BRPI0922832B1 - Composto e composição com atividade antitumor e pacote farmacêutico - Google Patents
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Abstract
composto e composição com atividade antitumor. a presente invenção refere-se a peptídeos ou moléculas similares a peptídeos e seus usos em terapia, em particular como agentes antitumor.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a peptídeos ou moléculas similares a peptídeos e seus usos em terapia, em particular como agentes antitumor e também como adjuvantes para vacinas incluindo vacinas de tumor.
[0002] Os peptídeos e seus derivados foram reconhecidos há muito tempo como moléculas terapeuticamente interessantes. Uma ampla variedade de organismos usa peptídeos como parte de seu mecanismo de defesa de hospedeiro. Peptídeos antimicrobianos foram isolados de espécies tão diversas como bactérias e mamíferos. Geralmente, estes peptídeos têm uma carga positiva líquida e uma tendência a formar estruturas de folha-beta ou hélice-alfa anfifílicas com interação com a bicamada de fosfolipídeo exterior em membranas de células bacterianas. Na maioria dos casos, os detalhados mecanismos moleculares da ação de antibiótico são desconhecidos, embora alguns peptídeos classificados como peptídeos classe L (líticos) sejam acreditados interagirem com membranas de célula bacteriana, formando canais de íons, poros ou outras estruturas capazes de desestabilizarem a membrana.
[0003] Entre a classe geral de peptídeos antimicrobianos líticos, alguns também foram mostrados terem atividade antitumor. Membranas de células eucarióticas de células de tumor desenvolvem propriedades similares às membranas de células procariotas e foi postulado que isto pode prover um grau de seletividade destes peptídeos líticos para células de tumor in vivo. Alguma atividade antitumor de peptídeos tendo caráter anfifílico e uma carga positiva líquida foi descrita em WO 00/12542, WO 01/66147, WO 01/19852 e por Yang et al., em Journal of peptide Science [2004], 10, pp. 37-46 (PMID: 14959890). Geralmente atividade antitumor requer peptídeos maiores do que podem ser projetados para usos antibacterianos. O balanço da necessidade de boa citotoxicidade para célula-alvo e seletividade in vivo apresenta problemas particulares na geração de peptídeos antitumor úteis, em parte porque permanece um alto grau de similaridade entre as células de tumor e não transformadas. Não obstante, a predominância de câncer em populações humanas e animais e seu papel na mortalidade significam que há uma continuada necessidade de novos fármacos que sejam eficazes contra tumores. Eliminação de um tumor ou a redução de seu tamanho ou redução de número de células de câncer circulando no sangue ou sistemas linfáticos pode ser benéfica em uma variedade de maneiras; redução de dor ou desconforto, prevenção de metástase, facilitação de intervenção operativa, prolongamento de vida.
[0004] Durante suas investigações na atividade biológica de peptídeos, os presentes inventores identificaram um pequeno grupo de moléculas que exibem atividade particularmente boa contra uma faixa de tipos de câncer e boa seletividade para células cancerosas sobre células normais. Como é detalhado abaixo, uma molécula (LTX-315) é particularmente preferida e por isso de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é provido um composto tendo a fórmula de SEQ ID NO: 23, ou um sal do mesmo, éster ou amida.
[0005] Em um aspecto, a presente invenção provê um composto, preferivelmente um peptídeo, tendo as seguintes características: a) consistindo em 9 aminoácidos em um arranjo linear; b) destes 9 aminoácidos, 5 são catiônicos e 4 têm um grupo R lipofílico; c) pelo menos um dos ditos 9 aminoácidos é um aminoácido codificado não geneticamente ou um derivado modificado de um aminoácido codificado geneticamente; e opcionalmente d) os resíduos lipofílicos e catiônicos são dispostos de modo que não existem mais que dois de qualquer tipo de resíduo adjacentes um ao outro; e ainda opcionalmente e) a molécula compreende dois pares de aminoácidos catiônicos adjacentes e um ou dois pares de resíduos lipofílicos adjacentes.
[0006] Os aminoácidos catiônicos, que podem ser idênticos ou diferentes, são preferivelmente lisina ou arginina mas podem ser histidina ou qualquer aminoácido modificado ou codificado não geneticamente transportando uma carga positiva em pH 7,0.
[0007] Apropriados aminoácidos catiônicos codificados não geneticamente e aminoácidos catiônicos modificados incluem análogos de lisina, arginina e histidina tais como homolisina, ornitina, ácido diamino butírico, ácido diamino pimélico, ácido diamino propiônico e homoarginina assim como trimetil lisina e trimetil ornitina, ácido 4-amino piperidino-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamidoil piperidino-4- carboxílico e 4-guanidino fenil alanina.
[0008] Os aminoácidos lipofílicos (isto é, aminoácidos com um grupo R lipofílico), que podem ser idênticos ou diferentes, todos possuem um grupo R com pelo menos 7, preferivelmente pelo menos 8 ou 9, mais preferivelmente pelo menos 10 átomos não hidrogênio. Um aminoácido com um grupo R lipofílico é aqui referido como um aminoácido lipofílico. Tipicamente o grupo R lipofílico tem pelo menos um, preferivelmente dois grupos cíclicos, que podem estar fundidos ou conectados.
[0009] O grupo R lipofílico pode conter heteroátomos tais como O, N ou S mas tipicamente não há mais que um heteroátomo, preferivelmente ele é nitrogênio. Este grupo R preferivelmente não tem mais que 2 grupos polares, mais preferivelmente nenhum ou um, mais preferivelmente nenhum.
[00010] Triptofano é um aminoácido lipofílico preferido e as moléculas preferivelmente compreendem 1 a 3, mais preferivelmente 2 ou 3, mais preferivelmente 3 resíduos triptofano. Ainda aminoácidos lipofílicos codificados geneticamente que podem ser incorporados são fenilalanina e tirosina.
[00011] Preferivelmente um dos aminoácidos lipofílicos é um aminoácido codificado não geneticamente. Mais preferivelmente a molécula consiste em 3 aminoácidos lipofílicos geneticamente codificados, 5 aminoácidos catiônicos codificados geneticamente e 1 aminoácido lipofílico codificado não geneticamente. Neste contexto, um aminoácido D, embora não estritamente geneticamente codificado, não considerado ser um "aminoácido codificado não geneticamente", o qual deve ser estruturalmente não justo estereoespecificamente, diferente dos 20 aminoácidos L codificados geneticamente. As moléculas da invenção podem ter alguns ou todos os aminoácidos presentes na forma D, preferivelmente, entretanto, todos os aminoácidos estão na forma L.
[00012] Quando as moléculas incluem um aminoácido lipofílico codificado não geneticamente (ou derivado de aminoácido), o grupo R deste aminoácido preferivelmente contém não mais que 35 átomos não hidrogênio, mais preferivelmente não mais que 30, mais preferivelmente não mais que 25 átomos não hidrogênio.
[00013] Aminoácidos codificados não geneticamente preferidos incluem: ácido 2-amino-3-(bifenil-4-il) propanoico (bifenil alanina), ácido 2-amino-3,3-difenil propanoico ((difenil alanina), ácido 2-amino-3- (antracen-9-il) propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-2-il) propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-1-il) propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1’,4’,1"-t- fenil-4-il] propiônico, ácido 2-amino-3-(2,5,7-tri-t-butil-1H-indol-3-il) propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1’:3’,1"-terfenil-4-il] propiônico, ácido 2- amino-3-[1,1’:2’,1"-terfenil-4-il] propiônico, ácido 2-amino-3-(4-naftalen- 2-il fenil) propiônico, ácido 2-amino-3-(4’-butil bifenil-4-il) propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1’:3’,1"-terfenil-5’-il] propiônico e ácido 2-amino-3-(4- (2,2-difenil etil) fenil) propanoico.
[00014] Em uma modalidade preferida, os compostos da invenção têm uma de fórmulas I a V listadas abaixo, nas quais C representa um aminoácido catiônico como definido acima e L representa um aminoácido lipofílico como definido acima. Os aminoácidos sendo covalentemente ligados, preferivelmente por ligações peptídicas resultando em um peptídeo verdadeiro ou através de outras ligações resultando em um peptideomimético. Os terminais livres amino ou carbóxi destas moléculas podem ser modificados, o terminal carbóxi é preferivelmente modificado para remover a carga negativa, mais preferivelmente o terminal carbóxi é amidado, este grupo amida pode estar substituído. CCLLCCLLC (I) (SEQ ID NO: 1) LCCLLCCLC (II) (SEQ ID NO: 2) CLLCCLLCC (III) (SEQ ID NO: 3) CCLLCLLCC (IV) (SEQ ID NO: 4) CLCCLLCCL (V) (SEQ ID NO: 5)
[00015] Um peptideomimético é tipicamente caracterizado por reter a polaridade, o tamanho tridimensional e funcionalidade (bioatividade) de seu peptídeo equivalente mas onde as ligações peptídicas foram substituídas, frequentemente por ligações mais estáveis. Por ‘estável’ é pretendido mais resistente à degradação enzimática por enzimas hidrolíticas. Geralmente, a ligação que substitui a ligação amida (substituto de ligação amida) conserva muitas das propriedades da ligação amida, por exemplo, conformação, volume estéreo, caráter eletrostático, possibilidade para ligação de hidrogênio etc. Capítulo 14 de "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds.) 1996, Horwood Acad. Pub. provê uma discussão geral de técnicas para o projeto e síntese de peptideomiméticos. No presente caso, onde a molécula está reagindo com uma membrana antes que o específico sítio ativo de uma enzima, alguns dos problemas descritos de imitar exatamente afinidade e eficácia ou função de substrato não são relevantes e um peptideomimético pode ser facilmente preparado baseado em uma dada estrutura de peptídeo ou um motivo de requeridos grupos funcionais. Apropriados substitutos de ligação amida incluem os seguintes grupos: N-alquilação (Schmidt, R. et al., Int. J. peptide Protein Res., 1995, 46, 47), amida retro - inversa (Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), tioamida (Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), tioéster, fosfonato, cetometileno (Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), hidróxi metileno, flúor vinila (Allmendinger, T. et al., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 7297), vinila, metileno amino (Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), metileno tio (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), alcano (Lavielle, S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) e sulfonamido (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).
[00016] Os compostos peptideomiméticos da presente invenção podem ter 9 subunidades identificáveis que são aproximadamente equivalentes em tamanho de função aos 9 aminoácidos catiônicos e lipofílicos. O termo ‘aminoácido’ assim pode ser aqui convenientemente usado para referir-se às equivalentes subunidades de um composto peptideomimético. Além disso, peptideomiméticos podem ter grupos equivalentes aos grupos R de aminoácidos e discussão aqui de apropriados grupos R e de grupos de modificação de N- e C-terminal aplica-se, mutatis mutandis, a compostos peptideomiméticos.
[00017] Como é discutido em "Drug Design and Development", Krogsgaard et al., 1996, assim como substituição de ligações amida, peptideomiméticos podem envolver a substituição de maiores metades estruturais com estruturas di- ou tri-peptideomiméticas e neste caso, metades miméticas envolvendo a ligação peptídica, tais como miméticos derivados de azol podem ser usadas como substituições dipeptídeo. Peptideomiméticos e assim cadeias principais peptideomiméticas onde justo as ligações amida foram substituídas como discutido acima são, entretanto, preferidas.
[00018] Apropriados peptideomiméticos incluem peptídeos reduzidos onde a ligação amida foi reduzida a uma metileno amina através de tratamento com um agente redutor, por exemplo, borano ou um reagente hidreto tal como hidreto de lítio alumínio. Uma tal redução tem a vantagem adicionada de aumento de cationicidade total da molécula.
[00019] Outros peptideomiméticos incluem peptoides formados, por exemplo, através de síntese em etapas de poliglicinas de funcionalidade amida. Algumas cadeias principais peptideomiméticas serão facilmente disponíveis de seus precursores peptídeos, tais como peptídeos que foram per-metilados, apropriados processos são descritos por Ostresh, J.M. et al. em Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 11138-11142. Condições fortemente básicas favorecerão N-metilação sobre O- metilação e resulta em metilação de alguns ou todos os átomos de nitrogênio nas ligações peptídicas e o nitrogênio de terminal-N.
[00020] Preferidas cadeias principais peptideomiméticas incluem poliésteres, poliaminas e seus derivados assim como alcanos e alquenos substituídos. Os peptideomiméticos preferivelmente terão Ne C-terminais que podem ser modificados como aqui discutido.
[00021] β e Y-aminoácidos assim como alfa aminoácidos são incluídos no termo ‘aminoácidos’, na medida em que são glicinas N- substituídas. Os compostos da invenção incluem beta peptídeos e depsipeptídeos.
[00022] Como discutido acima, os compostos da invenção incorporam pelo menos um, e preferivelmente um, aminoácido codificado não geneticamente. Quando este resíduo é representado por L’, compostos preferidos são representados pelas seguintes fórmulas: CCL'LCCLLC (1’) (SEQ ID NO: 6) CCLLCCLL'C (1") (SEQ ID NO: 7) CCLL'CCLLC (1"’) (SEQ ID NO: 8) LCCLL'CCLC (II’) (SEQ ID NO: 9)
[00023] São particularmente preferidos peptídeos de fórmulas I e II, e destes, peptídeos de formula I" são especialmente preferidos.
[00024] Preferivelmente, o peptídeo não é LTX-302 (SEQ ID NO: 11) (abaixo).
[00025] Os seguintes peptídeos como apresentados na Tabela 1 (com a exceção de LTX-302) são mais preferidos. Tabela 1
onde:
[00026] o código de letra simples padrão é usado para os aminoácidos codificados geneticamente . caixa menor representa D-aminoácidos . Dip é difenil alanina . Bip é bifenil alanina . Orn é ornitina . Dap é ácido 2,3-diamino propiônico . Dab é ácido 2,4-diamino butírico . 1-Nal é 1-naftil alanina . 2-Nal é 2-naftil alanina . Ath é ácido 2-amino-3-(antracen-9-il) propanoico . Phe(4,4’Bip) é ácido 2-amino-3-[1,1’:4’,1"-terfenil-4-il] propiônico
[00027] Todas as moléculas aqui descritas podem estar em forma de sal, éster ou amida.
[00028] Assim, é também provido de acordo com a presente invenção um composto selecionado do grupo consistindo em: LTX-301, LTX-303 - LTX-310, LTX-312 - LTX-321, LTX-323 - LTX-327, LTX-329, LTX-331 - LTX-336, e L^^ ou s^ do mesmo, éster ou amida. Assim, a presente invenção provê um composto tendo uma fórmula selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 10 e 12-42, ou um sal do mesmo, éster ou amida.
[00029] As moléculas são preferivelmente peptídeos e preferivelmente têm um terminal-C modificado, particularmente amidado. Peptídeos amidados podem eles próprios estarem em forma de sal e formas acetato são preferidas. Apropriados sais fisiologicamente aceitáveis são bem- conhecidos na técnica e incluem sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos, e incluem triflúor acetato assim como acetato e sais formados com HCl.
[00030] As moléculas aqui descritas são de natureza anfipática, sua 2a estrutura, que pode ou não tender na direção de formação de uma hélice-alfa, proporciona uma molécula anfipática em condições fisiológicas.
[00031] Ainda em um aspecto são providos os compostos da invenção, em particular os compostos de fórmulas I a V, especialmente os peptídeos de Tabela 1, para uso em terapia, particularmente para uso como um agente antitumor ou anticâncer, os termos são aqui usados sinonimamente.
[00032] Os compostos exibem atividade antitumor; em particular eles exercem um efeito citotóxico através de um direto mecanismo de afetação de membrana. Estas moléculas são líticas, desestabilizando ou mesmo perfurando a membrana de célula. Isto oferece uma distinta vantagem terapêutica sobre agentes que atuam sobre ou interagem com componentes protéicos das células alvos, por exemplo, receptores de superfície de célula. Embora mutações possam resultar em novas formas das proteínas- alvo conduzindo a resistência quimioterapêutica, é muito menos provável que mudanças radicais para as membranas de lipídeos possam ocorrer para evitar o efeito citotóxico.
[00033] Assim ainda em um aspecto são providos os compostos da invenção para uso na desestabilização e/ou permeabilização de membranas de células de tumor. Por ‘desestabilização’ é pretendido uma perturbação da configuração bicamada de lipídeo tridimensional normal incluindo mas não limitada a afinamento de membrana, aumentada permeabilidade de membrana (tipicamente não envolvendo canais) para água, íons ou metabólitos, etc.
[00034] A invenção provê processos de tratamento de tumores, ambos, tumores sólidos e não sólidos, através de administração de vários compostos aqui descritos. A quantidade administrada deve ser eficaz para matar todas ou uma proporção das células- alvo ou para prevenir ou reduzir sua taxa de multiplicação, ou para inibir metástase ou de outro modo diminuir o efeito danoso do tumor sobre o paciente. O clínico ou paciente deve observar aperfeiçoamento em um ou mais dos parâmetros ou sintomas associados com o tumor. Administração também pode ser profilática. O paciente tipicamente será um paciente humano, mas animais não humanos, como animais domésticos ou gado também podem ser tratados.
[00035] Diferente de maioria de agentes que têm proteínas-alvo, as moléculas da presente invenção podem ter como alvo uma ampla variedade de cânceres, como mostrado nos presentes exemplos. Cânceres-alvo preferidos incluem linfomas, leucemias, neuroblastomas e glioblastomas (por exemplo, do cérebro), carcinomas e adenocarcinomas (particularmente da mama, cólon, rim, fígado, ovário, pâncreas, próstata e pele) e melanomas. Câncer de mama é um alvo especialmente preferido.
[00036] Os peptídeos da invenção podem ser sintetizados em qualquer maneira conveniente. Geralmente os grupos reativos presentes (por exemplo, amino, tiol e/ou carboxila) serão protegidos durante todas as sínteses. A etapa final na síntese será assim a desproteção de um derivado protegido da invenção.
[00037] Na construção de peptídeo, pode-se em princípio partir tanto no terminal-C como o terminal-N embora o procedimento de partida de terminal-C seja preferido.
[00038] Processos de síntese de peptídeos são bem- conhecidos na técnica mas para a presente invenção pode ser particularmente conveniente realizar-se a síntese sobre um suporte de fase sólida, tais suportes sendo bem-conhecidos na técnica. Uma ampla escolha de grupos de proteção para aminoácidos são conhecidos e apropriados grupos de proteção de amina podem incluir carbo benzilóxi (também designado Z) t-butoxi carbonila (também designado Boc), 4-metoxi- 2,3,6-trimetil benzeno sulfonila (Mtr) e 9-fluorenil metoxi carbonila (também designado Fmoc). Será apreciado que quando o peptídeo é construído a partir do terminal-C, um grupo de proteção - amina estará presente sobre o grupo alfa amino de cada novo resíduo adicionado e precisará ser removido seletivamente antes de seguinte etapa de acoplamento.
[00039] Grupos de proteção de carboxila que podem, por exemplo ser empregados incluem grupos éster facilmente clivados tais como benzila (Bzl), p-nitro benzila (ONb), ou t-butila (OtBu) assim como os grupos de acoplamento sobre suportes sólidos, por exemplo, a amida Rink ligada a poliestireno.
[00040] Grupos de proteção tiol incluem p-metoxi benzila (Mob), tritila (Trt) e acetamido metila (Acm).
[00041] Peptídeos preferidos da invenção podem ser convenientemente preparados usando o grupo de proteção t-butiloxi carbonila (Boc) para as cadeias laterais amina de Lys, Orn, Dab e Dap assim como para proteção do nitrogênio indol dos resíduos triptofano. Fmoc pode ser usado para proteção dos grupos alfa amino. Para peptídeos contendo Arg, 2,2,4,6,7-penta metil di-hidro benzofurano-5- sulfonila pode ser usado para proteção da cadeia lateral guanidina.
[00042] Existe uma ampla faixa de procedimentos para remoção de grupos de proteção amina e carboxila. Estes, entretanto, têm de ser consistentes com a estratégia sintética empregada. Os grupos de proteção de cadeia lateral têm de ser estáveis para as condições usadas para remover o grupo de proteção alfa amino temporário antes da seguinte etapa de acoplamento.
[00043] Grupos de proteção de amina como Boc e grupos de proteção de carboxila como tBu podem ser removidos simultaneamente através de tratamento ácido, por exemplo, com ácido triflúor acético. Grupos de proteção tiol como Trt podem ser removidos seletivamente usando um agente de oxidação tal como iodo.
[00044] Referências e técnicas para síntese de compostos peptideomiméticos e as outras moléculas bioativas da invenção são aqui descritas e assim são bem- conhecidas na técnica.
[00045] Formulações compreendendo um ou mais compostos da invenção em mistura com um apropriado diluente, veículo ou excipiente constituem ainda um aspecto da presente invenção. Tais formulações podem ser, inter alia, para propósitos farmacêuticos (incluindo veterinários). Apropriados diluentes, excipientes e veículo são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00046] Embora seja possível para os compostos da presente invenção (ou seus sais, ésteres ou amidas) serem administrados como compostos puros, é preferível apresentar os mesmos como formulações farmacêuticas. Assim, formulações de acordo com a presente invenção preferivelmente compreendem pelo menos um composto, sal, éster ou amida como definida acima, junto com pelo menos um outro ingrediente terapêutico. Assim, a presente invenção estende-se a produtos de combinação incorporando o composto da presente invenção (ou um sal do mesmo, éster ou amida) e pelo menos um outro agente terapêutico.
[00047] Processos de tratamento de tumores que compreendem administração a um paciente humano ou animal de um ou mais dos compostos como aqui definidos constituem ainda um aspecto da presente invenção.
[00048] As composições de acordo com a invenção podem ser apresentadas, por exemplo, em uma forma apropriada para administração oral, tópica, nasal, parenteral, intravenosa, intratumoral, retal ou regional (por exemplo, perfusão de membro isolado). Administração tipicamente é através de uma via parenteral, preferivelmente através de injeção subcutânea, intramuscular, intracapsular, intraespinhal, intratumoral ou intravenosa.
[00049] Os compostos ativos aqui definidos podem ser apresentados nas formas convencionais de administração como comprimidos, comprimidos revestidos, sprays nasais, soluções, emulsões, lipossomos, pulverizados, cápsulas ou formas de liberação sustentada. Excipientes farmacêuticos convencionais assim como os processos usuais de produção podem ser empregados para a preparação destas formas.
[00050] Sistemas de veículos específicos orgânicos também podem ser usados.
[00051] Soluções de injeção, por exemplo, podem ser produzidas na maneira convencional, tal como através de adição de agentes preservativos, como p-hidroxi benzoatos, ou estabilizadores, como EDTA. As soluções são então enchidas em frascos ou ampolas de injeção. Formulações preferidas são aquelas nas quais os peptídeos são dissolvidos em solução salina. Tais formulações sendo apropriadas para uso em processos preferidos de administração, especialmente administração local, isto é, intratumoral, por exemplo, através de injeção ou através de perfusão / infusão de um membro, região do corpo ou órgão preferivelmente isolado (incluindo isolamento parcial).
[00052] Dosagens unitárias contendo as moléculas ativas preferivelmente contêm 0,1-10 mg, por exemplo, 1-5 mg do agente antitumor. As composições farmacêuticas adicionalmente podem ainda compreender ingredientes ativos, incluindo outros agentes citotóxicos tais como outros peptídeos antitumor. Outros ingredientes ativos podem incluir diferentes tipos de citocinas, por exemplo, IFN-y, TNF, CSF e fatores de crescimento, imunomoduladores, quimioterapêuticos, por exemplo, cisplatina ou anticorpos ou vacinas de câncer.
[00053] No emprego de tais composições sistemicamente, a molécula ativa está presente em uma quantidade para obter um nível em soro da molécula bioativa de pelo menos cerca de 5 μg/mL. Em geral, o nível em soro não precisa exceder 500 μg/mL. Um nível em soro preferido é cerca de 100 μg/mL. Tais níveis em soro podem ser obtidos através de incorporação de molécula bioativa em uma composição a ser administrada sistemicamente em uma dose de 1 a cerca de 10 mg/kg. Em geral, a(s) molécula(s) não precisa(m) ser administrada(s) em uma dose excedendo 100 mg/kg.
[00054] De acordo com a presente invenção também é provido um composto, sal, éster ou amida de acordo com a presente invenção em combinação com pelo menos uma vacina.
[00055] Como detalhado abaixo, experimentos mostraram que vacinação profilática com células de tumor lisadas com LTX-315 resulta em inibição de crescimento de tumor e mostra que os compostos da presente invenção são altamente eficazes como adjuvantes de vacina, e assim a presente invenção estende-se ao uso dos compostos (ou seus sais, ésteres ou amidas) em combinação com pelo menos uma vacina. Vacinas preferidas incluem, mas não são limitadas a, vacinas anticâncer contendo pelo menos uma proteína e/ou peptídeo com sequências de aminoácidos correspondendo a sequência(s) imunogênica de antígeno(s) associado a tumor (TAA), TAAs preferidos, mas não limitados a, são telomerase, ras p21 oncogênica survivina, abl, gip, gsp, ret, terk, e vacinas antivírus contendo pelo menos uma proteína e/ou peptídeo com sequência(s) de aminoácidos correspondendo a sequências imunogênicas de proteína(s) viral. Em adição, lisado de tumor pode ser usado. Exemplos de vacinas preferidas incluem vacinas, peptídeos, fragmentos de peptídeos e imunógenos ensinados por WO 92/14756, WO 00/66153 (NO 309798), WO 00/02581, WO 02/051994, WO 02/070679, WO 02/094312, WO 99/58552, e WO 99/58564.
[00056] É também provido de acordo com a presente invenção o uso de um composto, sal, éster ou amida ou combinação de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento, particularmente na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer e/ou na fabricação de uma vacina.
[00057] Preferivelmente, o medicamento é para o tratamento de tumores resistentes a multi-fármacos (MDR).
[00058] É também provida de acordo com a presente invenção uma embalagem farmacêutica compreendendo: (i) pelo menos uma vacina; e (ii) um composto, sal, éster ou amida de acordo com a presente invenção.
[00059] Com embalagens farmacêuticas, a pelo menos uma vacina e o composto, sal, éster ou amida podem ser administrados separadamente (por exemplo, com um retardo de tempo de cerca de, pelo menos, ou não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90 ou 120 minutos). A embalagem farmacêutica também pode, é claro, compreender instruções para administração.
[00060] É também provido de acordo com a invenção um processo de tratamento de um tumor, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto, sal, éster ou amida ou combinação de acordo com a presente invenção a um paciente em necessidade da mesma.
[00061] É também provido de acordo com a presente invenção um processo de vacinação compreendendo a etapa de administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto, sal, éster ou amida ou combinação de acordo com a presente invenção a um paciente.
[00062] É também provido de acordo com a presente invenção um processo de fabricação de um medicamento, compreendendo mistura de um composto tendo a fórmula de SEQ ID NO: 23 (LTX-315) ou um sal do mesmo, éster ou amida com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00063] É também provido de acordo com a presente invenção um processo de fabricação de um medicamento, compreendendo mistura de um composto tendo a fórmula de SEQ ID NO: 23 (LTX-315) ou um sal do mesmo, éster ou amida com células de tumor.
[00064] A invenção será agora ainda descrita nos seguintes Exemplos e com referência às figuras nas quais:
[00065] a figura 1 é um gráfico mostrando a porcentagem de morte de células vermelhas de sangue em uma série de experimentos para testar peptídeo LTX-315 em várias concentrações. O eixo-x mostra concentração de peptídeo (μg/mL). O eixo-y mostra % de morte de células;
[00066] a figura 2 mostra crescimento de tumor em camundongos reinoculados com células de linfoma de célula B A20 de murino comparado com crescimento nos animais controles a partir do estudo inicial. Diamantes indicam controles de estudos primários. Quadrados sólidos indicam camundongos reinoculados;
[00067] a figura 3 mostra crescimento de tumor em camundongos individuais reinoculados com células de linfoma de célula B A20 de murino tendo sido inicialmente tratados com LTX-315. Quadrados indicam Camundongos 1. Triângulos (base no fundo) indicam Camundongo 2. Triângulos (base no alto) indicam Camundongo 3. Diamantes indicam camundongo 4;
[00068] a figura 4 mostra crescimento de tumor em camundongos reinoculados com células de carcinoma de cólon CT26WT de murino comparado com crescimento nos animais controles. Diamantes indicam controles de estudos primários. Quadrados sólidos indicam camundongos reinoculados;
[00069] a figura 5 mostra crescimento de tumor em camundongos individuais reinoculados com células de carcinoma de cólon CT26WT de murino tendo sido inicialmente tratados com LTX-315. Quadrados pequenos indicam Camundongo 1. Triângulos pequenos (base no fundo) indicam Camundongo 2. Triângulos pequenos (base no alto) indicam Camundongo 3. Diamantes pequenos indicam Camundongo 4; círculos indicam camundongo 5. Quadrados grandes indicam Camundongo 6. Triângulos grandes (base no fundo) indicam Camundongo 7. Triângulos grandes (base no alto) indicam Camundongo 8. Diamantes grandes indicam Camundongo 9;
[00070] a figura 6 mostra crescimento de linfomas de células B A20 em camundongos irradiados que receberam esplenócitos de camundongos doadores mostrando completa regressão de tumor seguindo tratamento com LTX-315 (Grupo 1) ou camundongos controles (Grupo 2) que receberam esplenócitos de camundongos doadores naturais. Quadrados indicam Grupo 1 (camundongos que receberam esplenócitos de doadores mostrando completa regressão). Diamantes indicam Grupo 2 (camundongos que receberam esplenócitos de doadores naturais);
[00071] a figura 7 mostra efeito anticâncer de dois diferentes regimes de tratamento sobre tumores A20 murinos sólidos (Grupos 1 e 2) como comparados a controles não tratados (Grupo 3). Triângulos sólidos invertidos (base no alto) indicam Grupo 1 (tratamento). Quadrados abertos indicam Grupo 2 (tratamento + adjuvante). Triângulos abertos (base embaixo) indicam Grupo 3 (controle). Ordem de tamanho de tumor (mm2) no Dia 21 é (maior para menor): Grupo 3, Grupo 1, Grupo 2.
[00072] Em resumo, os Exemplos abaixo mostram:
[00073] Exemplo 1 - que LTX-315 é o mais potente dos 5 compostos testados em um estudo de atividade citotóxica in vitro contra um painel de 37 linhagens de células de câncer humano.
[00074] Exemplo 2 - que LTX-315 é o mais potente dos 5 compostos testados em um estudo in vitro de atividade citotóxica contra um painel de 10 linhagens de células de linfoma.
[00075] Exemplo 3 - que LTX-315 tem um valor EC50 médio maior que 1200 μg/mL (833 μM) contra células vermelhas de sangue humano.
[00076] Exemplo 4 - que a atividade antitumor de LTX-315 resultou em uma completa resposta de tumor em 3 de 7 camundongos tratados para o Grupo recebendo dose opcional (Grupo 1) em uma investigação no efeito de LTX-315 em diferentes níveis de doses sobre um linfoma de célula B A20 murina em camundongos.
[00077] Exemplo 5 - que quatro diferentes regimes de tratamento de LTX-315 demonstraram um forte efeito antitumor contra tumores CT26WT murinos (resistentes a multi-fármacos).
[00078] Exemplo 6 - que LTX-315 tem um amplo espectro de atividade contra várias linhagens de células de câncer resistentes a multi - fármacos e, significantemente, um efeito citotóxico muito mais fraco sobre células humanas normais.
[00079] Exemplo 7 - que completa regressão de tumor seguindo tratamento inicial de tumores murinos sólidos com LTX-315 resultou em uma forma de proteção de longo termo endógena contra crescimento dos mesmos tumores seguindo reinoculação.
[00080] Exemplo 8 - que o tratamento com LTX-315 pode conferir proteção de longo termo contra específicos tumores através de elicitação de uma resposta imune.
[00081] Exemplo 9 - que uma resposta de célula imune anti A20 foi induzida pela injeção do coquetel de LTX-315 e células A20 lisadas.
[00082] Estudo de atividade citotóxica in vitro de 5 compostos testes contra um painel de 37 linhagens de células de câncer humanas1. Alvo de Estudo - determinar as concentrações de cinco novos compostos para obter uma inibição de 50% de proliferação (IC50) contra um painel de 37 linhagens de células de câncer humanas 2. Materiais e Processos 2.1 Substâncias Testes 2.1.1 Substâncias Testes
[00083] Substâncias testes, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 e LTX-329 (vide Tabela 1) providas em forma pulverizada. 2.1.2 Controle Positivo
[00084] Triton X-100 foi usado como controle positivo, fornecido por Oncodesign (Dijon, France) de Sigma (Saint Quentin Fallavier, France). 2.1.3 Veículo fármaco e condições de estocagem
[00085] Compostos foram estocados a 4oC. Pulverizado foi primeiro dissolvido em meio de cultura livre de soro (RPMI 1640, Lonza, Verviers, Belgium) e ainda diluído usando meio de cultura livre de célula para obter apropriadas diluições. Solução estoque não foi estocada e foi preparada recente no dia de experimento.
[00086] Triton X-100 1% (concentração final) foi obtido através de diluição usando meio de cultura. 2.2 Linhas de células de tumor e condições de cultura 2.2.1 Linhas de células de tumor
[00087] Linhas de células de câncer e meios de cultura foram adquiridos e providos por Oncodesign.
a - Pharmacell, Paris b - ATCC, Manassas, Virgínia, USA
[00088] Células de tumor foram crescidas como monocamadas aderentes ou como suspensões a 37oC em uma atmosfera umedecida (5% CO2, 95% de ar). O meio de cultura foi RPMI 1640 contendo L- glutamina a 2 mM (Lonza, Belgium) e suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS, Lonza). Para uso experimental, as células aderentes foram separadas do frasco de cultura através de um tratamento de 5 minutos com tripsina - verseno (Lonza), diluídas em meio de Hank sem cálcio ou magnésio (Lonza) e neutralizadas pela adição de meio de cultura completo. Células foram contadas em um hemocitômetro e sua viabilidade foi avaliada através de exclusão de azul de tripan 0,25%.
[00089] Deteção de micoplasma foi realizada usando o MycoAlert (RTM) Mycoplasma Detection Kit (Lonza) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as células testadas foram verificadas serem negativas para contaminação com micoplasma.
[00090] Células de tumor foram revestidas em placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços (Nunc, Dutscher, Brumath, France) e incubadas a 37oC por 24 horas antes de tratamento em 190 microlitros de meio de cultura livre de fármaco suplementado ou não com FBS 10% para linhagens de células crescendo aderentes ou em suspensão, respectivamente.
[00091] Densidades de implante para cada linhagem de células são resumidas na Tabela 2 abaixo: Tabela 2
[00092] As linhagens de células aderentes foram lavadas uma vez com 200 microlitros de meio de cultura isento de FBS antes de tratamento. Células de tumor foram incubadas por 4 horas com 10 concentrações de compostos em etapa de diluição de % com uma dose superior de 400 micromolar (faixa 4x10-4 a 4x10-10 M), com Triton X-100 a 1% (concentração final) como controle positivo e meio de cultura isento de FBS como controle negativo. As células (190 microlitros) foram incubadas em um volume final de 200 microlitros de meio de cultura isento de FBS contendo substâncias testes a 37oC e de CO2 a 5%.
[00093] Três (3) experimentos independentes foram realizados, cada concentração sendo testada em quadruplicata. Células controles foram tratadas com veículo sozinho. No final dos tratamentos, a atividade citotóxica foi avaliada através de um ensaio MTS (vide § 3.3).
[00094] Diluições de composto testadas assim como distribuição para placas contendo células foram realizadas usando um sistema de manuseio de líquidos Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences S.A.). De acordo com uso de autômato, uma faixa simples de concentrações foi testada quaisquer linhagens de células que fossem testadas. A faixa não foi adaptada para cada linhagem de células.
[00095] A atividade citotóxica in vitro da substância teste foi revelada por um ensaio MTS (BALTROP J.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614) usando um novo composto tetrazolium (MTS, 3-(4,5- dimetil tiazol-2-il)-5-(3-carboxi metoxi fenil)-2-(4-sulfo fenil)-2H- tetrazolium) e um reagente de acoplamento de elétrons chamado PMS (metossulfato de fenazina). Como MTT, MTS é biorreduzido por células em um produto formazano que é diretamente solúvel em meio de cultura sem processamento, diferente de MTT.
[00096] No final do tratamento de células, 40 microlitros de uma solução recentemente combinada filtrada 0,22 micromolar de MTS (20 mL em 2 mg/mL, Ref G1111, batelada 235897, Exp 03/2009, Promega, Charbonniéres, France) e PMS (1 mL em 0,92 mg/mL, Ref P9625, Batelada 065K0961, Sigma) em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, Ref 17-513Q, Batelada 6MB0152, Cambrex), foram adicionados em cada poço. Placas de cultura foram incubadas por 2 horas a 37oC. Absorbância (OD) foi medida em 490 nm em cada poço usando contador VICTOR 1420 multilabeled (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, France).
[00097] A resposta de dose de inibição de proliferação (IC) foi expressa como se segue:
[00098] Os valores OD são a média de 4 medições experimentais.
[00099] IC50: concentração de fármaco para obter uma inibição de 50% de proliferação de células.
[000100] As curvas de dose - resposta foram plotadas usando XLFit3 (IDBS, United Kingdom). Os valores de determinação de IC50 foram calculados usando o software XLFit 3 a partir de curvas semi-log. Valores de determinação de IC50 individuais assim como valores médios e SD foram gerados.
[000101] O índice de resistência foi calculado usando a seguinte fórmula:
[000102] Índice de resistência foi calculado para cada composto para cada par de linhagens de células sensíveis e resistentes. Índice de resistência individual foi calculado quando valores de IC50 de ambas linhagens de células sensíveis e resistentes correspondentes foram determinadas dentro do mesmo experimento. Em adição, índice de resistência também foi calculada razão de valores de IC50 média obtidos durante três experimentos independentes.
[000103] Todas as trinta e sete (37) linhagens de células de tumor humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-302 com valores de IC50 variando de 4,83+/-0,96 μM a 20,09+/-4,07 μM para linhagens de células T-47D e Hep G2, respectivamente.
[000104] Valor de IC50 médi0o para composto LTX-302 obtido sobre as 37 linhagens de células de tumor foi de 12,05 +/- 4,27 μM com um valor médio de 11,70 μM. Valor médio de IC50 obtido para a linhagem de células normais (HUV-EC-C) foi maior que para qualquer uma das linhagens de células de tumor.
[000105] Linhas de células de câncer de pulmão e hematológico foram as mais sensíveis a composto LTX-301 (valores de IC50 médios 7,96 μM (n = 7) e 9,02 μM (n = 3) para linhagens de células de câncer hematológico e de pulmão, respectivamente) enquanto linhagens de células de câncer de fígado foram as mais resistentes (valor de IC50 médio de 17,84 μM, n = 2).
[000106] Atividade do composto LTX-302 pareceu ser levemente diminuída por resistência adquirida na direção de doxorubicina como exibida pelos valores RI de ambas linhagens de células HL-60/ADR e MCF-7/mdr (1,31 e 1,23 para linhagens de células HL-60/ADR e MCF- 7/mdr, respectivamente). Ao contrário, atividade de composto LTX-302 pareceu ser aumentada por resistência adquirida na direção de cisplatina como exibida por um valor RI de 0,33 para linhagem de células IGROV-1/CDDP.
[000107] Todas as trinta e sete (37) linhagens de células de tumor humanas foram sensíveis a composto LTX-313 com valores IC50 variando de 4,01+/-0,39 μM a 18,49+/-4,86 μM para linhagens de células RPMI 8226 e U-87 MG, respectivamente.
[000108] Valor de IC50 médio para composto LTX-313 obtido sobre as 37 linhagens de células de tumor foi de 9,60 +/- 3,73 μM com um valor médio de 8,
[000109] 83 μM. Valor de IC50 médio obtido para a linhagem de células normais (HUV-EC-C) foi maior que para qualquer uma das linhagens de células de tumor.
[000110] Linhas de células de câncer hematológico foram as mais sensíveis a composto LTX-313 (valor IC50 médio de 7,04 micromolar, n = 7), enquanto linhagens de células de câncer de fígado foram as mais resistentes (valor IC50 médio de 13,71 micromolar, n = 2).
[000111] Atividade de composto LTX-313 pareceu não ser modificada por resistência adquirida na direção de doxorubicina como exibida pelos valores RI de linhagens de células CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR e MCF-7/mdr (0,76, 1,16 e 1,24 para linhagens de células CCRF- CEM/VLB, HL-60/ADR e MCF-7/mdr, respectivamente). Ao contrário, a atividade de composto LTX-313 pareceu ser aumentada por resistência adquirida na direção de cisplatina como exibida por um valor RI de 0,49 para linhagem de células IGROV-1/CDDP.
[000112] Todas as trinta e sete (37) linhagens de células de tumor humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-315 com valores IC50 de 1,18 +/- 0,25 μM a 7,16 +/- 0,99 μM para linhagens de células T- 47D e SK-OV-3, respectivamente.
[000113] Valor IC50 médio para composto LTX-315 obtido sobre as 37 linhagens de células de tumor foi de 3,63 +/- 1,45 micromolar com um valor médio de 3,27 micromolar. Valor de IC50 médio obtido para a linhagem de células normais (HUV-EC-C) foi maior que para qualquer uma das linhagens de células de tumor.
[000114] Linhas de células de câncer de mama, hematológico e pulmão foram as mais sensíveis a composto LTX-315 (valores de IC50 médios de 2,45 micromolar (n = 5), 2,60 micromolar (n = 7) e 2,83 micromolar (n = 3) para linhagens de células de câncer de mama, hematológico e pulmão, respectivamente) enquanto linhagens de células de câncer de fígado foram as mais resistentes (valor IC50 médio de 5,86 micromolar, n = 2).
[000115] Atividade de composto LTX-315 pareceu ser levemente diminuída através de resistência adquirida na direção de doxorubicina como exibida pelo valor RI de linhagens de células HL-60/ADR e MCF-7/mdr (1,45 e 1,12 para linhagens de células HL-60/ADR e4 MCF-7/mdr, respectivamente). Ao contrário, atividade de composto LTX-315 apreceu ser aumentada por resistência adquirida na direção de cisplatina como exibida por um valor RI de 0,50 para linhagem de células IGROV-1/CDDP. 5.4. LTX-320
[000116] Todas as trinta e sete (37) linhagens de células testadas foram sensíveis a composto LTX-320 com valores de IC50 variando de 3,46 +/- 0,22 micromolar a 16,64 +/- 3,15 micromolar para linhagens de células T-47D e Hep G2, respectivamente.
[000117] Valor de IC50 médio para composto LTX-320 obtido sobre as 37 linhagens de células de tumor foi de 7,58 +/- 2,79 micromolar com um valor médio de 6,92 micromolar. Valor de IC50 médio para a linhagem de células normais (HUV-EC-C) foi maior que para qualquer uma das linhagens de células de tumor.
[000118] Linhas de células de câncer hematológico, de mama, rim e cérebro foram as mais sensíveis a composto LTX-320 ((valores IC50 médios de 6,04 micromolar (n = 7), 6,60 micromolar (n = 5), 6,60 micromolar (n = 2) e 6,92 micromolar (n = 3) para linhagens de células de câncer hematológico, mama, rim e cérebro, respectivamente), enquanto linhagens de células de câncer de fígado foram as mais resistentes (valor IC50 médio de 11,46 micromolar, n = 2).
[000119] Atividade de composto LTX-320 pareceu não ser modificada por resistência adquirida na direção de doxorubicina como exibida pelos valores de RI de linhagens de células HL-60/ADR e MCF-7/mdr (0,90 e 1,19 para linhagens de células HL-60/ADR e MCF-7/mdr, respectivamente). Ao contrário, atividade de composto LTX-320 pareceu ser aumentada por resistência adquirida na direção de cisplatina como exibida por um valor RI de 0,49 para linhagem de células IGROV-1/CDDP.
[000120] Todas as trinta e sete (37) linhagens de células de tumor humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-329 com valores IC50 variando de 2,43 +/- 0,34 micromolar a 16,90 +/- 1,18 micromolar para linhagens de células T-47D e U-87 MG, respectivamente.
[000121] Valor IC50 médio para composto LTX-329 obtido sobre as 37 linhagens de células de tumor foi 8,17 +/- 3,20 micromolar com um valor médio de 7,89 micromolar. Valor IC50 médio obtido para a linhagem de células normais (HUV-EC-C) foi maior que para qualquer uma das linhagens de células de tumor.
[000122] Linhagens de células de câncer de mama e hamatológico foram as mais sensíveis a composto LTX-329 (valores IC50 médios de 4,92 micromolar (n = 5) e 5,26 micromolar (n = 7) para linhagens de células de câncer de mama e hematológico, respectivamente) enquanto linhagens de células de câncer de ovário foram as mais resistentes (valor IC50 médio de 13,37 micromolar, n = 4).
[000123] Atividade de composto LTX-329 pareceu não ser modificada por resistência adquirida na direção de doxorubicina como exibida pelos valores RI de linhagens de células CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR e MCF-7/mdr (0,76, 0,80 e 1,07 para linhagens de células CCRF- CEM/VLB, HL-60/ADR e MCF-7/mdr, respectivamente). Ao contrário, atividade de composto LTX-329 pareceu ser aumentada por resistência adquirida na direção de cisplatina como exibida por um valor RI de 0,46 para linhagem de células IGROV-1/CDDP.
[000124] Linhagens de células de câncer de mama T-47D é a linhagem de células mais sensível qualquer que seja o composto LTX testado.
[000125] Linhagens de células de câncer hematológico são o tipo hematológico mais sensível para todos os cinco compostos testados, linhagens de células de câncer de fígado e ovário estando dentro das linhagens de células mais resistentes.
[000126] Todos os cinco compostos testados exibiram mais alta atividade sobre linhagem de células IGROV-1/CDDP (resistente a cisplatina) que sobre linhagem de células de câncer de ovário IGROV-1 patente. Resistência a doxorubicina pareceu diminuir levemente a atividade de compostos LTX.
[000127] O composto LTX-315 é o composto mais potente dos cinco compostos testados.
[000128] Todos os cinco compostos testados (isto é, LTX-302, LTX- 313, LTX-315, LTX-320 e LTX-329) exibiram atividade citolítica contra 37 linhagens de células de câncer humanas testadas com valores de IC50 em faixa de micromolar a dez micromolar.
[000129] O composto LTX-315 é o composto mais potente testado com valores de IC50 entre 1 e 5 micromolar sobre todas as 37 linhagens de células de câncer humanas testadas.
[000130] Estudo de atividade citotóxica in vitro de 5 compostos testes contra um painel de 10 linhagens de células de linfoma 1. Alvo de Estudo
[000131] Determinar as concentrações de cinco novos compostos para obter uma inibição de 50% de proliferação (IC50) contra um painel de 10 linhagens de células de linfoma. 2. Materiais e Processos 2.1. Substâncias Testes 2.1.1. Substâncias Testes
[000132] Substâncias testes, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 e LTX-3219 (vide Tabela 1) providas em forma pulverizada.
[000133] 2.1.2. Controle Positivo
[000134] Triton X-100 foi usado como controle positivo e fornecido por Oncodesign (Dijon, France) de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Frane). 2.1.3. Veículo de fármaco e condição de estocagem
[000135] Compostos foram estocados a 4oC. Pulverizado foi primeiro dissolvido em meio de cultura livre de soro (RPMI 1640, Lonza, Verviers, Belgium) e ainda diluídos usando meio de cultura livre de soro para atingir apropriadas diluições. Solução estoque não foi estocada e foi preparada fresca no dia de experimento.
[000136] Triton X-100 1% (concentração final) foi obtido por diluição usando meio de cultura. 2.2. Linhas de células de tumor e condições de cultura 2.2.1. Linhagens de células de tumor
[000137] Linhagens de células de câncer e meios de cultura foram adquiridas e providas por Oncodesign.
a American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia, USA b Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen Gmbh, Braunschweig, Germany 2.2.2. Condições de Cultura
[000138] Células de tumor foram crescidas como suspensões a 37oC em uma atmosfera umedecida (CO2 a 5%, ar a 95%). O meio de cultura para cada linhagem de células é descrito na Tabela 3 abaixo. Para uso experimental, células foram contadas em um hemocitômetro e sua viabilidade foi avaliada através de exclusão de azul de trypan 0,25%. Tabela 3
[000139] Detecção de micoplasma foi realizada usando o MycoAlert (RTM) Mycoplasma Detection Kit (Lonza) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as células testadas foram verificadas serem negativas para contaminação com micoplasma.
[000140] Células de tumor foram revestidas em placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços (Nunc, Dutscher, Brumath, France) e incubadas a 37oC por 24 horas antes de tratamento em 190 microlitros de meio de cultura livre de FBS e livre de fármaco .
[000141] Densidades de implantação para cada linhagem de células são resumidas na Tabela 4 abaixo: Tabela 4
[000142] Células de tumor foram incubadas por 4 horas com 10 concentrações de compostos em etapa de diluição de % com uma dose superior de 400 micromolar (faixa de 4x10-4 a 4x10-10 M), com Triton X100 1% (concentração final) como controle positivo e meio de cultura isento de FBS como controle negativo. As células (190 microlitros) foram incubadas em um volume final de 200 microlitros de meio de cultura livre de FBS contendo substâncias testes a 37oC sob CO2 a 5%.
[000143] Três experimentos independentes foram realizados, cada concentração sendo em quadruplicata. Células controles foram tratadas com veículo sozinho. No final dos tratamentos, a atividade citotóxica foi avaliada através de um ensaio MTS (vide 3.3 abaixo).
[000144] Diluições de composto testado assim como distribuição para placas contendo células foram realizadas usando um sistema de manuseio de líquidos Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences S.A.). De acordo com uso automatizado, uma única faixa de concentrações foi testada para quaisquer linhagens de células a serem testadas. A faixa não foi adaptada para cada linhagem de células.
[000145] A atividade citotóxica in vitro da substância teste foi revelada através de um ensaio MTS (Baltorp et al.) usando um novo composto tetrazolium (MTS, 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-5-(3-carboxi metoxi fenil)-2- (4-sulfo fenil)-2H-tetrazolio) e um reagente de acoplamento de elétrons chamado PMS (metossulfato de fenazina). Como MTT, MTS é biorreduzido por células em um produto formazano que é diretamente solúvel em meio de cultura sem processamento, diferente de MTT.
[000146] No fim do tratamento de células, 40 microlitros de uma solução recentemente combinada filtrada em 0,22 micrometros, de MTS (20 mL em 2 mg/mL, Ref G1111, Batelada 235897, Exp 03/2009, Promega, Charbonnières, France) e PMS ((1 mL em 0,92 mg/mL, Ref P9625, Batelada 065K0961, Sigma) em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, Ref 17-513Q, Batelada 6MB0152, Cambrex), foram adicionados em cada cavidade. Placas de cultura foram incubadas por 2 horas a 37oC. Absorbância (OD) foi medida em 490 nm em cada cavidade usando contador VICTOR 1420 multilabeled (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, France). 4. Apresentação de Dados 4.1. Dados de IC50 foram determinados como no exemplo 1. 5. Resultados 5.1. LTX-302
[000147] Todas as dez (10) linhagens de células de linfoma humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-302 com valores de IC50 variando de 5,30 +/- 2,02 micromolar a 12,54 +/- 3,52 micromolar para linhagens de células U-937 e Raji, respectivamente.
[000148] Valor IC50 médio para composto LTX-302 obtido sobre 10 linhagens de células sensíveis foi 8,11 +/- 2,44 micromolar com um valor médio de 7,53 micromolar. 5.2. LTX-313
[000149] Todas as dez (10) linhagens de células de linfoma humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-313 com valores de IC50 variando de 3,21 +/- 2,81 micromolar a 16,08 +/- 4,86 micromolar parra linhagens de células Ramos e Raji, respectivamente.
[000150] Valor de IC50 médio para composto LTX-313 obtido sobre 10 linhagens de células sensíveis foi 7,05 +/- 3,91 micromolar com um valor médio de 5,89 micromolar. 5.3. LTX-315
[000151] Todas as dez (10) linhagens de células de linfoma humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-315 com valores de IC50 variando de 1,15 +/- 0,42 micromolar a 4,93 +/- 1,03 micromolar para linhagens de células U-937 e Raji, respectivamente.
[000152] Valor de IC50 médio para composto LTX-315 obtido sobre 10 linhagens de células sensíveis foi 3,01 +/- 1,36 micromolar com um valor médio de 2,93 micromolar. 5.4. LTX-320
[000153] Todas as dez (10) linhagens de células de linfoma humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-320 com valores de IC50 variando de 2,22 +/- NA micromolar a 11,26 +/- 3,42 micromolar para linhagens de células Hs 445 e Raji, respectivamente.
[000154] Valor de IC50 médio para composto LTX-320 obtido sobre 10 linhagens de células sensíveis foi 5,03 +/- 2,82 micromolar com um valor médio de 4,84 micromolar. 5.5. LTX-329
[000155] Todas as dez (10) linhagens de células de linfoma humanas testadas foram sensíveis a composto LTX-329 com valores de IC50 variando de 2,46 +/- NA micromolar a 8,70 +/- 1,70 micromolar para linhagens de células Hs 445 e Raji, respectivamente.
[000156] Valor de IC50 médio para composto LTX-329 obtido sobre 10 linhagens de células sensíveis foi 5,76 +/- 2,27 micromolar com um valor médio de 5,72 micromolar. 5.6. Comentários Gerais
[000157] Linhas de células KARPAS-299 e Raji são as linhagens de células mais resistentes qualquer que seja o composto LTX testado.
[000158] Linhas de células Hs 445, Ramos e U-937 são as linhagens de células mais sensíveis qualquer que seja o composto LTX testado.
[000159] Composto LTX-315 é o composto mais potente dos cinco compostos testados. 6. Conclusões
[000160] Todos os cinco compostos testados (isto é, LTX-302, LTX- 313, LTX-315, LTX-320 e LTX-329) exibiram atividade citolítica contra as 10 linhagens de células de linfoma humanas testadas com valores de IC50 na faixa micromolar.
[000161] O composto LTX-315 é o composto mais potente testado com valores de IC50 entre 1 e 5 micromolar sobre todas as 10 linhagens de células de linfoma humanas testadas. Exemplo 3 Atividade hemolítica in vitro Princípio de teste
[000162] A atividade hemolítica do peptídeo LTX-315 contra células vermelhas de sangue humano foi medida. Materiais e Processos
[000163] Sangue humano recentemente coletado foi centrifugado em 1500 rpm por 10 minutos de modo a isolar as células vermelhas do sangue. As células vermelhas do sangue (RBC) foram lavadas três vezes com PBS [tampão fosfato a 35 mM com NaCl a 150 mM, pH 7,4] através de centrifugação em 1500 rpm por 10 minutos, e ajustadas para 10% hematócrito com PBS. Soluções de LTX-315 foram adicionadas para render uma faixa de concentração final do peptídeo de 1200 μg/mL a 1 μg/mL e uma concentração de RBC de 1%. A suspensão resultante foi incubada com agitação por uma hora a 37oC. Após incubação, a suspensão foi centrifugada em 4000 rpm por 5 minutos, e a hemoglobina liberada foi monitorada através de medição de absorbância do sobrenadante em 405 nm. PBS foi usado como controle negativo e assumido não causar hemólise. Triton 0,1% foi usado como controle positivo e assumido causar completa hemólise. Substância Teste: LTX-315 Substâncias Referências: PBS (controle negativo) e Triton X-100 (controle positivo) Componentes de misturas de reação: LTX-315, Triton X-100 10%, PBS e RBC (hematócrito 10%)
[000164] Hemoglobina liberada foi monitorada através de medição de absorbância do sobrenadante em 405 nm, e porcentagem de hemólise foi calculada através da equação:
[000165] % de hemólise = [(A405 LTX-315 - A405 PBS) / (A405 Triton X 100 0,1% - A405 PBS)] x 100
[000166] A concentração de LTX-315 correspondendo a 50% de hemólise (EC50) foi determinada a partir de uma curva de dose - resposta. Resultados
[000167] Os valores médios de cinco experimentos diferentes com desvio- padrão são apresentados abaixo. Os dados também são representados na figura 1. A figura 1 mostra que LTX-315 tem um valor médio de EC50 maior que 1200 μg/mL (833 μM).
[000168] O objetivo do estudo foi investigar o efeito de LTX-315 em diferentes níveis de dose sobre um linfoma de célula B A20 murino em camundongos. Materiais Processos
[000169] A administração ocorreu através de injeção intratumoral de LTX-315 dissolvido em solução salina estéril.
[000170] Camundongos fêmeas foram inoculados subcutaneamente no abdômen com 5 milhões de células A20 murinas (ATCC, LGC Promochem AB, Middlesex, England) em um volume de 50 microlitros. Os camundongos foram divididos em quatro grupos (vide Tabela 5 abaixo para detalhes). O tratamento intratumoral foi iniciado quando os tumores atingiram o desejado tamanho de aproximadamente 5 mm em diâmetro (mínimo de 20 mm2).
[000171] Três níveis de doses de LTX-315, 1 mg (Grupo 1), 0,5 mg (Grupo 2) e 0,25 mg (Grupo 3) por injeção, foram investigados. O volume foi de 50 microlitros para todas as injeções. LTX-315 foi dissolvido em solução de água e NaCl a 0,9% estéril . Este veículo foi usado como controle (Grupo 4). Todos os quatro grupos receberam três injeções.
[000172] Os camundongos foram monitorados durante o estudo através de medição de tumores e pesagem de animais regularmente. Os camundongos foram seguidos até a máxima carga de tumor de 125 mm2 ser atingida, ou até sérios eventos adversos terem ocorrido (isto é, formação de ferimento com repetidos tratamentos durante o período de acompanhamento), então os camundongos foram sacrificados. Um calibre foi usado para medições de tamanho de tumor e pesagem e exame físico foram usados como controles de saúde.
[000173] Animais: camundongos Balb/c fêmeas livres de patógeno específico, 6-8 semanas de idade, fornecidos por Harlan (England, UK).
[000174] Condicionamento de animais: animais foram mantidos com ração de laboratório- padrão e água.
[000175] Peso médio de corpo, dose, via e esquema de tratamento são dados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5
* Dia 1 é o primeiro dia de tratamento
[000176] O efeito antitumor dos vários tratamentos é apresentado como tamanho médio de tumor na Tabela 6 abaixo. Tabela 6
* tamanho de tumor antes d e início de tratamento no primeiro dia de tratamento
[000177] O grau de resposta de tumor nos diferentes grupos de tratamento é resumido na Tabela 7 abaixo. Tabela 7
Discussão / Conc usões
[000178] No grupo 3, recebendo a mais baixa dose de LTX-315 (0,25 mg/dose), um pequeno efeito inibidor é observado durante os primeiros dias. Em Grupo 1 e Grupo 2, recebendo doses de LTX-315 de 1,0 mg / dose e 0,5 mg / dose respectivamente, todos os animais mostraram parcial ou completa resposta de tumor. Foi verificado que a atividade antitumor resultou em uma completa resposta de tumor em 3 de 7 camundongos tratados do grupo recebendo a dose ótima (Grupo 1).
[000179] Necrose geralmente mais forte e mais formação de ferimento foram observados no Grupo 1 comparado aos outros dois grupos. Exceto pela formação de ferimento nenhum outro efeito adverso ou efeitos tóxicos foram observados em qualquer grupo de animais.
[000180] Ambas doses de 1 mg e 0,5 mg de LTX-315 demonstraram um forte e rápido efeito antitumor no primeiro período do estudo. Entretanto, na medida em que o estudo progride mais animais no Grupo 2 recorrem que no Grupo 1.
[000181] O efeito de LTX-315 sobre tumores de carcinoma de cólon CT26WT murino em camundongos Materiais e Processos
[000182] A administração ocorre via injeção intratumoral de LTX-315 dissolvido em solução salina estéril (NaCl a 0,9% em água estéril).
[000183] Cada um de um total de 40 camundongos fêmeas foi inoculado com cinco milhões de células CT26WT murinas (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Sweden) subcutaneamente sobre a superfície de abdômen em um volume de 50 microlitros. Os camundongos foram divididos em cinco grupos, 8 camundongos em cada grupo. Quando os tumores atingiram o desejado tamanho de 20 mm2 o tratamento através de injeção intratumoral foi iniciado. O Grupo um foi tratado somente no dia 1, Grupo dois no dia 1 e 2, Grupo três no dia 1 e 3 e Grupo 4 no dia 1, 2 e 3. Todos os tratamentos diários foram injeção única de 1,0 mg de LTX-315 dissolvido em 50 microlitros (20 mg/mL). Grupo cinco foi tratado com 50 microlitros de veículo para LTX-315 (Grupo 5).
[000184] Os camundongos foram monitorados durante o estudo através de medição de tumores (calibre digital) e pesagem de animais regularmente. Os camundongos foram acompanhados até a carga máxima de tumor de 125mm2 ser atingida, ou até sérios efeitos adversos ocorrerem (isto é, formação de ferimento devido a repetidas injeções), então os camundongos foram sacrificados. Pesagem e exame físico foram usados como controles de saúde.
[000185] Animais: camundongos Balb/c fêmeas livres de patógeno específico, 6-8 semanas de idade, supridos de Harlan (England, UK)
[000186] Condicionamento de animais: condições de instalação de animal padrão.
[000187] Peso médio de corpo, dose, via e esquema de tratamento são dados na Tabela 8 abaixo. Tabela 8 Grupo Número de animais Peso inicial de corpo (g; média +/- SE) Tratamento Dose Via Esquema (dia*)
* Dia 1 é o primeiro dia de tratamento Resultados
[000188] O efeito antitumor dos vários tratamentos é apresentado como tamanho médio de tumor na Tabela 9 abaixo. Tabela 9
* Tamanho de tumor antes de início de tratamento no primeiro dia de tratamento
[000189] Completa resposta de tumor foi observada na vasta maioria de todos os animais tratados com LTX-315. O grau de resposta de tumor nos diferentes grupos de tratamento está 'resumido na Tabela 10 abaixo. Tabela 10
Discussão / Conclusões
[000190] O tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram o desejado tamanho de um mínimo de 20 mm2 e animais foram sacrificados quando os tumores atingiram a carga máxima de tumor de 125 mm2.
[000191] O fim de estudo foi definido como dia 17 quando seis de oito animais controles (Grupo 5) foram sacrificados.
[000192] Todos os regimes de tratamento com LTX-315 resultaram em forte efeito antitumor CT26WT.
[000193] Um total de 27 dos 32 animais tratados foi observado com uma completa resposta de tumor e quatro com uma resposta parcial. Somente um animal (no Grupo 3) não tem uma resposta para o tratamento. Os resultados apresentados mostram que todos os quatro grupos tratados têm resposta de tumor total muito similares, os dados também indicam que o grau de reincidência de tumor foi maior no Grupo 2 que no Grupo 1, 3 e 4. Em adição, menos animais foram observados serem livres de tumor no fim de acompanhamento em Grupo 2 (figura 2).
[000194] Necrose e completa resposta de tumor foram observadas em todos os grupos tratados. No grupo 1 quatro de oito animais, no Grupo 2 dois de oito animais, no Grupo 3 cinco de oito animais, e no Grupo 4 cinco de oito animais mostraram completa resposta de tumor. Neste estágio o tumor foi completamente necrótico e uma crosta de ferimento formou-se na localização do tumor.
[000195] Necrose no sítio de tumor foi vista em todos os grupos de tratamento. Genericamente, animais em grupo 2, 3 e 4 mostraram mais formação de necrose, ferimento e crosta que os animais no Grupo 1 que receberam somente uma injeção de LTX-315. Animais de grupo 4, que receberam três injeções, mostraram mais formação de necrose, ferimento e crosta. A diferença em necrose entre Grupo 1 e Grupo 4 foi bem grande, mas os animais que receberam o número mais alto de tratamentos parecem suportar bem. Nenhum efeito tóxico ou outro adverso além de formação de ferimento e tecido necrótico local foi observado em qualquer dos grupos de animais tratados.
[000196] Todos os quatro regimes de tratamento de LTX-315 testados demonstraram um forte efeito antitumor contra tumores CT26WT murinos.
[000197] A quantidade de formação de necrose, ferimento e crosta foi proporcional ao número de tratamentos com LTX-315 dados.
[000198] Os dados acima most tram o amplo espectro de atividade de LTX-315 contra várias linhagens de células de câncer e, significantemente, um efeito citotóxico muito mais fraco sobre células humanas normais.
[000199] Redesafio com células de linfoma de célula-B A20 murina e carcinoma de cólon CT26WT murino em camundongos com completa regressão de tumor
[000200] Este estudo buscou investigar os efeitos de crescimento de tumor em animais que previamente mostraram completa regressão de tumor seguindo tratamento com LTX-315.
[000201] Processos: camundongos Balb-c fêmeas (n = 4), previamente tratados com LTX-315 (1 mg) ou (n = 9); previamente tratados com LTX-315 (0,5 ou 1 mg) foram reinoculados (s.c. na área abdominal) com células de linfoma de célula-B A20 murinas ou células de carcinoma de cólon CT26WT (5 milhões) respectivamente 6 semanas seguindo tratamento inicial com LTX-315. Crescimento de tumor foi monitorado por até 36 dias seguindo reinoculação.
[000202] Significante inibição (P<0,006) de crescimento de tumor foi observada em todos os 4 camundongos tratados previamente com LTX- 315 (1 mg) em estudo R315-03 comparado com animais controles (figura 2) e enquanto reincidência foi vista em 1 animal, 3 semanas depois, completa regressão de tumor foi observada nos outros 3 camundongos (figura 3).
[000203] Em 9 camundongos previamente tratados com LTX-315 (0,5 ou 1 mg) inibição (P<0,01) de crescimento de tumor foi observada em comparação com animais controles (figura 3). A súbita queda em tamanho de tumor na figura 20, após dia 18, é explicada pela morte de 6 animais transportando grandes tumores. Inibição foi observada em 7 camundongos e completa regressão em 2 dos animais (figura 5).
[000204] Tomados juntos estes dados sugerem que completa regressão de tumor seguindo tratamento inicial de tumores murinos sólidos (linfoma de célula B A20 murina ou carcinoma de cólon de CT26WT) com LTX-315 resultou em uma forma de proteção de longo termo endógena contra crescimento dos mesmos tumores seguindo reinoculação. Inibição de crescimento de tumor foi mais pronunciada em animais transportando tumores de linfoma de célula B A20 quando comparados com animais transportando tumores de cólon de CT26WT. Exemplo 8
[000205] Efeitos imunológicos de LTX-315 em um modelo de linfoma de célula-B A20 murino. Um estudo piloto de transferência de célula de baço adotiva in vivo.
[000206] Este estudo foi empreendido para investigar se a proteção de longo - termo contra crescimento dos mesmos tumores seguindo reinoculação em animais observados em estudo R315-33 pode ser passivamente transferida para receptores naturais via células de baço tomadas de animais doadores tratados com LTX-315.
[000207] Dez camundongos Balb/c fêmeas (n = 32) foram cada um inoculados com células A20 (5 milhões em 50 microlitros s.c.) sobre a superfície abdominal. Uma vez tumores tenham atingido 20 mm2 eles foram injetados com LTX-315 (1 mg) injetado intratumoralmente, uma vez por dia por 3 dias, em um volume de 50 microlitros. Tamanho de tumor (mm2) e peso de corpo foram subsequentemente monitorados e ainda uma injeção de LTX-315 foi dada se qualquer novo crescimento de tumor foi observado. Subsequentemente, camundongos mostrando completa regressão de tumor foram sacrificados e usados como doadores para transferência de esplenócitos enquanto camundongos doadores naturais foram usados como controles. Baços de camundongos doadores foram excisados e células isoladas. Camundongos receptores naturais foram irradiados e divididos em 2 grupos. Grupo 1 recebeu esplenócitos isolados de camundongos curados, enquanto grupo 2 recebeu esplenócitos isolados de camundongos naturais. Células recentemente preparadas foram injetadas (20 x 106 por 100 μL) via a veia de cauda. Vinte e quatro horas depois camundongos receptores foram inoculados com 5 milhões de células de linfoma de célula B A20 murinas sobre a superfície abdominal como descrito acima. Tamanho de tumor e peso de corpo foram monitorados até a carga máxima de tumor de ~125mm2 ser atingida, ou um evento adverso sério ocorrer (isto é, formação de ferimento devido a necrose de tecido de tumor) em cujo ponto camundongos foram sacrificados.
[000208] Inibição de crescimento de tumor foi observada em camundongos irradiados que receberam esplenócitos isolados de animais que mostraram completa regressão de tumor seguindo tratamento com LTX-315 quando comparados com animais controles que receberam esplenócitos de doadores naturais (figura 6). Também foi notado que houve uma diferença em cor e textura dos tumores em receptores de esplenócitos de camundongos tratados com LTX-315 sugerindo uma imediata resposta inflamatória.
[000209] Baseado nestas observações, os dados proveem evidência de uma resposta imune adaptativa nos animais que receberam esplenócitos de animais que previamente mostraram completa regressão de tumores de linfoma A20-B seguindo tratamento com LTX- 315. Estes dados sugerem que tratamento com LTX-315 pode conferir proteção de longo termo contra específicos tumores através de desencadeamento de uma resposta imune.
[000210] O objetivo deste estudo foi investigar o efeito anticâncer de vacinação profilática com células de linfoma A20 lisadas por 10 mg/mL de LTX-315: (i) sozinho; e (ii) em combinação com 20 mg/mL de LTX-315 injetados no sítio de vacinação antes da vacina.
[000211] No total, dois diferentes regimes de tratamento foram usados.
[000212] Administração foi através de injeção subcutânea de LTX-315 dissolvido em meios de crescimento contendo células de linfoma A20. O "coquetel" de célula - LTX-315 foi deixado por 30 minutos antes de injeção de modo a assegurar completa lise das células de câncer.
[000213] Camundongos de Grupo 1 ("vacina") foram injetados subcutaneamente na superfície de abdômen com 50 microlitros de um "coquetel" de dez milhões de células A20 murinas (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Sweden) e 10 mg/mL de LTX-315 ("lisado A20"). Camundongos de Grupo 2 ("vacina + adjuvante") foram tratados como para Grupo 1, mas em adição receberam 25 microlitros de 20 mg/mL de LTX-315 subcutaneamente no sítio de vacinação 5 minutos antes da injeção de lisado A20. Camundongos de Grupo 3 ("controle") não receberam tratamento.
[000214] Seis semanas após o tratamento, todos os camundongos foram inoculados com 5 milhões de células de linfoma de célula-B viáveis subcutaneamente sobre a superfície de abdômen em um volume de 50 microlitros.
[000215] Os camundongos foram monitorados durante o estudo através de medição de tamanho de tumor e pesagem de animais regularmente. Os camundongos foram seguidos até a carga máxima de tumor de ~130 mm2 ser atingida, em cujo ponto os camundongos foram sacrificados.
[000216] Animais: camundongos Balb/c fêmeas livres de patógeno específico, 6-8 semanas de idade, fornecidos por Harlan Laboratories (England, UK; www.harlan.com).
[000217] Condicionamento de animais: condições de instalação animal padrão na Universidade de Tromso.
[000218] Substância Teste: células A20 murinas lisadas por LTX-315 (Lote 1013687), e LTX-315 (Lote 1013687) sozinho.
[000219] Preparação de substância teste: 10x106 células A20 foram adicionadas a 50 microlitros de 10 mg/mL de LTX-315/veículo ("lisado A20"). A substância teste foi pronta para uso 30 minutos após mistura. LTX-315 sozinho foi dissolvido em NaCl 0,9% em H2O estéril.
[000220] Veículo: RPMI-1640 w/L-glutamina 2 mM ou NaCl 0,9% em H2O estéril
[000221] Substâncias referências: não aplicável.
[000222] Tratamento de controles: não aplicável
[000223] Processo de avaliação: medições de tamanho de tumor e controle de saúde através de pesagem e exame.
[000224] Processo com relação a dados adicionais: um calibre digital foi usado para medições de tamanho de tumor e pesagem e exame físico foram usados como controle de saúde.
[000225] Peso médio de corpo, dose, via e esquema de tratamento são mostrados na Tabela 11 (abaixo). Tabela 11
Resultados:
[000226] O efeito anticâncer dos vários tratamentos é apresentado como tamanho médio de tumor na Tabela 12 abaixo e uma apresentação gráfica dos dados é provida na figura 7. Na Tabela 12, Dia 1 foi o dia de inoculação de células A20 viáveis seis semanas após vacinação. Tabela 12
Discussão / Conclusões
[000227] A inoculação de células de linfoma de célula-B A20 viáveis foi realizada 6 semanas após o tratamento ser dado (dia 1) e os animais foram sacrificados quando os tumores atingiram a carga máxima de tumor permitida de ~130 mm2.
[000228] Os resultados mostram que os tumores desenvolveram mais lentamente em ambos os grupos de tratamento com lisado -A20 / LTX- 315 comparados com o Grupo controle. A sobrevivência média de Grupo 1 foi de 28 dias, 33 dias para Grupo 2 e 25 dias para o Grupo controle (Grupo 3). Aumento em sobrevivência média foi de 12% para Grupo 1 e 35% para Grupo 2 comparados ao grupo controle (Grupo 3).
[000229] Os dados indicam uma sobrevivência prolongada dos grupos tratados comparados com o grupo controle não tratado. No dia 34, quando o último animal no grupo controle foi sacrificado, 50% dos animais no Grupo 2 ainda estavam vivos enquanto 37,5% dos animais no Grupo 1 ainda estavam vivos. Fim do estudo foi definido como dia 60. Neste ponto de tempo, um total de 3 dos 16 animais tratados teve uma completa regressão de um tumor inicialmente em desenvolvimento e foram livres de tumor. No fim do estudo 25% de animais de Grupo 1, e 12,5% de animais de Grupo 2 foram observados estarem livres de tumor.
[000230] Macroscopicamente existiram diferenças morfológicas entre os grupos tratados (Grupo 1 e 2) comparados ao grupo controle não tratado (Grupo 3). Os tumores em desenvolvimento nos dois grupos de tratamento foram observados serem mais brancos e duros que os tumores observados no grupo controle. Esta verificação junto com a taxa de crescimento mais lenta dos tumores indica que uma resposta imune de célula anti-A20 foi induzida pela vacinação com o coquetel de LTX-315 e células A20 lisadas.
[000231] Portanto, LTX-315 pode ter um uso dual através da lise de células de tumor e indução de liberação de sinais de perigo a partir de células normais no sítio de injeção.
[000232] Será apreciado que não é pretendido limitar a invenção somente às específicas modalidades acima, numerosas modalidades, modificações e aperfeiçoamentos sendo facilmente aparentes para aqueles versados na técnica sem se fugir do escopo das reivindicações apostas.
Claims (9)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 23, 25, 28, 31 ou 33 a 42, o referido composto, opcionalmente, na forma de um sal, éster ou amida.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula de SEQ ID NO: 23 (LTX-315) ou um sal, éster, ou amida do mesmo.
3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2 em combinação com um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2 em combinação com pelo menos um outro ingrediente terapêutico.
5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto apresentando a fórmula de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 23, 25, 28, 31 ou 33 a 42, opcionalmente na forma de um sal, éster, ou amida em combinação com pelo menos uma vacina.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende um composto apresentando a fórmula de SEQ ID NO: 23 (LTX-315), ou um sal, éster ou amida do mesmo.
7. Pacote farmacêutico, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) pelo menos uma vacina; e (ii) um composto como definido na reivindicação 1 ou 2.
8. Pacote farmacêutico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 2.
9. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, ou pacote farmacêutico de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida vacina é ou um lisado de tumor, ou uma vacina anticâncer contendo pelo menos uma proteína e/ou peptídeo com sequências de aminoácidos correspondendo à(s) sequência(s) imunogênica(s) do(s) antígeno(s) associado(s) ao tumor.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 11/09/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |