BRPI0923157B1 - Anticorpos anti-alfa-sinucleína e seus fragmentos, seus usos e método de preparação, composição compreendendo-os, bem como kit e métodos para o diagnóstico e monitoramento de uma doença sinucleinopática - Google Patents

Anticorpos anti-alfa-sinucleína e seus fragmentos, seus usos e método de preparação, composição compreendendo-os, bem como kit e métodos para o diagnóstico e monitoramento de uma doença sinucleinopática Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-ALFA-SINUCLEÍNA E SEUS FRAGMENTOS, SEUS USOS E MÉTODO DE PREPARAÇÃO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO-OS, POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO-OS, VETOR COMPREENDENDO TAL POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA COMPREENDENDO TAL VETOR, BEM COMO KIT E MÉTODOS IN VITRO PARA O DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO DE UMA DOENÇA SINUCLEINOPÁTICA. São fornecidos novos anticorpos específicos de alfa-sinucleina humanos assim como fragmentos, derivados e variantes dos mesmos assim como métodos relacionados aos mesmos. Ensaios, kits, e suportes sólidos relacionados a um anticorpo específico para a alfa-sinucleína também são divulgados. O anticorpo, cadeia (s) de imunoglobulina, assim como fragmentosde ligação, derivados e variantes dos mesmos podem ser usados nas composições farmacêuticas e diagnósticas para a imunoterapia direcionada para a alfa-sinucleína e diagnóstico, respectivamente.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção geralmente se refere a novas moléculas de ligação a-sinucleína específicas, particularmente anticorpos humanos, bem como fragmentos, derivados e variantes dos mesmos que reconhecem a-sinucleína e formas agregadas de a-sinucleína, respectivamente. Além disso, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas e de diagnóstico que compreendem tais moléculas de ligação, anticorpos e imitadores dos mesmos, valiosos tanto como uma ferramenta de diagnóstico para identificar espécies tóxicas de a-sinucleína no plasma e CSF quanto em estratégias de vacinação passiva para o tratamento de transtornos relacionados a agregados da a-sinucleína, coma doença de Parkinson (PD), demência com corpos de Lewy (DLB) e variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (AD) e outras doenças sinucleinopáticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] O desdobramento errado de proteína e agregação são aspectos patológicos de várias doenças neurodegenerativas. Agregados da a-sinucleína são os principais componentes dos corpos de Lewy e neuritos de Lewy associados à doença de Parkinson (PD). Uma proteína nativamente desdobrada, a a-sinucleína pode adotar diferentes morfologias agregadas, incluindo oligômeros, protofibrilas e fibrilas. Os agregados oligoméricos pequenos têm se mostrado particularmente tóxicos.
[0003] Autoanticorpos de ocorrência natural contra a a-sinucleína foram detectados em pessoas saudáveis e níveis alterados em pacientes foram associados a distúrbios neurodegenerativos específicos; ver para revisão Neff et al., Autoimmun. Rev. 7 (2008), 501507. Assim, anticorpos que ocorrem naturalmente em pacientes que sofrem de doença de Parkinson, seja espontaneamente ou após a vacinação, em particular em pacientes saudáveis, podem desempenhar um papel protetor em relação à agregação da a-sinucleína; ver, por exemplo, Woulfe et al., Neurology 58 (2002), 1435-1436 e Papachroni et al., J. Neurochem. 101 (2007), 749-756. Até agora, o significado terapêutico de autoanticorpos tem sido difícil de se avaliar. Isto é principalmente devido à falta de abordagens experimentais diretas para seu isolamento e posterior caracterização in vitro.
[0004] Recentemente, espécies oligoméricas de a-sinucleína foram relatadas extracelularmente no plasma e CSF (El-Agnaf et al., FASEB J. 20 (2006), 419-425) e estudos de imunização em modelos de camundongo de PD mostram que anticorpos monoclonais extracelulares de camundongo contra a-sinucleína podem reduzir a acumulação intracelular de agregados de a-sinucleína (Masliah et al., Neuron, 46 (2005), 857-868) apoiando a ideia de que os anticorpos que neutralizam os agregados neurotóxicos sem interferir nas funções benéficas da a-sinucleína monomérica podem ser uma terapêutica útil. No entanto, a utilidade terapêutica de anticorpos com base murina em seres humanos é prejudicada pela resposta do anticorpo anti- camundongo humano (HAMA) em vista de sua origem não humana.
[0005] Emadi et al. em J. Mol. Biol. 368 (2007), 1132-1144, descreve o isolamento de fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFvs) de uma biblioteca de anticorpos de exibição de fagos com base em sequências humanas contra a a-sinucleína, que se ligam apenas a uma forma oligomérica da a-sinucleína e inibem a agregação e a toxicidade da a-sinucleína in vitro. No entanto, embora a geração de scFvs da exibição de fagos seja bastante simples, esta técnica tem graves desvantagens, pois os anticorpos produzidos carregam o risco de reatividade cruzada indesejada contra autoantígenos e são desprovidos de características dos anticorpos humanos naturais otimizados evolutivos produzidos pelo sistema imunológico humano. Além disso, tais anticorpos podem não ser específicos o suficiente por causa de reatividade cruzada com outras proteínas e/ou com a proteína- alvo no contexto de ambiente fisiológico e função normais. No caso da doença de Parkinson, por exemplo, anticorpos que também reagem de forma cruzada com derivados fisiológicos da a-sinucleína têm o potencial de causar efeitos colaterais relacionados às funções normais das estruturas-alvo fisiológicas. A este respeito, uma doença auto- imune indesejada seria evidentemente induzida - um risco dificilmente calculável também no projeto conceitual de experimentos de imunização ativa que empregam estruturas de proteínas que, em forma variante, também ocorrem fisiologicamente.
[0006] Mais recentemente, Seitz et al. (81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fur Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg10.-13.09.2008), relatou sobre o isolamento de autoanticorpos policlonais anti-a-sinucleína a partir de diferentes soluções de imunoglobulina e amostras de doadores de sangue através de cromatografia por afinidade. No entanto, além do fato de que essa abordagem fornece apenas quantidades limitadas do anticorpo desejado, anticorpos policlonais são de uso limitado para aplicação terapêutica, por exemplo, por causa de sua heterogeneidade e do risco de serem contaminados com outras moléculas associadas a a-sinucleína que têm efeitos colaterais indesejados. Da mesma forma, o valor diagnóstico de anticorpos policlonais é reduzido, uma vez que a variabilidade da composição dos anticorpos influenciará a especificidade e a reatividade geral. Isto é verdadeiro para anticorpos contra proteínas sujeitos a agregação e deposição devido ao desdobramento errado.
[0007] Assim, há uma necessidade de superar as limitações acima descritas e fornecer um anticorpo humano terapêutico e de diagnóstico contra a α-sinucleina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção faz uso da resposta imune a-sinucleína específica de indivíduos de controle saudáveis e com idade avançada e pacientes com doença neurológica para o isolamento de anticorpos naturais monoclonais humanos específicos para a a-sinucleína. Em particular, os experimentos realizados de acordo com a presente invenção foram bem-sucedidos no isolamento de anticorpos monoclonais específicos para a-sinucleína de um grupo de indivíduos idosos sem sinais de Parkinsonismo.
[0009] A presente invenção é, portanto, direcionada a anticorpos humanos, fragmentos de ligação a antígenos e moléculas de ligação a antígenos similares que são capazes de reconhecer especificamente a a-sinucleína. Por "reconhecer especificamente a a-sinucleína", "anticorpo específico para/de a-sinucleína" e "anticorpo anti-a- sinucleína" entende-se especificamente, geralmente e coletivamente, anticorpos para a forma nativa da a-sinucleína, ou a-sinucleína deformada, ou oligomérica, ou agregada, ou pós-traducionalmente modificada. São fornecidos aqui anticorpos humanos seletivos para formas de monômero nativo, comprimento total, truncadas e agregadas.
[00010] Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção o anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo demonstra as características de ligação imunológicas de um anticorpo caracterizado pelas regiões variáveis VH e/ou VL, conforme estabelecido na figura 1.
[00011] O fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo pode ser um fragmento Fv de cadeia única, um fragmento F(ab'), um fragmento F(ab) e um fragmento F(ab')2, ou qualquer outro fragmento de ligação a antígenos. Em uma modalidade específica, infra, o anticorpo ou fragmento dele é um anticorpo isotipo de IgG humana. Alternativamente, o anticorpo é um anticorpo quimérico humano-murino ou murinizado, sendo este último particularmente útil para métodos de diagnóstico e estudos em animais.
[00012] Além disso, a presente invenção se refere a composições que compreendem o anticorpo da presente invenção ou fragmentos ativos do mesmo, ou agonistas e moléculas cognatas, ou, alternativamente, antagonistas do mesmo e para métodos imunoterápicos e imunodiagnósticos que usam tais composições na prevenção, diagnóstico ou tratamento de uma doença sinucleinopática, onde uma quantidade eficaz da composição é administrada a um paciente em necessidade da mesma.
[00013] Naturalmente, a presente invenção se estende ao linfócito de memória B humano imortalizado e célula B, respectivamente, que produz o anticorpo com as características distintas e únicas, tal como definido abaixo.
[00014] A presente invenção também se refere a polinucleotídeos que codificam pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo da invenção. Preferencialmente, esta região variável compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da VH e/ou VL da região variável, conforme definido na Figura 1.
[00015] Assim, a presente invenção também engloba vetores que compreendem ditos polinucleotídeos e células hospedeiras transformadas com isso, assim como sua utilização para a produção de um anticorpo e moléculas de ligação equivalentes que são específicos para a α-sinucleina. Meios e métodos para a produção recombinante de anticorpos e imitadores dos mesmos, bem como métodos de triagem para moléculas de ligação de competição, que podem ou não ser anticorpos, são conhecidos na técnica. No entanto, conforme descrito aqui, em particular no que diz respeito a aplicações terapêuticas em seres humanos, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo humano no sentido de que a aplicação deste anticorpo é substancialmente livre de uma resposta HAMA, observada para anticorpos quiméricos e mesmo humanizados.
[00016] Além disso, são divulgados aqui composições e métodos que podem ser usados para identificar a a-sinucleína em amostras. Os anticorpos anti-a-sinucleína divulgados podem ser usados para selecionar sangue humano, CSF e urina para a presença de α- sinucleína em amostras, por exemplo, usando ensaio baseado em ELISA ou adaptado de superfície. Os métodos e composições divulgados aqui podem ajudar na doença sinucleinopática, como o diagnóstico da doença de Parkinson, e podem ser usados para monitorar a progressão da doença e a eficácia terapêutica.
[00017] Como demonstrado no Exemplo 4, o anticorpo anti-α- sinucleína da presente invenção é capaz de melhorar o desempenho do motor e comportamento em labirinto em cruz elevado em um modelo de camundongo transgênico da doença de Parkinson. Estes resultados confirmam o valor terapêutico esperado dos anticorpos anti-a-sinucleína humano-derivados da presente invenção.
[00018] Por isso, é um objetivo particular da presente invenção fornecer métodos para tratar ou prevenir uma doença sinucleinopática, coma doença de Parkinson (PD), demência na doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), atrofia de sistemas múltiplos (MSA), insuficiência autonômica pura (PAF), neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo-1 (NBIA-I), doença de Alzheimer, doença de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada juvenil (doença de Hallervorden- Spatz), esclerose lateral amiotrófica, traumatismo crânio-encefálico e síndrome de Down. Os métodos compreendem administrar uma concentração eficaz de um anticorpo humano ou derivado de anticorpos ao indivíduo, onde o anticorpo direciona a a-sinucleína.
[00019] Modalidades adicionais da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição e exemplos que se seguem.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00020] figura 1: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da região variável, ou seja, cadeia pesada e cadeia leve kappa/lambda de anticorpos humanos NI-202.3G12 (A), NI-202.12F4 (B) e NI-202.3D8 (C). Para o anticorpo humano NI-202.3D8 duas sequências de cadeia leve variável VKa1 (C) e VKc1 (D) foram clonadas, cada uma das quais pode ser emparelhado com a sequência de cadeia pesada variável VHE1 (C). Regiões de estrutura (FR) e determinantes de complementaridade (CDRs) são indicadas com as CDRs sublinhadas. A região de junção de cadeia pesada (JH) e a região de junção de cadeia leve (JK) são indicadas também. Devido à estratégia de clonagem, a sequência de aminoácidos no N-terminal da cadeia pesada e da cadeia leve pode potencialmente conter alterações induzidas por iniciador em FR1, que, no entanto, não afeta substancialmente a atividade biológica do anticorpo. A fim de proporcionar um anticorpo humano de consenso, as sequências de nucleotídeos e aminoácidos do clone original foram alinhadas e ajustadas de acordo com as sequências de região variável de linhagem germinativa humana pertinentes no banco de dados; ver, por exemplo, Vbase (http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) hospedado por MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK). Os aminoácidos que são considerados potencialmente fora da sequência de linhagem germinativa de consenso e, portanto, poderiam ser devido ao iniciador PCR, são indicados em negrito.
[00021] figura 2: Anticorpos de a-sinucleína humanos recombinantes são direcionados contra epítopos distintos. a-sinucleína recombinante de comprimento total e truncada foi revestida em placas ELISA em concentração de revestimento igual (20 μg/ml). (A) O anticorpo de a- sinucleína humana recombinante NI-202.3G12 se liga à a-sinucleína de comprimento total, mas não a truncamentos de a-sinucleína em um ELISA direto, apontando para um epítopo de reconhecimento estrutural de NI-202.3G12. (B) NI-202.12F4 recombinante se liga à a-sinucleína de comprimento total e a truncamentos de a-sinucleína contendo aminoácidos (aa) 1-60 em um ELISA direto, apontando para um epítopo de NI-202.12F4 dentro da região de repetição anfipática do N-terminal da alfa-sinucleína. (C) O anticorpo LB509 se liga a fragmentos de a- sinucleína do C-terminal, confirmando o epítopo previamente determinado (aa 115-122). Os valores são médias ± SEM (n=2-3).
[00022] figura 3: Anticorpos de a-sinucleína humana recombinante se ligam à a-sinucleína, mas não a β- e Y-sinucleína em um ELISA direto. α-, β- e Y-sinucleína recombinante revestida em placas ELISA em concentração de revestimento igual (2 μg/ml) foram incubadas com anticorpos de a-sinucleína humana recombinante ou com um anticorpo pan sinucleína. (A) Este último detecta todas as três proteínas de sinucleína, enquanto os anticorpos de a-sinucleína humana recombinante (B) NI-202.3G12 e (C) NI-202.12F4 (C) se ligam seletivamente à a-sinucleína. Os valores são médias ± SEM (n=2-3).
[00023] figura 4: Anticorpo de a-sinucleína humana recombinante NI- 202.12F4 se liga à a-sinucleína, mas não β- e Y-sinucleína em análise Western blot. a-, β- e Y-sinucleína recombinante (cada 750 ng) foram submetidas a SDS-PAGE e posterior à análise Western Blot. (A) A coloração Coomassie revela concentração de proteínas igual em SDS- PAGE. (B) NI-202.12F4 interage fortemente com a a-sinucleína, mas não com beta ou gama sinucleína. (C) Não foi detectado nenhum sinal sem o anticorpo primário.
[00024] figura 5: (A) NI-202.12F4 a análise imunoblot de extratos de cérebro de camundongos não-transgênicos e camundongos transgênicos com alfa-sinucleína humana mostra ligação preferencial com a α-sinucleina humana. Extratos de cérebro de camundongos de tipo selvagem e transgênicos com a-sinucleína humana foram analisados por imunoblottingcom anticorpo humano de a-sinucleína específico LB509, clone de anticorpo reativo a a-sinucleína humana e de camundongo 42 e NI-202.12F4. Enquanto o clone 42 detecta bandas proeminentes correspondentes a a-sinucleína de camundongo e humana, LB509 e NI-202.12F4 mostram uma forte preferência pela a- sinucleína humana. (B) NI-202.12F4 a análise imunoblot de extratos de cérebro mostra ligação preferencial com agregados de a-sinucleína humana. Extratos de cérebro corticais de um indivíduo de controle saudável e uma demência com paciente com corpos de Lewy (DLB), bem como extratos de cérebro de camundongos selvagens e camundongos transgênicos com a-sinucleína A30P humana foram analisados por Western blotting. NI-202.12F4 detecta formas oligoméricas e fibrilares de agregados de a-sinucleína em DLB e extrato de cérebro transgênico com a-sinucleína A30P com alta sensibilidade. A ligação mínima é observada para formas monoméricas de a- sinucleína em tecidos humanos ou de camundongo selvagem e ligação moderada em extratos de cérebro transgênico com a-sinucleína A30P que superexpressam elevadamente a-sinucleína. Em contraste, o anticorpo clone 42 detecta formas monoméricas e fragmentos de a- sinucleína com alta sensibilidade e se liga fracamente a espécies agregadas de a-sinucleína.
[00025] figura 6: NI-202.12F4 recombinante mostra alta afinidade de ligação para o tipo selvagem e mutantes causadores de doenças da a- sinucleína humana. a-sinucleína humana selvagem recombinante (*), A53T (), A30P (*) e E64K (•:) foram revestidas em placas ELISA (2 μg/ml) e sondadas com diferentes concentrações de NI202.12F4. As meias-concentrações máximas eficazes (EC50) foram 321pM de tipo selvagem a-sinucleína, 293pM para A53T, 228pM para A30P e 483pM para a-sinucleína E64K mutante humana.
[00026] figura 7: Análise de ligação imuno-histoquímica de NI- 202.12F4. NI-202.12F4 mostra coloração proeminente da patologia de a-sinucleína, incluindo inclusão de corpo de Lewy e similar a neurito de Lewy, bem como pequenos acúmulos de a-sinucleína sináptica e somatodendrítica em seções de livre flutuação a partir de camundongos transgênicos que expressam a-sinucleína A53T humana (A) ou A30P (B), bem como em tecidos do cérebro humano da doença de Parkinson (C) e demência com corpos de Lewy (D). O anticorpo Syn211 detecta a a-sinucleína sináptica fisiológica com uma alta sensibilidade em camundongos transgênicos com a-sinucleína A30P humana (E), enquanto NI-202.12F4 se liga preferencialmente a agregados patológicos da a-sinucleína (B). A ligação de NI-202.12F4 é virtualmente ausente em seções do cérebro de camundongos de tipo selvagem (F) comparável ao anticorpo secundário somente a coloração de controle (G), enquanto o anticorpo do clone 42 mostra a coloração sináptica proeminente da proteína a-sinucleína de camundongo (H).
[00027] figura 8: NI-202.12F4 recombinante mostra ligação preferencial com a-sinucleína revestida de alta densidade. a-sinucleínas recombinantes de comprimento total ou truncadas foram revestidas em placas ELISA nas concentrações indicadas e sondadas com diferentes concentrações de anticorpos NI-202.12F4 ou Syn211 por ELISA direta (020 μg/ml; 2 μg/ml; 1 μg/ml; 250 ng/ml; □ 100 ng/ml de concentração de revestimento de a-sinucleína recombinante de comprimento total ou 1-60). A meia-concentração máxima eficaz (EC50) indicando a potência dos anticorpos foi determinada. (A) A Ligação de alta afinidade de NI-202.12F4 recombinante com a-sinucleína requer altas densidades de revestimento da proteína a-sinucleína. Enquanto uma EC50 de 111pM é observada para a-sinucleína revestida a 20 μg/ml, os valores da EC50 de concentração aumentam de forma acentuada com concentrações decrescentes de revestimento demonstrando uma perda dramática de afinidade em concentrações de revestimento mais baixas de a-sinucleína. Estas características estão apontando para um epítopo conformacional de NI-202.12F4 que é preferencialmente formado em concentrações elevadas de revestimento de a-sinucleína. (B) A ligação de Syn211 não é afetada pela concentração de revestimento. Não é observada nenhuma diminuição da afinidade do anticorpo Syn211 comercialmente disponível em baixas densidades de revestimento com EC50s que variam de 335 pm para 20 μg/ml a 99 pM para 100 ng/ml de densidade de revestimento da a-sinucleína, sugerindo ligação a um epítopo não conformacional linear. (C) A ligação de alta afinidade de NI-202.12F4 recombinante com um fragmento de a-sinucleína do N-C terminalompreendendo os aminoácidos 1-60 requer altas densidades de revestimento. NI- 202.12F4 mostra concentração de revestimento equivalente e ligação dependente para comprimento total, assim como a a-sinucleína truncada, apontando para um epítopo conformacional de NI-202.12F4 que está contido dentro dos aminoácidos 1-60 da proteína a-sinucleína. (D) Peptídeos biotinilados compreendendo a sobreposição de 20 fragmentos de aminoácidos cobrindo os 60 aminoácidos do N-terminal da a-sinucleína foram revestidos em placas de avidina e sondados com NI-202.12F4 ou um anticorpo de controle de pan-sinucleína que detecta um epítopo dentro de aa 21-40. Assim, o anticorpo de controle liga-se fortemente com o peptídeo 21-40 e com peptídeos de menor extensão 11-30 e 31-50. Em contraste, nenhuma ligação é observada para NI- 202.12F4 com nenhum dos peptídeos testados, sugerindo que nenhum dos fragmentos do N-terminal é suficiente, visto que o epítopo NI- 202.12F4 e um fragmento maior podem ser necessários para a ligação e a formação ideais do epítopo NI-202.12F4 estrutural.
[00028] figura 9: O tratamento crônico com NI-202.12F4 melhora o desempenho motor em camundongos transgênicos com a-sinucleína A53T. Camundongos transgênicos com a-sinucleína A53T de 10,5 meses de idade foram tratados semanalmente com NI-202.12F4 ou PBS (5mg/kg; aplicação intraperitoneal). O desempenho motor foi avaliado após dois meses de tratamento no Pole-Test. (A) Animais tratados com NI-202.12F4 precisaram de muito menos tempo para virar para baixo (t-virada; 1,7 ± 0,3 vs. 4,6 ± 0,6 seg., p=0,0002, teste t de Student bicaudal). (B) Animais tratados com NI-202.12F4 também precisaram de muito menos tempo (t-total) para descer para a gaiola (7,3 ± 0,9 vs. 10,4 ± 0,7 seg., p=0,012, teste t de Student bicaudal).
[00029] figura 10: O tratamento crônico de camundongos transgênicos com a-sinucleína A53T com NI-202.12F4 leva à recuperação do comportamento em labirinto em cruz elevado. Camundongos transgênicos com a-sinucleína A53T de 10,5 meses de idade foram tratados semanalmente intraperitoneal com 5 mg/kg de NI- 202.12F4 ou PBS. Após dois meses de tratamento os animais foram testados quanto ao comportamento em labirinto em cruz elevado. Animais tratados com NI-202.12F4 gastaram muito menos tempo e cobriram uma distância significativamente menor nos braços abertos em relação aos animais de controle tratados com o veículo, indicando uma recuperação do comportamento normal.
[00030] figura 11: O tratamento crônico de camundongos transgênicos com a-sinucleína A53T com NI-202.12F4 resulta em níveis de plasma elevados de a-sinucleína A53T humana. Amostras de plasma foram preparadas a partir de camundongos transgênicos com a- sinucleína A53T de 12,5 meses de idade que foram tratados semanalmente intraperitoneal por 2 meses com 5 mg/kg de NI-202.12F4 ou PBS. Sangue foi tirado 24 horas após a última aplicação. (A) Os níveis de NI-202.12F4 no plasma foram determinados usando ELISA de a-sinucleína direta. (B) Os níveis de α-sinucleina A53T no plasma foram determinados usando-se ELISA em sanduíche de a-sinucleína humano- específica. Animais tratados com NI-202.12F4 têm níveis significativamente elevados de a-sinucleína humana no plasma em comparação com animais de controle (24,9 ± 4,1 vs. 1,9 ± 1,2 ng/ml, p=0,0002).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[00031] Doenças sinucleinopáticas ou sinucleinopatias são um grupo diverso de distúrbios neurodegenerativos que compartilham uma lesão patológica comum composta de agregados da proteína a-sinucleína insolúvel em populações seletivamente vulneráveis de neurônios e glia. Estes distúrbios incluem doença de Parkinson (PD), demência na doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), atrofia de sistemas múltiplos (MSA) e neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro tipo-1 (NBIA-I). Clinicamente, caracterizam-se por uma queda crônica e progressiva das funções motora, cognitiva, comportamental e autônomas, dependendo da distribuição das lesões.
[00032] A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa idade-dependente de etiologia desconhecida. Acredita-se que a doença de Parkinson esporádica resulte de uma combinação de vulnerabilidade genética e afrontas ambientais. Acredita-se ainda que a doença de Parkinson (PD), enquanto desencadeada por mecanismos diferentes, segue um caminho fisiopatológico partilhado. Um nó compartilhado é o envolvimento da a-sinucleína. A ligação desta proteína com a patogênese da doença de Parkinson foi estabelecida através da identificação de mutações do ponto e da triplicação do gene em casos familiares, a localização da α-sinucleina para corpos de Lewy, uma das características patológicas marcantes da doença de Parkinson, e a correlação da expressão da α-sinucleina e a patologia da doença em modelos neurotóxicos da doença de Parkinson. Outras evidências indicam que formas particulares da α-sinucleina (por exemplo, dopamina deformada e ligada com α-sinucleina) estão envolvidas na doença esporádica.
[00033] Sinucleinas são proteinas pequenas e solúveis expressas principalmente no tecido nervoso e em certos tumores. A familia inclui três proteínas conhecidas: α-sinucleina, β-sinucleina e Y-sinucleína. Todas as sinucleinas têm em comum um motivo de ligação com lipideo α-helicoidal altamente conservado com similaridade com os dominios de ligação lipidica classe A2 das apolipoproteinas permutáveis. Membros da familia sinucleina não se encontram nos invertebrados, apesar de terem alguma semelhança estrutural com proteinas vegetais 'tardias-embrião-abundantes'. As proteínas α- e β-sinucleina são encontradas principalmente no tecido cerebral, onde elas são vistas principalmente nos terminais pré-sinápticos. A proteína Y-sinucleína é encontrada principalmente no sistema nervoso periférico e na retina, mas sua expressão em tumores de mama é um marcador da progressão do tumor. Funções celulares normais não foram determinadas para nenhuma das proteínas sinucleínas, embora alguns dados sugiram um papel na regulação da estabilidade da membrana e/ou modificação. Mutações na a-sinucleína são associadas a raros casos familiares da doença de Parkinson de início precoce, e a proteína se acumula de forma anormal na doença de Parkinson, doença de Alzheimer e várias outras doenças neurodegenerativas. Para revisão ver, por exemplo, George, Genome Biol. 3 (2002), reviews3002.1-reviews3002.6 publicado on-line em 20 de Dezembro de 2001, em que a Tabela 1 cataloga os elementos exclusivos da família da sinucleína que estão listados atualmente no GenBank, cuja divulgação de conteúdo é incorporada aqui por referência.
[00034] A α-sinucleina foi originalmente identificada no cérebro humano como a proteína precursora do componente não—e—amiloide de (NAC) das placas da doença de Alzheimer (AD) placas; ver, por exemplo, Ueda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 1282—1286. A a-sinucleína, também chamada de precursora do componente não- Aβ de amiloide AD (NACP), é uma proteína de 140 aminoácidos. A α— sinucleína existe em sua forma nativa como uma bobina aleatória; no entanto, mudanças no pH, aglomeração molecular, teor de metais pesados e níveis de dopamina, todos afetam a conformação da proteína. Mudanças na conformação de porções oligoméricas, proto- fibrilares, fibrilares e agregados são pensados para regular a toxicidade da proteína. Evidências crescentes indicam que a a-sinucleína dopamina-aduzida tem um curso de tempo mais rápido para a formação de fibrilas em comparação com a proteína não-aduzida. Além disso, a dopamina no fundo da superexpressão de a-sinucleína é tóxica.
[00035] Neste relatório descritivo, os termos "a-sinucleína", "alfa- sinucleína", "a-sinucleína" e "aSyn" são utilizados alternadamente para se referir especificamente à forma de monômero nativo da a-sinucleína. O termo "a-sinucleína" também é usado para identificar geralmente outros confômeros da a-sinucleína, por exemplo, a-sinucleína ligada a dopamina-quinona (DAQ) e oligômeros ou agregados de a-sinucleína. O termo "a-sinucleína" também é usado para se referir coletivamente a todos os tipos e formas de a-sinucleína. A sequência de proteína para a-sinucleína humana é MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKE GVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAAT GFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEP EA (SEQ ID N°: 1). A sequência de aminoácidos da a-sinucleína pode ser recuperada a partir da literatura e bancos de dados pertinentes; ver, por exemplo, Ueda et al., ibid.; GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, número de acessão P37840. O componente não-Aβ de amiloide AD (NAC) é derivado da α-sinucleina. NAC, um domínio altamente hidrofóbico dentro da α-sinuclefna, é um peptídeo que consiste em pelo menos 28 resíduos de aminoácidos (resíduos 60-87) e, opcionalmente, 35 resíduos de aminoácidos (resíduos 61-95). NAC exibe uma tendência a formar uma estrutura de folha-beta (Iwai, et al., Biochemistry, 34 (1995) 10139-10145). As sequências de aminoácidos de NAC são descritas em Jensen et al., Biochem. J. 310 (1995), 91-94; GenBank número de acessão S56746 e Ueda et al., PNAS USA 90 (1993), 1282-11286.
[00036] α-sinuclefna desagregada ou fragmentos da mesma, incluindo NAC, significa unidades de peptídeo monomérico. α- sinucleína desagregada ou fragmentos da mesma geralmente são solúveis e são capazes de se auto-agregar para formar oligômeros solúveis. Oligômeros de α-sinuclefna e fragmentos dos mesmos geralmente são solúveis e existem predominantemente como α-h^lices. A α-sinuclefna monomérica pode ser preparada in vitrodissolvendo-se um peptídeo liofilizado em DMSO puro com sonicação. A solução resultante é centrifugada para remover quaisquer partfculas insolúveis. α-sinuclefna agregada ou fragmentos da mesma, incluindo NAC, significa oligômeros de α-sinuclefna ou fragmentos dos mesmos que se associaram em conjuntos de folhas β insolúveis. α-sinuclefna agregada ou fragmentos da mesma, incluindo NAC, significa também polfmeros fibrilares. Fibrilas são normalmente insolúveis. Alguns anticorpos se ligam tanto a α-sinuclefna solúvel ou fragmentos da mesma quanto a α- sinuclefna agregada ou fragmentos da mesma. Alguns anticorpos se ligam a oligômeros de α-sinuclefna mais fortemente do que a formas monoméricas ou formas fibrilares. Alguns anticorpos se ligam a α- sinucleína solúvel e agregada ou fragmentos da mesma, quanto e, opcionalmente, a formas oligoméricas também.
[00037] Os anticorpos anti-α-sinucleina humana divulgados aqui se ligam especificamente a a-sinucleína e epítopos desta e a diferentes conformações de a-sinucleína e epítopos da mesma. Por exemplo, são divulgados aqui anticorpos que se ligam especificamente a a-sinucleína, a-sinucleína na sua forma monomérica nativa, a-sinucleína de comprimento total e truncada e agregados de a-sinucleína. Como usado aqui, a referência a um anticorpo que "se liga especificamente", "se liga seletivamente", ou "se liga preferencialmente" à a-sinucleína refere-se a um anticorpo que não se liga a outras proteínas não relacionadas. Em um exemplo um anticorpo de a-sinucleína divulgado aqui pode se ligar à a-sinucleína ou um epítopo da mesma e não mostra nenhuma ligação acima de cerca de 1,5 vezes de fundo para outras proteínas. Um anticorpo que "se liga especificamente" ou "se liga seletivamente" ao confômero de a-sinucleína refere-se a um anticorpo que não se liga a todas as conformações da a-sinucleína, ou seja, não se liga a pelo menos um outro confômero de a-sinucleína. Por exemplo, são divulgados aqui anticorpos que podem distinguir entre formas monoméricas e agregadas de a-sinucleína, a-sinucleína humana e de camundongo; formas de a-sinucleína de comprimento total e truncadas, bem como a-sinucleína humana contra β- e Y-sinucleína. Como os anticorpos anti-a-sinucleína humana da presente invenção foram isolados a partir de um grupo de indivíduos idosos sem sinais de parkinsonismo e exibindo uma resposta imune a-sinucleína-específica, os anticorpos anti-a-sinucleína da presente invenção também podem ser chamados de "autoanticorpos humanos", a fim de enfatizar que esses anticorpos foram realmente expressos pelos sujeitos e não foram isolados de, por exemplo, uma imunoglobulina humana que expressa biblioteca de fagos, que até então representava um método comum para tentar fornecer anticorpos semelhantes aos humanos.
[00038] Deve ser observado que o termo "um" ou "uma" entidade se refere a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "um anticorpo"é entendido como representando um ou mais anticorpos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados indiferentemente aqui.
[00039] Como usado aqui, o termo "polipeptídeo"se destina a abranger um "polipeptídeo"no singular, bem como "polipeptídeos"no plural e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados de forma linear por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo"se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo"pode ser utilizado em vez de, ou de forma intercambiável com qualquer um destes termos.
[00040] O termo "polipeptídeo" também é usado para se referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não-natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte natural biológica ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerado de qualquer forma, inclusive por síntese química.
[00041] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos pode ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adotar um grande número de conformações diferentes, são referidos como desdobrados. Como usado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de carboidrato que é anexada à proteína através de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido contendo oxigênio ou nitrogênio, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
[00042] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou derivado do mesmo se entende um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos produzidos recombinantemente e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para a invenção proposta, bem como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.
[00043] Também são incluídos como polipeptídeos da presente invenção, fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos expostos e suas combinações. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo", quando se referem a anticorpos ou polipeptídeos de anticorpos da presente invenção, incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação a antígenos da molécula nativa de ligação, anticorpo, ou polipeptídeo correspondente. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de exclusão, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos aqui. Variantes de anticorpos e polipeptídeos de anticorpos da presente invenção incluem os fragmentos, como descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições de aminoácidos, exclusões, ou inserções. Variantes podem ocorrer naturalmente ou não naturalmente. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos usando métodos de mutagênese conhecidos na técnica. Polipeptídeos variantes podem incluir substituições de aminoácidos, supressões ou adições conservadoras ou não conservadoras. Derivados de moléculas específicas de ligação à a-sinucleína, por exemplo, anticorpos e polipeptídeos de anticorpos da presente invenção, são polipeptídeos que foram alterados de forma a apresentar características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também podem ser referidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Como usado aqui, um "derivativo" de uma molécula de ligação ou fragmento do mesmo, um anticorpo, ou um polipeptídeo de anticorpo refere-se a um polipeptídeo do indivíduo com um ou mais resíduos quimicamente derivados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" estão os peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4- hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3 metilistidina pode ser substituída por histidina; homosserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.
[00044] O termo "polinucleotídeo" é destinado a englobar um ácido nucleico no singular, assim como ácidos nucleicos no plural, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou constructo, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode incluir uma ligação fosfodiéster convencional ou não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico "isolado" ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isolado incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção também incluem moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento de regulação, como um promotor, sítio de ligação do ribossomo, ou um terminador de transcrição.
[00045] Como usado aqui, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Apesar de um "códon de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não ser traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de acompanhamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação do ribossomo, terminadores de transcrição, íntrons e similares, não são parte de uma região codificadora. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um constructo de polinucleotídeo único, por exemplo, em um único vetor, ou em constructos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode incluir duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor único pode codificar separadamente uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação, um anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, como um peptídeo de sinal secretor, ou um domínio funcional heterólogo.
[00046] Em certas modalidades o ácido nucleico ou polinucleotídeo é DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação é operável quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências regulatórias, de forma a colocar a expressão do produto do gene sob influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como uma região de codificação de polipeptídeos e um promotor associado a ela) são "operacionalmente associados" ou "operacionalmente ligados" se a indução da função promotora resultar na transcrição do mRNA que codifica o gene produto desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir na capacidade das sequências reguladoras de expressão em direcionar a expressão do produto gênico ou interferir na capacidade do modelo de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição deste ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor de células específicas que direciona a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição célula-específica. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são divulgados aqui.
[00047] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, como, mas não limitados a, segmentos promotores e intensificadores de citomegalovírus (o promotor inicial imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (o promotor inicial) e retrovírus (como o vírus do sarcoma Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes vertebrados, como actina, proteínas de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. Regiões adicionais de controle de transcrição adequadas incluem promotores e intensificadores tecido-específicos, bem como promotores linfocina- induzíveis (por exemplo, promotores induzíveis por interferon ou interleucina).
[00048] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação do ribossomo, códons de iniciação e terminação de tradução e elementos oriundos de picornavírus (particularmente um sítio de entrada ribossomal interna, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).
[00049] Em outras modalidades um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).
[00050] Regiões de codificação de ácido nucleico e polinucleotídeos da presente invenção podem estar associadas a regiões codificadoras adicionais que codificam peptídeos secretores ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo de sinal ou sequência líder secretora que é clivada a partir da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente em todo o retículo endoplasmático rugoso tenha sido iniciada. Aqueles versados na técnica estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo de sinal fundido ao N-terminal do polipeptídeo, o qual é clivado a partir do polipeptídeo completo ou de "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é usado, ou um derivado funcional desta sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual é operacionalmente associado. Alternativamente, um peptídeo de sinal heterólogo de mamíferos, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador do plasminogênio tecidual humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.
[00051] Salvo disposição contrária, os termos "distúrbio"e "doença" são utilizados alternadamente aqui.
[00052] Uma "molécula de ligação", conforme usado no contexto da presente invenção, diz respeito principalmente a anticorpos e fragmentos dos mesmos, mas também pode se referir a outras moléculas de não-anticorpos que se ligam à a-sinucleína, incluindo, mas não limitado a, hormônios, receptores, ligantes, moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), acompanhantes, como proteínas de choque térmico (HSPs), bem como moléculas de adesão célula-célula, como membros das superfamílias caderina, intergrina, lectina tipo C e imunoglobulina (Ig). Assim, por razões de clareza apenas, e sem restringir o escopo da presente invenção, a maioria das modalidades seguintes é discutida com relação a anticorpos e anticorpos semelhantes a moléculas que representam as moléculas de ligação preferidas para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e de diagnóstico.
[00053] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados aqui alternadamente. Um anticorpo ou imunoglobulina é uma molécula de ligação de a-sinucleína que compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada e, normalmente, compreende pelo menos os domínios variáveis e uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente bem compreendidas; ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).
[00054] Como será discutido mais detalhadamente abaixo, o termo "imunoglobulina" compreende várias grandes classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica vão observar que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon (y, μ, α, δ, ε), com algumas subclasses entre elas (por exemplo, Y1-Y4). É da natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são facilmente perceptíveis para aquele versado na técnica em vista da presente divulgação e, portanto, estão dentro do escopo da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do escopo da presente invenção, a discussão seguinte geralmente será direcionada para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Em relação à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão é composta por dois polipeptídeos idênticos de cadeia leve de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídios idênticos de cadeia pesada de peso molecular de 53.000 a 70.000. As quatro cadeias são geralmente unidas por pontes dissulfeto em uma configuração em "Y" em que o suporte de cadeias leves agrupa as cadeias pesadas começando na boca do "Y" e continuando pela região variável.
[00055] Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode estar vinculada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas entre si e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, células B, ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm de um N-N terminalas extremidades bifurcadas da configuração em Y para o C-N terminala parte inferior de cada cadeia.
[00056] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, será observado que os domínios variáveis das porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2, ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação com o receptor Fc, ligação de complemento e assim por diante. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que eles se tornam mais distais do sítio de ligação de antígenos ou amino- terminais do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e a porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CL de fato compreendem o carbóxi-terminal da cadeia pesada e leve, respectivamente.
[00057] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente a epítopos em antígenos. Ou seja, o domínio VL e o domínio VH, ou subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação a antígenos tridimensional. Esta estrutura de anticorpos quaternários forma o sítio de ligação ao antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL. Qualquer fragmento de anticorpo ou imunoglobulina que contém uma estrutura suficiente para se ligar especificamente à α- sinucleína é denotado aqui alternadamente como um "fragmento de ligação"ou um "fragmento imunoespecífico".
[00058] Em anticorpos que ocorrem naturalmente, um anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis, às vezes chamada de "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação de antígenos, que são sequências de aminoácidos curtas, não-contíguas que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno conforme o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O "CDRs"são ladeado por quatro regiões de "estruturas" relativamente conservadas ou "FRs", que mostram menor variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura em grande parte adotam uma conformação folhas β e os CDRs formam loops que conecta, e em alguns casos fazem parte da, a estrutura β-sheets. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar uma estrutura que estabelece o posicionamento do CDRs na orientação correta intercadeia, interações não covalentes. O domínio de ligação de antígeno formado pelos CDRs posicionados define uma superfície complementar ao o epítopo do antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não- covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo os CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser prontamente identificados para qualquer região variável de cadeia pesada ou leve determinada por pessoas versadas na técnica, uma vez que foram precisamente definidos; ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, (1983); e Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, os quais estão incorporados neste por referência em suas totalidades.
[00059] No caso onde há duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como aqui utilizado está pretende incluir todos os significados, tais a menos que explicitamente expresso em contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever a locais combinando antígenos não-contíguos encontrados dentro da região variável tanto em polipeptídios de cadeia pesados quanto de cadeia leve. Esta região específica tem sido descrita por Kabat et al., Dept. de Saúde e Serviços Humanos, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, os quais são incorporados neste por referência, em que as definições incluem sobreposições ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparadas entre si. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a um CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é destinada a ser dentro do escopo do termo, tal como definido e usado neste documento. Resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem os CDRs, tal como definido por cada uma das referências acima citadas são definidos a seguir na Tabela 1 como uma comparação. Os números exatos de resíduo que abrangem um CDR particular irão variar dependendo da sequência e tamanho do CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramente determinar quais resíduos compõem uma determinada região hipervariável ou CDR do subtipo IgG de anticorpos humanos, dada a região variável de sequência de aminoácidos do anticorpo. Tabela 1: CDR Definições1
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1 Numeração de todas as definições CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).
[00060] Kabat et al.também definido um sistema de numeração para sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa versada na técnica pode inequivocamente atribuir este sistema de "numeração de Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da sequência própria. Como usado aqui, "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo disposição em contrário, as referências à numeração das posições de aminoácidos específicos de resíduos em um anticorpo ou fragmento, variante de ligação de antígeno, ou derivado destes da presente invenção estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[00061] Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos, fragmentos immunoespecíficos, variantes, ou derivados destes da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpo policlonal, monoclonal, multiespecífico, humanos, humanizados, primatizado, murinizado ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de epítopo de ligação, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs de ligação de dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo tanto um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, e anticorpo anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para os anticorpos divulgados neste documento). Moléculas ScFv são conhecidos na técnica e são descritas, por exemplo, em Patente US 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou anticorpos da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) ou subclasse de por molécula de imunoglobulina.
[00062] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção não é IgM ou um derivativo deste com uma estrutura pentavalente. Particular, em aplicações específicas da presente invenção, especialmente em uso terapêutico, IgMs são menos úteis do que IgG e outros anticorpos bivalente ou moléculas de ligação correspondentes, uma vez que IgMs devido à sua estrutura pentavalente e falta de maturação de afinidade muitas vezes mostram reatividade cruzada inespecífica e afinidade muito baixa.
[00063] Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da presente invenção não é um anticorpo policlonal, isto é, consiste substancialmente em uma espécie de anticorpo específico ao invés de ser uma mistura obtida a partir de uma amostra de plasma de imunoglobulina.
[00064] Fragmentos de anticorpos, incluindo os anticorpos de cadeia única, podem incluir a(s) região(ões) variável(s) isoladamente ou em combinação com a totalidade ou uma parte do seguinte: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e CH3. Tambem incluído na invenção estão os fragmentos de ligação α- sinucleína, também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(s) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e CH3. Anticorpos ou fragmentos immunoespecíficos do mesmo da presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De preferência, os anticorpos são humanos, anticorpos murinos, de burro, de cabra, de coelho, de cobaia, de camelo, de lhama, de cavalo ou de galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser de origem condrícties (por exemplo, a partir de tubarões).
[00065] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano isolado de um ser humano. Opcionalmente, a região de estrutura do anticorpo humano está alinhada e aprovada em conformidade com a linha germinal humana pertinente as sequências de região variável no banco de dados, ver, por exemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) hospedada pelo MRC Centro para Engenharia de Proteína (Cambridge, RU). Por exemplo, os aminoácidos considerados para desviar potencialmente da sequência verdadeira linha germinal pode ser devido a sequências dos iniciadores PCR incorporadas durante o processo de clonagem. Em comparação com anticorpos do tipo humano gerados artificialmente, tais como fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFvs) de uma biblioteca de anticorpos fago exibida ou camundongos xenogénicos o anticorpo monoclonal humano da presente invenção é caracterizado por (i) ser obtido utilizando a resposta imunológica humana, em vez da resposta de substitutos animais, ou seja, o anticorpo tem sido gerado em resposta ao natural a-sinucleína em sua conformação relevante no corpo humano, (ii) ter protegido o indivíduo ou pelo menos significativo para a presença de a-sinucleína, e (iii) uma vez que o anticorpo é de origem humana os riscos de reatividade cruzada contra autoantígenos é minimizado. Assim, de acordo com a presente invenção, os termos "anticorpo monoclonal humano", "autoanticorpos monoclonais humanos", "anticorpo humano" e similares são usados para denotar uma molécula de a-sinucleína vinculativa que é de origem humana, isto é, que foi isolada a partir de uma célula humana, como uma célula B ou mesmo hibridoma deste ou o cDNA do qual foi clonada diretamente a partir de mRNA de uma célula humana, por exemplo, uma célula B de memória humana. Um anticorpo humano ainda é "humano", mesmo que substituições de aminoácidos sejam feitas nos anticorpos, por exemplo, para melhorar as características de ligação
[00066] Anticorpos derivados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito acima e, por exemplo, em, Patente US N° 5.939.598 por Kucherlapati et al., são denotadas anticorpos do tipo humano para distingui-las dos anticorpos verdadeiramente humanos da presente invenção.
[00067] Como usado aqui, o "anticorpo murinizado" ou "imunoglobulina murinizada" refere-se a um anticorpo compreendendo um ou mais CDRs de um anticorpo humano da presente invenção, e uma região de estrutura humana que contém substituições de aminoácidos e/ou supressões e/ou inserções que são baseados em uma sequência de anticorpos de camundongo. A imunoglobulina humana fornecendo os CDRs é chamada de "pai" ou "receptora" e o anticorpo do camundongo fornecendo as mudanças de estrutura é chamado de "doador". Regiões constantes não precisam estar presentes, mas se estiverem, elas geralmente são substancialmente idênticas às regiões de anticorpos de camundongo constantes, isto é, pelo menos cerca de 85-90%, de preferência cerca de 95% ou mais idênticos. Assim, em algumas modalidades, um comprimento total murinizado cadeia de imunoglobulina pesada ou leve humana contém uma região do camundongo constante, CDRs humana, e uma estrutura substancialmente humana que tem uma série de substituições de aminoácidos "murinizados". Tipicamente, um "anticorpo murinizado"é um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável murinizada e/ou uma cadeia pesada variável murinizada. Por exemplo, um anticorpo murinizado não englobaria um anticorpo quimérico típico, por exemplo, porque toda a região variável de um anticorpo quimérico é não- camundongo. Um anticorpo modificado que tem sido "murinizado" pelo processo de "murinização"liga-se ao mesmo antígeno como o anticorpo pai que fornece os CDRs e normalmente é menos imunogênico em camundongos, quando comparado com o anticorpo pai.
[00068] Como usado aqui, o termo "porção de cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivados de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos um dos seguintes: um domínio CH1, uma dobradiça (por exemplo, região superior, médio e/ou inferior da dobradiça) domínio, um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça, e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode não ter pelo menos uma parte de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por uma pessoa versada na técnica que estes domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de tal forma que eles variam na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.
[00069] Em certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou derivados destes divulgados neste documento, as porções de cadeia pesada de uma cadeia polipeptídica de uma multimer são idênticos aos de uma segunda cadeia de polipeptídeo da multimer. Em alternativa, monômeros da invenção contendo parte de cadeia pesada não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um local de destino de ligação diferente, formando, por exemplo, um anticorpo ou diacorpo bispecífico.
[00070] Em outra modalidade, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou derivados destes divulgados neste documento são compostos por uma única cadeia polipeptídica, como scFvs e devem ser expressos intracelularmente (intracorpos) para o potencial in vivoaplicações terapêuticas e diagnósticos.
[00071] As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento divulgados neste documento podem ser derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulinas. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região da dobradiça derivados de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode incluir uma região de dobradiça derivada, em parte, a partir de uma molécula de IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode incluir uma dobradiça quimérico derivada, em parte, a partir de uma molécula de IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula de IgG4.
[00072] Como usado aqui, o termo "porção de cadeia leve" inclui sequências de aminoácidos derivados de uma cadeia leve de imunoglobulina. De preferência, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio VL ou CL.
[00073] O tamanho mínimo de um epítopo peptídeo ou polipeptídeo de um anticorpo é considerado tendo cerca de 4 a 5 aminoácidos. Epítopos peptídicos ou polipeptídeo preferencialmente contêm pelo menos sete mais de preferência, pelo menos, nove e mais preferivelmente entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que um CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os aminoácidos compreendendo um epitopo não precisam ser contíguos, e em alguns casos, não pode mesmo estar na mesma cadeia peptídica. Na presente invenção, um epítopo de peptídeos ou polipeptídeos reconhecidas por anticorpos da presente invenção contém uma sequência de pelo menos 4, pelo menos, 5, pelo menos, 6, pelo menos, 7, mais de preferência, pelo menos, 8, pelo menos, 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 de aminoácidos a-sinucleína contíguos ou não contíguos.
[00074] Por "especificamente vinculativa", ou "especificamente reconhecendo", usados como sinônimo aqui, isto geralmente significa que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo se liga a um epitopo através do seu domínio de ligação de antígenos, e que a ligação implica alguma complementaridade entre o domínio de ligação de antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é considerado como "ligando especificamente" para um epítopo quando se liga a esse epítopo, através do seu domínio de ligação de antígenos mais facilmente do que teria se ligado a um epítopo aleatório, sem relação. A "especificidade"é aqui utilizada para qualificar a afinidade relativa pelo qual um anticorpo determinado se liga a um epítopo determinado. Por exemplo, o anticorpo "A" pode ser considerado como tendo uma maior especificidade para um epítopo determinado do que anticorpo "B", ou anticorpo "A" pode ser considerado se ligando ao epítopo "C" com uma maior especificidade do que ele tem para o epítopo "D" relacionado.
[00075] Quando presente, o termo "características de ligação imunológica", ou outras características de ligação de um anticorpo com um antígeno, em todas as suas formas gramaticais, refere-se à especificidade, afinidade, reatividade cruzada, e outras características de ligação de um anticorpo.
[00076] Por "preferencialmente vinculativo", isto significa que a molécula de ligação, por exemplo, o anticorpo se liga especificamente a um o epítopo mais facilmente do que teria se ligado a um epítopo relacionado, semelhante, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que "preferencialmente se liga" a um o epítopo determinado ligaria maior provavelmente a que o epítopo do que para um epítopo relacionado, apesar deste anticorpo poder ter uma reação cruzada com o epítopo relacionado.
[00077] Como um exemplo não-limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar ao primeiro epítopo mencionado com uma constante de dissociação (KD) que seja menor que o anticorpo KD para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro antígeno preferencialmente se ele ligar ao primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos uma ordem de grandeza menor do que o anticorpo KD para o segundo epítopo. Em outro exemplo não-limitante, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar ao epítopo primeiro com uma afinidade que seja pelo menos duas ordens de grandeza menor do que o anticorpo KD para o segundo epítopo.
[00078] Em outro exemplo, não limitante, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar ao primeiro epítopo com uma taxa de off (k(off)) que seja menor que k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar ao primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos uma ordem de grandeza menor do que do anticorpo k(off) para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos duas ordens de grandeza menor do que do anticorpo k (off) para o segundo epítopo.
[00079] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante de ligação de antígeno, ou derivados destes divulgados neste documento pode ser considerado para ligar um α- sinucleína ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa off (k (off)) menor ou igual a 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 ou l0-3 sec- 1. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser considerado para ligar α-sinucleina ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa off (k (off)) inferior ou igual a 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec- 1, ou 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 ou 10-7 sec-1.
[00080] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante de ligação de antígeno ou derivado divulgado neste documento pode ser considerado para ligar um α- sinucleína ou um fragmento ou variante destes com uma taxa (k(on)) maior ou igual a 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 or 5 X 104 M-1 sec-1. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser considerado para ligar α-sinucleina ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa (k(on)) maior que ou igual a 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec- 1, or 5 X 106 M-1 sec-1 ou 107 M-1 sec-1.
[00081] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo é considerado para inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência para um epitopo determinado se ele preferencialmente se ligar a esse epitopo na medida em que ele bloqueia, até certo ponto, a ligação do anticorpo referência ao epitopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, testes ELISA de competição. Um anticorpo poder ser considerado para inibir competitivamente a ligação do anticorpo referência a um epitopo determinado por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou, pelo menos, 50%.
[00082] Como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epitopo individuo com o CDR de uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina; ver, por exemplo, Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) nas paginas 27-28. Como usado aqui, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do conjunto entre uma população de imunoglobulinas e um antigeno, isto é, a força funcional que combina de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno, ver, por exemplo, Harlow na paginas 29-34. Avidez está relacionada tanto a afinidade das moléculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos, e também as valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura epítopo altamente de repetição, como um polímero, seria uma com avidez alta. A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado, ver, por exemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" Em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), e métodos descritos neste documento. Técnicas gerais para medir a afinidade de um anticorpo para um antígeno incluem ELISA, RIA, e ressonância plasmon de superfície. A afinidade medida de uma interação antígeno-anticorpo específica pode variar se for medida em condições diferentes, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação do antígeno, por exemplo, KD, IC50, são preferencialmente feitas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno e um tampão padronizado.
[00083] Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritos ou especificados em termos de reatividade cruzada. Como usado aqui, o termo "reação cruzada" se refere à capacidade de um anticorpo, especificamente para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida de relacionamento entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo é reativo cruzado se ele se liga a um epítopo diferente daquele que induziu a sua formação. O epítopo reativo cruzado geralmente contém muito das mesmas características estruturais complementares como as do epítopo indutor e, em alguns casos, poder realmente se encaixar melhor que o original.
[00084] Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reatividade cruzada, em que eles ligam epítopos relacionados, mas não idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos, 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (conforme calculado utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) para um epítopo de referência. Um anticorpo poder ser considerado tendo pouca ou nenhuma reatividade cruzada se não ligam epítopos com menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, e menos de 50% de identidade (conforme calculado utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) para um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado "altamente específico"para um epítopo determinado se não ligar qualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo do mesmo epítopo.
[00085] Moleculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes ou derivados destes da invenção também podem ser descritos ou especificados em termos de sua afinidade de ligação para a-sinucleína. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com constante de dissociação ou de Kd menor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12M, 1012 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M.
[00086] Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidade e configuração tridimensional das regiões constante das classes diversas de imunoglobulina são bem conhecidas. Como usado aqui, o termo "domínio VH" inclui o domínio amino terminal variável de uma cadeia pesada da imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro (mais terminal amino) domínio de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobu-lina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é terminal amino para a região da dobradiça de uma molécula de cadeia pesada da imunoglobulina
[00087] Como usado aqui o termo "domínio CH2" inclui a parte de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de 244 resíduo a 360 resíduos de um anticorpo usando esquemas convencionais de numeração (244-360 resíduos, sistema de numeração Kabat; e 231 -340 resíduos, sistema de numeração EU, ver Kabat EA et al. op. cit). O domínio CH2 é o único que não está intimamente combinado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos de ligação N ramificadas se interpõem entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. É também bem documentado que o domínio CH3 se estende a partir do domínio CH2 para o C terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
[00088] Como usado aqui, a "região da dobradiça"compreende a porção de uma molécula de cadeia pesada que una o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende cerca de 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões N terminal de ligação de antígenos se movam de forma independente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, médio e inferior; ver Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083.
[00089] Como usado aqui a "ligação dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas que ocorrem naturalmente IgG, as regiões e CH1 CL são ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligados por duas pontes dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 utilizando o , sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE).
[00090] Como usado aqui, os termos "ligado", "fundidos" ou "fusão" são usados alternadamente. Esses termos referem-se à união de mais dois elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo a conjugação de meios químicos ou recombinantes. Uma "fusão na estrutura" refere-se à junção de duas ou mais estruturas de polinucleotídeos de leitura aberta (ORFs) para formar uma ORF contínua mais longa, de uma forma que mantém a estrutura de leitura correta de translação da ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína simples contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos ORFs original (que segmentos não são normalmente tão unidos na natureza). Embora a estrutura de leitura seja, assim, contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, sequência de ligador em estrutura. Por exemplo, polinucleotídeos codificando os CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em estrutura, mas ser separados por um polinucleotídeo codificando pelo menos uma região de estrutura de imunoglobulina ou regiões adicionais CDR, desde que a "fusão"CDRs seja co-traduzida como parte de um polipeptídeo contínuo.
[00091] A "expressão"termo, como usado neste documento refere- se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, knockdown do gene, assim como tanto a expressão transitória e expressão estável. Ele inclui, sem limitação de transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), small hairpin RNA (shRNA), pequeno RNA de interferência (siRNA) ou qualquer outro produto RNA, e a transcrição do mRNA para tal polipeptídeo (s). Se o produto final desejado é um bioquímico, a expressão inclui a criação bioquímica e de quaisquer precursores. Expressão de um gene produz um "produto do gene." Como usado aqui, um produto de genes pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de uma transcrição. Produtos de genes descritos neste documento incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, exemplo por, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, exemplo por, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, a associação com outras subunidades da proteína, clivagem proteolítica, e assim por diante.
[00092] Como usado aqui, o termo "amostra" refere-se a qualquer matéria biológica obtida a partir de um sujeito ou paciente. Em um aspecto, uma amostra pode ser composta por sangue, líquido cefalorraquidiano ("CSF"), ou na urina. Em outros aspectos, uma amostra pode incluir sangue total, plasma, células B enriquecidas a partir de amostras de sangue, e células cultivadas (por exemplo, as células B a partir de um indivíduo). A amostra também pode incluir uma biópsia ou amostra de tecido, incluindo o tecido neural. Em ainda outros aspectos, uma amostra pode ser composta por células inteiras e/ou um lisado das células. Amostras de sangue podem ser coletadas por métodos conhecidos na técnica. Em um aspecto, as pelotas podem ser ressuspensas pelo vórtice a 4 °C em 200 μl de tampão (20 mM Tris, pH. 7.5, 0.5% Nonidet, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1M NaCl, Inibidor de Protease IX Sigma, e Inibidor de Fosfatase IX Sigma 1 e 2). A suspensão pode ser mantida em gelo por 20 minutos com vórtex intermitente. Depois de girar a 15.000 x g por 5 minutos a cerca de 4°C, alíquotas do sobrenadante podem ser armazenadas a cerca de -70°C.
[00093] Conforme utilizados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" se referem tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (atenuar) uma mudança ou distúrbio fisiológico indesejado, como o desenvolvimento de Parkinsonismo. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, melhora dos sintomas, diminuição da proprorção da doença, estado estabilizado (isto é., sem piora) da doença, atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão (seja parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tratamento"também pode significar sobrevivência prolongada em comparação à sobrevivência esperada se não receber tratamento. Aqueles que necessecitam de tratamento incluem aqueles que já possuem a condição ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a manifestação da condição ou distúrbio deva ser prevenida.
[00094] "Sujeito" ou "indivíduo"ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero"significa qualquer sujeito, especificamente um sujeito mamífero, por exemplo., um paciente humano, para quem o diagnóstico, prognóstico, prevenção ou terapia é desejada.
II. Anticorpos
[00095] A presente invenção geralmente se refere a anticorpos anti- a-sinucleína humanos e seus fragmentos de ligação a antígeno, que preferencialmente demonstram as características de ligação imunológicas e/ou propriedades biológicas conforme delineado para os anticorpos ilustrados nos Exemplos. Em conformidade com a presente invenção anticorpos monoclonais humanos específicos para α- sinucleína foram clonados a partir de um conjunto de sujeitos envelhecidos.
[00096] No curso dos experimentos realizados em conformidade com a presente invenção tentativas iniciais falharam em clonas anticorpos α- sinucleína específicos mas quase sempre resultaram em clones falso- positivos. Outras investigações destes clones revelaram que eles produziram anticorpos que reconhecem proteínas de E. coli. Para contornar este problema, os anticorpos em meios condicionados de culturas de células B de memória humana foram submetidos à varredura em paralelo para ligação a monomer de sinucleína alfa de comprimento complete revestido e ausência de ligação a proteínas E. coli. e albumina sérica bovina (BSA). Especificamente, meio condicionado de células B foi pré-absorvido com proteínas de E. coli antes de o meio ser submetido a uma análise ELISA para varredura de anticorpos a-sinucleína de ligação humanos.
[00097] Tentativas iniciais de isolar anticorpos específicos foram focadas em pools de sujeitos humanos com alta atividade de ligação plasmática a a-sinucleína, sugestiva de níveis elevados de plasma de anticorpos a-sinucleína circulantes. Inesperadamente, estas tentativas falharam em produzir células B de memória humana específica de a- sinucleína e os anticorpos descritos na presente invenção foram isolados de conjuntos de sujeitos com baixa reatividade plasmática a a- sinucleína.
[00098] Devido a esta medida, diversos anticorpos poderiam ser isolados. Anticorpos selecionados foram ainda analisados para determinação de classe e subclasse de cadeia leve. Mensagens de anticorpos relevantes selecionadas a partir de culturas de células B de memória são em seguida transcritos por RT-PCR, clonados e combinados em vetores de expressão para produção recombinante; ver os Exemplos em anexo. Expressão recombinante dos anticorpos humanos em HEK293 ou células CHO e a caracterização subsequente de suas especificidades de ligação para a-sinucleína de comprimento complete e suas formas truncadas (figura 2), em Western Blot (figura 4) bem como a β- e Y-sinucleína (figura 3) confirmaram pela primeira vez que anticorpos humanos foram clonados sendo altamente específicos para a-sinucleína e reconhecem diferentes epítopos dentro da proteína a-sinucleína.
[00099] Desta forma, a presente invenção geralmente se refere a um anticorpo anti-a-sinucleína monoclonal humano de ocorrência natural e seus fragmentos de ligação, derivados e variantes. Como demonstrado nos Exemplos e mostrado na figura 3 o anticorpo anti-a-sinucleína monoclonal humano da presente invenção é preferencialmente caracterizado em especificamente se ligar a-sinucleína em comparação a e-sinucleína e Y-sinucleína. De forma vantajosa, o anticorpo é capaz de se ligar a a-sinucleína na forma de monomer native e/ou na forma oligomérica ou agregada. Além disso, o anticorpo anti-a-sinucleína humano da presente invenção pode ainda ser caracterizado por sua capacidade de reconhecer a-sinucleína em Western Blotting; ver figura 4.
[000100] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um anticorpo anti-a-sinucleína, ou fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo especificamente se liga ao mesmo epítopo de a-sinucleína como um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em NI-202.3G12, NI- 202.12F4 ou NI-202.3D8. Como ilustrado nos Exemplos, o anticorpo NI- 202.3G12 se liga a (wt) a-sinucleína do tipo selvagem mas não a truncações de a-sinucleína em uma análise ELISA direta, apontando para um epítopo estrutural de NI-202.3G12; ver figura 2A. Em contrapartida, o anticorpo NI-202.12F4 se liga a truncações de a- sinucleína contendo a região de repetição anfipática de terminal-N (aminoácidos 1 a 60) em uma análise ELISA direta, apontando para um epítopo de terminal-N de NI-202.12F4; ver figura 2B. Além disso, os resultados preliminaries de análises ELISA diretas realizados com o anticorpo NI-202.3D8 revelaram que NI-202.3D8 especificamente reconhece o terminal-C de a-sinucleína, preferencialmente os aminoáciso 96 a 140.
[000101] Além disso, sem o intuito de se comprometer a observações experimentais iniciais outros experimentos preliminares assumem que o anticorpo NI-202.3D8 preferencialmente se liga ao monômero de α- sinucleína em vez de fibrilos em uma análise de anticorpos ELISA direta enquanto os anticorpos NI-202.12F4 e NI-202.3G12 preferencialmente se ligam a agregados de a-sinucleína ou fibrilos na forma monomérica de a-sinucleína. Portanto, a presente invenção fornece um conjunto de anticorpos anti-a-sinucleína humanos com diferentes especificidades, que são, assim, especificamente úteis para fins diagnósticos e terapêuticos.
[000102] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção exibe as propriedades de ligação do anticorpo NI-202.12F4 exemplar como descrito em qualquer um dos Exemplos 1 a 5. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti-a-sinucleína da presente invenção preferencialmente reconhece a-sinucleína humana, e não de camundongo, especificamente quando analisado de acordo com o Exemplo 3. Além disso, ou como alternativa, o anticorpo anti-a- sinucleína da presente invenção preferencialmente reconhece a- sinucleína de formas impropriamente dobrada ou agregada, e não formas monoméricas fisiológicas, especificamente quando analisado de acordo com o Exemplo 3. Além disso, ou como alternativa, o anticorpo anti-a-sinucleína da presente invenção se liga a doenças que causam mutantes de a-sinucleína humana, especificamente aqueles descritos no Exemplo 3. Neste contexto, as especificidades de ligação podem estar na faixa conforme mostrado para o anticorpo NI-202.12F4 exemplar na figura 5, isto é tendo meias concentrações eficazes máximas (EC50) de cerca de 100 a 1000 pM, preferencialmente um EC50 de cerca de 100 a 500 pM para α-sinucleina de tipo selvagem ou uma doença que cause mutante da mesma.
[000103] Portanto, o anticorpo anti-a-sinucleína da presente invenção preferencialmente se liga a formas patológicas de a-sinucleína no cérebro, p. ex. agregados patológicos de a-sinucleína como exemplificado por análise Western blot e marcação imunohistoquímica descrita no Exemplo 3. Consequentemente, em outra modalidade adicional ou alternative, o anticorpo anti-a-sinucleína da presente invenção preferencialmente se liga a um epítopo conformacional de α- sinucleína humana e não se liga significativamente a fragmentos derivados de terminal-N de a-sinucleína consistindo dos aminoácidos 1 a 20; 21 a 40; 41 a 60; 11 a 30; ou 31 a 50.
[000104] A presente invenção também é direcionada a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo compreende um domínio de ligação a antígeno idêntico àquele de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em NI-202.3G12, NI-202.12F4 ou NI-202.3D8.
[000105] A presente invenção ainda exemplifica diversas moléculas de ligação, p. ex. anticorpose seus fragmentos de ligação, que podem ser caracterizados por compreender em sua região variável, p. ex. domínio de ligação em pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) da região variável de VH e/ou VL compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas na figura 1. As sequências de nucleotídeos correspondentes que codificam as regiões variáveis identificadas acima são determinadas na listagem de sequência em anexo. Um conjunto de exemplo de CDRs das sequências de aminoácidos acima da região de VH e/ou VL conforme descrito na figura 1 também é indicado na listagem de sequência em anexo. No entanto, conforme discutido a seguir, aqueles versados na técnica estão cientes do fato de que além de, ou como alternativa, as CDRs podem ser usadas, que diferem em sua sequência de aminoácidos daquelas determinadas na figura 1 por um, dois, três ou até mais aminoácidos no caso de CDR2 e CDR3.
[000106] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é qualquer um dos anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácidos da região de VH e/ou VL conforme descrito na figura 1. Como alternativa, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, derivado ou variante do mesmo, que compete para ligação a a-sinucleína com pelo menos um dos anticorpos tendo a região VH e/ou VL conforme descrito na figura 1. Aqueles anticorpos podem ser, também, humanos, especificamente para aplicações terapêuticas. Como alternativa, o anticorpo é um anticorpo murino, murinizado e murino-humano quimérico, que são especificamente úteis para métodos diagnósticos e estudos em animais.
[000107] Conforme mecionado acima, devido a sua geração após uma resposta imune humana, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção reconhecerá epítopos que são de relevância fisiológica específica e que podem não ser acessíveis ou menos imunogênicos no caso de processos de imunização para a geração de, por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo e varredura in vitro de bibliotecas de exibição de fagos, respectivamente. Consequentemente, é prudente estipular que o epítopo do anticorpo anti-a-sinucleína humano da presente invenção é único e não existe nenhum outro anticorpo que é capaz de se ligar ao epítpo reconhecido pelo anticorpo monoclonal humano da presente invenção. Portanto, a presente invenção também se estende geralmente a anticorpos anti-a- sinucleína e moléculas de ligação a-sinucleína que compete com o anticorpo monoclonal humano da presente invenção para ligação específica a a-sinucleína. A presente invenção é mais especificamente direcionada a um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo especificamente se liga ao mesmo epítopo de a-sinucleína como um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em NI-202.3G12, NI- 202.12F4 ou NI-202.3D8.
[000108] A competição entre anticorpos é determinada por uma análise em que a imunoglobulina sob teste inibe ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como a-sinucleína. Diversos tipos de análises de ligação competitivas são conhecidos, por exemplo: radioimunoanálise direta ou indireta (RIA), imunoanálise de enzimas direta ou indireta de fase sólida (EIA), análise de competição sanduíche; ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA de biotina-avidina direta de fase sólida; ver Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 e Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; análise marcada direta de fase sólida, análise sanduíche marcada direta de fase sólida; ver Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de marcação direta de fase sólida usando marcação I125; ver Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 e Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Geralmente, tal análise envolve o uso de a-sinucleína purificada ou seus agregados ligados a uma superfície sólida ou células contendo uma imunoglobulina de teste não marcada ou uma imunoglobulina de referência marcada, isto é o anticorpo monoclonal humano da presente invenção. A inibição competitive é medida determinando a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Preferencialmente, a análise de ligação competitive é realizada sob condições conforme descrito para a análise ELISA nos Exemplos em anexo. Os anticorpos identificados por análise de competição (anticorpos competitivos) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítpo adjacent suficientemente próximo do epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estérico. Geralmente, quando um anticorpo competidor está presente em excess, inibirá ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50% ou 75%. Portanto, a presente invenção é ainda direcionada a um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivados do mesmo, onde o anticorpo competitivamente inibe um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em NI-202.3G12, NI-202.12F4 ou NI-202.3D8 a partir de ligação a α-sinucleina.
[000109] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), onde pelo menos um dentre VH-CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos dois dentre VH-CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos às sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência. a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Como alternativa, as regiões VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 de VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos de VH -CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 de cadeia pesada de referência a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Desta forma, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia pesada da invenção tem sequências de polipeptídeos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 relacionadas aos grupos mostrados na figura 1. Embora a figura 1 mostre VH-CDRs definidos pelo sistema Kabat, outras definições de CDR, p. ex., VH-CDRs definidos pelo sistema Chothia, também são incluídos na presente invenção, e podem ser facilmente identificados por aqueles versados na técnica usando os dados apresentados na figura 1.
[000110] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na figura 1.
[000111] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia de imunoglobulina (VH) em que as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH- CDR3 mostrados na figura 1, exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácidos em qualquer VH-CDR. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservadoras.
[000112] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos um dos VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos dois dentre VL-CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos a sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência. Como alternativa, as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 de VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 de cadeia leve de referência a partir de anticorpos divulgados no presente documento. Desta forma, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia leve da invenção tem as sequências de polipeptídeos de VL- CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 relacionadas aos polipeptídeos mostrados na figura 1. Embora a figura 1 mostre VL-CDRs definidos pelo sistema Kabat, outras definições de CDR, p. ex., VL-CDRs definidas pelo sistema Chothia, também são incluidas na presente invenção.
[000113] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) em que as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VL-CDR1, VL-CDR2 e VL- CDR3 mostrados na figura 1.
[000114] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VL) em que as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VL- CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostrados na figura 1, exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácidos em qualquer VL-CDR. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservadoras.
[000115] Uma imunoglobulina ou seu DNA codificador pode também ser modificado. Assim, em uma outra modalidade o método da presente invenção compreende qualquer uma das etapas de produção de um anticorpo quimérico, anticorpo murinizado, anticorpo de cadeia única, fragmento de Fab, anticorpo bi-específico, anticorpo de fusão, anticorpo marcado ou um análogo de qualquer um destes. Métodos correspondentes são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos, p. ex., em Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Quando os derivados de tais anticorpos são obtidos por técnica de exibição de fagos, ressonância plasmônica de superfície conforme empregada no sistema BIAcore pode ser usada para aumentar a eficácia de anticorpos de fagos que se ligam ao mesmo epítopo de qualquer um dos anticorpos descritos aqui (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). A produção de anticorpos quiméricos é descrita, por exemplo, no pedido internacional WO89/09622. Métodos para a produção de anticorpos humanizados são descritos em, p. ex., Pedido Europeu EP-A1 0 239 400 e pedido internacional WO90/07861. Uma outra fonte de anticorpos a ser utilizada em conformidade com a presente invenção são os denominados anticorpos xenogênicos. O princípio geral para a produção de anticorpos xenogênicos como anticorpos do tipo humano em camundongos é descrito nos, p. ex., pedidos internacionais WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 e WO 96/33735. Conforme discutido acima, o anticorpo da invenção pode existir em uma variedade de formas além de anticorpos completos; incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab)2, bem como em cadeias únicas; ver p. ex. pedido internacional WO88/09344.
[000116] Os anticorpos da presente invenção ou suas cadeias de imunoglobulina correspondentes podem ainda ser modificados usando técnicas convencionais conhecidas na técnica, por exemplo, usando deleções de aminoácidos, inserções, substituições, adições e/ou recombinações e/ou quaisquer outras modificações conhecidas na técnica, sejam sozinhas ou em combinação. Os métodos para introduzir tais modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são bem conhecidos por aqueles versados na técnica; ver, p. ex., Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). As modificações do anticorpo da invenção incluem derivatizações químicas e/ou enzimáticas em um ou mais aminoácidos constituintes, incluindo modificações de cadeia lateral, modificações de estrutura principal, e modificações em terminal-C e terminal-N incluindo acetilação, hidroxilação, metilação, amidação e a ligação de porções de carboidrato ou lipídeos, cofatores e semelhantes. De forma semelhante, a presente invenção compreende a produção de proteínas quiméricas que compreendem o anticorpo descrito ou algum fragmento do mesmo no terminal amino fundido à molécula heteróloga como um ligante imunoestimulatório no terminal carboxila; ver, p. ex., pedido internacional WO00/30680 para detalhes técnicos correspondentes.
[000117] Além disso, a presente invenção compreende peptídeos que incluem aqueles contendo uma molécula de ligação como descrito acima, por exemplo, contendo a região CDR3 da região variável de qualquer um dos anticorpos mencionados, especificamente CDR3 da cadeia pesada uma vez que frequentemente foi observado que a cadeia pesada CDR3 (HCDR3) é a região tendo um grau maior de variabilidade e uma participação predominante em interação antígeno-anticorpo. Tais peptídeos podem facilmente ser sintetizados ou produzidos por meios recombinantes para produzir um agente de ligação útil de acordo com a invenção. Tais métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando sintetizadores de peptídeos automáticos que são disponíveis comercialmente. Os peptídeos também podem ser produzidos por técnicas recombinants incorporando o DNA que expressa o peptídeo em um vetor de expressão e transformando células com o vetor de expressão para produzir o peptídeo.
[000118] Portanto, a presente invenção se refere a qualquer molécula de ligação, p. ex., um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que é orientado em direção aos anticorpos anti-a-sinucleína humanos da presente invenção e exibe as propriedades mencionadas, isto é que especificamente reconhece a-sinucleína. Tais anticorpos e moléculas de ligação podem ser testados para sua especificidade e afinidade de ligação por análise ELISA e Western Blot e imunohistoquímica conforme descrito no presente documento, ver, p. ex., os Exemplos. Além disso, resultados preliminares de experimentos subsequentes realizados em conformidade com a presente invenção revelaram que o anticorpo anti- a-sinucleína humano da presente invenção, especificamente o anticorpo NI-202.12F4 reconhece os corpos de inclusão de a-sinucleína presentes em seções cerebrais de humanos de pacientes que sofreram de demência com corpos de Lewy (DLB) ou doençã de Parkinson (PD). Assim, emu ma modalidade preferencial específica da presente invenção, o anticorpo humano ou fragmento de ligação, derivado ou variante do mesmo reconhece a-sinucleína em seções cerebrais DLB e PD de humanos.
[000119] Como uma alternativa para obter imunoglobulinas diretamente da cultura de células B imortalizadas ou células B de memória, as células imortalizadas podem ser usadas como uma fonte de locais de cadeia leve e cadeia pesada re-arranjados para expressão subsequente e/ou manipulação genética. Genes de anticorpos re- arranjados podem ser transcritos de forma reversa a partir de mRNAs apropriados para produzir cDNA. Se desejado, a região constante de cadeia pesada pode ser trocada por aquela de um isótipo diferentes ou eliminada junto. As regiões variáveis podem ser ligadas para codificar regiões Fv de cadeia única. Regiões Fv múltiplas podem ser ligadas para conferir capacidade de ligação a mais de um alvo ou combinações de cadeia leve e pesada quiméricas podem ser utilizadas. Assim que o material genético estiver disponível, o projeto de análogos conforme descrito acima que retém sua capacidade de ligação ao alvo desejado é simples. Os métodos para a clonagem de regiões variáveis de anticorpo e geração de anticorpos recombinantes são conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos, por exemplo, em Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.
[000120] Uma vez que o material genético apropriado for obtido e, se desejado, modificado para codificar um análogo, as sequências de codificação, inclusive aquelas que codificam, no mínimo, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada, podem ser inseridas em sistemas de expressão contidos em vetores que podem ser transfectados em células hospedeiras recombinantes padrão. Uma variedade de tais células hospedeiras pode ser usada; para processamento eficiente, no entanto, células de mamíferos são preferenciais. Linhagens celulares de mamíferos típicas úteis para este propósito incluem, mas não são limitadas a, células CHO, células HEK 293 ou células NSO.
[000121] A produção do anticorpo ou análogo é em seguida realizada através de cultura do hospedeiro recombinante modificado sob condições apropriadas para o crescimento das células hospedeiras e a expressão das sequências de codificação. Os anticorpos são, em seguida, recobertos isolando-os da cultura. Os sistemas de expressão são preferencialmente designados para incluir peptídeos de sinal de modo que os anticorpos resultantes são secretados nos meios; no entanto, a produção intracelular também é possível.
[000122] Em conformidade com o acima, a presente invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou molécula de ligação equivalente da presente invenção, no caso de o anticorpo preferencialmente ter pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo descrito acima. Geralmente, tal região variável codificada pelo polinucleotídeo compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de VH e/ou VL da região variável do referido anticorpo.
[000123] Aqueles versados na técnica apreciarão imediatamente que o domínio variável do anticorpo tendo o domínio variável descrito acima pode ser usado para a construção de outros polipeptídeos ou anticorpos de especificidade e função biológica desejada. Assim, a presente invenção também compreende polipeptídeos e anticorpos compreendendo pelo menos uma CDR do domínio variável descrito acima e que vantajosamente têm substancialmente as mesmas ou propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo descrito no exemplos em anexo. Aqueles versados na técnica sabem que a afinidade de ligação pode ser realçada fazendo substituições de aminoácidos dentro das CDRs ou dentro das alças hipervariáveis (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que parcialmente se sobrepõem com as CDRs conforme definido por Kabat; ver, p. ex., Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327. Assim, a presente invenção também se refere a anticorpos em que uma ou mais das CDRs mencionadas compreendem uma ou mais, preferencialmente não mais de duas substituições de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo da invenção compreende em um ou ambas as suas cadeias de imunoglobulina duas ou todas as três CDRs das regiões variáveis conforme determinado na figura 1.
[000124] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígeno, variantes ou derivados da invenção, como conhecido por aqueles versados na técnica, podem compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente de complemento C1 a uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema complementar. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise de patógenos celulares. A ativação de complemento também estimula a resposta inflamatória e pode ainda ser envolvida em hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos se ligam a receptores em diversas células através da região Fc, com um local de ligação receptor de Fc na região Fc do anticorpo que se liga a um receptor de Fc (FcR) em uma célula. Há uma série de receptores de Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores ípsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação de anticorpos a receptores de Fc em superfícies celulares aciona uma série de respostas biológicas importantes e diversas incluindo engolfamento e destruição de partículas revestidas por anticorpos, remoção de complexos imunes, lise de células alvo revestidas por anticorpos por meio de células assassinas (killer cells) (denominada citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle de produção de imunoglobulina.
[000125] Consequentemente, certas modalidades da presente invenção incluem um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivado do mesmo, em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios de região constante foi deletada ou de forma diversa alterada de modo a fornecer características bioquímicas desejadas como funções efetoras reduzidas, a capacidade de dimerizar não-covalentemente, aumento de capacidade para localizer no local de agregação e depósito de a-sinucleína, meia vida sérica reduzida, ou auemnto de meia vida sérica em comparação a um anticorpo complete e inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, certos anticorpos para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento são anticorpos de domínio deletado que compreendem uma cadeia de polipeptídeos semelhante a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que são desprovidos pelo menos de uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, um domínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será deletado, por exemplo, todo ou parte do domínio de CH2 será deletado. Em outras modalidades, certos anticorpos para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento têm uma região constante, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de IgG, que é alterada para eliminar glicosilação, denominados em outras partes do presente documento como anticorpos aglicosilados ou "agli". Tais anticorpos "agli" podem ser preparados enzimaticamente bem como por engenheiração de locais de glicosilação consenso na região constante. Embora não se comprometendo a nenhuma teoria, acredita-se que anticorpos "agli" podem ter um perfil de segurança e estabilidade melhorado in vivo. Os métodos de produção de anticorpos aglicosilados, tendo função efetora desejada são encontrados, por exemplo, no pedido internacional WO2005/018572, que é incorporado por referência integralmente.
[000126] Em certos anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações de ponto ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação de receptor de Fc do anticorpo modificado circulante aumentando assim a localização de a-sinucleína. Em outros casos, pode ser que as modificações de regiões constantes compatíveis com a presente invenção moderem ligação complementar e assim reduzam a meia vida sérica e associação não-específica de uma citotoxina conjugada. Ainda que outras modificações da região constante possam ser usadas para modificar ligações de dissulfeto ou porções de oligossacarídeos que permitem localização realçada devido a aumento de especificidade de antígenos ou flexibilidade de anticorpos. O perfil fisiológico, boidisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações resultantes, como localização de a-sinucleína, biodistribuição e meia-vida sérica, podem facilmente ser medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida.
[000127] Em certos anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígeno, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode ser mutada ou trocada por sequências de proteína alternativas para aumentar a absorção celular de anticorpos por meio de exemplo aumentando a edocitóse mediada por receptores de anticorpos através de receptores de FCY, LRP, ou receptores de Thy1 ou pela 'SuperAntibody Technology', que permite que os anticorpos sejam lançados em células vivas sem as prejudicar (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por exemplo, a geração de proteínas de fusão da região de ligação do anticorpo e os ligantes de proteínas cognatas de receptores de superfície celular ou anticorpos bi ou multiespecíficos com uma ligação de sequências específica a a-sinucleína bem como um receptor de superfície celular podem ser engenheirados usando técnicas conhecidas na técnica.
[000128] Em certos anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode ser mutada ou trocada por sequências de proteína alternativas ou o anticorpo pode ser quimicamente modificado para aumentar sua penetração na barreira cerebral sanguínea.
[000129] As formas modificadas de anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção podem ser feitas a partir de anticorpos completos ou principais usando técnicas conhecidas na técnica. Exemplos de técnicas são discutidos mais detalhadamente abaixo. Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção podem ser feitos ou fabricados usando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, as moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são "produzidas recombinantemente", isto é, são produzidas usando tecnologia de DNA recombinante. Exemplos de técnicas para fazer moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são discutidas mais detalhadamente em outras partes do presente documento.
[000130] Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção também incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de modo que a ligação covalente não impeça o anticorpo de especificamente se ligar ao epítopo cognato. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de bloqueio/proteção conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc. Quaisquer de diversas modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina etc. Além disso, o derivado por conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.
[000131] Em modalidades preferenciais específicas, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção não obterão uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em certas modalidades, as moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígenos da invenção são derivados de um paciente, por exemplo, um paciente humano, e são subsequentemente usados na mesma especial a partir da qual são derivados, por exemplo, humana, aliviando ou minimizando a ocorrência de resposta imune deletéria.
[000132] A desimunização também pode ser usada para diminui a imunogenicidade de um anticorpo. Conforme usado aqui, o termo "desimunização"inclui alteração de um anticorpo para modificar epítopos de células T; ver, por exemplo, pedidos internacionais WO98/52976 e WO00/34317. Por exemplo, as sequências de VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um "mapa" de epítopos de células T humanas de cada região V mostrando a localização de epítopos em relação a regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e outros resíduos importantes dentro da sequência. Epítopos de células T individuais do mapa de epítopos de células T são analisados para identificar substituições de aminoácidos alternativas com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma faixa de sequências alternativas de VH e VL é designada compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e estas sequências são subsequentemente incorporadas em uma faixa de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos a-sinucleína específicos ou seus fragmentos imunoespecíficos para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento divulgados no presente documento, que são em seguida testados para função. Geralmente, entre 12 e 14 anticorpos variantes são gerados e testados. Os genes de cadeia pesada e leve completos compreendendo regiões V e c humana modificadas são em seguida clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes introduzidos em linhagens celulares para a produção do anticorpo completo. Os anticorpos são, em seguida, comparados em análises bioquímicas e biológicas apropriadas e a variante ideal é identificada.
[000133] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologia de hibridoma, recombinante e de exibição de fagos, ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aqueles conhecidos na técnica e instruídas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), tais referências incorporadas por referência integralmente. O termo "anticorpo monoclonal" conforme utilizado no presente documento não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fágico, e não do método pelo qual é produzido. Desta forma, o termo "anticorpo monoclonal"não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são derivados de células B humanas que foram imortalizadas através de transformação com vírus Epstein-Barr, conforme descrito no presente documento.
[000134] No processo de hibridoma conhecido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais de um mamífero, por exemplo, células B derivadas de um sujeito humano conforme descrito no presente documento, são fundidos com uma linhagem celular de tumor imortal (por exemplo,. uma linhagem celular de mieloma), assim, produzindo células híbridas ou "hibridomas" que são ambos imortais e capazes de produzir o anticorpo geneticamente codificado da célula B. Os híbridos resultantes são segregados em cepas genéticas únicas por seleção, diluição e re-crescimento com cada cepa individual compreendendo genes específicos para a formação de um anticorpo único. Eles produzem anticorpos, que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referência a sua parentagem genética pura, são denominados "monoclonais".
[000135] As células de hibridomas assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cyltura adequado que preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma não-fundidas e parentais. Aqueles versados na técnica avaliarão que os reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, seleção e crescimento de hibridomas são disponíveis comercialmente a partir de uma série de fontes e protrocolos padronizados bem estabelecidos. Geralmente, o meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas é analisado para a produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por análises in vitro como imunoprecipitação, radioimunoanálise (RIA) ou análise imunoabsorvente ligada a enzimas (ELISA) conforme descrito no presente documento. Após células de hibridoma serem identificadas como produzindo anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão; ver, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Ainda será apreciado que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos de purificação convencionals como, por exemplo, proteína-A, cromatografia de hidroxiapatia, eletroforese por gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[000136] Em outra modalidade, os linfócitos podem ser selecionados por micromanipulação e os genes variávels isolados. Por exemplo, as células mononucleares sanguíneas periféricas podem ser isoladas de um mamífero imunizado ou naturalmente imune, por exemplo, um humano, e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser submetidas à varredura para IgGs específicos que atendem os critérios de varredura. As células de poços positivos podem ser isoladas. Células B produtoras de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou sendo identificadas em uma análise de placas hemolíticas mediadas por complemento. As células B produtoras de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genes VH e VL podem ser ampliados usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpos e transfectados em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.
[000137] Como alternativa, as linhagens celulares produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. Neste aspecto, as técnicas adequadas para uso na invenção são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) que é incorporado neste documento por referência integralmente, incluindo os suplementos.
[000138] Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos pode ser generados por técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos recombinantemente ou por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usindo enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Tais fragmentos são suficientes para uso, por exemplo, em procedimentos imunodiagnósticos envolvendo acoplamento das porções imunoespecíficas de imunoglobulinas para detectar reagentes como radioisótopos.
[000139] Os anticorpos completamente humanos, conforme descrito no presente documento, são especificamente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos da presente invenção são isolados, por exemplo, de sujeitos idosos que devido a sua idade podem ser suspeitos de estar em risco de desenvolver um distúrbio, por exemplo, doença de Parkinson, ou um paciente com o distúrbio mas com um curso da doença incomumente estável. No entanto, embora seja prudente esperar que sujeitos idosos saudáveis e sem sintomas, respectivamente, mais regularmente terão desenvolvido anticorpos anti-a-sinucleína protetores do que sujeitos mais jovens, os últimos podem ser usados bem como fonte para obter um anticorpo humano da presente invenção. Isto é especificamente verdade para pacientes mais jovens que são predispostos a desenvolver uma forma familiar de uma doença sinucleínopática, mas permanecem sem sintomas uma vez que seu sistema e resposta imune funcionam mais eficientemente do que em adultos mais velhos.
[000140] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve ou pesada de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Exemplos de moléculas de anticorpo compreendendo pelo menos uma CDR que podem ser incluidas nos anticorpos de sujeitos são descritos no presente documento.
[000141] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, especificamente, por síntese química ou preferencialmente por técnicas de expressão recombinante conforme descrito no presente documento.
[000142] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno, variante ou derivado do mesmo da invenção compreende uma região constante sintética em que um ou mais domínios são parcialmente ou completamente deletados ("anticorpos com domínios deletados"). Em certas modalidades, os anticorpos modificados compatíveis compreenderão construtos de domínios deletados ou variantes em que todo o domínio de CH2 foi removido (construtos de ΔCH2). Para outras modalidades, um peptídeo de ligação curto pode ser substituído pelo domínio deletado para fornecer flexibilidade e liberade de movimentação para a região variável. Aqueles versados na técnica avaliarão que tais construtos são especificamente preferenciais devido às propriedades regulatórias do domínio de CH2 na taxa catabólica do anticorpo. Os construtos de domínios deletados podem ser originados usando um vetor que codifica um domínio constante humano de IgG1, ver, por exemplo, pedidos internacionais WO02/060955 e WO02/096948A2. Este vetor é engenheirado para deletar o domínio de CH2 e fornecer um vetor sintético que expressa uma região constante de IgG1 com domínio deletado.
[000143] Em certas modalidades, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da presente invenção são minicorpos. Os minicorpos podem ser feitos usando métodos descritos na técnica, ver, por exemplo, Patente U.S. 5.837.821 ou pedido internacional WO 94/09817.
[000144] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo da invenção compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina tendo deleção ou substituição de alguns ou até mesmo um único aminoácido desde que este permita associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio de CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e assim aumentar a localização de a-sinucleína. De forma semelhante, pode ser desejável simplesmente deletar aquela parte de um ou mais domínios de região constante que controlam a função efetora (por exemplo ligação complementar) a ser modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (meia-vida sérica) enquanto deixa outras funções desejáveis associadas ao domínio de região constante do sujeioto intactas. Além disso, conforme mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser sintéticas através de mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que realçam o perfil do construto resultante. Neste aspecto, pode ser possível romper a atividade fornecida por um local de ligação conservado (por exemplo Fc binding) enquanto substancialmente mantém a configuração e perfil imunogênico do anticorpo modificado. Ainda que outras modalidades compreendam a adição de um ou mais aminácidos à região constante para realçar as características desejáveis como função efetora ou fornecer mais ligação de citotoxinas ou carboidratos. Em tais modalidades, pode ser desejável inserir ou replica sequências específicas derivadas de domínios de região constantes selecionadas.
[000145] A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem, consistem essencialmente de, ou consistem de, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) descritas no presente documento, cujos anticorpos ou fragmentos se ligam imunoespecificamente a α- sinucleína. As técnicas-padrão conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, incluindo, mas não limitadas a, mutagenese direcionada ao local e mutagenese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácidos. Preferencialmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação à região VH de referência, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, região VL, VL- CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3. Uma "substituição de aminoácido conservadora"é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas ( por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Como alternativa, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagenese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser submetidos à varredura para atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, capacidade de se ligar a α-sinucleina).
[000146] Por exemplo, é possível introduzir mutações somente em regiões de estrutura ou somente em regiões de CDR de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser mutações "missense" silenciosas ou neutras, por exemplo, ter nenhum ou pouco efeito sobre a capacidade de um anticorpo de se ligar a um antígeno, de fato algumas destas mutações não alterem a sequência de aminoácidos. Estes tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códons, ou melhorar a produção de anticorpos de um hibridoma. As regiões de codificação otimizadas por códons que codificam anticorpos da presente invenção são divulgadas em outras partes do presente documento. Como alternativa, as mutações "missense"não- neutras podem alterar a capacidade de um anticorpo de se ligar a um antígeno. A localização da maioria das mutações missense selenciosas e neutras provavelmente está nas regiões de estrutura, enquanto a localização da maioria das mutações missense não-neutras é provável de estar na CDR, embora isto não seja uma exigência absoluta. Aqueles versados na técnica seriam capazes de designar e testar moléculas mutantes com as propriedades desejadas, como não alteração em atividade de ligação a antígenos ou altereação na atividade de ligação (por exemplo, melhoras na atividade de ligação a antígenos ou mudança na especificidade de anticorpos). Após a mutagenese, a proteína codificada pode rotineiramente ser expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada, (por exemplo, capacidade de se ligar imunoespecificamente a pelo menos um epítopo de a-sinucleína) pode ser determinada usando técnicas descritas no presente documento ou por técnicas rotineiramente modificadas conhecidas na técnica.
III. Polinucleotídeos que Codificam Anticorpos
[000147] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo pode ser composto de qualquer poliribonucleotídeo ou polideoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo pode ser composto de DNA de filamento único e duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento único e duplo, RNA de filamento único e duplo e RNA que é uma mistura de regiões de filamento único e duplo, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que pode ser de filamento único ou, mais geralmente, filamento duplo ou uma mistura de regiões de filamento único ou duplo. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo pode ser composto de regiões de filamento triplo compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo pode também conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas principais de DNA ou RNA modificadas por estabilidade ou outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomums como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita para DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo"compreende formas quimicamente, enzimaticamente, ou metabolicamente modificadas.
[000148] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção de cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina) pode ser criado introduzindo uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos da imunoglobulina de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas-padrão, como mutagenes direcionada ao local e mutagenese mediada por PCR. Preferencialmente, as substituições de aminoácidos conservadoras são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não-essenciais.
[000149] Como se sabe, o RNA pode ser isolado das células B originais, células de hibridoma ou de outras células transformadas por técnicas-padrão, como extração e precipitação de isotiocianato de guanidínio seguida de centrifugação ou cromatografia. Quando desejável, o mRNA pode ser isolado de RNA total por técnicas-padrão como cromatografia em celulose oligo dT. As técnicas adequadas são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, os cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo podem ser feitos, simultânea ou separadamente, usando transcriptase reversa e DNA polimerase em conformidade com métodos bem conhecidos. PCR pode ser iniciada por iniciadores de região constante consenso ou por iniciadores mais específicos com base nas sequências de aminoácidos e DNA de cadeia leve e pesada publicadas. Conforme discutido acima, PCR também pode ser usada para isolar clones de DNA que codificam cadeias de anticorpos leve e pesada. Neste caso, as bibliotecas podem ser submetidas à varredura pode iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores, como sondas de região constante humana.
[000150] DNA, geralmente DNA plasmidial, pode ser isolado das células usando técnicas conhecidas na técnica, restrição mapeada e sequenciada em conformidade com técnicas-padrão, bem conhecidas determinadas em detalhes, por exemplo, nas referências anteriores relacionadas a técnicas de DNA recombinante. Obviamente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise subsequente.
[000151] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos de VH- CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Como alternativa, as regiões VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 de VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos de VH- CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 de cadeia pesada de referência a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Desta forma, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia pesada da invenção tem sequências de polipeptídeos de VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 relacionadas às sequências de polipeptídeos mostradas na figura 1.
[000152] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos um dos VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos dois dos VL-CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos às sequências de aminoácidos deVL-CDR1, VL- CDR2, ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Como alternativa, as regiões VL- CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 de VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 de cadeia leve de referência a partir dos anticorpos divulgados no presente documento. Assim, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia leve da invenção tem sequências de polipeptídeos de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 relacionadas às sequências de polipeptídeos mostradas na figura 1.
[000153] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na figura 1 e na listagem de sequência em anexo.
[000154] Conforme conhecido na técnica, a "identidade de sequência" entre dois polipeptídeos ou dois polinucleotídeos é determinada comparando a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos de um polipeptídeo ou polinucleotídeo à sequência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo. Quando discutido no presente documento, se qualquer polipeptídeo específicoé pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo pode ser determinado usando métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica, como, entre outros, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar o melhor segment de homologia entre duas sequências. Ao usar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência específica é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são estabelecidos, obviamente, de modo que o percentual de identidade seja calculado no comprimento complete da sequência de polipeptídeos de referência e que lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas.
[000155] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o polinucleotíodeo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em um ácido nucleico tendo uma sequência de polinucleotídeos da região VH ou VL de um anticorpo anti-a-sinucleína conforme estipulado na ID SEQ N°s. forth in SEQ ID NOS: 2, 5, 8, 11, 14, 17 or 20. Neste aspecto, aqueles versados na técnica avaliarão imediatamente que os polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada podem codificar o domínio variável de ambas as cadeias de imunoglobulina ou apenas uma.
[000156] A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotídeos da invenção, conforme descrito em outras partes deste documento. Além disso, os polinucleotídeos que codificam os polinucleotídeos de fusão, fragmentos de Fab e outros derivados, conforme descrito no presente documento, também são contemplados pela invenção.
[000157] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente, por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que, rapidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, recozimento e ligação daqueles oligonucleotídeos e em seguida a ampliação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[000158] Como alternativa, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, um fragmento de ligação a antígenos, variante ou derivado do mesmo pode ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo específico não estiver disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo poderá ser sintetizado quimicamente ou obtido a partir de uma fonte adequada I (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, preferencialmente poliA+ RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo a-sinucleína específico, como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por ampliação PCR usando iniciadores sintéticos que podem ser hibridizados às extremidades 3' e 5' da sequência ou clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeos específica para a sequência de genes específica para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos ampliados gerados por PCR podem ser clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método conhecido na técnica.
[000159] Uma vez que a sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos correspondente do anticorpo, ou fragmento de ligaçao a antígenos, variante ou derivado do mesmo for determinado, sua sequência de nucleotídeos poderá ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagenese direcionada ao local, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), que são ambos incorporados por referência no presente documento integralmente), para gerar anticorpos tendo uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.
IV. Expressão de Polipeptídeos de Anticorpos
[000160] Após a manipulação do material genético isolado para forncer anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos são geralmente inseridos em um vetor de expressão para introdução em células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo. A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo é descrita no presente documento. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo, ou porção da mesma (preferencialmente contendo o domínio variável de cadeia leve ou pesada), da invenção tenha sido obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo poderá ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicasbem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para preparar uma proteína através de expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica a sequência de nucleotídeos são descritos no presente documento. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de anticorpos e sinais de controle transcricionais e translacionais apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante for in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, desta forma, fornece vetores replicáveis compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada da mesma, ou um domínio variável de cadeia leve ou pesada, operacionalmente ligado a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, pedidos internacionais WO 86/05807 e WO 89/01036; e Patente N° U.S. 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para expressão de toda a cadeia leve ou pesada.
[000161] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é utilizado no presente documento para significar vetores utilizados em conformidade com a presente invenção como um veículo para introduzir e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Como conhecido por aqueles versados na técnica, tais vetores podem facilmente ser selecionados a partir do grupo que consiste em plasmídeos, pagos, vírus e retrovirus. No geral, vetores compatíveis com a presente invenção compreenderão um marcador de seleção, locais de restrição apropriados para facilitar clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procarióticas. Para o propósito desta invenção, diversos sistemas de vetores de expressão podem ser utilizados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animais como papiloma vírus bovino, polioma vírus, adenovirus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistema policistrônicos com locais de ligação de ribossomos internos. Além disso, as células que integraram o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode fornecer prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocídas (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados como cobre. O gene marcador selecionável pode ser diretamente ligado à sequência de DNA a ser expressa, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Elementos adicionais também podem ser necessários para síntese ideal de mRNA. Estes elementos podem incluir sequências de sinais, sinais de união, bem como promotores transcricionais, realçadores e sinais de terminação.
[000162] Especificamente, em modalidades preferenciais, os genes de região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão ao longo dos genes de região constante de cadeia leve e pesada (preferencialmente humanos) como discutido acima. Em uma modalidade, isto é realizado usando um vetor de expressão de propriedade da Biogen IDEC, Inc., denominado NEOSPLA, divulgado na Patente N° U.S. 6.159.730. Este vetor contém o promotor/realçador de cytomegalovírus, o promotor principal de globina beta de camundongo, a origem SV40 de replicação, a sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, exon 1 e exon 2 de fosfotransferase de neomicina, gene reductase de dihidrofolato e a sequência principal. Foi descoberto que este vetor resulta em expressão de nível muito alto de anticorpos mediante incorporação de genes de região variável e constante, transfecção em células CHO, seguida de seleção em G418 contendo ampliação de meio e metotrexato. Obviamente, qualquer vetor de expressão que é capaz de obter expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não são limitados a, Examples pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZeoSV2 plasmidiais (disponibilizados por Invitrogen, San Diego, CA), e pCI plasmidial (disponibilizado por Promega, Madison, WI). No geral, a varredura de grandes números de células transformadas para aquelas que expressam níveis adequadamente altos se cadeias leve e pesada de imunoglobulina forem experimentação de rotina pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Os sistemas de vetores também são descritos nas Patentes N°s U.S. 5.736.137 e 5.658.570, cada qual sendo incorporada por referência no presente documento integralmente. Este sistema fornece níveis de expressão, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros exemplos de sistemas de vetores são divulgados por exemplo, na Patente N° U.S. 6.413.777.
[000163] Em outras modalidades preferenciais, os anticorpos, seus fragmentos de ligação a antígenos, variantes ou derivados da invenção podem ser expressos usando construtos policistrônicos como aqueles divulgados na publicação de pedido de patente N° U.S. 2003-0157641 A1 e incorporados no presente documento por referência integralmente. Nestes sistemas de expressão, múltiplos produtos de gene de interesse como cadeias leve e pesada de anticorpos podem ser produzidos a partir de um único construto policistrônico. Estes sistemas usam vantajosamente um local de ribossomo interno (IRES) para fornecer níveis relativamente altos de anticorpos. Sequências de IRES compatíveis são divulgados na Patente N° U.S. 6.193.980 que também é incorporada no presente documento. Aqueles versados na técnica avaliarão que tais sistemas de expressão podem ser usados para produzir de forma eficaz a faixa completa de anticorpos divulgada no presente pedido.
[000164] Mais geralmente, uma vez que o vetor ou sequência de DNA que codifica uma sub-unidade monomérica do anticorpo tenha sido preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por diversas técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Estas incluem, mas não são limitadas a, transfecção, incluindo lipotransfecção usando, por exemplo, Fugene ou lipofectamina, fusão protoplástica, precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envelopado, microinjeção e infecção com vírus intacto. Geralmente, a introdução de plasmídeos no hospedeiro se dá através do método de co-precipitação de fosfato de cálcio. As células hospedeiras que abrigam o construto de expressão são cultivadas sob condições apropriadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e analisadas para síntese de proteína de cadeia leve e/ou pesada. Exemplos de técnicas de análise incluem análise imunoabsorvente ligada a enzimas (ELISA), radioimunoanálise (RIA), ou análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), imunohistoquímica e semelhantes.
[000165] O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são em seguida cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo para uso nos métodos descritos no presente documento. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo, operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Em modalidades preferenciais para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam ambas as cadeias leve e pesada podem ser co- expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina inteira, conforme detalhado abaixo.
[000166] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual de polipeptídeos de cadeias leve e pesada. Como alternativa, um único vetor pode ser usado codificando ambos os polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada. Em tais situações, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excess de cadeia pesada livre; ver Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. As sequências de codificação para as cadeias leve e pesada podem compreender cDNA ou DNA genômico.
[000167] Conforme utilizado aqui, "células hospedeiras" se referem a células que abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e codificando pelo menos um gene heterólogo. Em descrições de processos para isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula"e "cultura de células" são usados alternadamente para denotar a fonte de anticorpo a menos que isto seja claramente especificado de outra forma. Em outras palavras, a recuperação de polipeptídeos a partir das "células"pode significar células completas centrifugadas, ou da cultura de células contendo ambos o meio e as células suspensas.
[000168] Uma variedade de sistemas de vetores de expressão hospedeiros pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para uso nos métodos descritos no presente documento. Tais sistemas de expressão hospedeiros representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressam uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, mas não são limitados a microorganismos como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de DNA bacteriófago recombinante, DNA plasmidial ou DNA de cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpos; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células vegetais infectados com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor, CaMV; vírus mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpos, ou sistema de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que abrigam construtos de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; promotor 7.5K de vírus vaccinia). Preferencialmente, as células bacterianas como Escherichia coli, e mais preferencialmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante complete, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células de mamíferos como células Ovarianas de Hamster Chinês (CHO), junto com um vetor como o elemento de promotor de gene inicial intermediário principal de citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos; ver, por exemplo, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.
[000169] A linhagem celular de hospedeiro usada para expressão de proteínas é, com frequência, de origem mamífera; aqueles versados na técnica são creditados com a capacidade de preferencialmente determinar linhagens celulares de hospedeiro específicas que são melhor adequadas para o produto de gene desejado a ser expresso em tais linhagens celulares. Exemplos de linhagens celulares de hospedeiro incluem, mas não são limitados a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, DHFR menor), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster bebê), MDCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês), BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Células CHO e 293 são especificamente preferenciais. As linhagens celulares de hospedeiro são geralmente disponibilizadas por serviços comerciais, American Tissue Culture Collection ou literatura publicada.
[000170] Além disso, uma cepa de célula de hospedeiro pode ser escolhida como modelando a expressão das sequências inseridas, ou modificando e processando o produto de gene da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de protudos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células de hospedeiros diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-translacional de proteínas e produtos de gene. As linhagens celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento correto da proteína estranha expressa. Para este fim, as células hospedeiras eucarióticas possuem o maquinário celular para processamento adequado da transcrição, glicosilação e fosforilação primárias do produto de gene podem ser usadas.
[000171] Para produção de proteínas recombinantes de alto rendimento e a longo prazo, a expressão estável é preferencial. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente molécula de anticorpo podem ser engenheiradas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, realçador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação etc), e um marcador selectionável. Após a introdução do DNA estrangeiro, as células engenheiradas podem crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido, e em seguida são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integram estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar focus que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode vantajosamente ser usado para engenheirar linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo.
[000172] Uma série de sistemas de seleção pode ser usada, incluindo, mas não limitada a quinase de timidina de vírus da herpes simples (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), genes hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) podem ser empregados na células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Além disso, a resistência antimetabólitos pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confere resistência a aminoglicosídeo G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Os métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados por referência no presente documento integralmente.
[000173] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por ampliação de vetor, para uma revisão, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa anticorpo pode ser ampliado, o aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região ampliada é associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará; ver Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257.
[000174] A produção in vitro permite escalonamento para fornecer grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. As técnicas para cultivo de células de mamíferos sob condições de cultura de tecidos são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo em um reator aeróbio ou em um reator de agitação continua, ou cultura de células imobilizadas ou presas, por exemplo em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas por métodos de cromatografia comuns, por exemplo, filtração por gel, cromatografia de troca de ions, cromatografia em DEAE-celulose ou cromatografia de (imuno-)afinidade, por exemplo, após biosíntese preferencial de um polipeptídeo de região de dobradiça sintética ou antes ou após a etapa de cromatografia por interação hidrofóbica (HIC) descrita no presente documento.
[000175] Genes que codificam anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção também podem ser expressos em células de não-mamíferos tais como bactérias ou insetos ou células de levedura ou de plantas. Bactérias que absorvem rapidamente ácidos nucleicos incluem membros da família Enterobacteriaceae, como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, como Bacillus subtilis; pneumococo; Streptococcus eHaemophilus influenzae. será ainda apreciado que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos geralmente se tornam parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e, em seguida, montados em moléculas funcionais. Onde as formas tetravalente de anticorpos são desejadas, as subunidades, então, irão se auto-organizar em anticorpos tetravalentes; ver, por exemplo, pedido internacional WO 02/096948.
[000176] Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado, dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade dessa proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificadas podem ser desejáveis. Vetores incluem, mas não estão limitados, a vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), no qual a sequência de codificação de anticorpos pode ser ligada individualmente no vector na estrutura com a região lacZ de codificação para que uma proteína de fusão seja produzida; vetores PIN (Inouye & Inouye, Nucleic acid Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509), e assim por diante. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificada a partir de células lisadas por adsorção e ligação em uma matriz de esferas de glutationa-agarose seguida de eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou fator locais de clivagem da protease Xa para que o produto do gene clonado alvo possa ser liberado a partir da fração GST.
[000177] Além dos procariontes, os micróbios eucarióticos também podem ser usados. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro comum, é o mais usado entre os microorganismos eucarióticos embora uma série de outras cepas estarem comumente disponíveis, por exemplo, Pichia pastoris. Para a expressão em Saccharomyces , o YRp7 plasmídeo, por exemplo, (Stinchcomb et al, Nature 282 (1979), 39;.. Kingsman et al, Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1 que fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC n ° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). A presença da lesão trlp como uma característica do genoma da célula de levedura hospedeira fornece então um ambiente eficaz para a detecção de transformação do crescimento, na ausência de triptofano.
[000178] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é normalmente usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpos pode ser clonada individualmente em regiões não-essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e colocado sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).
[000179] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção foi recombinantemente expressa, então todos os anticorpos, seus dímeros, cadeias individuais pesadas ou leves, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção, pode ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo, por exemplo, por meio de cromatografia (por exemplo,, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico depois da proteína A, cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas, ver, por exemplo, Scopes, "Purificação de Proteínas", Springer Verlag, NY (1982). Alternativamente, um método preferido para aumentar a afinidade de anticorpos da invenção é divulgada no pedido de patente doa EUA 2002-0123057 A1.
V. Proteínas de fusão e Conjugados
[000180] Em certas modalidades, o polipeptídeo do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos ou uma ou mais metades normalmente não associada com um anticorpo. Modificações exemplares são descritas com mais detalhes abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo de cadeia simples fv da invenção pode compreender um ligador de sequência flexível , ou pode ser modificado para adicionar uma fração funcional (por exemplo,, PEG, um fármaco, uma toxina, ou um marcador, como um fluorescente, radioativo, enzima, metal pesado, nuclear magnético, e similares).
[000181] Um polipeptídeo de anticorpo da invenção pode compreender, consistir essencialmente de, ou ser constituído por uma proteína de fusão. As proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, uma imunoglobulina de domínio de ligação de α-sinucleina com pelo menos um local alvo de ligação, e pelo menos uma fração heteróloga, isto é, uma porção que não está naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas separadas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou podem normalmente existi na mesma proteína, mas são colocados em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por meio de síntese química, ou por meio da criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeos são codificadas na relação desejada.
[000182] O termo "heterólogo" como aplicado para um polinucleotídio ou um polipeptídeo significa que o polinucleotídio ou polipeptídeo é derivado a partir de uma entidade distinta daquela do restante da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, como usado neste documento, um "polipeptídeo heterólogo" para ser fundido com um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou análogos do mesmo é derivado de um polipeptídio de imunoglobulina da mesma espécie, ou uma polipeptídeo de imunoglobulina ou não imunoglobulina de uma espécie diferente.
[000183] Como discutido em mais detalhes em outros lugares aqui, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ainda ser recombinantemente fundidos a um polipeptídeo heterólogo no N terminal-ou C- ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) para polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados com moléculas úteis tais como marcadores em ensaios de detecção e moléculas efetoras, tais como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionuclídeos, ou toxinas; ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO92/08495; WO91/14438 ; WO89/12624; patente n° US 5314995, e pedido de patente europeia EP 0 396 387.
[000184] Anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser compostos de aminoácidos unidos entre sí por meio de ligações de peptídios ou ligações de peptídios modificados, ou seja, peptídeos isosteres, e podem conter aminoácidos que não são os 20 aminoácidos codificados por gene. Os anticorpos podem ser modificados por meio de processos naturais, tal como o processamento pós-translacional, ou por meio de técnicas de modificação química que são bem conhecidas na na técnica. Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar do anticorpo, incluindo a estrutura principal do peptídeo, as cadeias laterais do aminoácido e os terminais amino ou carboxila, ou em frações tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou diferentes em vários locais em um determinado anticorpo. Além disso, um determinado anticorpo pode conter muitos tipos de modificações. Os anticorpos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os anticorpos cíclicos, ramificados, cíclicos e ramificados podem resultar de processos naturais ou pós-translacionais ou podem ser feitos por meio de métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP ribosilação, amidação, ligação covalente da flavina, ligação covalente de uma fração de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um derivado de lipídio ou lipídios, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligações de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formolação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos para proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação; ver, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, TE Creighton, WH Freeman and Company, New York 2a Ed, (1993);. Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, BC Johnson, Ed, Academic Press, New York, pgs.. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).
[000185] A presente invenção também fornece proteínas de fusão que compreendem um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado, e um polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em, um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões V H de um anticorpo da invenção ou a sequência de aminoácidos de um ou mais dasregiões V L de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e uma sequência heteróloga de polipeptídeo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento divulgados neste documento compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dosV H-CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, ou a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dosV L-CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, e uma sequência heteróloga de polipeptídeo. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo que comprende a sequência de aminoácidos de um vh-CDR3 de um anticorpo da presente invenção, ou fragmento, derivante ou variante, e uma sequência heteróloga de polipeptídeo, na qual a proteína de fusão se vincula especificamente em a-sinucleína. Em uma outra modalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de ao menos uma região V H de um anticorpo da invenção e a sequência de aminoácidos de ao menos uma região V L de um anticorpo da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes dos mesmos, e uma sequência heteróloga de polipeptídeo. De preferência, as regiões V H V L da proteína de fusão correspondem a um única fonte de anticorpo (ou scFv ou fragmento Fab) que se liga especificamente a-sinucleína. Ainda em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento divulgados neste documento compreende um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais dosV H CDRs de um anticorpo e a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais dosV L CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, ou variantes dos mesmos, e uma sequência heteróloga de polipeptídeo. De preferência, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais dos V H-CDR (s) ou VL-CDR (s) correspondem a única fonte de anticorpos (ou scFv ou fragmento Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas de fusão também são abrangidas pela invenção.
[000186] Exemplos de proteínas de fusão relatadas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; and Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-selectin (homing receptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; and Watson et al., Nature 349 (1991), 164167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991) ,721-730); CTLA-4 (Lisley et al, J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al, Cell 66 (1991.) 1133-1144); TNF receptor (Ashkenazi et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; e Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991). e receptor de IgE (Ridgway e Gorman, j. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448).
[000187] Como discutido em outros lugares no presente documento, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser fundidos em polipeptídeos heterólogos para aumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado com os anticorpos da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo, ver, por exemplo, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
[000188] Além disso, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser fundidos em sequências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a sua purificação ou detecção. Em modalidades preferenciais, a sequência de aminoácidos marcadora é um peptídeo hexa-histidina (HIS), assim como o marcador fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece uma conveniente purificação da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para a purificação incluem, mas não estão limitados ao marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da influenza (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) e o marcador "frag".
[000189] Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidas na técnica; ver, por exemplo, patente n° US 5,116,964 e 5,225,538. O local preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar as características de secreção ou ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é então transfectado para dentro de uma célula hospedeira para a expressão.
[000190] Anticorpos da presente invenção podem ser usados de forma não-conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos um dentre uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção do alvo, ou para geração de imagens ou tratamento do paciente. Anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser marcados ou conjugados, tanto antes ou depois da purificação, quando a purificação é realizada. Em particular, os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.
[000191] Os conjugados que são munotoxinas incluindo os anticorpos convencionais têm sido amplamente descritos na técnica. As toxinas podem ser acopladas nos anticorpos por meio de técnicas de acoplamento convencional ou imunotoxinas contendo porções de toxina de proteína podem ser produzidas como proteínas de fusão. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados de forma correspondente para obter tais imunotoxinas. Os exemplos ilustrativos dessas imunotoxinas são aqueles descritos por Byers, Seminars Cells. Biol. 2 (1991), 59-70 e por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
[000192] As pessoas versadas na técnica apreciarão que os conjugados também podem ser montados usando uma variedade de técnicas, dependendo do agente selecionado para ser conjugado. Por exemplo, os conjugados com biotina são preparados, por exemplo, reagindo um polipeptídeo de ligação a-sinucleína com um éster ativado de biotina, como o éster N-biotina hidroxisuccinimida. Da mesma forma, os conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles listados no presente documento, ou pela reação com um isotiocianato, de preferência isotiocianato de fluoresceína. Conjugados de anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção são preparados de maneira análoga.
[000193] A presente invenção abrange ainda os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígenos, variantes, ou seus derivados da invenção conjugados em um diagnóstico ou agente terapêutico. Os anticorpos podem ser usados diagnósticamente para, por exemplo, demonstrar a presença de uma doença neurológica, para indicar o risco de contrair uma doença neurológica, para monitorar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença neurológica, ou seja, doença sinucleinopática como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento e/ou prevenção. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons utilizando diversas tomografias por emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos; ver, por exemplo, patente n° US 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnóstico de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; adequados exemplos de complexos de grupo porostéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; adequados exemplos de materiais fluorescentes incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorin; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 111Em ou 99Tc.
[000194] Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo também pode ser marcado de forma detectável por meio do acoplamento com um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo com marcação quimioluminescente é então determinada por meio da detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Exemplos de compostos particularmente úteis de marcação quimioluminescente são luminol, isoluminol, teromatic acridinio éster, imidazol, sal de acridinio e oxalato éster.
[000195] Uma das maneiras em que um anticorpo ou fragmento de ligação de, variante, ou seu derivado pode ser detectável por meio de marcadores é através da ligação do mesmo com uma enzima e usando o produto ligado em um ensaio imunoenzimático (EIA) (Voller, A. "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). A enzima, que é ligada ao anticorpo reage com um substrato adequado, de preferência um substrato cromogênico, de tal forma a produzir uma molécula química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Enzimas que podem ser usadas para marcar o anticorpo detectável incluem, mas não estão limitadas a, malato desidrogenase, estafilocócicas nuclease, delta-5- esteroide isomerase, álcool de levedura desidrogenase, alfa- glicerofosfato, desidrogenase, fosfato triose isomerase, peroxidase de rabano silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenas, glicoamilase, e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção também pode ser realizada por meio de comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com os padrões similares de preparação.
[000196] Detecção também pode ser feita usando qualquer um dentre uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por meio da marcação radioativa do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (Março, 1986)), que é incorporado por referência neste documento). O isótopo radioativo pode ser detectado por meio de, incluindo, mas não limitado a, um contador gama, um contador de cintilação, ou autoradiografia.
[000197] Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado do mesmo pode também ser marcado de forma detectável usando metais que emitem fluorescência tais como152 Eu, ou outros da série dos lantanídios. Estes metais podem ser anexados no anticorpo usando tais grupos de quelação de metal, tais como ácido dietilenotriaminepentacético quelante (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[000198] Técnicas para conjugar várias metades em um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivados do mesmo são bem conhecidas, ver, por exemplo,, Arnon et al."Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", emControlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (Eds.), Marcel Dekker, Inc., pp 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", emMonoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", emMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.
[000199] Como mencionado, em certas modalidades, uma fração que melhora a estabilidade ou a eficácia de uma molécula de ligação, por exemplo, uma ligação polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunoespecífico do mesmo podem ser conjugados. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado com as moléculas de ligação da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
VI. Composições e métodos de uso
[000200] A presente invenção refere-se a composições que compreendem a referida molécula de ligação a-sinucleína, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção ou derivados, ou suas variantes, ou o polinucleotídeo, vetor ou célula da invenção. A composição da presente invenção pode ainda compreender um transportador farmaceuticamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir adicionais agentes, tais como: interleucinas ou interferons, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Por exemplo, para uso no tratamento da doença de Parkinson o agente adicional pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em pequenas moléculas orgânicas, anticorpos anti-a-sinucleína, e suas combinações. Assim, em uma modalidade especial de preferência, a presente invenção se refere ao uso ae molécula de ligação de a-sinucleína, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção ou de uma molécula de ligação que tenham substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um dos mesmos, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para o tratamento profilático e terapêutico de uma doença sinucleinopática, acompanhamento da progressão de uma doença sinucleinopática ou uma resposta de um tratamento para uma doença sinucleinopática em um objeto para determinar o risco de um objeto de desenvolver uma doença sinucleinopática.
[000201] Assim, em uma modalidade a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma desordem neurológica caracterizada por acúmulo anormal e/ou deposição de a-sinucleína no cérebro e no sistema nervoso central, respectivamente, em que método compreende administração para um objeto com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das moléculas de ligação a-sinucleína, anticorpos, polinucleotídeos, vetores ou células descritos acima na presente invenção. O termo "distúrbio neurológico" inclui, mas não se limita a doenças sinucleinopáticas tais como a doença de Parkinson (DP), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), a variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), atrofia de multiplos sistemas (MSA), insuficiência pura autonômica (PAF), neurodegeneração com acumulação cerebral de ferro tipo-1 (NBIA-I), a doença de Alzheimer,doença de Pick, distrofia generalizada neuroaxonal juvenil (doença Hallervorden-Spatz ), a esclerose lateral amiotrófica, lesão cerebral traumática e síndrome de Down, bem como outros distúrbios do movimento e as doenças do sistema nervoso central (SNC) em geral. Salvo declaração ao contrário, os termos neurodegenerativos, neurológico ou neuropsiquiátrico são usados indistintamente neste documento.
[000202] Uma vantagem particular da abordagem terapêutica da presente invenção reside no fato de que os anticorpos da presente invenção são derivados de células B ou células B de memória de idosos sem sinais de parkinsonismo e, portanto, são, com uma certa probabilidade, capazes de prevenir uma doença sinucleinopática clinicamente manifesta, ou de diminuir o risco da ocorrência da doença clinicamente manifesta, ou de retardar o início ou progressão da doença clinicamente manifesta. Normalmente, os anticorpos da presente invenção também já passaram por maturação somática com sucesso, ou seja, a otimização com relação à seletividade e eficácia na alta afinidade de ligação para o alvo a-sinucleína molécula por meio de variação somática das regiões variáveis do anticorpo.
[000203] O conhecimento de que tais células in vivo , por exemplo, em um ser humano, não tenham sido ativadas por meio de relacionadas ou outras proteínas fisiológicas no sentido de uma reação alérgica ou autoimunologica também é de grande importância médica uma vez que este significa uma chance consideravelmente maior de sucesso de vida atraves das fases de teste clínico. Por assim dizer, eficiência, aceitabilidade e tolerabilidade já foram demonstradas antes do desenvolvimento pré-clínico e clínico do anticorpo profilático ou terapêutico em pelo menos um objeto humano. Assim, pode-se esperar que os anticorpos humanos anti-a-sinucleína da presente invenção, tanto sua eficiência para alvo de estrutura específica como agente terapêutico e sua probabilidade reduzida de efeitos colaterais aumentam significativamente a sua probabilidade clínica de sucesso.
[000204] A presente invenção também fornece um produto farmacêutico e de diagnóstico, respectivamente, embalagem, ou kit composto por um ou mais recipientes com um ou mais dos ingredientes acima descritos, por exemplo, anticorpo anti-a-sinucleína, fragmento de ligação, derivados ou variantes dos mesmos, polinucleotídeo, vector ou celula da presente invenção. Associados com tais recipientes(s) podem ser um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração em seres humanos. Além disso ou, alternativamente, o kit é composto por reagentese/ou instruções para o uso em ensaios de diagnóstico apropriados. A composição, por exemplo kit da presente invenção é, naturalmente, particularmente adequada para a avaliação de riscos, prevenção, diagnóstico e tratamento de um distúrbio que é acompanhado da presença de a-sinucleína, e em especial, aplicáveis para o tratamento da doença de Parkinson (PD), a demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB) e variante do corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD).
[000205] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos na técnica; ver, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Exemplos de adequados transportadores farmacêuticos são bem conhecidas na técnica e incluem soluções salinas de tampão fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. Composições compreendendo esses transportadores podem ser formuladas por conhecidos métodos convencionais. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas ao objeto na dose adequada. A administração das adequadas composições pode ser efetuada por diferentes formas, por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, administração tópica ou intradérmica ou distrubuição espinhal ou cerebral. Formulações em aerossol, tais como formulações de nasal incluem soluções aquosas purificadas ou de outro agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formulações são preferencialmente ajustadas para um pH e estado isotônico compatível com as membranas da mucosa nasal. Formulações para administração retal ou vaginal da podem ser apresentadas como um supositório com um transportador adequado.
[000206] Além disso, enquanto a presente invenção inclui o presente procedimento padrão (embora, felizmente, pouco frequente) de perfuração de um pequeno orifício no crânio para administrar um fármaco da presente invenção, em um aspecto preferido, a molécula de ligação, especialmente de anticorpos ou um fármaco baseada em anticorpos da presente invenção pode atravessar a barreira hemato- encefálica, que permite a administração intravenosa ou oral.
[000207] O regime de dosagem será determinado pelo médico em atendimento e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as doses para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o composto específico a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros fármacos que estão sendo administrados concomitantemente. A dose normal pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 1000 μg (ou de ácido nucleico para a expressão ou inibição da expressão neste intervalo), no entanto, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplar estão previstas, considerando especialmente os fatores já mencionados. Geralmente, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 até 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 até 5 mg/kg (por exemplo,, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc), do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo dosagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1 até 10 mg/kg, de preferência, pelo menos, 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas acima também são consideradas estanto dentro do escopo da invenção. Os objetos podem ser administrados com tais doses diariamente, em dias alternativos, semanalmente ou de acordo com qualquer outro horário determinado pela análise empírica. Um tratamento exemplar envolve a administração de doses múltiplas durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. exemplos de adicionais regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas, ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 até 6 meses. Exemplos de cronogramas de dosagens incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, no caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos intervalos indicados. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. Preparativos para a administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, emulsões e suspensões . Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como azeite, e os ésteres injetáveis orgânicos, tais como oleato de etila. Os transportadores aquosos incluem água, soluções alcoolicas/aquosas, suspensões ou emulsões incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. transportadores intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer), e assim por diante. Aditivos e outros conservantes também podem estar presentes, como por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir adicionais agentes, tais como dopamina ou fármacos psicofarmacológicas, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica.
[000208] Além disso, em uma modalidade preferida da presente invenção a composição farmacêutica pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, se a composição farmacêutica da invenção compreender um anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação, derivados ou suas variantes para a imunização passiva. Como mencionado na seção de fundamentos, as espécies oligoméricas de α- sinucleína foram relatadas extracelularmente no plasma e CSF (El- Agnaf et al., FASEB J. 20 (2006), 419-425) e estudos de imunização passiva em modelos de camundongos com a doença de Parkinson mostraram que os anticorpos monoclonais extracelulares de camundongos contra a-sinucleína podem reduzir a acumulação de agregados intracelulares de a-sinucleína (Masliah et al., Neuron, 46 (2005), 857-868). De acordo com isso é prudente esperar que os anticorpos anti-a-sinucleína humanos e moléculas de ligação de a- sinucleína equivalentes da presente invenção são particularmente úteis como uma vacina para a prevenção ou melhora de doenças sinucleinopáticas doenças tais como PD, DLB e LBVAD.
[000209] Em uma modalidade, pode ser benéfico usar Fab recombinante (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFvs) do anticorpo da presente invenção, que podem mais facilmente penetrar uma membrana celular. Por exemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) 16 de outubro; S1741-0134, publicado em online a seguir, descreve o uso de Fab recombinante quimérico (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFvs) de anticorpo monoclonal WO-2, que reconhece um epítopo na região N-terminal de Aβ. Os fragmentos projetados foram capazes de (i) impedir fibrillização amiloide, (ii) desagregar fibrilas pré- formadas Aβ1 - 42 e (iii) inibir a neurotoxicidade de Aβ1-42 mediada por oligômero in vitro de forma tão eficiente como a molécula de IgG completa. As vantagens percebidas do uso de pequenos Fab e scFv formatos de anticorpos engenheirados que não possuem a função efetora incluem passagem mais eficiente através da barreira hemato- encefálica e minimizam o risco de desencadear reações inflamatórias colaterais. Além disso, além dos scFv e anticorpos de domínio simples manterem a especificidade de ligação de anticorpos completos, eles podem podem ser expressos como genes simples e intracelularmente em células de mamíferos como intracorpos com potencial para alteração da dobradura, interações, modificações ou localização subcelular de seus alvos; ver para revisão , por exemplo, Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.
[000210] Em uma abordagem diferente Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, descrevem uma plataforma de tecnologia, chamada 'Tecnologia de SuperAnticorpo', que permite que os anticorpos sejam empurrados para dentro de células vivas, sem prejudicá-las. Esses anticorpos que penetram células abrem novas janelas terapêuticas e de diagnósticos. O termo "TransMabs" foi designado para estes anticorpos.
[000211] Em uma modalidade adicional, a co-administração ou administração sequencial de outros agentes neuroprotetores úteis para o tratamento de uma doença sinucleinopática pode ser desejável. Em uma modalidade, o agente adicional é compreendido na composição farmacêutica da invenção presente. Exemplos de agentes neuroprotetores, que podem ser usados para tratar um objeto incluem, mas não são limitados a, um inibidor da acetilcolinesterase, um antagonista do receptor glutamatérgico, os inibidores da quinase, inibidores de HDAC, agentes anti-inflamatórios, divalproato de sódio, ou qualquer combinação destes. Exemplos de outros agentes neuroprotetores que podem ser utilizados concomitante com composição farmacêutica da presente invenção são descritos na técnica, ver, por exemplo, pedido internacional WO2007/011907. Em uma modalidade, o agente adicional é a dopamina ou um agonista do receptor de dopamina.
[000212] Em uma modalidade adicional da presente invenção as moléculas de ligação de α-sinucleina, em especial anticorpos da presente invenção também podem ser co-administradas ou administradas antes ou após a terapia de transplante com transplantes neurais ou terapia com células-tronco úteis para o tratamento de uma doença sinucleinopática. Tais abordagens com transplantes de neurônios mesencefálicos embrionários têm sido realizadas em pacientes com doença de Parkinson com o objetivo de substituir os neurônios que são perdidos na doença e para o restabelecimento da neurotransmissão dopaminérgica no estriado. Depois de 11-16 anos após o transplante, descobriu-se que os neurônios enxertados continham os corpos de Lewy e neuritos de Lewy. Esta propagação da patologia de α-sinucleina do hospedeiro para os tecidos vazados pode ser impedida por meio da co-administração de moléculas de ligação de α-sinucleina, em particulares anticorpos da presente invenção.
[000213] Uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a essa quantidade de ingrediente ativo suficiente para melhorar os sintomas ou condição. A eficácia terapêutica e toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou com animais experimentais, como por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e de LD 50 (a dose letal para 50% da população). A relação de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o indice terapêutico, e pode ser expressa como a razão, LD50/ED50. De preferência, o agente terapêutico na composição está presente em quantidade suficiente para restaurar ou preservar um comportamento normal e/ou propriedades cognitivas em caso de PD, DLB ou outras doenças sinucleinopáticas.
[000214] Pelo exposto, é evidente que a presente invenção engloba qualquer uso de uma molécula de ligação de α-sinucleina compreendendo pelo menos um CDR do anticorpo descrito acima, em particular para o diagnóstico e/ou tratamento de uma doença sinucleinopática como mencionado acima, particularmente a doença de Parkinson. Preferencialmente, tal molécula de ligação é um anticorpo da invenção presente ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se aos anticorpos anti- idiotípicos de qualquer um dos anticorpos descritos mencionados acima. Estes são anticorpos ou outras moléculas de ligação que se ligam a única sequência de peptídeo antigênico localizado na região variável de um anticorpo, perto do local de ligação do antígeno, e são úteis, por exemplo,, para a detecção de anticorpos anti-a-sinucleína na amostra de um objeto.
[000215] Em outra modalidade a presente invenção se refere a uma composição de diagnóstico envolvendo qualquer uma das moléculas de ligação de a-sinucleína descritas acima, anticorpos, fragmentos de antígeno de ligação, polinucleotídeos, vetores ou células da invenção e meios adequados para a detecção, opcionalmente, como reagentes convencionalmente usados em métodos de diagnóstico imuológicos ou baseados em ácido nucleico. Os anticorpos da invenção são, por exemplo, adequados para uso em imunoensaios em que eles podem ser utilizados na fase líquida ou ligados em um transportador em fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar o anticorpo da invenção são os imunoensaios competitivos e não-competitivos tanto em um formato direto ou indireto. Exemplos de tais imunoensaios são os radioimunoensaios (RIA), o sanduíche (ensaio imunométrico), citometria de fluxo e ensaios de Western Blot. Os antígenos e anticorpos da invenção podem ser ligados em muitos transportadores diferentes e usados para isolar as células especificamente liagadas nestes. Exemplos bem conhecidos de transportadores incluem vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextran, náilon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetitas. A natureza do transportador pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da invenção. Existem muitos marcadores diferentes e métodos de marcação conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser usados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, os compostos fluorescentes, compostos quimiluminescentes, e compostos bioluminescentes, ver também as incorporações discutida acima no presente documento.
[000216] Por meio de uma modalidade adicional, as moléculas de ligação de α-sinucleina , em especial os anticorpos da presente invenção, também podem ser utilizados em um método para o diagnóstico de um distúrbio em um indivíduo através da obtenção de uma amostra de fluido corporal do indivíduo testado que pode ser uma amostra de sangue, uma amostra linfática ou qualquer outra amostra de fluido do corpo e colocar essa amostra de fluido corporal em contato com um anticorpo da presente invenção sob condições que permitam a formação de complexos antígeno-anticorpo. O nível de tais complexos é então determinado por meio de métodos conhecidos na técnica, um nível significativamente mais elevado do que aquele formado em uma amostra de controle, indicando a doença no indivíduo testado. Da mesma forma, o específico antígeno ligado pelos anticorpos da invenção podem também ser usados. Assim, a presente invenção refere-se a um imunoensaio in vitro que compreende a molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, da invenção.
[000217] Neste contexto, a presente invenção também se refere aos meios especificamente projetados para esta finalidade. Por exemplo, um arranjo baseado em anticorpos pode ser usado, que é carregado com anticorpos ou equivalentes de moléculas de ligação de antígenos da presente invenção que reconhecem especificamente a α-sinucleina. O projeto de microarranjo de imunoensaios é resumido em Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. De acordo com isso, a presente invenção também se relaciona com microarranjos carregados com moléculas de ligação de α-sinucleina identificados de acordo com a presente invenção.
[000218] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um método para diagnosticar uma doença sinucleinopática em um objeto, em que o método compreende: (A) avaliação de um nível de α-sinucleina em uma amostra do objeto a ser diagnosticado com um anticorpo da presente invenção, um fragmento de ligação de α-sinucleina do mesmo, ou uma molécula de ligação de α-sinucleina que tenham substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um destes, e (b) comparação do nível de α-sinucleina com um padrão de referência que indica o nível da α-sinucleina em um ou mais objetos de controle, em que a diferença ou semelhança entre o nível da α- sinucleina e o padrão de referência indica que o objeto tem a doença de Parkinson.
[000219] O objeto a ser diagnosticado pode estar em estado assintomático ou pré-clinico para a doença. De preferência, o objeto de controle tem uma doença sinucleinopática, por exemplo PD, DLB ou LBVAD, em que uma semelhança entre o nível de α-sinucleina e o padrão de referência indica que o objeto a ser diagnosticado tem uma doença sinucleinopática. Como alternativa, ou ainda como um segundo controle o objeto de controle não tem uma doença sinucleinopática, onde a diferença entre o nível de α-sinucleina e o padrão de referência indica que o objeto a ser diagnosticado tem uma doença sinucleinopática. De preferência, o objeto a ser diagnosticado e o objeto de controle (s) são pareados por idade. A amostra a ser analisada pode ser qualquer fluido de corpo com suspeita de conter α-sinucleina, por exemplo, uma amostra de sangue, CSF oude urina.
[000220] O nível de α-sinucleina pode ser avaliado por qualquer método adequado conhecido na técnica compreendendo, por exemplo, a análise de α-sinucleina por uma ou mais técnicas escolhidas dentre Western blot, imunoprecipitação, ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), separação de células com fluorescência ativada (FACS), eletroforese em gel bidimensional, espectroscopia de massa (MS), tempo de vôo-MS de dessorção/ionização à laser assistida por matriz (MALDI-TOF), tempo de vôo de dessorção/ionização por superfície melhorada à laser (Seldi- TOF), cromatografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografia líquida multidimensional (LC), seguido por espectrometria de massa (MS/MS), e densitometria à laser. Preferencialmente, tais gerações de imagens in vivo de α-sinucleina compreende tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia por emissão de fóton único (SPECT), infravermelho próximo (NIR) imagens ópticas ou imagens por ressonância magnética (MRI).
[000221] Métodos para iagnosticar uma doença sinucleinopática como a doença de Parkinson ou a doença do corpo de Lewy, o monitoramento de uma progressão da doença sinucleinopática e monitoramento de um tratamento da doença sinucleinopática utilizando anticorpos e meios relacionados que podem ser adaptados de acordo com a presente invenção também são descritos no pedido internacional WO2007/011907. Da mesma forma, os métodos de detecção de α- sinucleína baseado em anticorpos são descritos nos pedidos internacionais WO99/50300, WO2005/047860, WO2007/021255 e WO2008/103472, cujos conteúdos de divulgação na sua forma integral estão incorporados no presente documento por referência. Esses métodos podem ser aplicados como descritos, mas com um anticorpo específico de α-sinucleina, fragmento de ligação, derivados ou variantes da presente invenção.
[000222] Estas e outras modalidades são divulgadas e abrangidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Adicional literatura sobre qualquer um dos materiais, métodos, usos e compostos a serem empregados em conformidade com a presente invenção podem ser recuperadas de bibliotecas públicas e bancos de dados, usando, por exemplo dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline" pode ser utilizado, que é hospedado pelo Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia e/ou a Biblioteca Nacional de Medicina dos Institutos Nacionais de Saúde. Bases de dados adicionais e endereços da web, como os do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI), que faz parte do European Molecular Biology Laboratory (EMBL) são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e também podem ser obtidos usando as ferramentas de busca na Internet. Uma visão geral de informações sobre patentes em biotecnologia e um levantamento de fontes relevantes de informações sobre patentes úteis para a busca retrospectiva e conhecimento atual é apresentada em Berks, Tibtech 12 (1994), 352-364.
[000223] A divulgação acima geralmente descreve a presente invenção. Salvo declaração em contrário, um termo como aqui utilizado é designado coma definição, tal como prevista no Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado em 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2. Vários documentos são citados ao longo do texto desta especificação. Citações bibliográficas completas podem ser encontradas no final da especificação imediatamente antes das reivindicações. O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo referências bibliográficas, patentes concedidas, pedidos de patente publicados como citados ao longo deste pedido e as especificações do fabricante, instruções, etc) são expressamente incorporadas por referência, no entanto, não há admissão de que qualquer documento citado é de fato do estado da técnica em relação à presente invenção.
[000224] Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência dos seguintes exemplos específicos que são fornecidos neste documento para fins de ilustração somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS
[000225] Os exemplos que seguem ilustram ainda mais a invenção, mas não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da invenção de qualquer maneira. Os seguintes experimentos nos Exemplos 1 e 2 são ilustrados e descritos com relação ao anticorpo NI- 202.3G12, NI-202.12F4 e NI-202.3D8 como clonados, ou seja, contendo mutações induzidas por primers nas partes N-terminais da estrutura 1 Ig das regiões variável e não sendo ajustado à sequências de linhagem germica (GL) de cadeias humanas variáveis pesadas e leves; ver Figura 1. No entanto, os outros anticorpos da série NI-202, em particular aqueles com as sequências GL ajustadas são estruturalmente similares e, portanto, se espera que estes possam fornecer resultados comparáveis. Estes anticorpos foram expressos em moléculas IgG1 humanas. Os seguintes experimentos nos Exemplos 3 e 4 são ilustrados e descritos com relação ao anticorpo NI-202.12F4 com mutações induzidas por primer nas terminações N- das regiões variáveis Ig sendo ajustado à sequências de linhagem gérmica (GL) de cadeias humanas variáveis pesadas e leves; ver Figura 1. Este anticorpo foi expresso como uma molécula quimérica onde os domínios variáveis ajustados humanos foram fundidos com as regiões constante de IgG2a de camundongo para permitir os estudos de dosagem crônica de em modelos de camundongos transgênicos sem induzir uma resposta imunológica anti-humana do camundongo.
Material e métodos
[000226] Descrições detalhadas de métodos convencionais, como as aqui empregadas podem ser encontradas na literatura citada. A menos que indicado de outro modo abaixo, a identificação de células B específicas para a-sinucleína e clonagem molecular de anticorpos de α- sinucleína exibindo especificidade de interesse assim como suas expressões recombinanres e caracterização funcional foram ou podem ser realizadas como descrito na seção de Exemplos e Métodos Suplementares do pedido internacional PCT/EP2008/000053 publicado como WO2008/081008, o conteúdo divulgado do qual é incorporado aqui como referência em sua totalidade.
Purificação de antigínio
[000227] Recombinante His-a-sinucleína foi obtida pela expressão recombinante em Escherichia coli e posterior purificação utilizando precipitação induzida por calor, afinidade com níquel, troca de ânion, e cromatografia de exclusão por tamanho.
[000228] Por exemplo, uma construção de DNA que compreende cDNA que codifica a-sinucleína sob o controle do promotor T7 foi utilizada para transformar uma adequada cepa de Escherichia coli , tais como BL21 (DE3) e expressão de 200 ml de cultura de células foi induzida pela adição de 1mM isopropil e-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). As células foram coletadas após 4 horas de indução a 37°C e então ressuspensas em 20 ml de Tris 50mM, NaCl 150 mM pH 8, seguido de sonificação. Após fervura durante 15 minutos, 17000g do sobrenadante resistente ao calor foram recolhidos. Semelarmente, 17000g de sobrenadante resistente ao calor Escherichia coli mock foi coletado. Depois que 17000g de sobrenadante resistente ao calor (20 ml) de Escherichia coli expressando α-sinuclefna marcada com His foi ajustado para 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8, este foi carregado em uma coluna HisTrap HP 1ml (GE Life Science) e HIS-α- sinucleína foi eluída com um gradiente de imidazol 30-500mm. Frações contendo HIS-α-sinucleina foram reunidas e, em seguida, diluídas 1:10 com 50 mM Tris pH 8. as frações reunidas diluídas foram aplicados em uma coluna de HiTrap Q HP 1ml (GE Life Science) e as proteínas ligadas foram eluídas em um gradiente de 30-1000 mM NaCl. Finalmente, eluatos contendo HIS-a-sinucleína foram purificado ainda mais utilizando filtração em gel de alto desempenho (Superdex 200 10/300 GL). Este processo de purificação rende HIS-a-sinucleína com um grau de pureza de cerca de 99% estimada pelo SDS-PAGE e coloração Coomassie. A concentração de proteína purificada foi determinada através de um ensaio BCA (Pierce).
Varredura de anticorpos de a-sinucleína
[000229] Microplacas com meia área de 96 poços (Corning) foram revestidas com HIS-a-sinucleína purificada ou a-sinucleína (rPeptídeo) em uma concentração padrão de 2μg/ml em revestimento de tampão (PBS pH 9,6) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS- T pH 7,6 e locais de ligação não-específicos foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente com PBS-T contendo BSA 2% (Sigma, Buchs, Switzerland). O meio condicionado com células B foi pré- absorvido por 1 hr em temperatura ambiente com 10% de proteínas de E. coli resistentes ao calor em BSA 1%. Esta etapa de pré-absorção foi desenvolvida depois que várias tentativas anteriores de varredura por ELISA não foram bem sucedidas na identificação de específicos anticorpos de a-sinucleína humana. Assim, felizmente, descobriu-se que a pré-absorção da placa de ELISA com proteínas de E. coli resistentes ao calor exclui a verredura de falsos positivos, tais como anticorpos grudentos e anticorpos direcionados contra contaminações por proteína de E. coli provavelmente presentes em amostras de a- sinucleína purificada recombinante. O meio pré-absorvido foi então transferido das placas de culturas de células B de memória para placas de ELISA e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. As placas de ELISA foram lavadas em PBS-T e então incubadas com anticorpos policlonais IgG anti-humano de burro conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (específico de fragmento FCY). Após a lavagem com PBS-T, a ligação de anticorpos humanos foi determinada pela medição da atividade de HRP em um ensaio colorimétrico padrão.
Clonagem molecular dos anticorpos de α-sinuclein
[000230] As amostras que contêm células de memória B foram obtidas de voluntários > 60 anos de idade. Todos os voluntários tinham em comum a falta de qualquer sinal de parkinsonismo. Células B vivas das culturas de células de memória B selecionadas são colhidas e mRNA é preparado. Sequências de imunoglobulina de cadeia leve e pesada são então obtidas utilizando iniciadores específicos para a estrutura de Ig 1 para todas as famílias humanas de cadeia variável leve e pesada como 5 'iniciadores em combinação com os iniciadores específicos para todos os segmentos J humanos (cadeia pesada e leve kappa) e segmentos C (cadeia leve lambda) como 3' iniciadores (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 1821818230).
[000231] A identificação do clone do anticorpo com a especificidade desejada é realizada pela resseleção de ELISA sobre a expressão recombinante de anticorpos completos. A expressão recombinante anticorpos de IgG1 humano completo ou anticorpos quiméricos IgG2a é alcançada após a inserção das sequências variáveis de cadeia pesada e leve "na estrutura de leitura correta" em vetores de expressão que complementam a sequência de região variável com uma sequência de codificação de um peptídeo líder na extremidade 5' e na extremidade 3' com uma sequência que codifica os apropriados domínios constantes. Para essa finalidade, os iniciadores contidos nos locais de restrição designados para facilitar a clonagem das sequências de cadeia variável pesada e leve em vetores de expressão de anticorpos. As imunoglobulinas de cadeia pesada são expressas através da inserção do produto RT-PCR da cadeia pesada de imunoglobulina na estrutura em um vetor de expressão de cadeia pesada tendo um peptídeo de sinal e os domínios constantes de imunoglobulina humana gama 1 ou imunoglobulina de camundongo gama 2a. imunoglobulina de cadeia leve Kappa é expressa pela inserção do produto RT-PCR da cadeia leve kappa de NI-202.3D8 na estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve proporcionando um peptídeo de snal e o domínio constante da imunoglobulina de cadeia leve kappa humana. As imunoglobulinas de cadeia leve lambda NI-NI-202.12F4 e 202.3G12 são expressas através da inserção do produto RT-PCR da cadeia leve lambda na estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve lambda proporcionando um peptídeo de sinal e o domínio constante da imunoglobulina de cadeia leve lambda humana ou de camundongo.
[000232] Anticorpos monoclonais funcionais recombinantes são obtidos mediante a co-transfecção em células CHO ou HEK293 (ou qualquer outra linhagem celular recipiente apropriada de origem humana ou de camundongo) de um vetor de expressão Ig de cadeia pesada e um vetor de expressão de cadeia leve de Ig kappa ou lambda. O anticorpo monoclonal humano recombinante é posteriormente purificado do meio condicionado usando uma coluna de purificação de proteína A padrão. O anticorpo monoclonal humano recombinante pode produzido em quantidades ilimitadas usando células tanto transitoriamente ou estavelmente transfectadas. A célula revestida produtora de anticorpo monoclonal humano recombinante pode ser estabelecida tanto usando os vetores de expressão de Ig diretamente ou por reclonagem de regiões variável de Ig em diferentes vetores da expressão. Derivados, tais como F (ab), F (ab)2 e scFv também podem ser gerados a partir dessas regiões variáveis de Ig.
Anticorpos
[000233] O anticorpo de sinucleína pan policlonal de coelho (Abcam), anticorpo monoclonal de camundongo específic de LB509 a-sinucleína (Invitrogen), anticorpo Syn211 (Sigma) e Clone 42 (BD Biosciences) foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. Anticorpos humanos recombinantes de α-sinucleina NI202.3G12, NI202.12F4 e NI- 202.3D8 são anticorpos desta invenção. Eles foram expressos em HEK293 ou células CHO e, em seguida, o meio condicionado foi diretamente utilizado em aplicações subsequentes, a menos que seja declarado de forma contrária. Nos exemplos de 3 até 5 os anticorpos recombinantes purificados da presente invenção foram utilizados.
ELISA Direto
[000234] Os antígenos foram revestidos na concentração indicada em PBS pH 9,6 em microplacas de meia área com 96 poços (Corning) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS-T pH 7,6 e locais não-específicos de ligação foram bloqueados por 1 hora em temperatura ambiente com PBS-T contendo BSA 2% (Sigma). As sondas (anticorpos primários) foram então transferidas para poços e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Após lavagem em PBS-T pH 7,6, os poços foram incubados com anticorpos secundários anti-humano policlonal conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (para anticorpos recombinantes humanos), anticoelho (para anticorpo sinucleína pan) ou anti-camundongo (para LB509 ou Syn211 ) por 1 hora em temperatura ambiente. Após a rigorosa lavagem em PBS-T, a ligação das sondas foi determinada pela medição da atividade de HRP em um ensaio padrão colorimétrico usando 3,3 ', 5,5'-tetrametilbifenil-4, 4'-diamina (Sigma) como substrato cromogênico.
Western Blotting e Coloração das proteínas Coomassie
[000235] Para avaliar a ligação com a-sinucleína humana e de camundongo, o cérebro congelado de camundongos do tipo selvagem ou de um tipo transgênico de α-sinuclema foram homogeneizados em PBS (10 ml de peso/g molhado), utilizando um homogeneizador Dounce. O extrato foi centrifugado a 100'000 g e o sobrenadante foi designado uma fração solúvel. A fração solúvel ou proteínas recombinantes (750 ng) foram misturadas com corante de carga, aquecidas a 65°C por 10 min e 0,75 μg foram carregados por fileira e separados em um Tris-Glicina SDS-PAGE de 4 até 20%. Os géis foram tingidos tanto em solução 0,025% Comassie Azul Brilhante R 250 (Fluka) ou eletroblotted em membrana de transferência de nitrocelulose. Os blots foram então incubados com anticorpo primário durante 2 horas. A ligação de anticorpos primários foi revelada usando anticorpos anti- humanos secundários conjugados com HRP. Os blots foram desenvolvidos utilizando ECL mais reagentes de detecção de Western Blotting (GE Healthcare).
[000236] Para avaliar a ligação para monômeros de a-sinucleína e agregados, extractos de cérebro foram preparadas em PBS contendo 0,5% Triton X 100 seguido por centrifugação a 1000 g por 5 min. Os sobrenadantes foram separados por electroforese em gel NuPAGE BisTris 4-12% e analisados por WB.
Teste de Poste
[000237] Os camundongos são testados no início da fase de escura quando eles estão mais ativos. O poste é feito de uma vara madeira com 50 cm de comprimento e 1 cm de largura coberta com pano para facilitar a escalada. A base do poste é colocada na gaiola dos camundongos. O mouse é colocado no topo do poste e um tempo de orientação para baixo o tempo para descer o poste até a gaiola é registrado durante 5 ensaios com intervalos de 30 min entre os testes. O teste de melhor desempenho é analisado.
Teste de labirinto elevado em cruz
[000238] Os camundongos são testados no início da fase de escura quando eles estão mais ativos. Os testes são realizados com pouca luz (40 lux). O labirinto em cruz elevado é composto por dois braços abertos e dois fechados (comprimento do braço: 30 cm; largura: 5 cm). Os braços abertos têm uma pequena borba de 1 cm e os braços fechados estão cercados por uma parede de 15 cm. No início da tarefa, os camundongos são colocados no centro do labirinto em cruz elevado de frente para um braço aberto. Os camundongos são rastreados por video enquanto exploram o labirinto por 5 min. O tempo gasto nos braços abertos e fechados e a distância percorrida são medidos e analisados.
Camundongos transgênicos
[000239] B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J (Giasson et al., Neuron. 34 (2002), 521-533) camundongos de a-sinucleína transgênic e camundongos correspondentes de tipo selvagem foram mantidos em condições de habitação padrão em um um ciclo invertido de 12h: 12h de luz/escuro, com livre acesso à comida e água. Os grupos de tratamento foram equilibrados de acordo com a idade e o sexo.
Determinação dos níveis de NI-202.12F4 e a-sinucleína no plasma do camundongo
[000240] Os níveis do plasma de NI-202.12F4 foram determinados utilizando um ELISA direto para a-sinucleína usando NI-202.12F4 recombinante de concentração conhecida conforme o padrão. Para a determinação de níveis de a-sinucleína humana no plasma um ELISA sanduíche foi aplicado (Invitrogen, EUA).
Exemplo 1: A identificação de anticorpos específicos de a-sinu-cleína humana com especificidades de diferentes epítopos
[000241] a-sinucleína é uma proteína naturalmente desdobrada com 140 aminoácidos (aa) de comprimento que é composta de três domínios. Estes são a região de repetição anfipática N-terminal (10-60 aa), a região central (61-95 aa) e a região C-terminal ácida (96-140). Para entender melhor a especificidade dos anticorpos humanos recombinantes de a-sinucleína, o domínio de a-sinucleína que contém a sequência de reconhecimento foi determinado. Os truncamentos de α-sinucleina 1-60 aa, 1-95 aa, 61-140 aa e 96-140 aa foram revestidos em concentração igual em placas de ELISA e os anticorpos recombinantes humanos de a-sinucleína NI-202.3G12 e 202.12F4 foram testados para a ligação com esses truncamentos.
[000242] Curiosamente, NI-202.3G12 se liga apenas na a-sinucleína completa revestida, mas não em qualquer um dos quatro truncamentos testados (figura 2A). Isto sugere que o epítopo de reconhecimento NI- 202.3G12 é um estrutural motivo ao invéz de uma sequência linear primária de reconhecimento.
[000243] Por outro lado, NI-202.12F4 se liga em fragmentos de α- sinucleína compreendendo aa 1-60 (figura 2B), mas não em fragmentos de truncamentos N-terminais que compreendem aminoácidos 61-140 ou 96-140. Isso mostra que o seu epítopo localizado dentro da terminação N. Notavelmente, a caracterização de anticorpos monoclonais de camundongo que seletivamente se ligam em α- sinucleína em inclusões patológicas, revelaram que os seus epítopos estão dentro do segmento N-terminal (Waxman et al., Acta Neuropathol. 116 (2008), 37-46.
[000244] Além disso, resultados preliminares de ensaios ELISA diretos realizado com anticorpo NI-202.3D8 revelaram que NI-202.3D8 reconhece especificamente o C terminal- de a-sinucleína, em particular, os aminoácidos 96-140. A deleção dos aminoácidos chave 125-140 dentro do domínio C-terminal altera amplamente a agregação de a- sinucleína e os cérebros de pacientes com a doença de demência com corpo de Lewy (LBD) bem como em modelos de animais transgênicos. Existe a abundante acumulação de fragmento de a-sinucleína C- terminal. Estes estudos sugerem que os anticorpos capazes de reconhecer a região C-terminal podem ter potenciais efeitos terapêuticos; ver Masliah et al., Neuron, 46 (2005), 857-868.
[000245] Para excluir que a-sinucleína C-C terminalompreende truncamentos não são eficientemente revestidos em placas ELISA, o mapeamento de epítopos de anticorpo sinucleína alfa monoclonal de camundongo LB509 (Baba et al.,Am. J. Pathol. 152 (1998), 879-884) foi realizado. LB509 se liga em um epítopo C-terminal (Jakes et al., Neuroscience Letters 269 (1999), 13-16). Como mostrado na figura 2C, este estudo confirma que o epítopo C-terminal de LB509 e, portanto confirma o eficiente revestimento dos fragmentos de a-sinucleína C- terminal. Em conclusão, o mapeamento de epítopos de anticorpos recombinantes humanos de a-sinucleína nos experimentos realizados de acordo com a presente invenção mostra que estes anticorpos são direcionados contra diferentes epítopos incluindo epítopos conformacionais e potenciais estruturas patológicas na terminação N e na terminação C.
Exemplo 2: Os anticorpos humanos são específicos para a-sinucleína
[000246] a-, β- e Y-sinucleína são proteínas altamente homólogas que são predominantemente expressadas no sistema nervoso, músculos do esqueleto e coração. No entanto, apenas a a-sinucleína normal é ligada em um amplo espectro de doenças do CNS enquanto que β-sinucleína é sugerida como inibidora de agregação de a-sinucleína e pode proteger o sistema nervoso central dos efeitos neurotóxicos de a-sinucleína. Assim, os anticorpos (terapêuticos) contra variantes patológicos de a- sinucleína preferencialmente não têm reação cruzada com β- e Y- sinucleína. Para dar suporte a uma especificidade e potencial uso terapêutico de anticorpos humanos recombinantes de anti-a-sinucleína, os anticorpos candidatos foram testados para ligação com a-, β- e Y- sinucleína em um ensaio ELISA direto por meio de Western blotting (WB). Primeiro, a-, β- e Y- sinucleína recombinantes foram revestidos em placas de ELISA com uma concentração de revestimento igual (2μg/ml) e foram então diluídos e tanto incubados com um anticorpo de controle de sinucleína pan ou anticorpos recombinantes humanos de α- sinucleína. Os anticorpos de sinucleína pan reagem com todas as três proteínas de sinucleína revestidas em placas de ELISA (Fig 3A). Então os anticorpos recombinantes humanos de α-sinucleina foram testados para a específica ligação com α-sinucleina. Ambos NI-202.3G12 e NI- 202.12F4 reagem com a α-sinuclefna revestida, mas não com β- e Y- sinucleina (Figs. 3A e 3B).
[000247] Similarmente, a especificidade dos anticorpos recombinantes também foi investigada usando a análise de WB. O tingimento de proteinas com Coomassie confirmou que concentrações iguais de todas as três proteinas de sinucleina foram aplicadas na análise SDS PAGE (Fig 4A). A análise de WB mostra então que NI- 202.12F4 se liga seletivamente em α-sinucleina (figura 4B) enquanto que sem os anticorpos primários nenhum sinal foi detectado (figura 4C). NI-202.3G12 ligando-se com α-sinucleina em WB foi detectado. Isto está de acordo com um epitopo estrutural ao invés de uma sequência de reconhecimento linear de NI-202.3G12. Essas descobertas mostraram que os anticorpos de sinucleina recombinantes humanos alfa descritos na presente invenção podem ser altamente especificos.
[000248] Todos os experimentos subsequentes foram realizados com o anticorpo quimérico de camundongo NI-202.12F4.
Exemplo 3: Especificidade de ligação de NI-202.12F4 A ligação específica com a-sinucleína humano com uma preferência por espécies agregadas de a-sinucleína
[000249] Para avaliar a ligação de NI-202.12F4 com a α-sinucleina humana e de camundongo, extratos de cérebro foram preparados a partir de camundongos do tipo selvagem e camundongos transgênicos de a-sinucleína A53T e a ligação de anticorpos foi analisada por meio de Western blotting. NI-202.12F4 detecta a faixa proeminente que corresponde a a-sinucleína em extratos cerebrais de camundongos transgênicos α-sinucleina A53T humanos enquanto tais faixas são virtualmente ausentes em extratos cerebrais de camundongos do tipo selvagem (Figura 5 A), sugerindo a ligação especifica com α-sinucleina de humano, mas não com o de camundongo. Resultados semelhantes foram obtidos com o anticorpo LB509 comercialmente disponivel (Jakes et al., Neuroscience Letters 269 (1999), 13-16) direcionado contra um epítopo específico para α-sinucleina humana. Em contraste, o anticorpo comercialmente disponivel clone 42 (van der Putten et al., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029) que foi relatado que se liga em α-sinucleina de ambas as espécies, detectou a proteína α-sinucleina humana bem como a de camundongo. Estes dados sugerem que NI-202.12F4 se liga preferencialmente em α-sinucleina humana.
[000250] Para avaliara a ligação de NI-202.12F4 em forma fisiológicas bem como agregados patológicos de α-sinucleina humana, extratos corticais do cérebro de um objeto de controle saudável e um paciente com demência de corpos de Lewy (DLB) como também de extratos cérebro de de camundongo do tipo selvagem e cérebros de camundongos transgênicos α-sinucleina A30P humana (Kahle et al. J. Neurosci. 20 (2000), 6365-73) foram preparados, separados por eletroforese em gel SDS e analisadas por meio de Western blotting. NI- 202.12F4 detecta com alta sensibilidade um proeminente nódoa refletindo formas oligoméricas e fibrilares de agregados α-sinucleina em DLB e extrato cerebral transgênico A30P α-sinucleina, mas não em extratos de controles saudáveis e do tipo selvagem (Figura 5 B). Em contraste a ligação mínima foi observada para forma monomérica de α- sinucleina em tecidos humanos ou de camundongos do tipo selvagem e ligação moderada em extratos cerebrais transgênicos A30P α- sinucleína superexpressando altamente a proteína α-sinucleina. Em contraste, o anticorpo clone 42 mostrou um padrão de ligação oposto na análise de Western blot, detectando forma monomérica e fragmentos de α-sinucleina com uma alta sensibilidade e pobre ligação com espécies de α-sinucleina agregadas. Estes resultados mostram que NI- 202.12F4 preferencialmente se ligam em agregados patológicos de α- sinucleína tais como os oligômeros e fibrilas sobre monômeros de α- sinucleina fisiológicos.
NI-202.12F4 se liga à alfa-sinucleína humana selvagem e seus mutantes causadores de doença com alta afinidade
[000251] A metade da concentração efetiva máxima (EC50) foi determinada para mutantes da α-sinucleina humana causadores de doença assim como para a versão selvagem usando ELISA de α- sinucleina direto. A ligação de alta afinidade foi observada para a forma selvagem assim como para as formas mutantes A30P, E46K e A53T da α-sinucleina humana (Figura 6).
NI-202.12F4 recombinante se liga preferencialmente às formas patológicas de a-sinucleína no cérebro.
[000252] A ligação de NI-202.12F4 a α-sinucleina foi adicionalmente caracterizada por marcação imunoistoquímica de cortes cerebrais de camundongos transgênicos para a-sinucleína e pacientes com doença de Parkinson confirmada neuropatologicamente ou demência com corpos de Lewy. O NI-202.12F4 mostra marcação proeminente da patologia da a-sinucleína incluindo corpo de Lewy e inclusão semelhante a neurito de Lewy assim como pequenos acúmulos somatodendríticos e sinápticos de a-sinucleína em cortes flutuantes livres de camundongos transgênicos expressando a-sinucleína A30P (Figura 7 B) ou A53T (Figura 7 A) humana assim como em tecidos de cérebro humano de doença de Parkinson e demência com corpos de Lewy (Figura C, D). Em contraste com o anticorpo Syn211 comercialmente disponível (Giasson et al., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528-33) que também detecta a a-sinucleína sináptica fisiológica com uma alta sensibilidade (Figura 7 E), o NI-202.12F4 se liga preferencialmente a agregados patológicos de a-sinucleína como exemplificado por marcação imunoistoquímica de camundongos transgênicos para a-sinucleína A30P humana (Figura 7 B). A ligação de NI-202.12F4 está virtualmente ausente de corte de cérebro de camundongos selvagens (Figura 7 F) comparável à marcação do controle com apenas anticorpo secundário (Figura 7 G) confirmando a ligação preferencial à a-sinucleína humana contra a de camundongo como foi observado na análise de Western blot (Figura 5). Em contraste, o anticorpo clone 42 comercialmente disponível (van der Putten et al., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029) que foi relatado por se ligar a a- sinucleína humana assim como a de origem de camundongo, mostrou proeminente marcação sináptica da proteína a-sinucleína de camundongo em cortes de cérebro de camundongos selvagens (Figura 7 H).
NI-202.12F4 mostra ligação preferencial à a-sinucleína humana em altas concentrações de revestimento apontando para um epítopo conformacional
[000253] A metade da concentração efetiva máxima (EC50) indicando a potência de um anticorpo foi determinada para baixas e altas concentrações de revestimento da a-sinucleína recombinante usando um ELISA de a-sinucleína direto. A ligação de alta afinidade de NI- 202.12F4 recombinante com um EC50 de ~100 pM foi observada para altas densidade de revestimento da proteína a-sinucleína (20 μg/mL). Em concentrações de revestimento mais baixas, uma acentuada queda foi observada na afinidade, com um aumento correspondente no EC50 próximo a 100 vezes (Figura 8 A). Em contraste, o anticorpo comercialmente disponível Syn211 (Giasson et al., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528-33), direcionado contra um epítopo linear na extremidade C-terminal da a-sinucleína, não exibiu diminuição na afinidade de ligação em densidade de revestimento mais baixas de alfa-sinucleína (Figura 8 B). Essas descobertas sugerem que NI-202.12F4 se direciona preferencialmente a um epítopo estrutural da a-sinucleína, que é formado em altas concentrações de a-sinucleína. Os resultados são consistentes com as características de ligação imunoistoquímica de NI- 202.12F4, o que sugere uma preferência por conformações patológicas de agregados de a-sinucleína, como fibrilas ou oligômeros de a- sinucleína. Como foi observado para a a-sinucleína completa, a ligação de NI-202.12F4 a 1-60 de a-sinucleína truncada mostra uma dependência equivalente da concentração de revestimento apontando para um epítopo conformacional que está contido nos aminoácidos 160 da proteína a-sinucleína (Figura 8 C). Entretanto, não se pode excluir o fato dos aminoácidos 60-140 da a-sinucleína poderem influenciar a formação do epítopo N-terminal. Notadamente, os aminoácidos 1-60 N- terminais da a-sinucleína humana contendo a mutação A53T são 100% idênticos à extremidade N-terminal da a-sinucleína de camundongo. Assim, a preferência observada pela a-sinucleína humana contra o ortólogo de camundongo poderia ser devido a uma influência da parte C-terminal da sinucleína sobre à acessibilidade ou formação do epítopo preferido de NI-202.12F4 na extremidade N-terminal. Estudos de mapeamento de epítopos usando fragmentos derivados N- terminalmente menores de a-sinucleína (aminoácidos 1-20; 21-40; 4160; 11-30; 31-50) não revelaram a ligação do anticorpo NI-202.12F4 a quaisquer dos peptídeos, sugerindo que essas regiões não são suficiente para a ligação de NI-202.12F4 (Figura 8 D).
Exemplo 4: Anticorpo humano-derivado recombinante contra alfa-sinucleína melhora o desempenho motor e comportamento no labirinto em cruz elevado em um modelo de camundongo transgênico da doença de Parkinson
[000254] Para avaliar os efeitos farmacológicos do tratamento com NI- 202.12F4, camundongos transgênicos de 10,5 meses de idade superexpressando o transgene de sinucleína de α-sinucleina A53T humana (Giasson et al., Neuron 34 (2002), 521-533) foram tratados semanalmente intraperitoneal com 5 mg/kg de anticorpo NI-202.12F4 quimérico recombinante ou controle de veículo por um total de 4 meses. Após 2 meses de tratamento, o desempenho motor foi avaliado no teste de poste. Camundongos tratados com NI-202.12F4 exibiram uma melhora significativa no desempenho motor em comparação com o grupo tratado com veículo com diminuição significativa do tempo para subir no poste (Tturn; p<0,001; n=17-19 animais por grupo) assim como o tempo total para descer para a gaiola de residência (Ttotal; p<0,05; n=17-19 animais por grupo) como mostrado na Figura 9. Em um segundo teste de comportamento os efeitos do tratamento sobre o desempenho no labirinto em cruz elevado foi analisado. Camundongos transgênicos com α-sinucleina A53T foram previamente relatados por exibir comportamento no labirinto em cruz elevado insuficiente, gastando mais tempo para abrir os braços em comparação com controles selvagens (George et al., Exp. Neurol., 210 (2008), 788-92). Como mostrado na Figura 10, o tratamento crônico com NI-202.12F4 leva a uma melhora significativa no comportamento no labirinto em cruz elevado em animais transgênicos com α-sinucleina A53T. Camundongos tratados com anticorpo gastam significativamente menos tempo e cobrem uma distância significativamente menor de braços abertos em comparação com animais tratados com veiculo (p<0,05; n=17-19 animais por grupo) enquanto os niveis de atividade foram equivalentes para ambos os grupos. Esses resultados demonstram que o tratamento crônico com o anticorpo NI-202.12F4 leva a melhorias significativas do desempenho motor e recupera o comportamento no labirinto em cruz elevado anormal em modelos de camundongo transgênico com α-sinucleina da doença de Parkinson.
Exemplo 5: Anticorpo NI-202.12F4 aumenta os níveis de sinucleína no plasma em modelos de camundongo transgênico com sinucleína da doença de Parkinson
[000255] Camundongos transgênicos com α-sinucleina A53T transgênica de 10,5 meses de idade foram tratados semanalmente intraperitoneal por 2 meses com 5 mg/kg de NI-202.12F4 quimérico ou PBS. Vinte e quatro horas após a última injeção, amostras do plasma foram preparadas e as concentrações no plasma do anticorpo de tratamento e α-sinucleina humana foram determinados por ELISA (Figura 11). Os níveis no plasma da a-sinucleína humana foram significativamente aumentados em mais de 10 vezes em comparação com animais tratados com veículo (25 ± 4,1 ng/mL para o grupo de tratamento com NI-202.12F4 X 1,9±1,2 ng/mL para o grupo de PBS, p = 0,0002) demonstrando a modulação farmacodinâmica da α-sinuclema no tratamento com NI-202.12F4. Efeitos similares foram observados no tratamento com anticorpo agudo nos camundongos transgênicos com α-sinuclema A30P. Como nos modelos transgênicos de α-sinuclema A53T e A30P a α-sinuclema humana é predominantemente expressa no cérebro, o aumento de α-sinuclema humana circulante poderia ocorrer devido a um efluxo de rede mediado por NI-202.12F4 da α-sinuclema do cérebro para a periferia.

Claims (15)

1. Anticorpo monoclonal humano anti-a-sinucleína ou um fragmento de ligação a a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende em sua região variável um VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 31-35 da SEQ ID NO: 9, um VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 50-68 da SEQ ID NO: 9, um VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 101-102 da SEQ ID NO: 9, um VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 23-33 da SEQ ID NO: 12, um VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de resíduos 49-55 da SEQ ID NO: 12, e um VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 88-98 da SEQ ID NO: 12.
2. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
3. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
4. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humano e uma região constante de cadeia leve lambda humana.
5. Método para preparar um anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação anti-a-sinucleína do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar uma célula que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo anti-a-sinucleína ou o fragmento de ligação anti- a-sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e (b) isolar o referido anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação anti-a-sinucleína do mesmo a partir da cultura.
6. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é (i) marcado de forma detectável, em que o marcador detectável é selecionado do grupo que consiste em uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado; ou (ii) ligado a um medicamento.
7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a-sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, , em que a composição é (i) uma composição farmacêutica compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável; ou (ii) uma composição de diagnóstico compreendendo ainda um ou mais reagentes de diagnóstico imunológicos ou à base de ácido nucleico.
8. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano, em que a doença sinucleinopática é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), a variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV AD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), insuficiência autonômica pura (PAF), neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo -1 (NBIA-1), doença de Alzheimer, doença de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de início juvenil (doença de Hallervorden-Spatz), esclerose lateral amiotrófica, lesão cerebral traumática e síndrome de Down.
9. Anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, para uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença sinucleinopática é a doença de Parkinson.
10. Método in vitro para diagnosticar ou monitorar a progressão de uma doença sinucleinopática em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) avaliação de um nível de a-sinucleína em uma amostra do indivíduo a ser diagnosticado com o anticorpo anti-a-sinucleína ou o fragmento de ligação a a-sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6; e (b) comparar o nível da a-sinucleína com um padrão de referência que indica o nível da a-sinucleína em um ou mais indivíduos controle, em que uma diferença ou similaridade entre o nível de a- sinucleína e o padrão de referência indica que o sujeito tem uma doença sinucleinopática, em que a doença sinucleinopática é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD) demência com corpos de Lewy (DLB), a variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV AD), atrofia de sistemas múltiplos (MSA), insuficiência autonômica pura (PAF), neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo-1 (NBIA-1), doença de Alzheimer , Doença de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de início juvenil (doença de Hallervorden-Spatz), esclerose lateral amiotrófica, lesão cerebral traumática e síndrome de Down.
11. Kit para o diagnóstico de uma doença sinucleinopática, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação a-sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, com reagentes e/ou instruções de uso.
12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-a-sinucleína ou fragmento de ligação de a-sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, ligado a um agente terapêutico ou de diagnóstico para uso na detecção in vivo de a-sinucleína, ou direcionamento de um agente terapêutico e/ou agente de diagnóstico para a-sinucleína no corpo humano ou animal, em que a-sinucleína é detectada por tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia por emissão de fóton único (SPECT), imagem óptica de infravermelho próximo (NIR), imagem por ressonância magnética (MRI ), ou uma combinação dos mesmos.
13. Uso de um anticorpo ou um fragmento de ligação a a- sinucleína do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença sinucleinopática em um indivíduo humano, em que a doença sinucleinopática é selecionada do grupo consistindo em doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinon (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), a variante de corpo de Lewy da doença de Alzheimer (LBVAD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), falha autonômica simples (PAF), neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo 1 (NBIA-I), doença de Alzheimer, doença de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de início juvenil (doença de Hallervorden- Spatz), esclerose lateral amiotrófica, lesão traumática do cérebro e síndrome de Down.
14. Método in vitro para monitorar a progressão de uma doença sinucleinopática ou uma resposta a um tratamento de doença sinucleinopática em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contato de uma amostra biológica com o anticorpo anti- α-sinucleina ou fragmento de ligação a α-sinucleina do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6; e (b) detecção do anticorpo ou fragmento de ligação a α- sinucleina do mesmo, em que a doença sinucleinopática é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Parkinson (PD), doença de Parkinson, demência (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB), a variante de corpos de Lewy da doença de Alzheimer (LBV AD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), insuficiência autonômica pura (PAF), neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo-1 (NBIA-1), doença de Alzheimer, doença de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (Hallervorden -Spatz doença), esclerose lateral amiotrófica, lesão cerebral traumática e sindrome de Down.
15. Uso de um anticorpo anti-α-sinucleina ou um fragmento de ligação a α-sinucleina do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6, ligado a um agente terapêutico ou diagnóstico, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a detecção in vivo de ou direcionamento de um agente terapêutico ou diagnóstico à α-sinucleina no corpo humano ou animal, em que a α-sinucleina é detectada por tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia de emissão de fóton único (SPECT), imagem ótica de infravermelho próximo (NIR) ou imagem de ressonância magnética (MRI).
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