PCR. A sequência para o iniciador K5-1 é (5')- GCTGAGGATCCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAA TC (SEQ ID NO:5) e a sequência para o iniciador K3-1 é (5')- CTAGAGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID NO:6). Seguindo a ampliação, o fragmento de PCR alkK e pFS91 (descrito no parágrafo acima) foram digeridos com BamHI e ligados para formar pMS96. A orientação de alkK em pMS96 foi verificada como sendo a mesma direção que phaEC por digestão de enzima de restrição, garantindo, assim, a construção apropriada de uma fusão de operon phaEC-alkK sob o promotor PTrc-

Os plasmídeos pMS93 e pMS102 foram construídos ao primeiramente digerir pACYC 177 (N° de Acesso X06402) com BspHI para remover o marcador kan e ligando-no ao sítio único de BspHI de pFS30 para formar pFS73, que contém phaC-orfZ sob o controle dos promotores seguidos PTrc θ PRΘ- A região do promotor PRe foi removida ao substituir o fragmento de EcoRI-BspEI de pFS73 que contém ambos PRee 837 bp da extremidade 5' do phaC CDS por um fragmento de EcoRI-BspEI a partir de pKAS4 (Peoples et al., Patente U.S. N° 5.480.794) que continha apenas o 837 bp a partir da extremidade 5' de phaC. Esse plasmídeo resultante, que contém phaC-orfZ apenas sob o promotor Pjrc. foi designado pMS93. Para criar pMS102, o gene orfZ foi removido de pFS73 ao digerir com Dral e se auto-ligando à cadeia principal do plasmídeo para formar pMS74. O gene alkK foi ampliado por PCR a partir do plasmídeo pTrcN-A.eut- AlkK (descrito abaixo) com o uso de iniciadores K5-2 e K3-2. A sequência para o iniciador K5-2 é (5')-AATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC (SEQ ID NO:7) e a sequência para o iniciador K3-2 é (5’)- GATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID NO; 8). O plasmídeo pMS74 foi, então, digerido com Spel e Sbfl e, então, suas extremidades foram tornadas abruptas através de preenchimento Klenow e o fragmento de PCR de alkK ligado à cadeia principal abrupta de pMS74 para formar pMS92. O plasmídeo pMS92 contém, portanto, a fusão de operon XhsphaC-alkK sob o controle de promotores seguidos PTI-C e PRΘ- A fim de expressar o operon exclusivamente a partir do promotor Pjrc induzível por IPTG, a região do promotor PRe foi removida ao substituir o fragmento EcoRI-BspEI de pMS92 que contém ambos o PRe e 837 bp da extremidade 5' do phaC CDS com um fragmento de EcoRI-BspEI de pMS93 que continha apenas o 837 bp da extremidade 5' de phaC. Esse plasmídeo resultante, que contém sob o promotor PTCC, foi designado pMS102.

O plasmídeo pTrcN-A.eut-AlkK foi criado primeira mente através de alkK de amplificação por PCR de DNA genômico de P. oleovorans com o uso de iniciadores Posynrbs.c (5’-GGAATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATCAG) (SEQ ID NO:9) e Posynrbs.r (5'-CGGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTGCG) (SEQ ID NO: 10). O produto de PCR resultante foi digerido com EcoRI e BamHI e ligado a pTrcN similarmente digerido para criar pTrcN-AlkK. O promotor PRe foi, então, amplificado por PCR de DNA genômico de Ralstonia eutropha com o uso de iniciadores A.eutPhaG.c (5-GGAATTCGGATCCCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGC) (SEQ ID NO:11) e A.eut.EcoRl.r (5'-GGAATTCCCGGCTCCGGGATTGCCCTGGCCGGACT) (SEQ ID NO: 12). O produto de PCR resultante foi digerido com EcoRI e ligado a pTrcN-AlkK similarmente digerido a fim de criar pTrcN-A.eut-AHcK.

Os plasmídeos pFS92, pMS96, pMS93 e pMS102 foram individualmente transformados em MG1655 (Jensen, J Bacteriol. 175(11):3.401 a 3.407 (1993)) para criar quatro cepas portadoras de plasmídeo que continham diferentes combinações de CoA transferase/sintetase (orfZ ou alkK) e PHA sintetase (phaC ou phaEC). Estas cepas foram cultivadas em frascos de agitação de 250 ml para caracterizar produção de homopolímero P(5HV), conforme descrito na seção seguinte.

Meio, condições de crescimento e teste para a produção de homopolímero P(5HV) em culturas de frasco de agitação

Cada cepa MG 1655 portadora de plasmídeo foi cultivada de um dia para o outro em um tubo de teste que contém 3 ml LB (Sambrook ed Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (2001)) suplementado com antibiótico apropriado a 37°C com agitação de 250 rpm. Os antibióticos apropriados para cada cepa são como segue: 100 μg/ml de ampicilina foram adicionados, de um dia para o outro, às culturas de cepas MG1655 portadoras de pFS92 e pMS96; e 50 μg/ml de Km foram adicionados, de um dia para o outro, às culturas de cepas MG1655 portadoras de pMS93 e pMS102. No próximo dia, 0,5 ml de cada cultura de um dia para o outro foi utilizado para inocular um frasco de agitação que contém 50 ml de LB fresco suplementado com o antibiótico apropriado e cultivado a 37°C com agitação de 250 rpm. Em 3,5 horas, 0,1 mM de IPTG foi adicionado às culturas líquidas e em 5 horas, a cultura foi girada para baixo a 4150 rpm (centrífuga de bancada Sorvall Legend RT) e ressuspensa em 50 ml de meio de produção que contém 0,1 mM de IPTG e o mesmo antibiótico. O meio de produção consiste na solução de sais mínimos E2 que contém 10 g/l de glicose, 2,5 g/l de LB, 10 g/l de NaSHV5, 2mM de MgSC>4 e Solução de Sais Traço 1x. A solução estoque E2 50x consiste em 1,275 M de NaNH4HPO4-4H2O, 1,643 M de K2HPO4 e 1,36 M de KH2PO4. A Solução Estoque de Sais Traço 100x é preparada através da adição para cada 1 L de 1,5 N de HCL: 50 g de FeSO4-7H20, 11 g de ZnSO4-7H2O, 2,5 g de MnSO4-4H2O, 5 g de CuSO4-5H2O, 0,5 g de (NH4)6Mθ7θ24-4H2O, 0,1 g de Na2B4O? e 10 g de CaCI2-2H2O.

As culturas ressuspensas foram transferidas para frascos de agitação de 250 ml e incubadas a 3O°C durante 24 a 72 horas com agitação. Ao término do experimento, as culturas foram giradas para baixo a 4150 rpm, lavadas uma vez com água destilada, congeladas a -80°C durante pelo menos 30 minutos e liofilizadas de um dia para o outro. No próximo dia, uma quantidade medida de pélete de célula liofilizada foi adicionada a um tubo de vidro, seguido por 3 ml de reagente de butanólise que consiste em uma mistura de volume igual de 99,9% de n-butanol e 4,0 N de HCI em dioxano com 2 mg/ml de difenilmetano como padrão interno. Após tampamento dos tubos, os mesmos foram vortexados brevemente e colocados em um bloco de calor ajustado a 93°C durante seis horas com vortexação periódica. Posteriormente, o tubo foi resfriado até a temperatura ambiente antes da adição de 3 ml de água destilada. O tubo foi vortexado durante aproximadamente 10 s antes de ser girado para baixo a 620 rpm (centrífuga de bancada Sorvall Legend RT) durante 2 minutos. Foi pipetado 1 ml da fase orgânica em uma ampola de GC, que foi, então, analisada através de cromatografia gasosa-detecção de ionização de chama (GC-FID) (Hewlett- Packard 5890 Series II). A quantidade de homopolímero P(5HV) no pélete de célula foi determinada através de comparação contra curvas padrão que foram produzidas através da adição de quantidades definidas de DVL em reações de butanólise separadas. Três padrões de DVL que se situam entre 2 a 6 mg foram utilizados para criar curvas padrão.

Resultados experimentais

A Tabela 2 mostra que todos os construtos puderam gerar P(5HV). No entanto, MG1655 [pMS93] gerou significantemente mais P(5HV) que qualquer outra cepa demonstrando que a combinação de gene ideal para polimerizar P(5HV) é phaC e orfZ.Tabela 2. Produção de homopolímero P(5HV)

EXEMPLO 2: Biossíntese de copolímero P(3HB-co-5HV) de 5- hidroxivalerato de sódio

O próximo experimento serviu para demonstrar a produção do copolímero P(3HB-co-5HV) em uma cepa de E coli capaz de sintetizar os monômeros 3HB- CoA e 5HV-CoA e de incorporar os mesmos a PHA.

Construção da cepa

A cepa usada neste exemplo foi MBX2641, que é um derivado de MG 1655 que contém um operon que consistem em H16 bktB-B de R eutropha phaB-kan de megaterium aleatoriamente integrada ao cromossomo. Para executar a integração do operon, a cepa S17-IÀp/r (Miller e Mekalanos, J Bacteriol 170(6):2.575 a 2.583 (1988)) que contém pCJ022 (descrito abaixo) foi correspondido com MBX1987, que é um mutante resistente ao ácido nalidíxico de MG1655, com o uso de um protocolo tirado da literatura (De Lorenzo e Timmis, Methods Enzymol 235:386 a 405 (1994)). Os derivados de MBX1987 que transportam o cassete bktB-phaB-kan no cromossomo foram selecionados em placas de LB que contêm 30 μg/ml de ácido nalidíxico (NI) e 50 μg/ml de kanamicina (Km). Um tal integrante que exibe um fenótipo N1R KmR foi salvo como MBX2079. Então, phaEC-cat foi aleatoriamente integrado ao cromossomo de MBX2079 através da correspondência com uma cepa S17-1Ap/r que transporta o vetor de integração pUT-C16-cat (descrito abaixo). Os integrantes de MBX2079 que transportam o cassete phaEC-cat no cromossomo foram selecionados em placas de LB que contém 25 μg/ml de cloranfenicol (Cm). Diversos integrantes que possuem o fenótipo N1R KmR CmR foram agrupados e submetidos a nitrosoguanidina mutagênese (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)), com seleção em placas de LB que contêm 100 μg/ml de Cm. Um mutante foi isolado e designado MBX21 14. Finalmente, MBX2641 foi criado através da elevação de um lisado de P1 em MBX2114 e transduzido em MG 1655 conforme descrito por Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) com o uso de KmR como seleção. Um tai transdutante foi salvo e designado MBX2641, que é MG1655 com o cassete de gene bktB-phaB-kan aleatoriamente integrado ao genoma.

Os plasmídeos pFS92 (vide Exemplo 1) e pJB84 (construção descrito abaixo) foram individualmente transformados em MBX2641 que contém bktB- phaB-kan aleatoriamente integrado ao cromossomo.

Construção de plasmídeo

O plasmídeo pCJ022 foi produzido através da criação de um vetor de integração mini-TnJ que contém bktB-phaB a montante de um marcador kan. Para executar isto, o operon bktB-phaB foi montado em pSE380 (Invitrogen, Carlsbad, CA) primeiramente através de bktB de amplificação por PCR com iniciadores MS069 e MS070 de pMON25765 (Slater et al, J. Bacteriol 180(8): 1.979 a 1.987 (1998)). A sequência para o iniciador é (5’)-GGTGGATCCTTAAGAGGAGGTTTTTATGACGCGTGAAGTGGTAGTGG (SEQ ID NO: 13) e a sequência para o iniciador MS070 é (5’)-GGTGCTAGCTCAGATACGCTCGAAGATGGCG (SEQ ID NO: 14). O fragmento de PCR resultante foi digerido com BamHI e Nhel e ligado a pSE380 que foi cortado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pSE380- bktB. Posteriormente, phaB foi amplificado por PCR de pGMIO (McCool e Cannon, J Bacteriol 181(2):585 a 592 (1999)) com iniciadores MS071 e MS072. A sequência para o iniciador é (5')-GGTCCTAGGTTAAGAGGAGGTTTTTATGACAACATTACAAGGTAAAG (SEQ ID NO: 15) T e a sequência para o iniciador MS072 é (5’)-GGTGCGGCCGCTTACATGTATAAGCCGCCGTTAAT (SEQ ID NO; 16). O fragmento de PCR resultante foi digerido com Avrll e Notl e ligado a pSE38O-bktB que foi tratado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pSE380-bktBphaB19. Após o operon ter sido montado, o mesmo foi movido para pTrcN-kan (um derivado de pTrcN que teve o gene bla substituído por gene kan) através da digestão de pSE380-bklBphaB19 com EcoRI e Spel e da ligação do fragmento que contém bktB-phaB a pTrcN-kan que foi cortado com EcoRI e Xbal. O plasmídeo resultante foi designado pMS115. O operon bktB-phaB foi, então, transferido de pMS115 para o vetor de integração pBSL118 (Alexeyev et al., Can.J. Microbiol. 41: 1.053 a 1.055 (1995)) através da digestão de pMS115 e pBSL118 com BamHI e da ligação em conjunto a fim de produzir plasmídeo pCJ022, que foi utilizado para integrar bktB-phaB ao cromossomo de MG1655.

O plasmídeo pUT-C16cat foi produzido através da remoção de phaEC de pFS91 com EcoRI e Xbal e da clivagem abrupta das extremidades pegajosas com o uso de Klenow. O vetor de integração pUT-cat (De Lorenzo e Timmis, Methods Enzymol. 235:386 a 405 (1994)) foi digerido com Avrll, clivado abruptamente com o uso de preenchimento de Klenow e, então, ligado ao fragmento de phaEC. Após verificar que phaEC estava na mesma orientação como o marcador cat a jusante, o plasmídeo foi designado pUT-C16cat.

O plasmídeo pJB84 foi construído através da amplificação por PCR do marcador aacC (GmR) de pBSL202 (Alexeyev et al., Can. J, Microbiol 41 : 1.053 a 1.055 (1995)) com o uso de iniciadores JB123b e JB124a, que foram modificados para incluir sítios de BspHI, nas extremidades de flaqueamento 5’. A sequência para o iniciador JB123b é (5’)-TTATTTCATGAACCCTCGAATTGACGCGCTC (SEQ ID NO: 17) e a sequência para o iniciador JB124a is (5')- TTATTTCATGAGCTTATCGATACCGTCGACC (SEQ ID NO: 18). O fragmento de PCR resultante que contém o gene aacC foi digerido com BspHI e ligado a pMS93 que foi digerido com a mesma enzima para formar pJB84. Notar que esta última etapa foi efetuada para substituir o marcador bla (ApR) original em pMS93 com aacC (GmR) na mesma orientação.

Resultados experimentais

As cepas MBX2641 que transportam os plasmídeos pFS92 (descrito no Exemplo 1) ou pJB84 foram cultivadas e preparadas para análise por GC-FID conforme descrito no Exemplo 1. MBX2641 [pJB84] produziu mais copolímeros (69,5% dcw) e incorporou mais 5HV ao copolímero (82,3% PHA) conforme mostrado na Tabela 3.Tabela 3. Produção de P(3HB-co-5HV)

EXEMPLO 3: Composição de monômero 5HV ajustável no copolímero P(3HB-co-5HV) e efeito nas propriedades do material

A composição do copolímero foi modulada através da alteração das quantidades de NaSHV e glicose adicionadas ao meio de produção. As formas alternativas para realizar isto incluem (1) alimentar diferentes quantidades de L- lisina ao meio de crescimento a uma célula recombinante que pode produzir 5HV 5 de L-lisina conforme mostrado no Exemplo 6, ou (2) desregular genes de trajetória de L-lisina em células recombinantes que podem produzir 5HV de glicose através de L-lisina conforme mostrado no Exemplo 9 e 10.

Para demonstrar composição de monômero 5HV ajustável em copolímero P(3HB-co-5HV), cepa MBX2641 [pFS30] foi utilizada que expressa as enzimas 10 para trajetória 3HB [bktB e phaB) em adição à CoA-transferase (ou fZ) e PHA sintetase (phaC). Culturas paralelas de MBX2641 [pFS30] foram cultivados em ambas concentrações decrescentes de glicose (10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0 g/L) ou NaSHV (10, 5, 1,0,5, 0,1,0 g/L) e analisadas para teor de polímero como descrito no Exemplo 1. A tabela 4 mostra que diversas quantidades de 5HV podem ser 15 incorporadas no copolímero P(3HB-co-5HV).Tabela 4. Efeito de co-alimentado em incorporação de 5HV em P(3HB-co-5HV)

Em outro experimento, um total de 10 amostras de copolímero P(3HB-co- 5HV) que possuíam uma vasta gama de composições 5HV foram gerada e então 20 extraído para análise calorimetria diferencial de varredura (DSC). A tabela 5 mostra que a temperatura de transição de vidro (Tg) diminuiu à medida que a composição percentual de 5HV aumentou no copolímero P(3HB-co-5HV). Isto demonstra que uma vasta gama de propriedades de material pode ser obtida ao modular a composição de comonômero 5HV.Tabela 5. Propriedades de material de polímeros extraídos

EXEMPLO 4: Síntese de 3-hidróxi-propionato a partir de NaSHV através do sistema de degradação de ácido graxo

Para determinar se o sistema de degradação de ácido graxo (FAD) de E. coli poderia quebrar 5HV em acetil-CoA e 3-hidróxipropionil-CoA (3HP-CoA), plasmídeo pMS93 (ao expressar phaC-orfZ a partir de um promotor Ptrc; ver Exemplo 1) foi transformado em cepas E. coli K12 que foram fadR+, atoC+ (FAD reprimido) ou fadR, atoCconst (FAD desreprimido) MG1655 e LS5218 (Spratt et al, J Bacterial 146(3): 1166 a 1169 (1981)) foram utilizadas como as cepas fadR+, atoC+ e fadR, atoCconst, respectivamente. MG1655 [pMS93] e LS5218 [pMS93] foram testadas ao alimentar NaSHV em frascos de agitação como descrito no Exemplo 1. Análises de Espectroscopia de Massa (MS) de GC-FID e GC demonstraram que LS5218 [pMS93] produziu P(5HV-co-3HP), enquanto que MG 1655 [pMS93] não o fez (Tabela 6). Isto mostra que degradação ativa de ácido graxo produzirá 3HP a partir de 5HV.Tabela 6. Incorporação de 3HP em P(5HV-co-3HP)

EXEMPLO 5: Biossíntese de P(SHV) homopolímero a partir de L-lisina

A trajetória idealizada para converter L-lisina em P(SHV) é esquematicamente diagramada na Figura 2B e requer seis genes heterólogos para serem clonados e expressos em E. coli: P. putida davB, P. putida davA, P. putida davT, A, thaliana gsaRAt, C. kluyveri orfZ e R. eutropha phaC (ver Tabela 1 A). Uma estratégia de clonagem foi projetada de tal modo que os genes davBAT seriam clonados em pACYC184 (Chang e Cohen, J. Bacterid. 134: 1141 a 1156 (1978)) e gsaRAt, orfZ e phaC seriam clonados em pSE380. Etes plasmídeos são designados a receber pJB91 e pMZ28, respectivamente, e seus agrupamentos são descritos na próxima seção.

Construção de plasmídeo

Os locais múltiplos de clonagem de plasmídeo pSE380 foi amplificado por PCR com iniciadores JB134 (5'-TGAGCGGATAACAATTTCAC) (SEQ ID NO: 19) e JB135 (5’-AATAACACGTCAACGCAAAAAGGCCATCCGT) (SEQ ID NQ:20). O produto de PCR resultante foi cozido com BmgBI e clonado em plasmídeo pACYC184 que foi cozido com EcoRV e Nrul para criar pJB78.

O plasmídeo pJB91 foi construído em um processo de três etapas. Primeiro, os genes davBA de P. putida foram amplificados por PCR a partir de uma preparação genômica de DNA ao utilizar iniciadores JB136 e JB137, que foram modificados para incorporar locais de restrição Ndel e BsrGI, respectivamente, nas extremidades 5' e 3' do produto de PCR davBA, A sequência para iniciador JB136 é (5’)-TTTTTCATATGAGGAGGTTTTTATGAACAAGAAGAACCGCCA (SEQ ID NO:21) e a sequência para iniciador JB137 é (5’)- TTTTTTGTACATCAGCCTTTACGCAGGTGCA (SEQ ID NO:22). O produto de PCR resultante foi cozido com Ndel e BsrGI e ligado a pJB78 que foi tratado com as mesmas enzimas, para fornecer plasmídeo pJB79. Em seguida, o gene davT de P. putida foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico ao utilizar iniciadores JB138 e JB139, que foram modificados para incorporar locais de restrição Spel e ApaLI, respectivamente, nas extremidades 5' e 3' do produto de PCR davT. A sequência para iniciador JB138 é (5’)- TATATACTAGTAGGAGGATAATATGAGCAAAACCAACGAATC (SEQ ID NO:23) e a sequência para iniciador JB139 é (5’)- TTTTTGTGCACTCAGGCGATTTCAGCGAAGC (SEQ ID NO:24). O produto de PCR resultante foi cozido com Spel e ApaLI e ligado a pJB79 que foi cozido com as mesmas enzimas, logo produzindo plasmídeo pJB80. E por final, o promotor ompA foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico de E. coli K12 ao utilizar iniciadores JB141 e JB142, que foram modificados para incorporar locais de restrição BmgBI e Asei, respectivamente, nas extremidadesδ' e 3'. O produto de PCR resultante foi cozido com BmgBI e Asei e ligado a pJB80 que foi cozido com SnaBI e Ndel para formar plasmídeo pJB82. O plasmídeo pJB91 foi construído ao cozinhar um produto de PCR davBA produzido com iniciadores JB 136 e JB 137 (como descrito acima) com Dralll e ao ligar o fragmento 507 bp a pJB82 que foi cozido com a mesma enzima, logo produzindo plasmídeo pJB91. Esta construção foi realizada para corrigir a mutação sem sentido que foi descoberta no CDS de davB de pJB82. O plasmídeo pJB80 contém o operon davBAT sob o promotor constitutivo Ptet, enquanto o plasmídeo pJB91 contém o mesmo operon sob o forte promotor POmpA-

O plasmídeo pMZ28 foi construído ao cozinhar plasmídeo pJ31:7950, que é um construto produzido por DNA 2.0 (Menlo Park, CA) e continha gsaRAt que é otimizado em códon para expressão em E. coli K12, com BsrGI. O fragmento resultante que contém gsaRAt foi ligado a pFS30 que também foi cortado com BsrGI. Após verificar que a orientação de gsaRAt foi na mesma direção que phaC- orfZ por digestão de enzima de restrição, o plasmídeo resultante foi designado como pMZ28.

Resultados experimentais

MG1655 [pMZ28] que expressa uma L-lisina incompleta para trajetória de P(5HV) e MG1655 [pMZ285 pJB91] que expressa toda a L-lisina para trajetória de P(5HV) foram inoculadas em um tubo de ensaio que contém 3 mL LB suplementada com antibiótico apropriado (25 μg/mL cloranfenicol para pJB91; 100 μg/mL ampicilina para pMZ28) e cultivada de um dia para o outro a 37°C com agitação de 250 rpm. No dia seguinte, 0,5 mL de cada cultura de um dia para o outro foi utilizada para inocular um frasco de agitação que contém 50 mL de LB fresco suplementado com o(s) antibiótico(s) apropriado(s) e cultivado a 37°C com agitação de 250 rpm. Em 3,5 horas, 0,1 mM IPTG foi adicionado às culturas líquidas e em 5 horas, as culturas foram giradas a 4150 rpm (centrífuga de bancada Sorvall Legend RT) e ressuspensas em 50 mL de meop de produção que consistiu de 1x E2 em solução de sais mínimos que contém 10 g/L glicose, 2.5 g/L LB, 10 g/L L-lisina, 2mM MgSO4, 1x Solução de Sais de Traço e 0,1 mM IPTG. As receitas para sais E2 e Solução de Sais de Traço são fornecidas no Exemplo 1.

As condições de cultura em frasco de agitação e o protocolo de análise para teor de PHA são como descritos no Exemplo 1. A tabela 7 mostra que oito vezes mais P(SHV) foi produzido após introdução do operon davBAT.Tabela 7. Produção de P(SHV) a partir de L-lisina

EXEMPLO 6: Biossíntese de copolímero P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina

A trajetória idealizada para converter L- lisina em P(SHV) também foi introduzida na cepa MBX2641 que expressa bktB e phaB a fim de produzir copolímero P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina e eventualmente glicose.

Construção de plasmídeo

Os genes que compreendem a trajetória neste exemplo incluem: P. putida davB, P. putida davA, P. putida davT, C. kluyveri orfZ, R. eutropha phaC e A. thaliana gsaRAt ou A. terreus gsaRAt2 (ver Tabela 1 A).

O plasmídeo pJB90, que contém uma trajetória alternativa que consiste dos genes gsaRAt2, phaC e orfZ, foi produzido da seguinte maneira. O gene A. terreus gsaRAt2, otimizado em códon para expressão em E. coli K12, foi amplificado por PCR a partir de pSG40 (um construto porduzido por DNA 2.0 (Menlo Park, CA)) ao utilizar iniciadores JB145 e JB146. Ambos os iniciadores continham locais Bglll nas extremidadesδ'. A sequência para iniciador JB145 é (5')- TTTTTAGATCTAGGAGGTTTTTATGCTGCGTGCTGCTTCTCG (SEQ ID NO:25) e a sequência de iniciador JB146 é (5')- TTTTTAGATCTTTAGCGGAAATAGTTTGGAC (SEQ ID NO:26). O fragmento de PCR resultante foi cozido com Bglll e ligado no local correspondente de pJB84 para produzir pJB90.

Resultados Experimentais

As cepas MBX2641 [pJB78, pJB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28] e MBX2641 [pJB91, pJB90] foram cultivadas em frascos de agitação e analisadas para teor e composição de PHA como descrito no Exemplo 1 e 2, para caracterizar a produção de P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina e glicose. MBX2641 [pJB78, pPB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28] e MBX2641 [pJB91, pJB90) foram inoculadas em tubos de ensaio que contêm 3 mL LB suplementado com 25 μg/mL cloranfenicol e 100 μg/mL ampicilina e cultivadas de um dia para o outro a 37°C com agitação de 250 rpm. No dia seguinte, 0,5 mL de cada cultura de um dia para o outro foi utilizada para inocular um frasco de agitação que contém 50 mL de LB fresco suplementado com o mesmo antibiótico e cultivado a 37°C com agitação de 250 rpm. Em 3,5 horas, 0,1 mM IPTG foi adicionado às culturas líquidas e em 5 horas, as culturas foram giradas a 4150 rpm (centrífuga de bancada Sorvall Legend RT) e ressuspensas em 50 mL de meio de produção que consistiu de 1x E2 de solução de sais de traço que contém 10 g/L glicose, 2.5 g/L LB, 10 g/L L- lisina, 2mM MgSO4, 1x Solução de Sais de Traço e 0,1 mM IPTG. As receitas para sais de E2 e Solução de Sais de Traço são fornecidas no Exemplo 1.

Como mostrado na tabela 8, a cepa MBX2641 [pJB785 pJB84], que não possui os genes que convertem L-lisina em 5HV, foi incapaz de produzir 5HV a partir de L-lisina e produziu apenas homopolímero de P(3HB). As cepas MBX2641 [pJB91, pMZ28] e MBX2641 [pJB91, pJB90], ambas as quais continham toda a trajetória a partir de L-lisina até 5HV-CoA, 5HV to incorporada em 2,5% em peso e 5% em peso, respectiva mente, do copolímero total. Isto demonstra que os genes davBAT e gsaR precisam ser expressos a fim de produzir 5HV- que contêm copolímeros a partir de L-lisina.Tabela 8. Produção de P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina

EXEMPLO 7: Biossintese aprimorada de polímero PHA que contém 5HV a partir da L-lisina

Devido ao fato de que o 5HV foi incorporado a um nível inesperadamente baixo, a existência de uma trajetória concorrente foi considerada. Para ver se o glutarato poderia ser produzido a partir da L-lisina, MG1655 [pJB91] expressando os genes davBATdo plasmídeo foi produzido em meio LB que contém 25 mg/l de cloranfenicol a 30°C com agitação durante 6h. As alíquotas das culturas na fase logarítmica média de 25 μl foram inoculadas formando um meio mínimo de 475 μl E0 e incubadas a 30°C com agitação a 250 rpm durante 48 horas. O meio mínimo E0 consistia de 10 g/l da glicose, 4 g/l da lisina, 58 mM K2HPO4, 27 mM MgSC^, 25 μl de cloranfenicol, 0,1 mM IPGT e elementos traço. Mediu-se o glutarato, presente no sobrenadante, por CG-EM como delineado abaixo: obtiveram-se os supernandantes do caldo de fermentação por centrifugação e 1 μl da amostra foi pipetado em tubos Eppendorf a fresco contendo 1 μl de 1 g/l de 4-aminobutirato (GABA) como padrão interno. As amostras foram secas em um Labconco centrivap e ressuspensas em 100 μl de acetonitrila (AON): solução de 1:1 N-(t- butildimetilsilila)-N- metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) por sonicação durante 3 h.

As amostras foram então derivatizadas a 65°C durante 30 min, centrifugadas para a remoção de material insolúvel e supernadantes injetados em CG-EM Agilent 5975 equipado com coluna HP-5ms, usando os parâmetros de aquisição seguintes: gás de arraste hélio com taxa de fluxo de 2 ml/min, modo de varredura m/z 65 a 700, atraso de solvente para 3,5 min, programa de forno: 150°C durante 2 min, depois sobe-se para 280°C a 3°C/min, temperatura da fonte ions a 230°C, a temperatura do filtro de massa quadrupolar é de 150°C.

Curiosamente, produziu- se 0,6 g/l de glutarato a partir da L-lisina quando o óperon davBatT foi superexpresso em MG 1655. O óperon davBAT T expressa genes que codificam enzimas que convertem a L-lisina em GSA. Pode-se produzir glutarato por meio de um gene endógeno E. coli cuja enzima codificada pode oxidar GSA a glutarato.

O exame de prováveis reações enzimáticas de GSA para glutarato levou à identificação de dois possíveis genes endógenos E. coli GSA desidrogenase, gabD e/ou ynel (ver Tabela 1A). Estes dois genes foram identificados anteriormente para oxidar o semialdeído succínico a ácido succínico (Dennis e Valentim, Patente N° U.S. 6.117.658), mas não mostrou oxidar GSA a glutarato. Para testar se uma cepa gabD- e yne/-negativo ainda produz glutarato a partir da L-lisina, as seguintes cepas foram construídas.

O nulo único gabD e mutante ynel foram construídos pelo método Red/ET Recombineering descrito por Datsenko e Wanner (Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 97:6640-6645 (2000)). O processo de exclusão de gabD do cromossomo de MG 165 envolveu a substituição de gabD com um marcador do Kanamicina flanqueado com FRT através de recombinação homóloga mediada por PCR. O marcador do Kanamicina flanqueado com FRT foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pKD4 (Datsenko e Warmer, Proc. Natl. Acad. ScL USA. 97:6640-6645 (2000)) pelo uso de iniciadores RF314 5'-GCAAGCCAGAGTAACCCCGGACGCACGCTGCGAGCGGCACGTAGTGTGGAT GCCTTACACGCCGCATTTAATCAATAACCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG CTGCTTC (SEQ ID NO:27) e RF315 5'-GAATTTGCCCAACGCCACGGGGAATCGCCTGACTGCGGCGCTGCATTAACTC TTTATTGCTGTTCATTCGCATTCTCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCCATATG AATAT (SEQ ID NO:28).

O gene ynel foi deletado do cromossomo de MG1655 por substituição com um marcador do Kanamicina (kan) flanqueado com FRT. Este marcador foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pKD4 usando primers MS220 5'-GCAAGAGTAAATCTGCGTATCTTCATACCATGACTCATAAAGGAG ATACCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:29) e MS217 5'- ACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTGAATATG TCGCGCATATGAATATCCTCCTTAGT (SEQ ID NQ:30) que introduziram 50bp de homologia para o gene ser eliminado. A substituição de ynel com este fragmento de DNA não funcionou e, portanto, outro fragmento PCR que foi criado aumentou as regiões de homologia para substituição do gene. Para conseguir isso, uma volta adicional de PCR foi realizada com o fragmento de PCR gerado acima como modelo e iniciadores MS223 5'-TCGATTCGTGAATAAGTGGCTTAATATTATTCATTTTAAAGCAAGAGTAAATCT GCGTATC (SEQ ID NO:31) e MS224 5'-GCCACTTTCTACTCCTGGACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAG AGCTG (SEQ ID NO:32). Uma substituição bem sucedida de ynel com FRT-kan- FRT foi alcançada. O marcador kan foi então removido como descrito em Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6640-6645 (2000)).

O MG1655 ΔgabD::FRT-kan-FRT, Δyne/::FRT foi construído por P1- mediated transduction from MG\655ΔgabD::FKT-kan-FRT to MG1655δyroe/::FRT e o marcador kan restante foi usado mais adiante usando o mesmo método descrito acima. A cepa resultante MG1655 ΔgabD::FRT, Δyne/::FRT foi transformada com pJB91 e analisada para produção de glutarato a partir de L- lisina em um experimento semelhante ao descrito acima com MG1655 [pJB91] expressando os genes davBAT do plasmídeo.

Em contraste a MG1655 [pl_B91] que produziu 0,6 g/l de glutarato a partir de L-lisina, a cepa MG1655 ΔgabD::FRT, Δyne/::FRT [pJB91] não produziu nenhum glutarato a partir de L-lisina, o que demonstra que os endógenos E. coli, gabD e/ou ynel foram responsáveis por converter GSA a glutarato.

Produção aprimorada de copolímeros P(3HB-co-5HV) a partir de L- lisina

O fluxo aprimorado de 5HV a partir de L-lisina foi realizada ao excluir a GSA desidrogenase endógena que codificam genes gabD e ynel em uma cepa que produziu o copolímero 3HB-co-5HV.

O MBX2885 foi construído pela transformação de plasmídeos pJB91 e pJB90 em cepa MBX2641. Esta cepa tem todos os genes a fim de produzir P(3HB-co-5HV) a partir da glicose e L-lisina.MG1655 ΔgabD::FRT, Δyne/::FRT foi P1-transduzido com a cepa doadora MBX2114 que conferiu PHB produzindo capacidades como descrito no Exemplo 2. Esta cepa foi posteriormente transformada com pJB90 e pJB91, que expressou L-lisina para P(5HV) trajetória genes conforme descrito nos Exemplos 6 e 5, respectivamente. A cepa resultante foi designada como MBX3378 e tem todos os genes a fim de produzir P(3HB-co-5HV) a partir da glicose e L-lisina, mas ao contrário MBX2855 tem os dois genes, gabD e ynel removidos do genoma.

Uma fermentação com placa de agitação foi conduzida usando cepa MBX2855 e sua contraparte MBX3378 deficiente de GSA desidrogenase. As células foramincubadas e analisadas sob as mesmas condições, como descrito acima (com agitação de 300 rpm a 30°C). O meio mínimo E0 consistiu de 10 g/l da glicose, 2 g/l de L-lisina, 58 mM K2HPO4, 2 mM MgSO4, 25 μg/ml de cloranfenicol, 5 μg/ml de gentamicina, 0,1 mM IPGT e 5 elementos traço como descrito em um exemplo anterior. O fluxo de carbono a partir da L-lisina para 5HV foi dramaticamente aprimorado na cepa MBX3378 deficiente de GSA desidrogenase quando comparada com MBX2855 que continha a atividade desidrogenase GSA de tipo selvagem como mostra a Tabela 9. A fim de melhorar significativamente a produção de 5HV que contém PHA, genes de GSA desidrogenase como gabD e ynel precisam ser removidos do genoma de hospedeiros de produção.Tabela 9. Produção aprimorada de P(3HB-co-5HV) a partir da L-lisina

EXEMPLO 8: Biossíntese da L-lisina a partir da glicose

A regulação da reação alostérica ocorre na trajetório L-lisina através dos genes lysC e dapA. Portanto, esse controle deve ser eliminado a fim de permitir o aumento da produção de L-lisina a partir da glicose. O procedimento para fazer isso é bem estabelecido e foi descrito para os dois genes (Kojima et al., U.S. Patent No. 6,040,160). E. coli mutants possessing deregulated lysC e dapA pode ser obtido primeiro ao excluir metL e thrA a partir de E. coli LysC, MetL e ThrA são isoenzimas e todas catalisam a mesma reação aspartato quinase, então será necessário eliminar as duas últimas antes de mutações em lysC podem ser selecionadas positivamente. Uma vez que uma cepa ΔmetL ΔthrA foi feita, ela pode ser mutada com N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). O conjunto mutante resulante poderia se desenvolver em um meio mínimo que contém s-2- aminoetilcisteína (AEG), um análogo não metabolisado de L-lisina, a fim de exercer pressão sobre lysC e dapA. Já que metL e dapA estão faltando, apenas mutações que dessensibilizam lysC e dapA para L-lisina (ou seu análogo AEC) permitirão que as células sintetizem a L-lisina, tronina e metionina e, assim, sobrevivam. Manipulações adicionais depodem ser realizadas por superexpressão de lysC desregulado, dapA desregulado e outras trajetórias de genes de um promotor recombinante, a fim de aumentar a capacidade de fluxo e eliminar a regulação da trancrição.

EXEMPLO 9: Biossíntese de homopolímero P(SHV) a partir da glicose

P(SHV) foi produzido a partir da glicose como a única fonte de carbono em um a cepa E. coli capaz de sintetizar os monômeros 5HV-CoA a partir da glicose e incorporá-los a PHA. Para isso, uma cepa foi construída para expressar não apenas os genes requeridos a fim de produzir homopolímero P(5HV) a pertir de L- lisina, mas que também para expressar um gene dapA mutado chamado dapA^r que codificaa L- diidro-di-picolinato sintetase insensível à reação da lisina. A primeira parte deste exemplo descreverá a construção de plasmídeos requeridos para demonstrar esta habilidade.

Construção de plasmídeos

Em E. coli, a regulação alostérica ocorre na trajetória de L-lisina por meio da aspartato quinase e III dihidrodipicolinate sintetase codificadas pelos genes lysC e dapA, respectivamente (Figura 6). A fim de aumentar a produção de L- lisina e eventualmente polímero P(SHV) a partir da glicose, a regulação alostérica precisa ser reduzida ou inteiramente eliminada. O O procedimento para fazer isso é bem estabelecido e foi descrito para ambos os genes (Kojima et al, U.S. Patent No. 6,040,160). Um gene dapA^ resistente a reação de L-lisina foi construído e teve o 352° resíduo de nucleotídeo trocado de citosina para timina (c/apAC352T). Ele foi obtido pela amplificação PCR do gene dapA E. coli cromossômico gerando dois fragmented de DNA usando iniciadores que introduziram a mudança de base desejada, seguida de emenda por sobreposição de extensão PCR (SOE-PCR) para fundir os dois fragmentos de DNA. O método SOE-PCR foi descrito anteriormente (Ho et al., Gene 77(l):51 -9 (1989). Detalhadamente, um fragmento de DNA continha do 1o ao 366° pares de nucleotídeos de gene dapA que foi amplificado com iniciadores DE081 (5-AAAAGAATTCTTAATTAATTCTAGAAGGAGGTTTCATATGTTCAC GGGAAGTATT GTC) (SEQ ID NO:33) e DE082 (5'- AGCGATGGCTTTGAAATACTGATACAAACCTTC) (SEQ ID NO:34) e o outro fragmento de DNA continha do 337° ao 879° pares de nucleotideos dapA amplificados com iniciadores DE083 (5 GAAGGTTTGTATCAGTATTTCAAAGCCATCGCT) (SEQ ID NO:35) e DE084 (5'- CCCGAGCTCGTTTAAACTTAATTAAGACTAGTTTTACAGCAAACC GGCATGCTT) (SEQ ID NO:36). Os iniciadores DE082 e DE083 complementarmente reversos e foram concebidos para introduzir a citosina para mudança de base de timina ao resíduo de nucleotideo 352°. Os dois fragmentos de DNA a partir do primeiro ciclo de PCRs foram fundidos por SOE-PCR usando iniciadores DE081 e DE084. O produto de PCR resultante foi digerido com Xbal e Saci e ligado a pDE031 que foi digerido com Spel e Saci, dessa forma, criando o plasmídeo pDE035. O plasmídeo pDE031, que contém um promotor constitutivo sintético (PSyni) foi construído pela digestão de um fragmento de DNA de filamento duplo 63 bp sintetizado (5'- TTTTTCTAGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCACTAGTGT TTAAACCCCC ) (SEQ ID NO:37) com Xbal e Pmel e ligado nos mesmos sítios de enzima de restrição de um plasmídeo pBluescript II SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) que foi previamente modificado para conter esses sítios. O construto de gene PsynrdapAC352T em pDE035 foi digerido com Xhol e Pmel, que foi seguido por ligação com o plasmídeo pJB90 (descrito no Exemplo 6) que foi digerido com BsrGI, clivado abruptamente com nuclease mung bean e digerido uma segunda vez com Xhol para gerar o plasmídeo pJG22 que expressou o operon phaC- gsaRAt-orfZ a partir do promotor Ptrc e o gene dapAc352T a partir do promotor Psyni-

Resultados experimentais

O plasmídeo pJG22 foi transformado junto com os plasmídeos pJB91 (descritos no Exemplo 5) na cepa MBX3342 (MG 1655 ΔgabD::FRT Δynel::FRT) para formar a cepa MBX3342 [pJB91, pJG22], Os plasmídeos pSE380 e pACYC184, os vetores vazios utilizados para construir pJG22 e pJB91, respectivamente, também foram transformados na cepa MBX3342 para criar a cepa de controle negativo MBX3342 [pSE380, pACYC184]. Essas cepas foram incubadas durante 48 h, com agitação em 300 rpm a 30°C em meio E2 2x e analisadas conforme descrito nos exemplos anteriores. O meio consistiu em glicose a 15 g/l, NaNH4HPO4 a 52 mM, K2HPO4 a 66 nM, KH2PO4 a 54 mM, MgSÜ4 a 2 mM, IPTG a 0,1 mM e elementos de traço conforme descrito acima. Para o meio de cultura para MBX3342 [pJB91, pJG22], 25 μg/ml de cloranfenicol e 5 μg/ml de gentamicina foram suplementados, enquanto que 25 μg/ml cloranfenicol e 100 μg/ml de ampicilina foram adicionados para MBX3342 [pSE380, pACYC184], Os dados na Tabela 10 mostram que MBX3342 [pJB9, pJG22] produziu 2,60% de peso seco de célula (DCW) do homopolímero P(5HV), enquanto a cepa MBX3342 [pSE380, pACYC184] não produziu nenhum PHA. Esses resultados demonstram que uma cepa que expressa o gene dapA resistente à reação em adição à L-lisina para genes de trajetória P(5HV) pode produzir P(5HV) a partir de glicose como a única fonte de carbono.Tabela 10. Produção de P(SHV) a partir de glucose

EXEMPLO 10: Biossintese de copolímero P(3HB-co-5HV) a partir da glicose

O experimento seguinte foi para demonstrar a produção de copolímero P(3 HB-co-5HV) a partir da glicose em uma cepa de E. coli capaz de sintetizar os monômeros 3HB-CoA e 5HV-CoA e os incorpora em PHA.

Resultados experimentais

Os genes btkB-phaB-kan da cepa MBX2114 foram transduzidos por PI em MBX3342 gerando a cepa MBX3344. A MBX3344 foi transformada com plasmídeos pJB91 e pJG22 para criar a cepa MBX3344 [pJB91, pJG22]. Os plasmídeos pSE380 e pACYC1845, os vetores vazios utilizados para construir pJG22 e pJB91, respectivamente, também foram transformados em MBX3344 para criar uma cepa de controle negativo, MBX3344 [pSE380, pACYC184]. Essas cepas foram incubadas por 48 h, com agitação em 300 rpm a 30°C em meio E2 2x e analisadas conforme descrito nos exemplos anteriores. O meio consistiu em glicose a 15 g/l, NaNH4HPO4 a 52 mM, K2HPO4 a 66 mM, KH2PO4 a 54 mM, MgSO4 3 2 mM, IPTG a 0,1 mM e elementos de traço conforme descrito acima. Para o meio de cultura para MBX3344 [pJB91, pJG22], 25 μg/ml de cloranfenicol e 5 μg/ml de gentamicina foram suplementados, enquanto 25 μg/ml de cloranfenicol e 100 μg/ml de ampicilina foram adicionados para MBX3344 [pSE380, pACYC184]. O caldo de cultura foi suplementado com 10 g/l de glicose após 24 horas de incubação. A Tabela 11 mostra que 5HV poderia ser incorporado na cepa que contém todos os genes de trajetória metabólica P(3HB- co-5HV) a partir da glicose como a única fonte de carbono.Tabela 11. Produção de P(3HB-co-5HV) a partir de glucose

A seguir, a cepa MBX3824 (W3110 ΔgabD:.FRT Δynel::FRT ΔcadA.-.FRT ΔldcC::FRT ΔargO.'.FRT bktB-phaB-kan) foi testada como a cepa hospedeira a fim de produzir copolímero P(3HB-co-5HV) a partir de glicose. Nessa cepa, as trajetórias concorrentes que podem desviar a L-lisina para longe do co-monômero 5HV-CoA foram removidas do genoma de E. coli.

A primeira trajetória concorrente pode converter L-lisina em cadaverina e consiste em duas enzimas de L-lisina descarboxilase (número EC 4.1.1.18) codificadas por cadA (Meng e Bennett, J. Bacterid. 174(8):2659 a 2669 (1992); número de acesso EcoCyc: EG10131) e IdcC (ver Tabela 1 A; Yamamoto et al., Genes Genet. Syst. 72(3):167 a 72 (1997); número de acesso EcoCyc: G6094).

Uma segunda trajetória concorrente pode exportar L-lisina para fora da célula microbiana. Em Corynebacterium glutamicum, a L-lisina exporta a proteína que foi identificada como LysE (ver Tabela 1A; Vrljic et al., Mol. Microbiol. 22 (5): 815 a 826 (1996)). Com a finalidade de identificar genes exportadores de L-lisina putativa em E. coli, inúmeras pesquisas de literatura e patente, bem como pesquisas de BLAST e Psi-BLAST usando LysE de C. glutamicum como um ponto de questionamento foram conduzidas. Seis proteínas foram descobertas por serem alvos para a remoção do genoma de E. coli a fim de evitar a exportação de L-lisina para fora da célula. Essas incluem: (1) ArgO (conhecido, ainda, como YggA, Nandineni e Gowrishankar, J. Bacteriol 186:3539 a 3546 (2004)), (2) YfiK (conhecido, ainda, como EamB; Franke et al., J. Bacterial 185:1161 a 1166 (2003)), (3) RlitB (denominada formalmente como YigK; Zakataeva et al„ FEBS Lett. 452(3):228 a 32 (1999)), (4) YahN (Kutukova et al., Mol. Biol (Mask.) 39(3);374 a 378 (2005)), (5) RhtC (denominada formalmente como YigJ; Zakataeva et al., FEBS Lett, 452(3):228 a 32 (1999)) e (6) YeaS (conhecido, ainda, como LeuE; Kutukova et al., FEBS Lett. 579(21 ):4629 a 34 (2005)). A ArgO demonstrou ser a candidata mais provável para exportar a L- lisina para fora das células de E. coli com base em seu valor de e inferior de 2e- 22 em pesquisas de BLASTP usando LysE de C. glutamicum como o ponto de questionamento, a que se agrupou mais proximamente com LysE em uma Árvore de Agrupamento de Vizinhos após Clustal X (Thompson et al, Nucleic Acids Res. 25: 4876 a 4882 (1997)) com LysE de C glutamicum e os seis homólogos de E. coli e relatou uma resistência aumentada de 3 vezes para a L-lisina, bem como um acúmulo de L-lisina 38% superior quando argO foi superexpressa comparada com as cepas de controle apenas de vetor (Livshits et al., patente U.S. n°6.979.560). Entretanto, as outras proteínas identificadas podem também exportar L-lisina e, portanto também são alvos para a deleção do gene.

Outra trajetória concorrente pode converter L-lisina em (R)-β-lisina que é catalisada por 2,3-aminomutase lisina (número de EC 5.4.3.-) codificada por yjeK de E. coli (número de acesso EcoCyc: G7836; Behshad et al, Biochemistry 45(42): 12639 a 46 (2006)).

Os mutantes cadA e IdcC nulos únicos foram construídos pelo método de Recombinação Red/ET a partir de pontes de gene conforme descrito previamente usando os seguintes iniciadores: DE118 (5- TGTCCCATGTGTTGGGAGGGGCCTTTTTTACCTGGAGATATGACTG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:38) e DE119 (5'- GAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTA AATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:39) para uma mutação 21cacM::FRT-fcan-FRT e DE 122 (5- GTTTGAGCAGGCTATGATTAAGGAAGGATTTTCCAGGAGGAACAC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NQ:40) e DE123 (5’- TATTTGTTAACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAG ATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:41) para mutação ΔldcC::FRT-cat- FRT. Uma mutação de argO nula e única foi construída pelo método de Recombinação Red/ET usando iniciadores DE106 (5- GTGTTTTCTTATTACTTTCAAGGTCTTGCACTTGGGGCGGCTATGG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:42) e DE107 (5'- CTAACTGAACAAGGCTTGTGCATGAGCAATACCGTCTCTCGCCAG ATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:43). A W3110 ΔgabD::FRT Δynel::FRT ΔcadA::FRT ΔldcC::FRT ΔargO::FRT foi construído por transduções mediadas por PI iterativas de cassetes ΔgabD-.-.FRT-kan-FRT, Δyner.:FRT-kan- FRT, ΔcaαW::FRT-kan-FRT, ΔldcC::FRT-cat-FRT, ΔcadA-.-.FRT-kan-FRT na cepa W3110 (Bachmann, Bacterial Rev., 36 (4):525 a 557 (1972)), que foi seguida pela remoção de marcadores kan ou cat após cada transdução mediada por PI conforme descrito nos exemplos anteriores. A cepa resultante MBX3818 foi transduzida por PI com a cepa doadora MBX2114 para finalizar a construção de MBX3824. Os plasmídeos pJG22 e pJB91 foram transformados em MBX3824 e a cepa resultante MBX3824 [pJG22, pJB91] foi testada para a produção de copolímero P(3HB-co-5HV) junto com MBX3344 [pJG22, pJB91]. Essas cepas foram incubadas por 48 h, com agitação em 300 rpm a 30°Cem meio E2 a 1,5x e analisadas conforme descrito nos exemplos anteriores. O meio consistiu em glicose a 15 g/l, NaNH4HPO4 a 39 mM, K2HPO4 a 49,5 mM, KH2PO4 a 40,5 mM, MgSO4 a 2 mM, IPTG a 0,1 mM e elementos de traço conforme descrito acima. O meio de cultura foi suplementado com 25 μg/ml de cloranfenicol e 5 μg/ml de gentamicina. A Tabela 12 mostra que várias cepas com antecedentes genéticos diferentes têm a capacidade de produzir P(3HB-co-5HV) a partir de glicose com diferentes composições de 5HV no polímero. Em particular, a remoção de trajetórias concorrentes que desviam o carbono para longe de 5HV-CoA, como a remoção da proteína argO que exporta L- lisina ou os dois genes de descarboxilase lisina cadA e idcC, que aumentam a incorporação de 5HV em PHA.Tabela 12. Produção de P(3HB-co-5HV) a partir de glucose

EXEMPLO 11: Biossíntese de copolímero P(4HB-co-5HV) a partir de 4- hidróxi-butirato de sódio e 5-hidróxi-valerato de sódio

O experimento a seguir foi para demonstrar a produção de copolímero P(4HB-co-5HV) em uma cepa E. coli capaz de sintetizar os monômeros 4HB-CoA 0 e 5HV-CoA e incorporá-los em PHA. Os métodos para a projeção de co- monômeros 4HB em organismos recombinantes são descritos em detalhes em patente U.S. n° 6.117.658, patente U.S n° 6.316.262, patente U.S n° 6.689.589, patente U.S.n0 7.081.357, patente U.S n° 7.229.804, patente U.S n° 6.759.219 e publicação de pedido de patente U.S. 2004/0253693, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Em um experimento In similar àquele descrito no Exemplo 1, 5-hidróxi-valerato de sódio (Na5HV) foi fornecido como alimento para a cepa MG 1655 [pMS93] junto com 4-hidróxi-butirato de sódio (Na4HB). A cepa MG 1655 [pMS93] contém os genes orfZ e phaC, ambos são necessários para gerar 4HB-CoA e 5HV-CoA a partir de Na4HB e NaSHV, respectivamente, bem como para polimerizar os precursores para o copolímero P(4HB-co-5HV). O Na4HB para o uso como substrato foi preparado análogo ao método descrito para a preparação de NaSHV no Exemplo 1 com o uso de y-butirolactona (GBL) no lugar de DVL. As condições de cultura usadas para a produção de copolímero foram também iguais àquelas descritas no Exemplo 1 com a diferença de que 4 g/l de Na4HB foram adicionados ao meio de produção. Após o período de produção de PHA, análise do conteúdo de polímero da cultura MG 1655 [pMS93] procedeu como descrito no Exemplo 1 exceto que uma curva padrão para determinar o conteúdo de 4HB foi feita usando as normas GBL além da curva padrão feita para determinar o conteúdo de 5HV. Esta análise mostrou que a cultura de MGI 655 [pMS93] co-alimentado Na4HB e NaSHV geraram o copolímero P(4HB-co-5HV) que compreendeu 67% de orvalho e teve uma composição que foi de 67% 4HB e 33% 5HV. Uma amostra extraída deste polímero foi analisada usando DSC e foi determinada como tendo um Tg de- 54.9°C e nenhum Tm detectável.

EXEMPLO 12: Biossíntese de glutarato a partir de glicose

Para diferenciar qual dos dois produtos de gene era a desidrogenase GSA primária como identificada no Exemplo 7, cepa de tipo selvagem MG1655 [pJB91], MG1655Δyne/::FRT [pJB91] e MG1655ΔgabD::FRT [pJB91] foram comparados pelas suas habilidades a fim de produzir glutarato de 5- aminopentanoato, um metabólito intermediário entre L-lisina e GSA (veja a Figura 2). Todas as três cepas contém o plasmídeo pJB91 que expressam davBAT do promotor PompA como descrito no Exemplo 5. As três cepas foram crescidas em um meio mínimo EO que contém 2 g/L 5-aminopentanoato como descrito anteriormente e o glutarato foi medido por um método GC-MS de cultura sobrenadante. O método e condições de incubação foram os mesmos dos descritos no Exemplo 7.

Ao contrário das duas outras cepas, MG1655ΔgabD [pJB91 ] não acumulou qualquer glutarato detectável. Assim, a desidrogenase codificada por gab D tem a maior parte da atividade com relação a GSA. Portanto, se grandes quantidades de glutarato deverão ser produzidas, hospedeiros de produção precisam expressar gabD ou homólogos (veja a Tabela IP) do mesmo. Porém, já que MGI 655Δyne/ [pJB91] acumulou quantidades um pouco menores de glutarato de 5- aminopentanoato se comparado a MG1655 [pJB91], 0.75 g/L versus 1.0 g/L de glutarato, respectivamente, a desidrogenase codificada por ynel também tem atividade moderada com relação a GSA. Assim, a sobre expressão de ynel ou homólogos (veja a Tabela IQ) do mesmo, pode também produzir grandes quantidades de glutarato de GSA, L-lisina ou glicose.

Os dois melhores homólogos de GabD presentes em Corynebacterium glutamicum incluem (1) a desidrogenase aldeído NAD-dependente (N° de Acesso NP_599302) e (2) a proteína hipotética cgR_0068 (N° de Acesso YP_001136931). Inesperadamente, estas duas proteínas C. glutamicum foram também identificadas como os dois homólogos mais próximos para E. coli Ynel.

Em seguida, glutarato foi produzido de glicose. Para produzir uma cepa sobreproducente de L-lisina, o plasmídeo pDE033 que contém o gene L-lisina resistente à reação dapAC352T foi construído conforme segue: o produto de SOE- PCR para a fabricação do gene dapAC352T descrito no Exemplo 9 foi digerido com EcoRI e Sad, seguido pela ligação com pSE380 que tinha sido digerida com as mesmas enzimas, assim criando o plasmídeo pDE033. O gene dapAC352T em pDE033 está sob o promoter indizível por IPTG Ptre- Plasmídeos pDEO33 e pJB91 (descritos acima) foram transformados em cepa MG 1655 para criar a cepa MG 1655 [pDE033, pJB91], As cepas MG1655 e MG1655 [pDEO33, pJB91] foram incubadas por 48 h com agitação a 300 rpm a 3O°C em um meio que continha 25 g/L de glicose, 16 g/L (NH4) 2SO3, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4, 2 g/L de estrato de levedura, 30 g/L CaCOs, 0.1 mM IPTG e elementos traço como descrito acima. O meio de cultura para MG1655 [pDE033, pJB91] foi suplementado com 100 μg/ml de ampicilina e 25 μg/ml cloranfenicol. Glutarato foi medido como descrito no Exemplo 7. Os dados mostrados na Tabela 13 demonstram que MG 1655 [pDE033, pJB91] secretou 0.7 g/L de glutarato no meio enquanto a cepa de controle negativo MGI 655 não produziu glutarato. Este resultado mostra claramente que usar um gene resistente à reação dapA para acumular L-lisina, junto com o operon davBAT para converter L-lisina to GSA em uma célula hospedeira que codifica a desidrogenase GSA, é suficiente para produzir glutarato de glicose como a única fonte de carbono.Tabela 13. Produção de glutarato a partir de g icose

EXEMPLO 13: Biossintese de 1,5-pentanodiol de sódio 5-hidróxi- valerato Construção da cepa

A cepa MBX3017 (LS5218 Δad/?E::FRT, Δ/αV?A::FRT, ΔackA-pta::FRT) e K- 12 cepa MGI 655 foram usadas como cepas hospedeiras para avaliar se 1,5- pentanodiol (PDO) poderia ser acumulado e secretado no meio. Cada única cepa de deleção foi construída pelo método Red/ET da Gene Bridges. Iniciadores para a construção de casettes de knock-out para as três trajetórias estão listados na Tabela 14. Brevemente, os seguintes iniciadores foram usados para a construção das diversas deleções cromossomais: MS286 e MS287 para o casette ΔadhE; MS289 e MS290 para o casette ΔackA-pta; e MS292 e MS293 para o casette ΔldhA. O LS5218 ΔadhE::FRT, ΔldhA::FRT, ΔackA-pta.:FRT foi obtido ao iterativamente transduzir por P1 cada mutação nula para dentro de LS5218 e removendo o marcador como descrito em um exemplo anterior.Tabela 14. Iniciador usado para estudos PDO

A propionaldeido desidrogenase CoA-dependente codificando pduP de S. typhimurium (veja a Tabela IA; Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003)) foi amplificada por iniciadores JRG47 e JRG48. A 1,3-propanodiol desidrogenase que codifica dhaT de Klebsiella pneumoniae (veja a Tabela IA; Tong et al, Appl. Environ. Microbiol. 57(12):3541-3546 (1991)) foi amplificada com iniciadores JRG49 e JRG50. Os dois genes foram fundidos juntos por SOE-PCR usando iniciadores JRG47 e JRG50. O fragmento de DNA resultante foi clonado para dentro de pJB78 através de sítios BamHI e BspHI e o plasmídeo resultante foi designado como pJGIO.

Cepa MBX3017 ou MG1655 abrigando pFS16 ou pSE380 e pJGIO ou pJB78 foram usados para estudos PDO.

Cepas foram crescidas sob condições de oxigênio limitado em 5HV-que contém meio E2 por 40 h. O meio consistia de: 10g/L glicose, 2g/L 5HV, 26 mM NaNH4HPO4, 33 mM K2HPO4, 27 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 25 μg/ml cloramfenicol, 100 μg/ml ampicilina, 0.1 mM IPTG e elementos traço como descrito acima. Culturas deixadas de um dia para o outro foram inoculadas em um tubo de cultura selado que contém meio fresco para um final ODβoo de aproximadamente 0.2, o espaço livre para o tubo de cultura era pequeno para assegurar a limitação de oxigênio da cultura. As culturas foram incubadas a 3O°C. Após 48 h de incubação, uma amostra de 100 μL foi removida, centrifugada e o sobrenadante resultante foi dosado com 1,4-butanediol (0.1 g/L) como norma interna, secado em um centrivap Labconco e re-suspendida em 100 μL acetonitrila (ACN) por sonicação por 3 h. A solução de acetonitrila foi centrifugada para remover material insolúvel e o sobrenadante foi injetado em um Agilent 5975 GC-MS equipado com uma coluna DB-225ms usando os seguintes parâmetros de aquisição: razão de fluxo do gás carregador Hélio 1 ml/min, modo de varredura m/z 30-400, programa do forno: 4O°C por 2 min, então aumentando para 220°C a 10°C/min, temperatura de fonte de íons 230°C, a temperatura do filtro de massa quádruplo 150°C.

Os resultados PDO medidos são mostrados na Tabela 14. A combinação da cepa hospedeira MBX3017 e sobre expressão de orfZ-dhaT-pduP resultou no maior rendimento de PDO de 0,32 g/L. Cepa MGI 655 abrigando estes três genes deu um rendimento menor de 0.22 g/L, possivelmente devido ao seu etanol ativo, acetato e trajetória de lactatos, que são aceitadores de elétrons conhecidos (Clark, FEMS Microbiol. Rev. 5:223-34 (1989)) e poderiam competir com a trajetória 5HV para NAD(P)H. Interessantemente, MGI 655 abrigando somente orfZ também produziu pequenas quantidades de PDO, enquanto o hospedeiro MBX3017 não redeu qualquer PDO detectável (Tabela 15). Isto indica que uma desidrogenase de álcool endógena, por exemplo, adhE, tem atividade fraca com relação a 5HV-CoA. O PDO medido foi confirmado por GC-MS contra a norma de PDO e espectro de referência de PDO da biblioteca NIST como mostrado na Figura 8. Estes resultados demonstram que PDO pode ser produzido de NaSHV quando o gene orfZ é expresso para gerar 5HV-CoA e os genes pduP-dhaT são expressos convertendo 5HV-CoA em um 5-hidróxipentenal e em PDO.Tabela 15. Titre de PDO de cepas crescidas em 5HV que contém meioa

Resultados a são a media de três experimentos independentes replicados ID de Gene 001 Sequência de Nucleótido: Aspergillus terreus NIH2624 semialdeído de glutarato reductase gene gsaR-At2 ATGCCACTGGTTGCTCAAAATCCACTGCCACGTGCTATTCTGGGTCTGATG ACTTTCGGTCCGAGCGAAAGCAAAGGTGCGCGTATCACTTCCCTGGATGAG TTTAACAAGTGCCTGGATTACTTCCAGCAGCAGGGCTTCCAGGAAATCGAT ACCGCGCGCATCTACGTCGGCGGTGAACAGGAGGCATTCACGGCGCAGGCA AAGTGGAAAGAACGCGGCCTGACGCTGGCGACTAAGTGGTATCCGCAGTAC CCGGGTGCGCACAAACCGGATGTCCTGCGTCAGAACCTGGAGCTGTCCCTG AAAGAACTGGGCACGAACCAGGTCGATATCTTCTATCTGCACGCCGCGGAT CGTTCTGTGCCGTTCGCGGAAACTCTGGAAACTGTTAACGAACTGCACAAA GAAGGCAAATTTGTTCAGCTGGGTCTGTCTAACTACACCGCTTTCGAAGTA GCTGAAATCGTGACCCTGTGTAACGAGCGTGGTTGGGTTCGTCCGACTATC TACCAGGCGATGTATAACGCTATCACCCGTAACATCGAAACTGAACTGATC CCGGCGTGCAAGCGTTACGGTATTGACATTGTTATCTACAACCCACTGGCG GGTGGCCTGTTCAGCGGCAAATACAAAGCACAGGACATCCCGGCTGAAGGT CGTTACAGCGACCAATCTTCCATGGGCCAGATGTACCGCAACCGTTACTTT AAGGACGCAACCTTTGACGCTCTGCGCCTGATCGAACCGGTTGTTGCGAAG CACGGCCTGACGATGCCGGAAACCGCGTTCCGCTGGGTCCACCACCACTCC GCACTGAACATGGAAGATGGCGGCCGTGACGGCATCATTCTGGGTGTAAGC AGCCTGGCTCAGCTGGAAAACAACCTGAAAGACATTCAGAAAGGTCCGCTG CCGCAGGAGGTTGTAGACGTCCTGGATCAGGCTTGGCTGGTGGCTAAGCCG ACGGCTCCAAACTACTGGCATCTGGACCTGAAATACACGTACGACACCCAG GAAGCTCTGTTCAAACCGAAATCTAAGGCGTAA (SEQ ID NO:56) ID de Gene 001 Sequência de Amino Ácidos: Aspergillus terreus NIH2624 semialdeido de glutarato reductase gene gsaRAt2 MPLVAQNPLPRAILGLMTFGPSESKGARITSLDEFNKCLDYFQQQGFQEID TARIYVGGEQEAFTAQAKWKERGLTLATKWYPQYPGAHKPDVLRQNLELSL KELGTNQVDIFYLHAADRSVPFAETLETVNELHKEGKFVQLGLSNYTAFEV AEIVTLCNERGWVRPTIYQAMYNAITRNIETELIPACKRYGIDIVIYNPLA GGLFSGKYKAQDIPAEGRYSDQSSMGQMYRNRYFKDATFDALRLIEPWAK HGLTMPETAFRWVHHHSALNMEDGGRDGIILGVSSLAQLENNLKDIQKGPL PQEWDVLDQAWLVAKPTAPNYWHIxDLKYTYDTQEALFKPKSKA (SEQ TD NO:571 ID de Gene 002 Sequência de Nucleótido: Arabidopsis thaliana semialdeido de glutarato reductase gene gsaRAt ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATG AACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCT AAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCT GAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATCGCGATGCTGAGCGATCCGTGT GCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGC GAGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTG AAAATTAACGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCT GTTAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCCTGGCA GCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTG GGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTAACGGTGCGAAAATGAAA CTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTATGATGAACGCGTTTAGCGAAGGT CTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATT CTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCC ATGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAA GACATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCG GTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTG GGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAA TAA (SEQ ID NO:58) ID de Gene 002 Sequência de Amino Ácidos: Arabidopsis thaliana semialdeído de glutarato reductase gene gsaRAt MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPA EVIKKCKYTIAMLSDPCAALSWFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSL KINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVL GKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSEGLVLADKSGLSSDTLLDI LDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMP VAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE (SEQ ID NO: 59) ID de Gene 003 Sequência de Nucleótido: Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera poli(hidróxi alcanoato) sintetase gene de fusão phaC3/C5 ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGCAGTGGCAATCCTGGTTCAGCAAG GCGCCCACCACCGAGGCGAACCCGATGGCCACCATGTTGCAGGATATCGGC GTTGCGCTCAAACCGGAAGCGATGGAGCAGCTGAAAAACGATTATCTGCGT GACTTCACCGCGTTGTGGCAGGATTTTTTGGCTGGCAAGGCGCCAGCCGTC AGCGACCGCCGCTTCAGCTCGGCAGCCTGGCAGGGCAATCCGATGTCGGCC TTCAATGCCGCATCTTACCTGCTCAACGCCAAATTCCTCAGTGCCATGGTG GAGGCGGTGGACACCGCACCCCAGCAAAAGCAGAAAATACGCTTTGCCGTG CAGCAGGTGATTGATGCCATGTCGCCCGCGAACTTCCTCGCCACCAACCCG GAAGCGCAGCAAAAACTGATTGAAACCAAGGGCGAGAGCCTGACGCGTGGC CTGGTCAATATGCTGGGCGATATCAACAAGGGCCATATCTCGCTGTCGGAC GAATCGGCCTTTGAAGTGGGCCGCAACCTGGCCATTACCCCGGGCACCGTG ATTTACGAAAATCCGCTGTTCCAGCTGATCCAGTACACGCCGACCACGCCG ACGGTCAGCCAGCGCCCGCTGTTGATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTTC TACATCCTCGACCTGCAACCGGAAAATTCGCTGGTGCGCTACGCGGTGGAG CAGGGCAACACCGTGTTCCTGATCTCGTGGAGCAATCCGGACAAGTCGCTG GCCGGCACCACCTGGGACGACTACGTGGAGCAGGGCGTGATCGAAGCGATC CGCATCGTCCAGGACGTCAGCGGCCAGGACAAGCTGAACATGTTCGGCTTC TGCGTGGGCGGCACCATCGTTGCCACCGCACTGGCGGTACTGGCGGCGCGT GGCCAGCACCCGGCGGCCAGCCTGACCCTGCTGACCACCTTCCTCGACTTC AGCGACACCGGCGTGCTCGACGTCTTCGTCGATGAAACCCAGGTCGCGCTG CGTGAACAGCAATTGCGCGATGGCGGCCTGATGCCGGGCCGTGACCTGGCC TCGACCTTCTCGAGCCTGCGTCCGAACGACCTGGTATGGAACTATGTGCAG TCGAACTACCTCAAAGGCAATGAGCCGGCGGCGTTTGACCTGCTGTTCTGG AATTCGGACAGCACCAATTTGCCGGGCCCGATGTTCTGCTGGTACCTGCGC AACACCTACCTGGAAAACAGCCTGAAAGTGCCGGGCAAGCTGACGGTGGCC GGCGAAAAGATCGACCTCGGCCTGATCGACGCCCCGGCCTTCATCTACGGT TCGCGCGAAGACCACATCGTGCCGTGGATGTCGGCGTACGGTTCGCTCGAC ATCCTCAACCAGGGCAAGCCGGGCGCCAACCGCTTCGTGCTGGGCGCGTCC GGCCATATCGCCGGCGTGATCAACTCGGTGGCCAAGAACAAGCGCAGCTAC TGGATCAACGACGGTGGCGCCGCCGATGCCCAGGCCTGGTTCGATGGCGCG CAGGAAGTGCCGGGCAGCTGGTGGCCGCAATGGGCCGGGTTCCTGACCCAG CATGGCGGCAAGAAGGTCAAGCCCAAGGCCAAGCCCGGCAACGCCCGCTAC ACCGCGATCGAGGCGGCGCCCGGCCGTTACGTCAAAGCCAAGGGCTGA (SEQ ID NO:60) ID de Gene 003 Sequência de Amino Ácidos: Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera poli(hidróxi alcanoato) sintetase gene de fusão PhaC3/C5 MSNKNNDELQWQSWFSKAPTTEANPMATMLQDIGVALKPEAMEQLKNDYLR DFTALWQDFLAGKAPAVSDRRFSSAAWQGNPMSAFNAASYLLNAKFLSAMV EAVDTAPQQKQKIRFAVQQVIDAMSPANFLATNPEAQQKLIETKGESLTRG LVNMLGDINKGHISLSDESAFEVGRNLAITPGTVIYENPLFQLIQYTPTTP TVSQRPLLMVPPCINKFYILDLQPENSLVRYAVEQGNTVFLISWSNPDKSL AGTTWDDYVEQGVIEAIRIVQDVSGQDKLNMFGFCVGGTIVATALAVLAAR GQHPAASLTLLTTFLDFSDTGVLDVFVDETQVALREQQLRDGGLMPGRDLA STFSSLRPNDLVWNYVQSNYLKGNEPAAFDLLFWNSDSTNLPGPMFCWYLR NTYLENSLKVPGKLTVAGEKIDLGLIDAPAFIYGSREDHIVPWMSAYGSLD ILNQGKPGANRFVLGASGHIAGVINSVAKNKRSYWINDGGAADAQAWFDGA QEVPGSWWPQWAGFLTQHGGKKVKPKAKPGNARYTAIEAAPGRYVKAKG (SEQ ID NO:61) ID de Gene 004 Sequência de Nucleótido: Thiocapsa phenigii poli(hidróxi alcanoato) sintetase sub-unidade phaE ATGGCTGGTGACCACGTCGTGGAATGCCTTCGAATTCAGGAGGTTTTTATG AACGATACGGCCAACAAGACCAGCGACTGGCTGGACATCCAACGCAAGTAC TGGGAGACCTGGTCGGAGCTCGGCCGCAAGACCTTGGGTCTGGAGAAGACC CCGGCCAATCCTTGGGCCGGCGCCCTCGATCATTGGTGGCAGACGGTCTCG CCCGCCGCCCCCAACGACCTGGTTCGCGACTTCATGGAGAAGCTCGCCGAG CAGGGCAAGGCCTTCTTCGGCCTCACCGACTACTTCACGAAGGGCCTCGGC GGCAGTAGCGGTACGCAGGGCTGGGACACCCTCTCGAAGACCATCGACGAC ATGCAAAAGGCCTTCGCCAGCGGCCGGATCGAAGGCGACGAGACCTTCCGC CGCCTGATGGCCTTCTGGGAGATGCCGCTCGACAACTGGCAGCGCACCATG TCCTCGCTGTCCCCGGTGCCCGGCGACCTGCTGCGCAACATGCCGCACGAC CAAGTCAGGGACAGCGTCGACCGCATCCTCTCGGCACCCGGGCTCGGCTAC ACGCGCGAGGAGCAGGCCCGCTACCAGGATCTGATCCGCCGCTCGCTGGAG TACCAGTCGGCCCTGAACGAATACAACGGCTTCTTCGGCCAGCTCGGTGTC AAGTCCCTCGAGCGGATGCGCGCCTTCCTGCAGGGACAGGCCGAGAAGGGC GTCGCCATCGAGTCGGCGCGCACCCTCTACGACGCCTGGGTCGGCTGCTGC GAAGAGGTCTATGCCGAGGAGGTCAGCTCCGCCGACTACGCGCACATCCAC GGCCGCCTCGTCAACGCCCAGATGGCCCTCAAGCAGCGCATGTCGACCATG GTCGACGAGGTCCTCGGCGCGATGCCGCTGCCGACCCGCAGCGAGCTGCGC ACGCTCCAGGATCGGCTCCAGGAGTCGCGCGGCGAGGGCAAGCGCCAGCGC CAAGAGATCGAGACGCTGAAGCGGCAGGTCGCGGCCTTGGCCGGCGGCGCC CAGCCCGCGCCCCAGGCCTCCGCCCAGCCCAGCACCCGGCCCGCGCCGGCG ACGGCCCCGGCGGCGAGCGCGGCGCCCAAGCGCAGCACCACGACCCGCCGC AAGACCACCAAGCCCACCACCGGCCAGTGA (SEQ ID NO:62) ID de Gene 004 Sequência de Amino Ácidos: Thiocapsa phenigii poli(hidróxi alcanoato) sintetase sub-unidade PhaE MNDTANKTSDWLDIQRKYWETWSELGRKTLGLEKTPANPWAGALDHWWQTV SPAAPNDLVRDFMEKLAEQGKAFFGLTDYFTKGLGGSSGTQGWDTLSKTID DMQKAFASGRIEGDETFRRIMAFWEMPLDNWQRTMSSLSPVPGDLLRNMPH DQVRDSVDRILSAPGLGYTREEQARYQDLIRRSLEYQSALNEYNGFFGQLG VKSLERMRAFLQGQAEKGVAIESARTLYDAWVGCCEEVYAEEVSSADYAHI HGRLVNAQMALKQRMSTMVDEVLGAMPLPTRSELRTLQDRLQESRGEGKRQ RQEIETLKRQVAALAGGAQPAPQASAQPSTRPAPATAPAASAAPKRSTTTR RKTTKPTTGQ (SEQ ID NO:63) ID de Gene 005 Sequência de Nucleótido: Thiocapsa phenigii poli(hidróxi alcanoato) sintetase sub-unidade phaC ATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCGGCCCGACAAGCTGACCGAGGAGATG CTGGAGTACAGCCGCAAGCTCGGCGAGGGTATGCAGAACCTGCTCAAGGCC GACCAGATCGACACAGGCGTCACCCCCAAGGACGTCGTCCACCGCGAGGAC AAGCTGGTCCTCTACCGCTACCGGCGCCCGGCGCAGGTGGCGACCCAGACG ATCCCGCTGCTGATCGTCTACGCCCTCGTCAATCGGCCCTACATGACCGAC ATCCAGGAGGATCGCTCGACGATCAAGGGCCTGCTCGCCACCGGTCAGGAC GTCTATCTGATCGACTGGGGCTACCCGGATCAGGCCGACCGGGCGCTGACC CTCGATGACTACATCAACGGCTACATCGACCGCTGCGTCGACTACCTGCGC GAGACCCACGGCGTCGACCAGGTCAACCTGCTCGGGATCTGCCAGGGCGGG GCCTTCAGCCTCTGCTACACGGCCCTGCACTCCGAGAAGGTCAAAAACCTC GTCACCATGGTCACGCCGGTCGACTTCCAGACCCCGGGCAACCTGCTCTCG GCCTGGGTCCAGAACGTCGACGTCGACCTGGCCGTCGACACCATGGGCAAC ATCCCGGGCGAACTGCTCAACTGGACCTTCCTGTCGCTCAAGCCCTTCAGC CTGACCGGCCAGAAGTACGTCAACATGGTCGACCTGCTCGACGACGAGGAC AAGGTCAAGAACTTCCTGCGGATGGAGAAGTGGATCTTCGACAGCCCGGAC CAGGCCGGCGAGACCTTCCGCCAGTTCATCAAGGACTTCTACCAGCGCAAC GGCTTCATCAACGGCGGCGTCCTGATCGGCGATCAGGAGGTCGACCTGCGC AACATCCGCTGCCCGGTCCTGAACATCTACCCGATGCAGGACCACCTGGTG CCGCCGGATGCCTCCAAGGCCCTCGCGGGACTGACCTCCAGCGAGGACTAC ACGGAGCTCGCCTTCCCCGGCGGGCACATCGGCATCTACGTCAGCGGCAAG GCGCAGGAAGGAGTCACCCCGGCGATCGGCCGCTGGCTGAACGAACGCGGC TGA (SEQ ID NO:64) ID de Gene 005 Sequência de Amino Ácidos: Thiocapsa phenigii poli(hidróxi alcanoato) sintetase sub-unidade PhaC MSPFPIDIRPDKLTEEMLEYSRKLGEGMQNLLKADQIDTGVTPKDVVHRED KLVLYRYRRPAQVATQTIPLLIVYALVNRPYMTDIQEDRSTIKGLLATGQD VYLIDWGYPDQADRALTLDDYINGYIDRCVDYLRETHGVDQVNLLGICQGG AFSLCYTALHSEKVKNLVTMVTPVDFQTPGNLLSAWVQNVDVDLAVDTMGN IPGELLNWTFLSLKPFSLTGQKYVNMVDLLDDEDKVKNFLRMEKWIFDSPD QAGETFRQFIKDFYQRNGFINGGVLIGDQEVDLRNIRCPVLNIYPMQDHLV PPDASKALAGLTSSEDYTELAFPGGHIGIYVSGKAQEGVTPAIGRWLNERG (SEQ ID NO:65)

Claims (11)

1. Microrganismo recombinante geneticamente modificado para converter 5- aminopentanoato em um polímero ou copolímero de poli-hidroxialcanoato (PHA) do mesmo compreendendo 5-hidróxi-valerato, caracterizado pelo fato de que a via para converter 5-aminopentanoato em PHA compreendendo 5-hidróxi-valerato compreende 5-aminopentanoato transaminase (δ-aminovalerato transaminase), EC 2.6.1.48; succinato-semialdeído reductase (conhecido, ainda, como semialdeído de glutarato reductase), EC 1.1.1.61; CoA-transferase, EC 2.8.3.14 e EC 2.8.3.n ou Acil-CoA sintetase, EC 6.2.1.3; e PHA sintetase, EC 2.3.1.n; e em que o microrganismo recombinante produz o PHA compreendendo 5- hidroxivalerato a partir de lisina, em que o microrganismo recombinante é geneticamente modificado para expressar pelo menos um ou mais gene(s) que codifica(m) uma ou mais enzimas para produzir o PHA compreendendo 5-hidroxivalerato a partir de lisina, em que as enzimas são selecionadas do grupo que consiste em: lisina 2-monooxigenase, EC 1.13.12.2; 5-aminopentanomidase (δ-aminovaleramidase), EC 3.5.1.30; 5- aminopentanoato transaminase (δ-aminovalerato transaminase), EC 2.6.1.48; succinato-semialdeído reductase (conhecido, ainda, como semialdeído de glutarato reductase), EC 1.1.1.61; CoA-transferase, EC 2.8.3.14 e EC 2.8.3.n; Acil-CoA sintetase, EC 6.2.1.3; PHA sintetase, EC 2.3.1.n; em que o 5-aminopentanoato é convertido em 5-hidroxivalerato, e em que o 5-hidroxivalerato é convertido no polímero ou copolímero PHA do mesmo pelo microrganismo recombinante.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante expressa pelo menos um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas selecionadas a partir de β-cetoacil-CoA tiolase, EC 2.3.1.9 e acetoacetil-CoA reductase, EC 1.1.1.36.

3. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o PHA é um polímero de monômeros de 5 hidroxivalerato ou um copolímero de polímero de 5- hidroxivalerato, tal como poli (3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato).

4. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante converte lisina em 5-aminopentanoato.

5. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo utilizado para construir o microrganismo recombinante foi modificado para a superprodução de lisina em relação a um microrganismo não-modificado.

6. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante é resistente ao análogo da lisina tóxica S-(2-aminoetil) cisteína; em que o microrganismo recombinante expressa uma diidro-di-picolinato sintetase insensível à reação da lisina; em que o microrganismo recombinante expressa uma aspartato quinase III insensível à reação da lisina, e/ou em que o microrganismo recombinante é modificado, adicionalmente, para inibir ou bloquear a exportação de lisina.

7. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo foi modificado para reduzir ou eliminar atividade de semialdeído de glutarato desidrogenase, preferencialmente em que a semialdeído de glutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada ao excluir ou romper um ou mais genes selecionados a partir do grupo que consiste em davD, ynel e gabD ou seus homólogos.

8. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante converte 5-hidróxi-valerato em 5-hidróxi-valerato CoA e/ou converte 5-hidróxi-valerato CoA em um poli(hidróxi-alcanoato), tal como poli(5-hidróxi- valerato) ou um copolímero deste, por exemplo, um copolímero selecionado a partir de poli(3-hidróxi-propionato-co-5HV) e poli(4-hidróxi-butirato-co-5HV).

9. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o microrganismo recombinante é procariótico, tal como E.coli, ou é um microrganismo eucariótico.

10. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a produção de polímeros de poli- hidroxialcanoato (PHA) compreendendo monômeros de 5-hidroxivalerato a partir de lisina, em que o microrganismo recombinante é geneticamente modificado para expressar pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo em lisina 2-monooxigenase, EC 1.13.12.2; 5-aminopentanamidase (δ- aminovaleramidase), EC 3.5.1.30; 5-aminopentanoato transaminase (δ- aminovalerato transaminase), EC 2.6.1.48; succinato-semialdeído reductase (conhecido, ainda, como semialdeído de glutarato reductase), EC 1.1.1.61; CoA- transferase, EC 2.8.3.14 e EC 2.8.3.n; Acil-CoA sintetase, EC 6.2.1.3; PHA sintase, EC 2.3.1.n para produzir um poli-hidroxialcanoato compreendendo monômeros de 5-hidroxivalerato, e em que o microrganismo recombinante não produz lisina e/ou não expressa uma atividade enzimática de glutarato semialdeído desidrogenase funcional.

11. Método para a produção de polímeros ou copolímeros de poli- hidroxialcanoato (PHA) com base em 5 carbonos dos mesmos, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer lisina ou outra matéria-prima de carbono renovável às células geneticamente modificadas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10; e opcionalmente, em que: (i) a matéria-prima de carbono renovável é selecionada a partir de amido, sacarose, glicose, lactose, frutose, xilose, maltose e arabinose ou combinações das mesmas, e/ou (ii) o poli-hidróxi-alcanoato compreende 5-hidroxivalerato, por exemplo, poli (5-hidroxivalerato), poli(3-hidroxipropionato-co-5HV), poli(3-hidroxibutirato-co-5HV) ou poli(4-hidroxibutirato-co-5HV), e opcionalmente o método compreende ainda a etapa de recuperar o poli- hidroxialcanoato, polímero ou copolímero do mesmo, por exemplo, por extração com solvente ou processamento aquoso.