BRPI0922561A2 - vacina de peptídeo de ch3 da ige. - Google Patents

Abstract

VACINA DE PEPTÍDEO DE CH3 DA lgE. A presente invenção diz respeito à provisão de imunógenos inéditos compreendendo um peptídeo lgE antigênico preferivelmente ligado a um carreador imunogênico para a prevenção, tratamento ou alívio de distúrbios mediados por lgE. A invenção diz respeito adicionalmente a métodos para produção desses medicamentos, composições imunogênicas e suas composições farmacêuticas e seu uso na medicina.

Description

r JA A e aa gago aÃ" ras ç⓺”“Ô | Ú “IMUNÓGENOS COMPREENDENDO UM PEPTÍDEO IGE ANTIGÊNICO E COM- POSIÇÕES DOS MESMOS” Campo da Invenção - A presente invenção diz respeito à provisão de imunógenos inéditos compreenden- doumpeptídeo |gE antigênico preferivelmente ligado a um carreador imunogêr ico para a 7 prevenção, tratamento ou alívio de distúrbios mediados por IgE.

A invenção diz respeito adi- cionalmente a métodos para produção desses medicamentos, composições imunogênicas e composição farmacêutica desses e seu uso na medicina.

Antecedentes da Invenção Durante algumas décadas passadas, doenças alérgicas aumentaram até propor- ções quase epidêmicas e estimativas sugerem que 20-30 % da população total em muitos países ocidentais são afetados.

O papel chave desempenhado por IgE em iniciar as respos- tas alérgicas é bem documentado.

Mediante liberação de linfócitos B, IgE liga ao lecsptor de IgE de alta afinidade (FceRlI) presente nas células mast e basófilos.

À reticulação subse- * 15 quentede moléculas de lgE adjacentes nessas células por alérgenos específicas então re- sulta na sua ativação, levando à liberação de inúmeros mediadores pró-inflamátórios (por : exemplo, histamina, leucotrienos, prostaglandinas), bem como citocinas e quimibcinas cha- ves.

Consequentemente, respostas locais agudas são seguidas por recrutamento e ativação | de outras células inflamatórias (por exemplo, eosinófilos, linfócitos T), amplificando por meio distoa cascata alérgica.

Células dendríticas, por exemplo, aquelas presentes nós sítios de | inflamação alérgica (por exemplo, o pulmão), podem também expressar Feshl e podem usar este receptor para captar seletiva e eficientemente os alérgenos presentes éêm comple- xos imunes com IgE e processar esses alérgenos seletivamente para apresentação às célu- ; las T específicas de alérgeno, fornecendo assim um mecanismo para ativação de célula T persistente e respostas inflamatórias patológicas. | A maioria dos regimes de tratamento atuais visa aliviar sintomas sem Ser tratar a - causa da doença e é fundamentalmente baseada no uso de anti-histamínicos, abtileucotrie- nos, cromoglicatos, beta-agonistas e em compostos no geral antiinflamatório tais como - corticoesteróides.

Embora alguns dos pacientes afetados tenham sua doença sbb controle | - 30 relativamente bom com esses medicamentos, sua frequência de administração [resuente: mente diariamente ou mesmo diversas vezes ao dia) frequentemente leva a fraca conformi- 7 dade do paciente e deterioração subsequente da doença.

Além do mais, em alguns casos tais como asma grave e dermatite atópica grave, as terapias existentes são insuficientes para controlar a doença.

L Muito recentemente, um anticorpo monoclonal (omalizumab, também denominado ; E25, comercializado com a marca registrada Xolair&; Presta et al.

J tram 1922 Sep | 1;151(5):2623-32.) ganhou aprovação das diversas agências ao redor do mundo, basica- ( |

II A AMMAA Aa a aAW*aO 3BI2 RC CI NR ] 2 : mente para tratamento de asma grave e rinite.

Apesar de mostrar eficácia contra lasma gra- ve, este anticorpo ainda apresenta alguns inconvenientes.

Primeiramente, este é um anti- corpo monocional de murino humanizado e, como tal, não impede totalmente reações imu- nológicas em pacientes humanos, surgindo assim possivelmente algumas prsasupações de segurança.

Em segundo lugar, a dose de omalizumab usada no tratamento de astra grave é 7 baseada tanto no peso corpóreo quanto no nível de IgE livre circulante.

Pacientes cujo peso corpóreo e IgE livre circulante que desviam de uma faixa especificada são recomendados a não usar este tratamento.

Aqueles pacientes que podem ser tratados podem precisar rece- ber até três injeções subcutâneas uma vez a cada duas semanas.

Isto impacta Excessiva- menteo custo do tratamento (estimado na faixa de US$15.000-44.000 anualmente por paci- ente), bem como a qualidade de vida dos pacientes, tornando difícil o uso como lima estra- tégia geral para tratamento de alergias.

Para superar os problemas de alto custo e administrações frequentes, de alterna- tiva é desencadear nosso próprio sistema imune para produzir os anticorpos terapêuticos é 15 porvacinação. | No curso de suas investigações, especialistas anteriores no campo da alergia en- « contraram inúmeros considerações, e problemas, que devem ser levados em cota quando se projetam novas terapias de anti-alergia.

Um dos problemas mais perigosos gira em torno do envolvimento de reticulação de IgE no sinal de liberação de histamina.

É mais frequen- temente ocaso em que a geração de anticorpos anti-lgE durante vacinação ativa é capaz de desencadear a liberação de histamina per se pela reticulação de complexos de receptor de 1gE vizinhos na ausência de alérgeno.

Este fenômeno é denominado anaflactogenicidade.

Certamente, muitos anticorpos monocionais anti-lgE comercialmente disponíveis que são normalmente usados para ensaios de detecção de IgE são anaflactogênicos e, consequen- temente, desnecessários e potencialmente perigosos se administrados a um padiente.

Por- tanto, a fim de ser seguro e efetivo, os anticorpos passivamente administrados, o induzidos | - por vacina, devem se ligar em um região de IgE que é capaz de inibir atividades de IgE sem ser anafilática per se. | - A estrutura dos domínios constantes CH3-CH4 da IgE de humano que interage com - 30 o subunidade alfa do receptor FceRI de alta afinidade de IgE foi resolvida turbo BA et a. (2000) Immunidadey 13 (3) 375-85; Garman SC et al., (2000) Nature 20; 406 ( 793):259- | r 66). Trabalhos anteriores também identificaram inúmeros peptídeos IgE ou peptídeos ou ; mimótopos derivados considerados usados para induzir anticorpos anti-lgE não! anaflacto- | gênicos (WO 1993/005810; WO99/67293; WO2004/058799, WO9731948, WO2000/25722, — WO05/075504, US2002/0645525, US2004/146504 e US2006/062782; WO00/050461, WO02/34288 e WO2003/092714; Chen et al. (2008) J.

Immunologic.

Meth. ses 1025 Heil- man Expert Rev.

Vaccines 7(2):193-208 (2008)). Tais domínios ou peptídeos ' são nor- i a | v i 3 Ú malmente ligados a carreadores para aumentar sua imunogenicidade a fim de jquebrar a autotolerância a IgE em um indivíduo.

É portanto desejável fornecer uma composição, tal como um peptídeo IgE antigêni- ' co, ou a combinação de diversos destes acoplados, a um carreador imunogênico, e opcio- nalmente administrada com um ou mais adjuvantes, capaz de induzir anticorpos anti-lgE ' não anaflactogênicos potentes em um indivíduo capaz de reduzir sorcatentas níveis de IgE livre circulante. Maior potência tipicamente resultará nos seguintes benefícios: doses menores exigidas para obter benefícios clínicos, menor volume de injeção exigido, por e- xemplo, para administração subcutânea ou intramuscular (comparado com terapias de anti- corpo monoclional, por exemplo), menor custo de tratamento, maior chance de ducesso no tratamento, menor frequência de administração no regime do tratamento, proporcionando ! assim acesso ao tratamento para uma população mais ampla de pacientes, incllindo paci- entes com peso corpóreo mais alto e/ou altos níveis de IgE circulante, e melhor qualidade de vida dos pacientes.

é 15 Sumário da Invenção A presente invenção diz respeito a um imunógeno compreendendo um peptídeo IgE ; “ antigênico preferivelmente ligado a um carreador imunogênico. O dito peptídeo E antigêni- | co compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430, preferivelmente do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 183 e220a 430, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 220 a ao. O dito peptídeo IgE antigênico pode ser modificado com propósitos de conjugação, prefórivelmente pela adição de resíduos de cisteína ou lisina e/ou a adição de ligantes tais como ligantes GC/GGC. Em modalidades preferidas, o dito peptídeo IgE antigênico é conformacionalmen- te restrito, de forma preferível simplesmente restrito. O dito carreador imunogênico é uma proteina heteróloga, preferivelmente uma partícula tipo vírus (VLP), mais preferivelmente uma VLP de HBcAg, HBsAg ou Qbeta. A invenção também diz respeito a métodos para - produzir tal peptídeo IgE antigênico preferivelmente ligado a um carreador imunogênico.

A invenção também diz respeito a composições imunogênicas compreendendo tal . peptídeo IgE antigênico preferivelmente ligado a um carreador imunogênico, preferivelmente ] 30 —acomposiçõesimunogênicas, opcionalmente compreendendo um adjuvante prefóriveimente selecionado do grupo que consiste em alume; oligonucleotídeos contendo CpG) preferivel- " mente CpG7909 e CpG24555; e adjuvantes a base de saponina, preferivelmente |scometrh Preferivelmente, o dito ácido nucléico contendo CpG compreende uma ou mais ligações modificadas, preferivelmente uma ou mais ligações de fosforotioato, ainda mais preferivel- —mentetodas as ligações internucleotídeo do oligonucleotídeo são ligações de fosforotioato.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a composições farmacêuticas compre- endendo um peptídeo IgE antigênico de acordo com a invenção, ou uma composição imu- |

| | Ú nogênica deste, bem como aos usos médicos de tais composições.

Em particular, a invenção diz respeito a um peptídeo IgE antigênico da invenção, ou uma composição imunogênica ou farmacêutica deste, para uso como um medicarhento, pre- ' ferivelmente no tratamento, alívio ou profilaxia de distúrbios mediados por IgE.

À invenção também diz respeito a métodos de induzir uma resposta imune em um indivíduo por auto- ' IgE e a métodos para tratar, aliviar ou prevenir distúrbios mediados por IgE compreendendo administrar uma quantidade efetiva do dito peptídeo IgE antigênico ou composição imuno- gênica ou farmacêutica deste.

Descrição Resumida dos Desenhos Figura 1: Exibição estrutural da interação entre a região CH3-CH4 de o de huma- no com seu receptor FceRI de alta afinidade.

São exibidos 4 laços (azul, púrpura, laranja e amarelo) correspondentes aos 4 peptídeos das SEQ ID Nos: 165, 312, 1 e 220 respectiva- mente.

Figura 2. Representações gráficas de formatos de peptídeo para induzir respostas , 15 doanticorpo para epítopos estruturalmente definidos de IgE de humano. s Descrição Detalhada da Invenção ; Definições e Técnicas Gerais | A menos que de outra forma aqui definidos, termos científicos e técnicos usados com relação a presente invenção devem ter os significados que são comumente entendidos pelos versados na tecnologia.

Geralmente, a nomenclatura usada com relação a cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteina e ácido nucléico e hibridização e técnicas destes aqui descrita são aquelas bem Lonhecidas | e comumente usadas na tecnologia. ] Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo commétodos convencionais bem conhecidos na tecnologia e da maneira descrita em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por toda a predente espe- o. cificação, a menos que de outra forma indicada.

Ver, por exemplo, Sambrook J. 8 Russell D.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold - Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Biology molecular: À Compen- | - 30 dium of Methods from Current Protocols in Biology molecular, Wiley, John glsons Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo- | 7 ratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short ProtocolS in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Técnicas de reações enzimáticas e purificação são realizadas de acordo com especificações do fabricante, da maneira comumente realiza- danatecnologiaouda maneira aqui descrita. | A nomenclatura usada com relação aos procedimentos de laboratório e química analítica, química orgânica sintética, e medicinal e química farmacêutica e técnicas destes,

| Ú aqui descritos é aquela bem conhecida e comumente usada na tecnologia.

Por toda esta especificação e reivindicações, deve-se entender quela palavra “compreender,” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo,” implicará na l . inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros mas não na exclu- sãode qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

Os termos “Compresn- , dendo”, “que consiste em” e “que consiste essencialmente" devem ser considerados permu- táveis.

Quando os termos "um," "uma," ou "uns", "umas" são usados nesta revelação, eles significam "pelo menos um" ou "um ou mais", a menos que de outra forma indicada.

Adicio- nalmente, a menos que de outra forma exigida pelo contexto, termos singulares devem in- cluiros plurais e termos plurais devem incluir o singular, a menos que o conteúdo dite cla- ramente de outra forma.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados, quer supra ou infra, estão por meio deste incorporado pela referência.

Definições Gerais: . 15 O termo “peptídeo” ou “polipeptídeo” refere-se a um polímero de aminoácidos sem considerar o comprimento do polímero; assim, peptídeos, oligopeptídeos e proteínas são ? incluídos na definição de polipeptídeo.

Este termo também não especifica ou exclui modifi- cações pós-expressão de polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeos que incluein a anexa- ção covalente de grupos glicosila, grupos acetila, grupos fosfato, grupos lpídiose similares são expressamente englobados pelo termo polipeptídeo.

Também incluídos na definição estão polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por e- xemplo, aminoácidos de ocorrência não natural, aminoácidos que ocorrem somente natu- ralmente em um sistema biológico não relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamífero etc.), polipeptídeos com ligações substituídas, bem como outras niodificações conhecidas na tecnologia, tanto de ocorrência natural quanto de ocorrência não riatural.

Os termos “proteína isolada”, “polipeptídeo isolado” ou “peptídeo isolado” são uma - proteína, polipeptídeo ou peptídeo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação: (1) não ser associada com componentes naturalmente associados que o — em seu - estado nativo, (2) ser livre de outras proteinas da mesma espécie, (3) ser expresso por uma - 30 —célulade uma espécie diferente, ou (4) não ocorrer na natureza.

Assim, um pegtídeo que é quimicamente sintetizado ou que é sintetizado em um sistema celular diferente da célula a 7 partir da qual ele origina naturalmente será “isolado” de seus componentes queime | associados.

Uma proteína pode também se tornar substancialmente livre dos componentes naturalmente associados por isolamento, usando técnicas de purificação de proteina bem | conhecidas na tecnologia.

Da maneira aqui usada, quando o termo "purificado" é usado com referência a uma molécula (por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína), significa que a -

| | | da molécula que está sendo purificada foi maior com relação às moléculas associados com ela em seu ambiente natural, ou ambiente em que ela foi produzida, encontradajou sinteti- ! zada.

Moléculas naturalmente associadas incluem proteínas, ácidos nest io: e 7 açúcares, mas geralmente não incluem água, tampões, e reagentes adicionados para man- teraintegridade ou facilitar a purificação da molécula que estão sendo purificada. " Em algumas modalidades, um composto é substancialmente puro e pateno quando tem pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 % em peso livres de moléculas orgânicas com as quais ele é neluraimento associado ou com as quais ele é associado durante a fabricação.

Em algumas modalidades, apreparação tem pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 90 %, pelo ménos 95 %, ou pelo menos 99 % em peso do composto de interesse com relação a seus contaminantes.

Um composto substancialmente puro ou purificado pode ser obtido, po exemplo, por extração de uma fonte natural (por exemplo, bactéria), sintetizando quimicamente um composto, ou por uma combinação de purificação e modificação química. um composto + 15 substancialmente puro ou purificado pode também ser obtido, por exemplo, enriquecendo uma amostra tendo um composto que liga um anticorpo de interesse, Pureza pode ser me- Y dida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia, espectroscopia de mas- sa, análise de cromatografia líquida de alto desempenho, etc. | O termo “heterólogo," da maneira aqui usada no contexto de um peptídeo ou poli- —peptídeolgE, onde uma proteina de fusão de polipeptídeo IgE compreende um peptídeo ou polipeptídeo IgE e um polipeptídeo “heterólogo”, refere-se a um polipeptídeo que é sem ser um peptídeo ou polipeptídeo IgE, por exemplo, um polipeptideo que não é normalmente as- sociado na natureza com um peptídeo ou polipeptídeo IgE.

Por exemplo, um otipeptídeo heterólogo não tem nenhuma identidade de sequência de aminoácidos significante com o peptídeo ou polipeptídeo IgE, por exemplo, o polipeptídeo heterólogo tem menos que cerca de 50 %, menos que cerca de 40 %, menos que cerca de 30 %, ou menos que cerca de 20 - % de identidade de sequência de aminoácidos com o peptídeo ou polipeptídeo IgE.

Da maneira aqui usada, o termo "distúrbio mediado por IgE" ou “distúrbio relaciona- - do a IgE” significa uma condição ou doença que caracterizada pela superproduéão elou hi- - 30 persensibilidade à IgE de imunoglobulina.

Especificamente seria explicado inc condições associadas com hipersensibilidade anafilática e alergias atópicas, incluindo, por exemplo: í asma, asma alérgica, rinite alérgica e conjuntivite (febre dos fenos), eczema, urticária, der- matite atópica, e alergias a alimento incluindo alergias a amendoim.

À condição fisiológica séria de choque anafilático causada, por exemplo, por picadas de abelha, picadas de cobra, alimentooumedicação, é também englobada no escopo deste termo.

Outros distúrbios me- diados por IgE incluem anafilaxia, dermatite de contato, gastroenteropatia alérgica, aspergi- lose pulmonar alérgica, púrpura alérgica, eczema, síndrome hiper IgE (Job's), hipersensibi-

| " : | ; | i dade anafilática, mieloma de IgE, doença do intestino inflamatório (por exemplo, fioença de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infecciosa), urticária, e psoríase. Peptídeo de IgE Antigênico da Invenção + A presente invenção diz respeito a peptídeos IgE, e peptídeos seus derilados, que ' foram identificados como porções do CH3 da IgE domínio capaz de formar laços que partici- . pam da interação de região CH3-CH4 com seu receptor FceRI de alta afinidade figura 1). Tais peptídeos IgE mostraram ser imunogênicos e não anafilatogênicos.

Tais peptídeos IgE antigênicos podem ser usados sozinhos ou em combinação, preferivelmente quando conjugados com um carreador imunogênico, para induzir) anticorpos auto-anti-lgE em um sujeito a fim de tratar, prevenir ou melhorar distúrbios relacionados a IgE.

Em particular, a presente invenção diz respeito a um imunógeno que consiste em, que consiste essencialmente, ou compreendendo um peptídeo IgE antigênico preferivelmen- te ligado a um carreador imunogênico. | “ 15 Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, consiste es- ' sencialmente, ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430 e suas variantes funcionalmente ativas, prefêrivelmente selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430. Em uma outra madalidade, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, consiste essencialmente, ou compreende uma se- —quênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 ajiss e suas variantes funcionalmente ativas, preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID Nos:1 a 153. Em uma outra modalidade, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, consiste essencialmente, ou compreende uma sequência de aminoácidos sel lclonada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 154 a 219 e suas variantes Rincnaient atas. pre- ferivelmente selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 154 a 219. Ainda em uma outra modalidade, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, consiste essenciálmente, ou - compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consisteem SEQ ID Nos: 220 a 310 e suas variantes funcionalmente ativas, preferivelmente selecionadas do - grupo que consiste em SEQ ID Nos: 220 a 310. Ainda em uma outra modalidade, o dito pep- - 30 tídeolgE antigênico consiste, consiste essencialmente, ou compreende uma séquência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 311 a 430 e Íuas varian- 7 tes funcionalmente ativas, preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 311 a 430. | O termo “peptídeo IgE antigênico”, dentro do significado da presente invenção, in- cluitodos os peptídeos derivados de CH3 da IgE, preferivelmente da aspácie mamífero, mais preferivelmente humano, bem como suas variantes, análogos, ortólogos, Homéólogos e derivados, e fragmentos desses que apresentam um “atividade biológica do fepcoo IgE h " o | NaN : | | | ' antigênico”. Preferivelmente, o termo “peptídeo IgE antigênico” refere-se a peptíieos com- preendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430, bem como em suas variantes, . homólogos e derivados que apresentam essencialmente a mesma atividade biológica.

Mais preferivelmente, o termo “peptídeo IgE antigênico” refere-se a peptídeos compreendendo, 7 consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos sklecionada do grupo que consiste em SEQ ID 1 a 430, mais preferivelmente a peptídeos contpreenden- do, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de — selecio- | nada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais, preferivel- | mente, os peptídeos compreendendo, consistindo ou consistindo eae o em uma | sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2: : 0 430. Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, óu consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que donsiste em SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23,24, ? 15 25,26,27,28,29,30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, as fa, 47, 48, - 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, .. 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,135,136,137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 148, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 1. 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 208, 204, 205, | 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, ! 224,225,226,227,228,229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, | 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, | - 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, : 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, | - 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 31, 312, 313, . 30 314,315,316,317,318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 324 330, 331, i 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, i 7 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, ' 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, ! 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, —404,405,406,407,408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430. Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, Ou con- | i siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, bo, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ba, 45, 46, 7 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, bs, 69, 70, 71,72,73,74,75,76,77, 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 9O, 91, bo, 93, 94, : 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 1 112, 1193, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129] 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147/ 148, 149, 150, 151, 152, e 153. | ! Preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essêncialmen- ' te, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEO ID Nos: | 1, 2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, br, 28,29, ' 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, bs, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, ji. 84, 85, | * 15 88,89,90,91,92, 93,94, 95,96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109) 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 7 136, 139, 140, 141, 144, 145 e 148. Mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, | 25,26,27,28,34,35, 36,37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, oo. 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, 127, 133 e 139. Ainda mais preferivel- mente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1, 2, 3,4,5,6, | 7,8,9,18,19,20,21,22,23,24, 25,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 e 109. Ainda mais preferivelmente, o * dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sebuência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1, 2,3,4,5,6, hs, 19,20, - 21,22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 e 76. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo , 30 IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aininoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1,2,3,18, 19 e 34. Acima de tudo prefe- 7 rivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 1 ou 18, ' Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, ou con- | siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165) 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183) 184, 185,

o Na) co RR 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,/202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, e 219. Preferi- | velmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma se- : ' quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 154,/155, 156, | 5 157,158,159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176,/177, 178, 7 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200,/201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217 . Mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 10 175,176,177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 e 200. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de amíi- noácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e

175. Acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste * 15 essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 154 ou 165] Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, Ou con- Y siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249; 250, 251, 252,253,254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285) 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303| 304, 305, 306, 307, 308, 309, e 310. Preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, Ou con- siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo lue consis- teem&SEQID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 232 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253) 256, 257, - 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e sos . Mais . - preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em | 30 uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ 1 Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, ' 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 | 290 . Ain- da mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmen- te, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 220,221,222,223,224,233,234,235, 236, 245, 246, 247, 256,257 e 266 Jainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ' Nos: 220, | |

ME EE | | 221, 222, 233, 234 3 245. Acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo E antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220 ou 233. | ' Ainda em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada e grupo que 7 consiste em SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 74, 376, 377, 378,379,380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 3092, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 1, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e eso.

Prefe- rivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma Ú sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID ne 311, 312, j . 15 313,314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, | 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, ss 353, 354, ” 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, | : 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, e. 397, 398, ; | 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 f 425. Mais ! | 20 preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em | : uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ D Nos: 311, |; 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403] 404 e 410. Aindamais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencial- | mente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste E SEQ ID Ps Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, | 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386 . Ainda mais preferiveintente, o dito o. peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de ami- | 7 30 —noácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 311, 312, 313, si 326, 327, 328, 340, 341 e 353 . Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, | Í ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 311, 312 e 326. Acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo | IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de Íminoácidos dasSEQIDNos:311ou312. O termo “atividade biológica do peptídeo IgE antigênico”, quando " aqui, refe- j | re-se a à capacidade de os peptídeos IgE antigênicos da invenção induzirem anticorpos au- : | o | : 12 | o to-anti-|lgE em um paciente, com um perfil antagonístico, como auto-anticorpos cdpazes de diminuir o nível de IgE livre circulante embora não causando nenhuma liberação mediada por IgE significante de mediadores inflamatórios e sendo ao mesmo tempo incapazes subs- ' tancialmente de ligar à IgE ligado a seu receptor de alta afinidade.

Ficará aparentt os ver- sados na tecnologia, que técnicas podem ser usadas para confirmar se um construto espe- : cífico cai no escopo da presente invenção.

Tais técnicas incluem, mas sem restrições, técni- cas descritas na seção de Exemplo do presente pedido, e também no seguinte. o peptídeo putativo pode ser ensaiado para acertar a imunogenicidade do construto, em que lantissoros ' elevados pelo peptídeo putativo reticularam com a molécula de IgE nativa, e são também | 10 funcionais no bloqueio de liberação de mediadores alérgicos das alérgicas células efetoras.

A especificidade dessas respostas pode ser confirmada por ensaios funtionais on- de o enfraquecimento de IgE pode ser quantificado e/ou por inibição de degranulação de células que expressam o receptor de IgE, ou por experimentos de competição loqueando a atividade do antissoro com o peptídeo ou a IgE nativa por si mesmos, e/ou antidorpos mo- - 15 — noclonais específicos que são conhecidos para ligar o epítopo no IgE.

Técnicas para acertar ligação com IgE-FcRI são também bem conhecidas pelos versados na sa by Em uma modalidade, os peptídeos IgE antigênicos da presente invenção|são de um j tamanho, de maneira tal que eles mimetizam uma região selecionada do domínio de IgE total, em que o epítopo nativo é encontrado.

Em uma modalidade particular, os peptídeos IgE antigênicos da invenção, são menos que 100 aminoácidos em comprimento, preferivel- mente menos que 75 aminoácidos, mais preferivelmente menos que 50 aminoácidos, ainda mais preferivelmente menos que 40 aminoácidos.

Os peptídeos IgE antigênicos da inven- ção, são tipicamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 22,23,24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos em comprimento, preferivelmente de 4 a 20 aminoáci- —dos,porexemplo,6a12,ou6 ag aminoácidos. h Exemplos específicos de peptídeos IgE antigênicos da invenção são fornecidos na | listagem de sequência e incluem peptídeos variando de 4 a 20 aminoácidos de comprimen- to. - Os peptídeos antigênicos da invenção incluem uma sequência de aminoácidos de- 7 30 —rivadosde um porção de CH3 da IgE humano, como porção derivada de CH3 humano tanto correspondente à sequência de aminoácidos de IgE de ocorrência natural quanto Corres- : pondente à IgE variante, isto é, à sequência de aminoácidos IgE de ocorrência natural em | que um pequeno número de aminoácidos foi substituído, adicionado ou deletato mas que retém essencialmente as mesmas propriedades imunológicas.

Além do mais, ta porção de CH3dalgE derivada pode ser adicionalmente modificada por aminoácidos, especialmente nos terminais do término N e C para permitir que o peptídeo IgE antigênico sele conformacr onalmente restrito e/ou para permitir acoplamento do peptídeo IgE antigênico | Um carrea- | À

13 | : dor imunogênico depois de química apropriada ser realizada. | Os peptídeos IgE antigênicos da presente invenção englobam peptídeds variantes funcionalmente ativos derivados da sequência de aminoácidos de CH; da IgE em que ami- 7 noácidos foram deletados, inseridos ou substituídos sem essencialmente prejudicar suas propriedades imunológicas, isto é, tais peptídeos variantes funcionalmente ativos retêm uma | " atividade biológica substancial do peptídeo IgE antigênico. Tipicamente, tais pegtídeos vari- antes têm funcionalmente uma sequência de aminoácidos homóloga, preferivelmente alta- mente homóloga, a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que Consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferivelmente a uma sequência de aminoácidos Selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente a | uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID|Nos: 220 a

430. Em uma modalidade, tais peptídeos variantes funcionalmente ativos apresentam | pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade com uma | . 15 sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1 a 430, | mais preferivelmente com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo ” consis- - te em SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente com uma sequência de | aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 220 a 430. Similaridade de sequência com polipeptídeos, que é também referida oro identi- dadede sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. Softwa- re de análise de proteina casa sequências similares usando medidas de similaridade proje- tadas para várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativo. Por exemplo, GCG contém programas tais como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros padrões para determinar homologia do sequência ouidentidade de sequência entre polipeptídeos proximamente relacionados, as como poli- | peptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteina tipo sel- c vagem e uma muteína destes. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptí- deos também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrões ou reco- * mendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, sn FASTA3) | ' 30 fornecem alinhamentos e identidade de porcentagem de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. , 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Um a alternati- | vo quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados Y ntendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de icomputador — BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros padrões. Ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Rês. 25:3389- 402 (1997).

| | | | : ' 14 | ' Variantes funcionalmente ativas compreendem variantes funcionalmente ativas de ocorrência natural tais como variantes alélicas e variantes da espécie e variantes! funcional- | mente ativas de ocorrência não natural que podem ser produzidas, por exemplo) por técni- | ' cas de mutagênese ou por síntese direta. | | Uma variante funcionalmente ativa difere por cerca, por exemplo, de 1, 2) 3,4, 5,6, ' 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido de qualquer do peptideo mostrado nas SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferivelmente nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais) preferivel- mente nas SEQ ID Nos: 220 a 430, e ainda retém uma atividade biológica de IgE Intigênica.

Onde esta comparação exige alinhamento, as sequências são alinhadas pera romalogi máxima.

O sítio de variação pode ocorrer em qualquer lugar no peptídeo, de maneira que a atividade biológica seja substancialmente similar a um peptídeo mostrado nas sto ID Nos: | 1 a 430, mais preferivelmente de forma substancial similar a um peptídeo mostrado nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente de forma substancial similar a um peptídeo mostrado nas SEQ ID Nos: 220 a 430. | ” 15 Diretriz com relação a como fazer substituições de aminoácido fenotipicamente si- lenciosas é fornecida em Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990), que prócaltua que 7 existem duas estratégias principais para estudar a tolerância de uma sequência te aminoá- cidos a mudança. | A primeira estratégia explica a tolerância de substituições de aminoácido por sele- ção natural durante o processo de evolução.

Comparando-se sequências de aminoácidos em diferentes espécies, as posições de aminoácido que foram conservados ente as espé- cies podem ser identificadas, Esses aminoácidos conservados são provavelmente importan- tes para função da proteina.

Ao contrário, as posições de aminoácido em que substituições foram toleradas por seleção natural indicam posições que não são críticas para função da proteina.

Assim, posições que toleram substituição de aminoácido podem ser hodificadas mantendo ainda ao mesmo tempo a atividade imunogênica específica do peptiddo modifica- - do.

A segunda estratégia usa engenharia genética para introduzir trocas de aminoácido - nas posições específicas de um gene clonado para identificar regiões críticas para função 7 30 da proteína.

Por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina pode ser usada (Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)). os peptídeos " variantes resultantes podem então ser testados para atividade biológica específica de IgE antigênica. | De acordo com Bowie et al., essas duas estratégias revelaram que proteínas são | surpreendentemente tolerantes a substituições de aminoácido.

Os autores adicionalmente | indicam que trocas de aminoácido devem provavelmente ser permissíveis em. posi- | ções de aminoácido na proteína.

Por exemplo, a maioria dos resíduos de aminoácido enter- | | | |!

| | 15 Ú rados ou interiores (na estrutura terciária da proteína) exige cadeias laterais não UA ao passo que algumas características de cadeias laterais superficiais ou exteriores bão geral- mente conservadas. | ' Métodos de introduzir uma mutação nos aminoácidos de uma proteína são bem co- —nhecidos pelos versados na tecnologia.

Ver, por exemplo, Ausubel (ed.), Curren : Protocols " in Biology molecular, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T.

Maniatis, E, F. gde and J.

Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold | Spring Harbor, N.

Y. (1989)). | Mutações podem também ser introduzidas usando estojos comercialmente disponí- veistais como "QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene) ou diretamente por síntese do peptídeo.

A geração de uma variante funcionalmente ativa com um peptídeo IgE antigênico substituindo um aminoácido que não influencia significativamente a função do dito peptídeo IgE antigênico pode ser realizada por versados na tecnologia. | Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita em um dos peptídeos de . 15 acordo coma invenção é uma substituição de aminoácido conservativa.

Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por um ; outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral) com propriedádes quími- cas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de ami- noácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais é uma pro- teina.

Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservativas, a identidade de sequência de porcentagem ou grau “ similari- dade pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição, Meios para fazer estes ajustes são bem conhecidos pelos versados na tecnologia.

Ver por exemplo, Pearson, Methods Mol.

Biol. 243:307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valinal leucina, e - isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxilas alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias lterais con- tendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalaninatirosina, e - triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais acídi- 1 30 cas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre! cisteina e metionina.

Os grupos de substituição aminoácidos conservativos preferidos bão: valina- 7 leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina.

Í Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança com um valor posítivona matriz de verossimilhança log PAM250 revelada em Gonnet et hi, Science 256:1443-45 (1992). Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança com um valor não negativo na matriz de verossimilhança log PAM250. |

| 16 : Um peptídeo variante funcionalmente ativo pode também ser isolado usando uma técnica de hibridização.

Resumidamente, DNA tendo uma alta homologia com toda ou parte de um sequência de ácido nucléico que codifica o peptídeo, polipeptídeo ou —. de inte- ' resse, por exemplo, SEQ ID Nos: 1 a 430 é usado para preparar um peptídeo funcionalmen- teativo.

Portanto, um peptídeo IgE antigênico da invenção também inclui peptídeos que são ' funcionalmente equivalentes a um ou mais dos peptídeos das SEQ ID Nos: 1 a lago e que são codificados por um molécula de ácido nucléico que hibridiza com um ácido núeléico que codifica qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 a 430 ou um de seu complemento.

Vdrsados na tecnologia podem facilmente determinar sequências de ácido nucléico que codíflam peptí- deosdainvenção usando tabelas de códon facilmente disponíveis.

Como tal, ess. s sequên- cias de ácido nucléico não são apresentadas aqui. | O rigor da hibridização para um ácido nucléico que codifica um peptídeo, polipeptí- deo ou proteína que é uma variante funcionalmente ativa é, por exemplo, 10 % foimamida, 5 x SSPE, solução de Denhart 1 x, e DNA de esperma de salmão 1 x (condições de baixo ri- » 15 gor). Condições mais preferíveis são formamida 25 %, SSPE 5 x, solução de Dernar Ixe DNA de esperma de salmão 1 x (condições de rigor moderado), e condições ainda mais * preferíveis são formamida 50 %, SSPE 5 x, solução de Denhart 1 x, e DNA de dsperma de | salmão1 x (condições de rigor alto). Entretanto, diversos fatores influenciam o ridor de hibri- ' dização sem ser a concentração de formamida supradescrita, e versados na tecnologia po- dem selecionar adequadamente esses fatores para realizar um rigor similar. | Moléculas de ácido nucléico que codificam uma variante funcionalmente ativa po- dem também ser isoladas por um método de amplificação genética tal como PÉR, usando | uma porção de um DNA de molécula de ácido nucléico que codifica um peptídeo, polipeptí- deo ou proteína de interesse, por exemplo, qualquer um dos peptídeos mostram SEQ ID —Nos:1a430,comoa sonda.

Com o propósito da presente invenção, deve-se considerar que diversos peptídeos - IgE antigênicos da invenção podem ser usados em combinação.

Todos os tipos de combi- nações possíveis podem ser previstos.

Por exemplo, um polipeptídeo compreendendo mais * que um peptídeo IgE antigênico, preferivelmente selecionado de SEQ ID Nos: 1 h 430, mais ' 30 preferiveimente de SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferiveimente de SEQ ID Nos: 220 a 430, pode ser usado, em que o mesmo peptídeo IgE antigênico é upado em di- 7 versas cópias na mesma molécula do polipeptídeo, ou em que peptídeos IgE antigênicos de diferentes sequências de aminoácidos são usados na mesma molécula do polipentideo; os diferentes peptídeos IgE antigênicos ou cópias sendo diretamente fundidos umas nas outras ou espaçadas por ligantes apropriados, Da maneira aqui usada, o termo “(poliiteptideo IgE antigênicos multimerizado” refere-se a ambos tipos de combinação em que páptideos IgE antigênicos tanto de sequência diferente quanto da mesma sequência de aminoácidos estão |

: 17 | presentes em uma única molécula do polipeptídeo.

De 2 a cerca de 20 peptídeos IgE anti- gênicos idênticos e/ou diferenciados, preferivelmente 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 peptídeds IgE anti- gênicos, podem estar assim presentes em uma única molécula de polipeptídeo dE antigêni-

" co multimerizado. | Em um aspecto da invenção, o imunógeno consiste, consiste essencialmente, ou Í compreende um peptídeo IgE antigênico multimerizado que consiste, que consiste essenci- almente, ou que compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos seletionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430 e suas variantes funcionalmente atvas, prefe- rivelmente selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430. Em uma modali-

| 10 dade, o dito peptídeo IgE multimerizado compreende um primeiro peptídeo assa | compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 1 à 153 e um segundo peptídeo IgE antigênico compreendendo um: | sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 154 a 219 bu SEQ ID | No: 220 a 310 ou SEQ ID No: 311 a 430. Em uma outra modalidade, o dito peptideo IgE * 15 —multimerizado compreende um primeiro peptídeo IgE antigênico compreendendo uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 154 a 219 e um b segundo peptídeo IgE antigênico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID No: 1 a 153 ou SEQ ID No: 220 a sto os SEQ ID No: 311 a 430. Ainda em uma outra modalidade, o dito peptídeo IgE multimerizado compre- endeum primeiro peptídeo IgE antigênico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 220 a 310 e um segundo phptideo IgE antigênico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID No: 1 a 153 ou SEQ ID No: 154 a 219 ou SEQ ID No: 311 a as.

Ainda em uma outra modalidade, o dito peptídeo IgE multimerizado compreende um primeiro peptídeo IgE antigênico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 311 a 430 e um segundo peptídeo IgE antigênico compreendendo + uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 1a153 ou SEQ ID No: 154 a 219 ou SEQ ID No: 220 a 310. Ainda em uma outra modalidade, o dito - peptídeo IgE multimerizado compreende um primeiro peptídeo IgE entirica come SS 30 — dendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 311 a 430, um segundo peptídeo IgE antigênico compreendendo uma sequência de amino- 7 ácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No: 220 a 310 e um terceiro peptídeo IgE antigênico compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada " grupo que consiste em SEQ ID No: 154 a 219 ou SEQ ID NO: 1 a 153, Em uma modalidade da invenção, um peptídeo, polipeptídeo ou proteina da inven- ção são derivados de uma fonte natural e isolados de um mamífero, tais como Um humano, um primata, um gato, um cão, um cavalo, um camundongo, ou um rato, TT de

18 | uma fonte humana. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína da invenção prá asim ser isolado das fontes de células ou tecido usando técnicas de purificação de proteina/padrões. | Alternativamente, peptídeos, polipeptídeos e proteínas da invenção podem ser sin- ' tetizados quimicamente ou produzidos usando técnicas de DNA recombinante. ! Por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína da invenção podem Ser sinteti- ' zados por procedimentos bem conhecidos de fase sólida na tecnologia. Sínteses adequadas podem ser realizadas utilizando procedimentos "T-boc" ou "F-moc". Peptídeos cíclicos po- dem ser sintetizados pelo procedimento de fase sólida empregando o procedimento bem conhecido "F-moc" e resina de poliamida no aparelho totalmente automatizado. Alternativa- mente, versados na tecnologia conhecerão os procedimentos de laboratório nicassários para realizar o processo manualmente. Técnicas e procedimentos para síntese dé fase sóli- da são descritos em 'Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach' by É. Atherton and R. C. Sheppard, publicado por IRL at Oxford University Press (1989) and * ethods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. Wi Pemington leme B. M. : 15 Dunn), chapter 7, pp91-171 por D. Andreau et al. d Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo, polipeptí jeo ou pro- * teina da invenção pode ser introduzido em um vetor de expressão que pode ser expresso em um sistema de expressão adequado usando técnicas bem conhecidas na Tecnatoaia seguidas por isolamento ou purificação do peptídeo, polipeptídeo, ou proteína dê interesse expresso. Uma variedade de sistemas de expressão bacteriana, de levedura, planta, mamií- fero, e inseto são disponíveis na tecnologia e qualquer sistema de expressão como esse pode ser usado. Opcionalmente, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo, pblipeptídeo ou proteína da invenção pode ser traduzido em um sistema de tradução sem célula. Peptídeos IgE antigênicas da invenção podem também compreender atueles que surgem em decorrência da existência de múltiplos genes, eventos de transcrição alternati- vos, eventos de recomposição de RNA alternativos, e eventos translaciondis e pós- - translacionais alternativos. Um peptídeo pode ser expresso em sistemas, por ekempo, de células cultivadas, que resulta substancialmente nas mesmas modificações pós-

Í 7 translacionais presentes como quando o peptídeo é expresso em uma célula nativa, ou em 7 30 sistemas que resulta na alteração ou omissão de modificações pós-translacio: tais, por e- xemplo, glicosilação ou clivagem, presente quando expresso em uma célula nato , Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína da invenção, tais como um peptídeo IgE an- tigênico, pode ser produzido como uma proteína de fusão que contém outro sequências de aminoácidos não IgE ou derivadas não IgE, tais como ligantes de aminoácido ou sequências desinalou carreadores imunogênicos da maneira definida aqui, bem como ligantes usados em purificação de proteína, tais como glutationa-S-transferase, etiqueta de histidiha, e prote- ina A estafilococo. Mais que um peptídeo IgE antigênico da invenção pode estir presente |

! 19 | | em uma proteína de fusão. O polipeptídeo heterólogo pode ser fundido, por exemplo, no terminal N ou terminal C do peptídeo, polipeptídeo ou proteina da invenção. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína da invenção podem também ser produzidos como proteinas de " fusão compreendendo sequências de aminoácidos homólogas, isto é, outras Senlências de IgEouderivadas de lgE. | ' Os peptídeos IgE antigênicos da invenção podem ser lineares ou contomacionat- | mente restritos. Em modalidades preferidas da invenção, o peptídeo IgE antigênico é con- formacionalmente restrito. Da maneira aqui usada com referência a uma molécula, o termo "conformacionalmente restrito” significa uma molécula, tais como um peptídeo, polipeptídao ou proteina, em que a estrutura tridimensional é mantida substancialmente em im arranjo espacial com o tempo. Moléculas conformacionalmente restritas podem ter melhores propri- edades tais como maior afinidade, estabilidade metabólica, permeabilidade ou solubilidade da membrana. | Além do mais, espera-se que tais moléculas conformacionalmente restritas estejam . 15 presentes no Epítopo de IgE antigênica em uma conformação similar à sua conformação do laço nativo, induzindo por meio deste anticorpos anti-lgE mais suscetíveis para leconhecer 3 moléculas de IgE intactas auto-nativas ou com uma maior afinidade para reconhecer molé- culas auto-lgE. Métodos de restrição conformacional são bem conhecidos na tecnologia e incluem, sem limitações, ligação e ciclização.

Existem diversas abordagens conhecidas na tecnologia anterior para introduzir res- trições conformacionais em uma cadeia de peptídeo ou polipeptídeo linear. Pr exemplo, ligação entre dois aminoácidos vizinhos em um peptídeo leva a uma modificação conforma- cional local, a flexibilidade da qual é limitada em comparação com aquela dos peptídeos regulares. Algumas possibilidades para formar tais ligações incluem incorporação de lacta- nasepiperazinonas (para revisão ver Giannis and. Kolter, Angew. Chem. Int. Ed., 1993,32: 1244).

Da maneira aqui usada com referência a um peptídeo, o termo “cíclico” refere-se a | uma estrutura incluindo uma ligação intramolecular entre dois aminoácidos não| adjacentes 7 ou aminoácido análogos. A ciclização pode ser efetuada através de uma ligação covalente o 30 ounão covalente. Ligações intramoleculares incluem, mas sem limitações, espirha dorsal a espinha dorsal, cadeia lateral a espinha dorsal, cadeia lateral a cadeia lateral, cúdeia lateral o” a grupo terminal, ligações terminais a terminais. Métodos de ciclização incluem, sem limita- | ções, formação de uma ligação de dissulfeto entre as cadeias laterais de tom sem não : adjacentes ou aminoácidos análogos; formação de uma ligação de amida entre as cadeias laterais de resíduos de Lys e Asp/Glu; formação de uma ligação de éster entre — de serina e resíduos de Asp/Glu; formação de uma ligação de lactam, por exemplo, entre um grupo de cadeia lateral de um aminoácido ou seu análogo com o amina do T N do

Ú resíduo amino-terminal; e formação de ligações de lisinonorleucina e ditirosina.

Versões de carbono de uma ligação de dissulfeto, por exemplo, uma ligação de etenila ou etila, pode também ser usada (J.

Peptide Sc., 2008, 14, 898-902) bem como reações de alquilação com um reagente apropriadamente eletrofílico polissubstituído tal como um di-, tri- ou tetra- | ; 5 aloalcano(PNAS, 2008, 105(40), 15293-15298; ChemBioChem, 2005, 6, 821-824). Vários | Í análogos de prolina modificados podem também ser usados para incorporar restrições con- | formacionais nos peptídeos (Zhang et al., J.

Med Chem., 1996,39: 2738-2744; Preifer and Robinson, Chem.

Comm., 1998,1977-1978). Substâncias químicas que podem ler usadas para ciclizar peptídeos da invenção resultam em peptídeos ciclizados com umal ligação in- ! —cluindo, mas sem limitações, o seguinte: ligações de lactam, hidrazona, oxima,; tiazolidina, tioéter ou sulfônio. | Ainda uma outra abordagem no projeto de peptídeos conformacionalmente restri- tos, que é descrita em US10/114918, é anexar uma sequência de aminoácidos pequeno de interesse a um gabarito, para gerar um peptídeo cíclico restrito.

Tais peptídeos cíclicos não E Ea E Main aa ata Mega ET ais nas proteínas conformações tridimensionais que podem imitar epítopos conformacior de mamífero autó- , nativas tais como em virus e parasitas ou nas auto-proteínas (proteínas ; lineares a degra- logo tal como IgE), mas eles são também mais resistentes que peptídeos: e de conformacio- dação proteolitica no soro.

US 10/114918 revela adicionalmente a síntes intéticos para aco- 20 nalmente restrita peptídeos reticulados por preparação de aminoácidos s os a fim de estabi- plamento da espinha dorsal nos aminoácidos apropriadamente posicionad da por hcoplamen- lizar a estrutura super secundária de peptídeos.

Reticulação pode ser obti oprolina ortogonal- to de amida do grupo amino primário de um resíduo de (2S, 3R) -3-amin nte posicionado de mente protegido com um grupo o-carboxila de cadeia lateral adequadame tetrapeptídeo con- 25 glutamato.

Esta abordagem foi seguida na preparação de repetições de foi substituída por formacionalmente restrito da proteína CS em que pelo menos uma prolina deia láteral, gluta- (28, 3R) -3-aminoprolina e, a fim de introduzir um grupo o-carboxila de c: | mato foi incorporado como uma substituição para alanina. io de metátese de ' Estratégias de reticulação também incluem a aplicação da reaç: los paia mimetizar " 30 fechamento do anel Grubbs para formar peptídeos “grampeados' projetac JACS, 2000, 122, conformações ailfa-helicoidal (Angew.

Int.

Ed.

Engl., 1998, 37, 3281; stionina (Chemistry 5891); uso de sacarídeos polifuncionalizados; uso de uma ligação de tripte os que podem ser Eu.

J., 2008, 24, 3404-3409); uso de reação tipo “click' de azidas e alcin into localizados na incorporados tanto como um resíduos de aminoácido de cadeia lateral que 4), 1128-1137). É 35 espinha dorsal da sequência de peptídeo (Drug Disc.

Today, 2003, 8(< formações de pep- também conhecido na literatura que íons de metal podem estabilizar con por exemplo, histi- tídeos lineares limitadas através de resíduos específicos sequestrantes,

: | 21 | ' dina, que co-ordenam com cátions metálicos (Angew.

Int.

Ed.

Engl., 2003, 42, 421). Simi- larmente, funcionalização de uma sequência de peptídeo linear com funcionalidade do ácido não natural e amina, ou funcionalidade de poliamina e poliácido pode ser usada bara permi- Í tir acesso a estruturas ciclizadas após a ativação e formação de ligação de amida.

De acordo com uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico é conformadionalmente | Ú restrito por ligação covalente intramolecular de dois aminoácidos não adjacentes do pepti- ! deo IgE antigênico um no outro, por exemplo, os aminoácidos dos terminais N e C.

De acor- do com uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção é confôrmacional- mente restrito por ligação covalente a uma molécula andaime.

De acordo com Uma modali- dade adicional, o peptídeo IgE antigênico é simplesmente restrito, isto é, acoplado tanto em ' um terminal, (terminal C ou D) ou através de um outro aminoácido não localizado em qual- quer um terminal, na molécula andaime.

De acordo com uma outra —— peptídeo ' IgE antigênico é duplamente restrito, isto é, acoplado tanto nos terminais C quanto N na mo- lécula andaime, De acordo com uma outra modalidade, o peptídeo antigênico é fesrto cicli- . 15 —zando por meio do efeito de formação de gabarito de uma unidade diprolina heteroquiral (D- Pro-L-Pro) (Spath et al, 1998, Helvetica Chimica Acta 81, p1726-1738). Exemplos ilustrati- MÁ vos, mas não limitantes de peptídeos conformacionalmente restritos de acordo com a inven- | ção, são graficamente representados na figura 2. | ' O andaime (também denominado 'plataforma') pode ser qualquer molécula que é ' capaz de reduzir, através de ligação covalente, o número de conformações que o peptídeo IgE antigênico pode assumir.

Exemplos de andaimes que restringem a ame incluem Í proteínas e peptídeos, por exemplo, moléculas relacionadas a lipocalina tais como proteínas tipo tioredoxina e tioredoxina contendo beta-barrel, nucleases (por exemplo, RNasea), pro- | teases (por exemplo, tripsina), inibidores de protease (por exemplo, eglina C), anticorpos ou ' fragmentos estruturalmente rígidos desses, proteínas fluorescentes tais como GFP ou YFP, ' conotoxinas, regiões de laço de domínio III tipo fibronectina, CTL-A4, e partículas tipo vírus - (VLPs). Outras moléculas plataformas adequadas incluem carboidratos tal como sefarose.

GO A plataforma pode ser uma molécula linear ou circular, por exemplo, fechada bara formar o 30 umlaço.A plataforma é geralmente heteróloga com relação ao peptídeo IgE antgêrico.

Ob- servou-se que tais peptídeos conformacionalmente restritos ligados a uma plataforma são , mais resistentes a degradação proteolítica que o peptídeo linear. h De acordo com uma modalidade preferida, o andaime é um carreador imunogênico da maneira definida no presente pedido, preferivelmente uma proteína carreadora heterólo- gaouumaVLlP.Em uma modalidade, adicional, o peptídeo IgE antigênico é Testito sim- plesmente no carreador imunogênico.

Em uma outra modalidade adicional, o peptídeo IgE antigênico é duplamente restrito no carreador imunogênico.

Desta maneira, o peptídeo IgE i 22 | antigênico forma uma estrutura de laço conformacionalmente restrita que mostras ser uma estrutura particularmente adequada como uma molécula de reconhecimento intracslutar. . Os peptídeos IgE antigênicos da invenção podem ser modificados para a facilidade Í de conjugação com uma plataforma, por exemplo, pela adição de um cisteina tárminal em um ou ambos terminais e/ou pela adição de um sequência ligante, uma dupla cabeça ou ; : cauda de glicina como essa, um ligante que termina com um resíduo de lisina ol qualquer outro ligante conhecido pelos versados na tecnologia para realizar tal função.

Qlímica bio- ortogonal pode também ser usada (tal como a reação tipo click descrita anteriormente) para acoplar a sequência de peptídeo completa no carreador, evitando assim aten rate regioquímico e quimioseletividade.

Ligantes rigidificados tais como os descritos em Jones et al.

Angew.

Chem.

Int.

Ed. 2002, 41:4241-4244 são conhecidos para elicitar uma tnelhor res- posta imunológica e podem também ser usados. | | Em uma modalidade, adicional, o peptídeo IgE antigênico é anexado a um gabarito multivalente, que é por si mesmo acoplado ao carreador, aumentando assim a densidade do . 15 —antigeno (ver a seguir). O gabarito multivalente pode ser um polímero ou oligômero apropri- | adamente funcionalizado tal como (mas sem limitações) oligoglutamato ou oligoquitosano. * O. | e. | Linker< emos Antigente peptide / é | O dito ligante pode ser localizado no terminal N do peptídeo, ou no telminal Cc do peptídeo, ou ambos terminais do peptídeo.

O dito ligante pode ser de O a 10 aminoácidos de comprimento, preferivelmente de O a 6 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferivel- ' 20 mente 2-3 aminoácidos de comprimento.

Alternativamente, adição ou substituicão de uma forma de estereoisômero D de um ou mais dos aminoácidos pode ser realizada para criar um derivado benéfico, por exemplo, para melhorar a estabilidade do peptídeo. | Combinações exemplares de conjugações, todas no escopo da presente invenção . e constituindo várias modalidades, usando vários ligantes são fornecidas a seguir Peptídeo — GGGGGC — andaime | Peptídeo — GGGGC — andaime i Peptídeo — GGGC — andaime Peptídeo — GGC — andaime Peptídeo — GC — andaime Peptídeo — C — andaime | |

| | 23

Í | Peptídeo — GGGEGK | | Peptídeo — GGGGK Peptídeo — GGGK | . Peptídeo — GGK | Peptídeo — GK , Peptídeo — K Peptídeo — GGGGSC | Peptídeo — GGGSC | Peptídeo — GGSC Peptídeo — GSC Peptídeo — SC | CSGGGG — Peptideo | CSGGG- Peptídeo | CSGG- Peptídeo , 15 CSG- Peptídeo CS — Peptídeo 7 Em uma modalidade, o peptídeo consiste em qualquer peptídeo IgE antibênico aqui revelado e o andaime consiste em qualquer carreador imunogênico aqui revelado, preferi- velmente uma VLP. Combinações exemplares de conjugações usando vários ligantes e pebtideos du- plamente restritos são fornecidas a seguir, onde o carreador pode ser o monômêro idêntico de um carreador ou um monômero diferenciado de um carreador. (No exemploja seguir, o | ligante GC pode ser substituído por qualquer ligante GK ou ligante GSC exemplificado ante- riormente ou qualquer outro conhecido pelos versados na tecnologia): Carreador — CGGGGG — Peptideo — GGGGGC — carreador | Carreador — CGGGG — Peptídeo —- GGGGC — carreador 7 Carreador — CGGGG — Peptídeo — GGGGC — carreador Carreador - CGGG — Peptídeo — GGGC — carreador | * Carreador — CG — Peptídeo — GC — carreador " 30 Carreador — C — Peptídeo — C — carreador | Em uma modalidade, o peptídeo consiste em qualquer peptídeo IgE antigênico aqui ' revelado e o carreador consiste em qualquer carreador imunogênico aqui revel do, preferi- velmente uma VLP. | Em uma modalidade, um resíduo de cisteína terminal, se já não presente na se- —quênciade aminoácidos do peptídeo IgE antigênico, é adicionado a um ou ambos terminais de qualquer peptídeo IgE antigênico das SEQ ID Nos: 1 a 430 para gerar um pêptídeo con- formacionalmente restrito. Em uma modalidade preferida, o peptídeo de IgE antgênico con- |

24 | formacionalmente restrito da invenção é selecionado do grupo que consiste nas SEQ |D Nos: 1 a 430 e suas variantes funcionalmente ativas, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a ' 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220a

430. Em uma modalidade, o dito resíduo de cisteína terminal é adicionado no terminal Cc do ' dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra modalidade, o dito resíduo de cisteína/terminal é adicionado no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra modalidade um resíduo de cisteína terminal é adicionado tanto no terminal C quanto no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra modalidade, um ligante GC compreendendo um número variável de resíduos de glicina e um resíduo de cisteína terminal é adicionado a um ou ambos terminais de qualquer peptídeo IgE antigênico das SEQ ID Nos: 1 a 430 para gerar um peptídeo con- formacionalmente restrito. Preferivelmente, o ligante GC compreende de 1 a 10 rêsiduos de glicina, mais preferivelmente 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de glicina. Em uma modalid: ide preferi- . 15 da adicional, o peptídeo de IgE antigênico conformacionalmente restrito da inventão é sele- cionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, e suas variantes funcionalmente í ativas, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferiveimen- te do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430. Em uma modalidade, o dito dante GCé adicionado no terminal C do dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra modaliade o dito ligante GC é adicionado no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra moda- lidade, o dito ligante GC é adicionado tanto no terminal C quanto no terminal N | dito pep- | tídeo IgE antigênico. | i Ainda em uma outra modalidade, um ligante GC compreendendo um número variá- | —velde resíduos de glicina e um resíduo de cisteina terminal é adicionado a um foice do | peptídeo IgE antigênico das SEQ ID Nos: 1 a 430 e um resíduo de cisteina terminal, se já . não presente no outro terminal do peptídeo IgE antigênico, é adicionado ao outrojisrminal do peptídeo antigênico. Preferivelmente, o ligante GC compreende de 1 a 10 resíduos de glici- . na, mais preferivelmente 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de glicina. Em uma modalidade preferida ! " 30 adicional, o peptídeo de IgE antigênico conformacionalmente restrito da invenção é selecio- ! nado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, e suas variantes funcionalmente ati- Í ' vas, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferivelmente | do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferitalimente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430. Em uma modalidade, o dito ligante GC é adicionado no terminal C do dito peptídeo IgE antigênico e o dito resíduo de cisteina termi- nal é adicionado no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico. Em uma outra modalidade, o dito ligante GC é adicionado no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico e o | resíduo |

| 25 de cisteína terminal é adicionado no terminal C do dito peptídeo IgE antigênico.

Em uma modalidade preferida adicional, o ligante GC é modificado, preferivelmente pela adição de um resíduo de lisina, a fim de permitir conjugação do dito ligante adoptado ao : Í dito peptídeo IgE antigênico a um molécula andaime.

Ainda em uma modalidade preferida adicional, o peptídeo de IgE antigênico conformacionalmente restrito da invanção é selecio- : nado do grupo que consiste no grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, e slas varian- tes funcionalmente ativas, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1a 430, | mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a hão, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430. Em uma modalida- de,oditoligante GC modificado é adicionado no terminal C do dito peptídeo 19E bntigêrico, Em uma outra modalidade, o dito ligante GC modificado é adicionado no terminal N do dito peptídeo IgE antigênico.

Em uma modalidade, o peptídeo de IgE antigênico conformacionalmente restrito da invenção é qualquer peptídeo revelado na tabela 9. . 15 Carreador imunogênico da invenção Em uma modalidade, da presente invenção, o peptídeo IgE antigênico ou polipeptí- 7 deo da invenção é ligado a um molécula carreadora imunogênica para formar iinunógenos para protocolos de vacinação, preferivelmente em que o molécula carreadora não é relacio- nada à molécula de IgE nativa.

O termo "carreador imunogênico" aqui inclui aqueles materiais que têm a proprie- dade de elicitar independentemente uma resposta imunogênica em um animal hospedeiro e que pode ser covalentemente acoplado a um peptídeo, polipeptídeo ou proteina tanto dire- tamente por meio de formação de peptídeo ou ligações de éster entre grupos darboxila, a- mino ou hidroxila livre no peptídeo, polipeptídeo ou proteina e grupos correspondentes no material do carreador imunogênico, quanto alternativamente por ligação através de um gru- po de ligação bifuncional convencional, ou como uma proteína de fusão. . Os tipos de carreadores usados nos imunógenos da presente invenção/|serão facil- ” mente conhecidos pelos versados na tecnologia.

Exemplos de tais carreadores| imunogêni- " cos são: albuminas de soro tais como albumina de soro bovino (BSA) globulinas; tiroglobuli- ' 30 nas; hemoglobinas; hemocianinas (particularmente Keyhole Limpet Hemocyanin hero; pro- teinas extraídas de áscaris, toxinas bacterianas inativadas ou toxóides tais como toxinas de ' tétano ou difteria (TT e DT) ou CRM197, a proteína purificada derivada de tuberculina (PPD); ou Proteína D de Haemophilus influenzae (WO 91/18926) ou seus fragmentos re- combinantes (por exemplo, Domínio 1 de Fragmento C de TT, ou o domínio de translocação debDTouProteíinaD 1/3rd compreendendo os aminoácidos 100-110 do terminal N de prote- ina D de Haemophilus influenzae (GB 9717953. 5); polilisina; poliácido glutâmicb: copolime- ros de lisina-ácido glutâmico; copolímeros contendo lisina ou ornitina; carreadotes de lipos- | | |

| i 26 | | somo, etc. | Em uma modalidade, o carreador imunogênico é KLH.

Em uma outra modalidade, o | carreador imunogênico é uma partícula tipo vírus (VLPs), preferivelmente uma párticula tipo " vírus recombinante. ' | Da maneira aqui usada, o termo "partícula tipo vírus" refere-se a uma estrutura se- ' melhante a uma partícula de vírus, mas que demonstrou não ser patogênica.

Em geral, par- tículas tipo vírus não têm pelo menos parte do genoma viral.

Também, partículas tipo vírus podem frequentemente ser produzidas em grandes quantidades por expressão heteróloga e podem ser facilmente purificadas.

Uma partícula tipo vírus de acordo com a invenção pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma.

Uma modalidade típica e preferida de uma partícula tipo vírus de acordo com a presente invenção é um capsídeo viral tais como o cap- sideo viral do vírus, bacteriófago correspondentes, ou RNA-fago. | Da maneira aqui usada, os termos "partícula tipo vírus de um bacteriófago" referem- se a uma partícula tipo vírus parecendo a estrutura de um bacteriófago, não sendo replicati- . 15 vaenão infecciosa, e não tendo pelo menos o gene ou genes que codificam para o maqui- nário de replicação do bacteriófago, e tipicamente não tem também o gene ou/genes que . codificam a proteína ou proteínas responsáveis pela anexação viral ao hospedeiro ou entra nele.

Esta definição deve, entretanto, também englobar partículas tipo vírus e bacteriófa- gos, em que o gene ou genes supramencionados estão ainda presentes, mas inativos e, portanto, também levam a partículas tipo vírus não replicativas e não infecciosas de um bac- | teriófago. | A estrutura de capsídeo formado a partir da automontagem de 180 subunidades de proteína de revestimento de RNA-fago e opcionalmente contendo RNA hospedeiro é aqui referida como uma "VLP de proteína de revestimento de RNA-fago". Um exemplo específico éaVWVlP de proteina de revestimento Qbeta.

Neste caso particular, a VLP de 'protera de revestimento Qbeta pode tanto ser montada exclusivamente de subunidades Qbeta CP (ge- “ radas por expressão de um gene Qbeta CP contendo, por exemplo, um códorl de parada : TAA precludindo qualquer expressão da proteína A1 maiores através de suprestão, ver Ko- Y zlovska, T.

M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)), quanto adicionalmente contor subunida- , 30 desde proteina Al na montagem de capsídeo.

Geralmente, a porcentagem apra A1 de Qbeta com relação a Qbeta CP na montagem de capsídeo será limitada, a fim de garantir ' formação de capsídeo. | | Exemplos de VLPs adequadas como carreadores imunogênicos no contexto da presente invenção incluem, mas sem limitações, as proteínas de capsídeo de Vírus da He- patiteB (Ulrich, etal., Vírus Res. 50: 141-182 (1998)), vírus de sarampo (Warnes, etal., Ge- ne 160: 173-178 (1995)), vírus de Sindbis, rotavírus (U.

S.

Patente Nos. 5,071, 651 e 5,374, 426), vírus da doença do pé e boca (Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, Ns vírus ' | o ! o TA ">" | | 27 | | ' de Norwalk (Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, S.

M., et L.

J Clin. ; Invest. 87: 1456-1461 (1991)), a proteina GAG retroviral (PCT Patente Appl.| No.

WO | 96/30523), o retrotransposon Ty proteína pl, a proteína superficial de vírus da Hepatite B " (WO 92/11291), vírus do papiloma humano (WO 98/15631), vírus do polioma humano (Sas- nauskasK, etal, Biol.

Chem. 380 (3): 381-386 (1999); Sasnauskas K,, et al., Geração de ' partículas tipo vírus recombinantes de diferente poliomavírus em levedura. 3rd Ihterational Workshop "Vírus-like particles as vaccecines. "Berlin, September 26-29 (2001)), fagos RNA, Ty, fr fago, fago GA, fago 205 AP e, em particular, fago Qbeta, vírus do mosquito clorótico | de capim, vírus do papiloma humano (HPV), vírus papiloma bovino, parvovírus pateino, par- | 10 vovírus, calicivirus (por exemplo, vírus de Norwalk), vírus da doença hemorrágica de coelho, VLPs do Antígeno do núcleo de hepadnavírus animal. | Conforme ficará facilmente aparente aos versados na tecnologia, a VLP para ser usada como um carreador imunogênico da invenção não é limitada a nenhuma fdrma espe- cífica.

A partícula pode ser sintetizada quimicamente ou através de um processa biológico, . 15 — que pode ser natural ou não natural.

A título de exemplo, este tipo de modalidade!inclui uma partícula tipo vírus ou uma forma recombinante deste.

Em uma modalidade, mais específica, + a VLP pode compreender, ou alternativamente consiste em, polipeptídeos recombinantes de | qualquer dos vírus conhecidos para formar uma VLP.

A partícula tipo vírus ade bompreen, de adicionalmente, ou alternativamente consiste em, um ou mais fragmentos de tdis polipep- tídeos, bem como variantes de tais polipeptídeos.

Variantes de polipeptídeos podem com- partilhar, por exemplo, pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 99 % de iddntidade no nível de aminoácido com suas contrapartes tipo selvagem.

VLPs variantes adequadas para uso na presente invenção podem ser derivadas de qualquer organismo de manela que elas sejam capazes de formar uma “partícula tipo vírus” e possam ser usadas como Um “carrea- — dorimunogênico” da maneira definida aqui.

VLPs preferidas de acordo com a invenção, incluem a proteína de capsídeo ou an- s tígeno da superfície de HBV (respectivamente HBcAg e HBsAg) ou proteínas recombinantes Po ou seus fragmentos, e a proteína de revestimentos de fagos RNA ou proteínas rácombinan- . tes ou seus fragmentos, mais preferivelmente a proteína de revestimento de Qbeta ou prote- : 30 fínasrecombinantes ou seus fragmentos. | Em uma modalidade, o carreador imunogênico usado em combinação com um pep- : tídeo IgE antigênico ou polipeptídeo da invenção é uma proteina HBcAg.

Exemplos de pro- teínas HBcAg que devem ser usadas, podem ser usados no contexto da preseni le invenção, podem ser facilmente determinados por versados na tecnologia.

Exemplos in luem mas sem limitações, proteínas do núcleo HBV descritas em Yuan et al, (J.

Virol. 73: 10122- 10128 (1999)), e em WOO00/198333, WO 00/177158, WO 00/214478, WO mnloco/32227, WO01/85208, WO02/056905, WO03/024480, e WOO03/024481. HBcAgs o. para

] MM | | 28 | i uso na presente invenção pode ser derivadas de qualquer organismo de maneid que elas sejam capazes de formar uma “partícula tipo vírus” e possam ser usadas como um “carrea- dor imunogênico" da maneira definida aqui. ' Variantes de HBcAg de interesse particular que podem ser usadas no contexto da presente invenção são aquelas variantes em que um ou mais resíduos de cisteina natural- ' mente residentes foram tanto deletados quanto substituídos.

É bem conhecido na [ecnologia que resíduos de cisteína livre podem ser envolvidos em inúmeras reações laterais químicas incluindo trocas de dissulfeto, reação com substâncias químicas ou metabólitos que são, por exemplo, injetados ou formados em uma terapia de combinação com outras substâncias, ou oxidação e reação diretas com nucleotídeos mediante exposição a luz UV.

Adutos tóxicos podem assim ser gerados, especialmente considerando o fato de que HBcAgs tem uma for- te tendência para ligar ácidos nucléicos.

Os adutos tóxicos seriam assim distribuídos entre uma multiplicidade de espécie, que individualmente pode cada qual estar presente em baixa concentração, mas atinge níveis tóxicos quando juntos.

Em vista da anterior, uma vantagem . 15 —paraousodeHBcAgsem composições de vacina que foram modificadas para remover re- síduos de cisteína naturalmente residentes, é que sítios nos quais espécie tóxica pode se . ligar quando determinantes antígenos ou antigênicos são anexado seria, reduzillos no nú- mero ou eliminados completamente. | Além do mais, a forma processada de HBcAg que não tem a sequência líder do terminal N da proteína precursora do antígeno do núcleo da Hepatite B pode tâmbém ser usada no contexto da invenção, especialmente quando HBcAg é produzida em condições onde o processamento não ocorrerá (por exemplo, expressão em sistemas baciafanns), Outras variantes de HBcAg de acordo com a invenção incluem i) polissequência de peptídeo tendo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 99 % idênticos (a uma das sequências de aminoácidos HBcAg tipo selvagem, ou uma subporção dessas, Lsando pro- gramas computador convencionalmente conhecidos, ii) mutantes de unieção termina Cc | incluindo mutantes onde 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 ou 35, aminoácidos foram removidos do | terminal C, ii) mutantes de truncação terminal N incluindo mutantes onde 1, 2, 5, r 9, 10, 12, 14, 15, ou 17 aminoácidos foram removidos do terminal N, iii) mutantes truncados tanto no ! ' 30 terminal N quanto no terminal C incluem HBcAgs onde 1, 2,5, 7, 9, 10, 12, 14, 18 ou 17 ami- noácidos foram removidos do terminal N e 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 ou 35 aminoácidos , foram removidos do terminal C.

Ainda outras proteínas variante de HBcAg no escopo da invenção, são aquelas va- riantes modificadas a fim melhorar a apresentação imunogênica de um epitopo estrangeiro emqueuma ou maisdas quatro repetições de arginina foram deletadas, mas em que a cis- teina do terminal C é retida (ver por exemplo, WO01/98333), e HBcAg truncada terminal- mente C quimérico tais como aquela descrita em WO02/14478, onto e F ]

29 | o WO04/053091. | l Em uma outra modalidade, o carreador imunogênico usado em combiriação com | um peptídeo IgE antigênico ou polipeptídeo da invenção é uma proteína HBsAg.| Proteínas " HBsAg que podem ser usadas no contexto da presente invenção pode ser facilmente de- terminada por versados na tecnologia.

Exemplos incluem, mas sem ——.— ' superficiais HBV descritas em US5792463, WO02/10416, e WO08/020331. HBsAgs ade- | quadas para uso na presente invenção podem ser derivadas de qualquer organismo de ma- neira que elas sejam capazes de formar uma “partícula tipo vírus” e possam ser Jsadas co- mo um “carreador imunogênico” da maneira definida aqui.

Por exemplo, subtipó adw (ver partedo exemplo do presente documento). Ainda em uma outra modalidade, o carreador imunogênico usado em C mbinação com um peptídeo IgE antigênico ou polipeptídeo da invenção é uma proteína de rêvestimen- ' to Qbeta. | . Observou-se que proteina de revestimento Qbeta foi automontada em/capsídeos Ú . 15 quando expressa em E. coli (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993) Os capsí- deos ou partículas tipo vírus obtidos mostraram um estrutura de capsídeo tipo fdgo icosae- * dral com um diâmetro de 25 nm e simetria quase T=3. Adicionalmente, a estrutura cristalina de fago Qss foi resolvida.

O capsídeo contém 180 cópias da proteína de revestimento, que são ligadas em pentâmeros covalentes e hexâmeros por ligações de dissulfeto (Golmo- hammadi,R etal, Structure 4: 5435554 (1996)) levando a uma estabilidade extraordinária ] do capsídeo de proteína de revestimento Qbeta.

Proteína de capsídeo Qbeta tarhbém mos- tra resistência incomum a solventes orgânicos e agentes desnaturantes.

A alta estabilidade do capsídeo de proteína de revestimento Qbeta é um recurso vantajoso, em particuiar, para seu uso em imunização e vacinação de mamíferos e humanos de acordo com|a presente | invenção.

L Exemplos de proteína de revestimento Qbetas que pode ser usada no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinados por versados na tecnolbgia.

Os e- xemplos foram extensivamente descritos em WO02/056905, WO03/024480, WO03/024481 j (incorporados pela por referência na sua íntegra) e incluem, mas sem limitações, sequên- ' Í 30 ciasde aminoácidos reveladas em base de dados PIR, acesso No.

VCBPQbeta com refe- j rência a Qbeta CP; Acesso No.

AAA16663 com referência a proteína Al ai | suas vari- | ' antes incluindo proteínas variantes nas quais o metionina do terminal N é clivado; formas truncadas de terminal C de Qbeta A1 faltando até 100, 150 ou 180 aminoácidos; proteínas variantes que foram modificadas pela remoção de um resíduo de lisina por deleção ou subs- tituição ou pela adição de um resíduo de lisina por substituição ou inserção (vel, por exem- plo, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 e Qbeta-259 revblados em WO03/024481, incorporados pela referência na sua íntegra), e variantes que lpresentam o | i

| 30 | | pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 99 % de identidade com qualquer das proteí- | nas do núcleo Qbeta descritas anteriormente.

Proteína de revestimento Qbetas variante a- dequado para uso na presente invenção pode ser derivada de qualquer organismo de ma- ' neira que elas sejam capazes de formar uma “partícula tipo vírus" e possam ser Usadas co- mo'“carreadores imunogênicos” da maneira definida aqui. | ' Os peptídeos IgE antigênicos da invenção podem ser acoplados a carreadores i- | munogênicos por meio de conjugação química ou por expressão de parceiros de fusão ge- | neticamente modificados por engenharia.

O acoplamento não precisa pecsssatmen ser direto, mas pode ocorrer através de sequências ligantes.

Mais no geral, no caso em que | peptídeos antigênicos tanto fundidos, conjugados quanto de outra forma anexddos a um carreador imunogênico, espaçador ou sequências ligantes são tipicamente sap a um ou ambos terminais dos peptídeos antigênicos.

Tais sequências ligantes geralmente ' compreendem sequências reconhecidas pelo proteassoma, proteases dos Grdossomas ou outro compartimento vesicular da célula. | + 15 Em uma modalidade, os peptídeos da presente invenção são expressos|como pro- teínas de fusão com o carreador imunogênico.

Fusão do peptídeo pode ser efetuada por . inserção no sequência primária do carreador imunogênico, ou por fusão tanto noi terminal N quanto no C do carreador imunogênico.

A seguir, quando com referência a proteínas de fu- são de um peptídeo a um carreador imunogênico, a fusão tanto dos terminais da sequência da subunidade quanto inserção interna do peptídeo na sequência do carreador |são englo- badas.

Fusão, da maneira referida a seguir, pode ser efetuada por inserção do peptídeo antigênico na sequência de carreador, por substituição de parte da sequência do carreador com o peptídeo antigênico, ou por uma combinação de deleção, substituição ou us Quando o carreador imunogênico é uma VLP, a subunidade de VLP do peptídeo antigênico quimérico será em geral capaz de automontagem em uma VLP.

VR que exibe epítopos fundidos nas suas subunidades são também aqui referidos como VLPs luiméricas.

Por exemplo, EP 0 421 635 B descreve o uso de partículas do antígeno do núcleo hepadna- vírus quimérico nas sequências de peptídeo estrangeiro presentes em uma partícula tipo vírus. | ' 30 Resíduos de aminoácido de flanqueamento podem ser adicionados tanto no termi- nal da sequência do peptídeo antigênico a ser fundido em qualquer terminal dá sequência ' da subunidade de uma VLP, quanto para inserção interna de tal sequência peptídica Na se- | quência da subunidade de uma VLP.

Glicina e resíduos de serina são particularmente ami- | noácidos favorecidos para ser usados nas sequências de flanqueamento adicionadas ao peptideoa ser fundido.

Resíduos de glicina conferem flexibilidade adicional, que pode dimi- | nuir potencialmente o efeito desestabilizante de fundir uma sequência estrangeira na se- quência de uma subunidade de VLP. |

| 31 | Em uma modalidade, específica da invenção, o carreador imunogênico é dra VLP de HBcAg.

Proteínas de fusão do peptídeo antigênico tanto para o terminal N de um HBcAg (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 11571163 (1999)) quanto inserções na assim denomina- ' da região imunodominante principal (MIR) foram descritas (Pumpens, P. and Grens, E., In- | tervirology 44: 98114 (2001)), WO 01/98333), e são modalidade específicas da invenção. ' ] Variantes de HBcAg de ocorrência natural com deleções na MIR foram também Lesoritas (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), e fusões no terminal NoucC, bem como inserções na posição da MIR correspondente ao sítio de deleção corparadas com um wt HBcAg são adicionalmente modalidades da invenção.

Fusões no terminal C fo- ram também descritas (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Versa- ! dos na tecnologia encontrarão facilmente diretriz em como construir proteínas de fusão u- . sando técnicas moleculares de biologia clássica.

Vetores e plasmídeos que codificam HB- cAg e proteínas de fusão de HBcAg e usados para à expressão de uma HBcAg efron: . de fusão de HBcAg foram descritos (Pumpens, P. and %38; Grens, E.

Intervirolody 44: 98- .« 15 114(2001), Neyrinck, S. et al, Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) e podem ser úsados na prática da invenção.

Um importante fator para a otimização da eficiência de autorhontagem . e da exibição do epítopo a ser inserido na MIR de HBcAg é a escolha do sítio de inserção, | bem como o número de aminoácidos a ser deletado da sequência de HBcAg na / IR (Pum- pens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 0 421 635; U.S. plionto No. 6,231,864) mediante inserção, ou em outras palavras, que HBcAg em forma del aminoáci- dos deve ser substituída com o novo epítopo.

Por exemplo, substituição de aminóácidos de HBcAg 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 ou 80-81 com epítopos estrangeiros foi desárita (Pum- pens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EPO0421635; US 6,231, 864, WO00/26385). HBcAg contém uma cauda de arginina longa (Pumpens, P. and jerens, E. —Intervirology 44: 98-114 (2001)) que é dispensável para montagem de capsídeo e capaz de ligar ácidos nucléicos (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001 )). HBcAg tanto compreendendo quanto que não tem sua cauda de arginina são ambas modalidades da invenção. | Em uma outra modalidade específica da invenção, o carreador imunogênico é uma Ú 30 VLP deum RNA-fago, preferivelmente Qbeta.

As proteínas de revestimento principais de fagos RNA monta espontaneamente nas VLPs mediante expressão em bactéria b. em parti- cular, em E. coli.

Construtos de proteína de fusão em que peptídeos antigênicos foram fun- didos no terminal C de uma forma truncada da proteína A1 de Qbeta, ou inseridas na proteí- na A1 foram descritos (Kozlovska, T.

M., et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). a Al é gerada por supressão no códon de parada UGA e tem um comprimento de 329 aa, ou 328 aa, se a clivagem da metionina do terminal N for levada em conta.

Clivagem da Ihetionina do terminal N antes de uma alanina (o segundo aminoácido codificado pelo i Qbeta CP) |

| 32 | Ú normalmente ocorre em E. coli, e como é o caso para terminais N das proteinas ke revesti- mento Qbeta. A parte do gene A1, 3' do códon âmbar UGA codifica a extensão de CP, que tem um comprimento de 195 aminoácidos. Inserção do peptídeo antigênico entre a posição | 7 72 e 73 da extensão de CP leva a modalidades adicionais da invenção (Kozlovska, T.M, et al, Intervirology 39: 9-15 (1996)). Fusão de um peptídeo antigênico no — de uma ' proteína A1 Qbeta terminalmente C truncada leva às modalidades adicionais preferidas da | invenção. Por exemplo, Kozlovska et al., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) descreve fusões de proteina A1 Qbeta onde o epítopo é fundido no terminal C da extensão Qbeta OP truncada 1 na posição 19. | | Da maneira descrita por Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1 996), a monta- | gem das partículas que exibe os epítopos fundidos tipicamente exige a presença tanto da fusão de proteína Al -antígeno quanto do wt CP para formar uma partícula de mosaico. En- | ' tretanto, modalidades compreendendo as partículas tipo vírus, e por meio destas em particu- | : lar as VLPs da proteína de revestimento Qbeta de RNA-fago, que são exclusivamente com- | + 15 postas de subunidade de VLPs tendo um peptídeo antigênico fundido nela, estão também no escopo da presente invenção. | | . A produção de partículas de mosaico pode ser feita de inúmeras maneiras. Ko- zlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996), descrevem três métodos, que podem todos ser usados na prática da invenção. Na primeira abordagem, exibição eficiente do enítopo fundi- donas VWVLPs é mediada pela expressão do plasmídeo que codifica a fusão da proteina A - Qbeta tendo um códon de parada UGA entre CP e extensão de CP em uma cepa E. coli que hospeda um plasmídeo que codífica um RNAt supressor de UGA clonado que léva a tradu- ção do códon UGA em Trp (plasmídeo piSM3001 (Smiley B. K., et al, Gere 134: 33-40 (1993))). Em uma outra abordagem, o códon de parada CP do gene é modificado em UAA, eum segundo plasmídeo que expressa a fusão de proteína A1-antigeno é cotrânsformado. O segundo plasmídeo codifica uma resistência a antibiótico diferente e a origem de replica- | ção é compatível com o primeiro plasmídeo. Em uma terceira abordagem, CP q a fusão de proteina A1-antígeno são codificadas de uma maneira bicistrônica, operacionalrhente ligada a um promotor tal como o promotor Trp, da maneira descrita na figura 1 de Kozlovska et al., : 30 —Intervirology, 39: 9-15 (1996). | VLPs adicionais adequadas para fusão de antígenos ou antigênicos determinantes ' são descritas em WO03/024481 e incluem bacteriófago fr, RNA fase MS-2, protéina de cap- sídeo de papilomaviírus, retrotransposon Ty, levedura e também partículas tipo retrovírus, j HIV2 Gag, Vírus do mosaico Cowpea, parvoviírus VP2 VLP, HBsAg (US a 840, ! —EPO020416B1). Exemplos de VLPs quiméricas adequadas para a prática da invenção, são | também aqueles descritos em Intervirology 39: 1 (1996). Adicionalmente, exemplos de VLPs | contemplados para uso na invenção são: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, r HPV- '

À

| : | 33 | : 33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, Vírus mosaico do tabaco.

Partículas tipo Vilas de SV- | 40, Poliomavírus, Adenovírus, Herpes Vírus Simples, Rotavírus e Norwalk vírus. | Para qualquer peptídeo ou proteina recombinantemente expresso que forma parte ' da presente invenção, incluindo um peptídeo IgE antigênico de acordo com a invenção, a- copladoounãoa um carreador imunogênico, o ácido nucléico que codifica o dito peptídeo : ou proteína também forma um aspecto da presente invenção, tal como um vetor ee expres- são compreendendo o ácido nucléico, e uma célula hospedeira contendo o vetor ide expres- são (autonomamente ou cromossalmente inseridos). Um método de produzir recombinan- temente o peptídeo ou proteína expressando-o na célula hospedeira anterior e isolanco o —imunógeno dele é um aspecto adicional da invenção.

A molécula de IgE nativa pe compri- mento total ou a sequência de DNA nativa de comprimento total que codifica-a não são co- bertas pela presente invenção. | : Em uma outra modalidade, o peptídeo da invenção é quimicamente acoplado a um carreador imunogênico, usando técnicas bem conhecidas na tecnologia.

À conjugação pode ] . 15 ocorrer para permitir movimento livre de peptídeos por meio de conjugação de tono único (por exemplo, tanto no ponto do terminal N quanto terminal C) ou como estrutura fechada . onde ambos terminais de peptídeos são conjugados tanto com uma proteína — imunogênica quanto com uma estrutura de andaime tal como uma VLP.

Onde a conjugação ocorre por meio de conjugação química conhecida pelos versados na tecnologia, tais como pormeio de resíduos de cisteina, resíduo de lisinas ou outra fração de carbóxi Emas comumente como pontos de conjugação tal como ácido glutâmico ou ácido aspártico.

As- sim, por exemplo, para acoplamento covalente direto é possível utilizar um éster carbodi- imida, glutaraldeído ou (N- [y- malcimidobutirilóxi] succinimida, utilizando ligantés heterobi- funcionais comercialmente disponíveis comuns tais como CDAP e SPDP sena instruções dos fabricantes) Exemplos de conjugação de peptídeos, particularmente peptídeos cicliza- dos, para uma proteína carreadora por meio de derivados de peptídeo acilidrazina são des- critos em WO03/092714. Depois da reação de acoplamento, o imunógeno pode facilmente ser isolado e purificado por meio de um método de diálise, um método de meáção de gel, um método de fracionamento etc.

Peptídeos que terminam com um resíduo de cisteína (pre- f 30 ferivelmente com um ligante fora da região ciclizada) podem ser convenientemente conjuga- dos com uma proteína carreadora por meio de química de maleimida. | : Quando o carreador imunogênico é uma VLP, diversos peptídeos antigênicos, tanto tendo uma sequência de aminoácidos idêntica quanto uma sequência de amindácidos dife- rente, podem ser acoplados a uma única molécula de VLP, levando preferivelmente a uma estrutura repetitiva e ordenada que apresenta diversos antigênico determinantes de uma maneira orientada conforme descrito em WO00/32227, WO03/024481, WO02/056905 e WO04/007538. | | | | |

34 | Em um aspecto da invenção, o peptídeo antigênico é ligado à VLP por meio de reti- culação química, tipicamente e de forma preferível usando um reticulador heterobifuncional.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conhecidos na técnica.

Em algumas modali- 7 dades, o reticulador heterobifuncional contém um grupo funcional que pode reagir com os primeiros sitios de anexação, isto é, com o grupo amino de cadeia lateral de resíduo de lisi- ' nas da VLP ou subunidade de VLP, e um grupo funcional adicional que pode reagir com um segundo sítio de anexação preferido, isto é, um resíduo de cisteína fundido no páptídeo an- tigênico e opcionalmente também ser disponibilizado para reação por redução.

A primeira etapa do procedimento, tipicamente denominada de derivatização, é a reação da | LP com o reticulador.

O produto desta reação é uma VLP ativada, também denominada Fveatora ativada.

Na segunda etapa, reticulador não reagido é removido usando —— tais como filtração de gel ou diálise.

Na terceira etapa, o peptídeo antigênico reage com a VLP : ativada, e esta etapa é tipicamente denominada de etapa de acoplamento.

Peptídeo antigê- nico não reagido pode ser opcionalmente removido em uma quarta etapa, por exemplo, por | * 15 diálise.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conhecidos na técnica.

Essos incluem os reticuladores SMPH preferidos (hexanoato de succinimidil-6-[&-maleimidoproplonamido]), * Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros reticuladores disponíveis, por exemplo, pela Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA), e tendo um grupo funcional reativo com os grupos amino e um grupo funci anal reativo com os resíduos de cisteina, Todos os reticuladores supramencionados levam à formação de uma ligação de tioéter.

Í Uma outra classe de reticuladores adequados na prática da invenção é daracteriza- da pela introdução de uma ligação de dissulfeto entre o peptídeo antigênico e a VLP medi- ante acoplamento.

Reticuladores preferidos que pertencem a esta classe incluem, por e- xemplo, SPDP e Sulfo-LC-SPDP (Pierce). A extensão de derivatização da VLP tom reticu- ' lador pode ser influenciada variando condições experimentais tais como a concentração de cada qual dos parceiros de reação, o excesso de um reagente com relação ao outro, opH,a ' temperatura e a força iônica.

O grau de acoplamento, isto é, a quantidade de Sette, anti- gênico por subunidades da VLP, pode ser ajustada variando as condições experimentais " 30 descritas anteriormente para casar as exigências da vacina. | Um outro método de ligação de peptídeos antigênicos na VLP, é o ligação de um : resíduo de lisina na superfície da VLP com um resíduo de cisteína no pestiiaaaistass Em algumas modalidades, fusão de um aminoácido ligante contendo um resíduo de cisteí- na, como um segundo sítio de anexação ou como uma parte deste, com o peptídeo antigê- —nicopara acoplamento na VLP pode ser exigida.

Em geral, ligantes de aminoácido flexíveis são favorecidos.

Exemplos do ligante de aminoácido são selecionados do grupo que consis- te em: (a) CGG; (b) ligante gama 1 do terminal N; (c) ligante gama 3 do terminal ' (d) regi- | | |

Ú 35 | Ú ões de dobradiça lg; (e) ligantes de glicina do terminal N; (f) (G) kKC (G) n com n=0-12 e k=0- 5; (g) ligantes de glicina-serina do terminal N; (h) (G) kC (G) m (S) i (GGGGS) n dom n=0-3, | k=0-5, m=0-10, i=0-2; (1) GGC; (k) GGO-NH2; (1) ligante gama 1 do terminal C; Mm ligante ' gama 3 do terminal C; (n) ligantes de glicina do terminal C; (0) (G) nº (G) k com n=0-12 e —k=0-5;(p)ligantes de glicina-serina do terminal C; (q) (G) m (S) t (GGGGS) n (6) oC (G) K | : com n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, e 0=0-8. Adicionalmente, exemplos de ligantes de amino- ácido são a região de dobradiça de imunoglobulinas, ligantes de glicina-serina (ÉGGGS) n, e ligantes de glicina (G) n todos adicionalmente contendo um resíduo de cisteina como se- gundo sítio de anexação e adicionalmente de forma opcional resíduos de glicina Exemplos tipicamente preferidos dos ditos ligantes de aminoácido são gama 1 do terminal Nº: | CGDKTHTSPP; gama 1 do terminal C: DKTHTSPPCG; gama 3 do têminal N: CGGPKPSTPPGSSGGAP; gama 3 do terminal C: PRARPSTPPGSSGGAPGGOCSG;) ligante de Ú glicina do terminal N: GCGGGG e ligante de glicina do terminal C: GGGGCG.

Outros ligantes de aminoácido particularmente adequados na prática da invenção, ' . 15 quando um peptídeo antigênico hidrofóbico é ligado a uma VLP, são celas, ou CGDEGG para ligantes do terminal N, ou GGKKGC e GGEDGC, para os ligantes do termi- + nal C.

Para os ligantes do terminal C, a cisteina terminal é de forma opcional terminalmente C amidada.

Em algumas modalidades da presente invenção, ligantes GGCG, GGC ou GGC- NH2("NH2" quer dizer amidação) do terminal C do peptídeo ou CGG no seu iene N são preferidos como ligantes de aminoácido.

Em geral, resíduos de glicina serão inselidos entre aminoácidos volumosos e a cisteína para ser usada como segundo sítio de anexação, para evitar impedimento estérico potencial do aminoácido mais volumoso na reação : acopla- mento.

Em uma modalidade adicional da invenção, o ligante de aminoácido GGC-NH2 é fundidono terminal C do peptídeo antigênico. | O resíduo de cisteína presente no peptídeo antigênico tem de ser em Seu estado reduzido para reagir com o reticulador heterobifuncional na VLP ativada, que é uma cisteina livre ou um resíduo de cisteína com um grupo sulfidrila livre tem de estar disponível.

No e- xemplo onde o resíduo de cisteina que funciona como sítio de ligação está em uma forma Í 30 oxidada,porexemplo, se ele estiver formando ligação de dissulfeto, é exigida redução desta ligação de dissulfeto, por exemplo, com DTT, TCEP ou p- mercaptoetanol.

Concentrações S baixas de agente de redução são compatíveis com acoplamento da maneira descrita em WO02/05690, concentrações mais altas inibem a reação de acoplamento, contem versa- dos na tecnologia perceberão, no caso em que a redundância tem que ser removida ou sua concentração diminuída antes do acoplamento, por exemplo, por diálise, filtração de gel ou HPLC de fase reversa. | Ligação do peptídeo antigênico na VLP usando um reticulador heterobifúncional de do i 36 : acordo com os métodos descritos anteriormente permite acoplamento do peptídeo antigêni- co na VLP em um modo orientado.

Outros métodos de ligar o peptídeo antigênico na VLP | incluem métodos em que o peptídeo antigênico é reticulado na VLP usando o EDÍ carbodi- " imida, e NHS.

P | Em outros métodos, o peptídeo antigênico é anexado na VLP usando ul reticula- ] dor homobifuncional tais como glutaraldeído, DSGBM [PEO] 4, BS3, (Pierce Cherical Com- pany, Rockford, IL, USA) ou outros reticuladores homobifuncionais conhecidos com grupos funcionais reativo com grupos amina ou grupos carboxila da VLP., | Outros métodos de ligação da VLP em um peptídeo antigênico incluem métodos ondeaVLP é biotinilada, e o peptídeo antigênico expresso como uma proteína de fusão de estreptavidina, ou métodos em que tanto o peptídeo antigênico quanto a VLP são biotinila- dos, por exemplo, da maneira descrita em WO 00/23955. Neste caso, o Deptídeo|antigênico ' pode ser primeiro ligado a estreptavidina ou avidina ajustando a razão de peptídeo antigêni- co com estreptavidina de maneira tal que sítios de ligação livres sejam ainda disponíveis ] . 15 paraligaçãoda VLP, que é adicionada na etapa seguinte.

Alternativamente, todos os com- ponentes podem ser misturados em uma reação tipo "um pote". Outros pares de receptor eo ligante, onde uma forma solúvel do receptor e do ligante é disponível, e podem ser reticula- dos na VLP ou no peptídeo antigênico, podem ser usados como agentes de lidação para ligar peptídeo antigênico no VLP.

Alternativamente, tanto o ligante quanto o receptor pode | 20 —serfundido no peptídeo antigênico, e assim, mediante ligação na VLP quimicamente ligada ou fundida tanto receptor, quanto ligante respectivamente.

Fusão pode também ser efetuada por inserção ou substituição. | Uma ou diversas moléculas de antígeno podem ser anexadas a uma subunidade do capsídeo ou VLP de proteínas de revestimento de fagos RNA, preferivelmente través dos resíduos de lisina expostos da VLP de fagos RNA, se estericamente permissível, Um recur- so específico da VLP da proteina de revestimento de fagos RNA e em particular da VLP da proteína de revestimento OP é assim a possibilidade para acoplar diversos antígenos por subunidade.

Isto permite a geração de um arranjo de antígeno denso.

Em uma modalidade da invenção, a ligação e anexação, respectivamente, de pelo ' 30 menos um antígeno ou antigênico determinante para a partícula tipo vírus é Bor meio de interação e associação, respectivamente, entre pelo menos um primeiro sítio de anexação ' da partícula tipo vírus e pelo menos uma segunda anexação do peptídeo antigênico.

VLPs ou capsídeos de proteína de revestimento Q exibem um Súmaro| definido de resíduos de lisina na sua superfície, com uma topologia definida com três resíduos de lisina apontando para o interior do capsídeo e que interagem com o RNA, e quatro outros resíduos de lisina expostos no exterior do capsídeo.

Essas propriedades definidas favorgcem a ane- xação de antígenos no exterior da partícula, e não no interior da partícula onde | resíduos

| 37 | ] de lisina interagem com RNA. VLPs de outra proteína de revestimento de fagos RNA tam- bém têm um número definido de resíduos de lisina na sua superfície e uma topologia defini- da desses resíduos de lisina. | 7 Em uma modalidade adicional da presente invenção, o primeiro sítio de anexação é um resíduo de lisina e/ou a segunda anexação compreende grupo sulfidrila ou um resíduo Ú de cisteína. Ainda em uma modalidade adicional da presente invenção, o primeiro sítio de anexação é um resíduo de lisina e a segunda anexação é um resíduo de cisteína, e moda- lidades adicionais da invenção, o antígeno ou antigênico determinante é ligado por meio de um resíduo de cisteina, nos resíduos de lisina da VLP de proteina de revestimento de RNA- fago,eem particularnas VLP de proteina de revestimento Qbeta. | Uma outra vantagem das VLPs derivadas de fagos RNA é seu alto rendimento de expressão em bactéria que permite produção de grandes quantidades de material a custo ' acessível. Além disso, o uso das VLPs como carreadores permite a formação de drranios de antígeno robustos e conjugados, respectivamente, com densidade de antígeno variável. Em ' 2 15 particular, o uso de VLPs de fagos RNA, e por meio disto em particular o uso da VLP de RNA-fago proteína de revestimento Qbeta permite obter densidade de epítopo muito alta.

- Em algumas modalidades da invenção, composições imunogênicas da invenção podem compreender misturas de conjugados imunogênicos, isto é, carreadores imunogêni- cos acoplados a um ou diversos peptídeos IgE antigênicos da invenção. Assim, dssas com- posiçõesimunogênicas podem ser compostas de carreadores imunogênicos que lirerem da sequência de aminoácido. Por exemplo, composições de vacina podem ser reparadas compreendendo uma VLP "tipo selvagem" e uma proteína de VLP modificada em que um ou mais resíduos de aminoácido foram alterados (por exemplo, deletados, inseridos ou substi- tuídos). Alternativamente, o mesmo carreador imunogênico pode ser usado, mas/acoplados a peptídeos lgE antigênicos de diferentes sequências de aminoácido.

A invenção, portanto, também diz respeito a método para produzir um Imunógeno de acordo com a invenção compreendendo i) fornecer um peptídeo IgE antigênico de acordo com a invenção, ii) fornecer um carreador imunogênico de acordo com a invenção, preferi- velmente uma VLP, e iii) combinar o dito peptídeo IgE antigênico e o dito carreador imuno- " 30 gênico Em uma modalidade, a dita etapa de combinação ocorre através de reticúlação qui- mica, preferivelmente através de um reticulador heterobifuncional.

' Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, bo, 23,24, 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, r 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, Í 4, 95, 96,

Í

A i 38 | Ú 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131) 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149) 150, 151, | , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170,171,172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, | ' 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221) 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,261,262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275) 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311) 312, 313, Ú 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, + 15 —350,351,352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, ” 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430. Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, ou con- siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72,73.74,75,76,77, 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111) 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, e 153.

' 30 Preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmen- te, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sEQ ID Nos: ' 1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88,89,90,91,92,93,94,95,96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 e 148. Mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE) antigênico i 39 | ' consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, Do, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, Ss. 55, 56, ' 57, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101,102,103, 109, 110,111,112, 118, 119, 120, 126, 127, 133 e 139 Ainda mais preferi- ' velmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 e 109. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1,2,3,4,5, 6.18, 19,20, 21,22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 e 76. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo ' IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de alhinoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1,2,3,18, 19 e 34. Acima ep prefe- ' 15 rivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma - sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 1 ou 18. ” Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção cansada ou con- siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165) 166, 167, 168,169,170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 1 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201) 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, e 21 Preferi- velmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, qo uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157,158,159,160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 178 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217. Mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essenci- : almente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID " 30 Nos: 154,155,156,157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, : 186, 192, 193, 199 e 200. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico con- | ' siste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo | que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175 . Acima de tudo preferivelmen- te, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma| sequência —deaminoácidosdasSEQ ID Nos: 154 ou 165. Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, ou con- siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis-

| 40

Ú te nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 2 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, ' 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288,289,290,291,292,293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, B 306, 307, 308, 309, e 310. Preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, Ou con- siste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consis- te nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 263, 256, 257, 258,259,260,261,262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e sos . Mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em | uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ o Nos: 220, | . 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, ! 4 15 249,250,256,257,258,259,260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 eo.

Ainda - mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, í em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas seo ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256,257 e 266. Ainda mais | preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ iDINos: 220, 221, 222, 233, 234 e 245. Acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE | antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos:

220 ou 233. | | Ainda em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico da invenção consiste, | 25 ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do|grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311,312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339) 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 2657) 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, , 30 378,379,380,381,382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, ao 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411) 412, 413, ] 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430. Prefe- rivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmentd, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: | 311, 312, 313,314,315,316,317,318,319,320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330) 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, so 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372) 373, 376,

|

SN)

| 41 í l , ' ; 1 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 ê 425. Mais | ] preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em ' uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ É Nos: 311, 312,313,314,315,316,317,318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, : 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 368, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403) 404 e 410. Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou A essencial- ' mente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID Nos: .311,312,313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386 . Ainda mais preferiveimente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequênhia de ami- | Ú noácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, idos 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353 . Ainda mais preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico con- " 15 siste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo : - que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326. Acima de tudo preferivelmente, d dito peptí- | - deo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoáci- : dos das SEQ ID Nos: 311 ou 312. Em uma modalidade, da presente invenção, o peptídeo IgE antigênico des revela- doéligadoa uma molécula carreadora imunogênica.

Em uma modalidade, o dito carreador | imunogênico é selecionado do grupo que consiste em qualquer carreador imunodênico aqui descrito.

Em uma outra modalidade, o dito carreador imunogênico é selecionado do grupo que consiste em: albuminas de soro tais como albumina de soro bovino (BSA); pos | tiroglobulinas; hemoglobinas; hemocianinas (particularmente hemocianina do molusco gi- —gante buraco de fechadura [KLH]) e partícula tipo vírus (VLPs). Em uma modalidade preferi- | da o dito carreador imunogênico é hemocianina do molusco gigante buraco de fechadura ou partícula tipo vírus (VLPs). Ainda em uma modalidade preferida, o dito carreador Imunogêni- co é uma VLP selecionada do grupo que consiste em VLP de HBcAg, HBSAg/ VLP, VLP Qbeta ou qualquer variante revelada aqui.

Ainda em uma modalidade preferida, d dito carre- : Na 30 —adorimunogênico é uma VLP Qbeta selecionada do grupo que consiste em Qoeta CP; Qbe- | ta A1, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 e Qbeta-259 (redetado em | 7 WOO03/024481). | Em uma modalidade, o dito carreador imunogênico é covalentemente ligado ao peptídeo IgE antigênico aqui revelado tanto diretamente quanto por meio de um ligante.

Em uma modalidade, o dito carreador imunogênico é ligado ao peptídeo IgE antigênico aqui re- velado por expressão de uma proteina de fusão da maneira aqui descrita.

Em juma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico aqui revelado é ligado ao carreador PP rr o o

. |

: 42 ; |

. ! Í

. preferivelmente uma VLP, por meio de reticulação química da maneira aqui descrita e prefe- rivelmente usando um reticulador heterobifuncional.

Diversos reticuladores hetetfobifuncio- nais são conhecidos na tecnologia.

Em algumas modalidades, o reticulador hetefobifuncio-

: nal contém um grupo funcional que pode reagir como os primeiros sítios de anexação, isto é, comogrupo amino de cadeia lateral de resíduos de lisina da VLP ou subunidade de VLP,

' e um grupo funcional adicional que pode reagir com um segundo sítio de anexação preferi- do, isto é, um resíduo de cisteína fundido no peptídeo antigênico disponibilizado p: ; ra reação por redução. |

Portanto, em uma modalidade da presente invenção o peptídeo IgE antigênico aqui revelado, compreende adicionalmente tanto no seu terminal N, quanto no seu tem inal C ou tanto em terminal N quanto terminal C um ligante que é capaz de reagir com ue sítio de anexação do carreador imunogênico em uma reação de reticulação química, Em uma moda- lidade, o peptídeo IgE antigênico aqui revelado compreende adicionalmente no seu terminal Po C um ligante com a fórmula (G),C em que n é um número inteiro escolhido no grupo que - 15 consisteem0O,1,2,3,4,5,6,7,8,9e10, preferivelmente no grupo que consiste EP 0,1,2, = 3,4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em O, 1, 2 e 3, acima de tudo pre- ; - ferivelmente n é O ou 1 (onde n é igual a O, a dita fórmula representa uma cisteiná). Preferi- velmente o peptídeo IgE antigênico aqui revelado compreende adicionalmente nojseu termi- nal C um ligante com a fórmula GGGC, GGC, GC ou C. : 20 Em uma outra modalidade da presente invenção, o peptídeo IgE antigênico aqui re- velado compreende adicionalmente no seu terminal N um ligante com a mus O(S), em que n é um número inteiro escolhido no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3, 4, 5,6,7) 8,9 € 10, preferivelmente no grupo que consiste em 0, 1, 2,3,4e5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em O, 1, 2 e 3, acima de tudo preferivelmente n é O ou 1 (onde n d igual a O, —afórmula representa uma cisteína). Preferivelmente, o peptídeo IgE antigênico dau revela- do compreende adicionalmente no seu terminal N um ligante com a fórmula CGGG, CGG, * CGouC. ) Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico aqui revelado compreende a- dicionalmente no seu terminal N um ligante com a fórmula GGGC, GGC, GC ou cl , 30 Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico aqui revelado com reende a- dicionalmente no seu terminal C um ligante com a fórmula (G),C em que n é dm número É inteiro escolhido no grupo que consiste em 0, 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9€ 10, preferivólmente no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3, 4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que co! isistem em O, 1, 2 e 3, acima de tudo preferivelmente n O ou 1 (onde n é igual a O o dito tórhuia repre- sentauma cisteina)e no seu terminal N um ligante com a fórmula C(G), em que h é um nú- mero inteiro escolhido no grupo que consiste em O, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 9e 10) preferivel- ' mente no grupo que consiste em 0, 1, 2,3,4€e5, mais preferivelmente nos Suns que con- | |

. | i 43 ; ' sistem em O, 1, 2 e 3, acima de tudo preferivelmente n é O ou 1 (onde n é igual a ó, a fórmu- " la representa uma cisteína). Preferivelmente o peptídeo IgE antigênico aqui revelado com- preende adicionalmente no seu terminal N um ligante com a fórmula GGGC, seres ou C ' e no seu terminal C um ligante com a fórmula GGGC, GGC, GC ou C.

Mais preferivelmente opeptídeolgE antigênico aqui revelado compreende adicionalmente no seu termihal N uma ' cisteína e no seu terminal C uma cisteína.

L Representativo dos ditos peptídeos IgE antigênicos compreendendo adicionalmente um ligante como esse é revelado na SEQ ID NO: 434, 436, 437, 438 e 439. Em una moda- lidade da invenção, o peptídeo IgE antigênico compreendendo um ligante é qualquer peptí- deorevelado na tabela 9. | O resíduo de cisteína adicionado no terminal N e/ou terminal C do peptídeo IgE an- tigênico é disponível tipicamente para reação por redução (reticulação química) e preferi- velmente usando um reticulador heterobifuncional.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conhecidos na tecnologia.

Em algumas modalidades, o peptídeo IgE antigênico que ' 15 compreende adicionalmente um ligante aqui descrito são reticulados com o grupa amino de S cadeia lateral de resíduos de lisina de uma VLP. | Í Portanto, em uma modalidade o peptídeo IgE antigênico que compreende adicio- ' nalmente um ligante descrito anteriormente é reticulado no carreador imunogênico (em par- ticular para uma VLP, preferivelmente VLP de HBcAg, HBsAg VLP ou VLP Qbeta A primei- ra etapa do procedimento, tipicamente denominado de derivatização, é a reação da VLP para o reticulador.

O produto desta reação é uma VLP ativada, também denominada carrea- dor ativado.

Na segunda etapa, reticulador não reagido é removido usando métodos usuais tais como filtração de gel ou diálise.

Na terceira etapa, o peptiídeo antigênico reage com a VLP ativada, e esta etapa é tipicamente denominada a etapa de acoplamento.

Peptideo an- tigêniconão reagido pode ser de forma opcional removido em uma quarta elapo. por exem- plo, por diálise.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conhecidos na tecnologia.

Es- ses incluem os reticuladores preferidos SMPH (hexanoato de succinimidi-6-18- maleimidopropionamido]), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Siro-SuPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros reticuladores disponíveis por exemplo, pela Piece Chemi- : 30 calCompany (Rockford, IL, USA), e tendo um grupo funcional reativo com os grupos amino e um grupo funcional reativo com os resíduos de cisteína.

Todos os reticuladores supra- : mencionados levam a formação de uma ligação de tioéter. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoáci- dosdasSEQID Nos: 1,2,3,18,19 ou 34, acima de tudo preferivelmente, das são ID Nos: 1 ou 18, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu —.—. C uma | cisteina que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio dê uma liga- |

A : RNA i 44 o | ' ção de tioéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que con- ] siste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda máis preferi- velmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. : | " Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma Í IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência del aminoáci- Í dos das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 18, 19 ou 34, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 1 ou 18, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu terminal N uma cisteína que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio de uma liga- ção de tioéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que con- siste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferi- | velmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência — dos das SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175, acima de tudo preferivelmente, das SEQID Nos: 154 ou 165, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu Í terminal C uma cisteina que é quimicamente reticulada com uma partícula tipd vírus por º meio de uma ligação de ticéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do ' grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência e aminoáci- dos das SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175, acima de tudo preferiveirhente, das SEQ ID Nos: 154 ou 165, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmehte no seu terminal N uma cisteína que é quimicamente reticulada com uma partícula tipd vírus por —meiode uma ligação de ticéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma 1lgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoáci- 7 30 dosdasSEQID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 e 245, acima de tudo preferivelhente, das SEQ ID Nos: 220 ou 233, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu ' terminal C uma cisteína que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio de uma ligação de tioéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência 1 aminoáci- , | dos das SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 3 245, acima de tudo prefeivalinenta, das SEQ ID Nos: 220 ou 233, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu terminal N uma cisteina que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por | meio de uma ligação de tioéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda ' mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência dê aminoáci- dos das SEQ ID Nos: 311,312 e 326, acima de tudo preferivelmente, das SEQ Db Nos: 311 ou312,em que a dita lgE antigênica compreende adicionalmente no seu terminal C uma cisteina que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio de uma liga- ção de tioéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que con- siste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferi- veimente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma % IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência dé aminoáci- dos das SEQ ID Nos: 331, 312 e 326, acima de tudo preferivelmente, das SEQ pb Nos: 311 ou 312, em que a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu terminal N uma cisteina que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio dê uma liga- ção detiocéter.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que con- siste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferi- velmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. . Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência dê aminoáci- Í dosdasSEQID Nos: 311,312 e 326, acima de tudo preferivelmente, das SEQ o Nos: 311 ou 312 . Preferivelmente, a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no séu terminal | C um ligante GC, preferivelmente um ligante com a fórmula GGC (preferivelmente o dito : peptídeo IgE antigênico que compreende no seu terminal C um ligante GC consiste, ou con- siste essencialmente em sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 457) que é quimicamen- te reticuladacom uma partícula tipo vírus por meio de uma ligação de tioéter usahdo SMPH (hexanoato de succinimidil-6-[&-maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre resíduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteína do dito ligante do lerminal C. | Em uma modalidade prêferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, ! HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da j —SEQIDNO: 435. | : Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma | IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoáci- |

| o 46 ” dos das SEQ ID Nos: 220, 221, 233, 234, 244 e 246, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 220 ou 233, que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por l meio de uma ligação de tioéter, a dita ligação sendo entre resíduos de lisina da vip eore- | , síduo de cisteina do dito peptídeo IgE antigênico.

Na dita modalidade, o peptídeos IgE anti- gênicoaquirevelado é ligado ao carreador imunogênico, preferivelmente uma VLP, por meio : de reticulação química da maneira aqui descrita e preferivelmente usando um lsticutador j heterobifuncional.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conhecidos na tecnologia. | Em algumas modalidades, o reticulador heterobifuncional contém um grupo funtional que pode reagir com os primeiro sítios de anexação, isto é, com o grupo amino de cadeia lateral de resíduos de lisina da VLP ou subunidade VLP, e um grupo funcional adicional que pode reagir com um segundo sítio de anexação preferido, isto é, o resíduo de cisteína do peptídeo antigênico torna-se disponíveis para reação por redução.

Em uma modalidade preferida, a : dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Prefeliveimente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | “. 15 Em uma modalidade, a invenção diz respeito a imunógeno compreendendo uma IgE antigênica que consiste em, ou que consiste essencialmente em uma sequência de a- - minoácidos da SEQ ID No: 220 que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus | por meio de uma ligação de tioéter usando SMPH (hexanoato de succinimidil-6-[R- maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre resíduos de lisina da VLPeoresíduo de cisteína do dito peptídeo IgE antigênico.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmen-

] te a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. Em uma modalidade particular, quando a sequência do peptídeo IgE antigênico a- qui revelado compreende uma cisteína, o dito peptídeo IgE antigênico é covalentemente ligadoao carreador imunogênico diretamente por meio da dita cisteína.

Na dita modalidade, o peptídeo IgE antigênico aqui revelado é ligado ao carreador imunogênico, preferivelmente uma VLP, por meio de reticulação química da maneira aqui descrita e preferivelmente usan- do um reticulador heterobifuncional.

Diversos reticuladores heterobifuncionais são conheci- : dos na tecnologia.

Em algumas modalidades, o reticulador heterobifuncional contém um ' 30 grupo funcional que pode reagir com os primeiros sítios de anexação, isto é, com o grupo amino de cadeia lateral de resíduos de lisina da VLP ou subunidade VLP, e um grupo fun- ' cional adicional que pode reagir com um segundo sítio de anexação preferido | isto é, um resíduo de cisteina fundido no peptídeo antigênico disponibilizado para reação por redução.

Portanto em some modalidade, quando a sequência do peptídeo IgE antigênico áqui revela- do compreende uma cisteína, o dito peptídeo IgE antigênico é quimicamente reticulado ao carreador imunogênico por meio de uma ligação de tivéter, a dita ligação sendo) entre resi- duos de lisina do carreador imunogênico e o resíduo de cisteína da dita IgE antigênica.

Em

| | 1 | 47 | | uma modalidade preferida, o dito carreador imunogênico é uma VLP, preferivaimônto uma partícula tipo vírus Qbeta (ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435). Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a uma composição : compreendendo pelo menos dois imunógenos aqui descritos. Em uma modalidade, a pre- senteinvenção diz respeito a uma composição compreendendo pelo menos dois imunógeno ' em que cada imunógeno compreende um peptídeo IgE antigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico. Em uma modalidade, a dita composição compreende dois, três, quatro ou cinco imunógenos da presente invenção em que cada imunógeno aan um peptídeo IgE antigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico.

Preferivelmente, cada peptídeo IgE antigênico é individualmente ligado a diferentes moléculas de carreador imunogênico (cada molécula de carreador imunogênico tendo so- mente um tipo de peptídeo IgE antigênico conjugado com ela). Na dita madslidado, o peptí- deo IgE antigênico é o dito ser individualmente conjugado com o carreador imunogênico. . Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo - 15 ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- tigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico. Preferivelmente, cada um dos - peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o carreador imunogênico. | . Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógero consiste em: uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consíste nas SEO) ID Nos: 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ã 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, ra, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116. 117, 118, 119,120,121,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 154 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, k 153, pre- ferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9, 101, 12,13, 14, 15, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 86 57. 68, 69, , 30 70,71,72,73,76,77,78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 11, 120, 121, ' 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 E 148, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8, 9. 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43) 49, 50, 51, 52,53,54,55,56,57, 63,64,65,66,67,68,69,70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, ar, 133, e 139, ainda mais preferivelmente, do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, Í 4,5,6,7, ” | mm 48 | Ú 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 e 109, ainda mais preferivelmente, do ; grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, 22, 34,35, 36, 37, 49, | ' 50, 51, 63, 64 e 76, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ Db Nos: 1,2, 3,18,196e34, acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em ' uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 1 ou 18. | | Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógemno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sto ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,173,174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 208, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, e 219, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188) 189, 192, 2 15 193, 194,195,196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217, nei preferi- velmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159) 165, 166, =. 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 e 200, ainda nais preferi- velmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175, acima de tudo preferivelmente o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoá- cidosdas SEQID Nos: 154 ou 165.

Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID | Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255,256,257,258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, “. 307, 308, 309, e 310, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, . 242, 245, Í 30 246,247,248,249,250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, : 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283,284 e 290, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ o Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266, ainda pois preferi- velmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 2343 | acima de

| Ú 49 | : tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoá- cidos das SEQ ID Nos: 220 ou 233. | Ainda em um outro o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em ' uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ DD Nos: 311, 312,313,314,315,316,317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 27, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 881. 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402,403,404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 17, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430, preferivelmente do grugo que con- siste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, s21, 322, 323, Ú 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, . 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 368, 366, 367, 2 15 368,369,370,371,372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, av. 412, 413, = 416, 417, 418, 421, 422 e 425, mais preferivelmente do grupo que consiste nas sEQ 1D Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367,368,369,370,376,377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397) 403, 404 e 410, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: . 31, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353, ainda mais próferivelmen- tedogrupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326, acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das sea ID Nos: 311 ou 312. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptideo IgE an- " 30 tigênico ligado a um carreador imunogênico em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Nos: 1 e o peptídeo IgE ' antigênico do segundo imunógeno consiste em 165. Em uma outra modalidade) o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Nos: 1 e o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em uma sequência — de aminoácidosdasSEQ ID Nos: 220. Em uma outra modalidade, o peptídeo " antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ O Nos leo peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em uma sequência de âminoácidos |

=; | 50 | , i das SEQ ID Nos: 312. Preferivelmente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são indivi- | dualmente conjugados com o carreador imunogênico. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ' ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptideo 1gE an- —tigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico.

Preferivelmente, cada um dos : peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o carreador mujogêrico Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em: uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: fsa 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, IP. 173, 174,175,176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, bos, 209, . 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, e 219, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, o 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, ks 194, o. 15 195,196,199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, es, 169, - 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 e 200, ainda mais preferivelmente do gru- po que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175, acima de tudo preferivel- mente o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos) das SEQ IDNos:1540ou165. Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ 1D Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, | 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253 254, 255, —256,257,258,259,260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271,/272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, ass 2 291, | 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, . 8, 309, e | 310, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223,224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245,/246, 247, : 30 —248,249,250,251,252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305, mais preferivelmente do grupo que consiste nás SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, je 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 e 290, ainda mais preferiveemente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220) 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 e 245, acima de tudo pre- | o 1

" À Í a Í 51 | Ú ferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminhácidos das SEQ ID Nos: 220 ou 233. | Em uma outra modalidade, o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- , siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311,312,313,314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 328, 326, 327, | ' 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 348, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, ' 382, 383, 384,385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, —400,401,402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 418, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311,312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, . 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, - 15 —367,368,369,370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 1 411, 412, ss 413, 416, 417, 418, 421, 422 e 425, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 368, 359, 365, 366,367,368,369,370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, 404 e 410, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: | 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386, ainda mais preferivelmente do grupo aus consiste | nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353, ainda mais preferivel- mente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326, acima de tudo preferivel- ' mente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ | ID Nos: 311 ou 312. Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- , 30 tigênico ligado à um carreador imunogênico em que, o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 165 e b peptídeo | ' IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em 220. Em uma outra SA o pepti- deo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 165 e o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste Se uma se- —quênciade aminoácidos das SEQ ID Nos: 312. Preferivelmente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o carreador imunogênico. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição eis

| 52 ] — ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um pestídeo IgE an-

Í Í tigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico. Preferivelmente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o carreador imunogênico. : Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em: uma sequênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, Ú 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, : 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 258 256, 257, : 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 200, 291 292, 293, 294,295,296,297,298,299,300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, e 310, pre- ferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224 25 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246) 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268) 269, 270, |. 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 22. 293, 296, - 15 297,298, 301, 302 e 305, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: | 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245 246, 247, | - 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, be e 290, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221] 222, 223, | 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266, ainda mais e — do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 3 245, acima de tudo preferi- velmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220 ou 233 . | Em uma modalidade, o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógerio consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311,312,313,314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326 327, 328, ; 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344] 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398 399, 400, 7 30 — 401,402,403,404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430, preferivelmente do (grupo que ' consiste nas SEQ ID Nos: 311,312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, a 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365) 366, 367, —368,369,370,371,372,373,376,377,378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387) 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 41 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 e 425, mais preferivelmente do grupo que consiste nas seo 1D Nos: | AA |

53 | t 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, aa, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397,/403, 404 e j ' 410, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: . 311), 312, 313, 314,315,316,317,326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, ] 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386, ainda mais preferivelmente do grupo que cbneiste nas | SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326, acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: : 10 3110ou3i2. ; Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo : ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- ! | tigênico ligado a um carreador imunogênico em que, o peptídeo IgE antigênico do primeiro . imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220 “+ peptídeo . 15 IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em 312. Preferivelmente, cada um dos pep- tídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o carreador imunogêriico. . De acordo com uma modalidade da presente invenção o imunógeno da composição aqui revelado anteriormente é ligado, preferivelmente quimicamente reticulado, q um carre- ador imunogênico tanto diretamente quanto por meio de um ligante da maneira aqui revela- da Em uma modalidade, o carreador imunogênico é Hemocianina do molusco gigante bura- co de fechadura [KLH]) ou uma partícula tipo vírus (VLPs). Em uma modalidade breferida o dito carreador imunogênico é uma VLP selecionada do grupo que consiste em NT de HB- cAg, HBsAg VLP, VLP Qbeta ou qualquer variante revelada aqui.

Ainda em uma j odalidade preferida, o dito carreador imunogênico é uma VLP Qbeta selecionada do grupo im consis- teem dQbeta CP; Qbeta A1, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 e Qbeta-259. Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo b ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- | tigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico.

Em uma modalidade, o primeiro imunógeno consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou " 30 consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220, 221, 233, 234, 244 e 246, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 220 ou = que é ' quimicamente reticulada com uma partícula tipo virus Qbeta (mais preferivelmenté Qbeta da SEQ ID NO: 435) por meio de uma ligação de tioéter, a dita ligação sendo entre rêsiduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteina do dito peptídeo IgE antigênico, e o segundo imunóge- no consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, bu consis- tindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 311, 312 e 326, acima de tudo preferivelmente das SEQ ID Nos: 311 ou 312, em que a dita IgE po

- ! | 54 ' compreende adicionalmente no seu terminal C uma cisteína que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus Qbeta, mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. Prefe- rivelmente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com o ] carreador imunogênico. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- tigênico aqui revelado, ligado à um carreador imunogênico.

Em uma modalidade, lo primeiro imunógeno consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos 220, 221, | 10 233,234,244 e 246, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 220 ou ds, que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus Qbeta (mais preferivelmente Qbeta da | SEQ ID NO: 435) por meio de uma ligação de tivéter, a dita ligação sendo entre réstduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteína do dito peptídeo IgE antigênico, o segundo imunógeno . consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou donsistindo - 15 essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 18) 19 ou 34, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 1 ou 18, em que a dita IgE entigênica com- " preende adicionalmente no seu terminal C uma cisteína que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus Qbeta, mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. 'Preferivel- mente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados tom o car- readorimunogênico. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ou consistindo em três imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídêo IgE an- tigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico.

Em uma modalidade b primeiro imunógeno consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ |D Nos! 220, 221, 233, 234, 244 e 246, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 220 ou 239, que são quimicamente reticuladas com uma partícula tipo vírus Qbeta (mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435) por meio de uma ligação de tioéter, a dita ligação sendo ento resíduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteína do dito peptídeo IgE antigênico, o segundo imunó- , 30 geno consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica consistindo, Ou con- sistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 311, 312e ' 326, acima de tudo preferivelmente das SEQ ID Nos: 311 ou 312, em que a dita 1bE antigê- nica compreende adicionalmente no seu terminal C uma cisteina que é quimicamente reticu- lada com uma partícula tipo vírus Qbeta, mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID ko: 435 e oterceiroimunógeno consiste em um imunógeno compreendendo uma IgE antigênica con- sistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ |D Nos: 1, 2, 3, 18, 19 ou 34, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 1 ou 18, em que 1 |

| 55 | í a dita IgE antigênica compreende adicionalmente no seu terminal C uma csteind que é qui- micamente reticulada com uma partícula tipo vírus Qbeta, mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. Preferivelmente, cada um dos peptídeos IgE antigênicos são individual- ' mente conjugados com o carreador imunogênico. ) Ss Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ' ou consistindo em dois imunógenos, cada imunógeno compreendendo um peptídeo IgE an- tigênico aqui revelado, individualmente conjugado com um carreador unegênido Em uma modalidade, o primeiro imunógeno consiste em um imunógeno compreendendo um peptí- deo IgE antigênico consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de ami- —noácidos das SEQ ID Nos: 220, 221, 233, 234, 244 e 246, acima de tudo preferivelmente, 1 das SEQ ID Nos: 220 ou 233 . Preferivelmente, o dito primeiro peptídeo IgE antigênico é quimicamente reticulado com uma partícula tipo vírus Qbeta (mais preferivelmente Qbeta da L i SEQ ID NO: 435) por meio de uma ligação de tioéter usando SMPH (hexanoato ke succini- . midil-6-[R&-maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre resíduos de lisinada VLP e o resíduo de cisteína do dito peptídeo IgE antigênico.

Preferivelmente, o se- ' gundo imunógeno consiste em um imunógeno compreendendo um peptídeo e antigênico z consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 311, 312 ou 326, acima de tudo preferivelmente, das SEQ ID Nos: 311 ou 3/12. Preferi- velmente, o dito segundo peptídeo IgE antigênico compreende adicionalmente no seu termi- nalCum ligante GC, preferivelmente um ligante com a fórmula GGC (preferiveimlente o dito segundo peptídeo IgE antigênico que compreende no seu terminal C um ligante so consis- | te, ou consiste essencialmente em sequência de aminoácidos da SEQ ID No: (57 que é quimicamente reticulada com uma partícula tipo vírus por meio de uma ligação de tioéter usando SMPH (hexanoato de succinimidil-6-[&3-maleimidopropionamido]) como reliculador, a ditaligação sendo entre resíduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteina do dita ligante do | terminal C.

Em uma modalidade preferida, a dita VLP é selecionada do grupo que consiste i em HBcAg, HBsAg e Qbeta.

Preferivelmente a dita VLP é Qbeta, ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435. | Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo ' 30 ou consistindo em dois, três, quatro ou mais imunógenos em que cada imunógero compre- ende um peptídeo IgE antigênico ligado a um carreador imunogênico e em que, oj dito pepti- : deo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de| aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, í 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ba, 35, 36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, bo, 83, 84, | 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, b. 105, 106, | o | 56 | ] 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122. 123, 124, Í 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, ' 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179,180,181,182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, : 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269,270,271,272,273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, o 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 357, 358, —359,360,361,362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374) 375, 376, o 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, a92 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, hazo e 430. Em uma modalidade, os ditos peptídeos IgE antigênicos são ligados no mesmo carreador —imunogênico.

Em uma outra modalidade, os ditos peptídeos IgE antigênicos são ligados em | carreador imunogênico diferente e então misturados.

Método de produção do imunógeno da invenção A invenção, diz respeito adicionalmente a um processo para a produção, do imunó- t geno revelado aqui.

Em uma modalidade, o dito imunógeno compreende pelo menos um —peptídeo IgE antigênico aqui revelado, ligado a um carreador imunogênico reviao aqui.

Portanto, a invenção diz respeito adicionalmente a um processo para a produção de um i- , munógeno compreendendo a etapa de ligar pelo menos um peptídeo IgE antidênico aqui revelado a um carreador imunogênico revelado aqui.

Em uma modalidade, a dita ligação é realizada por reticulação química, tanto diretamente quanto por meio de um ligante, em par- ' 30 ticularumligante GC (por exemplo, uma cisteína) da maneira aqui revelada.

Em uma moda- lidade, a invenção diz respeito a um processo para o produção de um imunógeno compre- ' endendo a etapa de ligar pelo menos um peptídeo IgE antigênico aqui revelado, de forma ' opcional compreendendo adicionalmente um ligante da maneira aqui revelada, q uma VLP revelada aqui, a dita ligação sendo realizada por reticulação química, tanto diretamente quanto por meio de um ligante, em particular um ligante GC (por exemplo, uma cisteína) da maneira aqui revelada.

Em uma modalidade particular, quando a sequência do peptídeos 1gE antigênico aqui revelado compreende uma cisteína, o dito peptídeo IgE .. é cova-

| 57 | ' lentemente ligado a VLP diretamente por meio da dita cisteína. Na dita madafidede, o pro- cesso inclui uma etapa de reticulação química da maneira aqui descrita e preferivelmente usando um reticulador heterobifuncional (por exemplo, éster N-gama-maleimido-butirilóxi- : succinimida (GMBS) ou hexanoato de succinimidil-6-[&-maleimidopropionamido] (SMPH)).

: 5 Portanto, em algumas modalidades, a etapa de reticulação química resulta na ve sendo ' reticulada por meio de uma ligação de tioéter, a dita ligação sendo entre resíduos de lisina da VLP e o resíduo de cisteína da dita IgE antigênica. Em uma modalidade preferida, a dita VLP é preferivelmente uma partícula tipo vírus Qbeta (ainda mais preferivelmente Qbeta da SEQ ID NO: 435). Uma modalidade adicional da presente invenção, diz respeito a um imu- | 10 —nógeno obtenível pelo processo aqui revelado. Composições compreendendo um peptídeo IgE antigênico da invenção A presente invenção diz respeito adicionalmente a composições, particularmente o composições imunogênicas também referidas como “composições munagêrica em ques- tão”, compreendendo um peptídeo IgE antigênico da invenção, preferivelmente ligadas a um —carreador imunogênico, mais preferivelmente uma VLP, ainda mais preferivelmente um VLP SS HBsAg, HbcAg ou Qbeta, e de forma opcional pelo menos um adjuvante. Tais composições z imunogênicas, particularmente quando formuladas como composições farmacêlticas, são ; consideradas prevenir, tratar ou aliviar distúrbios relacionados a IgE.

Em algumas modalidades, uma composição imunogênica em questão |de acordo coma invenção, compreende um peptídeo IgE antigênico compreendendo uma|sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID Nos: 1 a 430, e suas variantes funcionalmente ati- vas, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferiveimente | do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivélmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430. Em alguma modalidade, o dito peptideo IgE antigênico é ligado a um carreador imunogênico, preferivelmente uma VLP, mais! preferivel- mente a um VLP HBsAg, HbcAg ou Qbeta.

t Uma composição imunogênica em questão compreendendo um peptídeo IgE anti- gênico de acordo com a invenção, pode ser formulada em inúmeras maneiras, da maneira descrita com mais detalhes a seguir. : ' 30 Em algumas modalidades, uma composição imunogênica em questão compreende única espécie de peptídeo IgE antigênico, por exemplo, a composição imunogênica compre- ' ende uma população de peptídeos IgE antigênicos, substancialmente todos lue têm a | mesma sequência de aminoácido. Em outras modalidades, uma composição. imunogênica | em questão compreende dois ou mais peptídeos IgE antigênicos diferenciados, por exem- plo, acomposiçãoimunogênica compreende uma população de peptídeos IgE antigênicos, os membros de cuja população podem diferir da sequência de aminoácido. une conses: ção imunogênica em questão pode compreender de dois a cerca de 20 " IgE anti-

i gênicos diferenciados, por exemplo, uma composição imunogênica em — com- preender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, ou 15-20 peptídeos IgE antigênicos diferenciados, cada qual tendo um aminoácido que difere das sequências de aminoácidos dos butros pep- : tídeos IgE antigênicos. | Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição imunogênica em questão | i compreende um primeiro peptídeo IgE antigênico, preferivelmente ligado a a carreador imunogênico, mais preferivelmente a uma VLP, ainda mais preferivelmente a uma VLP HB- sAg, HbcAg ou Qbeta, e compreendendo “uma primeira sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: SEQ ID Nos: 1 a 430, mais preferivelmente do | 10 grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente do | grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430; e pelo menos um segundo peptídeo IgE antigênico, preferivelmente ligado a um carreador imunogênico, mais preferivelmênte a uma VLP, ainda mais preferivelmente a um VLP HBsAg, HbcAg ou Qbeta, e compreendendo . uma segunda sequência de aminoácido, preferivelmente selecionada do grupo que consiste nasSEQID Nos: 1 a430, mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a ' 153 e 220 a 430, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a à 430; onde a segunda sequência de aminoácidos difere da primeira sequência de aminoáci- dos por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10, ou 15 aminoácidos.

Em uma modalidade adicional, o primeiro peptídeo IgE antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada —dogrupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311 a 430 e o dito segundo peptídeo IgEl antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 310, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 310 ou das ': SEQ ID Nos: 1 a 153, ou das SEQ iD Nos: 154 a 219, mais preferivelmente coloraro que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 310. Em uma outra modalidade adicional, o pri jeiro peptí- ] 25 deolgE antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dojarupo que | consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 310 e o dito segundo peptídeo IgE antigênico dmpreendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ 1d Nos: 1a 219 e 311 a 430, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311 a dão ou das SEQ ID Nos: 1 a 153, ou das SEQ ID Nos: 154 a 219, mais preferivelmente do lerupo que : 30 consistenasSEQ ID Nos: 311 a 430. Em uma outra modalidade adicional, o primeiro peptí- deo IgE antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada douro que ' consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e o dito segundo peptídeo IgE antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154a | 430, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 310, das SEQ ID Nos: 311a430,0oudasSEQID Nos: 154 a 219. Em uma outra modalidade sscoreto primeiro peptídeo IgE antigênico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154 a 219 e o dito segundo peptídeo IgE me compre- o

| 59 | ende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 153 e 220 a 430, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: . 310, ou das SEQ ID Nos: 1 a 153, ou das SEQ ID Nos: 311 a 430. | ' Como um outro exemplo, uma composição imunogênica em questão compreende um primeiro peptídeo IgE antigênico, preferivelmente ligado a um carreador nbrogêni ' mais preferivelmente a uma VLP, ainda mais preferivelmente a uma VLP HBsAg) HbcAg ou Qbeta, e compreendendo 'uma primeira sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430; um segundo peptideo IgE antigênico, preferivelmen- te ligado a um carreador imunogênico, mais preferivelmente a uma VLP, ainda mais preferi- velmentea uma VLP HBsAg, HbcAg ou Qbeta, e compreendendo uma segunda sequência de aminoácido, preferivelmente selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1a430 l onde a segunda sequência de aminoácidos difere da primeira sequência de aminvácidos por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 10, ou 15 aminoácidos; e pelo menos um terosira antigênico ' polipeptídeo IgE, preferivelmente ligado a um carreador imunogênico, mais preferivelmente auma VLP, ainda mais preferivelmente a uma VLP HBsAg, HbcAg ou Qbeta, e! compreen- ' dendo uma terceira sequência de aminoácido, preferivelmente selecionada do! grupo que , consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 430, onde a terceira sequência de aminoácidos difere tanto | das primeiras quanto das segundas sequências de aminoácidos por pelo menos Ê 2,3,4,5, 6 a 10, ou 15 aminoácidos.

Em uma modalidade adicional, o primeiro peptídeo IgE antigêni- co compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311 a 430; e os ditos segundo e terceiros peptídeos IgE antigênicos compre- endem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: ' 1 a 310, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 310 ou as SEQ ID | Nos: 1 à 153 ou das SEQ ID Nos: 154 a 219. | Em uma outra modalidade adicional, o primeiro peptídeo IgE antigênico compreen- de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ P Nos: 220 a 310 e os ditos segundo e terceiros peptídeos IgE antigênicos compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 219 é 311 a 430, preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311 a 430 ou das SEQ ID Nos: 1 a ' 30 1530udasSEQID Nos: 154a219. | Em outras modalidades, uma composição imunogênica em questão tompreende ] um polipeptídeo IgE antigênico multimerizado, da maneira descrita anteriormente.

Da manei- ra aqui usada, os termos “composição imunogênica compreendendo um peptídeo IgE anti- gênico” ou “composição imunogênica da invenção” ou composição imunogânita em ques- tão” refere-se a uma composição imunogênica compreendendo tanto espécie Érica (muilti- merizado ou não) quanto espécie múltiplas de peptídeo(s) IgE antigênico(s) acoplado(s) ou não à um carreador imunogênico.

Onde dois ou mais peptídeos são usados aodoiados aum

60 | : ' carreador, o peptídeo pode ser acoplado na mesma molécula carreador ou individualmente acoplado na moléculas carreadores e então combinado para produzir uma composição imu- nogênica. | ' Um outro aspecto da invenção diz respeito a métodos para produzir um imunógeno de acordo coma invenção, o dito método compreendendo acoplar um peptídao lo antigê- Ú nico a um carreador imunogênico.

Em uma modalidade, o dito acoplamento é químico.

Em algumas modalidades, uma composição imunogênica em questão cbmpreende pelo menos um adjuvante.

Adjuvantes adequados incluem aqueles adequados para uso em mamíferos, preferivelmente em humanos.

Exemplos de adjuvantes adequados Lonhecidos que podem ser usados em humanos incluem, mas necessariamente sem limitações, a es- | tes, alume, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MF59 (4,3 % p/v de esquiar 0,5% | p/v de polissorbato 80 (Tween 80), 0,5 % p/v de trioleato de sorbitano (Span 85)), ácido nu- i cléico contendo CpG (onde o citosina é não metilada), OS21 (adjuvante de saponina), MPL | . (monofosforil lipídio A), SDMPL (MPL 3-O-deacilado), extratos de aquila, —. (ver, por — 15 exemplo, Sjôlander et al. (1998) J.

Leucocyte Biol. 64:713; WO90/03184, WO96/11711, WO ' 00/48630, WO98/36772, WO00/41720, WO06/134423 e WO07/026190), muartes LT/CT, . micropartículas de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), interleucinas Quil A, e similares.

Para aplicações veterinárias incluindo, mas sem limitações, experimento anima, pode-se usar N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetl-nor-murami-l-alant-D- isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil- L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE) de Freund, e RIBI, que contêm três componentes extraídos da bâctéria, mo- nofosforil lipídio A, dimicolato de trealose e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de esqualeno/Tween 80 2 %. | Adjuvantes adicionalmente exemplares para melhorar a efetividade da composição incluem, mas sem limitações: (1) formulações de emulsão de óleo em água (. ) m ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como os peptídeos muramil eder a seguir) ou componentes da parede celular bacteriana), tal como, por exemplo, ( ) MF59TV (WOS90/14837; Chapter 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant apread, eds.

Po- . 30 well & Newman, Plenum Press 1995), contendo 5 % de Esqualeno, 0,5 % de Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitano), e 0,5 % de Span 85 (trioleato de solbitano) (de ' forma opcional contendo tri-peptídeo muramil covalentemente ligado a dipalmitofa fosfatidi- letanolamina (MTP-PE)) formulada em partículas submicron usando um microfluidizador, (b) SAF, contendo 10 % de Esqualeno, 0,4 % deTween 80, 5 % de polímero bloqueado por plu- rônicoL121,ethr-MDP tanto microfluidizados em uma emulsão submicron quahto vortexa- dos para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adiuv. nte RIBITM (RAS), (Ribi Imunochem, Hamilton, MT) contendo 2 % de Esqualeno, 0.2 % de Teen 80, e

MT .. 5 Z 2 0 0 la b. -- Y 1 : | 61 | | ] um ou mais componentes da parede celular bacteriana tais como monofosfe drilipídeo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DETOX'Y); (2) adjuvantes de saponina, tais como QS21, STIMULÔN't" (Cam- ' bridge Bioscience, Worcester, MA), Abisco& (Isconova, Suécia), ou Iscomatrix& (Common- wealth Soro Laboratories, Austrália), podem ser usados ou partículas geradas deles tal co- Ú mo ISCOMs (complexos imunoestimulantes), cujo ISCOMS pode ser livre ce cororgento adicional, por exemplo, WO00/07621; (3) Adjuvante de Freund Completo (CFA) é Adjuvante de Freund Incompleto (IFA); (4) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo) IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, 1L-6, IL-7, 11-12 (WO99/44636), etc.), interferons (por exemplo, gama iinterferon), fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), etc.; (5) monofosforil lipídio A (MPL) ou MPL 3-O-deacilado (3dMPL) por exemplo, Sn2a202A, EP- A-0689454, de forma opcional na ausência substancial de alume quando usado dom sacarí- deos pneumococos, por exemplo, WO00/56358; (6) combinações de 3dMPL, p: a exemplo, . com QS21 e/ou emulsões óleo em água, por exemplo, EP-A-0835318, EP-A.07â5898, EP- — A-0761231; (7) oligonucleotideos compreendendo motivos de CpG [Krieg Vaccinê 2000, 19, ' 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24; Roman et al., Nat.

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Imunol, 1998, 160, 5898-5906; Pedidos de patentes in- ternacionais WOS96/02555, WOS98/16247, WOS98/18810, WOS98/40100, WO98/55495, WOS98/37919 e WO98/52581] isto é, contendo pelo menos um dinucleotídeo de, onde a citosina é não metilada; (8) um éter de polioxietileno ou um éster de polioxietileno, por e- xemplo, WO99/52549; (9) um agente tensoativo de éster de polioxietileno sorbitano em ] 30 — combinação com um octoxinol (WO01/21207) ou um agente tensoativo de alquil éter ou és- ter de polioxietileno em combinação com pelo menos um agente tensoativo não| iônico adi- ' cional tal como um octoxinol (WOO01/21152); (10) uma saponina e um oligonucleotídeo imu- noestimulatório (por exemplo, um oligonucleotídeo de CpG) (WO00/62800); (11)/jum imuno- estimulante e uma partícula de sal de metal, por exemplo, WO00/23105; (12) uma saponina e uma emulsão de óleo em água, por exemplo, WO99/11241; (13) uma saponina (por e- xemplo, QS21) + SdMPL + IM2 (opcionalmente + um esterol) por exemplo, WO98/57659; (14) outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes para " a eficá-

| : 62 | cia da composição, tais como os, peptídeos muramila incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor.MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutarninil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3- , hidroxifosforilóxi)-etilamina MTP-PE), (15) ligantes para receptores toll-like (TLR), naturais ou sintetizados (por exemplo, da maneira descrita em Kanzler et al 2007, Nato Medicine 13, p1552-9), incluindo ligantes TLR3 tal como polil:C e compostos similares tais como Hil- tonol e Ampligen. Em uma modalidade, a composição imunogênica da presente invenção compreen- de pelo menos um adjuvante. Em uma modalidade particular, o dito adjuvante é um oligonu- cleotídeo imunoestimulatório e mais preferivelmente um oligonucleotídeo de cpô. Em uma modalidade, o oligonucleotideo de CpG tem a sequência de ácido nucléico 5 TCGTCGTTTTTCGGTGCTTIT 3' (ODN CpG 24555; SEQ ID NO: 431). À sequência de i ácido nucléico de oligonucieotídeo imunoestimulatório da SEQ ID NO: 431 difere de um oli- . gonucleotideo — imunoestimulatório — previamente — reportado — (ODN 101 os) ss TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 432) pela reversão de mais 3' do dinucleotí- ' deo de CG. As similaridades na atividade entre esses dois oligonucleotídeos imunasstimuta- . tórios é surpreendentemente em virtude de ter sido previamente reportado que ja atividade imunoestimulatória de oligonucleotídeos de CpG é dependente do número de |motivos de CpG, das sequências que flanqueiam o dinucleotídeo de CG, da localização do(s) motivo(s) de CpG e do espaçamento entre os motivos de CpG (Ballas et al., 1996, J. Imunol; Hart- mann et al., 2000, J. Imunol.; Klinman et al., 2003, Clin. Exp. Imunol.). A remoção de mais 3' de dinucleotídeo de CG em oligonucleotídeo imunoestimulatório ODN de CpG 24555 (SEQ 1D NO: 431) não resulta em um impacto negativo na capacidade deste oligonucisotidea [3 munoestimulatório aumentar respostas imunes específicas de antígeno como séria espera- —dodasrevelações anteriores. ODN de CpG 24555 demonstrou atividade imunoestimulatória similar e em alguns casos maior quando comparado com ODN de CpG 10103. | O oligonucleotídeo imunoestimulatório pode ser de fita dupla ou de fita Simples. Ge- ralmente, de moléculas de fita dupla são mais estáveis in vivo, enquanto moléculas de fita simples têm menor atividade imune. Assim, em alguns aspectos da invenção é preferido que : 30 oácidonucléico seja de fita simples e em outros aspectos é preferido que o ácido nucléico seja de fita dupla.

' Os termos “ácido nucléico” e “oligonucleotídeo” são usados indiferentemente aqui para significar múltiplos nucleotídeos (isto é, moléculas compreendendo um aquear (por e- xemplo, ribose ou deoxiribose)) ligados a um grupo fosfato e a uma base orgânica permutá- vel, que6é tanto uma pirimidina substituída (por exemplo, citosina (C), timidina - Ou uracil (U)) quanto uma purina substituída (por exemplo, adenina (A) ou guanina (G)). /Da maneira aqui usada, os termos referem-se a oligoribonucleotídeos (isto é, um — menos " Í

| 63 | o fosfato) e qualquer outra base orgânica contendo polímero.

Moléculas de áci lo nucléico podem ser obtidas de fontes de ácido nucléico existentes (por exemplo, genômicas ou DNAc), mas são preferivelmente sintéticos (por exemplo, produzidas por síntese de ácido : nucléico). Em uma modalidade, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem englobar vá- Ú rios modificações e substituições químicas, em comparação com RNA e DNA natural, que envolvem uma ponte de internucleosídeo fosfodiéster, uma unidade B-D-ribose dou um ba- | se de nucleosídeo natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracil). Exemplos e modifica- ções químicas são conhecidos pelos versado e são descritos, por exemplo, em Uhimann E. etal (1990), Chem.

Rev. 90:543; “Protocols of Oligonucleotides and Analogs” Sypthesis and Properties & Synthesis and Analytical Technics, S.

Agrawal, Ed., Human Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu.

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Toxicol. 36:107-126; and Hun- i ziker J. et al., (1995), Mod.

Synth.

Methods 7:331-417. Um oligonucleotídeo de Acordo com . a invenção, pode ter uma ou mais modificações, em que cada modificação é localizada em uma ponte de internucleosídeo fosfodiéster particular e/ou em uma unidade $-D-ribose parti- ' cular e/ou em uma posição da base de nucleosídeo natural particular em comparação com . um oligonucleotídeo da mesma sequência que é composta de DNA natural ou RNA.

Por exemplo, os oligonucleotídeos podem compreender um ou mais modificações.

Í Tais modificações podem ser selecionadas de: a) da substituição de uma ponte ide internu- —cleosídeo fosfodiéster localizado no terminal 3' e/ou no 5' de um nucleosídeo por uma ponte de internucleosídeo modificado, b) da substituição de ponte de fosfodiéster localizado no | terminal 3' e/ou o 5º de um nucleosídeo por uma ponte de defosfo, c) da substituição de uma unidade de fosfato de açúcar da espinha dorsal do fosfato de açúcar por uma outra unidade, d) da substituição de uma unidade B-D-ribose por uma unidade de açúcar modificado, e e) da substituiçãode uma base de nucleosídeo natural.

Ácidos nucléicos também incluem purinas e pirimidinas substituídas, tais como ba- ses modificadas de C-5 propina pirimidina e purina 7-deaza-7-substituídas (Wagner et al., 1996, Nat.

Biotechnol. 14:840-4). Purinas e pirimidinas incluem, mas sem limitações, adeni- na, citosina, guanina, timidina, S-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6- o 30 diaminoputina, hipoxantina, e outras frações aromáticas de nucleobases de com ncia natu- ral e não natural, substituídas e não substituídas.

Outras tais modificações são dem conhe- ' cidas pelos versados na tecnologia. | Uma base modificada é qualquer base que é quimicamente distinta das bases de ocorrência natural tipicamente encontradas em DNA e RNA, tais como T, C, G, A, e U, mas que compartilham estruturas químicas básicas com essas bases de ocorrência natural.

À base modificada de nucleosídeo pode ser, por exemplo, selecionada de hipoxanti a, uracila, di-hidrouracil pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, . |

64 | 5-(C2-C6)-alqueniluracila, 5-(C2-C6)-alquilniluracila, S-(hidroximetil)uracila, S-clodauradia, 5- fluoruracila, — 5-bromouracila, — S-hidroxicitosina, — 5-(C1-C6)-alquilcitosina, jo (casar alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquilnilcitosina, S-clorocitosina, 5-fluorcitosina, S-bromocitosina, ' N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, um 7-deazapurina substituída, preferi- velmente purina 7-deaza-7-substituídas e/ou 7-deaza-8-substituídas, S-hidroximetilcitosina, : Nã4-alquilcitosina, por exemplo, Ná4-etilcitosina, S5-hidroxideoxicitidina, 5- hidroximetildeoxicitidina, N4-alquildeoxicitidina, por exemplo, N4-etildeoxicitidina, 6- tiodeoxiguanosina, e deoxiribonucleosídeos de nitropirrol, C5-propinilpirimisina, e diaminopu- rina, por exemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, S-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6- —cloropurina, hipoxantina ou outras modificações de uma base de nucleosídeo “deurar Esta lista deve ser exemplar e não deve ser interpretada como limitante. : Em alguns aspectos da invenção, o dinucleotídeo CpG dos cmol imu- noestimulatórios aqui descritos são preferivelmente não metilados.

Um motivo CpG não me- - tilado é uma sequência de dinucleotídeo citosina-guanina não metilada (isto é, una citosina 5 não metilada seguida por guanosina 3' e ligada por uma ligação de fosfato). |Em outros ' aspectos, os motivos de CpG são metilados.

Um motivo de CpG metilado é ma sequência : de dinucleotídeo citosina-guanina metilada (isto é, uma citosina S'metilada seguida por uma guanosina 3' e ligada por uma ligação de fosfato). Em alguns aspectos da invenção, um oligonucleotídeo Imuncestraudário pode conteruma citosina modificada.

Uma citosina modificada é uma base de pirimidina de ocor- | rência natural ou ocorrência não natural análoga de citosina que pode substituir esta base sem prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligonucleotídeo.

Citosinas niodificadas incluem, mas sem limitações, 5- citosinas substituídas (por exemplo, 5-metil-citosina, 5-flúor- citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5:hidroximetil- citosina, 5-difluormetil-citosina, e 5-alquinil-citosina não substituídas ou substituídas), 6- citosinas substituídas, N4- citosinas substituídas (por exemplo, N-etircitosina), B5-aza- citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sis- temas de anel condensado (por exemplo, N,N'-propileno citosina ou foncnazinal e uracil e seus derivados (por exemplo, 5-flúor-uracila, 5-bromo-uracila, 5-bromovinil-urácila, 4-tio- " 30 uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-propinil-uracil). Algumas das citosinas preferidas incluém B-metil- citosina, 5-flúor-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, e N4-etilcitosiná.

Em uma ' outra modalidade da invenção, a base de citosina é substituída por uma base universal (por exemplo, 3-nitropirrol, P-base), um sistema anel aromático (por exemplo, fluorobenzeno ou | difluorbenzeno) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer). | Em alguns aspectos da invenção, um oligonucleotíideo imunoestimutalório pode | conter um guanina modificada.

Uma guanina modificada é uma base de purina de ocorrên- cia natural ou ocorrência não natural análoga de guanina que pode substituir esta base sem |

' 65 | ' prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligonucleotídeo.

Guaninas modificadas inclu- em, mas sem limitações, 7-de-eazaguanina, guanina 7-deaza-7-substituídas, hipoxantina, guaninas N2-substituídas (por exemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H- ' tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, inda), adenina, adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil-adenina, 8-ox0-adenina), duanina 8- Ú substituídas (por exemplo, 8-hidroxiguanina e 8-bromoguanina), e G-fioguanina.

Em uma outra modalidade da invenção, a base de guanina é substituída por uma base universal (por | exemplo, 4-metil-indol, S-nitro-indol, e K-base), um sistema anel aromático tror exemplo, benzimidazo! ou dicloro-benzimidazol, amida do ácido 1-metil-1H-[1 ,2,A4]triazol-3-carboxílico) ouum átomo de hidrogênio (dSpacer). | Em certos aspectos, os oligonucleotídeos podem incluir ligações internucleotideo modificadas.

Essas ligações modificadas podem ser parcialmente resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizadas). Uma “molécula de ácido nucléico estabilizada” beve signi- . ficar uma molécula de ácido nucléico que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, por meio de uma exo- ou endo- nuclease). A estabilização pode ser uma fun- ' : ção do comprimento da secundária estrutura.

Ácidos nucléicos que têm dezenas h centenas . de quilobases de comprimento são relativamente resistentes à degradação in jo Para ácidos nucléicos menores, estrutura secundária pode estabilizar e aumentar seu efeito.

À formação de uma estrutura semicircular pode estabilizar uma molécula de ácido nucléico.

Porexemplo, se o terminal 3' de um ácido nucléico tem auto-complementariedade com uma região à montante de forma que ele possa redobrar e formar uma estrutura semiciraular, então o ácido nucléico pode se tornar estabilizado e apresentar mais atividade. | A estabilização de ácido nucléico pode também ser realizada por meio dê modifica- ' ções da espinha dorsal do fosfato.

Oligonucleotídeos tendo ligações de fosfordtioato, em algumas modalidades, podem fornecer atividade máxima e proteger o oligonuclbotídeo de degradação por nucleases exo- e terminal- intracelulares. | Para uso in vivo, ácidos nucléicos são preferivelmente, de forma relativa lusistartes à degradação (por exemplo, por meio de endo- e exo-nucleases). Demonstrou-sej que modi- ficação da espinha dorsal do ácido nucléico fornece melhor atividade de ácidos nucléicos 7 30 quando administrada in vivo.

Estruturas secundárias, tais como semicirculares, podem esta- bilizar ácidos nucléicos contra degradação.

Alternativamente, estabilização de ácido nucléi- ' co pode ser realizada por meio de modificações da espinha dorsal do fosfato. ur aco nu- cléico estabilizado preferido tem pelo menos uma espinha dorsal de fosforotivato modificado parcial.

Fosforoticatos podem ser sintetizados usando técnicas automatizadas erhpregando tanto químicas de fosforamidato quanto H-fosfonato.

Aril- e alquil-fosfonatos podêm ser fei- tos, por exemplo, da maneira descrita em Patente U.S.

No. 4.469.863; e alquitfosfotriêsteres (em que a fração de oxigênio carregada é alquilada da maneira descrita na Patente U.S.

No. 1 | |

| 66 |

5.023.243 e Patente européia No. 092.574) podem ser preparados por síntese automatizada de fase sólida usando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e substituições na espinha dorsal do DNA foram descritos (Uhimânn, E. and ' Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate chem 1:165). Os ácidos 2'-O-metil nucléicos com motivos de CpG também causam ativação imune, tal como : os ácidos nucléicos CpG modificados por etóxi. De fato, não foi observada nenhuma modifi- cação na espinha dorsal que abole completamente o efeito de CpG, embora ssa bastante j reduzido substituindo o C com um 5-metil C. Construtos com ligações de fosforoticato forne- cem atividade máxima e protegem o ácido nucléico de degradação por exb- e endo- —nucleases intracelulares. Outros ácidos nucléicos modificados incluem ácidos nubléicos mo- | dificados por fosfodiéster, combinações de ácido nucléico de fosfodiéster e fobforoticato, : ' metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfororditicato, p-etóxi, e suas combinações, a qual ' dessas combinações e seus efeitos particulares nas células imunes é discutida com mais : detalhes com relação aos ácidos nucléicos CpG em Pedidos de Patentes publicados PCT PCT/US95/01570 (WO 96/02555) e PCT/US97/19791 (WO 98/18810) e em Patentes Uu.s. : US 6.194.388 B1 concedido em 27 de fevereiro de 2001 e US 6.239.116 B1 corleedido em . 29 de maio de 2001, os teores na íntegra dos quais estão aqui incorporados pela referência. Acredita-se que esses ácidos nucléicos modificados possam apresentar atividade mais es- timulatória por causa de maior resistência à nuclease, maior captação celular, maior ligação de proteína, e/ou localização intracelular alterada. | Para administração in vivo, ácidos nucléicos podem ser associados com uma molé- cula que resulta em ligação de maior afinidade com célula alvo (por exemplo, célula dendrí- tica, célula B, célula monocítica e célula matadora natural (NK)) superfícies e/ou maior cap- | tação celular por célula alvos para formar um "complexo de distribuição de ácido nucléico”".

Ácidos nucléicos podem ser ionicamente ou covalentemente associados com|motécutas apropriadas usando técnicas que são bem conhecidas na tecnologia. Uma valiedade de acoplamentos ou agentes de reticulação pode ser usada, por exemplo, proteína A, carbodi- imida, e propionato de N-succinimídil-3-(2-piridildítio) (SPDP). Ácidos nucléicos podem alter- nativamente ser encapsulados em lipossomos ou virossomes usando técnicas Bem conhe- ' 30 cidas. Outros ácidos nucléicos estabilizados incluem, mas sem limitações, abétogos de ] DNA não iônicos, tais como alquil- e aril-fosfatos (em que o fosfonato de oxigênio| carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiéster e asia aa dem que a fração de oxigênio carregada é alquilada. Ácidos nucléicos que contêm diol, tal como tetrae- tilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em qualquer um dos terminais ou ambos mastah também ; ser substancialmente resistentes à degradação de nuclease. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo imunoestimulatório da invenção pode incluir pelo menos um dhálogo de

| | 67 ' nucleotídeo substituído lipofílico e/ou um dinucleotídeo de pirimidina-purina.

Os oligonucleotídeos podem ter um ou dois terminais 5' acessíveis, É possível criar oligonucleotídeos modificados tendo dois terminais 5' como esses, por exemplo! anexando Ú dois oligonucleotídeos através de uma ligação 3'-3' para gerar um oligonucleotídeo tendo um oudoisterminais5' acessíveis. A ligação 3'3' pode ser um fosfodiéster, tostirotaeto ou ' qualquer outra ponte de internucleosídeo modificado. Métodos para realizar tdis ligações são conhecidos na tecnologia. Por exemplo, tais ligações foram descritas em Séliger, H. et al., Oligonucleotides analogs with terminal 3-3"- and 5'-5'-internucleotidic linkages as anti- sense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides & Nucleotides (1991), 101113), 469-77 ; 10 edJiang,etal, Pseudo-ciclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735. | : Adicionalmente, ODNs 3'3'-ligados onde a ligação entre os nucleosídeos do termi- nal 3' não é um fosfodiéster, fosforotioato ou outra ligação modificada, podem ser prepara- . dos usando um espaçador adicional, tais como fração de fosfato tri- ou tetra-etilehglico! (Du- | 15 rand/M.etal, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (aaxi2 and two O (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), . 9197-204, Patente US No. 5.658.738, e Patente US No. 5.668.265). Altemativafnente, o li- gante não nucleotídico pode ser derivado de etanodiol, propanodiol, ou de uma unidade de deoxiribose abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical Recognítion by T4 polinucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to aligonuciaofidas; Nucleic Acid Research (1994), 22(11), 2022-7) usando química fosforamíidita padrão. Os ligantes ! não nucleotídico pode ser incorporado uma vez ou múltiplas vezes, ou combinado um com o outro permitindo qualquer distância desejável entre os terminais 3' dos dois ODNs a ser li- gados. | Uma ponte de internucleosídeo fosfodiéster localizada na extremidade $' e/ou o 5' | f de um nucleosídeo pode ser substituída por uma ponte de internucleosídeo modificado, em | - que a ponte de internucleosídeo modificado é, por exemplo, selecionada de fosforotiaato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, a-fosfonato de hidroxibenzia, fosfato- (C1-C21)-O-alquil éster, fosfato-[(C6-C12)aril-([C1-C21)-O-alquilJéster, (C1- oO 30 C8)alquilfosfonato e/ou ligações (C6-C12)arilifosfonato, (C7-C12)- a-hidroximetitaril (por e- xemplo, revelado em WO 95/01363), em que (C6-C12)arila, (C6-C20)arila e (C$-C19)arila Ú são opcionalmente substituídas por halogênio, alquila, alcóxi, nitro, ciano, e onde R1 e R2 : são, independentemente um do outro, hidrogênio, (C1-C18)-alquila, (C6-C20)-arita, (C6- | C14)-arila, (C1-C8)-alquila, preferivelmente hidrogênio, (C1-C8)-alquila, preferivelihente (C1- C4)-alquil e/ou metoxietila, ou R1 e R2 formam junto com o átomo de nitrogênio que o car- rega, um anel heterocíclico de 5 a 6 membros que pode adicionalmente conter S&S heteroá- tomo adicional do grupo O, Se N.

|

Í ' .

' A substituição de uma ponte de fosfodiéster localizada no terminal 3' ke o 5' de um nucleosídeo por uma ponte de defosfo (ligações de defosfo são descritas, por exemplo, em Uhimann E. e Peyman A. em “Methods in Molecular Biology”, Vol. 20, “Prototols for Oli- ' gonucleotides an Analogs”, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, crae 16, pp.

355ff) em que uma ponte de defosfo é, por exemplo, selecionada do formacetal ligado por Ú defosfo, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetilenossul- fona e/ou grupos silila.

Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios da invenção podem opcionálmente ter espinhas dorsais quiméricas. Uma espinha dorsal quimérica é uma que compreende mais que um tipo de ligação. Em uma modalidade, a espinha dorsal quimérica pode ser represen- tada pela fórmula: 5º YIN1IZN2Y2 3'. Y1 e Y2 são moléculas de ácido nucléico tendo entre 1 e 10 nucleotídeos. Y1 e Y2 cada qual inclui pelo menos uma ligação didi modifi- cada. Uma vez que pelo menos 2 nucleotídeos dos oligonucleotídeos quiméricos incluem . modificações da espinha dorsal, esses ácidos nucléicos são um exemplo de um tipo de “áci- dos nucléicos imunoestimulatórios estabilizados”.

* Com relação aos oligonucleotídeos quiméricos, Y1 e Y2 são considerados indepen- . dentes um do outro. Isto significa que cada qual de Y1 e Y2 pode ou não ter diferentes se- quências e diferentes ligações de espinha dorsal um do outro na mesma molécula. Em al- gumas modalidades, Y1 e/ou Y2 têm entre 3 e 8 nucleotídeos. N1 e N2 são moléculas de ácido nucléico tendo entre O e 5 nucleotídeos de maneira que N1ZN2 tem pelo menos 6 nu- cleotídeos no total. Os nucleotídeos de N1ZN2 têm uma espinha dorsal de fosfodiéster e não incluem ácidos nucléicos tendo uma espinha dorsal modificada. Z é um motivo de ácido nucléico imunoestimulatória, preferivelmente selecionado desses aqui citados. | Os nucleotídeos centrais (N1ZN2) da fórmula YIN1ZN2Y2 têm ligações internu- cleotídeo de fosfodiéster e Y1 e Y2 têm pelo menos uma, mas podem ter mais que uma ou í podem mesmo ter todas as ligações internucleotídeo modificadas. Em modalidades preferi- ts das, Y1 e/ou Y2 têm pelo menos duas ou entre duas e cinco ligações internucleotídeo modi- ficadas ou Y1 tem cinco ligações internucleotídeo modificadas e Y2 tem duas ligações inter- nucleotídeo modificadas. O ligação internucleotídeo modificada, em algumas mo: jalidades, é , 30 uma ligação modificada com fosforotioato, um fosforoditioato de fosforoditioato > uma liga- ção modificada com p-etóxi. | : Os ácidos nucléicos também incluem ácidos nucléicos tendo espinha dorsal de a- gçúcares que são covalentemente anexadas a grupos orgânicos de baixo pesd molecular sem ser um grupo hidroxila na posição 2' e sem ser um grupo fosfato na posição 5". Assim, ácidos nucléicos modificados pode incluir um grupo ribose 2"-O-alquilada, Aén do mais, ácidos nucléicos modificados podem incluir açúcares tais como arabinose ou 2"- fluoroarabinsoe em vez de ribose. Assim, os ácidos nucléicos podem ser T na i 69 | ] composição da espinha dorsal por meio deste, contendo qualquer combinação possível de unidades de polímero ligadas entre si tais como peptídeo-ácidos nucléicos (que têm espinha dorsal de aminoácido com bases de ácido nucléico). Em algumas medísios Ds ácidos Ú nucléicos são homogêneos na composição da espinha dorsal.

Uma unidade de fosfato de açúcar (isto é, uma B-D-ribose e ponte de internucleost- : deo fosfodiéster formando entre si uma unidade de fosfato de açúcar) da espinha dorsal de fosfato de açúcar (isto é, uma espinha dorsal de fosfato de açúcar é composta le unidade de fosfato de açúcares) pode ser substituída por uma outra unidade, em que a ata unidade é, por exemplo, adequada para construir um oligêmero “derivado de morfolino” (da maneira descrita, por exemplo, em Stirchak E.

P. et al. (1989) Nucleic Acid res. 17:6129-41), que é, por exemplo, a substituição por um derivado de morfolino; ou para construir um| ácido nu- : cléico de poliamida (“PNA”; da maneira descrita, por exemplo, em Nielsen P.

E. et al. (1994) Bioconjug.

Chem. 5:3-7), que é, por exemplo, a substituição por uma unidade à espinha . dorsal de PNA, por exemplo, por 2-aminoetilglicina.

O oligonucleotídeo pode ter outras modi- ficações e substituições da espinha dorsal de carboidrato, tais como ácidos nucléicos de * peptídeo com grupos fosfato (PHONA), ácidos nucléicos bloqueados (LNA), e oli jonucleoti- . deos tendo seções da espinha dorsal com ligantes alquila ou ligantes amino.

O . alqui- : ' la pode ser ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído, e quiralente puro ou um mistura racêmica. | Uma unidade de B-ribose ou uma unidade de B-D-2' deoxiribose pode ser substituí- da por uma unidade de açúcar modificado, em que a unidade de açúcar modificado é, por exemplo, selecionada de B-D-ribose, a-D-2'-deoxiribose, L-2:-deoxiribose, 2-F-2"- deoxiribose, 2'-F-arabinose, 2-O0-(C1-C6)alquil-ribose, preferivelmente 2-0(01-c6) alquil- ribose é 2-O-metilribose, 2'-O-(C1-C6)alquenil-ribose, 2'-[0-(C1-C6)alquil-O-(C1.C6)alquil]- ribose, 2-NH2-2'-deoxiribose, B-D-xilo-furanose, a-arabinofuranose, 2,4-didemaál6-D-aritro- hexo-piranose, e carbocíclico (descritos, por exemplo, em Froehler J. (1992) Am.

Chem. | Ú Soc. 114:8320) e/ou análogos de açúcar de cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Van- | dendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) e/ou análogos de bicicloaçúcar [desaritos, por exemplo, em Tarkov M. et al. (1993) Helv.

Chim.

Acta. 76:481. Em algumas modalida- " 30 des,o açúcar é 2'-O-metilribose, particularmente para um ou ambos nucleotídeos ligados | por uma ligação internucleosídeo tipo fosfodiéster ou fosfodiéster. ; ' Os oligonucleotídeos da invenção pode ser sintetizados de novo, usando qualquer dos inúmeros procedimentos bem conhecidos na tecnologia.

Por exemplo, o Imétodo b- cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.

L., e Caruthers, M.

H., (1981) Tet.

Let. 22:1589); méto- do nucleosídeo H-fosfonato (Garegg et al., (1986) Tet.

Let. 27:4051-4054; Froehler et al, (1986) Nucl.

Acid Res.14:5399-5407; Garegg et al., (1986) 27:4055-4058; Gafiney et al., (1988) Tet.

Let. 29:2619-2622). Essas químicas pode ser realizadas por uma valiedade de

| 70 ' sintetizadores automatizados de ácido nucléico disponíveis no mercado.

Esses Algonueeo- tídeos são referidos como oligonucleotídeos sintéticos.

Alternativamente, dinucleotídeos ricos em T e/ou TG podem ser produzidos em uma grande escala em plasmídeos, (ver ' Sambrook T. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) e separados em peças menores ou totalmente administrados.

Áci- Ú dos nucléicos podem ser preparados a partir de sequências de ácido nucléico existentes (por exemplo, genômicas ou DNAc) usando técnicas conhecidas, tais como aquita empre- gando enzimas de restrição, exonucleases ou endonucleases. ! Espinhas dorsais modificadas tais como fosforotioatos podem ser sintótizadas u- sando técnicas automatizadas empregando tanto químicas de fosforamidato quanto de H- fosfonato.

Aril- e alquil-fosfonatos pode ser feitos, por exemplo, da maneira desciita em Pa- : tente U.S.

No. 4.469,863, e alquilfosfotriésteres (em que a fração de oxigênio chrregada é alquilada da maneira descrita em Patente U.S.

No. 5.023.243) pode ser preparados por sin- . tese de fase sólida automatizada usando reagentes comercialmente disponíveis.

Métodos para fazer outras modificações e substituições na espinha dorsal do DNA foram descritos 1 (por exemplo, Uhimann, E. e Peyman, A., Chem.

Rev. 90:544, 1990; Goodehild, ., Biocon- + jugate Chem. 1:165, 1990). | Ácidos nucléicos preparados desta maneira são referidos como ácido nucléico iso- lado.

Um “ácido nucléico isolado” geralmente refere-se a um ácido nucléico que b separado dos componentes com o qual ele é separado de uma célula, de um núcleo, de Initocôndria ou de cromatina e qualquer outro componente que possa ser considerado conto contami- nante. ' | Em uma modalidade, a composição imunogênica da presente invenção, compreen- de pelo menos um adjuvante que é um oligonucleotídeo de CpG.

Oigonucieotidãos de CpG foram descritos em inúmeras patentes concedidas, Pedidos de patentes publicados, e ou- 4 tras publicações, incluindo Patentes U.S.

Nos. 6.194.388, 6.207.646, 6.21 4.806) 6.218.371, ” 6.239.116, e 6.339.068. | Diferentes classes de oligonucleotídeo imunoestimulatórios de CpG foram identifi- cadas.

Essas são referidas como classe A, B, C e P, e são descritas com mais detalhes a " 30 seguir.

Métodos e composições da invenção adotam o uso dessas diferentes] classes de oligonucleotideo imunoestimulatório de CpG. | ' Quaisquer das classes podem ser submetidas a uma modificação E de aumenta sua potência.

Uma modificação E pode ser uma substituição de halogênio pará o nucleotí- deo do terminal 5; exemplos de tais substituições incluem, mas sem limitações, substitui- ções bromo-uridina ou iodo-uridina.

Uma modificação E pode também incluir um [substituição etil-uridina para o nucleotídeo do terminal 5'. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG "classe A" são cafacierizados |

| | | n | ' funcionalmente pela capacidade de induzir altos níveis de interferon-alfa (IFN-0) de células dendríticas plasmacitóides (pDC) e induzir ativação de célula NK embora com efeitos mini- mos na ativação da célula B.

Estruturalmente, esta classe tipicamente tem sequências poli- ' G estabilizadas nos terminais 5' e 3'. Ela também tem uma sequência contendo fiancisat- deo CpG fosfodiéster palindrômico de pelo menos 6 nucleotídeos, por exemplo, mas não necessariamente, ela contém um dos seguintes palíndromos hexâmeros: jeac6TO, AGCGCT, ou AACGTT descritos por Yamamoto e colleagues.

Yamamoto S et al.

J.

Imuno! 148:4072-6 (1992). Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG classe Ale sequên- cias exemplares desta classe foram descritos no Pedido de Patente não Provisõrio U.S.

Sé- rie No 09/672.126 e Pedido de POT Publicado POT/USOO/26527 (WO 01/22960), ambos depositados em 27 de setembro de 2000. | Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG "classe A" da invenção tem a se- guinte sequência de ácido nucléico: ' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (St Q ID NO: 440). T Alguns exemplos não limitantes de oligonucleotídeos classe A incluem: | Í SGGCGCGACGACGTCGTG G'G*"G*"G*G'G 3'; em que |* refere-se a uma ligação de fosforotioato e refere-se a uma ligação de fosfodiéster.

Í Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG “classe B”" são caracterizados funcionalmente pela capacidade de ativar células B e exceto pDC são relativamente fracas —naindução de lFN-a e ativação de célula NK.

Estruturalmente, esta classe tipicamente pode ser completamente estabilizada com ligações de fosforoticato, mas ela pode também ter uma ou mais ligações de fosfodiéster, preferivelmente entre o a e guanina do(s) motivo(s) de $ CpG, em cujo caso a molécula é referida como semimacia.

Em uma modalidade, o oligonu- cleotídeo de CpG da presente invenção é um oligonucleotídeo de CpG classe B fepresenta- dopelomenos pela fórmula: | q 5' XiXaCGX5X, 3', em que X1, X2, X3, e X4 são nucleotídeos.

Em uma tnodalidade, À X,2 é adenina, guanina, ou timina.

Em uma outra modalidade, X; é citosina, adenina, ou timi- na.

Í Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo de CpG da presente invênção é um ' 30 — oligonucleotideo de CpG classe B representado pelo menos pela fórmula: | 5' NX XICGX;X,N; 3', em que X,, X2, X3, e X, são nucleotídeos e N é duaiquer nu- ' cleotídeo e N, e N; são sequências de ácido nucléico compostas de cerca de 0-25 N's cada qual.

Em uma modalidade, XX, é um dinucleotídeo selecionado do grupo que bonsiste em GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT e TpG; e X3X, é um dinucleotí- —deo selecionado do grupo que consiste em TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC,| ApC, CpC, TpA, ApA e CpA.

Preferivelmente XX, é GpA ou GpT e X3X4 é TpT.

Em ouro modalida- des, X, ou X,; ou ambos são purinas e X; ou X, ou ambos são pirimidinas ou T é GpÃe | |

X; ou X, ou ambos são pirimidinas. Em uma modalidade preferida, XX, é um drLetectideo selecionado do grupo que consiste em TpA, ApA, ApC, ApG e GpG. Ainda em lima outra modalidade, X;X, é um dinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em TpT, TpA, TpG, ' ApA, ApG, GpA e CpA. XX, em uma outra modalidade, é um dinucleotídeo sslecianado do grupoque consiste em TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT e CpG; X; é um nucleotí- Ú deo selecionada do grupo que consiste em Um e T, e X, é um nucleotídeo, mas quando X1X>2 for TpC, GpT ou CpG, X;3X, não será TpC, ApT ou ApC. | Em uma outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo de CpG tem a sequência 5' TON; TX, X;CGX3X, 3'. Os oligonucleotídeos de CpG da invenção, em algumas módalidades, incluem X,X, selecionado do grupo que consiste em GpT, GpG, GpA e ApA e xa) 4 selecio- nado do grupo que consiste em TpT, CpT e TpC. | : As sequências de oligonucleotideo de CpG classe B da invenção, são aqueles am- plamente descritas anteriormente bem como reveladas nos Pedidos de Patentes per Publi- . cados PCT/US95/01570 e PCT/US97/19791, e em USPs 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806,

6.218.371, 6.239.116 e 6.339.068. Sequências exemplares incluem, mas sem limitações, ' aquelas reveladas nesses últimos pedidos e patentes. | Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG “classe B" da invenção tem a se- ' guinte sequência de ácido nucléico: 5º TEGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 431), ou 5º TEGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 432), ou 5' TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 433), ou 5' TEGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 441), ou 85' TEGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO: 442). Em qualquer dessas sequências, todas as ligações podem ser todas ligações de fosforotivato. Em uma outra modalidade, em quaisquer dessas sequências, uma ou mais das ligações pode ser fosfodiéster, preferivelmente entre o “C” e o “G” do motivo de CpG 2 V tornando um oligonucleotídeo de CpG semimacio. Em quaisquer dessas senlinass um eti-uridina ou um halogênio pode substituir o 5 'T; exemplos de substituições de halogênio incluem, mas sem limitações, substituições de bromo-uridina ou iodo-uridina. , 30 Alguns exemplos não limitantes de oligonucleotídeos classe B incluem: 5 T'CGT*CGCTTTTTC*C*G*T"E*CT*TT*T 3, ou ' 5 T*C*G*T*C*GTT"T"T*T"C*G*G*T"C*GTTT*T 3', ou 5 TCS TCS TTTT"GS*T"C GS TT"T"T"GAT*C*G* TT 3', ou 5 'T"C*G*T*C*G*T*T"T"C*GT*"C*EST"T"TtT*G*T*C*G*T*T 3, ou 5 T*C*GT'CGTTTTG TOS TT"T"T"T"T*T*CO*G*A 3º. em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato. A"C classe" de oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG é T fun-

| : | 73 | ' cionalmente pela capacidade de ativar células B e células NK e induzir IFN-a.

Lsiruturar mente, esta classe tipicamente inclui uma região com um ou mais motivos de cp6 imunoes- timulatório tipo classe B, e uma região palíndromo ou quase palíndromo rica em GC que : permite que as moléculas formem estruturas tipo secundárias (por exemplo, semicircular) ou terciárias (por exemplo, dímero). Alguns desses oligonucleotídeos têm tanto uma Fequência CpG "estimulatória" tradicional quanto um motivo "rico em GC" ou "neutralizante de célula B". Esses oligonucleotídeos motivos de combinação têm efeitos estimulantes inhunes que caem em alguma parte entre os efeitos associados com oligonucleotídeos de . classe B tradicionais (isto é, forte indução de ativação da célula B e ativação de .—— (DO)),e os efeitos associados com ODN de CpG classe A (isto é, forte indução de IFN-a e ativação de célula NK mas indução relativamente fraca de célula B e ativação de DC). Krieg . AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Imunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Imunol 148:4072-6. . A classe C dos oligonucleotídeos estimulatórios imunes de motivo de combinação : 15 pode ter espinhas dorsais tanto completamente estabíilizadas, (por exemplo, todas fosforoti- i oato), quiméricas (região central fosfodiéster), quanto semimacias (por exemplo, fosfodiéster no motivo de CpG). Esta classe foi descrita em pedido de patente US U.S. 10/224.523 de- ' positado em 19 de agosto de 2002. | Um domínio ou motivo estimulatório do oligonucleotídeo de CpG classe & é definido —pelafórmula:5'X,DCGHX,3'.D é um nucleotídeo sem ser C.

C é citosina.

G é guanina.

Hé um nucleotídeo sem ser G.

X, e X, são qualquer sequência de ácido nucléico O dio nucleo- tídeos de comprimento.

X, pode incluir um CG, em cujo caso existe preferivel pente um T imediatamente precedendo este CG.

Em algumas modalidades, DCG é TCG.

X, é preferi- velmente de O a 6 nucleotídeos de comprimento.

Em algumas modalidades, X, hão contém — quaisquer motivos poli G ou poli A.

Em outras modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimu- A latório tem uma sequência poli-T no terminal 5º ou no terminal 3'. Da maneira qui usada, - “poli- A" ou "poli-T" deve referir-se a um alongamento de quatro ou mais A's ou Ts respecti- | vamente consecutivos, por exemplo, 5' ARAA 3' ou 5 'TTTT 3'. Da maneira aqui Lsada, "ter- minal poli-G" deve referir-se a um alongamento de quatro ou mais G's consecutivos, por SS 30 exemplo, 5' GGGG 3', que ocorrem no terminal 5 ou o terminal 3' de um ácido quatétoo.

Da | maneira aqui usada, "oligonucieotídeo poli-G" deve referir-se a um oligonucleotídeo tendo a o fórmula 5' X;X-GGGX;X, 3' em que X;1, X2, Xs, e X, são nucleotídeos e preferivelmente pelo menos um de X; e X, é um G.

Alguns projetos preferidos para o domínio estimulatório da célula B desta fórmula compreende TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTITTCG, TCGT, TTCGT,TTTCGT, TCGTCGT. | | O segundo motivo do oligonucleotídeo de CpG classe C é referido tanto como P | quanto N e é posicionado imediatamente 5' de X, ou imediatamente 3' de X,. |

' | MM Na 74 o | | N é uma sequência neutralizante da célula B que começa com um trinucleotídeo | CGG e é pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento.

Um motivo neutralizante de célula B | inclui pelo menos uma sequência CpG em que o CG é precedido por um C ou seguido por | Ú um G (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sd USA 95:12631-12636) ou é uma sequência | de DNA contendo CG em que o C do CG é metilado.

Motivos ou sequências natitralizantes : têm algum grau de capacidade imunoestimulatória quando presente em um motil (o de outra forma não estimulatório, mas, quando presentes no contexto de outros motivos! imunoesti- mulatórios, servem para reduzir o potencial imunoestimulatório dos outros motivos.

P é uma sequência contendo palíndromo rico em GC pelo menos 10 nucleotídeos ! 10 de comprimento. | | Da maneira aqui usada, "palíndromo" e equivalentemente "sequência palindrômica" Í . devem referir-se a uma repetição invertida, isto é, uma sequência tais como ABCDE- E'D'CB'A' em que A e A', Be B', etc., são bases capazes de formar os pares dé base Wat- : son-Crick usuais. | Da maneira aqui usada, "palíndromo rico em GC" deve referir-se a um Ipalindromo ' tendo uma composição de base de pelo menos dois terços de G's e Cs.

Em agdras moda- lidades o domínio rico em GC é preferivelmente 3' do "domínio estimulatório da célula B". No S caso de um palíndromo rico em GC de 10 bases de comprimento, o palindramo) assim con- tém pelo menos 8 G's e Cs.

No caso de um palíndromo rico em GC de 12 bases de compri- mento, o palindromo também contém pelo menos 8 G's e Cs.

No caso de um patíndromo rico em GC 14-mer, pelo menos dez bases do palindromo são G's e Cs.

Em algumas moda- lidades, o palíndromo rico em GC é feito exclusivamente de G's e Cs.

Em algumas modalidades, o palíndromo rico em GC tem uma composição de base de pelo menos 81 % de G's e Cs.

No caso de um de palíndromo rico em GC 10 bases de comprimento como esse, o palíndromo assim é feito exclusivamente de G's e os No caso õ de um palíindromo rico em GC de 12 bases de comprimento como esse, prefere-se que pelo . ; menos dez bases (83 %) do palíndromo sejam G's e Cs, Em algumas modatidádes preferi- das, um palíindromo rico em GC de 12 bases de comprimento é feito exclusivamente de G's e Cs.

No caso de um palíndromo rico em GC 14-mer, pelo menos doze bases (6 %) do pa- . 30 líndromo são G's e Cs.

Em algumas modalidades preferidas, um palíndromo rico em GC de 14 bases de comprimento é feito exclusivamente de G's e Cs.

O Cs de um palíndromo rico Ú em GC pode ser não metilado ou ele pode ser metilado. | Em geral, este domínio tem pelo menos 3 Cs e Gs, mais preferivelmente 4 de cada qual, e acima de tudo preferivelmente 5 ou mais de cada qual.

O número de Cs e Gs neste — domínio não precisa ser idêntico.

Prefere-se que o Cs e Gs sejam arranjados de forma que eles sejam capazes de formar um duplex autocomplementar, ou paltíndromo, tal como CCGCGCGG.

Isto pode ser interrompido por As ou Ts, mas prefere-se que a fue

: 75 | ' mentariedade seja pelo menos parcialmente preservada, por exemplo, como nos motivos CGACGTTCGTCG ou CGGCGCCGTGCCG. Quando a complementariedade não é preser- vada, prefere-se que os pares de base não complementares sejam TG. Em uma podatidade : preferida, existem não mais que 3 bases consecutivas que não são parte do palíindromo, preferiveimente não mais que 2, e acima de tudo preferivelmente somente 1. Em algumas ' modalidades, o palíndromo rico em GC inclui pelo menos um trímero CGG, es um trímero CCG, ou pelo menos um terâmero CGCG. Em outras modalidades, o palíndromo rico em GC não é CCCCCCGGGGGG ou GGGGGGCCOECCC, CECCCoGesecs ou GGGGGCCCCC. Pelo menos um de G's da região rica em GC pode ser substituído com uma inosina ' (1). Em algumas modalidades, P inclui mais que um |. | . Em certas modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimulatório tem uma das se- guintes fórmulas 5' NXK/DCGHX, 3', 5º X;DCGHX,N 3', 5' PK;DCGHX, 3', 5º X.DÉGHXZP 3, 4 5' X;DCGHX,PX; 3', 5' X;/DCGHPX; 3', 5' DCGHX,PX; 3', 5 TOGHX,PX3 3', 5º DCGHPX, 3 ouSDCGHP3. ; ' A invenção fornece outro oligonucleotídeos estimulatórios imunes definidos por uma Ú fórmula 5' N,PyGN,7P 3'. N, é qualquer sequência 1 a 6 nucleotídeos de comprimento, Py é ' uma pirimidina. G é guanina. N, é qualquer sequência O a 30 nucleotídeos de comprimento.

P é uma sequência contendo palíndromo rico em GC pelo menos 10 nucleotíde. s de com- primento, | N,; e N; podem conter mais que 50 % de pirimidinas, e mais preferivelmente mais que 50 % de T. N, pode incluir um CG, em cujo caso existe preferivelmente um T imediata- mente precedendo este CG, Em algumas modalidades, N1PyG é TCG, e acima do tudo pre- ferivelmente um TCGN,, onde N, não é G. N;PyGN2P pode incluir um ou mais nucleotídeos inosina (1). Tanto o O quanto o G À em N,; pode ser substituído por inosina, mas o Cpl é preferido para o IpG. Para spstituições BR de inosina tal como IpG, a atividade ideal pode ser obtida com o uso de uma espinha dorsal "semimacia" ou quimérica, onde a ligação entre o IG ou o CI é fosfodiester. N1 bode incluir pelo menos um motivo Cl, TCI, IG ou TIG. d Í 30 Em certas modalidades N,PyGN, é uma sequência selecionada do grupo que con- siste em TTITTTCG, TCG, TTOG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTOGT, TITCGT, e TteGetcGr. ' Em uma modalidade, os oligonucleotídeos de CpG "classe C" da inverição têm a seguinte sequência de ácido nucléico: 5 TCGCGTCEGTTCGGCGCGCOGCCGE 3' (SEQ ID NO: 443), ou 5 TCEGTCGACGETTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 444), ou 5 'TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 445), ou 5 'TCOGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 446), ou |

' 76 Ú 5 TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 447), ou TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 448), ou 5 'TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 449), ou ] 5 "TCGCGTCGETTCGGCGCCOG 3' (SEQ ID NO: 450), ou 5 5 TOGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 451), ou : 5 'TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 452), ou 5 'TCEGTCGTTTTCEGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO: 453), ou 5 "'TOGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCOG 3' (SEQ ID NO: 454), ou 5 TCGTOGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID NO: 455). i Em quaisquer dessas sequências, todas as ligações podem ser ligações todas de fosforotioato,. Em uma outra modalidade, em quaisquer dessas sequências, um ou mais - das ligações podem ser fosfodiéster, preferivelmente entre o “C” e o “G” do motivo de CpG produzindo um oligonucleotídeo de CpG semimacio. a Alguns exemplos não limitantes de oligonucleotídeos classe C incluem: 5'T'C G*C G*T'C G*T*T'C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3', ou S 5 TC G*T'C G*A'C G*TT“C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3', ou 5 'T'C G"G*A*C G*T'T“C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3', ou Í 5'T'C G"G'A'C G*T'T*C G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', ou 5 TC GC G*T'C GT'T'C G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', ou 5'T'C G*A"C G*T*T“C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3', ou 5'T'C G*A*C GT*T'C G*G*C*G*C*G*C*C*G 3', ou 5'T“C G*C GT'C G*TT'C G*G*C*G*C*C*G 3', ou 5'T'C GC GATE GT TC G*G*C*G"C G*C*G*C*C*G 3', ou 5 TCS TCE TTT'T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3', ou Í 5 T"C*GT*C*G“T*T*TT"C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3', ou | M 5 T"C*GT'C GTTT'T"UM"C G*G*C*G*C*C G*T*G*C*C*G 3', ou | . 5 TC GT'CGCTTTT'C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*“G*T3I | em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato e refere-se a uma ligação de fosfodiéster. | ' 30 Em quaisquer dessas sequências, um etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5 'T, exemplos de substituições de halogênio incluem, mas sem limitações, substituições de bromo-uridina ou iodo-uridina. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG “classe P" foram descritos em WOZ2007/095316 e são caracterizados pelo fato de que eles contêm regiões de formação — duplextaiscomo, por exemplo, palíndromos perfeitos ou imperfeitos ou ambos quase nos terminais 5' e 3', dando a eles o potencial para formar estruturas ordenadas maiores tais como concatâmeros. Esses oligonucleotídeos referidos como oligonucleotídeos classe P

Í

' T7 ] têm a capacidade em alguns exemplos, de induzir níveis mais altos de secreção de IFN-a do que a classe C.

O oligonucleotídeos classe P têm a capacidade de automontar Espontane- amente nos concatâmeros tanto in vitro e/quanto in vivo.

Sem se ligar por nenhuma teoria ' particular para o método de ação dessas moléculas, uma hipótese potencial é que esta pro- priedade dota os oligonucleotídeos da classe P com a capacidade de reticular mais altamen- te TLR9 dentro de certas células imunes, induzindo um padrão distinto de ativação imune comparado com as classes de oligonucleotideos de CpG previamente descritos.

Em uma modalidade, o oligonucleotideo de CpG da presente invenção é um oligo- nucleotídeo de CpG classe P contendo um domínio de ativação TLR 5' e pelo manos duas regiões palindrômicas, uma região palindrômica sendo uma região palindrômica 5' de pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento e conectada a uma região palindrômica 3' de pelo . menos 8 nucleotídeos de comprimento tanto diretamente quanto através de um espaçador, | em que o oligonucleotídeo inclui pelo menos um dinucleotíideo YpR.

Em uma modalidade, o a dito oligonucleotídeo não é T'C G*T'C G*A*C G*T'T'C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G.

Em | 15 uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG classe P inclui pelo menos um dirlucleotídeo : CpG. não metilado Em uma outra modalidade o domínio de ativação TLR é TG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, ou TTTT.

Ainda em uma ou- ' tra modalidade, o domínio de ativação TLR é na região palindrômica 5º.

Em uma outra mo- dalidade, o domínio de ativação TLR é imediatamente 5' da região palindrômica 5", Ainda em uma outramodalidade, a região palindrômica 5' é pelo menos 8 nucleotídeos de cbmprimen- to.

Em uma outra modalidade, a região palindrômica 3'é pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento.

Em uma outra modalidade, a região palindrômica 5' é pelo menos ho nucleo- tídeos de comprimento.

Ainda em uma outra modalidade, a região palindrômica 3' inclui um dinucleotideo CpG não metilado.

Em uma outra modalidade, a região palindrômica 3' inclui dois dinucleotídeo CpG não metilados.

Em uma outra modalidade, a região palindrômica 5º À inclui um dinucleotídeo CpG não metilado.

Ainda em uma outra modalidade, a região palin- . drômica 5' inclui dois dinucleotideo CpG não metilados.

Em uma outra modalidade, as regi- ões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 28. Em uma outra modalidade, as regiões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de , 30 pelomenos 30.Em uma outra modalidade, as regiões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 35. Em uma outra modalidade, as regiões palindrômicas ] 5' e 3 têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 40. Em uma outra modálidade, as regiões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 45. Em uma outra modalidade, as regiões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex — de pelomenos50.Em uma outra modalidade, as regiões palindrômicas 5' e 3' e um valor de estabilidade duplex de pelo menos 55. Em uma outra modalidade, as regiões palindrômi- cas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 60. Em uma outra modalida- | 1 '

| 1 . 78 j ] de, as regiões palindrômicas 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo les 65. Em uma modalidade, as duas regiões palindrômicas são conectadas dletamente. Em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas são conectadas por méio de uma ' ligação 3 '-3'. Em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas sobrepostas por um nucleotídeo. Ainda em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas sbbrepostas : por dois nucleotídeos. Em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas não sobre- postas. Em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas são conectadas por um espaçador. Em uma modalidade, o espaçador é um ácido nucléico tendo um comprimento de 1-50 nucleotídeos. Em uma outra modalidade, o espaçador é um ácido nucléico tendo um comprimento de 1 nucleotídeo. Em uma outra modalidade, o espaçador é um jespaçador não nucleotídeo. Em uma modalidade, o espaçador não nucleotídeo é um espaçador D. Em . uma outra modalidade, o espaçador não nucleotídeo é um ligante. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo tem a fórmula 5' XP,SP,T 3', em que X é o domínio de ativação TLR, P, é “ um palíndromo, S é um espaçador, P; é um palíndromo, e T é uma cauda 3' de 0-100 nu- —cleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, X é TCG, TTCG, ou TTTCG. Eh uma ou- 7 tra modalidade, T é 5-50 nucleotídeos de comprimento. Ainda em uma outra modalidade, T é 5-10 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade, S é um ácido na tendo um ' comprimento de 1-50 nucleotídeos. Em uma outra modalidade, S é um ácido nucléico tendo um comprimento de 1 nucleotídeo. Em uma outra modalidade, S é um espaçader não nu- cleotideo. Em uma modalidade, o espaçador não nucleotídeo é um espaçador D. Em uma outra modalidade, o espaçador não nucleotídeo é um ligante. Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo não é um oligonucleotídeo antissentido ou um ribozima. Em uma modalida- de, P; é rico em A e T. Em uma outra modalidade, P, inclui pelo menos 4 Ts. Em uma outra modalidade, P; é um palíndromo perfeito. Em uma outra modalidade, P2 é rico em G-C. A- indaem uma outra modalidade, P; é CGGCGCX,GCGCCG, onde X, é T ou nada. A Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação de fosforoti- oato. Em uma outra modalidade, todas as ligações internucleotídeo do oligonuciantidso são ligações de fosforotioato. Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo inclui eo menos uma ligação tipo fosfodiéster. Em uma outra modalidade, a ligação tipo fosfodiéster é uma ' 30 ligação de fosfodiéster. Em uma outra modalidade, um grupo lipofílico é conjugado com o oligonucleotídeo. Em uma modalidade, o grupo lipofílico é colesterol.

' Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG para uso na presente invenção é um oligonucleotídeo de CpG classe P com um domínio de ativação TLR 5' e plelo menos duas regiões contendo complementariedade, uma região contendo complementaridade se.

3', cada região contendo complementariedade sendo pelo menos 8 nucleotídeds de com- primento e conectada uma na outra tanto diretamente quanto através de um espáçador, em que o oligonucleotídeo inclui pelo menos um dinucleotídeo pirimidina-purina (YpR), e em que pelo menos uma das regiões contendo complementariedade não é um palíniromo per- feito.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos um dinucieotidep CpG não metilado.

Em uma outra modalidade, o domínio de ativação TLR é TCG, TTCG, TTTCG, TYPR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUVUCG, TTT, ou TTTT.

Em uma outra modalidade, odomíniode ativação TLR na região contendo complementariedade 5º.

Em uma outra mo- dalidade, o domínio de ativação TLR é imediatamente 5' para a região contendo comple- mentariedade 5'. Em uma outra modalidade, a região contendo complementariedade 3' é pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento.

Ainda em uma outra modalidade, a região contendo complementariedade 5' é pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento.

Em uma modalidade, a região contendo complementariedade 3' inclui um dinucleotídeo/ CpG não metilado.

Em uma outra modalidade, a região contendo complementariedade 3 linclui dois dinucleotideo CpG não metilados.

Ainda em uma outra modalidade, a região contendo com- plementariedade 5' inclui um dinucleotídeo CpG não metilado.

Em uma outra modafidade, a região contendo complementariedade 5' inclui dois dinucleotídeo CpG não metilados.

Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade incluem pelo menos um análogo de nucleotídeo.

Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementarie- dade formam um duplex intramolecular.

Em uma modalidade, o duplex intramolgular inclui pelo menos um par base não Watson Crick.

Em uma outra modalidade, o par. base não Watson Crick é G-T, G-A, G-G, ou C-A.

Em uma modalidade, as regiões contendo comple- mentariedade formam duplexes intermoleculares.

Em uma outra modalidade, pelo menos um dos duplexes intermoleculares inclui pelo menos um par base não Watson lerick.

Em uma outra modalidade, o par base não Watson Crick é G-T, G-A,, G-G, ou C-A.

Ainda em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade contêm um pareamento imperfeito.

Ainda em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade con- têm dois pareamentos imperfeitos.

Em uma outra modalidade, as regiões conténdo com- plementariedade contêm um nucleotídeo de intervenção.

Em uma outra modatidáde, as re-

giões contendo complementariedade contêm dois nucleotídeos de intervenção. | Em uma modalidade, as regiões contendo complementariedade 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 25, Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade 5' e 3' têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 20. Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade 5' e 3' têm um valor de estabi- lidade duplex de pelo menos 35. Em uma outra modalidade, as regiões contendo comple- mentariedade têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 40. Em uma outra moda- lidade, as regiões contendo complementariedade têm um valor de estabilidade Luplex de pelomenos 45.Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariédade têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 50. Em uma outra modalidade, às regiões contendo complementariedade têm um valor de estabilidade duplex de pelo menhs 55. Em uma outra modalidade, as regiões contendo complementariedade têm um valor de estabili- dade duplex de pelo menos 60. Em uma outra modalidade, as regiões contendo comple- mentariedade têm um valor de estabilidade duplex de pelo menos 65. | Em uma outra modalidade, as duas regiões contendo conplementateado são co- nectadas diretamente.

Em uma outra modalidade, as duas regiões palindrômicas são conec- tadas por meio de uma ligação 3 '-3', Ainda em uma outra modalidade, as duas rebiões con- tendo complementariedade sobrepõem por um nucleotídeo.

Em uma outra modalidade, as | duas regiões contendo complementariedade sobrepõem por dois meseidens, Em uma outra modalidade, as duas regiões contendo complementariedade do não sobrepõem.

Em uma outra modalidade, as duas regiões contendo complementariedade são consttadas por um espaçador.

Em uma outra modalidade, o espaçador é um ácido nucléico tendo um com- primento de 1 -50 nucleotídeos.

Em uma outra modalidade, o espaçador é um ácido nucléi- co tendo um comprimento de 1 nucleotídeo.

Em uma modalidade, o espaçador É um espa- çador não nucleotídeo.

Em uma outra modalidade, o espaçador não nucleotídeo é um espa- —çadorD.

Ainda em uma outra modalidade, o não nucleotídeo espaçador é um ligante.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo classe P tem a fórmula 5' XNSPT 3, em que X é o domínio de ativação TLR, N é um palindromo não perfeito, P é um palíhdromo, Ss é um espaçador, e T é uma cauda 3' de 0-100 nucleotídeos de comprimento.

Em lima outra modalidade, X é TCG, TTCG, ou TTTCG.

Em uma outra modalidade, T é 5-50 n | leotídeos de comprimento.

Em uma outra modalidade, T é 5-10 nucleotídeos de comprichanto, Em uma outra modalidade, S é um ácido nucléico tendo um comprimento de 1-50 rupectídeos | Em uma outra modalidade, S é um ácido nucléico tendo um comprimento de 1 nucleotídeo. | Em uma outra modalidade, S é um espaçador não nucleotídeo.

Em uma outra modalidade, o | espaçador não nucleotídeo é um espaçador D.

Em uma outra modalidade, o esp: leador não Í —nucleotídeoé um ligante.

Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo não é iu oligonu- cleotídeo antissentido ou um ribozima.

Em uma outra modalidade, N é rico em N eT.

Em | t uma outra modalidade, N é incluído pelo menos 4 Ts.

Em uma outra modaidado, Pé um palíndromo perfeito.

Em uma outra modalidade, P é rico em G-C, Em uma outra modalidade, P é CGGCGCX,GCGCCG, em que X, é T ou nada.

Em uma outra modalidade, o oligonu- ! cleotídeo inclui pelo menos uma ligação de fosforoticato.

Em uma outra modalidade, todas ! as ligações internucleotídeo do oligonucleotideo são ligações de fosforotioato.

Em luma outra | modalidade, o oligonucleotídeo incluí pelo menos uma ligação tipo fosfodiáster Em uma outra modalidade, a ligação tipo fosfodiéster é uma ligação de fosfodiéster.

Em uma outra | modalidade, um grupo lipofílico é conjugado com o oligonucleotíideo.

Em uma modalidade, o —grupolipofílicoé colesterol.

Em uma modalidade, os oligonucleotídeos de CpG "classe P" da invenção têm a | seguinte sequência de ácido nucléico: 5 TOGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3 (SEQ ID ' | 1

| | 81 NO: 456). | Nas ditas sequências, todas as ligações podem ser ligações todas de fosforotioato.

Em uma outra modalidade, uma ou mais das ligações pode ser fosfodiéster, preferivelmente ' entre o “C” e o “G” do motivo de CpG produzindo um oligonucleotídeo de CpG Lamimacio.

Em quaisquer dessas sequências, um etil-uridina ou um halogênio pode substituir o5'T, ' exemplos de substituições de halogênio incluem, mas sem limitações, substituições de bro- | mo-uridina ou iodo-uridina. | Um exemplo não limitante de oligonucleotídeos classe P metem: 5 l 'T'*C G*T'C G*A*C G*A*T*C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G 3' | | 10 em que * refere-se a uma ligação de fosforoticoato e refere-se a uma ligação de fosfodiéster. . Em uma modalidade, toda a ligação internucleotídeo dos oligonucleotídeos de CpG | reveladas aqui são ligações de fosfodiéster (oligonucleotídeos “macios”, da maneira descrita . no Pedido de POT WOZ2007/026190). Em uma outra modalidade, oligonucleotíddos de CpG 15 . da invenção, tornam-se resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizados). Um “oli- > gonucleotídeo estabilizado" refere-se a um oligonucleotídeo que é relativamente lesistente à ' degradação in vivo (por exemplo, por meio de um exo- ou endo-nuclease). Estabilização de : ácido nucléico pode ser realizada por meio de modificações da espinha dorsal. digonucleo- tídeos tendo ligações de fosforoticato fornecem atividade máxima e protegem à digonucleo: tídeodadegradação por exo- e endo-nucleases intracelulares. | Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem ter uma espinha dorsal quimérica, que têm combinações de fosfodiéster e ligações de fosforotioato.

Com propósitos da presen- te invenção, uma espinha dorsal quimérica refere-se a uma espinha dorsal parcialmente estabilizada, em que pelo menos uma ligação internucleotídeo é tipo fosfodiéstet ou fosfodi- . 25 éster, eem que pelo menos uma outra ligação internucleotídeo é uma ligação irtemuclsatr- deo estabilizada, em que pelo menos uma ligação tipo fosfodiéster ou fosfodiêster e pelo : menos uma ligação estabilizada são diferentes.

Quando a ligação de fosfodiéster é prefe- rencialmente localizada no motivo de CpG tais moléculas são denominadas “semimacias” da maneira descrita no Pedido de PCT WO2007/026190. | ' 30 Outros oligonucleotídeos modificados incluem combinações de ligações fosfodiés- ter, fosforoticato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditicato, e/ou p-etóxi. | ' Uma vez que ligações boranofosfonato reportaram ser estabilizadas com relação às ligações de fosfodiéster, com propósitos da natureza quimérica da espinha dorsal, ligações boranofosfonato podem ser classificadas tanto como tipo fosfodiéster quanto cdmo estabili- zadas, dependendo do contexto.

Por exemplo, uma espinha dorsal quimérica, de acordo com a presente invenção, em algumas modalidades, pode incluir pelo menos uma ligação fosfodiéster (tipo fosfodiéster ou fosfodiéster) e pelo menos uma ligação bondrofostnais

(estabilizada). Em outras modalidades, uma espinha dorsal quimérica de acordo com a pre- sente invenção, pode incluir ligações boranofosfonato (tipo fosfodiéster ou fosfodiêster) e fosforotioato (estabilizadas). Uma "ligação internucleotídeo estabilizada" deve significar uma ligação internucleotideo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por — . 5 —pormeiode um exo- ou endo-nuclease), comparado com uma ligação internucleo| ídeo fos- fodiéster. Ligações internucleotídeo estabilizadas preferidas incluem, sem limitações, fosfo- rotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, e metilfosforoticato. Outras ligações internuúcleotídeo estabilizadas incluem, sem limitações, peptídeo, alquila, defosfo, e outras da maneira descri- ta anteriormente. ; Espinhas dorsais modificadas tais como fosforoticatos podem ser sintelizadas u- sando técnicas automatizadas empregando tanto químicas fosforamidato quanto H- . fosfonato. Aril- e alquil-fosfonatos podem ser feitos, por exemplo, da maneira descrita na Patente U.S. No. 4.469,863; e alquilfosfotriésteres (em que a fração de oxigênio cárregada é & alquilada da maneira descrita na Patente U.S. No. 5.023.243 e Patente Européia No.

092.574) podem ser preparados por síntese automatizada de fase sólida usando [eagentes õ comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e substituições na es- . pinha dorsal do DNA foram descritos. Uhimann E et al. (1990) Chem Rev 9n:s4s coctcma J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Métodos para preparar oligonucleotídeos quiméricos são também conhecidos. Por exemplo, patentes concedidas para Uhimann et al descreve- ramtaistécnicas. | ODN modificado espinha dorsal misturada pode ser sintetizado da maneira descrita no Pedido de PCT WO2007/026190. Í Os oligonucleotídeos da invenção podem também incluir outras modificações. Es- ses incluem análogos de DNA não iônicos, tais como alquil- e aril-fosfatos (em que o oxigê- . 25 —niodefosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiêster e alquil- fosfotriésteres, em que a fração de oxigênio carregada é alquilada. Ácidos nudléicos que - contêm diol, tal como tetraetilenoglico! ou hexaetilenoglicol, em qualquer um dos terminais ou ambos mostram também ser substancialmente resistentes à degradação de nuúclease. O tamanho do oligonucleotídeo de CpG (isto é, o número de resíduos de nucleotí- Ú 30 —deoaolongodo comprimento do oligonucleotídeo) também pode contribuir paraja atividade . estimulatória do oligonucleotídeo. Para facilitar a captação nas células, lgeneosico de CpG da invenção preferivelmente têm um comprimento mínimo de 6 resíduos de nucleotí- deo. Oligonucleotídeos de qualquer tamanho maior que 6 nucleotídeos (mesmo muitos kb de comprimento) são capazes de induzir uma resposta imune se motivos imundestimulató- rios suficiente estiverem presentes, em virtude de oligonucleotídeos grandes seem degra- dados dentro das células. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos de CpG são 6 a 100 nucleotideos de comprimento, preferencialmente 8 a 30 nucleotídeos de Ns Em 1

: 83 Ú modalidades importantes, ácidos nucléicos e oligonucleotídeos da invenção, não são plas- mídeos ou vetores de expressão. i Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG revelado aqui compreebde substi- ] tuições ou modificações, tal como nas bases e/ou açúcares da maneira descrita ro parágra- fo134a147deWO2007/026190.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de CpG da presente invenção é quimica- mente modificado. Exemplos de modificações químicas são conhecidos pelos vei j ado e são descritos, por exemplo, em Uhimann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Human Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.

36:107-129; e Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Um oligonucleotí- deo de acordo com a invenção, pode ter uma ou mais modificações, em que a modifica- - ção é localizada em uma ponte de internucleosídeo fosfodiéster particular e/ou e: | uma uni- dade de B-D-ribose particular e/ou em uma posição de base de nucleosídeo natural particu- . lar em comparação com um oligonucleotídeo da mesma sequência que é pa de DNA ouRNA natural. | % Em algumas modalidades da invenção, ácidos nucléicos contendo cpG podem ser simplesmente misturados com carreadores imunogênicos de acordo com métodos conheci- NM dos pelos versados na tecnologia (ver, por exemplo, WO03/024480). | Em uma modalidade particular da presente invenção, qualquer da vacina revelada —aquicompreende de 2 ug a 100 mg de oligonucleotídeo de CpG, preferivelmente de 0,1 mg a 50 mg de oligonucleotídeo de CpG, preferivelmente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleoti- deo de CpG, preferivelmente de 0,3 mg à 5 mg de oligonucleotídeo de CpG, preferivelmente de 0,3 mg à 5 mg de oligonucleotídeo de CpG, ainda preferivelmente de 0,5 a 2 mg de oli- gonucleotídeo de CpG, ainda preferivelmente de 0,75 a 1,5 mg de oligonucleotídeo de CpG.

. 25 Emuma modalidade, preferida, qualquer vacina revelada aqui compreende aproximadamen- te 1 mg de oligonucleotídeo de CpG.

. Em algumas modalidades da invenção, ácidos nucléicos contendo co podem ser simplesmente misturados com carreadores imunogênicos de acordo com métodos conheci- dos pelos versados na tecnologia (ver por exemplo, WOO03/024480). Em outras niodalidades ' 30 da invenção, ácidos nucléicos contendo CpG podem ser encerrados nas VLPs| (ver por e- xemplo, WO03/024481).

Adjuvantes preferidos no contexto da presente invenção incluem alume; oligonucle- | otídeos contendo CpG, preferivelmente CpG 7909 (SEQ ID NO: 433) e pGareãs (SEQ ID | NO: 431); e adjuvantes a base de saponina, preferivelmente Iscomatrix, que pode ser usado sozinho ou em combinação. Preferivelmente, o dito ácido nucléico contendo che compre- ende uma ou mais ligações modificadas, preferivelmente uma ou mais ligações ” fosforoti- oato, ainda mais preferivelmente todas as ligações internucleotídeo do oligonucleotideo são | ligações de fosforotioato.

A invenção, portanto, diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo IgE antigênico, preferivelmente compreendendo uma sequência e emnoas dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos; 1 a 430, mais preferivel ente uma sequênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos 1al53e 220 a 430, ainda mais preferivelmente uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 a 430 e pelo menos um adjuvante.

O dito peptídeo IgE | antigênico é preferivelmente ligado a um carreador imunogênico da maneira aqui revelada, preferivelmente uma VLP, mais preferivelmente um VLP HBsAg, HBcAg ou Qbeta.

Em uma modalidade, o dito adjuvante é um adjuvante a base de saponina, prsfariveimente Iscoma- | trix.

Em uma outra modalidade, o dito adjuvante é Alume.

Ainda em uma outra modalidade, | o dito adjuvante é um ácido nucléico contendo CpG.

Preferivelmente o dito adjuvante é CpG7909. Mais preferivelmente o dito adjuvante é CpG24555. Preferivelmente, ê dito ácido nucléico contendo CpG compreende uma ou mais ligações modificadas, preferivelmente uma ou mais ligações de fosforoticato, ainda mais preferivelmente todas as ligações inter- nucleotídeo do oligonucleotídeo são ligações de fosforotioato.

Ainda em uma outra modalidade, o dito pelo menos um adjuvante compleende dois adjuvantes, preferivelmente selecionados do grupo que consiste em alume, aqiusantos a base de saponina, e ácidos nucléicos contendo CpG.

Em uma modalidade preferida, os di- tos adjuvantes são alume e um ácido nucléico contendo CpG, preferivelmente CpG790s ou , CpG24555, mais preferivelmente CpG24555. Preferivelmente, o dito ácido nucléico conten- do CpG compreende uma ou mais ligações modificadas, preferivelmente uma ob mais liga- ções de fosforotioato, ainda mais preferivelmente todas as ligações internucleotídeo do oli- gonucleotídeo são ligações de fosforoticato.

Em uma outra modalidade preferida, os ditos . 25 adjuvantes são um adjuvante a base de saponina, preferivelmente Iscomatrix, e um ácido nucléico contendo CpG, preferivelmente CpG7909, mais preferivelmente CpG24555. Prefe- .- rivelmente, o dito ácido nucléico contendo CpG compreende uma ou mais ligações modifi- cadas, preferivelmente uma ou mais ligações de fosforoticato, ainda mais preteriveimente todas as ligações internucleotídeo do oligonucleotídeo são ligações de fosfor tioato.

Em uma outra modalidade preferida, os ditos adjuvantes são alume e um aelvento a base de saponina, preferivelmente Iscomatrix. | Ainda em uma outra modalidade, o dito pelo menos um adjuvante com preende três adjuvantes, preferivelmente selecionados do grupo que consiste em alume, um adjuvante a base de saponina, preferivelmente Iscomatrix, e ácidos nucléicos contendo xe) mais prefe- | 35 rivelmente CpG7909, ainda mais preferivelmente CpG24555. Preferivelmente, | dito ácido nucléico contendo CpG compreende uma ou mais ligações modificadas, preferivelmente | uma ou mais ligações de fosforotioato, ainda mais preferivelmente todas as cui inter- . ;

: | Ú nucleotídeo do oligonucleotídeo são ligações de fosforotioato. | Composições farmacêuticas da invenção | A invenção também diz respeito a composições farmacêuticas compreendendo um ' peptídeo IgE antigênico da invenção ou uma composição imunogênica deste em uma for- mulaçãoem associação com um ou mais excipiente(s) farmaceuticamente aceitáveis) e ' opcionalmente combinada com um ou mais adjuvantes (como adjuvante descritos anterior- mente). O termo 'excipiente' é usado aqui para descrever qualquer ingrediente sem ser o | ingrediente ativo, isto é, o peptídeo IgE antigênico da invenção eventuaimente acoplado a | um carreador imunogênico e opcionalmente combinado com um ou mais adjuvantes.

A es- —colhade excipiente(s) dependerá de uma grande extensão nos fatores tais cotro o modo de administração particular, o efeito do excipiente na solubilidade e estabilidade, e a natureza : da forma de dosagem.

Da maneira aqui usada, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui todo e qualquer solvente, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos . e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção, e similares que dão fisiologica- mente compatíveis.

Alguns exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são á- é gua, salina, salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações.

Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos) por exemplo, ? açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição.

Exem- plos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes umectantes ou menores quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsifi- cantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou efetividade do ingrediente ativo. | Composições farmacêuticas da presente invenção e métodos para sua preparação ficarão facilmente aparentes aos versados na tecnologia.

Tais composições elmétados para R 25 sua preparação podem ser observados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995). Composições farmacêuticas são BR preferivelmente fabricadas nas condições de GMP.

Uma composição farmacêutica da invenção pode ser preparada, empacotada, ou vendida a granel, como uma dose unitária simples, ou como uma pluralidade de doses unitá- , 30 riassimples.

Da maneira aqui usada, uma "dose unitária" é quantidade discrela da composi- ção farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo.

A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que será administrada a um sujeito ou uma fração conveniente de uma dosagem como essa tal como, por exemplo, uma metade ou um terceiro de uma dosagem como essa.

Qualquer método para administrar peptídeos ou proteínas aceitos na:tecnologia po- de adequadamente ser empregado para os peptídeos ou proteínas da invenção.

As composições farmacêuticas da invenção, são tipicamente T para ad- |

" ns | o | ] 86 | ministração parenteral.

Da maneira aqui usada, "administração parenteral" de uma composi- ção farmacêutica inclui qualquer via de administração caracterizada por ruptura física de um tecido de um sujeito e administração da composição farmacêutica através da ruptura no te- ' cido, assim geralmente resultando na administração direta na corrente ... no mús- culo, ou em um órgão interna.

Administração parenteral inclui assim, mas sem |limitações, Ú administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição |através de um ferida não cirúrgica que penetra no tecido, e similares.

Em particular, cambio pa- renteral é contemplada para incluir, mas sem limitações, injeção subcutânea, intr peritoneal, intramuscular, intrasternal, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracranial, intrasinovial ou infusões; e técnicas de infusão dialítica do rim.

Modalidades pre- ' feridas incluem. as vias intravenosas, subcutâneas, intradérmicas e intramusculares, modali- dades ainda mais preferidas são as vias intramusculares ou as subcutâneas. | . Formulações de uma composição farmacêutica adequada para administração pa- renteral, tipicamente no geral compreende o ingrediente ativo combinado com um carreador ? farmaceuticamente aceitável, tais como água estéril ou salina isotônica estéril.

Táis formula- ções podem ser preparadas, empacotadas, ou vendidas em uma forma adequada para ad- * ministração de bolo ou para administração contínua.

Formulações injetáveis podém ser pre- paradas, empacotadas, ou vendidas em forma de dosagem unitária, tais como em ampolas ouem recipientes multidoses contendo um conservante.

Formulações para administração parenteral incluem, mas sem limitações, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleo- | sos ou aquosos, pastas, e similares.

Tais formulações podem compreender adicionalmente, ; um ou mais ingredientes adicionais incluindo, mas sem limitações, agentes de suspensão, estabilização ou dispersão.

Em uma modalidade de uma formulação para administração | ' 25 parenteral, o ingrediente ativo é fornecido em forma seca (isto é, pó ou granulár) para re- constituição com um veículo adequado (por exemplo, água estéril sem pirogênio) antes da : administração parenteral da composição reconstituída.

Formulações parenterais também incluem soluções aquosas que podem conter excipientes tais como sais, carboidratos ea gentes de tamponamento (preferivelmente a um pH de 3 a 9), mas, para algumas aplica- —ções,elaspode ser mais adequadamente formuladas como uma solução estéril não aquosa ou como uma forma seca para ser usada junto com um veículo adequado tais como estéril, Ú água sem pirogênio.

As formas de administração parenteral exemplar incluem soluções ou suspensões em soluções estéreis aquosas, por exemplo, soluções de propileno glicol ou dex- trose aquosa.

Se desejado, tais formas de dosagens podem ser adequadamente tâmponadas.

Outras formulações parenteralmente administráveis que são usadas, incluem aquelas que compreendem ingrediente ativo em forma microcristalina, ou em uma preparadão liposso- mal.

Formulações para administração parenteral podem ser formuladas para T liberação 1 |

87 | o NE | | imediata e/ou modificada.

Formulações de liberação modificada incluem liberação atrasada, ' sustentada, pulsada, controlada, alvejada e programada. | | Por exemplo, em um aspecto, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ] ! ' incorporando o peptídeo anti-lgE, preferivelmente acoplados a um carreador imunogênico. | eventualmente em combinação com um ou mais adjuvantes, na quantidade exigida em um i solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, conforme exigido, seguido por esterilização filtrada.

Geralmente, |dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que - um meio de dispersão básica e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados anteriormente, Nocaso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os mbtodos pre- feridos de preparação são secagem a vácuo e liofilização, que produzem um póldo ingredi- : ente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada previamente ' estéril deste.

A fluidez própria de uma solução pode ser mantida, por exemplo, gelo uso de - um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exibido no ca- sode dispersão e pelo uso de agentes tensoativos.

Absorção prolongada de composições . injetáveis pode ser realizada incluindo na composição, um agente que atrasa a absorção, ç por exemplo, sais de monoestearato.e gelatina. | » Uma composição farmacêutica não limitante exemplar da invenção é uma formula- ção como uma solução aquosa estéril tendo um pH que varia de cerca de 0,5a cbrea de 6,5 e compreendendo cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL de um peptídeo “ invenção, de cerca de 1 milimolar a cerca de 100 milimolares de tampão de histidina, de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, de cerca de 100 milimolar a cetca de 400 milimolar de trealose, e cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de diidrato de dis- sódio EDTA. h ! . 25 Os peptídeos IgE antigênicos da invenção podem também ser administrados intra- º nasalmente ou por inalação, tipicamente na forma de um pó seco (tanto sozinhos, como | BR uma mistura, quanto como uma partícula do componente misturado, por exemplo misturado com um adequado excipiente farmaceuticamente aceitável) a partir de um inaládor de pó seco, como uma aspersão em aerossol de um recipiente pressurizado, bomba, aspersão, ' 30 atomizador (preferivelmente um atomizador usando eletrohidrodinâmica para produzir um névoa fina), ou nebulizador, com ou sem o uso de um propulsor adequado, ou como gotas nasais.

O recipiente pressurizado, bomba, aspersão, atomizador, ou na— ; te contêm uma solução ou suspensão de um anticorpo da invenção compreendendo, por exemplo, um agente adequado para dispersar, solubilizar ou estender a liberação do (s) propulsor(s) ativo(s) como solvente. | Antes do uso em uma formulação de pó seco ou suspensão, o produto do medica- |

| ss . mentoé geralmente micronizado para um tamanho adequado para distribuição por ihalação (tipicamente menos que 5 microns). Isto pode ser obtido por qualquer método de tituração apropriado, tais como moagem com jato em espiral, moagem com jato de leito fluido, pro- cessamento fluido supercrítico para formar nanopartículas, homogeneização a alta pressão, ousecagem por aspersão.

Cápsulas, ampolas e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador sobem ser formulados para conter um mistura em pó do composto da invenção, uma base em|pó ade- quada e um modificador de desempenho. Uma formulação de solução adequada para uso em um atomizador usando eletroidrodinâmica para produzir um névoa fina, pode conter uma dose adequada do peptídeo IgE antigênico da invenção por atuação e o volume de atuação pode, por exemplo, variar de 1 ul a 100 ul.

Flavorizantes adequados, tais como mentol e levomentol, ou edulcorantes, tal como sacarina ou sacarina sódica, podem ser adicionados às formulações da invenção destinadas a administração inalada/intranasal. ' Formulações para administração inalada/intranasal podem ser formuladas para ter liberação imediata e/ou modificada. Formulações de liberação modificada incluem liberação atrasada, sustentada, pulsada, controlada, alvejada e programada.

No caso de inaladores e aerossois de pó seco, a dosagem unitária é determinada por meio de uma válvula que distribui uma quantidade medida. Unidades, de acordo com a invenção são tipicamente arranjadas para administrar uma dose medida ou “bafbrada” de ' um anticorpo da invenção. A dose diária total será tipicamente administrada em bma dose única ou, mais normalmente, como doses divididas por todo o dia. Í | Uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo IgE antigênico pode também ser formulada para uma administração via oral. Administração oral podô envolver engolir,de forma que o composto entre no trato gastrintestinal, e/ou strideração bucal, lingual, ou sublingual pelo qual o composto entra na corrente sanguínea diretamente pela ' boca. | Formulações adequadas para administração oral incluem sistemas sólidos, semis- sólidos e líquidos tais como comprimidos; cápsulas macias ou duras contendo mp- ou na- —no-particulados, líquidos, ou pós; pastilhas em forma de losango (incluindo cheias com líqui- | do); gomas de mascar; géis; formas de dosagens de dispersão rápida; filmes; óvulos; asper- ' sões; e adesivos bucal/mucoadesivos. | Formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. fas formu- lações podem ser empregadas como cargas em cápsulas macias ou duras (feitas, por e- xemplo, de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose) e tipicamente compreende um carreador, por exemplo, água, etanol, polietileno glicol, propileno glicol, metilcelulose, ou ur óleo ade- quado, e um ou mais agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensão. Fonfulações li

|

Í Ne 8 om | 2 quidas podem também ser preparadas pela reconstituição de um sólido, por exemplo, a par- tir de um sachê, | As composições da invenção podem ser usadas para tratar, aliviar ou prevenir dis- túrbios mediados por IgE ou sintomas em um sujeito em risco ou que sofre de tal distúrbio ousintoma estimulando uma resposta imune no dito sujeito por imunoterapia. Imtunoterapia i pode compreender uma imunização inicial seguida, por exemplo, por um, dois, três, ou mais intensificadores adicionais. | Uma “quantidade imunologicamente efetiva" de um peptídeo IgE antigânico da in- venção, ou sua composição, é uma quantidade que é distribuída a um sujeito em questão, tanto em uma dose única quanto como parte de uma série, que é efetiva para lnduzir uma resposta imune contra IgE no dito sujeito. Esta quantidade varia dependendo da condição de saúde e física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico de indivíduo e tratado, da capacidade do sistema imune di indivíduo para sintetizar anticorpos, da formulação da ” vacina, e outro fatores relevantes. Espera-se que a quantidade caia em uma faixa relativa- mente ampla que pode ser determinada através de experimentos de rotina. | ' Uma “dose farmaceuticamente efetiva" ou “dose terapeuticamente efetiva” é aquela > dose exigida para tratar ou prevenir, ou aliviar um ou mais distúrbio ou sintoma rélacionados à a IgE em um sujeito. A dose farmaceuticamente efetiva depende inter alia do composto es- pecífico para administrar, a gravidade dos sintomas, da suscetibilidade do sujeito a efeitos colaterais, do tipo de doença, da composição usada, da via de administração, do tipo de mamífero sendo tratados, das características físicas do mamífero específico em considera- ção, tais como condição de saúde e física, medicação concomitante, da capacidade do sis- tema imune do indivíduo de sintetizar anticorpos, o grau de proteção desejado, epuoos fato- ) res que versado na tecnologia perceberão. Com propósitos de profilaxia, a quántidade de . 25 —peptídeoem cada dose é selecionada como uma quantidade que induz um resposta imuno- protetora sem efeitos colaterais adversos significante em vacinas típicas. Após uma vacina- - ção inicial, os sujeitos podem receber um ou diversas imunizações do intensificador espaça- do adequadamente. Entende-se que o nível de dose específica para qualquer particular paciente de- ] 30 — pende de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico emprega- do, a idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de admi- i nistração, e taxa de excreção, combinação do medicamento e da gravidade da doença par- ticular que passa por terapia. Por exemplo, peptídeos IgE antigênicos ou composição farmacêutica da invenção — podem ser administrados a um sujeito em uma dose de cerca de 0,1 ug a cerca de 200 mg, por exemplo, de cerca de 0,1 ug a cerca de 5 ug, de cerca de 5 ug a cerca de 10/ug, de cer- ca de 10 ug a cerca de 25 ug, de cerca de 25 ug a cerca de 50 ug, de cerca de 50 ug a cer- Ú |

90 ; ' ca de 100 ug, de cerca de 100 ug a cerca de 500 ug, de cerca de 500 pg à cerca de 1 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 2 mg, com intensificadores opcionais dados, por exemplo, em 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, dois meses, três meses, 6 meses elou um ano | depois. | Em algumas modalidades, uma dose única de um peptídeo IgE antigênico ou com- | posição farmacêutica de acordo com a invenção é administrada.

Em outras modalidades, múltiplas doses de um peptídeo IgE antigênico ou composição farmacêutica de ácordo com a invenção são administradas.

A frequência de administração pode variar depêndendo de qualquer de uma variedade de fatores, por exemplo, gravidade dos sintomas, grau de imu- —noproteção desejado, se a composição é usada com propósitos profiláticos ou curativos, etc. | Por exemplo, em algumas modalidades, um peptídeo IgE antigênico ou composição farma- cêutica de acordo com a invenção é administrado uma vez per mês, duas vezês por mês, três vezes por mês, a semana sim outra não (qow), uma vez por semana (qw), duas vezes | por semana (biw), três vezes por semana (tiw), quatro vezes por semana, indo vezes por | semana, seis vezes por semana, dia sim outro não (god), diariamente (qd), duds vezes um | dia (qid), ou três vezes ao dia (tid). Quando a composição da invenção for usada com pro- | pósitos de profilaxia, ela será geralmente administrada tanto iniciando quanto intensificando | as doses.

Espera-se que a intensificação das doses sejam adequadamente espaçadas, ou | preferivelmente dadas anualmente ou em tais vezes onde os níveis de anticorpo circulante | caiabaixode um nível desejado.

Intensificação das doses pode consiste em beptídeo IgE | antigênico na ausência do imunogênico da molécula carreador original.

Tais donstrutos in- | tensificadores podem compreender um carreador imunogênico alternativo ou! pode ser na | ausência de qualquer carreador.

Tais composições intensificadoras podem ser formuladas | tanto com quanto sem adjuvante.

A duração de administração de um peptídeo IgE antigênico de acer lcom a inven- ção, por exemplo, o período de tempo no qual um peptídeo IgE antigênico é administrado, pode variar, dependendo de qualquer de uma variedade de fatores, por exentlo, resposta do paciente, etc.

Por exemplo, um peptídeo IgE antigênico pode ser administrado por um | período de tempo variando de cerca de um dia a cerca de uma semana, de perca de dois semanas a cerca de quatro semanas, de cerca de um mês a cerca de dois mdses, de cerca de dois meses a cerca de quatro meses, de cerca de quatro meses a cerca de seis meses, de cerca de seis meses a cerca de oito meses, de cerca de oito meses a cerca de 1 ano, de cerca de | ano a cerca de 2 anos, ou cerca de 2 anos a cerca de 4 anos, ou mais.

Uma variedade de métodos de tratamento é também contemplada pela presente revelação, cujos métodos compreendem administrar um peptídeo IgE antigênico de acordo com a invenção.

Métodos de tratamento em questão incluem métodos de inbuzir uma res- posta imune em um indivíduo para auto-lgE, e métodos de prevenir, aliviar bi. tratar um dis-

: MD

: 1 ! - | túrbio mediado por IgE ou sintoma em um indivíduo. |

Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para tratar, prevênir ou aliviar um distúrbio relacionado a IgE ou sintoma em um sujeito, compreendendo admi-

nistrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um peptídeo IgE antigênico da inver- ção ou composição imunogênica ou farmacêutica desses, ao dito sujeito. |

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uM método para induzir uma resposta imune contra auto-lgE em um sujeito, compreendendo administrar um ltera- | peuticamente ou imunogenicamente quantidade efetiva de um peptídeo IgE antigênido da | invenção, ou composição imunogênica ou farmacêutica desses, ao dito sujeito. | "Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de aliviar ou abolir um distúrbio biológico elou pelo menos um de seus sintomas resultantes.

Da maneira aqui usa- " da, "aliviar" uma doença, distúrbio ou condição significa reduzir a gravidade e/ou frequência de ocorrência dos sintomas da doença, distúrbio, ou condição.

Adicionalmente, refetências ' aqui ao “tratamento” incluem referências ao tratamento curativo, paliativo e proftático, O dito sujeitoé preferivelmente humano, e pode ser tanto macho quanto fêmea, de qualquer idade.

Outros aspectos da invenção diz respeito a um peptídeo IgE antigênico de acordo * com a invenção, ou de uma composição imunogênica ou uma composição farmacêutica FÉ desses, para uso como um medicamento, preferivelmente em tratamento, alívio ou profilaxia de distúrbios relacionados a IgE. | Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso de úm pepti- deo IgE antigênico da invenção ou de uma composição imunogênica ou uma composição farmacêutica desses, na fabricação de um medicamento, preferivelmente para hratar um distúrbio mediado por 19E | Em alguns aspectos dos usos ou métodos da invenção, o dito distúrbio mediado por . 25 IgEé selecionado do grupo que consiste em conjuntivite, asma alérgica, rinite alérgica, der- matite atópica, anafilaxia, asma, dermatite de contato, gastroenteropatia alérgica) aspergilo- 7 se pulmonar alérgica, púrpura alérgica, eczema, síndrome hiper 1gE (Job's), hipersensibili- dade anafilática, mieloma de IgE, doença do intestino inflamatório (por exemplo, doença de . Crohn, alergias à alimento, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infeccit sa), urticá- ria, psoríase, preferivelmente do grupo que consiste em asma, asma alérgica, nto alérgica s e alergias a alimento. | Asma é um distúrbio inflamatório crônico das vias respiratórias que causa episódios recorrentes de ofegância, falta de respiração, tensão no peito, e/ou tosse em indivíduos sus- cetíveis.

Versados na tecnologia distinguem vários tipos de asma, incluindo: abma alérgica,

queé considerada surgir em pacientes tendo desenvolvido uma hipersensibilidade a alérge- | nos ambientais; asma induzida por medicamento, tipicamente desencadeada por sensibili- | dade a aspirina ou outros inibidores de COX; asma induzidos por exercício; asma quase

! | 1 i o '

Í i 92 ! fatal e hiperaguda; asma noturna; asma ocupacional, geralmente causada por exposição a : certas substâncias químicas no local de trabalho. Assim, asma pode ser desencadeada por vários estímulos, incluindo: alérgenos carregados no ar, tais como ácaros de poeira, pólens, cólera animal, esporos fúngicos, penas... (asma extrínseca); irritantes não específicos, tais comofumaça de tobaco, fumaça química, poluição, dióxido de enxofre (asma intrínseca). Rinite alérgica geralmente envolve uma coleção de sintomas, incluindo sintomas in- flamatórios, predominantemente no nariz, sinus e olhos, que ocorrem depois de ekposição a partículas carregadas no ar. Sintomas incluem espirro; obstrução nasal; nariz escorrendo (e ocasionalmente sangrias nasais); tosse; dor de cabeça; nariz coçando, boca, olhos, gargan- ta, pele, ou qualquer área exposta ao alérgeno; olfato prejudicado (e assim sensibilidade a flavorizantes); nariz entupido (congestão nasal); conjuntivite; olhos lacrimejantes; dor de . garganta; e ofegância. | Rinite alérgica pode ser constante e/ou sazonal. A rinite alérgica constante é rinite . alérgica que dura por todo o ano. É tipicamente causada por exposição contínua a alérge- nos tais como cólera animal, esporos de molde interno, ou ácaros de poeira doméstica. A rinite alérgica sazonal é rinite alérgica que ocorre somente durante algumas vezeis do ano. É + comumente causada por alergias a árvore, grama, e pólen de erva daninha que são produ- € zidos'sazonalmente. Uma alergia a alimento é um resposta imune exagerada cosencatenta por ovos, amendoins, leite, ou algum outro alimento específico. Qualquer alimento pode jcausar uma reação alérgica, mas poucos alimentos são os principais culpados. | Em crianças, as alergias a alimento mais comuns são a ovos, amendoins, leite, so- ja, nozes, trigo, marisco (camarão, caranguejo, lagosta, lesmas, conchas). Em grianças mais velhas e adultos, as alergias a alimento mais comuns são: amendoins, nozes, marisco, pei- . 25 xe. Os sintomas podem ser confinados principalmente no estômago e intestinos, ou podem envolver muitas partes do corpo depois do alimento ser digerido ou absorvido. Sintomas . podem incluir: garganta inflamada, anafilaxia (uma grave reação alérgica em todo corpo que pode resultar em morte); dor abdominal; diarréia; náusea; vomito; dores de estômago; cocei- ra da boca, garganta, olhos, pele, ou qualquer área; urticária; angioedema (indhaço, especi- | ' 30 almentedas pálpebras, face, lábios, e língua); dor de cabeça leve ou desmaio; congestão | nasal; nariz escorrendo; dificuldade de respiração; ofegância; dificuldade de engolir: síndro- | i me de alergia oral. A síndrome de alergia oral geralmente compreende coceira nos lábios, língua, e garganta, e algumas vezes lábios inchados. | | Em outros aspectos dos usos ou métodos da invenção, o dito sujeito é um mamífe- | ro, preferivelmente um sujeito humano. | Ainda em outros aspectos dos usos ou métodos da invenção, o dito quieito sofre do dito distúrbio mediado por IgE. Alternativamente, o dito sujeito tem o risco % sofrer do dito | | | |

| 93 j : ! distúrbio mediado por IgE. ! | EXEMPLOS ! Os exemplos seguintes são apresentados de maneira a prover os versados na tec- nologia com uma revelação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção, ' enão visam limitar o escopo do qual os inventores consideram sua invenção, nam preten- dem representar que os experimentos a seguir são todos ou somente os experimentos reali- | zados. Esforços foram feitos para garantir precisão com relação aos números uÚsados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em conta. A menos que de outra forma indicada, as partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio em peso, a temperatura é em graus Celsius, ea pressão é na ou atmosférica próxima a ela. As abreviações padrões podem ser usadas, por . exemplo, bp, par base(s); kb, quilobase(s); pl, picolitro(s); s ou sec, segundo(s); min, minu- to(s); h ou hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobase(s); bp, par base(s); nt nucleoti- . deo(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea(mente); e | 15 similares. | Exemplo 1. Seleção de peptídeos IgE antigênicos Í | + A estrutura dos domínios constantes CH3-CH4 de IgE de humano que hterage com Ne a subunidade alfa do receptor FceRI de alta afinidade de IgE foi esclarecida e publicada (Wurzburg BA et a/., (2000) Immunidadey, 13 (3), 375-85; Garman SC et a/l., (2000) Nature 20,406 (6793), 259-66). Esta informação estrutural foi usada junto com a leratura sugerin- do que são duas regiões onde ligação ocorre para identificar 4 laços potenciais como pontos de interação chaves e desenhar os 4 peptídeos seguintes que corresponderiaml às áreas de importância para a interação de IgE-FceRI (ver figura 1). | Púrpura: ADSNPRGVSAYLSRPSP (SEQ ID No: 312) | . 25 Azul: LVVDLAPSKGTVN (SEQ ID No: 165) i Laranja: STRKEEKQRNGTLTVTSTLP (SEQ ID No: 1) ! . Amarelo: QCRVTHPHLPRALMRS (SEQ ID No: 220). | Exemplo 2- Preparação de Conjugados Púrpura-VLP | O peptídeo púrpura (SEQ ID No: 312) em que um resíduo de cisteina terminal foi adicionado com propósitos de conjugação (sequência ADSNPRGVSAYLSRPSPC (SEQ ID NO: 434)) foi sintetizado usando um protocolo Fmoc padrão em resina CLEAR amida. As reações acoplamento de aminoácido foram realizadas usando 5 vezes o excesso de Amino- ácido protegido com Fmoc ativado com 1 eq de HBTU (hexatiuoriosfato de 2-(1H- benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3-tetrametilurônio) na presença de HOBt (hidroxibenzotriazol) e NMM (N-metilmorfolina). A desproteção de grupo Fmoc foi obtida com 20 % de piperidina/DMF. | Peptídeo ligado a resina foi então clivado e grupos de proteção de cadeia lateral removido simultaneamente com Reagente D (TFA/H20/DODT: 89/3/8). O peptídeo foi q com ! |

Í | |

NM i 94 ! ” Í um terminal N livre e terminal C amidado. O peptídeo bruto foi purificado até a homogenei- Fo. zação por HPLC usando uma coluna C18 BEH 130 e um gradiente água/acetonitrila na pre- sença de 0,1% de TFA. O peptídeo purificado foi seco a vácuo usando um liofilizador. O peptídeo foi analisado usando espectrometria de massa (LC-MS) e deu dados satisfatórios | 5 (vera seguir). ! | Tabela 1 i ee a TA Peptídeo Iperada | (Da) (Da) | | - O peptídeo Púrpura + Cyst (SEQ ID NO: 434) foi conjugado com as pattículas tipo vírus QB (VLP) e Antígeno superfícial de Hepatite B (HBsAg) em dois experimentos de con- 7 jugação separada. A QB usada neste estudo foi produzida por fermentação de EColi bacte- ' rianoem uma cepa BL21 (DE3) incorporando um plasmídeo pET28 que codificá a proteína do monômero ! 14kD: | À MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRK ' € NYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLI DAIDQLNPAY (SEQ ID NO: 435). A fermentação é induzida e um OD600 de o8 com IPTG e prosseguida naturalmente por toda a noite em caldo terrífico (TB) com canamícina. A VLP que automonta na célula hospedeira, foi então purificada a partir do precipitado celular da fermentação usando o método descrito no pedido de patente EP20050105513 com as se- guintes diferenças: após a ruptura celular, o homogenato clarificado foi tratado com sulfato de amônio a 50 % de saturação e o precipitado celular recoberto por centrifugação. Então, o * 20 precipitado foi redissolvido em tampão HEPES e dialisado contra tampão HEPES antes de prosseguir para a primeira etapa da coluna no método publicado. Depois da coluna de troca - iônica e etapas da coluna de hidroxilapatita, o material foi purificado usando adicionalmente uma etapa da coluna de troca aniônica e filtrado estéril para produzir o material macivo da . VLP final, que foi analisado por cromatografia de exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mi- —croscopia eletrônica com resultado aceitável, Í . O HBsAg (subtipo adw) usado neste estudo foi adquirido pela Aldevron (ND, USA). O HBsAg existe como partículas esféricas aproximadamente 22 nm em diâmetro, que con- siste em múltiplas cópias de um 24kD proteína monomérica embutida em uma vesícula bi- camada de lipídio. Uma cepa S. Cerevisiae para produção de HBsAg deste tipo é também disponível a partir da coleção de cultura ATCC. i As VLPs (tanto QB quanto HBsAg) foram ativadas usando reagente de ligação éster N-gama-maleimido-butirilóxi-succinimida (GMBS). O reagente GMBS foi dissolvido em sul-

Í 1

Í Í

MM 95 ! | | S fóxido de dimetila (DMSO) e adicionado na solução de VLP a um excesso molar 210 vezes.

F A reação de ativação prosseguiu naturalmente por =30 minutos e a solução foi então des- salgada usando uma coluna de dessalgadura NAP-25 na Saline Tamponada com Fosfato Dulbeccos (DPBS) com EDTA 5 mM.

Se necessário, a solução da proteína foi levemente concentrada usando microconcentradores centrífugos 10kD antes da reação de conjugação seguinte.

Antes da reação de conjugação, o peptídeo púrpura foi dissolvido em um alíquota de pH 7,4 DPBS, com EDTA 5 mM como um aditivo.

A concentração do peptídeo em solu- ; ção foi 10 mg/mL.

O peptídeo solubilizado foi adicionado a uma alíquota de agente de redu- | ção imobilizado TCEP (Pierce Chemical) que foi lavado em DPBS contendo EDTA SMM.A alíquota de peptídeos foi incubada com mistura na presença do gel TCEP por áproximada- | . mente 1 hora, depois que time a alíquota foi centrifugada em uma microfuga e os sólidos precipitado descartados.

O sobrenadante contendo peptídeo reduzido foi adicionado direta- - mente na VLP ativada que foi preparada anteriormente. ' A reação entre as VLPs e os peptídeos reduzidos prosseguiu naturalmente por pelo menos trinta minutos com mistura muito suave.

No final do tempo de reação cada amostra , foi dessalgada em Dulbeccos PBS (DPBS) usando colunas de dessalgadura' NAP-10 ou - NAP-25 (GE Healthcare). Os peptídeos conjugados dessalgado foram analisados com rela- ção ao teor de proteína usando o ensaio Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Pierce Chemi- cal) bem como por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho.

Os produtos con- jugados foram filtrados estéreis usando um filtro de 0,22 um e armazenados a /2-8 ºC até o uso.

Atenção cuidadosa foi dada a essas amostras durante o armazenamento para prevenir | congelamento ou exposição a temperatura extrema. | A extensão da conjugação para as dois amostras de VLP-peptídeo foi medida u- . 25 —sando SDS-PAGE, e um peso molecular maior foi observado para ambas amostras que são consistentes com a adição do peptídeo na proteína de monômero VLP.

Além do mais, a . amostra de QB-peptídeo foi testada no ensaio de cromatografia de exclusão de tamanho HPLC (usando uma coluna Tosoh PWXL5000 HPLC) e observada conter VLP montada quando comparada com amostras não conjugadas de VLP.

Além disso, a amostra de QOB- peptídeofoiobservada usando microscopia eletrônica usando um JEOL 1230 TEM com fei- xe de 80 kV, e observada conter partículas uniformes montadas.

A integridade da partícula ' conjugada HBsAg-peptídeo foi testada usando SDS-PAGE não reduzido e uma vez que a proteína não entra no gel, a amostra foi considera conter espécie de massa molecular alta e ser adequada para uso in vivo. ; Exemplo 3. Preparação de Conjugados de VLP Laranja, Púrpura, Afnarelo, e Azul bem como Conjugados de VLP Púrpura Restrito e Azul Melhorado |; Os peptídeos Amarelo, Azul+Cyst, Púrpura+Cyst e Laranja+Cyst cujas sequências ; ! |

96 ' - ! de aminoácidos são indicadas na Tabela 2, foram sintetizados de acordo com métodos co- nhecidos na tecnologia e principalmente de acordo com o protocolo no Exemplo! 2, como a | seguir. Os peptídeos foram sintetizados em um sintetizador de peptídeo Symphohy com um protocolo Fmoc padrão em resina CLEAR amida, exceto para peptídeo Amarelo Qque foi pro- 5 duzidoem resina pré-carregada Fmoc-Ser(tBU)-Wang. Ver Exemplo 2 para detálhes a res- peito das reações de acoplamento e desproteção. Todos os peptídeos foram iproduzidos com um terminal N livre e terminal C amidado exceto o peptídeo Amarelo que si produzido com um terminal N acetilado e terminal C carboxilado. Os peptídeos brutos foram purifica- dos em um sistema HPLC com uma coluna C18 BEH 130 como no Exemplo 2. Os peptí- deos purificados foram secos a vácuo usando um liofilizador. Finalmente, os peptídeos fo- ram analisados com LC-MS e todos os peptídeos deram dados satisfatórios (ver Tabela 3 a ; BR seguir). | | Os peptídeos azul melhorado e púrpura restrito foram fabricados por CEM Corpora- | . tion (Matthews, NC, USA). Os peptídeos foram fabricados usando técnicas químicas pa- | drões de peptídeo e purificados usando cromatografia. Os peptídeos purificados foram ana- | lisados usando LC-MS e observados ser de alta pureza (>95 %) (ver Tabela 3 afsegui). | 4 Tabela 2. Sequências de peptídeo | eo ORE bo | | | “ O sublinhado indica resíduos de cisteína com propósitos de conjugação e sublinha- | do duplo indica um ligante GC. ! | : | | Tabela 3. Dados LC-MS dod Peptídeos. ! ! Massa Esperada | Massa Observada | Peptídeo Pureza | mo Jon fog | | |

À í í Cada peptídeo foi conjugado com a partícula tipo vírus (VLP) QB em lotes separa- à dos.

O QB usado neste estudo foi produzido por fermentação de E.Coli bacteriano e purifi- cação extensiva como no Exemplo 2. A VLP (concentração de proteina >1 mg/mL por ensaio Bradford) foi ativada usando reagente de ligação de éster N-gama-maleimidobutirilóxi-succinimida (GMBS) pela Pierce Chemical da maneira descrita anteriormente no Exemplo 2. Antes da reação de conjugação, cada peptídeo foi dissolvido em uma aliquota de Saline Tamponada com Fosfato Dulbeccos (DPBS) pH 7,4, com EDTA 5 mM como um aditi- vo.

A concentração de cada peptídeo em solução foi na faixa de 8 - 12 mg/mL, ver tabela 4 | aseguirpara dados exatos.

O peptídeo solubilizado foi adicionado a uma alíquota de agente | de redução imobilizado TCEP da maneira descrita anteriormente no Exemplo 2. O sobrena- | . dante contendo peptídeo reduzido foi adicionado diretamente na VLP ativada que foi prepa- rada anteriormente. | . A reação entre as VLPs e os peptídeos reduzidos prosseguiu naturalmente por pelo | menos trinta minutos com mistura muito suave.

No final do tempo de reação cada amostra | foi dessalgada em Dulbeccos PBS (DPBS) usando colunas de dessalgadura NAP-10 ou ? NAP-25 (GE Healthcare). Os peptídeos conjugados dessalgados foram então concentrados w usando concentradores centrífugos 10 kKD MWCO, e analisados com relação ao teor de pro- teina usando o ensaio Bradford (Coomassie Brilliant Azul, Pierce Chemical) bem como por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho, ver a seguir para detalhêés adicionais.

Os produtos conjugados foram filtrados estéreis usando um filtro de 0,22 um e armazenados Í a 2-— 8 ºC até o uso.

Atenção cuidadosa foi dada a essas amostras durante o armazena- ' mento para prevenir congelamento ou exposição à temperatura extrema.

Os conjugados ' VLP-peptídeo foram analisados para extensão de conjugação e montagem da partícula da | maneira descrita anteriormente no Exemplo 2 (SDS-PAGE incluindo densitometria, micros- | ' copia eletrônica e HPLC de exclusão de tamanho). | . Tabela 4. Conjugados VLP-Peptídeo | Peptídeo Quantidade | Concentração | Quantidade Rendimento | Substituição* | de Peptíi-jde Peptídeo| aproximada Final (mg) | (ug peptídeo | deo (mg) em DPBS | de VLP ativa- por mg de 1 (mg/mL) da adicionada proteina) (mg) | Laranja + | 4,5 11,3 2,8 7O ! [es Fe e w

98 | BET Dq [SRA ER gg *conforme determinado por SDS-PAGE e cálculos de densitometria ' Exemplo 4: Preparação de Conjugados Laranja, Púrpura, Amarelo, e AZUlKLH bem como Conjugados Púrpura Restrito e Azul-KLH Melhorado : Os peptídeos de Tabela 2 foram conjugados com KLH adquirido pela Pierce Che- mical (Rockford, Illinois, USA) e puríificados como a seguir.

Os peptídeos foram produzidos da maneira detalhada anteriormente nos Exemplos 2 e 3. O KLH usado foi KLH ativado por Í Malemide-activated fornecido pela Pierce Chemical como um sólido liofilizado.

Frascos des- : te KLH foram reconstituídos com água de qualidade cultura de tecido antes dad adição dos - peptídeos.

Os peptídeos foram tratados com gel TCEP da maneira descrita ahteriormente | nos Exemplos 2 e3e os sobrenadantes contendo peptídeo reduzido foram adicionados di- | * retamente nas alíquotas da solução de KLH ativada e incubados com mistura suave.

A rea- | ção de acoplamento prosseguiu naturalmente para duas horas, em cujo tempo as soluções 1 foram centrifugadas para remover sólidos e dessalgados usando colunas de dessalgadura | ? por gotejamento por gravidade como anteriormente.

Os conjugados dessalgados foram ana- | W 15 lisados por SDS-PAGE, ensaio de proteína Bradford, e digestão tríptica seguido por análise ; MS-MALDI.

Os conjugados foram filtrados estéreis usando um filtro de 0,22 umie mantidos a | 2-8 ºC até o uso, uma vez que congelamento de soluções KLH não é recomendado. | Exemplo 5. Identificação do peptídeo IgE ; ! Este estudo visou avaliar quanto eficazes foram os peptídeos conjugados com uma VLP Qbeta (da maneira detalhada anteriormente nos Exemplos 2 e 3) na indução de uma resposta do anticorpo que pode ligar na IgE de humano.

Fêmeas Balb/c (6-8 semanas) fo- : . ram injetadas pela via intramuscular (volume de 50 microlitros injetados em cada músculo ! Tibialis anterior) nos dias O, 19 e 34. A necropsia ocorreu no dia 46. Na necropsia 400 — 600 ! - microlitros de sangue foram amostrados de camundongos eutanizados por purição cardíaca.

O sanguefoideixado coagular por toda a noite e no dia seguinte, soro foi coletado. | Respostas do anticorpo de animais imunizados foram investigadas para alguns ou | todos os seguintes ensaios: a) IgG determinação do titulador, b) ligação no soro livre IgE, c) ligação na IgE ligado no FceRlI, d) ensaio de degranulação, e e) IgE ensaios: de quantifica- | ção. | a) Determinação do titulador de IgG total : Sumário: Um ELISA calorimétrico que gera um titulador recíproco (RD) para repre- | sentar os níveis de moléculas de IgG total que são específicos para a vacina.

Diluições em | série foram preparadas a partir de amostras de soro e testadas no ensaio.

Alnostra de soro preparada de amostras de soro de camundongos vacinados com Ce3 agrupados foi usada ; ; |

Ú como controle positivo.

Balb/c soro neg de Harlan Labs foi usado como controle negativo - (agrupados a partir de 400 animais Harlan laboratories Codeft R-0131D). Revestimento de placas de ensaio: placas de ensaio de alta ligação de 384 poços (Corning International Ga- ! tof3700) foram revestidos com 25 ul/poço de estoque de proteína Ce3Ce4 humano diluídos | em1ugmlcom PBS 0,01 M, pH 7,4 e incubados em um agitador a RT por 3 horas.

Depois de lavar 2 x com PBS pH 7,4, as placas foram bloqueadas usando 80 ul/poço de PBS 0,01 M/BSA 1 %, incubadas à RT por 1 hora antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH | 7,ATween 20 0,05 %. Preparação e ensaio da amostra: No dia seguinte, uma diluição em série 72 log de 8 pontos de cada amostra foi preparada começando em diluição 1:100 (dilu- entePBS/BSA 1%) 25 ul/poço da diluição em série transferidos em duplicata na placa re- vestida com Ce3Ce4 humano em seguida incubados agitando a RT por 1,5 hora.

Depois de . lavar x 3 com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, adicionados anticorpo de detecção de IgG total 25 ul/poço (Rabbit anti-mu IgG-Fc, Catft A90-130A Betil Laboratories), 1:6000 com . PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %, em seguida incubados agitando a RT por 1 hora.

Depois de lavar 5xcom PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, adicionados 25 ul/poço conjugado pe- roxidase de rábano silvestre cabra anti-coelho do estojo Bio-Rad (Bio-Rad Catit172 -1019) + 1:3000 com PBS 0,01 M pH 7, 4/Tween 20 0,05 % pH 7,4, em seguida incubados agitando a v RT por 1 hora.

Depois de lavar x 4 com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 % então 1 x com PBS 0,01 M pH 7,4 somente, adicionados 25 ul/poço de Camundongo Tiper HRP Substrate (Bio-Rad Catff172 -1064), em seguida incubada a RT por 30 minutos.

Adicionados 25 ul/poço de ácido oxálico 2 %, lido a Abs 405 nm.

Análise de dados: Um valor de corte (Abs 405 nm) foi calculado fazendo a média das leituras da duplicata gerada pela concentração mais baixa do grupo controle negativo de estudo apropriado e multiplicando este valor por 2,5. Curvas de titulação foram colocadas em gráfico para cada amostra teste (titulador de . 25 amostravs Abs 405 nm) e o titulador de amostra (subsequentemente transformado no titu- lador recíproco) foi previsto a partir do calculado valor de corte. : . b) Titulador de ligação IgE livre ' Sumário: Um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) que gera um titulador re- cíproco (RT) e valor máximo para representar os níveis de complexos IgG de camundon- —golgEde humano formados depois da incubação de diluições em série e de soro teste por toda a noite com uma concentração alta de IgE de humano.

Amostra de soro, preparada de amostras de soro de camundongos vacinados com Ce3 agrupados foi usada como controle | positivo, junto com um anticorpo de camundongo em uma região do domínio Ce3 da IgE de ! humano (AbDserotec 0100-0413 (E411 (5H2)) contaminado em 50 po/mL & 1 mg/ml em ! sorode Balb/cneg pela Harlan Labs (agrupados a partir de 400 animais Harlàn laboratories Codett R-0131D), que foi também usada sozinha como um controle negativo.

Incubação de | amostras com IgE de humano: Uma diluição em série 7 log de 8 pontos de cada amostra, | ' 1 : | ; | | i 100 i Ú incluindo controles, foi preparada começando em diluição 1:3 (PBS 0,01 M pH 7 ,4/diluente ç de BSA 1 %). volumes de 10 ul de cada amostra concentração foi misturados com 10 ul de 100 pg/mL IgE de humano (diluídos de estoque usando PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %), então placas foram seladas e incubadas por toda a noite a 4 ºC. Revestimento de placas de en- saio Nodia seguinte, placas de ensaio de 384 poços (Meso-Scale Diagnostics (MSD) stan- dard bind Catftf L11XA-1, 0370PA) foram revestidas com 12 ul/poço de pAb de ovelha para IgE de humano (Gentaur, ICL (Imunology Consultants Lab) Cat SE-80A) diluídos em 1 uVg/mL com PBS 0,01 M pH 7,4, em seguida incubadas em um agitador a RT por 2 horas. | Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4, as placas foram bloqueadas usando 25 ul/poçode tampão de bloqueio de partida Pierce (Pierce Biotech. Catff 37538) e incubada em um agitador a RT por 40 minutos, antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH . 7,4. Preparação e ensaio da amostra: Volumes de 20 yL da mistura da incubação por toda a noite de soro com IgE de humano foram diluídos 1:5 com 80 ul/poço PBS 0,01 M pH . 7,4/BSA 1 % e então 12 uL/poço transferido em duplicata nas placas de ensaio MSD reves- tidas. Depois da incubação em um agitador a RT por 2 horas, as placas foram lavadas 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %. 12 ul/poço de anticorpo de detecção adiciona- . dos (Donkey pAb para IgG de camundongo H+L Abcam Cat?! ab6707, MSD SULFO- Ç marcado usando MSD Catit R91AN-1) 1:5000 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %, em segui- | da incubada agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween | 200,05% adicionados 50 ul/poço de tampão de leitura T MSD (4 x) com agente tensoativo (MSD Catft R92TC) 1:2 com água MOQ. Placas foram lidas usando um MSD Sector Imager

6000. Análise de dados: Um valor de corte (Pixels) foi calculado fazendo a média das leitu- ras da duplicata geradas pela concentração mais baixa do grupo controle negativo de estu- do apropriado e multiplicando este valor por 5. Curvas de titulação foram colocadas em grá- . 25 ficopara cada amostra teste (titulador de amostra vs Pixels) e o titulador de amostra (sub- sequentemente transformado no titulador recíproco) foi previsto com relação ao valor de - corte calculado. O valor de pico máximo das curvas de titulação foi também registrado. c) Ligação a IgE ligado ao receptor i Estas medidas de ensaio se anticorpos em soro de camundongos vácinados pode ligara algum IgE de humano ligado ao receptor FceRI na superfície de células RBL-O, estes ! anticorpos são então detectados por um específico anticorpo Fc anti-camundongo conjuga- do com ficoeritrina e a fluorescência é medida por citometria de fluxo. Um anticorpo IgE anti- humano de Biodesign diluídos em soro de BALBc não vacinado foi usado conto um controle positivo. Ensaio: Células RBL-O congeladas (p12 10x10ºcélulas/mL) foram descongeladas e lavadas uma vez com tampão de ensaio (PBS - 5 % de soro de cabra). 216 células/poço : no tampão de bloqueio (PBS - 5 % de soro de cabra -0,1 mg/ml camundongo Fab (Chrom- Pure Mouse IgG, Fab fragment - Jackson Imunoresearch)) foram semeadas em placas de | | | ' Í o 1 101 | i 96 poços e incubadas no agitador a 4 ºC por 1,30 hora. 50 ul de 4 ug/mL de IgE de humano os foram adicionados por poço (diluídos em tampão de ensaio) (exceto o poços controles Bio- | design na IgE, apenas células e aMo-PE) e as placas foram incubadas por 1 horta no agita- ; dor a 4 ºC.

As células foram lavadas uma vez com tampão de ensaio e ressuspensas em 30 uldelgE anti-humano (Biodesign 10 ug/mL, 5 ug/mL, 2,5 ug/mL - controle positivo) diluídos em soro de BALBc 5 % ou com amostras de soro de camundongos vacinado diluídos 1:20. | 1:40 e 1:80 em tampão de ensaio.

As amostras de soro foram plaqueadas em triplicata eos controles em duplicata.

As placas foram incubadas no agitador a 4 ºC por 1,30 hora em se- guida lavadas com tampão de ensaio, ressuspensas em 100 yL de anticorpo PÉ Fc especí- ficode cabra antisccamundongo (1:200 em tampão de ensaio, Goat Jackson Imunoresearch) e incubadas por 45 minutos no agitador a 4 ºC.

As células foram lavadas 3 vezes com tam- | : pão de ensaio, ressuspensas em 80 ul de Paraformaldeído 2 % em PBS e incubadas por toda a noite a 4 ºC.

A intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo.

Análi- ' se de dados: A intensidade de fluorescência média de cada amostra foi usada para análise.

O controle negativo (aMo-PE sozinho) foi medido e seu valor subtraído de cada poço.

O | controle positivo foi medido e cada amostra foi expressa como uma porcentagem de contro- | * le positivo (Biodesign) na sua respectiva diluição de soro.

A diluição de soro 1;40 foi então Ç extraída e um ANOVA foi realizado. ! d) Ensaio de degranulação / | 20 Este ensaio mede se o soro de camundongos vacinado induz desgranulação de cé- | lulas RBL-O medindo-se a atividade de b-hexosaminidase enzima liberada poricélulas RBL- | O nomeio.

E25 (Xolair) diluído em soro de BALBc não vacinado foi usado comb um controle ! negativo (40 ug/mL) e anticorpo policlonal de cabra pela Sigma diluído em soro de BALBc | não vacinado foi usado como um controle positivo.

Semeadura de Célula: RBL-O p12 con- ' 25 geladas (10x10º células/frasco; células leucemia de basófilo de Rato estavelmente transfec- tadas com FceRI humano) foram descongeladas, lavadas em meio RBL-P. (suplemento - MEM-Earles com 15 % de FCS e -Glutamina 2 mM L) e ressuspensas em meio RBL-P a Í 8x10º células/ml. com 0,25 pg/mL de IgE de humano. 8x10ºcélulas/poço foram semeadas | em placa de 96 poços de fundo plano e incubadas por 48 horas a 37 º*C/ CO25 %. Prepara- Í çãode amostras e tampões: No dia 3 tampão de Tyrode 1X (NaCl 135 mM, Ke 5 MM, Ca- | CI2 1,8 mM, MaCI2 1 mM, Glicose 5,8 mM, BSA 1 mg/mL, Hepes 20 mM, pH Ta) foi prepa- rado.

Tampão Tyrode de BALBc 5 % tampão Tyrode de soro de BALBc 2,5 % e Triton 1% | em soro de Tyrode de BALBc 5 % foram também preparados.

Controle positivo (anticorpo ! anti-lgE policilonal cabra (82 mg/mL em PBS) - Sigma, 10632) foi serialmente dituído em soro ; deBALBcde tampão de Tyrode 5% (18t poço em soro de BALBc de tampão de Tyrode 5 % e seguida em tampão de Tyrode) de 10 pg/ml a 2,5 uo/mL.

O controle negativo (E25) foi | mantido constante a 40 ug/mL em soro de Balbc diluído (diluição do soro Po 1:40 e 1:80). | | 1 | | | o ND 102 | As amostras de soro testes de camundongos vacinados foram testadas a diluição do soro | s 1:20, 1:40 e 1:80. Todos os controles e amostras de soro testes são testados em triplicata | em cada placa. Ensaio agonista: No dia 3, placas de célula foram removidas do incubador. 95 ul do meio foram removidos dos poços e as células foram lavadas com 200 JL de tam- pãode Tyrode 1X, otampão de lavagem foi removido e 70 ul de anticorpos diluídos (tanto controle positivo, controle negativo quanto amostra teste de soro) foram adicionados. As células foram incubadas a 37 ºC/CO2 5 % por 1 hora. No terminal de incubação, as placas foram removidas do incubador e centrifugadas a 1.200 rpm por 5 minutos pará sedimentar quaisquer células destacadas. 65 pl. de sobrenadante foram removidos e colocados em pla- cas de 96 poços estéreis. 25 ul. do sobrenadante foram testados para atividade B- | hexosaminidase. Atividade B-hexosaminidase: 25 ul de sobrenadante foram adicionados a . uma placa de 96 poços. 25 ul de NAGA 4 mM em tampão de citrato (N-acetil-B-D- | glucosaminida 4 mM (NAGA) (Sigma, N9376) em tampão de citrato 50 mM PH 4,5) foram ' ' adicionados a todos os poços (recentemente preparados), as placas foram incubadas por 1 horaa37"Ce150 uL de glicina 0,2 M pH 10,7 foram adicionados para interromper a rea- | ção. As placas foram lidas a 405 nm com Envision. Análise de dados: Desgranulação foi . expressa como uma porcentagem da atividade B-hexosaminidase total com relação aos va- T lores para poços totais (tratados com 1 % de Triton X-100). A % de desgranulação em dilui- ção 1:40 foi então extraída para análise e uma ANOVA é realizada nas amostras de soro. e) Redução de ensaio de IgE humano livre | | | Sumário: Um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) que quantifica os níveis de IgE de humano livre que permanece depois de incubação de alíquotas de soro teste por toda a noite com um diluição em série de IgE de humano, durante em cujo tempo complexos IgG de camundongo:I|gE de humano se formam. Para garantir precisão do ensaio de quanti- . 25 ficaçãodolgE de humano, é essencial primeiramente remover qualquer complexo IgG de camundongo:I|gE de humano usando Dynabeads magnético revestido com proteina G, que . liga qualquer complexo por meio da região Fc de IgG de camundongo. Um valor para o % diminui em níveis de IgE de humano a partir do qual os grupos controles negativos apropria- dos podem ser calculados para cada amostra. Como um controle posiítivo, Xolair/E25 foi contaminado em 40 pg/mL (dose de terapia padrão) em soro de Balb/c neg pela Harlan Labs (agrupados a partir de 400 animais Harlan laboratories Codett R-0131D), que foi também usado sozinho como um controle negativo. Incubação de amostras com IgE de humano: Volumes de 2 ul. de cada concentração de uma diluição em série %4 log de 8 pontos de IgE | de humano (PBS 0,01 M pH 7 4/diluente de BSA 1 %) foram adicionados a cada 8 x 10 ul | de volumes de amostras testes de soro, incluindo controle positivo Xolair/E25 (40 pg/mL), o | IgE começando em um concentração final de 30 ug/mL. As placas foram seládas e incuba- das por toda a noite a 4 ºC. Revestimento de placas de ensaio: No dia seguinte, as placas | |

V de ensaio de 384 poços (Meso-Scale Diagnostics (MSD) standard bind Cat L11XA-1, - 0370PA) foram revestidas com 12 ul/poço de pAb de ovelha para IgE de humano (Gentaur, ICL (Immunology Consultants Lab) Catf SE-80A) diluídos em 5 pg/ml com PBS 0,01 M pH 7,4, em seguida incubadas em um agitador a RT por 2 horas.

Depois de lavar 3 x com PBS 0,01MpH7,,as placas foram bloqueadas usando 25 ul/poço de tampão de bloqueio de partida Pierce (Pierce Biotech.

Catft 37538) e incubadas em um agitador a RT por 40 minu- tos, antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4. Preparação da amostra e Dy- nabead: Volumes de 5 ul. da mistura da incubação de soro com IgE de humano por toda a noite foram diluídos 1:20 com 95 ul/poço PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %. [Nota: Também dilu- ídos10uL da diluição 1:20 um adicional de 1:2 com 0,01 PBS pH 7,4/BSA 1 % para teste no ensaio de ligação de IgE livre para obter uma medição de complexos mu IgG:hu IgE antes ! . da incubação da microesfera da proteína G]. O volume exigido de concentração 1 x de Pro- teina G Dynabeads (Invitrogen Cat! 10004D) foi lavado e preparado como no encarte da 9 embalagem, então concentrado x 4 ressuspendendo em 0,25 x o volume da microesfera inicial.

Incubação de amostra com Dynabeads: 30 ul. misturados de cada amostra de micro- esferas 1:20 com 15 ul/poço 4 x, incubados agitando a RT por 1 hora.

As microesferas são . removidas das amostras usando uma placa de barra magnética Dynal (Intitrogen Cat T 12027) e misturadas a 40 ul. da amostra remanescente com 20 yuL de microesfera fresca misturado 4 x, incubadas agitando a RT por 1 hora.

A amostra remanescente 45 ul/poço | 20 transferida em poços frescos e centrifugada 1 minuto a 1.000 rpm, as placas são retornadas na placa de barra magnética e transferidas 40 ul/poço em poços frescos. [Nota: Usados 30 ! uL de amostra remanescente para teste no ensaio de ligação de IgE livre pára obter uma medição de complexos mu IgG:hu IgE depois da incubação da microesfera da proteína G para garantir que todos os complexos foram removidos]. Ensaio de quantificação: Preparada . 25 uma curva padrão de diluição em série 72 log de 12 pontos de IgE de humano em 80 % de | diluente do ensaio de soro de camundongo MSD/20 % de PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1%, co- - meçando em um concentração de 5 ug/mL.

Amostra remanescente diluída a partir da incu- bação de microesfera 1:5 usando diluente do ensaio de soro de camundongo MSD (MSD Catif R52BB-2). Transferidas as diluições em série de curva padrão e amostrás em triplicata | 30 a12ul/poçoem poços MSD revestidos e incubadas agitando a RT por 2 hotas.

Depois de lavar as placas 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, são adicionados 12 ul de anticorpo de detecção /poço (Betil específico da cadeia epsilon do anticorpo IGE Coelho anti- humano Cat*tf A80-109A, MSD SULFO-marcado usando MSD Cattt R91AN-1) 1:300 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %, em seguida incubadas agitando a RT por 1 hora.

Depois de lavar 3 xcomPBS0,01M pH7?7,4/Tween 20 0,05% adicionado tampão de leitura MSD 50 yl/poço T (4x) com agente tensoativo (MSD Catit R92TC) 1:2 com água MQ.

As placas foram lidas usando um MSD Sector Imager 6000. (Nota: Um ensaio de ligação de IgE livre correu em

! |

' 104 Ú tandem com este ensaio de quantificação para amostra teste de antes e depois da incuba- = ção de microesfera usando o mesmo protocolo conforme previamente descrito, exceto u- sando o anticorpo de detecção de burro a 1:2.000 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 % e usan- do um anticorpo de detecção anti-humano somente para o controle positivo E25/Xolair (MSD delgG cabra antihumano SULFO-marcado Catitf R32AJ-5) 1:4.000 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %). Análise de dados: Dados brutos (Pixels) foram registrados, curvà padrão co- ! locada em gráfico (Log uman de concentração de IgE ng/mL vs. Log Pixels) e um ajuste da curva parâmetro 5 assimétrico aplicado. As concentrações IgE Log das amostras testes fo- ram previstas com relação à curva padrão e subsequentemente anti-log e multiplicadas por 200 para derivar as concentrações de IgE livre remanescente reais em ng/mL. Para cada amostra e controle, o % menor em níveis de IgE de humano foi calculado comparado com o . grupo controle apropriado e colocado em gráfico vs. IgE de humano (ng/mL) originalmente adicionado na amostra de soro, ambos eixos na escala Log, para gerar uma curva de titula- A: ção. ! Resultados ! Os resultados são sumarizados na tabela 5 a seguir. Mais especificamente e sur- º preendentemente, este estudo mostrou que uma combinação de conjugações Qpeta Amare- lo e Púrpura quando administrada por meio da via intramuscular a uma dose total de 25 mi- " crogramas do conjugado (isto é, 12,5 microgramas do conjugado individual) é É mais efetiva, | 20 efoimais efetiva do que usando qualquer peptídeo conjugado como único antígeno em do- : se dupla. Mostramos neste estudo que esta combinação induz uma resposta do anticorpo | com uma alta capacidade de ligar IgE livre, bem como, que esses anticorpos são capazes de reduzir níveis de IgE até 80 % dependendo da dose de desafio de IgE. Essas respostas do anticorpo não foram capazes de ligar IgE envolvido com o receptor e não causar desgra- . 25 —nulaçãode receptor que expressam célula alvos. Combinar o Qbeta com o Alume adjuvante | e CPG24555 (em que todas as ligações internucleotídeo do oligonucleotided são ligações | . de fosforotioato) foi altamente eficiente na indução dessas respostas do anticarpo. No geral, pode-se concluir que em termos de induzir IgG de anticorpo de camundongos com um forte capacidade de ligar IgE de humano livre, o peptídeo Amarelo é o peptídeo mais promissor — quando administrado individualmente ou em combinação com conjugados delpeptídeo Púr- pura ou Laranja, ou com conjugados de peptídeo tanto Púrpura quanto Laranja vacinados a alta dose e volume. Í | | | | , |

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; 107 ; N/A: Não aplicável ! É Dose de conjugação total é 25 microgramas, a menos que alta dose seja adminis- trada onde a dose total for 50 microgramas por injeção. ! Doses nos dias 0, 19, 34 Í Parceiro de conjugação = Qbeta VLP (partícula tipo Viral) | Adjuvante: 20 ug CPG 24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de fosforotioato). Alume = ALhydrogel"" a 20 % cadeias/cadeias : * n=1 corrida nas amostras agrupadas ! Exemplo 6 - Estudo de hiperimunização | Este estudo visou avaliar o efeito de uma tabela de imunização rápida para indução de anticorpos de alta afinidade contra IgE. Grupos de 8 camundongos fêmeas Balb/c (6-8 - semanas de idade) foram injetados intraperitonealmente e subcutaneamente om o peptí- deo conjugado com KLH (conforme detalhado anteriormente no Exemplo 4) nos dias 0, 3, 8 1 e 11. Foi usada uma combinação de CPG7909 e Alhydroge! (Alume 1,3 % a 20 % de cadei- as/cadeias)e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA) como adjuvantes neste estudo. Todos os peptídeos foram conjugados com KLH. Necropsia foi realizada no dia 22 e o sangue foi * coletado como no Exemplo 5. ! Respostas do anticorpo a partir de animais imunizados foram investigadas para u- " sar tanto em todos quanto em alguns dos seguintes ensaios: a) determinação do titulador de 1gG,b)ligação no soro IgE livre, c) ligação no IgE ligado no FceRlI, d) ensaio de desgranula- ção, e e) ensaios de quantificação de IgE. Todos os ensaios são descritos com detalhes com relação ao Exemplo 5. ! Resultados ! A Tabela 6 sumariza os dados do Exemplo 6. Tituladores totais neste estudo foram . 25 aproximadamente 10 vezes menos que em VRS-igE-008-003. Os dados a partir deste estu- do mostram que peptídeos Púrpura, Púrpura restrito, Amarelo e Laranja são imunogênicos. « Surpreendentemente, o peptídeo Azul foi um antígeno muito fraco, e limitação do peptídeo e aumento da solubilidade mostraram uma maior imunogenicidade, mostrando que este pepti- deo pode precisar ser restrito para apresentar imunogenicidade aceitável. | !

Í v | | | | sz Tabela 6 Sumário de dados do Exemplo 6 ! Titulador de IgG re- | Titulador % de ligação no Ccíproco média geo- | de liga- | Ligação de | IgE-FceRI * o desgra- métrica )JO95 % inter- | ção de | IgE máxima | (t desvio padrão) nulação . E , desvio padrão) valo de confiança) IgE [55 sra 5 rs Em ve Azul melho- : Púrpura Luto |ressrem casa ar [re aan facas ' * Mistura de ' Laranja, ' Amarelo, ' º Azul e Púr- : pura 1.665 (1.606 — 1.726) | 54* 18.349” 5 (0,7) 8 (+ 0,2) ' Controle de ? ' Dose de conjugação total é 25 microgramas por injeção Doses nos dias 0, 3, 8, 11 : Parceiro de conjugação = KLH | Adjuvante: 20 ug CPG 7.909 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de =“ fosforotioato), Alume = ALhydrogel"" a 20 % de cadeias/cadeias + IFA (adjuvante de Freund incompleto) r * n=1 corrida nas amostras agrupadas Exemplo 7 - Eficácia de peptídeos conjugados com KLH, HBsAg e Qbeta na res- posta do anticorpo de indução que pode se ligar na IgE de humano ' Este estudo visa avaliar como os peptídeos eficazes conjugados com KLH, HBsAg e Qbeta (como detalhado anteriormente nos Exemplos 2, 3 e 4) foram na indução de uma resposta do anticorpo que pode se ligar na IgE de humano.

Fêmeas Balb/c (6-8 semanas) foram injetadas pela via intramuscular (50 microlitros de volume injetados em cada qual músculo Tibialis anterior) nos dias O, 19 e 34. A necropsia ocorreu no dia 46. Na necropsia 400 — 600 microlitros de sangue foram amostrados de camundongos eutanizados por pun- ção cardíaca.

O sangue foi deixado coagular por toda a noite e no dia seguinte o soro foi coletado.

| | | | | | 109 | | Respostas do anticorpo de animais imunizados foram investigadas ed usando - tanto em todos quanto em alguns dos seguintes ensaios: a) determinação do titulador de | 1gG, b) ligação no soro IgE livre, c) ligação na IgE ligada no FceRI, d) ensaio de desgranuta- ção, e e) ensaios de quantificação de IgE.

Todos os ensaios são descritos com detalhes comrelaçãoaoExemplo5. Í Resultado | Este estudo mostrou que peptídeos púrpura e amarelo foram altamente lmunogêni- cos.

Conjugação do peptídeo púrpura com KLH, Qbeta e HBsAg permitiu a indução de altas respostas do anticorpo que foram capaz de ligar na IgE livre a um grau muito lato.

Essas respostas do anticorpo não foram capaz de ligar IgE envolvido com o receptor e pão causar desgranulação de receptor que expressam célula alvos.

Ambos adjuvantes (combinação de AbISCO e CPG 7909 e Alume) foram efetivos na indução altos níveis de respostas do anti- corpo. | ' | | | |

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Dose de conjugação total é 25 microgramas por injeção 7 Doses nos dias 0, 21 i Parceiro de conjugação = VLP de KLH, Q beta ou HBsAg ' ! Adjuvante: 20 ug CPG 24.555 (todas as ligações internucleotideo são ligações de fosforoticato)+ Alume = ALhydrogel'Y a 20 % cadeias/cadeias ou 12 ug ADISCO

Exemplo 8: Combinação de imunógenos de peptídeo em KLH '

Este estudo visa avaliar como eficaz uma combinação de peptídeos conjugados com KLH (como detalhada no anteriormente Exemplo 4) foi na indução de uma resposta do anticorpo que pode ligar na IgE de humano.

Fêmeas Balb/c (6-8 semanas) foram injetadas pelavia intramuscular (50 microlitros de volume injetados em cada músculo Tibialis anterior) nos dias O, 19 e 34. A necropsia ocorreu no dia 46. Na necropsia 400 — 600 microlitros de sangue foram amostrados de camundongos eutanizados por punção cardíaca. o sangue foi deixado coagular por toda a noite e no dia seguinte o soro foi coletado. '

Respostas do anticorpo de animais imunizados foram investigadas para usar tanto todos quanto alguns dos seguintes ensaios: a) determinação do titulador de 19G, b) ligação no soro IgE livre, c) ligação na IgE ligado no FceRI, d) ensaio de desgranulação, e e) ensai-

' os de quantificação de IgE.

Todos os ensaios são descritos com detalhes com relação ao Exemplo 5. !

. ' Resultado ;

Este estudo mostrou que uma combinação de Amarelo e Laranja, Azul e Púrpura,

- Amarelo e Púrpura é altamente imunogênica e induz respostas do anticorpo que pode for- mar ligação eficiente de IgE livre, apesar das baixas doses usadas neste estudo por causa de quantidade de peptídeos restrita disponível.

Essas respostas do anticorpo não foram ca- pazes de ligar IgE envolvida com o receptor e não causar desgranulação de receptor que expressam célula alvos. ;

Tabela 8 Sumário de dados do Exemplo 8

Média geométri- 1 Titulador de | ca do titulador de | Ligação de IgE |% de ligação | %de Degranula . IgG recípro- | ligação de IgE | máxima (t des- | na IgE-FceRI ção (+ desvio pa- confiança 95 %) drão) [Famastos Taz Tri mem Er mea ' Dose Amarela: 16 microgramas por dose 1 o A 113 | & ! | ' Dose Laranja: 20,3 microgramas por dose ! 7 Dose Azul: 0,5 microgramas por dose ' | Dose Púrpura: 25,3 microgramas por dose ! Doses nos dias 0, 21 ; Parceiro de conjugação = KLH ; Adjuvante: 12 ug ADISCO | Exemplo 9: Eficácia de vacina conjugada para quebrar tolerância in vivo (modelo animal) A capacidade de vacinas de peptídeo IgE para reduzir níveis de IgE in vivo é avali- | adaem modelos animais, usando espécie que expressam naturalmente níveis de IgE eleva- | dos (por exemplo, através de alergias) ou induzindo níveis de IgE experimentalmente eleva- | dos usando alérgenos modelo ou reais para imunizar animais.

Por exemplo, camundongos | são imunizados com ovalbumina sem endotoxina (OVA) como um modelo antígeno formula- | do com alume para induzir uma resposta IgE para OVA (referência de exemplo Lloyd Cetal, | dJ.

Imunol 2001, 166, p2033-2040). Pós-indução de respostas IgE, camundongos são vaci- ! nados com peptídeos antigênicos acoplados a carreador e formulados com adjuvantes.

Pep- : tídeos das regiões homólogas de camundongo IgE podem ser usados (em camundongos), | . em regiões homólogas de outra espécie em respectiva espécie animal, tem como os pepti- | . deos de IgE de humano para primatas não humano.

A eficácia de vacinações à níveis mais baixos de lgE pode então ser monitorada medindo-se os níveis de IgE em soro pré e pós j ã vacinação.

Além do mais, a capacidade dos peptídeos de diminuir respostas jinflamatórias | alérgicas pode ser monitorada os camundongos com OVA intra-nasal ou intratraqueal (por exemplo, durante 2-5 dias sequenciais) e avaliando a resposta inflamatória alérgica nos | pulmões contando a infiltração de subconjunto do leucócito nas amostras de lavagem do | pulmão e por avaliação histológica de recrutamento eosinófilo na parenquemia pulmonar Í bem como metaplasia da célula de goblet e produção de muco (por exemplo, Coyle Um. et | al, 1996 J.

Exp.

Med. 183, 1303-1310.). ! Exemplo 10: Eficácia e adequabilidade de peptídeos lineares restritos e quimica- ! ! mente conjugados com Qbeta ou HBsAg nos anticorpos de indução que podem lígar na IgE 1 dehumano | | Um dos desafios de usar peptídeos lineares pequenos como imunógenos para in- | duzir anti-respostas IgE é exatamente representar a estrutura secundária de IgE, garantindo | assim que anticorpos gerados pela vacinação de forma eficiente reconhece IgE circulante livre.

Limitação química para introduzir estrutura secundária adequada nas sequências de | aminoácidos parentais lineares pode fornecer imunógenos alternados para induzir respostas | | do anticorpo à IgE. ; Análise da estrutura tridimensional dos domínios Ce3Ce4 de IgE presente em PDB 1 |

114 | ; 1F6A (Garman et al, 2000 Nature 406: p259-266) revelou que algumas das sequências al- 7 vos na interface entre Ce3Cre4 e o receptor FceRI adotam arranjos não lineares que podem não ser bem representados pelas sequências lineares detalhadas na tabela 9. Portanto, fo- ram identificadas sequências que foram candidatas a limitação química em uma tentativa de avaliara capacidade de peptídeos restritos para induzir anticorpos anti-lgE (após adminis- tração in vivo) detectável em um Ensaio de ligação de IgE livre.

Variantes tanto das sequências Amarelas (SEQ ID NO: 220) quanto Laranjas + Cyst (SEQ ID NO: 436) foram separadamente limitadas por dois diferentes métodos: um método envolvido no uso de composição química tipo Click para introduzir uma fração de triazol através de dois átomos adjacentes da sequência de peptídeo.

O grau de restrição exertado na sequência de peptídeo por este método pode ser ajustado pela adição de gru- pos metileno para a fração de triazol (Laranja046, Laranja047, Amarelo043, Amarelo044 foram produzidos por este método). O segundo método envolveu ciclagem por meio do efei- | to de formação de gabarito de uma unidade de Diprolina heteroquiral (D-Pro-L:Pro) que foi notado na literatura ter potencial de indução da volta por B (Spath et a/, 1998, Helvetica Chimica Acta 81, p1726-1738); (Laranja044, Laranja045, Amarelo040, Amarelo041, Amare- : l0042 foram produzidos por este método). Estruturas químicas desses peptídeos restritos . são exibidas na Tabela 9. ; . Diversos estudos foram realizados para avaliar de IgE anti-humano respostas imu- nes tanto por peptídeos lineares quanto restritos de diferentes comprimentos conjugados . com HBsAg e Qbeta (conjugações as detalhada nos Exemplos 2 e 3). | Os peptídeos restritos Laranja + Cyst (SEQ ID No: 436), Amarelo (sEQ ID No: 220), Laranja044, Laranja045, Laranja046, Laranja047, Amarelo040, Amareló041, Amare- 10042, Amarelo043 e Amarelo044 foram conjugados com partículas tipo vírus Qbeta usando composição química de hexanoato de succinimidil-6-[&-maleimidopropionamido] (SMPH) a 1,5 X molar excesso e usada como imunógenos em camundongos.

Fêmeas Balb/c (6-8 se- manas) foram injetadas pela via intramuscular (50 ul injetados em cada músculo Tibialis anterior) com antígeno e Alhydrogel mais CpG-24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de fosforoticato) adjuvantes nos dias da maneira descrita a seguir na Tabela 9. Soro preparado | semana depois da intensificação final foi testado para atividade de anti- corpo anti-lgE no ensaio de ligação de IgE da maneira descrita no Exemplo 5. , Resultados ' Os estudos sumarizados na Tabela 9 mostraram que peptídeos lineares derivados de peptídeos púrpura, laranja e amarelo conjugados com Qbeta e HBsAg e distribuídos com os adjuvantes Alhydrogel e CpG24555 combinados induziram respostas do anticorpo que foram capazes de liga à IgE livre. ': Adicionalmente, peptídeo imunógenos mais restritos induziram antissoros capazes | | |

115 | de ligar IgE de humano livre.

Azul 003, 004 e 005 surpreendentemente induziram somente ; . respostas anti-lgE.

Laranja 047 e Laranja 048 não induziram anticorpos anti-IgE acima dos | níveis do patamar.

Tabela 9 Sumário de dados do Exemplo 10 Sequência Ligação de IgE máxima Média (+

Ca e o ame OO ' |

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FETO ' ” - Psrovricac o co-RactncRodaha ; " Às RTTZ7 AMARELO 041 55855 (+ 19382) eh

118 | oTenccaeçã - so.

A. / AMARELO 042 31595 (+ 9368) oh K A ÃO ( | o quatro ani 4: ; | nos) — " i AMARELO 043 19465 (+ 14660) = o x Taim do Lanna AMARELO 044 11435 (+ 8674) : Re ss i + HNOSR| E | | | | | | | | o cc Sr Õ gzxsgggaÚÕ%4205)%=2"AYu =A0AAHSAAÃAY2 ass. —itids?”asisaismaaa saastai cr 0" PPT a 119 TRKEEKQRNGTLTVTSggc" LARANJA 033 9.604 (+ 4.122) . RKEEKQRNGTLTVTggoc" LARANJA 034 9.805 (+ 5.228) , KEEKQRNGTLTVggc" LARANJA 035 7.339 (2 2.516) EEKQRNGTLTago" LARANJA 036 9.965 (+ 5.327) ! EKORNGTLggc LARANJA 037 4.607 (+ 332) | cggTrRKEEKORNGTLTVTS" LARANJA 039 7214 (1 1.842) cggRKEEKARNGTLTVTA LARANJA 040 6.500 (22.302) cggKEEKQRNGTLTVA LARANJA 041 6.973 (4 2.437) cggeEEKQRNGTLTA LARANJA 042 8.758 (+ 3.602) Cyc-STRKEEKQRNGTLTVTSTLPC-DPro-LPro LARANJA 044 | no o "A 7 o dee : o N LARANJA 045 5.826 (+ 2.164) ” sw | TV No | õ E-K-=Q-R=N=G=T—L—T—dProfine o. o SA LARANJA 046 7.991 (44.270) , s Y om ' º O To RN=G6T- Na, e... mo LARANJA 047 2.528 (+ 656) . H H . Ns º% are À | : HNoENT Tr Ns LARANJA 048 2.506 (+ 515)

PER =N | LVVDLAPSKGTVNggc"* AZUL 003 4.684 (£ 796) cagL VVDLAPSKGTVN'* AZUL -004 8.010 (2 6.572) cggGGSDLAPSKGTVSGGggc"" AZUL -005 3777(2525) NAEDOEVIS | 1555TESA) NA NAKED Qb-VLP 3.779 (4 403) NAREDTSSAS | STATEAS Dose conjugada total é 25 microgramas por injeção administradas duas vezes pela via intramuscular em camundongos fêmeas BALB/c nos dias O e 14 exceto os grupos mar- cados por * que foram dosados com uma dose de conjugação de 50 microgrâmas e grupos marcados com º que foram dosados 3 vezes nos dias O, 14, e 28. Os peptídeos restritos e a

: grupos marcados com ** foram dosados 3 vezes nos dias 0, 21 e 42. s Parceiro de conjugação = VLP Q beta ou HBsAg (marcados com **) ' Adjuvante: 20 ug de CPG 24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de fosforotioato) + Alhydrogel'” a cadeias/cadeias 20 % ' ND = Não feito | Nota — c, cgg, gcc, cdddd e kgg são ligantes adicionados nas sequências de peptí- deo IgE com propósitos de conjugação.

Exemplo 11: Eficácia de peptídeos conjugados com Qbeta, HBsAg e DT na indução de resposta do anticorpo que pode ligar à IgE de humano Este estudo visa avaliar como os peptídeos conjugados eficazes com uma varieda- de de carreadores tais como DT, CRM197, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, HB- | sAg e Qbeta (da maneira detalhada anteriormente nos Exemplos ) foram na indução de uma resposta do anticorpo que pode se ligar a IgE de humano.

Para a geração de DT, toxóide | diftperico conjugado (concentração 3 mg/mL) foi derivatizado com hexanoato de succinimi- | 15 dil-6-[R-maleimidopropionamido] (SMPH, Thermo Fisher Scientific Inc) a um excesso molar 10 vezes.

Depois desta etapa de ativação, excesso de reagente SMPH foi removido usando . uma coluna de dessalgadura NAP-25 (GE Healthcare) em Salina Tamponada com Fosfato Dulbeccos (DPBS) com EDTA 5 mM.

Sólido de peptídeo liofilizado foi então adicionado dire- | - ? tamente no toxóide ditérico ativado por malemida e incubado com mistura suave por 90 mi- nutos, Depois do que, a amostra foi aplicada a uma coluna de dessalgadura NAP-25 (GE o.

Healthcare) e eluída em Saline Tamponada com Fosfato Dulbeccos (DPBS) para remover peptídeo livre.

Depois disso, a solução da proteína foi concentrada usando microconcentra- dores centrífugos 10kD e esterilizada usando um filtro de 0,22 um e mantida a -80 ºC até o uso.

Os conjugados Qb-peptídeo e HbsAg-peptídeo foram produzidos como a seguir: VLPs (tanto OB quanto HBsAg) foram ativadas usando reagente de ligação éster N-gama- maleimido-butirilóxi-succinimida — (GMBS) ou hexanoato de succinimidil-6-[&- maleimidopropionamido] (SMPH) ambos foram obtidos pela Thermo Fisher Scientific Inc.

O reagente GMBS ou SMPH foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) e adicionado na solução de VLP a um molar excesso 25 vezes.

A reação de ativação prosseguiu natural- mente por>30 minutos e a solução foi então dessalgada usando uma coluna de dessalga- dura NAP-25 (GE Healthcare) em Salina Tamponada com Fosfato Dulbeccos (DPBS) com EDTA 5 mM.

Depois disso, uma quantidade apropriada de peptídeo liofilizado sólido foi adi- cionada diretamente na VLP ativada com maleimida e a reação entre as VLPs e os peptí- deos prosseguiu naturalmente por pelo menos trinta minutos com mistura muito suave.

No finaldotempo de reação cada amostra foi dessalgada em Dulbeccos PBS (DPBS) usando colunas de dessalgadura NAP-25 (GE Healthcare). Os peptídeos conjugados dessalgados foram analisados para teor de proteína usando o ensaio Bradford (Coomassie Brilliant Blue, i

121 Í 1 Ú Thermo Fisher Scientific Inc.) ou o Ensaio BCA Proteína (bicinchoninic acid, Thêmo Fisher : Scientific Inc.) bem como por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. Fêmeas Balb/c (6-8 semanas) foram injetadas pela via intramuscular (50 uL injeta- dos em cada músculo Tibialis anterior) com peptídeos conjugados com Qbeta, antígeno da superfície da hepatite B (HBsAg) ou toxóide diftérico (DT) com Alhydrogel mais adjuvantes CpG nos dias 0, 19 e 34 da maneira descrita a seguir na Tabela 10. Soros preparados 1 | semana depois da intensificação final foram testados para atividade do anticorpo anti-IlgE no ensaio de ligação de IgE da maneira descrita no Exemplo 5, Respostas são mbstradas na Tabela 10. : Resultados ' Este estudo (Tabela 10) mostrou que peptídeos PÚRPURA 001 e AMARELO 001 | (sequências mostradas na tabela 9) podem induzir anticorpo IgE anti-humano quando con- | jugados com DT, Qbeta ou HBsAg. Anticorpos IgE anti-humano foram induzidos usando | tanto o ligante GMBS quanto o ligante SMPH. | | Tabela 10. Sumário de dados do Exemplo 11 ; | ' . | Densidade do epí- | 1 | . Dose conju- Ligação de IgE Í topo (peptídeo por 2 a Peptídeo Ag + Carreador gada total máxima Média monômero ou e- Í . " (micrograma) À (Desvio padrão) - quivalente) AMARELO 001 VLP Qbeta | | 50 5,421 (t+ 624) Í . (GMBS) | PURPURA 001 VLP Qbeta i 50 -o,5 4.465 (+ 199) (GMBS) ; AMARELO 001 VLP Qbeta '

13.792 (t 5.544) (SMPH) 1 |

L AMARELO 001 VLP Qbeta 37.108) (t+ (SMPH) 13.782) í AMARELO 001 VLP Qbeta i >1,5 37.742 (+ 7.018) (SMPH) | AMARELO 001 VLP Qbeta 34.802, (£ 50 >1,5 À (SMPH) 13.636) PURPURA 001 VLP Qbeta 50 -0,5 10.653/(+ 2.915) (SMPH) PURPURA 001 VLP Qbeta 10 í. (+ (SMPH) ' 10.133) PURPURA 001 VLP Qbeta 15 27.517; (+ (SMPH) ' 13.701) 1 | | |

] PÚRPURA 001 VLP Qbeta 50 >1,5 27.898 (+ 8.203) a nenceno | AMARELO 007 HBSAG (SMPH) 15 jets | 134194677) | [PRESTAR ERA E eeaTA] omunónenêntv O e uso

14.412) [FORPOREON RSRSRS o masa [FERE IC eae “ Camundongos fêmeas BALB/c foram imunizados nos dias O e 14. Soro foi coletado . e analisado no dia 21. Parceiro de conjugação = VLP Q beta, DT ou HBsAg (como pela tabela anterior) | | " usando tanto SMPH quanto GMBS conforme esboçado anteriormente na Tabela. Adjuvante: 20 ug CPG 24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de 1 : fosforoticato) + Alhydrogel"“ a 20 % de cadeias/cadeias

SS. oABSGiGmeinaiccasçeeEá;rnaan“rAMETH 1 123 | 1 | " a A SO : SERRO | & "e h e 8 els = si S/s Ss =| El El sl ' Se Ss la les 2 /S 8 CW A 8 Z 8 E SH ESPEREC: o [2 o Rn 5 2 s 38os Flw Ts CS =) =) 8 = E 87 ,QE|B|S eis le 2) 2/3 3. E FS FE o o|S|S lo Z = =) E 2 5a 8 38 8 | os 8º ” S v e TF

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| | 125 ' | Dosagem de camundongos fêmeas BALB/c a cada 4 semanas a w O, 4, 8. Amostras | tiradas para testar 7 dias após 2º e 3º dose. '; | A dose de Alhydrogel igual à dose de vacina conforme anteriormente ; CpG-24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de fosforotidato) foi do- sadoa100microgramas ! A atividade de depleção de IgE foi testada usando 1.000ng/mL de IgE de humano contaminado em soro de BALB/c normal (ver Exemplo 5 com detalhes). : Exemplo 12: Eficácia de uma combinação de peptídeos é maior com o uso de pep- tídeos simples conjugados com Qbeta na indução de respostas do anticorpo que pode se | ligaralgEde humano | Diversos estudos avaliaram como os peptídeos conjugados com Qbeta (da maneira | detalhada anteriormente nos Exemplos) foram na indução de uma resposta do anticorpo que pode se ligar a IgE de humano foram realizados.

Fêmeas Balb/c (6-8 semanas) foram imu- nizados pela via intramuscular da maneira descrita no Exemplo 5, com detalhes de sincro- —nismo específico da maneira indicada nas tabelas.

Respostas anti-lgE, ativídade de indução de desgranulação e atividade de depleção de IgE foram medidos da maneira detalhada no Exemplo 5. | Resultado : Conforme mostrado na Tabela 11, conjugação dos peptídeos (ver sequências na tabela9)com respostas do anticorpo induzidas por Qbeta que foram capazes de ligar à IgE livre sem causar desgranulação acima do valor de controle.

Usar Alhydrogel como adjuvante simples é efetivo e uma combinação de peptídeo púrpuras e peptídeos amarelos induziu maior ligação de respostas a IgE do anticorpo.

Além disso, a combinação de peptídeos in- duziu respostas do anticorpo que foram mais potentes na ligação e depleção de IgE.

Adição de CPG 24555 na formulação de Alhydrogel aumentou as respostas anti-lgE do anticorpo adicionalmente sem induzir atividade de desgranulação. ; Exemplo 13: Indução de respostas anti auto IgE por um homólogo de murino de PÚRPURA 001 e AMARELO 001 ! A capacidade de vacinas de peptídeo induzir anticorpos IgG anti auto IgE e reduzir — níveisde lgE in vivo foi avaliada em camundongos com níveis de IgE elevados (induzidos por pré-imunização com ovalbumina sem endotoxina (OVA) como um modelo antígeno for- mulado com alume - referência do exemplo Lloyd C et al, J.

Imuno! 2001, 166, p2033-2040). Pós-indução de respostas anti-OVA IgE, os camundongos foram vacinados com peptídeos antigênicos acoplados a carreador de Qbeta e formuladas com adjuvantes.

Peptídeos de regiões homólogas de IgE de camundongo foram usados (murino amarelo 001 = QCIVDHPDFPKPIVRS(SEQ ID NO: 458); murino púrpura001 = PDHEPRGVITYLIPPSPC (SEQ ID NO: 459)). A eficácia de vacinações a níveis mais baixos de IgE fi monitorada | medindo-se níveis de IgE anti-OVA em soro pré- e pós-vacinação. a) Ensaio de quantificação de IgE específico de ovalbumina Sumário: Um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) que determina uma con- centração de IgE de murino específico de OVA. Um anticorpo monoclonal de IgÉ específico de OVA (AbD Serotec Cati?! PMP68) foi usado como um controle positivo, com diluições ve log de 12 pontos quantitativos destes padrões (contaminado em uma concentração superior de 30 ug/mL em soro de Balb/c neg paela Harlan Labs (agrupados a partir de 400 animais Harlan laboratories Codett R-0131D) testadas em cada ensaio. Este soro normal agrupado foi também usado sozinho como um controle negativo. Revestimento de placas de ensaio: placas de ensaio de 384 poços (Meso-Scale Diagnostics (MSD) standard bind Gatt LI11XA- 1, 0370PA) foram revestidas com 12 ul/poço de Rato pAb para IgE de camundongo - Invi- trogen Catft 04700 diluídos em 15 ug/ml com PBS 0,01 M pH7,4, em seguida incubadas em um agitador à RT por 2 horas. Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4, as placas foram bloqueadas usando 25 ul/poço de tampão de bloqueio de partida Pierce (Pierce Biotech. Catft37538)eincubadas em um agitador a RT por 40 minutos, antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4. Preparação e ensaio da amostra: Cada amostra de soro foi diluída 1 em 200 e 1 em 500 (PBS 0,01 M pH 7,4/diluente de BSA 1 %) e 12 ul de cada diluição adicionada, em triplicata, para as placas MSD revestidas, com diluições de padrão testado em paralelo. Depois da incubação em um agitador a RT por 2 horas, as placas fo- ram lavadas 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %. Adicionada detecção de 12 ulL/poço, Ovalbumina SULFO marcada, 1:300 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %, em segui- da incubadas agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M o 7 ATween 20 0,05 % adicionados tampão de leitura MSD 50 ul/poço T (4 x) com agente tensoativo (MSD Catft R92TC) 1:2 com água MQ. As placas foram lidas usando um MSD Sector Ima- —ger6000.Análisede dados: Dados brutos (Pixels) foram registrados, curva padrão colocada em gráfico (concentração Log de IgE de camundongo anti-OVA ng/mL vs. Log Pixels) e um ajuste curva parâmetro 5 assimétrico aplicado. Concentrações de IgE Log das amostras tes- tes foram previstas a partir da curva padrão e subsequentemente anti-logadas e multiplica- das por 200 ou 500 para derivar as concentrações de IgE reais em ng/mL. b) Determinação do titulador de IgG total de IgE anti murino Sumário: Um ELISA calorimétrico que gera um titulador recíproco (RT) para repre- sentar os níveis de moléculas de IgG total que são específicas para IgE de marido. Diluições em série foram preparadas a partir das amostras de soro e testadas no ensaio. Rato pAb para IgE de camundongo - Invitrogen Catit? 04700 pico no soro de Balb/c neg pela Harlan Labsa10 ug/mL e titulados em uma diluição em série semi log de 8 pontos foi usada como controle positivo. Soro de Balb/c neg from Harlan Labs foi usada como controle negativo (agrupados a partir de 400 animais Harlan laboratories Codeft R-0131D) junto com uma a-

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127 — mostra agrupada do grupo negativo de estudo (tratados mesmo como amostrds). Revesti- mento de placas de ensaio: placas de ensaio de alta ligação de 384 poços (Corning Interna- tional Cattt3700) foram revestidas com IgE de camundongo 25 ylL/poço para stens de OVA (ADD Serotec Catit PMP638) diluídos em 5 ug/mL com PBS 0,01 M pH 7,4 é incubados emum agitador a RT por 2 horas. Depois de lavar 2 x com PBS pH 7,4, às placas foram bloqueadas usando 80 ul/poço de PBS 0,01 M/BSA 1 %, incubadas a RT por 1 hora antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, Preparação e ensaio da amostra: Uma diluição em série 1/10 de 8 pontos de cada amostra foi preparada come- cando em diluição 1:10 (diluente de PBS/ BSA 1 %), diluição em série 25 ul/podo transferi- — dos em duplicata nas placa revestidas com IgE de camundongo em seguida incubados agi- tando a RT por 1,5 hora. Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween eo 0,05 %, anticorpo de detecção de IgG total 25 Hl/poço foram adicionados (coelho anti-mu IgG-Fc, Catft A90-130A Betil Laboratories) 1:6000 com PBS 0,01 M pH 7,4/BSA 1 %, dm seguida incubados agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar 5 x com PBS 0,01 M pH 7,AMTween 20 0,05%, adicionado 25 ul/poço de conjugado de peroxidase de rábano silvestre cabra anti- coelho do estojo Bio-Rad (Bio-Rad Catit172 -1019) 1:3000 com PBS 0,01 M pH|7,4/Tween 0,05 % pH 7,4, em seguida incubados agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar x 4 com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 % então 1 x com PBS 0,01 M pH 7,4 somente, 25 ul/poço de Mouse Tiper HRP Substrate (Bio-Rad Catft172 -1064) foram adicionados, em 20 seguida incubada a RT por 30 minutos antes da adição de 25 ul/poço de ácido dxálico 2% para interromper a reação e lendo a absorbância a 405 nm. Análise de gados: curvas de titulação foram colocadas em gráfico para cada amostra teste (titulador de amostra vs Abs 405 nm) e o titulador de amostra (subsequentemente transformado no titulador retiproco) foi previsto com relação a um valor de corte de OD 1. Resultado Dois estudos (Tabela 12) mostraram que uma combinação do homólogo|de murino de Amarelo 001 (mAmarelo-001 = QCIVDHPDFPKPIVRS (SEQ ID NO: 458)) e o) homólogo | de murino de Púrpura 001 (mpúrpura-001 = PDHEPRGVITYLIPPSPC (SEQ 1D |NO: 459)) pode induzir respostas do anticorpo anti-self IgE que pode formar níveis endógenos mais baixos eficientes de IgE (comparado com níveis em controles imunizados de vlP Qbeta). Prova de mecanismo foi consequentemente obtida mostrando que um peptídeo o conju- gado pode quebrar a tolerância da célula B com a molécula de IgE endógena e que isto se | correlaciona com uma redução nos níveis endógenos de IgE. Tabela 12. Sumário de dados do Exemplo 13 Titulador recíproco de IgE IgE específico dê ovalbu- IgG anti camundongo (inter- | mina total (ngm), (Desvio valo de confiança 95 %) após | padrão)) após 3 vacina-

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" RN e o. | : | E es TR 2 mpúrpura-001 e mAmarelo- : As eseeematenm o) | mpúrpura-001 e mAmarelo- Í

T Camundongos BALB/c foram sensibilizados com ovalbumina nas semanas veta altos níveis endógenos de IgE. | Camundongos foram vacinados com 200 microgramas de combinação de púrpura 001 murino e amarelo 001 (isto é, 100 microgramas cada) nas semanas 3, 7 ê 11, e testa- dos1 semana após a 3º imunização. Í Parceiro de conjugação = VLP Q beta usando SMPH. | | Adjuvante: 20 ug CPG 24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de | « fosforotioato) + Alhydrogel"" a 20 % cadeias/cadeias í ND = não feito | Exemplo 14: Vacinação de macaco cinomolgo com púrpura 014 e tanto amarelo CU 001 quanto amarelo 014 | A capacidade de vacinas de peptídeo IgE humano para quebrar tolelância contra | self IgE in vivo foi avaliada em macacos cinomolgo vacinadas com peptídeos antigênicos acoplados a carreador (VLP Q beta) e formuladas com adjuvantes. Peptídeos de IgE de humano foram usados. A eficácia de vacinações na indução respostas imunes de anti auto IgE foi então monitorada medindo-se níveis de IgG anti-|lgE em soros pré e pós vacinação. Ensaio de macaco cinomolgo ! a) Determinação do titulador de IgG total para IgG específico para os Seguintes an- tígenos/VLP: domínio Ce2-Ce4 de IgE de macaco cinomolgo, domínio Ce3C64 de IgE de humano, peptídeos individuais (amarelo e púrpura) conjugados com KLH, e com Qbeta. Sumário: Um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) que gera um titulador re- cíproco (RT) para representar os níveis de moléculas de IgG total que são específicos para BR a vacina ou VLP. Diluições em série foram preparadas a partir de amostras de soro e testa- : das no ensaio. Soro contaminado de macaco cinomolgo com anticorpo monoclonal anti-lgE - 25 humanizado (E25, Xolair) foi usado a 40 ug/ml como um controle positivo. Soro de macacos cinomolgo sem contaminação usado como um controle negativo. Revestimento de placas de ensaio: placas de ensaio de 384 poços (Meso-Scale Diagnostics (MSD) revestidas com es- treptavidina Cat L21SA-1) foram revestidas com 12 ul/poço de IgE Ce2-Ce4 de macaco cinomolgo ou IgE Ce3Ce4 de humano biotinilados diluídos em 1 ug/mL com PBS 0,01 M pH ! Ú |

129 . | 7,4/BSA 1 %. As placas de ensaio de 384 poços (Meso-Scale Diagnostics (MSD) standard 2 bind Cattt L11XA-1, 0370PA) foram revestidas com 12 ul/poço de peptídeo individual (con- jugado com KLH) diluídos em 1 ug/mL ou Qbeta diluído em 2-5 ug/ml com PBs 0,01 M pH 7,4 (no BSA). As placas foram em seguida incubadas em um agitador a RT por 1 hora. De- poisdelavar3xcom PBS 0,01M pH 7,4, as placas foram bloqueadas usando 25 ul/poço de tampão de bloqueio de partida Pierce (Pierce Biotech. Catft 37538) e incubadas em um agitador a RT por 40 minutos, antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 m pH 7,4. Pre- paração e ensaio da amostra: Uma diluição em série 7/2 log de 8 pontos de tada amostra incluindo controles foi preparada começando em diluição 1:20 (diluente de PBS/ BSA 1 %), 12 ul/poço da diluição em série foram transferidos nos poços de placas revestidas com o antígeno teste/VLP em seguida incubados agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, proteina G SULFO-marcada diluída em 0,02ug/mL (diluente de PBS/ BSA 1 %) foi adicionada nas placas (12 uL/poço). As placas foram incubadas com agitação a RT por 1 hora em seguida lavadas 3 x com PBS 0,01 M pH | 15 7,4/Tween 20 0,05 %. 50 ul/poço de tampão de leitura MSD T (4 x) com agente tensoativo (MSD Cattt R92TC) 1:2 com Água MQ foram adicionados. As pacas foram lidas usando um " MSD Sector Imager 6000. Análise de dados: Curvas de titulação foram colocadbs em gráfico para cada amostra teste (titulador de amostra vs Pixels) e o titulador de amostra (subse- - quentemente transformado em titulador recíproco) foi previsto com relação 1 um valor de corte(Pixeis).

- b) Ensaio de Avidez do Anticorpo de Macacos cinomolgos | Sumário: Um ELISA calorimétrico que gera um Índice de Avidez (Al) para represen- tar a intensidade da ligação de moléculas de IgG total que são específicas para Ce3Ce4 hu- mano. O anticorpo anti-!gE humanizado Xolair (E25) foi contaminado em um soro de maca- co cinomolgo agrupado (preparado pelo grupo controle Qb-VLP deste estudo) a40e4s ug/mL e titulado em uma diluição em série semi log de 12 pontos como controle positivo. Soro de macaco cinomolgo do grupo Qb-VLP de estudo foi usado como controle negativo junto com soro de macaco cinomolgo comercial. Revestimento de placas de ebsaio: Placas de 384 poços HBC Clear revestidas com Estreptavidina Reacti-Bind"" com tampão de blo- —queio SuperBlock (Fisher Scientific Co Ltd PI15504) foram revestidas com 12 ul/poço de Ce3Ce4 humano biotinilado a 1 ug/mL em PBS 0,01 M pH 7,4 e incubadas em um agitador a RT por 1 hora. Depois de lavar 3 x com PBS pH 7,4, as placas foram bloqueadas usando 25 - ul/poço de PBS 0,01 M/BSA 1 %, incubadas a RT por 40 minutos antes de uma lavagem final 3 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %. Preparação e ensaio da; amostra: As —amostrasforam diluídas com PBS 0,01 M/BSA 1 %. Cada amostra teve uma curva de titula- ção gerada e desta curva um valor pixel de 180.000 foi usada para calcular uma diluição do titulador recíproco individual (RT) para uso para cada amostra. Este RT foi esto para diluir | | AA A A 1,

| | | 130 ! | cada amostra para garantir que níveis de anticorpos similares de cada amostra fossem usa- - dos no ensaio de avidez. 12 ul de cada amostra diluída foram adicionados a 4 poços das placas de 384 poços revestidas e incubadas agitando a RT por 1 hora. Depois de lavar 5 x com PBS 0,01 M pH 7,4/Tween 20 0,05 %, tiocianato de amônio foi adicionado na placa em concentrações diferentes a 12 ul/poço em seguida incubado agitando por 15 minutos aRT. (12 concentrações de tiocianato de amônio foram usadas: 12, 10, 8,7,6,5, 4/3, 2,1,05e O M foram adicionados nas amostras duplicadas). Depois de lavar x 4 com PÉS 0,01 M pH 7, ATween 20 0,05 %, 12 ul/poço de IgG de camundongo anti-humano HRP-marcado (Sou- thern Biotech 9042-05) com PBS 0,01 M/BSA 1 % foram adicionados, em seguida incuba- dos agitandoa RT por 1 hora. Depois de lavar 5 x com PBS 0,01 M pH 7,4Mheen 20 0,05 %, 25 ul/poço de substrato de TMB (Sigma P-8665) foram adicionados, em seguida incuba- dos a RT no escuro por 30 minutos. Para interromper a reação, 25 ul/poço de ácido oxálico 2 % foram adicionados e as placas lidas a Abs 450 nm. Análise de dados: % de redução para cada amostra para cada concentração de tiocianato de amônio foi calculada usando a média Abs 405 nm para amostras de tiocianato de amônio O M como redução de O %. As Curvas de titulação foram então colocadas em gráfico para cada amostra teste (% de redu- “ ção vs Abs 450 nm) e o Al foi previsto com relação a um valor de corte de 50 %| redução. Resultado: ! | - Este estudo (Tabela 13) mostrou que uma combinação do Amarelo oo ou Amare- —lo014 com Púrpura 014 (ver sequência na tabela 9) é anti auto IgE imunogênica e induzida | - (Macaco cinomolgo) e respostas de anticorpo de IgE anti-humano que se cortelacionaram com respostas dos peptídeos específicos. Adicionalmente; ele mostra que avidez das res- postas do anticorpo pode ser aumentada por dosagem repetida no macaco cinofnoigo. Tabela 13. Sumário de dados do Exemplo 14 1 Titulador “de| Ss Titulador e . Titulador — de | Titulador de IgG | IgG recípro |. IgG recíproco , , Índice — de IgG recíproco | recíproco para | co para E BR para IgE de B Na >, avidez , para sequência | sequência Púr- | de humano cinomolgo . . | (média e . Amarela (inter- | pura (intervalo | (interva , (intervalo de h desvio valo de confi- | de confiança 95 | lo de confi- confiança 95 o o | padrão) % ança 95 %) %) an | ça 95 %) 7" Amarelo-001 + Púrpura-014 1,693 (+ . 20 400 (203-786) | 588(313-1.106) | 20 2 wks pós dose 1 | 0,05636) - Amarelo-001 + Púrpura-014 840 — (374-|2013 (1052-|2.145 (1.469-| 1521 (641-/5191 (E 2 wks pós dose 2 1888) 3855) 3.133) 3.610) Í 1,305) Amarelo-001 + Púrpura-014 1.189 (170- [1.716 (1213-|2125 (1.706-|1.802 (980- | 6,757 (É 2 wks pós dose 3 3.507) 2.429) 2.647) 3316) | | 08725) Amarelo-014 + Púrpura-014 : í imarelo-014 + Púrpura 22 (16-32) 400 (203-786) | 588(313-1.106) 20 | 1,698 (E 2 wks pós dose 1 0,05636) |

Í o 1

| US : 2 EEE E e e ERES . 2 wks pós dose 2 1.505) 2.819) 1,305) " controle de Qbeta [pras pencem sans O [ane ane e controle de Qbeta mem fes fas fre e controle de Qbeta ms eee fees faso Te e Macacos cinomolgos foram vacinados com 600 microgramas da combinação de púrpura 014 e amarelo 001 ou amarelo 014 (isto é, 300 microgramas cada) nas semanas O, 4 e 8, e testados na semana 12, | Parceiro de conjugação = VLP Q beta usando SMPH. | Adjuvante: 500 ug CPG 24555 (todas as ligações internucleotídeo são ligações de fosforotioato) + Alhydrogel"" a 600 microgramas. ! ND = não feito '

TT TSTAGEMDE SEQUENCIA % o - SEQ ID NO: 1 STRKEEKQRNGTLTVTSTLP | o SEQIDNO:2º— TRKEEKORNGTLTVTSTLP Í “SEQIDNO:3 —RKEEKORNGTLIVISTLP | . SEQIDNO4 KEEKORNGTETVISTER ||| TO SEQIDNO:5 EEKORNGTLIvrsnzaph — O SEQ ID NO: 6 EKQRNGTLTVTSTLP : SEQIDNO7 KORNGTLIVISTER |V SEQDNOS GRNGTLIVISTER ||ÀúÚÀÀÀÀ SEQIDNO:9 RNGTLÇIyISTIIP.——— “— Zd>AAAAaaínnrcOAoz*“ | SEQIDNO: 10 NGTLIVISTIP. = — g Ó CEQIDNOIT GMIVISTER ||| li II SEQIDNO: 12 TLTVTSTLp — smnar:xBBt"*"iÉ):SM5 SEQIDNO: 13. LTVTSTLP ; ” SEQIDNO: 14 TVTSTLP i SEQIDNO: 15" VITSTLP ” SEQIDNO: 16 TSTEP À TA SEQ ID NO: 17º STLP ' SEQIDNO: 18 STRKEERORNGTLTVISTE MMA SEQIDNO: 19 TRREERGRNGTEIVISTE |||||||||ÀÀÀÀÀúXúhúhM SEQIDNO:20 RKEEKORNGTLTVTSTL ' | ) |

| 132 2 | ; SEGIDNO: 27 REEKORNGTITVISTE | — — s SEQIDNO:22 EEKORNGTLIVISTE ||| SEQIDNO 23 ERORNGTEIVASTE ||| SEQIDNO: 24 KORNGTLTVISTL | SEQIDNO:25 QRNGTLTVTSTL CEQIDNO:268 RNGTLIVISTE ||| SEQIDNO:27 NGTLIVISTE |U IA SEQIDNO:28 GTLIVISTE |Ú|ÀÀ A SEQGIDNO: 20 TEIVISTE ||| MM AA SEQIDNO: 30 LTVISTL H SEQIDNOT TVISTE ||| MM FF SEQIDNO:32 VESTE ||| NET=(e E [o ENXTo Ec x IIS 1) [NS SEQIDNO:34 STRKEEKARNGTLIVIST ||| | « SEQIDNO:36 RKEEKORNGTLTVTST Í - SEQIDNO:37 KEEKRORNGTETVAST ||| . SEQIDNO:38 EERGRNGTETVIST ||| Ú SEQMNO 3 EKORNGTLIVEST ||| SEQIDNO:40 KORNGTLIVIST ||| SEQIDNO 47 QGRNGTLTIVEST ||| Aq SEQIDNO: 42 RNGTLTVTST Í SEQIDNO:48 NGTLIVIST À SEQIDNO: 44 GTLTVTST i BEQIDNO AS TEIVESP | SEQIDNO 46 LIVIST|ÚÂÀ|ÀÚÀW o

SEQIDNO A IVISTOMM A SEQIDNO:48 VTST | SEQIDNO:4 STRREEKARNGTETVES ||| mm SEGIDNO:50 TRREERORNGTOIVAS | —— q — CEQIDNO:ST RREERORNGTETVES |||/||||||||llúlúlúlhlNlNlNN : SEQIDNO:52 KEEKQORNGTLIVIS || SEQIDNO: 58325 EEKORNGTLTVTS SEQIDNO: 54º EKORNGTLTVTS Í SEQIDNO:55 KARNGTLIVES ||| AA SEQIDNO: 56º ORNGTLTVTS a a —— | |

133 : i CSEQIDNO:57 RNGTLIVES || J CEQIDNO:S58 NGTLIVIS À CEQIDNO:58 GTLIVES À SEQIDNO:6O TLIVES ||| | SEQIDNO 61 ELVIS À | CSEQIDNO:62 TVRS À ! SEQIDNO:63 STRKEEKORNGTLTVT — TV] 'i=" CSEQIDNO:64 TRKEEKORNGTETVE ||| SEQIDNO:6E5 RKEEKORNGTLTIVR ||| SEQIDNO:66 KEEKORNGTLTVE ||| SEQIDNO:67 EEKARNGTLTvT — — . . W , P . A as aa SEQIDNO:68 EKORNGTELTVE ||| !/ jÔ T) a CEQIDNO:6S8 KORNGTLIVE À CSEQIDNO:70 QGRNGTLIVE ||| SEQIDNO: 71 RNGTLIVE À & CEQIDNO:72 NGTLIVE À - SEQIDNO:73 GTLTVT " SEQIDNO:74 TLIVE À i SEQIDNO:7B LIVE À CSEQIDNO:76 STRKEEKORNGTEIV || SEQIDNO 77 TRREERORNGTER ||| SEQIDNO:78 RKEEKORNGTLTVY — )” rM(4MTP A SEQIDNO:79 KEEKORNGTETV ||| No iíor$*>&-is iRiui<insaso saea = SEQIDNO;80 EEKORNGTEIV ||| CEQIDNO:8T EKORNGTLTV ||| SEQIDNO:82 KORNGTLTIV SEQIDNO:88 QRNGTLTIV SEQIDNO: 84 RNGTLTIV À SEQIDNO:85 NETLTIV À SEQIDNO: 86 GTLTV À Ú CEQIDNO87 TEUIV À : “SEQIDNO:88 STRKEEKORNGTLT — tj 4 An 47 nona SEQIDNO:89 TRKEEKORNGTLT =... M a nM"T0 PC | SEQIDNO:90 RKEEKORNGTLT TEQIDNO ST RKEERORNGTER ||| AA SEQIDNO:92 EEKORNGTLT — Ts .;“s | |

134 | s SEQID NO: 94º KORNGTLT CEQIDNOSS BRNGTEF ||| AA EQDNOS RNGTEFO ||| AA BEQIDNO ST NETO ||||MMMM

BEGINS GM WWW E SEQIMNOS STRREERORNETE ||| SEQIDNO: TO TRREERGRNGTE |MWÀ|WúÀN SEQ ID NO: 101 RKEEKQORNGTL | SEQ ID NO: 102 KEEKQORNGTL ! SEQIDNO: TOS EERORNGTE ||| | BEQMDNO: TA ERORNGTE || | SEGIDNO: 105 KORNGTD MM | SEAIDNO:TO6 ARNEGTE ||| AAA SEQIDNO:To7 RNGTE || VS : SEQ ID NO: 109 STRKEEKQORNGT : SEQIDNO: 110 TRREEKORNGT|úÚÀ|— | i EEQIDNO TM RKEEKORNGT ||| CEQIDNO: MZ REERGRNGT ||| SEQ ID NO: 113 EEKORNGT ! BEGINS TM ERQRNGTO ||| TSEQIDNO: 115 KORNET MM O | CEGIDNO TMB QRNGT || : BEQIDNO IT RNGT || MM | TFEAIDNO: 18 STRREERKORNG | TSEGIDNO: 119 TRREEKARNG || —— VV” — FSEQIDNO 120 RREERARNG || SEGIONOTA REERORNG |úÀÂÀ|À|ú|úlúlúlNlNlNlMNM TI TEQIMNO: 122 EERORNG ||| TI BEGIDNO TA KORNG | i BSEQIDNO: 1 GRNEG||À|ÀMM | BEQIDNO: TB STRREERORN ||| BEQIDNO: 17 TRREEKORN || SEQIDNO; 128 RREERORN ||| E o a | | ' 1

SEQIDNO: Tao REEKGRN ||| : EQIDNO: TO BERQRN ||| BEQIDNO TT EKQRN ||| SEQIDNO: TZ KORN | EEQIMDNO: 133 STRREEKQOR ||| SEQIDNO: TM TRREERQR ||| EEQIDNO: 185 RREEKQOR ||| SEQIDNO: 136 KEEKOR À EGIDNO:Ta7 EEROR ||| EQIDNO:T8 EKRQR ||| EQIDNO: TO STRREERQ | SEQIDNO: 140 TRREEKQ |ÀÂ|À|À|À|À|À|À|À|À|À|À|ll SEQIDNO: TA RREEKO ||| SEQGIDNO:T42 KEEKA ||Ú|Ú|À| ! : SEQIDNO: TB EEKO ||| ás SEQIDNO: TM STRKEEK ||| : BEQIDNO: TAS TRREEKO ||| . MBEQIDNO:TMB RREEKO ||| Ú BEGIDNO 147 KEEK MM A A E SEQIDNO 148 STRKEE ||| EEQMBNOTMH TRRBE||ÚÀ|À|À|À|À MSEQIDNO: 10 RKREE ||| BEQIDNO IST STRRE |ÚÀÂÀ|À|À|ll KT =(e Yo 5 EVAN [2 UC INSS EEQIDNO: IS STRK|ÚÀ|ÀÀ TSEQIDNO: 154 CLVVDLAPSKGTVN ||| EEQIDNO:155 CEVWDLAPSKETV ||| SEQIDNO:156 CLVVDLAPSKGT | FEQIDNO: 157 CLVWDLAPSKE ||ÚÀ|À|À|À|À|ÀÀllll SEAIDNO: 158 CLVWDLAPSK ||| EQIDNO: 159 CEWDBLAPS | . SEQIDNO: TO CEVWBLAP | BEQIDNO: TT CEWBEA ||| AEQIDNO: TZ CEVWDE ||| ASEGIDNO: 163 CEVWD |úÀÂÀÂÀúl SEGIDNO:TSA EE |||

| EQIDNO: TS CVWDLAPSKGTVN : FEQIONO: TS EVVDLAPSRETV | FEQIONO T7 IVVDCABSRET MM SEGIDNO: 168 IVVDLABSRE MM EQIDNO: TM LVVDLABSKO | EEQIDNO: TO LVWDEAPS ||

BEQIDNOTA IVWBEARB MM EGIDNO TE CVBEA | BEQIDNO: 173 LVWDE ||| BEGIDNOTIA DVD| SEQIDNO TAS WDLAPSKETVN | BEQIDNO 177 WDLAPSKET MM SEQIDNO: T78 WDLAPSRG || 4 EQIDNOTO WDEAPS ||| . SEQ ID NO: 181º VVDLAP ; FEQIDNO TER WDEA | FEQIDNO: 184 VOLAPSKETVN MM | FEGIDNO TS VOLABSRET ||| | BEQIDNO: 187 VDLAPSKE MM SEQ ID NO: 188! VDLAPSK | EGIDNO TS VOEAPS | SEQIDNO: IO VOLAR MM

BEQIDNOTT VOA MM SEQIDNO: 198 DLAPSKETV MT SEQIDNO TM DEABSRET | EQIDNO:T6 DEAPSRE ||| BEQIDNO: TT DEAR A SEQIDNO 198 DIR À SEQIDNO: 189 LAPSRGTVN || TT SEQIDNO:200 LAPSKGTIV || TA

SEQIDNO:207 LAPSKGT || - CEQIDNO:202 LAPSKG ||| SEQIDNO:208 LAPSK ||| CEQIDNO:204 LABS ||| CEQIDNO:205 APSKGTVN || SEQIDNO:206 APSKGTV ||| CEQIDNO:207 APSKET ||| CEQIDNO:208 APSKG |Ú|À|À|À|| SEQIDNO:209 APSKO ||| SEQIDNO:210 PSKGTVN ||| BEQIDNO: ATT PSKEGTV ||| SEQIDNO:A2 PSKEGT ||| CEQIDNO:2R PSKG|ÀÀÀÀ SEQIDNO:2T4 SKGTVN || SEQIDNO:2T5 SKETV ||| SEQIDNO:2T6 SKGT||ÀÀ CSEQIDNO:2AT7 KEN || SEQIDNO:2T8 KETV ||| SEQIDNO:219 GTVN ||| SEQIDNO: 220 QCRVIHPALPRALMRS ||| SEQDNO:227 CRVTHPHLPRALMRS ||| “SEQIDNO:222 RVIHPHLPRALMRS — P . p P P R 2Aúgn" "a CSEQIDNO:223 VIHPHLPRALMRS ||| SEQIDNO:224 THPHLPRALMRS ||| SEQIDNO:225 HPALPRALMRS ||| SEQIDNO:226 PHLPRALMRS ||| SEQIDNO:227 HLPRALMRS ||| CSEQIDNO:228 LPRALMRS || SEQIDNO: 228 PRALMRS ||| SEQIDNO:280 RALMRS ||| SEQIDNO:231 ALMRS ||| SEQIDNO:282 EMRS | SEQIDNO:233 ACRVIHPHLPRALMR ——— . P . - Vi Bi" "0 “SEQIDNO:234 CRVIHPHLPRALMR ||| MM -/l/-'“)PÔÂi>>>70 nÓé SEQIDNO:235 RVTHPHLPRALMR ||| SEQIDNO: 236 VIHPHLPRAIMNR — Lu) âgggóÁ>aaan0 a

|

|

| 138 BEQIDNO: 237 THPALPRALMRO MM SEQIDNO: 239 PALPRALMR MM E TSEQIDNO:240 ALPRALMR MM TE SEQIDNO:2MT LPRALMR MM SEQIDNO 242 PRALVRMMM EEGIDNO 3 RAIMR MM SEQIDNO 2 ALMRMMMN Os SEQIDNO: 245 QERVIRPALPRAEMO uu A SEGIDNO: 2348 VIAHPALPRALIM MM A EEQIDNO:250 HPALPRALMO | — ESEGIDNO:258 TARA MM O FF SEQIDNO: 2565 RAL O SEQIDNO: 256 GERVIRHPALPRAL MM SEQIDNO:268 RVIRHPALARAL|||W——— SEGIDNO: 269 VIHPALPRAL ||| A SEGIDNO;260 THPALPRAC MM FF SEGIDNO:261 HBALPRAL MM SEQIDNO:262 PALPRAL MM AA BEGIDNO:363 HLPRAL MM A BEGIDNO;264 LPRAL MM O SEQIDNO:265 PRACA | SEQIDNO: 266 QERVIHPALPRA MM SEQIDNO:267 CRVIHPALPRA MM SEQIDNO: 268 RVIHPALPRA Mú SEQIDNO: 260 VIHPALPRA MW — — SEQIDNO:270 THPAHLPRA MM SEQIDNO:27T HPHLPRA MM SEGIDNO;272 PALPRA MM mm SEQIDNO:278 HPRA-ÀÀ os SEQIDNO:274 LPRAÀÀÀÀ o Tm SEQIDNO:275 QCRYIHBHPR = CBZ">ZEGSA A Õ$< SEQIDNO:276 CRVIHPHLPR À TA SEQIDNO:277 RVIHPHPR À SEQIDNO:278 VIHPBHPR — (“ãú õcx<cAAÕoÂÕÕÂAnas—cecaa— | SEQIDNO:2798 THPHPR

SEQID NO: 280 HPHLPR SEQIDNo:299 PHPR — — Q OÔgqgeÀebeióa;bgAaAeggs"zAAZAAAAZAõaA SEQIDNO:282 HPR —Aâõ,iuoaa" oaàrc+o AA sso0 É6É SEQIDNO:283 QCRVIHPHP. — —“ ÕóÓywuag>ãóoS Mn CdanagcgoaÀadâgqgg2d>0 SEQIDNO:284 CRVIHPHLP||| IO EE SEQIDNO:285 RVIHPHP— SEE SEQIDNO:286 VTHPHL.LP. = [7 aaecAaea"eÕP “oeeaszsxxnaci a — É— çaoo dcdqeqcc SEQIDNO267 THPHP = ãaõóea oÔõé caaaaaa & , SEQIDNOo:288 HHp — “ÓÉ%;7)Õ =<ÕNÔcwrXôWÉK&-"52“90sB:*CÕXDeÂ|a a a.

SEQIDNO:289 pHp — SA "ú$"ÕDGBÕZ Ss õ"ÔÕõAAAOOõAÕçtieglÔgdbaag gs SEQIDNO:290 GCRVTHPHL — 1 n2aeÕZEõZ ÕÔÕnÔãôõ SEQIDNO:2901 CRVIHPHE||| SEQIDNO:282 RVIHPHE ||| i SEQIDNO:293 vIHBDHL — ÔQÕúúúÂAÀÕN[ãaê6ÊÀaaÕõ QUQÕÔQQuõoxnêôdêe—eag—— SEQIDNO:284 THPHL SEQIDNO:295 HH — úâqgaoôGXggÚe ac = SEQIDNO: 2068 QCRyTHPH = = nodaa a SEQIDNO:2967 CRyJHBH = ôõõke CCP AcóOoanaa) SEQIDNO:298 RyTHBH = jnÂêÕÂ2Â2 cc.]aÔóodagga—<— SEQIDNO:2098 VIRBH- o E SEQIDNO:300 THPH = oc 6 n> >âoQodguAo ÓoOoacc— SEQIDNO: 301 QERVTHP— 2M/ on aaa êaÔõaaag Zoo SEQIDNO:302 CRVTHPÀ E : " SEQIDNO:308 RVIHP|À EA : * SEQIDNO:804 VIHP as >:xÕÕZAZÔoO zona aa Ú>= SEQIDNO:305 GCRVTH À E SEQIDNO:306 CRVIR CAbó cdi ágeegaUgagózr fas SEQIDNO:307 RvIH MM õSHôÉÇVYDZ>WBC—OO"OQ o ro okrqeadi—;mc"0 SEQIDNO:308 GERVT À E

' 1 ' SEQIDNO: 308 CRY | : 'SEQIDNO:310 QORVY — ZÔoaagnkb>s- ma a ir"A “SEQIDNO: 311 CADSNPRGVSAYLSRPESp = Qõ)QZÂaoa.Ôx-õ>É SEQIDNO: 312 ADSNPRGVSAYLSRBSp — º aZõaó aa SEQIDNO:313 DSNPRGVSAYLSRPSp — ((õeúgna aC “uy ' SEQIDNO:314 SNPRGVSAYVLSRPSRp=— > ZÕCÕGAAAAeABGAóE ô E éCá—-VCÕÕ"Aprzrô" 'SEQIDNO: 315 NPRGVSAYLSRPEsp — = 2ooynaÀÕx ôeÓ="A 'SEQIDNO:316 PRGYSAYVLSResp — —"ÂOCDóÔÔ ózêÚ og SEQIDNO:317 RIVSAVLSRPSp— õ O Ô GQ DÔ õ e oA>00Aag0gg É 'SEQIDNO:318 GYSAYVLSRESsp — ÕOÕÕÔNÔÔAGAQôóôoaõa a d a SEQIDNO:319 VSAYLSRRgsp— —- WgÁaEg ô$aanl 90 SEQIDNO:320 SAYLSRPSPÀÀÀÀ “SEQIDNO: 321 AyLsRPSP | H / %' dud>gga a TtBQÇÔÇÕHHea ACAM “SEQIDNO:322 YLSRPSPÀÀÀÀ A | SEQIDNO;333 LSRggsp — — -DOQÔQÔôâô 66 RDÕÔZZggg"asaH | 31 SEQDNO3ZM SRRSP--| XD Áb—r>>r»>ePOA—"HSSEEEA-AAANR>AAAHAAO — SEQIDNOgg8 RRSp = EÔÂSAÔÔQÓgzXZZ zAA ae>-osao>b>a aa gg a * SEQIDNO:s26 CADSNPRGVSAYESRPS ||| VT 1 SEQIDNO: 327 ADSNPRGVSAYLSRPS || MO | SEQIDNO: 328 DSNPRGVSAYLSRPS ||| | “SEQIDNO: 329 SNPRGVYSAYLSRBs — sz aAa)|Ôô ma SEQIDNO: 330 NPRGVYSAYLSRPs— — ——uuQ"AÃ3XÔÓ-naan0Cf“m = SEQIDNO:331 PRGVSAYLSRPS-=— > z6õ óõ ÔQõÔ OZÕZB CDA SEQIDNO: 332 RGVYSAYVLSRPBs — — - HõÓyo õ ÓõôóÓ éÕdÂdçoooAôsoo""abãgôAaaAA ! SEQIDNO:333 GySAÇLSRBg = ÔQ ?õÔ$ôÕaÔça"eaGeAaiim"7 SEQIDNO: 334 VSAYLSRES À A SEQIDNO:335 SAYLSRes = õÔÔGÓÕÓGÓ>XXWAÔW)WcW"ÚC-ZaA AAA SEQIDNO: 336 AYLSRPes — “cg aóçççRaçtiççtaac=<"T SEQIDNO:337 YVLSRPS À SEQIDNO:338 LSRPS-— O DbDLSAXA õCb3A >HAAA.aoxae SEQIDNo3 SRes = õzÔ ac gas OOQÕÕÇAHA SEQIDNO: 340 CADSNPRGVSAYELSRP.|ÀÀÀÀÀ SEQIDNO:341 ADSNPRGVSAYLSRP — PWWÔ)aaaõW ÕuQKdKa ag õZõs SEQIDNO: 342 DSNPRGVSAYLSRE.ÀÀ SEQIDNO: 348 SNPRGVSAVESRPÀÀ|| SEQIDNO: 344 NPRGVSAYLSRPÀ|À

CSEQIDNO: 345 PRGVSAYLSRPÀÀÀ : SEQIDNO: 346 RGVSAYLSRP. ||| TT SEQIDNO:347 GVSAYLSRPÀÀÀÀÀ A CSEQIDNO:348 VSAYLSRP|||| CSEQIDNO:349 SAYLSRP O CSEQIDNO:350 AYLSRPÀÀÀÀÀÀ CSEQIDNO:351 YLSRP À TT GCSEQIDNO:352 LSRP À TA GCSEQIDNO: 3538 CADSNPRGVSAYLSR SEQIDNO: 354 ADSNPRGVSAYLSR À SEQIDNO: 355 DSNPRGVSAYLSR À GCSEQIDNO: 56 SNPRGVSAYESR || CSEQIDNO: 357 NPRGVSAYLSR À TT SEQIDNO: 358 PRGVSAYLSR 000 O SEQIDNO: 358 REVSAYLSR = — — à CSEQIDNO:360 GVSAYLSR 0 . CSEQIDNO:361 VSAYLSR 0 A CU CSEQIDNO 362 SAVLISR MM AF ' CSEQIDNO:3638 AYLSR À SEQIDNO:364 VLSR ||| úDl TITE i “SEQIDNO: 365 CADSNPRGVSAYLS ||ÚÂÚÂÀÀÀ “SEQIDNO: 366 ADSNPRGVSAYLS || | CSEQIDNO: 367 DSNPRGVSAYLS ||ÀÚÀ|À|À|ÀÀ mm SEQIDNO: 3688 SNPRGVSAYLS UU SEQIDNO:369 NPRGVSAYLS ||| SEQIDNO:370 PRGVSAVLS |À CSEQIDNO: 371 RGVSAYLS À SEQIDNO: 372 GVSAYLS À CSEQIDNO:373 VSAYLS ||| GCEQIDNO:374 SAVLS À | GCSEQIDNO:375 AVLS = AS, 0 SEQIDNO: 376 CADSNPRGVSAYL À CSEQIDNO: 377 ADSNPRGVSAYL À “SEQIDNO:378 DSNPRGVSAYL À SEQIDNO: 378 SNPRGVSAYL À SEQIDNO:380 NPRGVSAYL À

1

|

EQIDNO: 383 GVSAVE|úNSSSMMMMMM A

| TEQIDNO; 384 VSAVL MM SEQIDNO: 386 CADSNPRGVSAY À q — SEGIDNO: 387 ADSNPRGVSAY À FEQIDNO:388 DSNPRGVSAY À q SEQIDNO: 389 SNPRGVSAY MM — SEQGIDNO: 300 NPRGVSAY MM SEQIDNO: 391 PROVSAY MM EEQIDNO 308 GVSAY MM A SEQIDNO; 34 VSAT&MMM—MXMXMXM SEQIDNO; 395 CADSNPRGVSA MM à SEQIDNOS0 ADSNPRGVSA |úÀ — — A ——— * CSEGIDNO 308 SNPRGVSÃ MN EEQIDNO: 400 PRGVSA |úÚú TT TEEQIDNO 102 GVSA MMA BEQIDNO: 403 CADSNPRGVS MM q —— SEGIDNO: 404 ADSNPRGVS MM BEQIDNO 406 SNPRGVS À — ——— BFEQIDNO 407 NPRGVS À FTEQIDNO;408 PRGVS MM A SEQIDNO 400 ROVS MM SEQIDNO:410 CADSNPRGY MM — — —r SEQIDNO: 43 SNPRGV||ÀúÀúÀ — BEQIDNO; AA NPRGV À —— SEQIDNO: 45 PREV |úÀúÀW ——— TT A r— SEQIDNO;46 CADSNPRG À — ——

143 | SEQIDNO: 417 ADSNPRGÀÀÀÀ SEQIDNO: 418 DSNPRG = >zAAa ÕÔÔÔgyqg>gg CA SEQIDNO:419g SNPRG = W õWCCõCCÕPSõCóG6ÕbéÕGRGWQWç & 6 ÔOÔÕÔyçag"m SEQIDNO:420 N—oRg — õÕQdOgggagganlt"nA9A"" “SEQIDNO: 421 CADSNPR — / Pô )õõ Ô >$g Og er n=- = ôõl-a | “SEQIDNO: 422 ADSNPR = A 9 ÔD aadáaÚ a ooeancózeddo A | “SEQIDNO: 428 DSNPR —— ---. .S?—>VÂNYAAagpanbbz>Õ> dÕ3ÕSÕÇ3E6Esgç$z$eaAa zé “SEQIDNO.424 SNPR o ÔÕ?PZ823ãUÔõodoeôobÂÓ 8WBÂÂÕÁeeaaaa A SEQIDNO: 425 CADSNPF — Ô ZYAA âÔAa0"ãz nada o ac<óaa SEQIDNO: 426 ADSNE | HH AA2.*BHliI-kggsCAc“mn—CA SEQIDNO: 427 psp — = pl l P an otgg |O Ódaeoiaaacsr)l0aoe "0 SEQIDNO:428 CADSIN|ÀÀ SEQIDNO: 429 ADSIN = PDÔõõÔÔódCogceExÓanigtaimmçeç—aeça;óáAaaaõâInÚ"““ SEQIDNO: 430 CADs | Nº? Bssr a ddigegçecenaosCCSCóCcáaainC <= "70 CEQIDNO AT TCGTCETITITOGETECITTT |ÀÚÂÀ|À|À|À|À|À|À|À|| SEQIDNO:432 TCGTCGTITITCGETCGTTTT ||| SEQIDNO: 433 TCGTCGTITIGTCGTTITGTEETT ||| SEQIDNO: 484 ADSNPRGVSAYLSRPSPE ||| SEQIDNO: 435. MAKLETVTLGNIGKDGKGTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKR

VTVSVSQP

SRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDE ERAFVRT | ELAALLASPLLIDAIDQLNPAY | SEQ ID NO: 486; STRKEEKQRNGTLTVTSTLPC | SEQIDNO: 437 LVVDLAPSKBIlVLNo— —“ AÉ-iwiminsoçúzi)ii>xmdrrleiciçtsiisisscscs"C AA | "SEQIDNO: 438 CLVVDLAPSKGTVNGGEGEE ||| | SEQ ID NO: 4/89. CADSNPRGVSAYLSRPSPC | SEQ ID NO: 440. GGGGACGACGTCEGTGGGEGÇSGE SEQIDNO:441 TCGTCGTITCGTCGTTITGTOGTT |||) SEQIDNO:442 TCGTCGTITITGICGITITITIDEA ||| SEQIDNO: 443 TCGCGTCGTTCGGCGEGEGEEE ||úÚúÚ|À|ÀÀÀ ! SEQIDNO: 444 TCGTCGACGTTCGECECECECEE ||ÚÂÚÀ|À|ÀWÀWJJJJ1o SEQIDNO: 445 TCGGACGTTCGGCGCGCECEG ||ÀÚÀÚÀÀWWW SEQIDNO: 446 TOGGACGTTCGGCECEEES |úÚúÀÀÀÀWN MM SEQIDNO: 447 TOGCGTCGTTOGECECEEES |||ÚúÚ|ÚÀ P 2 z/ SEQIDNO: 448 TCGACGTTCGGCGCECEÇEE — "2" PH 0 =a

GCEQIDNS: 449 TCGACGTTOGECECEES |ÚÀÂÀ|ÀJXJXllXlXúXúXNXN.N.N.... SEQIDNO:450 TCGCGTCGTTOGEÇEDES |ÚÀÂÀ|ÀJJJJllll ll) SEQGIDNO: 451 TCGCGACGTTOGECGECGEECES |ÚÂÚÂÀ|À|ÀWWJWJJJJJJ FSEQIDNO: 42 TCETCETIITTOGECECEESEES |ÀÚÂÀJXXllXlXúXúXúN.N.N.N.

SEQMNO: 43 TCSTCETITTTOGGCEGECEEES |ÚÀÂÀ|ÀJXJX.l XX... SEQIDNO:454 TCGTCGTTITTACGGCGCCETEEES |ÚÂÀ|À|ÀWÀÀJJJJJJJ.) GSEQIDNO:455 TCGTCGTITICAGCEGEGEGECET|ÚÀ|À|ÀÀÀJJJJJJJJJllS.. TSEQIDNO:456 TCGTCGACGATCGECECECECES |ÚÀÂÀ|ÀWJWJJJJlllllXlXúX.. FCEGIDNO:457 ADSNPRGVSAYVESRPSPGGE || SEQIDNO:48 QCIVDHPDFPRPIVRS ||| | SEQIDNO:459 PDHEPRGVITYLIPPSPE |||

Claims (110)

1. REIVINDICAÇÕES Í 1. Imunógeno compreendendo pelo menos um peptídeo IgE antigênico ligado a um carreador imunogênico, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos; 312,311,313,314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400,401,402,403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 1, 2,3, 4,5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84,85, 86,87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, é 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, + 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, ' 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177,178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, SS 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, | 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, ! 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267,268,269,270,271,272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 e 310.
2. 2. Imunógeno, de acordo com à reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada — dogrupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, - 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, - 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81. 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, —111,112,113,114,115,116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, e 153. ; ; | |
3. Ú 3. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de - que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada i do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,183,184,185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, | 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, Í l 218,0 219.
4. 4. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, | 15 — 302,303,304,305,306, 307, 308, 309, e 310. &
5. 5. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, - 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339,340,341,342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, - 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429€6430.
6. 6. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, | 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, | — 46,49,50,51,52,53,54, 55,56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, | 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, - 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 e 148 ; mais preferivelmen- ! te do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22,23,24,25,26,27,28,34,35,36,37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, 127, 133, e 139 ; ainda mais |

   3 | | preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 7 8, 19, 20, > 21,22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 e 109; ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 e 76 ; aindamais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 18, 19 e 34 ; acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 1 ou 18.
7. 7. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217; | mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 e 200 ; ainda | 15 mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175 á ; acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência | de aminoácidos das SEQ ID Nos: 154 ou 165. w
8. 8. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de s que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada l 20 do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, | ” 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, | 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305 ; mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223,224,225,226,227,233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 e 290 ; ainda mais pre- | ferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266 ; ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 3 245 ; acima de tudo preferivelmente, o dito pep- tídeolgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220 ou . 233. i
9. 9. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de . que o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321,322,323,326,327,328,329,330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, ! |

   | To 4 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, i 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 e 425 ; mais preferivelmente do grupo que consiste | nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359,365,366,367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, 404 e 410 ; ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: . | 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386; ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353; ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326 ; acima de tudo pre- ferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 311 ou 312.
10. 10. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico compreende adicional- mentetanto: s - no seu terminal C um ligante com a fórmula (G),C em que n é um número inteiro escolhido no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 96 10, preferivelmente no grupo | * que consiste em O, 1, 2, 3, 4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em 0, 1, 2 | - e 3, acima de tudo preferivelmente n é O ou 1 (onde n é igual a O a dita fórmula representa uma cisteina)quanto; | - - no seu terminal N um ligante com a fórmula C(G), em que n é um número inteiro É escolhido no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 € 10, preferivelmente no grupo que consiste em O, 1, 2, 3,4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em 0, 1, 2 e 3, acima de tudo preferivelmente n é O ou 1 (onde n é igual à O, a fórmula representa uma j cisteína) quanto; - no seu terminal C um ligante com a fórmula (G),C em que n é um número inteiro escolhido no grupo que consiste em O, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 € 10, preferivelmente no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3,4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em 0, 1, 2 e 3, acima de tudo preferivelmente n O ou 1 (onde n é igual a O a dita fórmula representa uma cisteina)e no seu terminal Num ligante com a fórmula C(G), em que n é um número ' inteiro escolhido no grupo que consiste em 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 e 10, preferivelmente no grupo que consiste em O, 1, 2, 3, 4 e 5, mais preferivelmente nos grupos que consistem em . 0, 1, 26 3, acima de tudo preferivelmente n é O ou 1 (onde n é igual a O, a fórmula represen- ta uma cisteína).
11. 11. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito carreador imunogênico é uma partícula tipo vírus selecionada do grupo que consiste em VLP HBcAg, HBsAg e Qbeta. | j
12. | 5 o 12. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de T que o dito peptídeo IgE antigênico é quimicamente reticulado com a dita partícula tipo vírus.
13. 13. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico é conformacionalmente restrito,
14. 14. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos dois imunógenos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. 15. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, — 93,94,95,96,97,98,99,100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, à 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, * 149, 150, 151, 152, e 153. -
16. 16. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do . primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que | consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79,80,81,82,83, 84,85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 144, 145 e 148.
17. 17. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que . consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 64, . 65, 66, 67, 68, 69, 70, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 110, 111, 112, 118, 119, 120, 126, 127, 133, e 139. |
18. 18. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de ! que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do ! primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que ! ]

    consiste nas SEQ ID Nos:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 34, 35, 36, X 37, 38, 39, 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 88, 89, 90, 99, 100, 101 e 109.
19. 19. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 49, 50, 51, 63, 64 e 76,
20. 20. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: SEQ ID Nos: 1,2,3,18, 19 e 34.
21. 21. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de | que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que n consiste nas SEQ ID Nos: SEQ ID Nos: 1 e 18.
22. 22. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de w que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do z primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: SEQ ID Nos. | 7
23. 23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, | 171,172,173,174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, e 219.
24. 24, Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID ' Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, . 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217.
25. 25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, —CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, 177, 178, 184, 185,
26. ] 186, 192, 193, 199 e 200. - 26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, ' CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- ' siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154,155,156,165,166e 175. ;
27. 27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154 e 165.
28. 28. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 165.
29. 29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID a Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, ” 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292,293,294,295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, - 309, e 310.
30. 30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID — Nos: 220,221,222,223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305.
31. 31. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, —CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- : siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, . 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 e |

    290. |
32. 32. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

    | 8 ] Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256,257 e 266 . o.
33. 33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ |D —Nos:220,221,222,233,234 3245.
34. 34, Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 ou 233.
35. 35. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 220. |
36. 36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID r Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, <« 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, - 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382,383,384,385,386, 3867, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, | - 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430.
37. 37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396,397,398,399,400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 e 425.
38. 38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, | . CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- | siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID | —Nos:311,312,313,314,315,316,317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, | 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, !
39. | | 9 1 i 404 e 410. I 39. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22 CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- ' siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID —Nos:311,312,313,314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, | 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386, ainda mais preferivelmente do gru- po que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353, ainda mais preferivelmente do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312 e 326, acima de tudo preferivelmente, o dito peptídeo IgE antigênico consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQID Nos: 311 ou312. :
40. 40. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID Nos; 312. . '
41. 41. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do É primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, - 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, - 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203,204,205,206,207,208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, é 219. .
42. 42. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169,170,171,172, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 210, 211, 214 e 217. :
43. 43. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA: pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que | consistenasSEQ ID Nos: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 165, 166, 167, 168, 169, 175, 176, | . 177, 178, 184, 185, 186, 192, 193, 199 e 200.
44. 44. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de - que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que —consistenasSEQID Nos: 154, 155, 156, 165, 166 e 175.
45. 45. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do

    Ú primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que > consiste nas SEQ ID Nos: 154 e 165.
46. 46. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 165.
47. 47. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que e o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,238,239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, | 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, - — 309,e310. |
48. 48. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, a CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imuriógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID ” Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, - 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262,263,266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, - 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305.
49. 49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220,221,222,223,224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 e

    290.
50. 50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID . Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266.
51. 51. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, . CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID —Nos:220,221,222,223,224,233,234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266 .
52. 52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, ! CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- !

    À o 1 : siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID > Nos: 220, 221, 222, 233, 234 3 245.
53. 53. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações, 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220 e 233. |
54. 54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações. 41 a 46, | CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- | siste em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220. | 10
55. 55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, | CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, —346,347,348,349,350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, à 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, - 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, - 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430. |
56. 56. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, - CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350,353,354,355,356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421, 422 e 425. |
57. 57. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, —“CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- . siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ |D Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, . 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403,

    4046410.
58. 58. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con-

    o NR 12 : siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID € Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, i 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386 .
59. 59. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações, 41 a 46, —CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353. :
60. 60. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações. 41 a 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID : Nos: 311, 312 e 326. ' Í
61. 61. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, | CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- | siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID | Nos:311e312, | .
62. 62. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, | CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- - siste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 312. | .
63. 63, Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do | “ primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que ! consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269,270,271,272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 1 305, 306, 307, 308, 309, e 310. i
64. 64. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do | primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que | . consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, | . 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 283, 284, 285, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 296, 297, 298, 301, 302 e 305.
65. 65. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que | consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 233, 234, 235, 236, 237, s 238, 239, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 256, 257, 258, 259, 260, 266, 267, 268, 269, 275, 276, 277, 283, 284 e 290 .
66. 66. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 245, 246, 247, 256, 257 e 266.
67. 67. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de queaditacomposição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 220, 221, 222, 233, 234 3 245.
68. 68. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE antigênico do primeiro imunógeno consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que a consiste nas SEQ ID Nos: 220 e 233. |
69. 69. Composição, de acordo com reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de * que a dita composição compreende dois imunógenos e em que o peptídeo IgE ahtigênico do . ' primeiro imunógeno consiste em um aminoácido da SEQ ID No: 220.
70. 70. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, - CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346,347,348,349,350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429 e 430. '
71. 71. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, . CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID . Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350,353,354,355,356,357,358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 403, 404, 405, 406, 407, 410, 411, 412, 413, 416, 417, 418, 421,
72. 14 | : 422 e 425. | s 72. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- | siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID | | 5 Nos:311,312,313,314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, | 333, 334, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 376, 377, 378, 379, 380, 386, 387, 388, 389, 395, 396, 397, 403, 404 e 410.
73. 73. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69 ' —CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- | siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID | Nos: 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 340, 341, 342, 343, 344, 353, 354, 355, 356, 365, 366, 367, 376, 377 e 386. ! |
74. 74. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, | CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- ; as siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 311, 312, 313, 314, 326, 327, 328, 340, 341 e 353 . ! | -
75. 75. Composição, de acordo com qualguer uma das reivindicações 63 a 69, | - CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- ; siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID - Nos: 311, 312 e 326. :;
76. 76. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- siste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos:311e312, |
77. 77. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 69, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo IgE antigênico do segundo imunógeno con- ! siste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 312. |
78. 78. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 77, —“CARACTERIZADA pelo fato de que o dito peptideo IgE antigênico é ligado a um carreador . imunogênico selecionado do grupo que consiste em VLP de HBcAg, HBsAg VvLP e VLP Qbeta. | .
79. 79. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 78, CARACTERIZADA pelo fato de que os ditos peptídeos IgE antigênicos são individualmente conjugados com os ditos carreadores imunogênicos.
80. 80. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende dois imunóge- nos, cada imunógeno consistindo em um peptídeo IgE antigênico individualmente conjugado
81. | | : , com um carreador imunogênico. * 81. Composição, de acordo com reivindicação 80, CARACTERIZADA pelo fato de | que o primeiro imunógeno consiste em um peptídeo IgE antigênico consistindo, ou consis- tindo essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220, 221, 233, | 5 234,244e246 ligadoa um carreador imunogênico.
82. 82. Composição, de acordo com reivindicação 81 CARACTERIZADA pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 220 ou 233 .
83. 83. Composição, de acordo com reivindicação 82, CARACTERIZADA pelo fato de | 10 queoditopeptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 220, |
84. 84. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 83, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito carreador imunogênico é selecionado do grupo que consiste em VLP de HBcAg, HBsAg VLP e VLP Qbeta. 15
85. 85. Composição, de acordo com reivindicação 84, CARACTERIZADA pelo fato de . que o dito carreador imunogênico é VLP Qbeta.
86. 86. Composição, de acordo com reivindicação 85, CARACTERIZADA pelo fato de « que a dita partícula tipo vírus Qbeta consiste em partícula tipo vírus Qbeta da SEQ ID NO: - 435.
87. 87. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 e 86, - CARACTERIZADA pelo fato de que o dito peptídeo IgE antigênico é quimicamente reticula- do com a dita partícula tipo vírus Qbeta por meio de uma ligação de tioéter usando SMPH (hexanoato de succinimidil-S-[&3-maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre resíduos de lisina da partícula tipo vírus e o resíduo de cisteina do dito peptídeo IgE antigênico.
88. 88. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 87, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo imunógeno consiste em um segundo peptí- deo IgE antigênico consistindo, ou consistindo essencialmente, em uma sequência de ami- noácidos das SEQ ID Nos: 311, 312 ou 326 ligada a um segundo carreador imunogênico.
89. 89. Composição, de acordo com reivindicação 88, CARACTERIZADA pelo fato de . que o dito segundo peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 311 ou 312. ' -
90. 90, Composição, de acordo com reivindicação 89, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito segundo peptídeo IgE antigênico consiste, ou consiste essencialmente, em uma —sequênciade aminoácidos da SEQ ID No: 312.
91. 91. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 90, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito segundo peptídeo IgE antigênico compreende
92. ' adicionalmente no seu terminal C um ligante GC, preferivelmente tendo a fórmula GGC. . 92. Composição, de acordo com reivindicação 91, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito segundo peptídeo IgE antigênico que compreende no seu terminal C um ligante GC consiste, ou consiste essencialmente, em sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 457, |
93. 93. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito segundo carreador imunogênico é selecionado 1 do grupo que consiste em VLP de HBcAg, HBsAg VLP e VLP Qbeta. |
94. 94. Composição, de acordo com reivindicação 93, CARACTERIZADA pelo fato de queoditocarreador imunogênico é VLP Qbeta.
95. 95. Composição, de acordo com reivindicação 94, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita partícula tipo vírus Qbeta consiste em partícula tipo vírus Qbeta da SEQ ID NO:

    435.
96. 96. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 e 95, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito segundo peptídeo IgE antigênico que compreen- a de no seu terminal C um ligante GC é quimicamente reticulado com a dita partícula tipo vírus Qbeta por meio de uma ligação de ticoéter usando SMPH (hexanoato de succinimidil-6-[R- , maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre um resíduo de lisina - da partícula tipo vírus e o resíduo de cisteina do dito ligante do terminal C. .
97. 97. Composição, compreendendo dois imunógenos, CARACTERIZADA pelo fato Í - de que cada imunógeno consiste em um peptídeo IgE antigênico individualmente conjugado com uma partícula tipo vírus Qbeta em que: - o primeiro imunógeno consiste em um peptídeo IgE antigênico da SEQ ID No: 220 quimicamente reticulado com uma partícula tipo vírus Qbeta da SEQ ID NO: 435 por meio de uma ligação de toéter usando SMPH (hexancato de succinimidil-S-[&- maleimidopropionamido]) como reticulador, a dita ligação sendo entre um resíduo de lisina da partícula tipo vírus e o resíduo de cisteína do dito peptídeo IgE antigênico e; - o segundo imunógeno consiste em um polipeptídeo da SEQ ID No: 457 quimica- mente reticulado com uma partícula tipo virus Qbeta da SEQ ID NO: 435 por meio de uma ligação de ticéter usando SMPH (hexanoato de succinimidil-6-[&-maleimidopropionamido]) ' como reticulador, a dita ligação sendo entre um resíduo de lisina da partícula tipo vírus e o resíduo de cisteína do dito polipeptídeo. -
98. 98. Composição de imunógenos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 97, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um adjuvante selecionado do grupo que consiste em alume, oligonucleotídeos contendo CpG e adjuvantes a base de saponina.

    17 | - | '
99. 99. Composição imunogênica compreendendo um Imunógeno, de acordo com | ho qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende | adicionalmente pelo menos um adjuvante selecionado do grupo que consiste em alume, oligonucleotídeos contendo CpG e adjuvantes a base de saponina.
100. 100. “Composição imunogênica, de acordo com reivindicação 99, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito pelo menos um adjuvante é um contendo oligo- | nucleotídeo de CpG selecionado do grupo que consiste em CpG7909 (SEQ ID NO: 433), CpG 10103 (SEQ ID NO: 432) e CpG24555 (SEQ ID NO: 431).
101. 101. Composição imunogênica,a de acordo com reivindicação 99, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito pelo menos um adjuvante é um adjuvante a base de saponina, preferivelmente Iscomatrix.
102. 102. “Composição de imunógenos, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 97, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos dois adjuvantes selecionados do grupo que consiste em alume, oligonucleotídeos contendo CpGe adjuvantes a base de saponina. a
103. 103. Composição imunogênica compreendendo um Imunógeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende « adicionalmente pelo menos dois adjuvantes selecionados do grupo que consiste em alume, - oligonucleotídeos contendo CpG e adjuvantes a base de saponina.
104. 104. Composição imunogênicay de acordo com a reivindicação 103, . CARACTERIZADA pelo fato de que os ditos adjuvantes são alume e CpG24555 (SEQ ID NO: 431).
105. 105. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o Imunógeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
106. 106. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma composição de imunógenos como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 97, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
107. 107. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma composição imunogênica, como definida em de qualquer uma das reivindicações 99, : 100, 101, 103 ou 104 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
108. 108. Uso do Imunógeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a | - 13, CARACTERIZADO por ser para a fabricação de um medicamento para prevenir, aliviar | ou tratar um distúrbio relacionado a IgE em um indivíduo.
109. 109. Uso da composição de imunógeno como definido em qualquer uma das reivin- | dicações de 14 a 97, CARACTERIZADO por ser para a fabricação de um medicamento pa- ra prevenir, aliviar ou tratar um distúrbio relacionado a IgE em um indivíduo.

     18 : >» | ]
110. 110. Uso da composição imunogênica como definido em qualquer uma das reivindi- ss cações de 99, 100, 101, 103 ou 104, CARACTERIZADO por ser para a fabricação de um | medicamento para prevenir, aliviar ou tratar um distúrbio relacionado a IgE em um indivíduo.

     111. Uso da composição farmacêutica como definido nas reivindicações de 105 a 107, CARACTERIZADO por ser para a fabricação de um medicamento para prevenir, aliviar ou tratar um distúrbio relacionado a IgE em um indivíduo. !

     112. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 108 a 111, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito distúrbio mediado por IgE é asma. — |

     113. Ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o Imunógeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13. ;

     114. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucléico definido na reivindicação 113. ;

     115. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreehde o vetor de expressão definido na reivindicação 114. ; ! ' | - Í | | | ! | - | ; | | í ! ! 1 | ; | j ' i ! ' | f

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