BRPI0923572B1 - Enzima tioesterase modificada que converte um substrato acil-acp c10, c12 ou c14 em um derivado de ácido graxo, polinucleotídeo codificando a tioesterase modificada, vetor de expressão, célula hospedeira de microrganismo e método de fabricação de composição de derivado de ácido graxo c10, c12 ou c14 - Google Patents

Enzima tioesterase modificada que converte um substrato acil-acp c10, c12 ou c14 em um derivado de ácido graxo, polinucleotídeo codificando a tioesterase modificada, vetor de expressão, célula hospedeira de microrganismo e método de fabricação de composição de derivado de ácido graxo c10, c12 ou c14 Download PDF

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Abstract

enzima tioesterase modificada que converte um substrato acil-acp c10, c12 ou c14 em um derivado de ácido graxo, polinucleotídeo codificando a tioesterase modificada, vetor de expressão, célula hospedeira de microorganismo e método de fabricação de composição de derivado de ácido graxo c10, c12 ou c14 a presente invenção se refere a enzimas inéditas de tioesterase mutante e equivalentes destas que ocorrem na natureza, composições feitas a partir de tais enzimas e usos das enzimas tioesterase. em particular, a presente invenção provê enzimas tioesterase mutantes que apresentam propriedades alteradas, por exemplo, especificidade de substrato alterada, atividade alterada, seletividade alterada, e/ou produtividade proporcional alterada nas misturas de produto. a presente invenção também provê polinucleotídeos codificando tais enzimas tioesterase mutantes, e vetores e células hospedeiras contendo tais polinucleotídeos. a invenção adicionalmente provê usos inéditos de tioesterases na produção de vários derivados de ácido graxo, que são úteis como, ou como componentes de compostos químicos industriais e combustíveis.

Description

ENZIMA TIOESTERASE MODIFICADA QUE CONVERTE UM SUBSTRATO ACILACP C10, C12 OU C14 EM UM DERIVADO DE ÁCIDO GRAXO, POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO A TIOESTERASE MODIFICADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICROORGANISMO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE COMPOSIÇÃO DE DERIVADO DE ÁCIDO GRAXO C10, C12 OU C14
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Esse pedido reivindica o benefício da U.S. Provisional Application No. 61/140.600, depositada em 23 de dezembro de 2008, o conteúdo na íntegra do qual está aqui incorporado por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a composições de tioesterase inéditas, células hospedeiras inéditas contendo tioesterases, métodos inéditos de produção de derivados de ácido graxo, e derivados de ácido graxo produzidos por este método e usos do mesmo. Um aspecto particular da presente invenção se refere à produção de químicos e combustíveis industriais.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Desenvolvimentos em tecnologia têm sido acompanhados por um aumento na confiança em combustíveis e químicos industriais de fonte petroquímica. Tais fontes de combustível vêm se tornando cada vez mais limitada e difícil de adquirir. Com a queima de combustíveis fósseis acontecendo a uma taxa nunca antes obtida, é provável que a demanda mundial de combustível e químicos derivados de petroquímicos irá em breve superar os suprimentos
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2/360 atuais.
Como resultado, esforços vêm sido direcionados para a busca de fontes de energia renovável, tais como luz solar, água, vento e biomassa. O uso de biomassa para produzir novas fontes de combustível e químicos que não são derivados de fontes de petróleo (ex., biocombustível) surgiu como uma opção alternativa.
O biocombustível é biodegradável, combustível de combustão de queima limpa que pode ser constituído de alcanos e/ou ésteres. Um biocombustível exemplar é o biodiesel. O biodiesel pode ser utilizado na maioria dos motores a diesel de combustão interna tanto na forma pura, que é referido como biodiesel limpo, ou como uma mistura em qualquer concentração como diesel de petróleo comum ou outros biodieseis.
O biodiesel oferece um número de propriedades benéficas comparado ao diesel baseado em petróleo, incluindo redução de emissão (ex. , monóxido de carbono, enxofre, hidrocarbonos aromáticos, partículas de fuligem, etc.) durante a combustão. O biodiesel também mantém um ciclo de dióxido de carbono balanceado devido ao fato de ser baseado em materiais biológicos renováveis. O biodiesel é tipicamente completamente biodegradável, e apresenta um bom perfil de segurança devido a seu alto ponto de inflamação e baixa inflamabilidade relativos. Além disso, o biodiesel provê boas propriedades de lubrificação, com isso reduzindo o desgaste dos motores.
Métodos atuais de produção de biodiesel envolvem a transesterificação de triacilglicerídeos de matéria-prima de
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3/360 óleo vegetal, tais como de colza na Europa, de soja na América do Norte e de óleo de palma no sudeste da Ásia. A produção de biodiesel em escala industrial é então geograficamente e sazonalmente restrita a áreas onde matérias-primas de óleo vegetal são produzidas. O processo de transesterificação leva a uma mistura de ésteres graxos que podem ser utilizados como biodiesel, porém também a um subproduto indesejado, a glicerina. Para serem utilizáveis como biodiesel, os ésteres graxos devem ser adicionalmente purificados a partir do produto heterogêneo. Isso aumenta os custos e a quantidade de energia requerida para a produção de éster graxo e, finalmente, pra a produção do biodiesel também. Além disso, matérias-primas de óleo vegetal são fontes ineficientes de energia devido ao fato delas requererem espaço extensivo para cultivo.
Por exemplo, a produtividade do biodiesel de colza é somente 1300 L/hectare devido ao fato de somente o óleo da semente ser utilizado para a produção do biodiesel, e não o restante da biomassa de colza. Adicionalmente, o cultivo de algumas matérias primas de óleo vegetal, tais como colza e soja, requer a frequente rotação de culturas para prevenir a depressão de nutriente do solo.
PCT Publication No. WO 2007/136762 revela microorganismos recombinantes que são capazes de sintetizar produtos derivados a partir da via sintética de ácido graxo, incluindo, inter alia, ésteres de ácido graxo e álcoois graxos. Em particular, certos derivados de ácido graxo são descritos como apresentando comprimento de cadeia de carbono, níveis de ramificação e saturação definidos. A publicação '762 descreve células recombinantes que utilizam super-expressão endógena ou expressão heteróloga de proteínas tioesterase na produção de derivados de
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4/360 ácido graxo.
PCT Publication No. WO 2008/119082 revela células e microorganismos geneticamente engenheirados que produzem produtos a partir da via biossintética de ácido graxo, incluindo, 5 inter alia, ésteres de ácido graxo e álcoois graxos. A publicação '082 descreve células recombinantes que utilizam a superexpressão de enzimas acil-CoA sintetase para produzir mais eficientemente derivados de ácido graxo.
U.S. Patent No. 5.955.329 revela proteínas acil-ACP tioesterase de planta geneticamente engenheiradas apresentando especificidade de substrato alterada. Em particular, a patente '329 revela a produção de tioesterases acil-ACP de planta engenheiradas, caracterizada pelo fato das tioesterases acilACP de planta engenheiradas demonstrarem especificidade de 15 substrato alterada no que diz respeito aos substratos acil-ACP hidrolisados pelas tioesterases de planta se comparado à tioesterase acil-ACP nativa.
Enquanto a arte precedente revela certas revelações úteis no que diz respeito à produção de certos derivados de ácido 20 graxo, uma necessidade existe no campo para métodos e processos melhorados para produção mais econômica e eficiente de tais derivados de ácido graxo, e também para tecnologia facilitadora da produção de composições que apresentam especificações de produto alteradas. Como um exemplo específico, uma necessidade 25 para a produção de composições de ácido graxo apresentando especificações e propriedades pré-desenhadas ou ajustadas para aplicações particulares tais como combustíveis, detergentes, lubrificantes, molécula precursora industrial e outras
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5/360 aplicações valiosas de derivados de ácido graxo.
RESUMO DA INVENÇÃO
É um objeto da presente invenção a provisão de enzimas tioesterase úteis mutante e que ocorrem na natureza, polinucleotídeos codificando essas enzimas, vetores contendo os polinucleotídeos codificando as enzimas tioesterase úteis, células hospedeiras recombinantes contendo enzimas tioesterases mutadas endógenas, células hospedeiras recombinantes transformadas com os vetores, células hospedeiras recombinantes 10 apresentando polinucleotídeos codificando enzimas tioesterases integrados nos cromossomos destas, tioesterases produzidas pela célula hospedeira, composições de derivados de ácido graxo (tais como químicos e biocombustíveis industriais) produzidas in vitro e/ou ín vivo, métodos para produção de composições de derivados 15 de ácido graxo in vitro e/ou in vivo, e métodos de utilização das composições de derivados de ácido graxo produzidas.
É um objeto da presente invenção a provisão de métodos de produção de composições de derivados de ácido graxo através de fermentações microbianas que apresentam um perfil de produto 20 pré-determinado no que diz respeito a comprimento de cadeias de carbono e produtividades proporcionais. Essas composições são bem apropriadas para aplicações nas indústrias de combustível e químicos devido ao fato das suas propriedades pode ser ajustadas para as aplicações particulares para as quais elas são 25 destinadas. Por exemplo, é possível ajustar um produto de éster graxo, de acordo com os métodos descritos aqui, de modo que ele pode ser utilizado como um combustível automotivo, e/ou desenhar uma composição que apresente, por exemplo, características de
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6/360 combustível melhoradas tais como ponto de turvação, lubricidade, número de cetano, viscosidade cinemática, número de ácido, ponto de ebulição, estabilidade oxidativa, ponto de entupimento de filtro a frio, perfil de impureza, nível de cinza sulfatada e/ou ponto de inflamação. Similarmente, é possível produzir químicos industriais de acordo com os métodos descritos aqui que podem substituir químicos atuais que têm como fonte o petróleo, e que são ajustados para aplicações particulares, por exemplo, para a produção de álcoois graxos que são ajustados de maneira ideal 10 para utilização como surfactantes e/ou detergentes.
É um objeto da invenção a provisão de métodos alternativos de produção de ésteres graxos sem a presença de (ou na ausência de) uma éster sintase. Esse método é energeticamente mais favorável que os métodos até agora revelados para produção de 15 composições de éster graxo através de processos de fermentação microbiana, o qual requeria pelo menos tanto uma enzima tioesterase quanto uma enzima éster sintase. Desse modo, as tioesterases inéditas da invenção provêm vantagens adicionais.
Em uma concretização da invenção, tioesterases mutantes (ou equivalentes destas que ocorrem na natureza) são providas que derivam de uma tioesterase precursora, caracterizado pelo fato de cada um dos mutantes (ou os equivalentes que ocorrem na natureza) apresentam pelo menos uma propriedade alterada in vitro e/ou in vivo, quando comparada às propriedades da 25 tioesterase precursora. A propriedade alterada pode ser, por exemplo, uma propriedade biofísica tais como estabilidade térmica (ponto de derretimento Tm); solvente, soluto, e/ou estabilidade oxidativa; lipofilicidade; hidrofilicidade;
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7/360 estrutura quaternária; momento dipolo; e/ou ponto isoelétrico. A propriedade alterada pode também ser, por exemplo, uma propriedade bioquímica tais como pH ideal, temperatura ideal, e/ou força iônica ideal. A propriedade alterada pode ser adicionalmente, por exemplo, um parâmetro de enzima catalítica tal como distribuição de produto (incluindo, por exemplo, uma porcentagem ou produtividade proporcional maior ou menor para um produto particular X outros produtos na mistura de produto), atividade específica, preferência de substrato, afinidade de substrato, inibição de substrato, afinidade de produto, taxa de renovação ou taxa catalítica, inibição de produto, mecanismo de cinética, Km, kcat, kcat/Km, e/ou VMax. A propriedade alterada pode adicionalmente ser, por exemplo, um aumento ou um decréscimo em atividade ou uma preferência alterada para alcólise X hidrólise, substratos de proteína carreadora acil-CoA X acil-acil, substratos éster X tioéster, substratos saturados X insaturados, substrato de cadeia simples X ramificada; alterações nas posições de insaturações, variações de números de cetano, ou comprimentos de cadeia de carbono específica, substratos ramificados, posição de ramificação, substratos hidróxi-acil, substratos ceto-acil; e/ou produtos com uma variação alterada de números de cetano específicos, taxa de octanagem, estabilidade oxidativa, lubricidade, ponto de inflamação, viscosidade, ponto de ebulição, ponto de derretimento, ponto de vazamento, ponto de turvação, ponto de entupimento de filtro a frio, característica de fluxo a frio, aromaticidade, e/ou número de iodo. Propriedades alteradas podem também incluir, por exemplo, um decréscimo na atividade ou uma atenuação de hidrólise de éster, de modo que a hidrólise de moléculas de produto desejado é reduzida ou
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8/360 eliminada. Propriedades alteradas podem adicionalmente incluir, por exemplo, um decréscimo na toxicidade da proteína à célula e/ou uma alteração no nível de expressão da proteína na célula, quando comparado à toxicidade da proteína precursora à e/ou nível 5 de expressão na mesma célula. Em uma concretização exemplar, uma propriedade alterada pode incluir uma alteração na habilidade de catalisação da síntese de derivados de acil graxo diretamente ou indiretamente in vivo ou in vitro. Em outra concretização exemplar, uma propriedade alterada é o melhoramento ou aumento 10 da produtividade ou produtividade proporcional ín vitro e/ou ín vivo de um derivado de ácido graxo particularmente desejado.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou um equivalente deste que ocorre na natureza) é derivada a partir de uma tioesterase precursora. Em uma concretização 15 particular da invenção, a tioesterase precursora é uma tioesterase que ocorre na natureza, uma tioesterase previamente modificada, ou uma tioesterase sintética.
Em uma concretização da invenção, a tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é derivada a partir 20 de um precursor que é uma tioesterase que ocorre na natureza. A tioesterase precursora que ocorre na natureza pode ser obtida a partir, por exemplo, de uma fonte vegetal, animal, bacteriana, fúngica, de levedura ou outra fonte microbiana. A tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) pode 25 ser derivada a partir de uma tioesterase precursora de Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas, Alcanivorax, Aliivibrio, Alkalilimnicola, Alteromonadales, Alteromonas, Aurantimonas, Azoarcus, Azorhizobium, Azotobacter, Beggiatoa, Beijerinckia,
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Bordetella, Bradyrhizobium,
Cellvibrio, Chromobacterium,
Cupriavidus, Dechloromonas,
Enterobacter, Erwinia, Esche
Burkholderia, Caulobacter,
Citrobacter, Comamonas,
Delftia, Desulfovibrio, íchia, Geobacter, Hahella,
Halorhodospira, Herminiimonas, Idiomarina, Janthinobacterium, Klebsiella, Leptospira, Leptothrix, Limnobacter, Magnetospirillum, Marinobacter, Marinomonas, Methylibium, Methylobacillus, Methylobacterium, Methylocella, Methylococcus, Moritella, Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Oceanospirillum, Oligotropha, Pectobacterium, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Proteus,
Providencia, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychromonas, Ralstonia, Reinekea, Rhodobacterales, Rhodoferax, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Saccharophagus, Salmonella, Serratia, Shewanella, Shigella, Stenotrophomonas, Streptococcus, Thauera, Thioalkalivibrio, Thiobacillus, Vibrio,
Xanthomonas, ou Yersinia.
Em uma concretização particular, a tioesterase precursora da invenção pode ser derivada a partir de qualquer uma dentre Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1, Acidovorax sp. JS42, Acinetobacter baumannii ACICU, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Aeromonas hydrophila subsp. Hydrophila ATCC 7966, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449, Alcanivorax borkumensis SK2, Alcanivorax sp. DG881, Aliivibrio salmonicida LFI1238, Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1, alpha proteobacterium HTCC2255, Alteromonadales bacterium TW-7, Alteromonas macleodii deep ecotype, Aurantimonas sp. SI85-9A1, Azoarcus sp. BH72, Azorhizobium caulinodans ORS 571, Azotobacter vinelandii AvOP, Beggiatoa sp. PS, Beijerinckia indica subsp. indica ATCC
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9039, Bordetella avium 197N, Bordetella bronchiseptica RB50, Bordetella parapertussis 12822, Bordetella pertussis Tohama I, Bordetella petrii DSM 12804, Bradyrhizobium sp. BTAi1, Bradyrhizobium sp. ORS278, Burkholderia ambifaria AMMD, Burkholderia ambifaria IOP40-10, Burkholderia ambifaria MC40-6, Burkholderia ambifaria MEX-5, Burkholderia cenocepacia AU 1054, Burkholderia cenocepacia HI2424, Burkholderia cenocepacia J2315, Burkholderia cenocepacia MC0-3, Burkholderia cenocepacia PC184, Burkholderia dolosa AUO158, Burkholderia graminis C4D1M, Burkholderia mallei ATCC 23344, Burkholderia mallei GB8 horse 4, Burkholderia mallei NCTC 10229, Burkholderia multivorans ATCC 17616, Burkholderia oklahomensis C6786, Burkholderia oklahomensis
EO147, Burkholderia phymatum STM815, Burkholderia pseudomallei
1106a,
Burkholderia pseudomallei
1106b,
Burkholderia pseudomallei
14, Burkholderia pseudomallei
1655,
Burkholderia pseudomallei
1710b, Burkholderia pseudomallei 305
Burkholderia pseudomallei
406e, Burkholderia pseudomallei
668,
Burkholderia pseudomallei 7894, Burkholderia pseudomallei
K96243, Burkholderia pseudomallei NCTC 13177, Burkholderia sp.
383, Burkholderia thailandensis Bt4, Burkholderia thailandensis
E264,
Burkholderia thailandensis
MSMB43,
Burkholderia thailandensis TXDOH, Burkholderia ubonensis Bu,
Burkholderia vietnamiensis G4, Caulobacter crescentus CB15, Cellvibrio japonicus Ueda107, Chromobacterium violaceum
ATCC 12472,
Chromohalobacter salexigens DSM
3043,
Citrobacter koseri ATCC
BAA-895, Comamonas testosteroni
KF-1,
Cupriavidus taiwanensis,
Dechloromonas aromatica RCB,
Delftia acidovorans SPH-1
Desulfovibrio desulfuricans subsp.
desulfuricans str.
G20
Desulfovibrio desulfuricans subsp.
desulfuricans str.
G20
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Enterobacter cancerogenus ATCC 35316, Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894, Enterobacter sp. 638, Erwinia tasmaniensis, Escherichia albertii TW07627, Escherichia coli O157:H7 EDL933, Escherichia coli O157:H7 str.EC4024, Escherichia coli O157:H7 str. EC4196, gamma proteobacterium HTCC5015, gamma proteobacterium KT 71, Geobacter sp. M21, Hahella chejuensis KCTC 2396, Halorhodospira halophila SL1, Herminiimonas arsenicoxydans, Idiomarina baltica OS145, Idiomarina loihiensis L2TR, Janthinobacterium sp. Marseille, Klebsiella pneumoniae 342, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Klebsiella sp. ZD414, Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130, Leptospira interrogans serovar Lai str. 56601, Leptothrix cholodnii SP-6, Limnobacter sp. MED105, Magnetospirillum magneticum AMB-1, marine gamma proteobacterium HTCC2080, marine gamma proteobacterium HTCC2143, marine gamma proteobacterium HTCC2207, marine metagenome, Marinobacter algicola DG893, Marinobacter aquaeolei VT8, Marinobacter sp. ELB17, Marinomonas sp. MWYL1, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylobacillus flagellatus KT, Methylobacterium chloromethanicum CM4, Methylobacterium extorquens PA1, Methylobacterium populi BJ001, Methylocella silvestris BL2, Methylococcus capsulatus str. Bath, Moritella sp. PE36, Nitrobacter sp. Nb-311A, Nitrobacter winogradskyi Nb-255, Nitrococcus mobilis Nb-231, Nitrosococcus oceani ATCC 19707, Nitrosococcus oceani C-27,Nitrosomonas europaea ATCC 19718, Nitrosomonas eutropha C91, Nitrosospira multiformis ATCC 25196, Oceanospirillum sp. MED92, Oligotropha carboxidovorans OM5, Pectobacterium atrosepticum SCRI1043, Photobacterium profundum 3TCK, Photobacterium profundum SS9, Photobacterium sp. SKA34,
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Figure BRPI0923572B1_D0002
Figure BRPI0923572B1_D0003
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Figure BRPI0923572B1_D0005
Figure BRPI0923572B1_D0006
Photorhabdus luminescens, Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1, Polaromonas naphthalenivorans CJ2, Polaromonas sp. JS666, Polynucleobacter sp. QLW-P1DMWA-1, Proteus mirabilis HI4320, Providencia stuartii ATCC 25827, Pseudoalteromonas atlantica T6c, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125, Pseudoalteromonas sp. 643A, Pseudoalteromonas tunicata D2, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa PACS2,
Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas fluorescens Pf0-1,
Pseudomonas fluorescens Pf-5, Pseudomonas mendocina ymp, Pseudomonas putida F1, Pseudomonas putida GB-1, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida W619, Pseudomonas stutzeri A1501, Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola 1448A, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000, Psychromonas ingrahamii 37, Ralstonia eutropha H16, Ralstonia eutropha JMP134, Ralstonia metallidurans CH34, Ralstonia pickettii 12D, Ralstonia pickettii 12J, Ralstonia solanacearum GMI1000, Ralstonia solanacearum IPO1609, Ralstonia solanacearum MolK2, Ralstonia solanacearum UW551, Reinekea sp. MED297, Rhodobacterales bacterium Y4I, Rhodoferax ferrireducens T118, Rhodopseudomonas palustris BisA53, Rhodopseudomonas palustris BisB18, Rhodopseudomonas palustris BisB5, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Rhodopseudomonas palustris HaA2, Rhodopseudomonas palustris TIE-1, Rhodospirillum centenum SW, Saccharophagus degradans 2-40, Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62:z4,z23:--, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67, Salmonella enterica subsp. enterica serovar allinarum str. 287/91, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Hadar str.
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RI_05P066, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Javiana str. GA_MM04042433, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul str. SARA23, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul str. SARA29, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18, Salmonella typhimurium LT2, Serratia proteamaculans 568, Shewanella amazonensis SB2B, Shewanella baltica OS155, Shewanella baltica OS185, Shewanella baltica OS195, Shewanella baltica OS223, Shewanella benthica
KT99, Shewanella denitrificans OS217, Shewanella frigidimarina NCIMB 400, Shewanella halifaxensis HAW-EB4, Shewanella loihica PV-4, Shewanella oneidensis MR-1, Shewanella pealeana ATCC 700345, Shewanella putrefaciens 200, Shewanella sediminis HAWEB3, Shewanella sp. ANA-3, Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi ATCC 51908, Shigella boydii Sb227, Shigella dysenteriae Sd197, Stenotrophomonas maltophilia K279a, Stenotrophomonas maltophilia R551-3, Streptococcus sp. (N1), synthetic construct, Thauera sp. MZ1T, Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7, Thiobacillus denitrificans ATCC25259, Thiomicrospira crunogena XCL-2, Vibrio alginolyticus 12G01, Vibrio angustum S14, Vibrio campbellii AND4, Vibrio cholerae 2740-80, Vibrio cholerae MZO-2, Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961, Vibrio cholerae V51, Vibrio fischeri ES114, Vibrio fischeri MJ11, Vibrio harveyi ATCC BAA1116, Vibrio mimicus,Vibrionales bacterium SWAT-3, Vibrio parahaemolyticus AQ3810, Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633,
Vibrio shilonii AK1, Vibrio splendidus 12B01, Vibrio sp. MED222,
Vibrio vulnificus CMCP6, Vibrio vulnificus YJ016, Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306, Xanthomonas campestris pv.
campestris str.ATCC 33913, Xanthomonas campestris pv. campestris
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14/360 str. B100, Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria str. 85-10, Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331, Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A, Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256, Yersinia bercovieri ATCC 43970, Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081,Yersinia frederiksenii ATCC 33641, Yersinia intermedia ATCC 29909,Yersinia mollaretii ATCC 43969, Yersinia pestis Angola, Yersinia pestis biovar Orientalis str. F1991016, Yersinia pestis CO92, Yersinia pestis KIM ou Yersinia pseudotuberculosis IP 31758.
Em uma concretização da invenção, a tioesterase precursora é uma tioesterase que apresenta uma sequência análoga àquela de 'TesA (ex., uma enzima TesA sem o peptídeo sinal). Em uma concretização preferencial, a tioesterase precursora apresenta pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência a 'TesA. Em ainda outro exemplo, a tioesterase precursora apresenta pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a uma 'TesA que é obtida a partir de uma E. coli., tal como uma E.coli K12. Em um exemplo adicional, a tioesterase precursora é uma tioesterase que apresenta uma sequência análoga à sequência de
SEQ ID NO:31, e preferencialmente pelo menos por volta de 20%,
por exemplo, pelo menos por volta de 2 5%, 30%, 35%, 40%, 45%,
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID
NO:31. A sequência análoga pode ser a partir de uma proteína que
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15/360 ocorre na natureza ou pode ser proveniente de uma proteína previamente modificada.
Em uma concretização da invenção, a tioesterase precursora é uma tioesterase que contém a cadeia de aminoácidos:
G-D-S-L-X(5)-M (SEQ ID NO:28), caracterizado pelo fato de:
o X se referir a qualquer resíduo de aminoácido; o número em parêntese adjacente a ele, quando presente, se referir ao número de resíduos X na porção de resíduos de aminoácidos;
o resíduo S na posição 3 ser um resíduo catalítico;
o resíduo D na posição 2 poder ser substituído por N ouT;
o resíduo L na posição 4 poder ser substituído por C ouQ;
o resíduo M na posição 10 poder ser substituído por C,D,
L, N, T, ou V;
e/ou
V-X(2)-G-X-N-D-X-L (SEQ ID NO:29), caracterizado pelo fato de:
cada X se referir a qualquer resíduo de aminoácido; o número em parêntese adjacente a ele, quando presente, se referir ao número de resíduos X na porção de resíduos de aminoácidos;
o resíduo N na posição 6 estar no buraco do oxiânion;
o resíduo V na posição 1 poder ser substituído por L;
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16/360 o resíduo N na posição 6 poder ser substituído por V, L, C,
A, G, H, I, T, ou W;
o resíduo D na posição 7 poder ser substituído por E;
o resíduo L na posição 9 poder ser substituído por I, W, F, T, M, A, E, N, ou V;
e/ou
D-X(2)-H-P-X(7)-I (SEQ ID NO:30), caracterizado pelo fato de:
cada X se referir a qualquer resíduo de aminoácido; cada número em parêntese adjacente a ele, quando presente, se referir ao número de resíduos X na porção respectiva de resíduos de aminoácidos;
os resíduos D e H nas posições 1 e 4 respectivamente serem os resíduos catalíticos;
o resíduo P na posição 5 poder ser substituído por G, A, F, L, S, ou V;
o resíduo I na posição 13 poder ser substituído por L ou V.
Em uma concretização da invenção, a tioesterase precursora é uma tioesterase apresentando reatividade imunológica cruzada com uma 'TesA obtida a partir de uma E. coli. Em uma concretização particular, a tioesterase precursora apresenta reatividade imunológica cruzada com a 'TesA obtida a partir de uma E. coli K-12. Em uma concretização particular, a tioesterase precursora apresenta reatividade imunológica cruzada com uma
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17/360 tioesterase contendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31. Em uma concretização particular, a tioesterase precursora apresenta reatividade cruzada com fragmento (ou porções) de qualquer uma das tioesterases obtidas a partir de uma E. coli, ou a partir de uma E. coli K-12, e/ou de qualquer uma das tioesterases que contém a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A enzima precursora apresentando reatividade imunológica cruzada com 'TesA pode ser uma proteína que ocorre na natureza, uma proteína previamente modificada, ou uma proteína sintética.
Em outro exemplo particular, a tioesterase precursora é uma 'TesA proveniente de uma E. coli, ou é um homólogo, um parálogo ou um ortólogo de uma 'TesA proveniente de uma E. coli, tal como uma 'TesA proveniente de uma E.coli K12. O precursor da tioesterase do qual um mutante da presente invenção é derivado pode também ser uma porção enzimaticamente ativa ou um fragmento de qualquer uma das tioesterases previamente descritas.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida que contém uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos uma substituição de um aminoácido, quando comparado a uma tioesterase precursora, de modo que a tioesterase mutante apresenta pelo menos uma propriedade alterada em relação à tioesterase precursora. Em uma concretização exemplar da invenção, uma tioesterase mutante é provida que apresenta uma sequência de aminoácidos com uma mutação de substituição única, e exibe pelo menos uma propriedade alterada quando comparada à tioesterase precursora da qual o mutante é derivado. Em uma concretização exemplar da invenção, uma tioesterase mutante é
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18/360 provida que contém uma sequência de aminoácido apresentando duas ou mais mutações de substituição a partir da sequência da sua tioesterase precursora, e a tioesterase mutante apresenta pelo menos uma propriedade alterada quando comparada à tioesterase precursora.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é uma variante de uma tioesterase precursora, e que apresenta pelo menos uma propriedade alterada in vitro ou in vivo em 10 relação a tal tioesterase precursora, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser uma tioesterase que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31 e, de acordo, contém resíduos de aminoácidos correspondendo a resíduos de aminoácidos 1-182 de
SEQ ID NO:31, e caracterizado pelo fato da tioesterase precursora 15 ser modificada em uma ou mais posições de aminoácidos selecionados a partir de posições correspondendo a um ou mais resíduos 1-182 de SEQ ID NO:31.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que 20 é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31 e, de acordo, contém resíduos de aminoácidos correspondentes 1-182 de SEQ ID NO:31, e que apresenta pelo menos uma propriedade alterada in vitro ou in vivo em relação a tal tioesterase precursora, caracterizado pelo 25 fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições correspondendo a uma ou mais posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31 selecionadas dentre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
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29, 30, 31 , 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44
45, 46, 47 , 48 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60
61, 62, 63 , 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76
77, 78, 79 , 80 , 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 , 91, 92
5 93, 94, 95 , 96 , 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106
107, 108 , 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119
120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132
133, 134 , 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145
146, 147 , 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159
10 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172
173, 174 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, e/ou 182.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente que ocorre na natureza) é provida, que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência 15 análoga a SEQ ID NO:31 e, de acordo, contém resíduos de aminoácido correspondentes 1-182 de SEQ ID NO:31, e que apresenta pelo menos uma propriedade alterada in vitro ou in vivo em relação a tal tioesterase precursora, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada com uma ou mais substituições 20 selecionada dentre A1C, A1F, A1L, A1Q, A1R, A1S, A1V, A1Y, D2E,
D2H, D2K, D2L, D2M, D2P, D2R, D2W, T3E, T3G, T3K, T3L, T3R, T3W
L4A, L4G, L4M, L4N, L4S, L4V, L4Y, L5C, L5E, L5F, L5G, L5H, L5K
L5N, L5Q, L5S, L5W, L5Y, I6A, I6L, I6T, I6V, L7A, L7C, L7E, L7K
L7M, L7N, L7S, L7T, L7V, L7W, L7Y, G8A, G8K, G8S, D9N, D9T, S10C
25 L11A, L11C, L11I, L11M, L11Q, L11V, S12A, S12I, S12L, S12M, S12N
S12T, S12V, S12Y, A13C, A13D, A13G, A13H, A13I, A13L, A13N, A13S
A13T, A13V, A13W, A13Y, G14A, G14C, G14E, G14F, G14I, G14K, G14M
G14N, G14P, G14Q, G14R, G14S, G14T, G14V, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E
Y15G, Y15I, Y15L, Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16A, R16D
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R16E, R16G, R16H, R16I, R16L, R16M, R16N, R16P, R16Q, R16S, R16T
R16V, R16W, M17A, M17C, M17D, M17E, M17G, M17K, M17L, M17N, M17P
M17Q, M17R, M17S, M17T, M17V, S18E, S18M, S18N, S18T, A19C, A19E
A19L, A19V, S20A, S20C, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21G, A21I
5 A21L, A21P, A21Y, A22C, A22D, A22E, A22F, A22G, A22H, A22I, A22K
A22L, A22M, A22N, A22P, A22R, A22S, A22T, A22Y, W2 3A, W23H, W23N
W23P, W23Y, P24A, P24C, P24D, P24E, P24F, P24G, P24I, P24M, P24N
P24S, P24T, P24V, P24W, A25D, A2 5E, A2 5L, A2 5N, A25P, A25Q, A2 5R
A2 5S, A2 5V, L26C, L26D, L26E, L26F, L26G, L26H, L26I, L26K, L2 6N
10 L26P, L26Q, L26R, L26S, L2 6V, L26W, L26Y, L27A, L27C, L27F, L27H
L27M, L27R, L27S, L27T, L27V, L27W, L27Y, N2 8A, N28G, N28I, N28K
N2 8M, N28P, N28R, N28W, D2 9M, D29P, D2 9V, K30P, W31D, W31E, W31G
W31L, W31N, W31P, W31R, W31S, W31T, Q32V, Q32Y, S33F, S33G, S33I
S33M, S33R, K34A, K34H, K34M, K34R, T35F, T35G, , T35K, , T35L, T35M
15 T35Q, T35V, T35Y , S36A , S36F, S36H, S36I, ; S36L, S36W, V37A.
V37F, V37G, V37H, V37L, V37N, V37S, V37Q, V37S, V37W, V37Y, V38D
V38E, V38F, V38G, V38K, V38L, V38P, V38R, V38S, N3 9A, N39C, N39E
N39F, N39G, N39K, N39M, N39P, N39Q, N39R, N39T, N39V, N39W, N39Y
A40D, A40G, A40H, A40L, A4 0M, A40P, A40T, A4 0V, A40Y, S41C, S41P
20 S41T, I42A, I42C, I42D, I42E, I42G, I42K, I42L, I42M, I42P, I42S
I42T, I42W, I42Y, S4 3A, S43C, S43D, S43E, S43F, S43G, S43H, S43L
S43M, S43N, S43P, S43R, S43T, S43V, S43W, G44A, G44C, G44E, G44F
G44H, G44K, G44L, G44M, G44N, G44Q, G44R, G44S, G44W, G44Y, D4 5A
D45C, D45E, D45F, D45G, D45H, D45I, D45K, D45L, D45M, D45P, D45Q
25 D45S, D45T, D45V, D45W, T4 6A, T46C, T46D, T46E, T46F, T46G, T46I
T46K, T46L, T46N, T46R, T46S, T46V, T46W, S47A, S47C, S47E, S47F
S47G, S47L, S47M, S47P, S47Q, S47R, S47T, S47V, S47W, S47Y, Q48C
Q48D, Q48E, Q48F, Q48G, Q48I, Q48M, Q48S, Q48T, Q48V, Q48W, Q48Y
Q4 9A, Q49C, Q49D, Q49E, Q49G, Q49H, Q49I, Q49K, Q49L, Q4 9M, Q49P
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Q49R, Q49S, Q4 9V, Q49W, Q49Y, G50A, G50C, G50E, G50F, G50I, G50K
G50L, G50M, G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50W, G50Y, L51A
L51C, L51D, L51F, L51H, L51N, L51P, L51S, L51T, L51V, L51W, L51Y
A52C, A52D, A52H, A52I, A52L, A52M, A52P, A52R, A52V, A52W, A52Y
5 R53A, R53C, R53D, R53E, R53F, R53G, R53I, R53K, R53L, R53N, R53S
R53T, R53V, R53W, R53Y, L54A, L54C, L54E, L54F, L54G, L54M, L54N
L54S, L54T, L54W, L54Y, P55A, P55G, P55Y, A56P, A5 6R, A5 6W, A5 6Y
L57A, L57C, L57F, L57G, L57H, L57I, L57K, L57N, L57P, L57Q, L57R
L57S, L57T, L57V, L57W, L57Y, L58A, L58D, L58E, L58F, L58G, L58H
10 L58I, L58M, L58N, L58R, L58S, L58V, L58W, L58Y, K59E, K59R, K59V
Q60E, Q60M, Q60P, H61A, H61D, H61E, H61G, H61P, H61W, Q62G, Q62M
Q62P, Q62W, P63D, P63E, P63G, P63I, P63K, P63L, P63M, P63N, P63Q
P63R, P63S, P63T, P63V, P63W, R64D, R64E, R64F, R64L, R64M, R64P
R64Q, R64W, R64Y, W65A, W65E, W65G, W65K, W65L, W65M, W65N, W65P
15 W65R, W65V, V66C, V66G, V66I, V66M, V66N, V66Q, V66S, V66W, V66Y.
L67A, L67C, L67E, L67G, L67M, L67Q, L67Q, L67S, L67T, L67W, V68A
V68E, V68G, V68L, V68M, V68N, V68P, V68Q, V68S, V68T, E69A, E69C
E69D, E69F, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69P, E69Q, E69S
E69V, E69W, E69Y, L7 0A, L70C, L70E, L70F, L70G, L70H, L70I, L70K
20 L70Q, L70S, L70T, L70V, L70W, G71A, G71C, G71S, G72A, G72C, G72M
G72P, G72S, N7 3A, N73C, N73G, N73H, N73I, N73L, N73P, N73R, N73S
N73T, N73V, N73W, D74A, D74C, D74E, D74F, D74G, D74Q, D74S, D74W
D74Y, G7 5A, G75C, G75D, G75E, G75F, G75I, G75K, G75L, G75M, G75N
G75P, G75R, G75T, G75V, G75W, G75Y, L7 6A, L76C, L76D, L76E, L76F
25 L76G, L76I, L76K, L7 6M, L76N, L76P, L76Q, L76R, L76T, L7 6V, L7 6W
R77A, R77C, R77D, R77E, R77F, R77G, R77H, R77K, R77L, R77N, R77Q
R77S, R77V, R77W, G7 8A, G78C, G78D, G78E, G78F, G78M, G78N, G78P
G78Q, G78R, G78S, G78T, G78V, G78Y, F7 9A, F79D, F79E, F79G, F7 9H
F79K, F7 9M, F79N, F79P, F79Q, F79S, F7 9V, F79W, F79Y, Q8 0A, Q80E
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Q80G, Q80L, Q80M, Q80S, Q80W, Q80Y, P81A, P81E, P81K, P81L, P81M
P81N, P81T, P81W, P81Y, Q82A, Q82F, Q82I, Q82M, Q82N, Q82P, Q82R
Q82S, Q82T, Q82V, Q82W, Q82Y, Q83A, Q83C, Q83F, Q83G, Q83K, Q83L
Q83M, Q83N, Q83R, Q83S, Q83T, Q83V, Q83W, Q83Y, T84A, T84D, T84E
T84F, T84G, T84H, T84K, T84L, T84M, T84N, T84Q, T84R, T84S, T84V
T84W, T84Y, E8 5A, E85C, E85D, E85F, E85G, E85L, E85P, E85Q, E85R
E85S, E85T, E85V, E85W, E85Y, Q8 6A, Q86G, Q86H, Q86K, Q86P, Q86T
Q8 6V, Q86W, Q86Y, T87A, T87C, T87D, T87E, T87F, T87G, T87H, T87L
T87M, T87P, T87R, T87S, T87V, T87W, L88A, L88C, L88E, L88F, L88G
L88H, L88Q, L88S, L88W, L88Y, R8 9A, R89G, R89H, R89L, R89P, R89T
R8 9V, R89W, Q90E, Q90L, Q90N, Q90P, Q90W, Q90Y, I91E, I91G, I91L
I91M, I91N, I91Q, I91S, I91V, I91Y, L92A, L92C, L92E, L92G, L92H
L92N, L92Q, L92R, L92S, L92T, L92V, L92Y, Q93A, Q93E, Q93F, Q93G
Q93H, Q93I, Q93L, Q93M, Q93N, Q93P, Q93S, Q93V, Q93W, Q93Y, D94C
D94E, D94F, D94G, D94H, D94K, D94L, D94N, D94P, D94Q, D94R, D94S
D94V, V95A, V95C, V95D, V95E, V95F, V95G, V95I, V95L, V95M, V95N
V95P, V95Q, V95T, V95W, V95Y, K9 6A, K96C, K96L, K96N, K96P, K96Q
K96R, K96V, K96Y, A97C, A97E, A97F, A97K, A97N, A97P, A97R, A97V
A97W, A98E, A98G, A98K, A98L, A98P, A98V, A98W, A98Y, N99A, N99C
N99D, N99G, N99L , N99M, N99P, N99Q, N99R, N99S, N99W, N99Y
A100D, A100E, A100G, A100H, A100I, A100K, A100L, A100M, A100Q
A100R, A100S, A100T, A100V, A100W, A100Y, E101A, E101D, E101G
E101L, E101M, E101P, E101S, E101T, E101V, P102E, P102F, P102G
P102H, P102I, P102L, P102Q, P102R, P102S, P102V, P102W, P102Y
L103A, L103C, L103E, L103G, L103I, L103K, L103N, L103Q, L103R
L103S, L103T, L103V, L103W, L104A, L104C, L104E, L104G, L104I
L104N, L104P, L104Q, L104S, L104W, L104Y, M105A, M105C, M105E
M105F, M105G, M105I, M105K, M105L, M105P, M105T, M105V, M105W
Q10 6A, Q106C, Q106D, Q106G, Q106H, Q106K, Q106L, Q106M, Q106R
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Q106S, Q106T, Q106V, Q106W, Q106Y, I107A, I107C, I107E, I107F
I107G, I107K, I107L, I107M, I107Q, I107S, I107T, I107V, I107Y
R108A, R108C, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L
R108M, R108S, R108V, R108W, R108Y, L109A, L109C, L109D, L109E
5 L109F, L109G, L109K, L109M, L109P, L109Q, L109R, L109S, L109T
L109V, L109Y, P110A, P110C, P110D, P110E, P110F, P110G, P110H
P110K, P110L, P110M, P110N, P110R, P110S, P110V, P110W, A111C
A111E, A111L, A111M, A111N, A111P, A111Q, A111R, A111S, A111V
A111W, A111Y, N112A, N112F, N112G, N112I, N112K, N112L, N112P
10 N112R, N112V, N112W, N112Y, Y113A, Y113C, Y113D, Y113E, Y113G
Y113I, Y113M, Y113P, Y113Q, Y113S, Y113S, Y113W, G114A, G114F
G114K, G114L, G114M, G114P, G114W, G114Y, R115A, R115C, R115E
R115G, R115I, R115N, R115P, R115Q, R115S, R115V, R115W, R115Y
R116C, R116D, R116E, R116H, R116T, R116V, R116W, Y117A, Y117C
15 Y117D, Y117E, Y117G, Y117H, Y117I, Y117L, Y117M, Y117N, Y117P
Y117Q, Y117R, Y117S, Y117T, Y117V, Y117W, N118A, N118C, N118E
N118F, N118G, N118H, N118I, N118K, N118L, N118M, N118P, N118Q
N118S, N118T, N118V, N118W, E119C, E119D, E119F, E119G, E119K
E119L, E119M, E119P, E119Q, E119R, E119T, E119W, E119Y, A120D
20 A120E, A120G, A120I, A120L, A120P, A120T, A120W, F121A, F121C
F121D, F121E, F121G, F121K, F121L, F121M, F121N, F121P, F121Q
F121R, F121S, F121V, F121W, F121Y, S122A, S122C, S122D, S122E
S122F, S122G, S122I, S122L, S122M, S122P, S122R, S122V, S122W
S122Y, A123C, A123E, A123F, A123H, A123L, A123R, A123T, A123V
25 A123W, A123Y, I124A, I124C, I124D, I124E, I124G, I124H, I124K
I124L, I124R, I124S, I124T, I124W, I124Y, Y125C, Y125F, Y125G
Y125H, Y125I, Y125L, Y125P, Y125Q, Y125R, Y125S, Y125T, Y125V
Y125W, P126C, P126F, P126H, P126K, P126R, P126T, P126V, P126Y
K127A, K127I, K127P, K127S, L128A, L128C, L128E, L128F, L128G
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L128Q, L128R, L128S, L128T, L128V, L128W, A129D, A129F, A129H
A129I, A129K, A129L, A129N, A129W, A129Y, K130E, K130I, K130P
K130V, E131A, E131C, E131D, E131F, E131G, E131I, E131K, E131L
E131N, E131P, E131V, E131W, F132C, F132D, F132E, F132K, F132L
5 F132N, F132P, F132T, F132V, D133C, D133K, D133R, D133S, D133T
D133V, D133Y, V134C, V134D, V134E, V134I, V134K, V134M, V134N
V134P, V134Q, V134R, V134S, V134W, V134Y, P135A, P135E, P135K
P135Q, L136A, L136C, L136D, L136E, L136F, L136G, L136H, L136K
L136M, L136N, L136P, L136Q, L136R, L136S, L136T, L137A, L137C
10 L137D, L137E, L137G, L137H, L137K, L137P, L137Q, L137R, L137S
L137Y, P138E, P138F, P138G, P138N, P138R, P138T, P138V, F13 9A
F139C, F139D, F139E, F139G, F139H, F139L, F139M, F139N, F139S
F139T, F139V, F139W, F140A, F140C, F140G, F140I, F140L, F14 0M
F140N, F140P, F140S, F140T, F140V, F140W, M141A, M141C, M141D
15 M141E, M141F, M141G, M141K, M141L, M141P, M141Q, M141R, M141T
M141V, M141W, M141Y, E142A, E142C, E142G, E142I, E142L, E142M
E142N, E142P, E142Q, E142R, E142S, E142T, E142V, E142W, E142Y
E143A, E143D, E143F, E143G, E143I, E143M, E143P, E143W, V14 4A
V144D, V144E, V144G, V144H, V144N, V144P, V144Q, V144R, V144S
20 V144W, V144Y, Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I, Y145L
Y145M, Y145N, Y145Q, Y145R, Y145S, Y145T, Y145W, L146A, L146C
L146D, L146E, L146G, L146H, L146P, L146S, L146W, K147G, K147P
K147R, K147W, P148D, P148E, P148W, Q149L, W150C, W150D, W150E
W150G, W150L, W150P, W150Q, W150R, W150T, M150V, M151A, M151C
25 M151D, M151E, M151F, M151G, M151I, M151L, M151Q, M151R, M151S
M151T, M151V, M151W, Q152A, Q152D, Q152E, Q152F, Q152H, Q152I
Q152K, Q152L, Q152N, Q152P, Q152R, Q152S, Q152T, Q152V, Q152Y
D153A, D153E, D153F, D153I, D153K, D153M, D153P, D153Q, D153V
D153W, D154A, D154C, D154E, D154F, D154G, D154H, D154I, D154K
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D154L, D154M, D154N, D154P, D154R, D154S, D154T, D154V, D154W
G155A, G155F, G155H, G155I, G155P, G155V, G155W, G155Y, I156A
I156C, I156E, I156F, I156G, I156K, I156L, I156M, I156Q, I156R
I156S, I156T, I156V, I156Y, H157C, H157E, P158A, P158F, P158G
5 P158H, P158I, P158L, P158Q, P158S, P158T, P158V, P158W, N159C
N159E, N159G, N159I, N159K, N159L, N159M, N159P, N159Q, N159R
N159T, N159V, N159W, R160A, R160C, R160D, R160E, R160G, R160H
R160I, R160K, R160N, R160Q, R160S, R160W, D161E, D161G, D161I
D161K, D161L, D161M, D161N, D161Q, D161R, D161S, D161V, D161W
10 A162G, A162I, A162K, A162L, A162N, A162R, A162T, A162V, A162Y
Q163A, Q163C, Q163D, Q163E, Q163F, Q163G, Q163I, Q163L, Q163M
Q163S, Q163T, Q163V, Q163W, Q163Y, P164A, P164C, P164D, P164K
P164L, P164M, P164N, P164R, P164T, P164V, P164W, F165D, F165E
F165G, F165H, F165I, F165K, F165L, F165M, F165R, F165S, F165T
15 F165V, F165W, F165Y, I166A, I166C, I166F, I166L, I166M, I166S
I166V, I166Y, A167C, A167D, A167E, A167F, A167G, A167K, A167L
A167M, A167N, A167Q, A167R, A167T, A167V, A167W, A167Y, D168A
D168G, D168H, D168L, D168M, D168P, D168R, D168T, D168V, D168W
W169A, W169D, W169E, W169G, W169K, W169M, W169Q, W169R, W169S
20 W169T, W169V, M170A, M170E, M170F, M170G, M170H, M170L, M170N
M170Q, M170S, M170T, M170V, M170W, M170Y, A171E, A171F, A171I
A171S, A171V, A171W, K172A, K172M, K172P, Q173D, Q173I, Q173N
Q173P, Q173W, Q173Y, L174A, L174F, L174G, L174Q, L174S, L174T
L174W, L174W, L174Y, Q175F, Q175I, Q175L, Q175M, Q175Y, P176D
25 P176H, P176K, P176L, P176N, P176Q, P176R, P176V, P176W, P176Y
L177D, L177F, L177G, L177M, L177S, L177T, V178A, V178F, V178G
V178K, V178L, V178R, V178S, V178T, V178W, N179G, N179H, N179R
N179T, N179V, N179W, N179Y, H180A, H180E, H180G, H180L, H180P
H180R, H180S, H180V, H180W, D181A, D181C, D181E, D181G, D181H
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D181I, D181L, D181P, D181Q, D181R, D181S, D181T, D181W, S182A, S182C, S182D, S182E, S182G, S182I, S182K, S182L, S182N, S182P, S182Q, S182R, S182T, e/ou S180V, caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) com respeito a substratos C10 (i.e., substratos, as cadeias de carbono das quais são de 10 carbonos de comprimento), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a um ou mais resíduos selecionados dentre 5-30, 35-60, 65-98, 102139, e/ou 140-180 de SEQ ID NO:31. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade com respeito a substratos C10 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre naturalmente) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) com respeito a substratos C10, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em um ou mais
posições de aminoácidos correspondendo a um ou mais resíduos de
SEQ ID NO:31 selecionados dentre 1, 3, 4, 7, 9, 12, 13, 14, 16,
17, 20, 22, 24, 25, 28, 32, 38, 39, 40, 42, 43, 46, 47, 48, 49,
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50, 51, 52, 54 , 56, 59, 60, 64, 68 , 72, 75, 76, 77, 78 , 79, 80,
81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 89, 90 , 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,
113, 114, 115, 116, 117, 118 , 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,
126, 127, 128, 130, 132, 133 , 134, 138, 139, 140, 141, 142, 144,
145, 146, 147, 148, 150, 151 , 152, 156, 158, 159, 160, 161, 162,
163, 164, 165, 166, 167, 168 , 169, 170, 171, 172, 173, 175, 176,
177, 178, 179, 180, 181, e/o u 182. A especificida de de subst rato
aumentada para, e/ou atividade com respeito a substratos C10 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade (ex., taxa catalítica) com respeito a substratos C10, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada com uma ou mais substituições
selecionadas dentre A1L, A1S, T3K, L4A, L7M, L7V, D9N, S12A
A13D, G14A, G14E, G14P, G14Q, G14R, G14S, G14V, R16G, R16L, R16M
R16N, R16P, R16Q, R16T, M17C, M17L, M17T, M17V, S20A, S20C, S20D
S20G, S20L, S20T, S20W, A22C, A22D, A22E, A22G, A22H, A22I, A22K
A22N, P24A, P24C, P24D, P24F, P24I, P24S, P24T, P24V, P24W, A25E
A2 5L, A25N, A25Q, A25V, N28A, N28R, Q32V, Q32Y, V38E, V38K, V38R
N39A, N39T, A40D, A40H, I42A, I42E, I42L, I42S, I42T, I42W, I42Y
S43A, S43C, S43D, S43E, S43L, S43N, S43P, T46E, T46F, T46I, T46L
T46V, S47A, S47C, S47F, S47G, S47L, S47M, S47T, S47V, Q48D, Q48E
Q48G, Q48S, Q48T, Q48V, Q48W, Q4 9A, Q49C, Q49D, Q49G, Q49H, Q49L
Q4 9M, Q49S, G50A, G50Q, L51A, L51F, L51H, L51Y, A52D, A52M, L54T
A56P, K59R, Q60M, R64D, R64E, R64Q, V68L, G72A, G72C, G72P, G72S
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G7 5A, G75C, G75D, G75E, G75F, G75I, G75K, G75L, G75M, G75N, G75P,
G75T, G75V, G75W, G75Y, L7 6A, L76D, L76G, L76I, L76K, L7 6M, L76N,
L76P, L76Q, L76R, L76W, R77G, R77L, R77Q, G7 8A, G78C, G78E, G78F,
G78M, G78N, G78Q, G78R, G78S, G78T, G78V, G78Y, F7 9A, F79D, F79E,
F79G, F79H, F79N, F79Q, F79W, F79Y, Q80E, P81N, P81T, P81Y, Q82R,
Q82S, Q82T, Q83A, Q83C, Q83F, Q83G, Q83K, Q83L, Q83M, Q83N, Q83R,
Q83S, Q83T, Q83V, Q83W, Q83Y, T84A, T84F, T84L, T84M, T84N, T84Q,
T84V, T84Y, E8 5A, E85C, E85L, E85Q, E85R, E85S, E85T, E85W, E85Y,
Q8 6A, Q86G, Q86K, Q86T, T87D, T87P, R8 9A, R89G, Q90E, Q90Y, I91V,
L92V, Q93A, Q93E, Q93G, Q93H, Q93I, Q93L, Q93S, Q93W, Q93Y, D94E,
D94F, D94G, D94H, D94K, D94N, D94Q, D94R, D94S, D94V, V95L, V95T,
K96V, K96Y, A98W, N99G, N99L, N99P, N99Q , N99R, N99Y, A100G
A100V, E101A, E101D, E101G, E101L, E101M, E101S, E101T, E101V
P102S, L103G, M105C, M105I, M105V, Q10 6A, Q106D, Q106H, Q106W
I107Y, R108A, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L
R108M, R108S, R108W, R108Y, L109A, L109D, L109E, L109F, L109G
L109K, L109P, L109R, L109S, L109Y, P110C, P110D, P110E, P110F
P110G, P110H, P110K, P110L, P110M, P110N, P110R, P110S, P110V
P110W, A111C, A111E, A111L, A111M, A111P, A111Q, A111R, A111V
A111W, A111Y, N112A, N112F, N112G, N112K, N112R, N112W, Y113A
Y113C, Y113G, Y113I, Y113M, G114K, G114L, G114P, R115A, R115C
R115E, R115G, R115N, R115S, R115W, R115Y, R116D, R116E, R116W
Y117A, Y117C, Y117E, Y117I, Y117L, Y117N, Y117Q, Y117R, Y117S
Y117T, Y117V, N118C, N118G, N118I, N118K, N118S, N118T, N118V
N118W, E119C, E119F, E119G, E119K, E119M, E119R, E119W, E119Y
A120D, A120E, A120G, A120W, F121A, F121D, F121E, F121M, F121P
F121Q, F121R, F121S, F121Y, S122D, S122E, S122F, S122I, S122L
S122M, S122V, S122W, S122Y, A123H, A123L, A123V, I124T, Y125C
Y125F, Y125G, Y125P, Y125S, Y125V, Y125W, P126R, P126T, P126V
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P126Y, K127S, L128C, L128T, L128V, K130E, K130I, K130V, F132D,
F132E, F132N, F132T, D133K, D133R, D133S, D133T, D133V, D133Y,
V134I, V134M, V134S, P138E, P138N, P138R, P138T, P138V, F13 9A,
F139D, F139G, F139H, F139M, F139S, F139W, F140C, F140G, F140M,
F140N, F140P, F140S, M141A, M141C, M141D, M141E, M141F, M141G,
M141K, M141L, M141P, M141Q, M141R, M141T, M141V, M141W, M141Y,
E142A, E142C, E142P, E142Q, E142W, E142Y, V144D, V144E, V144G,
V144H, V144N, V144P, V144Q, V144R, V144S, V144W, V144Y, Y145A,
Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I, Y145L, Y145M, Y145N, Y145Q,
Y145T, Y145W, L146A, L146C, L146D, L146E, L146G, L146H, L146S,
L146W, K147G, K147P, K147W, P148D, P148E, W150C, W150D, W150E,
W150G, W150L, W150Q, W150T, M151A, M151C, M151E, M151F, M151G,
M151I, M151Q, M151S, M151T, M151V, M151W, Q152D, Q152F, Q152I,
Q152L, Q152T, I156L, P158A, P158F, P158G, P158H, P158I, P158L,
P158Q, P158T, P158V, N159C, N159E, N159G, N159I, N159K, N159L,
N159M, N159R, N159T, N159V, R160A, R160C, R160D, R160E, R160G,
R160H, R160N, R160Q, R160S, R160W, D161E, D161G, D161I, D161K,
D161L, D161M, D161Q, D161R, D161W, A162I, A162L, A162T, A162V,
A162Y, Q163G, Q163L, Q163M, Q163S, P164A, P164C, P164D, P164M,
P164N, P164R, P164V, P164W, F165D, F165E, F165G, F165H, F165I,
F165K, F165L, F165M, F165R, F165S, F165T, F165V, F165Y, I166F,
I166L, I166M, I166V, A167C, A167M, A167R, A167T, D168G, D168P,
D168R, W169E, W169K, W169Q, M170F, M170H, M170L, M170T, M170V,
M170Y, A171E, A171F, A171V, A171W, K172A, K172M, Q173N, Q175I,
P176H, P176K, P176N, P176W, L177M, L177T, V178T, V178W, N179G,
N179H, N179R, N179T, N179V, N179Y, H180E, H180G, H180R, H180V,
H180W, D181A, D181H, D181I, D181L, D181P, D181R, D181W, S182A,
S182G, S182K, S182L, S182P, e/ou S182R, caracterizado pelo fato
dos números nas designações de mutação de substituição se
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30/360 referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade com respeito a substratos C10 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substrato C12 (i.e., substratos, as cadeias de carbono das quais têm 12 carbonos de comprimento), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo aos resíduos 10-25, 35-85, 90-103, 110-143, 146-180 de SEQ ID NO:31. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada no que diz respeito a substratos C12 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substratos C12, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a um ou mais resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
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46, 47, 4 8, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61 , 62, 63
64, 65, 6 6, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78 , 79, 80
81, 82, 8 3, 84 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97
98, 99, 1 00, 1 01, 1 02, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111
5 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 119, 120, 122, 123, 124, 125, 126
127, 128 , 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 142, 145
149, 152 , 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 166
167, 168 , 169, 170, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 179, 180, 181
e/ou 182. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou 10 atividade aumentada no que diz respeito a substratos C12 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou 15 atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substratos C12, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada com uma ou mais substituições selecionadas dentre A1Q, A1S, A1V, 20 D2E, D2K, D2P, D2W, T3R, T3W, L4A, L4Y, L5F, L5G, L5S, L5Y, I6T,
I6V, L7A, L7C, L7M, L7N, L7S , L7T , L7V, L7Y, D9N, L11M, S12A,
S12I, S12V, A13C, A13G, A13H, A13I, A13L, A13N, A13T, A13W, G14F,
G14I, G14K, G14M, G14V, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E, Y15G, Y15I, Y15L,
Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16D, R16E, R16G, R16H, R16I,
25 R16L, R16N, R16P, R16S, R16T, R16V, R16W, M17A, M17C, M17G, M17K,
M17N, M17P, M17Q, M17R, M17S, M17T, S18M, S18N, A19L, S20A, S20C,
S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21I, A21L, A21P, A21Y, A22F, A22L,
A22M, A22N, A22R, A22Y, P24G, P24V, A25D, A25E, A25L, A25N, A25Q,
A25R, A25V, L26D, L26E, L26F, L26G, L26H, L26I, L26K, L26N, L26R,
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L26S, L26W, L26Y, L27A, L27C, L27F, L27M, L27W, L27Y, N28R, N2 8W
D29P, K30P, W31E, W31N, T35L, T35Y, V37F, V37S, V37W, V38D, V3 8F
V38G, V38P, N3 9A, N39C, N39E, N39G, N39Q, N39W, A40D, A40L, A4 0M
A40P, A4 0V, A40Y, S41C, S41T, I42A, I42C, I42D, I42E, I42G, I42K
5 I42L, I42M, I42P, I42S, I42T, I42W, I42Y, S4 3A, S43D, S43E, S43F
S43G, S43H, S43L, S43M, S43N, S43R, S43T, S43V, G44C, G44E, G44H
G44K, G44L, G44N, G44Q, G44R, G44S, D4 5A, D45C, D45E, D45F, D45H
D45I, D45K, D45L, D45M, D45P, D45Q, D45S, D45T, D45V, D45W, T4 6A
T46C, T46D, T46G, T46K, T46N, T46R, T46S, S47P, S47Q, Q48E, Q48V
10 Q48W, Q48Y, Q4 9A, Q49C, Q49D, Q49E, Q49G, Q49H, Q49I, Q49K, Q49L
Q4 9M, Q49P, Q49R, Q49S, Q4 9V, Q49W, Q49Y, G50A, G50C, G50F, G50I
G50K, G50L, G50M, G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50Y, L51A
L51D, L51N, L51T, L51V, L51W, A52C, A52M, A52P, A52W, R53A, R53C
R53D, R53E, R53F, R53G, R53I, R53K, R53L, R53N, R53S, R53T, R53V
15 R53W, R53Y, L54A, L54C, L54E, L54F, L54G, L54M, L54N, L54S, L54W
L54Y, P55Y, L57A, L57C, L57F, L57K, L57P, L57Q, L57R, L57Y, L58A
L58D, L58E, L58G, L58H, L58N, L58R, L58S, L58W, L58Y, Q60P, H61D
H61G, H61P, Q62P, Q62W, P63I, P63L, P63N, P63S, P63T, P63V, P63W
R64F, R64P, R64W, R64Y, W65A, W65E, W65G, W65K, W65M, W65N, W65V
20 V66M, V66S, L67A, L67T, V68A, V68L, V68M, V68S, V68T, E69A, E69C
E69D, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69P, E69V, E69Y, L7 0A
L70C, L70E, L70F, L70H, L70I, L70K, L70Q, L70S, L70T, L70V, G71A
G72A, N73G, N73H, N73L, N73R, N73S, N73T, D74E, D74G, L76I, L7 6M
L76W, R77C, R77D, R77E, R77G, R77K, R77L, R77Q, R77S, R77V, R77W
25 G78D, F79P, Q80G, Q80M, Q80S, Q80Y, P81A, P81E, P81K, P81L, P81M
P81W, P81Y, Q82F, Q82V, Q82W, Q82Y, Q83A, T84E, T84R, T84W, Q8 6A
Q86T, T87E, T87G, T87L, L88C, R89L, R89P, Q90N, Q90P, Q90W, I91G
I91M, I91S, I91V, I91Y, L92A, L92C, L92G, L92H, L92N, L92S, L92T
L92V, L92Y, Q93A, Q93G, Q93H, Q93I, Q93P, Q93Y, D94P, V95F, V95G
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V95L, V95N, V95Q, V95T, V95W, K96A, K96L, K96P, K96Y, A97K, A97P,
A98L, A98P, A98V, A98W, A98Y, N99C, N99D, N99G, N99L, N99M, N99P,
N99Q, ] A100L, N99R, N99W, N99Y, A100D, A100E, A100G, A100H, E101G, A100I, E101L, A100K E101M
A100Q, A100R, A100V, A100W, A100Y,
5 E101P, E101S, E101T, E101V, P102E, P102F, P102H, P102L, P102Q
P102R, P102S, P102W, P102Y, L103E, L103K, L103N, L103Q, L103R
L104C, L104P, L104S, L104W, M105C, M105E, M105G, M105V, Q10 6A
Q106C, Q106G, Q106K, Q106R, Q106S, Q106T, I107C, I107E, I107K
I107L, I107M, I107S, I107V, R108F, R108W, L109M, A111C, A111Q
10 A111W, N112A, N112G, N112W, Y113A, Y113D, Y113G, Y113I, G114K
G114L, G114M, G114Y, R115A, R115C, R115E, R115G, R115N, R115S
R115Y, R116H, R116W, Y117C, Y117H, Y117I, Y117L, Y117M, Y117N
Y117S, Y117T, Y117V, E119C, E119F, E119K, E119M, E119R, E119W
E119Y, A120D, A120G, A120I, A120T, A120W, S122F, S122I, S122L
15 S122M, S122V, S122W, S122Y, A123C, A123F, A123H, A123L, A123R
A123T, A123V, A123W, A123Y, I124G, I124H, I124K, I124L, I124R
I124S, I124Y, Y125F, Y125R, P126C, P126F, P126H, P126Y, K127I
K127P, L128A, L128S, L128T, A129H, A129I, A129K, A129N, A12 9W
A129Y, K130P, E131A, E131C, E131F, E131G, E131K, E131L, E131N
20 E131V, E131W, D133K, V134D, V134E, V134K, V134N, V134Q, V134R
V134W, V134Y, L136A, L136D, L136E, L136F, L136G, L136H, L136K
L136N, L136P, L136Q, L136R, L136S, L136T, L137E, L137G, L137H
L137P, L137Q, L137S, L137Y, F140M, M141A, M141C, M141L, M141P
E142C, Y145E, Q149L, Q152A, Q152D, Q152E, Q152H, Q152K, Q152R
25 Q152Y, D153K, G155F, G155W, G155Y, I156C, I156F, I156M, I156V
P158A, P158G, N159G, N159Q, N159T, N159V, R160A, R160D, R160E
R160G, R160H, R160N, R160Q, R160S, R160W, D161I, D161K, D161L
D161M, D161N, D161Q, D161W, A162G, Q163A, Q163C, Q163G, Q163L
Q163M, Q163S, Q163T, P164C, P164M, I166L, I166V, A167C, A167E
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A167F, A167G, A167K, A167L, A167N, A167Q, A167R, A167T, A167V,
A167Y, D168G, D168H, D168L, D168R, D168V, D168W, W169A, W169D,
W169E, W169G, W169K, W169Q, W169S, M170F, M170G, M170N, M170Q,
M170S, M170V, M170W, K172M, K172P, Q173N, L174A, L174F, L174G,
L174T, L174W, Q175I, P176H, P176K, P176L, P176N, P176W, L177D,
L177G, N179H, N179R, N179Y, H180A, H180G, D181H, D181I, D181L,
D181R, D181W, S182K, S182L, S182P , e/ou S182R, caracterizado
pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada no que diz respeito a substratos C12 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substrato C14 (i.e., substratos, as cadeias de carbono das quais têm 14 carbonos de comprimento), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo aos resíduos 5-20, 35-58, 65-80, 83-90, 110-130, 140-145, 155160, 165-180 de SEQ ID NO:31. A especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada no que diz respeito a substratos C14 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou
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35/360 atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substratos C14, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a um ou mais
resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 1, 4, 5, 7, 8, 9
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 33
36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51
52, 53, 54, 56, 57, 58, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 91, 92, 93, 95, 96
97, 98, 99, 100 , 101, 102, 105, 106, 107, 108, 109 , 11 0, 111
112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,
125, 126, 131, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,
147, 148, 151, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163,
164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 178,
179, 180, 181, e/ou 182. A especificidade de substrato aumentada
para, e/ou atividade aumentada no que diz respeito a substratos
C14 podem ser medidas in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma especificidade de substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica) no que diz respeito a substratos C14, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada com uma ou mais substituições selecionadas dentre A1S, L4S, L4Y, L5H, L5Y, L7C, L7M, L7N, L7S, L7T, L7Y, G8S, D9N, D9T, L11C, L11I, L11M, L11Q, L11V, S12I, S12L, S12M, S12T, S12V, A13H, A13I, A13L, A13T, A13V, G14F, G14I, G14R, G14T, G14V, Y15A, Y15C, Y15D,
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Y15E, Y15G, Y15I, Y15L, Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16G
R16N, R16P, R16W, M17C, M17D, M17G, M17K, M17N, M17P, M17R, M17S
M17T, S20A, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21G, A22L, A22N, A22Y
W23Y, A2 5E, A2 5N, A25Q, A2 5V, L26C, L26F, L26H, L26Q, L2 6V, L2 6Y
5 N28K, N28P, D2 9V, S33F, S36H, V37H, V37Q, V38F, N39F, N39M, N39Q
N39V, N39W, N39Y, A40G, A40P, A40T, A4 0V, S41P, S41T, I42A, I42D
I42E, I42G, I42L, I42M, I42P, I42S, I42T, I42W, I42Y, S4 3A, S43D
S43E, S43F, S43G, S43H, S43L, S43M, S43N, S43T, S43V, S43W, G44A
G44C, G44E, G44F, G44H, G44K, G44L, G44M, G44N, G44Q, G44R, G44S
10 G44W, G44Y, D4 5A, D45C, D45E, D45F, D45G, D45H, D45M, D45P, D45Q
D45S, D45T, D45V, D45W, T4 6A, T46C, T46D, T46G, T46K, T46N, T46S
T46W, S47E, S47P, S47Q, S47W, S47Y, Q48C, Q48F, Q48I, Q48M, Q48V
Q48W, Q48Y, Q4 9A, Q49C, Q49D, Q49E, Q49G, Q49H, Q49I, Q49K, Q49L
Q4 9M, Q49P, Q49R, Q49S, Q4 9V, Q49W, Q49Y, G50A, G50C, G50E, G50F
15 G50I, G50K, G50L, G50M, G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50W
G50Y, L51A, L51C, L51D, L51S, L51V, A52H, A52I, A52L, A52M, A52P
A52R, A52V, A52W, A52Y, R53A, R53C, R53D, R53E, R53F, R53G, R53I
R53K, R53L, R53N, R53S, R53T, R53V, R53W, R53Y, L54W, L54Y, A5 6R
A5 6W, A56Y, L57F, L58F, L58I, L58Y, V66I, V68L, E69A, E69C, E69D
20 E69F, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69Q, E69S, E69V, E69Y
L7 0A, L70C, L70E, L70F, L70H, L70Q, L70S, L70T, L70V, L70W, G72A
G72C, G72P, G72S, N7 3A, N73C, N73G, N73H, N73I, N73L, N73P, N73R
N73S, N73T, N73V, N73W, D74E, D74G, G7 5A, G75C, G75D, G75E, G75F
G75I, G75K, G75L, G75M, G75N, G75P, G75T, G75W, G75Y, L7 6A, L76C
25 L76D, L76E, L76F, L76G, L76I, L76K, L7 6M, L76N, L76P, L76Q, L76R
L76T, L7 6V, L76W, R77A, R77C, R77D, R77E, R77F, R77G, R77H, R77K
R77L, R77N, R77Q, R77S, R77V, R77W, G78P, F7 9M, F79P, F7 9V, Q8 0A
Q80G, Q80L, Q80M, Q80S, Q80W, Q80Y, P81A, P81E, P81K, P81L, P81M
P81W, P81Y, Q82F, Q82I, Q82N, Q82P, Q82V, Q82W, Q82Y, Q83A, T84S
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E85D, Q86A, Q8 6T, Q86V, Q86W, T87A, T87C, T 87E, T87 F, T87G , T87H
T87L, T87M, T8 7S, T87V, T87W, R89H, R89T, R89V, R89W, I91L , I91V
I91Y, L92V, Q93A, Q93G, Q93H, Q93I, Q93P, Q93Y, V95L, V95M , V95T
V95W, K96A, K96L, K96P, K96Y, A97W, A98K, A98L, A98W, N99G , N99L
5 N99P, N99Q, N99R, N99Y, A100G , A100H, A100I , A100K, A100L, A100M
A100R, A100T, A100V, A100Y, E101G, E101L, E101M, E101S, E101T,
E101V, P102S, M105A, M105C, M105E, M105G, M105I, M105L, M105V,
Q10 6A, Q106C, Q106D, Q106G, Q106H, Q106K, Q106L, Q106M, Q106R,
Q106S, Q106T, Q106V, Q106W, Q106Y, I107C, I107E, I107G, I107L,
10 I107M, I107Q, I107V, R108A, R108C, R108D, R108F, R108I, R108L,
R108S, R108V, R108W, R108Y, L109C, L109M, L109Q, L109T, L109V,
L109Y, P110A, P110E, P110H, P110N, P110R, P110V, A111C, A111L,
A111Q, A111R, A111V, A111W, N112A, N112F, N112G, N112I, N112L,
N112P, N112V, N112W, N112Y, Y113A, Y113D, Y113G, Y113I, Y113M,
15 Y113W, G114F, G114K, G114L, G114M, G114W, G114Y, R115A, R115C,
R115E, R115G, R115I, R115N, R115P, R115Q, R115S, R115V, R115W,
R115Y, R116C, R116H, R116T, R116V, R116W, Y117C, Y117H, Y117I,
Y117L, Y117M, Y117N, Y117S, Y117W, N118A, N118C, N118E, N118G,
N118H, N118I, N118L, N118M, N118P, N118Q, N118T, N118V, N118W,
20 E119C, E119D, E119F, E119K, E119M, E119P, E119R, E119T, E119W,
E119Y, A120D, A120G, A120I, A120L, A120T, A120W, F121A, F121C,
F121D, F121E, F121K, F121L, F121M, F121P, F121Q, F121R, F121S
F121V, F121Y, S122A, S122C, S122D, S122E, S122F, S122G, S122I
S122L, S122M, S122P, S122V, S122W, S122Y, A123C, A123E, A123F,
25 A123H, A123L, A123T, A123V, A123W, A123Y, I124A, I124C, I124G,
I124L, I124Y, Y125C, Y125F, Y125G, Y125I, Y125L, Y125P, Y125Q
Y125R, Y125S, Y125T, Y125V, P126C, P126H, P126Y, E131I, E131L,
D133K, D133Y, V134S, L136C, L136M, L136Q, L136S, L137P, P138E,
P138R, P138T, F139M, F140M, M141A, M141C, M141L, M141P, E142A
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E142C, E142L, E142M, E142N, E142P, E142Q, E142S, E142Y, E143I,
E143P, K147R, P148W, M151I, M151Q, M151V, Q152A, Q152K, Q152S,
D153I, D153K, D153M, D153W, G155F, G155H, G155W, G155Y, I156C,
I156F, I156M, I156Q, I156R, I156S, I156V, P158A, P158G, P158S,
N159G, N159T, R160A, R160G, R160H, R160N, R160W, D161G, D161I,
D161K, D161L, D161M, D161N, D161Q, D161R, D161S, D161V, D161W,
A162G, Q163G, Q163L, Q163M, Q163S, P164A, P164C, P164K, P164L,
P164M, P164N, P164R, P164T, P164W, F165G, F165H, F165S, F165W,
F165Y, I166L, I166V, A167T, D168A, D168G, D168H, D168P, D168R,
D168T, W169A, W169E, W169K, W169M, W169Q, W169R, W169S, W169T,
W169V, M170A, M170F, M170V, A171I, Q173N, Q173W, Q173Y, L174Q,
L174W, Q175I, Q175Y, P176H, P176K, P176L, P176R, P176W, P176Y,
V178A, V178T, V178W, N179H, N179R, N179T, N179V, N179Y, H180G,
H180R, H180S, H180W, D181A, D181H, D181I, D181L, D181Q, D181R,
D181S, D181W, S182A, S182E, S182G, S182I, S182K, S182L, S182P,
S182Q, S182R, e/ou S182T, caracterizado pelo fato dos números
nas designações de mutação de substituição se referirem a
posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A especifici dade de
substrato aumentada para, e/ou atividade aumentada no que diz
respeito a substratos C14 podem ser medidas ín vítro e/ou ín
vívo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma preferência por substratos éster (ex., acil-PNP) sobre substratos tioéster (ex., acil-CoA), e que é uma variante de uma precursora tioesterase que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a resíduos selecionados dentre 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
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102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, e/ou 110 de SEQ ID NO:31. A preferência por substratos éster sobre substratos tioéster pode ser medida in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma preferência por substratos éster (ex., acil-PNP) sobre substratos tioéster (ex., acil-CoA), e que é uma variante de uma precursora tioesterase que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais substituições selecionada dentre V95L, V95M, V95T, K96A, K96L, K96W, K96Y, A97F, A97K, A97S, A97T, A97W, A98E, A98F, A98K, A98L, A98Q, A98W, N99Y, A100K, A100V, E101L, P102S, L104C, M105F, Q106A, Q106C, Q106T, Q106Y, I107A, I107C, I107G, I107L, I107M, I107Q, I107V, R108A, R108C, R108D, R108F, R108I, R108L, R108S, R108V, R108W, R108Y, L109M, L109V, P110A,P110F, P110H, P110N, P110V, e/ou P110W, caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A preferência por substratos éster sobre substratos tioéster pode ser medida in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma preferência por substratos tioéster (ex., acilCoA) sobre substratos éster (ex., acil-PNP), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo aos resíduos selecionados dentre 95, 96, 97, 101, 102, 103,104,
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105, 107, 109, e/ou 110 de SEQ ID NO:31. A preferência por substratos tioéster sobre substratos éster pode ser medida in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que apresenta uma preferência por substratos tioéster (ex., acilCoA) sobre substratos éster (ex., acil-PNP), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais substituições selecionadas dentre V95E, V95I, V95W, V95Y, K96P, A97E, A97M, E101P, P102D, P102K, P102Y, L103E, L103K, L103N, L104A, L104D, L104E, L104N, L104Q, L104W, L104Y, M105W, I107E, I107K, I107P, L109A, L109C,L109D, L109E, L109G, L109K, L109N, L109P, L109Q, L109S, L109T, L109Y, e/ou P110R, caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A preferência por substratos tioéster sobre substratos éster pode ser medida in vitro e/ou in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos ésteres não graxos (ex., ácidos graxos livres e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 1-14, 22-29, 33
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58, 65-100, 103-109, 114-117, 119-121, 127-136, 139-144, 150151, 155-170, e/ou 173-174. A produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos ésteres não graxos (ex., ácidos graxos livres e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a
res íduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentr e 1, 2, 4, 5, 6, 7,
8, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 44, 45, 46, 47, 49, 50 , 53, 58, 65, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 81 , 84, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 95, 96, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 10 7, 108, 109,
114 , 115, 11 7, 119, 120 , 121, 127, 128, 129, 131, 132, 134, 135,
136 , 139, 14 1, 142, 143 , 144, 150, 151, 155, 156, 158, 159, 160,
161 , 162, 163, 16 4, 165, 166, 169, 170, 173 , e/ou 174. A
ou de porcentagem de produtividade aumentada proporcional ésteres graxos sobre outros produtos ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a
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42/360 produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos ésteres não graxos (ex., ácidos graxos livres e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser
mutada em uma ou mais substituições selecionadas dentre A1R,
D2H, D2R, L4G, L4M, L5Q, I6A , I6L, L7E, G8A, S12N, A13I, A13L,
A13S, A13T, A13W, A13Y, G14K, G14R, G14S, G14T, A22D, A22E, A22H,
A22Y, W23Y, P24C, P24G, P24T, A25P, L26C, L26D, L26E, L26G, L26N,
N2 8A, N28M, D29V, S33G, S33M, K34A, K34H, K34M, T35G, T35M, S36A,
V37A, V37G, V37H, V37S, V38D, V38G, V38P, N39E, N39Q, N39R, A40M,
A40P, S41T, G44F, G44Y, D45P, D45Q, T46W, S47F, Q49I, G50A, G50K,
G50M, G50S, R53S, L58D, L58M, L58R, W65L, L67G, V68G, V68M, V68N,
E69P, E69Q, L70A, L70E, L70H, G71C, G72A, N73C, N73G, N73L, N73R,
N73T, N73V, D74C, D74S, D74W, G75A, G75K, G75L, G75M, L76A, L76F
L76G, L76I, L76M, L76N, L76T, L76W, R77G, F79A, F79M, F79P, P81E,
P81W, T84F, T84H, T84Y, Q86P, Q86W, T87M, T87S, T87W, L88C, L88F,
L88G, L88H, L88Y, R89G, Q90P, Q90W, I91M, I91S, L92C, L92G, Q93F,
Q93P, V95A, V95D , V95E, V95L, V95M, K96P, N99L, N99M, N99S,
A100D, A100K, A100L, A100M, A100V, A100Y, L103A, L104A, L104C,
L104P, L104Q, L104W, M105A, Q106A, Q106C, Q106T, Q106W, I107C,
I107M, R108E, L109F, L109M, G114F, R115W, Y117P, E119D, E119P,
A120P, F121A, F121C, F121W, K127P, L128F, A129L, A129Y, E131A,
F132P, V134P, P135A, L136A, F139M, M141A, M141P, E142A, E143P,
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V144A, W150D, W150E, M151S, G155V, I156K, I156M, P158A, P158G,
P158Q, P158S, N159E, N159I, R160H, R160I, R160K, D161G, A162T,
A162Y, Q163A, Q163C, Q163E, Q163G, Q163I, Q163M, Q163S, Q163T,
Q163V, P164C, F165D, F165S, I166A, I166L, W169M, M170E, M170G,
M170N, M170S, Q173P, e/ou L174A, caracterizado pelo fato dos
números nas de signações de mutação de substituição se referirem
a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A produtividade
aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., ácidos graxos livre e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) quando a produção de éster graxo é indesejada, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 3, 5, 15-18, 27-42, 46, 57-68, 77-78, 95106, 121-123, 152-154, 167, e/ou 175-182. A produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade diminuída
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44/360 proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., ácidos graxos livre e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) quando a produção de éster graxo é indesejada, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da
tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de
aminoácidos correspondendo ao resíduos de SEQ ID NO :31
selecionados dentre 3, 5, 1 5, 16, 18, 27, 28, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 40, 42, 46, 57, 59, 60, 62, 65 , 68, 77, 78, 95, 96, 97,
98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 121, 123, 152 , 153 , 154, 1 67,
175, 176, 178, 179, 180, 181, e/ou 182. A produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., ácidos
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45/360 graxos livre e/ou derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) quando a produção de éster graxo é indesejada, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais substituições
selecionadas dentre T3E, T3G, T3K, T3L, L5C, L5G, Y15A, Y15L,
Y15Q, Y15R, Y15V, R16D, R16E, R16G, R16I, R16V, S18E, L27V, N28G,
N28I, S33I, S33R, K34R, T35F, T35K, T35L, T35Q, T35V, S36F, S36I,
S36L, S36W, V37L, V38E, V38F, V38K, V38L, A40D, A40G, I42T, T46L,
L57A, L57F, L57G, L57H, L57K, L57N, L57P, L57R, L57S, L57T, L57V,
L57W, L57Y, K59V, Q60E, Q60P, Q62G, W65V, V68L, R77L, G78M, V95F,
V95N, K96C, K96L, K96N, K96Q, K96R, K96Y, A97E, A97F, A97R, A97W,
A98E, N99A, N99D, A100S, P102I, L103Q, L103W, M105L, Q106G,
Q106H, Q106K, Q106S, Q106V, F121P, A123E , Q152D, Q152E, Q152F,
Q152H, Q152I, Q152K, Q152L, Q152S, Q152T , Q152Y, D153P, D153V,
D154E, A167V, Q175L, P176D, V178K, N179H , N17 9W, H180E, H180L,
H180P, H180R, D181C, D181E, S182K, S182L , S182N, S182R, S182T,
e/ou S182V, caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. A produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácidos graxos com exceção de ésteres graxos) pode ser observada ou determinada in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos sobre outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos) é determinada in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que
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46/360 é capaz de aumentar e/ou melhorar a produção de um ou mais derivados de ácido graxo, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 2, 4, 11-22, 25-31, 37-45, 4958, 63-80, 84-130, 136-146, e/ou 150-174. Um exemplo de derivado de ácido graxo que é produzido de acordo é um ácido graxo livre. A produção aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo pode ser medida ín vitro e/ou ín vivo. Preferencialmente, a produção aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo é medida in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de aumentar e/ou melhorar a produção de um ou mais derivados de ácido graxo, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em
uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a resíduos de
SEQ ID NO:31 selecionados dentre 2, 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 19, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 39, 41, 42, 43,
44, 45, 49, 50, 51, 53, 54, 58, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 84, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 100 , 102, 103, 104, 1 05, 106, 107, 108, 109,
110, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 121 , 122 , 124, 127,
128, 129, 130, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 143 , 144 , 145, 146,
150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 162, 163, 166 , 167 , 169, 170,
173, e/ou 174. Um exemplo de derivado de ácido graxo que é
produzido de acordo é um ácido graxo livre. A produção aumentada
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47/360 e/ou melhorada de derivados de ácido graxo pode ser medida in vitro e/ou in vivo. Preferencialmente a produção aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo é medida in vivo.
Em uma concretização da invenção, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de aumentar e/ou melhorar a produção de um ou mais derivados de ácido graxo, e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em
uma ou mais substituições selecionadas dentre c D2L, D2P, D2R,
L5G, L11I, S12N, S12T, A13N, G14C, G14P, G14S, G14T, G14V, Y15C,
Y15I, Y15V, R16T, M17D, M17E, M17N, M17R, M17S, M17V, A19C, A21G,
A22L, A22R, A22T, A25P, L26D, L26G, L26W, L27C, L27F, L27W, L27Y,
N28I, N28P, D29P, K30P, W31D, W31G, W31N, W31P, W31R, W31S, W31T,
V37Y, N39P, S41C, I42D, I42G, S43E, G44K, G44R, G44W, D45G, Q49E,
G50A, G50K, G50M, G50Q, L51D, L51T, R53A, R53G, R53L, R53N, R53S,
R53V, L54E, L54F, L54G, L54N, L54S, L54W, L58R, P63G, P63M, P63N,
P63T, P63W, W65E, W65G, V66G, V66S, L67T, V68S, E69F, E69V, L70C,
L70F, L70Q, L70S, L70T, L70V, G71A, N73G, N73L, D74A, D74C, G7 5A,
G75C, G75F, G75R, G75W, L76I, R77A, R77C, R77D, R77F, R77G, R77H,
R77K, R77L, R77N, R77Q, R77S, R77W, G78D, G78E, F79K, Q80G, T84H,
T84N, T84Q, T87A, T87F, T87H, T87W, L88A, L88C, L88H, Q90N, Q90W,
I91G, I91L, I91M, I91S, L92G, L92N, L92Q, L92S, L92T, L92Y, Q93P,
A98V,
V95N, V95Q, K96P, A97C, A97P, A98P,
V95F,
D94P,
A100D,
A100E, A100Q, A100Y, P102L, P102Q, P102R, L103E, L103K, L104A,
L104Q, L104W, L104Y, M105C, M105E, M105F, M105L, Q106D, Q106G,
Q106L, Q106V, Q106W, Q106Y, I107A, I107C, I107E, I107G, I107K,
I107L, I107Q, I107S, I107T, R108G, L109F, L109V, L109Y, P110A,
P110E, P110F, P110G, P110H, P110N, P110S, P110V, A111Y, N112F,
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N112P, Y113D, Y113E, Y113P, R115W, Y117A, Y117D, Y117E, Y117G
Y117P, Y117Q, N118F, E119P, A120P, F121C, F121L, F121M, F121N
F121Q, F121R, F121V, F121W, F121Y, S122D, S122F, S122L, S122P
S122W, S122Y, I124A, I124G, I124H, I124K, I124R, K127P, L128S
A129I, A129W, A129Y, K130P, L136A, L136D, L136E, L136G, L136K
L136N, L136P, L136Q, L136S, L136T, L137A, L137C, L137H, L137K
L137Q, L137S, L137Y, P138F, F139L, F139M, F140C, F140I, F140L
F140M, F140V, M141T, E143P, V144H, Y145I, L146G, L146P, W150G
W150I, W150V, M151F, M151L, M151R, M151S, M151T, M151W, Q152N
Q152V, Q152Y, D154C, D154E, G155I, I156C, I156K, I156T, I156V
P158G, P158T, A162T, Q163A, Q163C, Q163E, Q163I, Q163S, Q163T
Q163V, I166C, A167E, A167F, A167L, A167N, A167R, A167V, A167Y
W169K, M170N , M170S, Q173D, L174A, L174T, e/ou L174W
caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. Um exemplo de derivado de ácido graxo que é produzido de acordo é um ácido graxo livre. A produção aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo pode ser medida ín vitro e/ou ín vivo. Preferencialmente, a produção aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo é medida ín vivo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa (ex., C15, C16, C17, C18, C19, C20), ésteres graxos de cadeia
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49/360 longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácido 5 correspondendo a um ou mais resíduos de SEQ ID NO:31 selecionado dentre 13, 16-17, 25-38, 55-67, 78-98, 105-119, 122, 126, 132145, 153, e/ou 161-182. Um exemplo de derivado de ácido graxo de cadeia curta é um derivado de ácido graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido 10 graxo C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia longa. A produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem 15 de derivados de ácido graxo de cadeia curta e/ou o decréscimo correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido in vitro ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia 20 curta ou o correspondente decréscimo de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida in vivo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., Cg, C9, C10, C11, C12,
C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de
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50/360 cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa, ésteres graxos de cadeia longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em um ou mais
resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 13, 16, 17, 25, 29,
31, 35, 36, 38, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 78,
79, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 105,
106, 108, 111, 113, 114, 117, 119, 122, 126, 132 , 135, 136, 139,
142, 144, 145, 153, 161, 162, 165, 168, 173, 175 , 176, 178, 179,
180, 181, e/ou 182. Um exemplo de derivado de ácido graxo de cadeia curta é um derivado de ácido graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido graxo C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia longa. A produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia curta e/ou o decréscimo correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido ín vitro ou ín vívo. Preferencialmente, a produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia curta ou o correspondente decréscimo de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida ín vívo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade aumentada proporcional ou de
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51/360 porcentagem de derivados de ácido graxo (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa, ésteres graxos de cadeia longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais substituições selecionadas dentre: A13V, R16A, M17T, A25S, D29M,
W31L, T35Y, S36W, V38S, P55A, P55G, L57I, L58M, L58V, K59E, H61W,
Q62M, P63V, R64M, W65L, V66C, L67C, L67M, G78F, G78M, G78R, G78T,
G78V, F79K, F79Y, Q82A, Q82M, Q82R, Q83G, Q83K, T84M, T84V, E8 5A,
E85C, E85G, E85Q, E85S, E85T, E85V, E85W, E85Y, Q86H, Q86Y, T87R,
R8 9V, Q90L, Q93M, Q93N, Q93V, D94C, D94L, V95G, K96C, A97N, A97V,
A98G, A98Y, M 105I, Q106K, Q106R, R108W, A111E, A111N, A111S
A111W, A111Y, Y113A, Y113S, Y113V, G114K, G114Y, Y117R, E119M
E119Q, E119R, S122F, S122I, S122M, S122R, P126K, F132C, F132D
F132K, F132L, F132N, F132V, P135A, P135E, P135K, P135Q, L136H
F139L, E142W, V144Y, Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I
Y145L, Y145M, Y145N, Y145R, Y145S, Y145T, D153K, D153Q, D161K
A162I, F165K, D168W, Q173I, Q175M, P176Q, P176R, P176V, V178F
V178G, V178L, V178R, V178S, V178T, N179H, H180E, H180P, H180R
H180S,H180V, H180W, D181R, D181T , S182C,S182D, S182G , e/o
S182R, caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID NO:31. Um exemplo de derivado de ácido graxo de cadeia curta é um derivado de ácido graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido graxo
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C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia 5 longa. A produtividade aumentada proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia curta e/ou o decréscimo correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido in vitro ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia curta ou o correspondente decréscimo de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida in vivo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma 15 equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivados de ácidos graxos (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., C8, C9, C10, C11, C12, 20 C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa (ex., C15, C16, C17, C18, C19, C20), ésteres graxos de cadeia longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência 25 análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácido correspondendo a um ou mais resíduos de SEQ ID NO:31 selecionado dentre 1-31, 36-81, 84-159, 162-177, e/ou 181. Um exemplo de derivado de ácido graxo de cadeia curta é um derivado de ácido
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53/360 graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido graxo C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia longa. A produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia curta e/ou o aumento correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido in vitro ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia curta ou o correspondente aumento de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida in vivo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivados de ácidos graxos (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa, ésteres graxos de cadeia longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais posições de aminoácidos correspondendo a um ou mais resíduos de SEQ ID NO:31 selecionados dentre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31,
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36, 37, 38 , 42, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 57,
61, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77,
78, 79, 81 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96,
97, 99, 10 10, 102, 1 03, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113 , 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 127,
128, 129 , 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 141,
142, 143 , 144, 145, 146, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,
158, 159 , 162, 163, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175,
176, 177 1 e/ou 181 . Um exemplo de der ivado de ácido grax o de
cadeia curta é um derivado de ácido graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido graxo C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia longa. A produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia curta e/ou o aumento correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido in vitro ou in vivo. Preferencialmente, a produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia curta ou o correspondente aumento de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida in vivo.
Em uma concretização, uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) é provida, que é capaz de gerar uma produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivados de ácidos graxos (ex., ácidos graxos de cadeia curta, ésteres graxos de cadeia curta, alcoóis graxos de
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55/360 cadeia curta, etc.) de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, C14) X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo de cadeia não curta, incluindo, por exemplo, ácidos graxos de cadeia longa, ésteres graxos de cadeia longa, alcoóis graxos de cadeia longa, etc.), e que é uma variante de uma tioesterase precursora que contém uma sequência análoga a SEQ ID NO:31, caracterizado pelo fato da tioesterase precursora ser mutada em uma ou mais substituições selecionadas dentre: A1C, A1F, A1L, A1Y, D2L, D2M, D2P, D2W, T3R, L4A, L4M, L4N, L4S, L4V, L4Y, L5E, L5F, L5G, L5K,
L5N, L5S, L5W, I6T, L7A, , L7E, L7K, L7M, L7W, G8K, D9N , D9T, L11A
L11C, L11I, L11M, L11Q, L11V, S12I, S12L, S12M, S12N, S12T, S12V
S12Y, A13C, G14C, G14E, G14I, G14M, G14N, G14P, G14S, G14T, G14V
Y15C, Y15E, Y15G, Y15I, Y15N, Y15V, R16T, M17D, M17E, M17G, M17L,
M17N, M17P, M17R, M17S, M17V, S18M, S18N, S18T, A19E, A19L, A19V,
A21P, A22D, A22E, A22F, A22H, A22I, A22K, A22L, A22P, A22R, A22S,
A22T, A22Y, W23A, W23H, W23N, W23P, P24A, P24C, P24D, P24E, P24F
P24G, P24I, P24M, P24N, P24S, P24T, P24V, P24W, L26P, L27A, L27C
L27F, L27H, L27R, L27S, L27T, L27W, L27Y, K30P, W31D, W31P, W31R,
S36F, S36L, V37G, V37H, V37N, V37Q, V37W, V37Y, V38P, N39E, N39G,
N39K, N39M, N39P, N39Q, N39Y, I42D, I42G, I42P, G44A, G44E, G44K
G44M, G44N, G44R, G44S, G44W, G44Y, D45G, D45M, T46D, S47E, S47P
S47Q, S47R, S47Y, Q48Y, G50C, G50E, G50F, G50I, G50K, G50L, G50M
G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50W, G50Y, L51D, L51P, L51T
A52P, R53A, R53C, R53D, R53E, R53F, R53G, R53I, R53K, R53L, R53N
R53S, R53T, R53V, R53W, R53Y, L54C, L54E, L54G, L54N, L54Y, P55Y
L57P, H61A, H61D, H61E, P63D, P63E, P63G, P63K, P63M, P63N, P63Q
P63R, R64L, W65G, W65P, W65R, V66N, V66Q, V66S, V66W, V66Y, L67E
L67G, L67Q, L67R, L67S, L67W, V68E, V68G, V68N, V68P, V68Q, E69A
E69C, E69D, E69F, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69P, E69Q
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E69S, E69V, E69W, E69Y, L7 0A, L70C, L70E, L70F, L70G, L70H, L70K
L70Q, L70S, L70T, L70W, G71C, G71S, G72A, G72M, G72P, N7 3A, N73G
N73H, N73I, N73L, N73P, N73R, N73S, N73T, N73W, D74A, D74C, D74F
D74G, D74Q, D74S, D74W, D74Y, G7 5A, G75C, G75D, G75E, G75F, G75I
G75K, G75L, G75M, G75N, G75P, G75R, G75T, G75V, G75W, G75Y, L7 6A
L76C, L76D, L76E, L76F, L76G, L76I, L76K, L7 6M, L76N, L76P, L76Q
L76R, L76T, L7 6V, L76W, R77A, R77C, R77D, R77E, R77F, R77G, R77H
R77N, R77S, R77V, R77W, G7 8A, G78C, G78D, G78E, G78N, G78P, G78Q
G78Y, F79P, F79Q, F79S, F7 9V, P81E, P81W, T84D, T84E, T84G, T84H
T84K, T84L, T84N, T84Q, T84R, T84W, T84Y, E85F, E85P, Q8 6A, T87F
L88A, L88E, L88G, L88H, L88Q, L88S, L88W, L88Y, R89P, Q90P, Q90W
I91E, I91L, I91M, I91N, I91Q, I91S, I91Y, L92C, L92E, L92G, L92H
L92N, L92Q, L92R, L92S, L92Y, Q93P, D94P, D94V, V95A, V95C, V95D
V95E, V95F, V95I, V95P, V95Q, V95W, V95Y, K96P, A97C, A97P, N99D
A100Q, A100Y, P102E, P102G, P102H, P102L, P102R, P102V, P102W
L103C, L103E, L103I, L103K, L103N, L103R, L103S, L103T, L103V
L104A, L104C, L104E, L104G, L104I, L104N, L104P, L104Q, L104S
L104W, L104Y, M105A, M105C, M105E, M105F, M105G, M105K, M105L
M105P, M105T, M105W, Q106D, Q106G, Q106H, Q106L, Q106W, I107A
I107E, I107F, I107G, I107K, I107L, I107Q, I107S, I107T, I107Y
R108A, R108C, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L
R108M, R108S, R108V, R108Y, L109C, L109F, L109G, L109K, L109Q
L109R, L109T, L109V, L109Y, P110A, P110C, P110D, P110E, P110F
P110G, P110H, P110K, P110L, P110M, P110N, P110R, P110S, P110V
P110W, A111C, A111L, A111P, A111Q, A111R, A111V, N112I, N112L
N112P, N112Y, Y113D, Y113E, Y113Q, G114A, R115W, Y117D, Y117G
Y117P, N118F, E119C, E119L, A120P, F121A, F121C, F121D, F121E
F121G, F121K, F121L, F121N, F121P, F121Q, F121R, F121S, F121V
F121W, F121Y, S122D, S122E, S122L, S122P, I124D, I124E, I124G
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I124H, I124K, I124R, I124W, I124Y, Y125C, Y125G, Y125H, Y125I
Y125L, Y125P, Y125Q, Y125R, Y125S, Y125T, Y125V, K127A, L128E,
L128F, L128G, L128K, L128Q, L128R, L128S, L128W, A129D, A129F,
A129L, A129W, A129Y, K130P, K130V, E131A, E131C, E131D, E131P,
5 E131V, F132P, D133C, V134C, V134D, V134N, V134P, V134W, L136A
L136D, L136E, L136G, L136N, L136P, L136T, L137D, L137E, L137G,
L137H, L137K, L137P, L137Q, L137R, L137S, P138G, P138N, P138V
F13 9A, F139C, F139D, F139E, F139G, F139H, F139M, F139N, F139S,
F139T, F139V, F139W, F140A, F140C, F140G, F140I, F140L, F14 0M
10 F140N, F140P, F140S, F140T, F140V, F140W, M141C, M141D, M141E,
M141F, M141G, M141K, M141L, M141P, M141Q, M141R, M141T, M141W,
M141Y, E142A, E142C, E142G, E142I, E142L, E142M, E142P, E142Q,
E142R, E142T, E142V, E143A, E143D, E143F, E143G, E143I, E143M
E143P, E143W, V144A, V144D, V144E, V144G, V144H, V144N, V144P,
15 V144Q, V144R, V144S, Y145Q, Y145W, L146C, L146P, W150P, W150R
M151A, M151C, M151D, M151E, M151F, M151G, M151I, M151L, M151Q
M151R, M151S, M151T, M151V, M151W, Q152P, D153A, D153E, D153F
D154A, D154C, D154E, D154F, D154G, D154H, D154I, D154K, D154L
D154M, D154N, D154P, D154R, D154S, D154T, D154V, D154W, G155A,
20 G155P, G155V, I156A, I156C, I156E, I156F, I156G, I156K, I156M,
I156Q, I156R, I156S, I156T, I156Y, H157C, H157E, P158F, P158H
P158I, P158L, P158Q, P158V, P158W, N159P, N159W, A162K, A162L,
A162N, A162R, A162Y, Q163A, Q163D, Q163E, Q163F, Q163I, Q163V
Q163W, Q163Y, F165L, I166A, I166F, I166M, I166S, I166Y, A167C,
25 A167D, A167E, A167F, A167L, A167N, A167R, A167V, A167W, A167Y,
D168M, D168R, M170E, M170F, M170G, M170N, M170S, M170T, A171S
Q173D, Q173P, L174A, L174G, L174S, L174T, L174W, L174Y, Q175F
P176L, P176Y, L177F, L177M, L177S, D181C , D181E , e/ou D181G,
caracterizado pelo fato dos números nas designações de mutação
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58/360 de substituição se referirem a posições de aminoácidos de SEQ ID
NO:31. Um exemplo de derivado de ácido graxo de cadeia curta é um derivado de ácido graxo C12. Um derivado de ácido graxo de cadeia curta alternativo é o derivado de ácido graxo C14. Em algumas circunstâncias, a produtividade diminuída proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia curta pode ser correlacionada a uma produtividade proporcional aumentada de derivados de ácido graxo de cadeia longa. A produtividade derivados de diminuída proporcional ou de porcentagem de ácido graxo de cadeia curta e/ou o aumento correspondente de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivado de ácido graxo de cadeia longa pode ser medido ín vitro ou ín vívo. Preferencialmente, a produtividade proporcional diminuída de derivados de ácido graxo de cadeia curta ou o correspondente aumento de produtividade proporcional ou de porcentagem de derivados de ácido graxo de cadeia longa é medida in vivo.
Em uma concretização da invenção, um polinucleotídeo (ou um gene) codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) da invenção é provido. Em outra concretização da invenção, um vetor é provido contendo o polinucleotídeo (ou o gene) de acordo com a invenção.
Em uma concretização da invenção, a tioesterase precursora é codificada por um gene que é capaz de hibridizar seletivamente com a sequência polinucleotídica de 'tesA, ou um ortólogo, parálogo ou homólogo deste. O ANEXO 13 lista os Números de Acesso do GenBank de homólogos de proteínas de 'TesA apresentando pelo menos 40% de identidade de sequência de aminoácidos com 'TesA.
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A tioesterase precursora pode ser codificada por um polinucleotídeo que é capaz de hibridizar seletivamente sob condições de estringência intermediária, sob alta estringência, ou sob estringência máxima.
Em uma concretização da invenção, um polinucleotídeo codificando uma tioesterase precursora contém uma sequência de aminoácido de 'TesA, um ortólogo deste, um parálogo, deste, ou um homólogo deste. Por exemplo, a tioesterase precursora contém a sequência de aminoácidos de uma 'TesA obtida de uma E.coli, tal como uma E.coli K12. Em uma concretização particular, um polinucleotídeo codificando a tioesterase precursora é provido caracterizado pelo fato da tioesterase precursora conter uma sequência de aminoácidos, uma variante, ou um fragmento de SEQ ID NO:31. Em uma concretização particular, o gene codificando a tioesterase precursora contém a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:32, ou um fragmento deste.
Em uma concretização da invenção, um polinucleotídeo codificando uma tioesterase precursora é provida caraterizada pelo fato da tioesterase precursora consistir de uma proteína apresentando pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos
por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75% , 80%, 85%, 90%, 91% , 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,
ou 100% de identidade com a sequência SEQ ID NO:31 . Em uma
concretização, um polinucleotídeo é provido caracterizado pelo fato da tioesterase precursora consistir de uma proteína apresentando pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,
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60/360 ou 100% de identidade com a sequência de uma 'TesA de E.coli K12. Em uma concretização da invenção, um polinucleotídeo é provido, que contém uma sequência apresentando pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com SEQ ID NO:32 in FIG. 59.
Em uma concretização da invenção, um vetor é provido que contém um gene (ou um polinucleotídeo) codificando uma tioesterase mutante ou uma equivalente desta que ocorre na natureza. Vetores de acordo com a invenção podem ser transformados em células hospedeiras apropriadas para produzir células hospedeiras recombinantes.
Em uma concretização da invenção, uma sonda é provida que contém um polinucleotídeo de por volta de 4 a por volta de 150 nucleotídeos de comprimento, que é substancialmente idêntico a um fragmento correspondente de SEQ ID NO:32, caracterizado pelo fato da sonda ser útil para a detecção e/ou identificação de sequências polinucleotídicas codificando enzimas que apresentam atividade de tioesterase. Uma sonda de acordo com a invenção pode ser utilizada para detectar e isolar potenciais tioesterases precursoras de fontes não conhecidas para produzir tais tioesterases precursoras ou para as quais a sequência de aminoácidos ou nucléica é desconhecida.
Em certas concretizações da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida contendo um polinucleotídeo codificando uma tioesterase mutante ou uma equivalente desta que ocorre na natureza. Em uma concretização, técnicas conhecidas de alteração
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61/360 ou modificação genômica podem ser empregadas para alterar ou modificar as tioesterases endógenas da célula hospedeira, efetuando uma ou mais das mutações previamente mencionadas, de modo que pelo menos uma das tioesterases endógenas mutantes apresenta pelo menos uma propriedade alterada. Em outra concretização, a célula hospedeira recombinante é engenheirada para incluir um plasmídeo contendo um polinucleotídeo codificando uma tioesterase mutante ou uma equivalente desta que ocorre na natureza. Em ainda outra concretização, a célula hospedeira recombinante expressa a tioesterase após o polinucleotídeo codificando a tioesterase ser integrado no cromossomo da célula hospedeira.
Em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante da qualquer célula invenção pode ser selecionada a partir de capaz de expressar uma construção gênica recombinante, e pode ser selecionada a partir de célula microbiana, vegetal ou animal. Em uma concretização particular, a célula hospedeira é de origem bacteriana de cianobactéria, fúngica, de levedura de alga, humana ou de mamífero. Em uma concretização particular, a célula hospedeira é selecionada a partir de qualquer uma das espécies de bactéria Gram positivas tais como Actinomycetes; Bacillaceae, incluindo Bacillus alkalophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus lentus, Bacillus brevis,
Bacillus stearothermophilus,
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus coagulans, Bacillus circulans,
Bacillus lautus,
Bacillus megaterium, B.
thuringiensis; Brevibacteria sp., incluindo
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium ammoniagenes,
Brevibacterium butanicum,
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Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium healii,
Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium linens,
Brevibacterium paraffinolyticum; Corynebacterium spp.
tais como
C. glutamicum e C. melassecola, Corynebacterium herculis,
Corynebacterium lilium, Corynebactertium acetoacidophilum,
Corynebacterium acetoglutamicum,
Corynebacterium acetophilum,
Corynebacterium ammoniagenes,
Corynebacterium fujiokense,
Corynebacterium nitrilophilus; ou espécies bacterianas de ácido lático incluindo Lactococcus spp.
tais como Lactococcus lactis;
Lactobacillus spp. incluindo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc spp.; Pediococcus spp.; Serratia spp. tais como Serratia marcescens; espécies Streptomyces, tais como Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, S. coelicolor e Streptococcus spp.. Alternativamente, cepas de espécies de bactérias Gram negativas pertencendo a Enterobacteriaceae incluindo E. coli, Cellulomonas spp.; ou a Pseudomonadaceae incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae e Burkholderia cepacia, Salmonella sp., Stenotrophomonas spp., e Stenotrophomonas maltophilia. Microorganismos oleaginosos tais como Rhodococcus spp, Rhodococcus opacus, Ralstonia spp., e Acetinobacter spp. São úteis também. Além disso, leveduras e cepas de fungos filamentosos podem ser células hospedeiras úteis, incluindo Absidia spp.; Acremonium spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., incluindo A. aculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus; A. tubingensis e A. versicolor; Aeurobasidium spp.; Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.;
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Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., incluindo F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F. lini, F. oxysporum e F. solaní; Glíocladíum spp.; Kluyveromyces sp.; Hansenula sp.; Humicola spp., including H. insolens e H.
lanuginosa; Hypocrea spp.; Mucor spp.; Neurospora spp., including N. crassa e N. sitophila; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.; Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Pichia sp. ; Piromyces spp.; Rhizopus spp.; espécies de Rhizomucor tais como Rhizomucor miehei; Schizophyllum spp.;
Schizosaccharomyces tais como, por exemplo, espécies de S. pombe; chytalidium sp., Sulpholobus sp., Thermoplasma sp., Thermomyces sp.; Trametes spp.; Trichoderma spp., incluindo T. reesei, T. reesei (longibrachiatum) e T. viride; Yarrowinia sp.; e Zygorhynchus spp e em particular inclui leveduras oleaginosas somente Phafia spp., Rhorosporidium toruloides Y4, Rhodotorula Glutinis e Candida 107.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida, que expressa ou super-expressa um gene codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta 20 que ocorre na natureza), e que também expressa (ou superexpressa) um ou mais genes codificando uma ou mais enzimas que utilizam, como um substrato, produtos de reação da tioesterase mutante (ex., ácidos graxos, acil-CoAs graxos, ésteres acilfosfato graxos, aldeídos graxos, ésteres graxos, ou alcoóis 25 graxos) ou produtos de reação de uma ou mais outras enzimas que são parte de uma via metabólica, incluindo produtos de reação da tioesterase mutante (ex., ácidos graxos) como precursores e/ou substratos.
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Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida, que expressa ou super-expressa um gene codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e que também expressa (ou super-expressa) um ou mais genes codificando uma ou mais enzimas que reagem com um substrato que é necessário como um precursor para uma reação em uma via sintética de ácido graxo. Em uma concretização particular, a célula hospedeira recombinante inclui um gene que codifica tioesterase e um gene que codifica um gene que codifica uma enzima que reage com um substrato que é necessário como um precursor para uma reação em uma via sintética de ácido graxo, que contém a super-expressão ou modificação de um gene selecionado dentre pdh, panK, aceEF, fabH, fabD, fabG, acpP, e/ou fabF.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante contém um gene (ou um polinucleotídeo) que codifica uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e que também contém a atenuação ou deleção de um gene que reduz o fluxo de carbono, ou um gene que compete por substratos, co-fatores, ou requerimentos de energia dentro de uma via biossintética de ácido graxo. Em uma concretização particular, o gene atenuado contém pelo menos um de fadE, gpsA, ldhA, pflB, adhE, pta, poxB, ackA, ackB, plsB, e/ou sfa.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante contém um gene (ou um polinucleotídeo) codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e um gene exógeno introduzido de maneira heteróloga codificando pelo menos uma enzima de derivado de ácido graxo. Em
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65/360 certas concretizações, o gene ou polinucleotídeo exógeno codifica, por exemplo, uma acil-CoA sintase, uma éster sintase, uma álcool acetiltransferase, uma álcool desidrogenase, uma acil-CoA redutase, uma acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, uma redutase de ácido carboxílico, uma decarboxilase, uma aldeído redutase, uma acetiltransferase de álcool graxo, uma enzima condensadora de acil, uma aminotransferase, ou uma decarbonilase.
Em uma concretização da invenção, recombinante contém um gene codificando uma célula hospedeira uma tioesterase mutante ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e pelo menos dois genes exógenos introduzidos de maneira heteróloga codificando enzimas de derivado de ácido graxo.
Em certas concretizações, o gene ou polinucleotídeo exógeno codifica, por exemplo, uma acil-CoA sintase, uma éster sintase, uma álcool acetiltransferase, uma álcool desidrogenase, uma acil-CoA redutase uma acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, uma redutase de ácido carboxílico, uma decarboxilase, uma aldeído redutase uma acetiltransferase de álcool graxo, uma enzima condensadora de acil, uma aminotransferase, ou uma decarbonilase.
Em uma concretização preferencial da invenção, um gene codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e/ou uma enzima de derivado de ácido graxo, por exemplo, uma acil-CoA sintase, uma éster sintase, uma álcool acetiltransferase, uma álcool desidrogenase, uma acilCoA redutase, uma acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, uma redutase de ácido carboxílico, uma decarboxilase, uma
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66/360 aldeído redutase, uma acetiltransferase de álcool graxo, uma enzima condensadora de acil, uma aminotransferase, uma tioesterase adicional ou uma decarbonilase que é super-expressa.
Em uma concretização da invenção, genes codificando tioesterases mutantes (ou equivalentes destas que ocorrem na natureza), enzimas de derivado de ácido graxo e/ou outros genes expressos de maneira recombinante em uma célula hospedeira recombinante são modificados para aperfeiçoar pelo menos um códon para expressão na célula hospedeira recombinante.
Em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante contém pelo menos um gene codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e um gene codificando uma acil-CoA sintase. A acilCoA sintase pode ser qualquer uma dentre fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p, ou o gene codificando a proteína ZP_01644857. Outros exemplos de genes de acil-CoA sintase incluem fadDD35 de M. tuberculosis HR7Rv [NP_217021], yhfL de B. subtilis [NP_388908], fadD1 de P. aeruginosa PAO1 [NP_251989], o gene codificando a proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3, ou faa3p de Saccharomyces cerevisiae [NP_012257].
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida contendo pelo menos um gene ou polinucleotídeo codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e um gene ou polinucleotídeo codificando uma éster sintase, tal com uma éster sintase obtida de Acinetobacter spp., Alcanivorax borkumensis,
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Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Simmondsia chinensis, Mortierella alpina, Cryptococcus curvatus, Alcanivorax jadensis, Alcanivorax borkumensis, Acinetobacter sp. HO1-N, ou Rhodococcus opacus. Exemplos de genes de éster sintase 5 incluem wax/dgat, codificando uma éster sintase/acil-CoA bifuncional: diacilglicerol aciltransferase de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. cepa ADP1, Alcanivorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana, ou Alkaligenes eutrophus. Em uma concretização 10 preferencial, o gene codificando a éster sintase é superexpressa.
Em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante contém pelo menos um gene codificando uma enzima biossintética de aldeído graxo. Um gene biossintético de aldeído 15 graxo pode ser, por exemplo, um gene redutase de ácido carboxílico (ex., um gene car), apresentando uma sequência polinucleotídica e/ou motivo polipeptídico listados nas FIGs. 32 e 33, ou uma variante destes. Em alguns exemplos, um gene biossintético de aldeído graxo codifica um ou mais motivos de 20 aminoácidos demostrado no ANEXO 2.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante contém um gene de produção de álcool graxo. Genes de produção de álcool graxo incluem, por exemplo, acr1. Genes de produção de álcool graxo são descritos em , por exemplo, PCT 25 Publication Nos. 2008/119082 e 2007/136762, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência.
Em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante contém um gene codificando uma tioesterase mutante
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68/360 (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza) e um gene codificando pelo menos um gene produtor de olefina. O gene pode ser um gene produtor de olefina terminal ou um gene produtor de olefina interna. Como exemplos de genes produtores de olefina 5 terminal, aqueles descritos em PCT Publication No. 2009/085278, incluindo orf880, são apropriados. Como exemplos de genes produtores de olefina interna, aqueles descritos em PCT Publication No. 2008/147781 A2 são apropriados. As revelações de PCT Publication Nos. 2009/085278 e 2008/147781 A2 estão 10 incorporadas aqui por referência.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida contendo pelo menos um gene ou polinucleotídeo codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), e pelo menos um de 15 (a) um gene ou polinucleotídeo codificando uma enzima de derivado de ácido graxo e (b) um gene ou polinucleotídeo codificando uma enzima acil-CoA desidrogenase que é atenuada. Preferencialmente aquele gene codificando uma enzima derivado de ácido graxo que é atenuado ou deletado é endógeno à célula hospedeira, 20 codificando, por exemplo, uma acil-CoA sintase, uma éster sintase, uma álcool acetiltransferase, uma álcool desidrogenase, uma acil-CoA redutase, uma redutase de ácido carboxílico, uma decarbonilase, uma acetiltransferase de álcool graxo, uma decarboxilase de ácido graxo, ou uma acil-CoA redutase formadora 25 de álcool graxo. Em uma concretização, os genes atenuados codificam uma acil-CoA sintase ou uma éster sintase.
Em uma concretização da invenção, uma célula hospedeira recombinante é provida que expressa, ou preferencialmente super
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69/360 expressa, uma enzima tioesterase sob condições que resultam na síntese direta de ésteres graxos a partir de acil-ACP ou acilCoA, tais como metil ésteres de ácido graxo (FAME) e etil ésteres de ácido graxo (FAEE), por tal tioesterase. Nessa concretização, a tioesterase converte diretamente acil-ACP ou acil-CoA em éster graxo sem necessariamente expressar uma enzima que é uma acil CoA graxo sintase ou uma éster sintase para produzir ésteres graxos. Todavia, enquanto a expressão ou super-expressão de uma acil CoA graxo sintase ou éster sintase é desnecessária, tais enzimas podem ser desejadas para aumentas a produtividade de produto. Nessa concretização, a enzima tioesterase pode ser qualquer uma dentre uma tioesterase endógena, uma tioesterase expressa de maneira heteróloga, uma tioesterase mutante, ou uma equivalente desta que ocorre na natureza.
Em uma concretização da invenção, a célula hospedeira recombinante apresenta um gene endógeno codificando uma enzima acil-CoA desidrogenase que é deletada ou atenuada.
Em uma concretização da invenção, um método é provido caracterizado pelo fato da célula hospedeira recombinante de acordo com a invenção ser cultivada sob condições que permitem a expressão ou super-expressão de uma ou mais enzimas tioesterases, que podem ser selecionadas dentre tioesterases endógenas, tioesterases expressas de maneira heteróloga, tioesterases mutantes (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), ou uma combinação dessas tioesterases. Em uma concretização particular, a enzima tioesterase que é expressa ou super-expressa pode ser recuperada, e mais preferencialmente substancialmente purificada, após a célula hospedeira ser
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70/360 coletada e/ou lisada.
Em uma concretização da invenção, um método é provido caracterizado pelo fato da célula recombinante hospedeira de acordo com a invenção ser cultivada sob condições que permitem a produção de derivados de ácido graxo. Em uma concretização preferencial, o derivado de ácido graxo pode ser recuperado, e mais preferencialmente o derivado de ácido graxo é substancialmente purificado. Em uma concretização particularmente preferencial, a composição de derivado de ácido graxo é substancialmente purificada a partir de outros componentes produzidos durante o cultivo por centrifugação.
Em um aspecto da invenção, um método é provido para a produção de um derivado de ácido graxo, consistindo de cultivo da célula hospedeira recombinante da invenção sob condições apropriadas para garantir expressão ou super-expressão de uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), e recuperação do derivado de ácido graxo que é produzido.
Em uma concretização, um método é provido para produzir extracelularmente um derivado de ácido graxo in vitro, consistindo de cultivo de uma célula hospedeira recombinante sob condições apropriadas para expressão ou super-expressão de uma enzima tioesterase (incluindo, por exemplo, uma tioesterase endógena, uma tioesterase expressa de maneira heteróloga, uma tioesterase mutante, ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), coleta das células, e lise das células, de modo que a enzima tioesterase que é produzida pode ser recuperada e utilizada para produzir derivados de ácido graxo in vitro. Em
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Figure BRPI0923572B1_D0007
Figure BRPI0923572B1_D0008
Figure BRPI0923572B1_D0009
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Figure BRPI0923572B1_D0011
Figure BRPI0923572B1_D0012
uma concretização exemplar, a enzima tioesterase é substancialmente purificada. Em outra concretização exemplar, a enzima tioesterase não é purificada a partir do lisado celular. A enzima tioesterase purificada ou o lisado celular contendo tal enzima pode então ser submetida a substratos de tioesterase apropriados sob condições que permitem a produção de derivados de ácido graxo extracelularmente. Técnicas para apresentação de substratos a enzimas são bem conhecidas na arte. Um exemplo não limitante é a adição de substrato(s) em uma forma de solução à solução de enzima ou ao lisado celular, permitindo que a mistura fique incubada. Outro exemplo não limitante envolve a incubação de substrato(s) e solução de enzima ou lisada celular a um meio
sólido (ex., contas, resinas, placas, etc.) e passagem da solução
de enzima/lisado ou substrato(s), respectivamente pelo meio sólido a uma velocidade que permita contato suficiente entre o(s) substrato(s) e a enzima.
Em outra concretização da invenção, um método é provido para a produção de um derivado de ácido graxo, que consiste do
cultivo de uma célula hospedeira recombinante sob condições
apropriadas para garantir a expressão de uma enzima tioesterase
(incluindo, por exemplo, uma tioesterase endógena, uma
tioesterase expressa de maneira heteróloga, uma tioesterase
mutante, ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), e
recuperação do derivado de ácido graxo que é secretado ou
liberado extracelularmente. De acordo, o produto de derivado de
ácido graxo é recuperado a partir, por exemplo, do sobrenadante
de um caldo de fermentação onde célula hospedeira é cultivada.
Em uma concretização da invenção, um método é provido para
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obtenção extracelular de uma composição de derivado de ácido
graxo at ravés do cultivo de uma célula hospedeira recombinante
que foi transformada com um polinucleotídeo codificando uma
enzima 1 tioesterase (incluindo, por exemplo, uma tioesterase
endógena , uma tioesterase expressa de maneira heteróloga, uma
tioester ase mutante, ou uma equivalente desta que ocorre na
natureza ), cultivo sob condições que permitem a produção de um
derivado de ácido graxo, uma porção majoritária ou minoritária
da qual < secretado ou liberado extracelularmente, e recuperação
do deriv ado de ácido graxo que é produzido. Em uma concretização
exemplar , o derivado de ácido graxo é produzido dentro da célula,
porém un ia porção dele é liberado pela célula hospedeira. De
acordo, o método adicionalmente consiste de coleta das células,
lise das células, e recuperação do derivado de ácido graxo.
Em uma concretização da invenção, um método de produção de
derivado s de ácido graxo é provido caracterizado pelo fato da
célula hospedeira recombinante que expressa, ou
preferen cialmente super-expressa, uma enzima tioesterase sob
condiçõe s que resultam na síntese de ésteres graxos a partir de
acil-ACV P ou acil-CoA por tal tioesterase ser cultivada sob
condiçõe s que permitem tal produção direta de ésteres graxos.
Em uma concretização da invenção, um método de produção de
derivado s de ácido graxo é provido consistindo de: modificar uma
ou mais tioesterases endógenas da célula hospedeira utilizando
técnicas apropriadas de alteração genômica de modo que as
tioester ases endógenas contêm uma ou mais mutações e apresentam
uma ou mais propriedades alteradas, quando comparadas aos
precurso res endógenos de tioesterase; e cultivo da célula
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73/360 hospedeira sob condições apropriadas para a dita célula hospedeira expressar ou super-expressar tais tioesterases mutantes; e recuperação das derivados de ácido graxo. Em uma concretização exemplar, o derivado de ácido graxo que é produzido pode ser secretado ou liberado extracelularmente, de modo que ele possa ser recuperado, por exemplo, a partir do sobrenadante do caldo de fermentação onde a célula hospedeira é cultivada.
Em uma concretização da invenção, um método de produção de derivados de ácido graxo é provido consistindo de: transformar a célula hospedeira com uma sequência polinucleotídica codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza), de modo que a produção de derivados de ácido graxo na célula hospedeira é alterado em relação a uma célula que não foi transformada com o gene da tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza).
Em uma concretização da invenção, um método de produção de derivados de ácido graxo é provido consistindo de: prover uma sequência polinucleotídica contendo o gene codificando uma tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza); transformar uma célula hospedeira apropriada sob condições caracterizadas pelo fato da dita sequência polinucleotídica ser incorporada no dito cromossomo da dita célula e o dito gene passível de ser expresso dentro da dita célula hospedeira; cultivar a célula hospedeira transformada sob condições apropriadas para a dita célula hospedeira expressar o dito gene e produzir uma proteína tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza); e recuperar os derivados de ácido graxo.
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Em qualquer uma das concretizações acima, derivados de um certo comprimento de cadeia de carbono podem ser recuperados a uma produtividade proporcional maior, em comparação com a produção de tais derivados de ácido graxo de mesmo comprimento de cadeia de carbono na mesma célula hospedeira na ausência da tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza). Em uma concretização particular, os derivados de ácido graxo que são recuperados a uma produtividade aumentada ou diminuída contém um comprimento de cadeia primária de cadeia
acil graxo C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C 13, C14, C15 , C16, C17, C18,
C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C28, C 29, C30, C31 , C32, C33, C34,
C35, C36, C37, C38 ou C39. Os derivados de ácido graxo que são
recuperados a uma produtividade aumentada ou diminuída na composição podem ser selecionados dentre todos os tipos de derivados de ácido graxo, incluindo, por exemplo, hidrocarbonos, ácidos graxos, ésteres graxos, aldeídos graxos, olefinas terminais de alcoóis graxos, olefinas internas, alcanos, diols, aminas graxas, ácidos dicarboxílicos, ou cetonas, ou combinações destes.
Alternativamente, em qualquer uma das concretizações acima, um derivado de ácido graxo particular pode ser produzido a uma produtividade proporcional ou de porcentagem aumentada ou diminuída relativo aos outros derivados de ácido graxo, quando comparado à produtividade proporcional ou de porcentagem daquele derivado de ácido graxo particular na mesma célula hospedeira na ausência da tioesterase mutante (ou uma equivalente desta que ocorre na natureza). Em uma concretização particular, o derivado de ácido graxo que é produzido a uma produtividade proporcional ou de porcentagem aumentada é um éster graxo. Em outra
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75/360 concretização, o derivado de ácido graxo que é produzido a uma produtividade proporcional ou de porcentagem diminuída é um éster graxo.
Alternativamente, em qualquer uma das concretizações acima, derivados de ácido graxo podem ser produzidos a uma produtividade aumentada, ou a uma produtividade proporcional aumentada de produtos de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, ou C14) . Por outro lado, em qualquer uma das concretizações acima, derivados de ácido graxo podem ser produzidos a uma produtividade diminuída, ou a uma produtividade proporcional diminuída de produtos de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, ou C14).
Em uma concretização da invenção, um método de produção de derivados de ácido graxo é provido caracterizado pelo fato da produtividade de derivados de ácido graxo produzidos através do método da invenção ser de pelo menos por volta de 0,001 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por exemplo, pelo menos por volta de 0,01 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,1 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,1 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,2 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,3 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,4 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono, por volta de 0,45 g de produto de derivado de ácido graxo/g de fonte de carbono.
Em uma concretização da invenção, um método de produção de derivados de ácido graxo é provido caracterizado pelo fato do
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76/360 método resultar em uma titulação de pelo menos por volta de 0,5 g/L, por exemplo, pelo menos por volta de 1 g/L, 2 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 150 g/L ou 200 g/L.
Em uma concretização da invenção, um método de produção de derivados de ácido graxo é provido caracterizado pelo fato da produtividade do método ser tal de modo que pelo menos por volta de 0,1 g/L.h, por exemplo, pelo menos por volta de 0,5 g/L.h, 1 g/L.h, 2 g/L.h, 3 g/L.h, 4 g/L.h, 5 g/L.h, 6 g/L.h, 7 g/L.h ou 8 g/L.h é produzido.
Em uma concretização da invenção, composições de derivados de ácidos graxos são providas pela célula hospedeira da invenção. Tais composições podem conter hidrocarbonos, ésteres, alcoóis, cetonas, aldeídos, ácidos graxos, ácidos dicarboxílicos, olefinas internas, olefinas terminais, e/ou combinações destes. Tais composições são úteis em aplicações na indústria química, por exemplo, na produção de surfactantes e detergentes, ou como um biocombustível e um substituto para petróleo, óleo combustível, querosene, diesel, combustível de aviação ou gasolina.
Em uma concretização da invenção, composições de derivado de ácido graxo são providas contendo menos que ou igual a por volta de 50 ppm arsênico, por volta de 30 ppm, por volta de 25 ppm, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm arsênico; menos que ou igual a por volta de 200 ppm cálcio, por volta de 150 ppm cálcio, por volta de 119 ppm cálcio ou entre por volta de 50 e por volta de 200 ppm cálcio; menos que ou igual a por volta de 200 ppm cloro, por volta de 150 ppm cloro, por volta de
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119 ppm cloro ou entre por volta de 50 e por volta de 200 ppm cloro; menos que ou igual a por volta de 50 ppm cobre, por volta de 30 ppm cobre, por volta de 23 ppm cobre, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm cobre; menos que ou igual a por volta de 300 ppm ferro, por volta de 200 ppm ferro, por volta de 136 ppm ferro, ou entre por volta de 50 e por volta de 250 ppm ferro; menos que ou igual a por volta de 50 ppm chumbo, por volta de 30 ppm chumbo, por volta de 25 ppm chumbo, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm chumbo; menos que ou igual a por volta de 50 ppm manganês, por volta de 30 ppm manganês, por volta de 23 ppm manganês, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm manganês; menos que ou igual a por volta de 50 ppm magnésio, por volta de 30 ppm magnésio, por volta de 23 ppm magnésio, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm magnésio; menos que ou igual a por volta de 0,5 ppm mercúrio, por volta de 0,1 ppm mercúrio, por volta de 0,06 ppm mercúrio ou entre por volta de 0,01 e por volta de 0,2 ppm mercúrio; menos que ou igual a por volta de 50 ppm molibdênio, por volta de 30 ppm molibdênio, por volta de 23 ppm molibdênio ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm molibdênio; menos que ou igual a por volta de 2% nitrogênio; por volta de 1% nitrogênio, por volta de 0,5% nitrogênio, ou entre por volta de 0,1-1% nitrogênio; menos que ou igual a por volta de 200 ppm potássio, por volta de 150 ppm potássio, por volta de 103 ppm potássio, ou entre por volta de 50 e por volta de 200 ppm potássio; menos que ou igual a por volta de 300 ppm sódio, 200 ppm sódio, por volta de 140 ppm sódio, ou entre por volta de 50 e por volta de 300 ppm sódio; menos que ou igual a por volta de 1 ppm enxofre, menos que ou igual a por volta de 1% enxofre, por volta de 0,14% enxofre, ou
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78/360 entre por volta de 0,05 e por volta de 0,3% enxofre; menos que ou igual a por volta de 50 ppm zinco, por volta de 30 ppm zinco, por volta de 23 ppm zinco, ou entre por volta de 10 e por volta de 50 ppm zinco; ou menos que ou igual a por volta de 700 ppm fósforo, por volta de 500 ppm fósforo, por volta de 350 ppm fósforo, ou entre por volta de 100 e por volta de 700 ppm fósforo.
Em uma concretização da invenção, derivados de ácido graxo apresentando frações de carbono moderno de por volta de 1,003 a por volta de 1,5 são providos.
Em uma concretização da invenção, uma composição de derivado de ácido graxo é provida caracterizada pelo fato da composição incluir constituintes contendo um grupo acil que apresenta uma ligação dupla na posição 7 na cadeia de carbono (entre o carbono número 7 na cadeia de carbono e o carbono número 8 na cadeia de carbono) a partir de sua extremidade reduzida.
Em uma concretização particular, uma composição de derivado de ácido graxo contém ésteres graxos C5-C25 (i.e., uma cadeia de carbono de 5 a 25 carbonos de comprimento), ácidos graxos C5-C25, aldeídos graxos C5-C25, alcoóis graxos C5-C25; ou ésteres graxos C10-C20 (i.e., uma cadeia de carbono de 10 a 20 carbonos de comprimento), ácidos graxos C10-C20, aldeídos graxos C10-C20, alcoóis graxos C10-C20; ou ésteres graxos C12-C18 (i.e., uma cadeia de carbono de 12 a 18 carbonos de comprimento), ácidos graxos C12-C18, aldeídos graxos C12-C18, alcoóis graxos C12-C18.
Em uma concretização particular, os derivados de ácido graxo da invenção consistem de derivados de ácido graxo de cadeia simples, derivados de ácido graxo de cadeia ramificada, e/ou
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79/360 porções cíclicas. Em uma concretização particular, os derivados de ácidos graxo são insaturados (ex., monoinsaturados) ou saturados.
Em uma concretização da invenção, a composição de derivado de ácido graxo contém um éster graxo que é produzido a partir de um álcool e um acil-CoA, caracterizado pelo fato do álcool ser pelo menos por volta de 1, por exemplo, pelo menos por volta de 2, por volta de 3, por volta de 4, por volta de 5, por volta de 6, por volta de 7, por volta de 8, por volta de 10, por volta de 12, por volta de 14, por volta de 16, ou por volta de 18 carbonos de comprimento, e a acil-CoA é pelo menos por volta de 2, por exemplo, pelo menos por volta de 4, por volta de 6, por volta de 8, por volta de 10, por volta de 12, por volta de 14, por volta de 16, por volta de 18, por volta de 20, por volta de 22, por volta de 24, ou por volta de 26 carbonos de comprimento. Em algumas concretizações, o álcool e acil-CoA dos quais o éster graxo é produzido varia em por volta de 2, por volta de 4, por volta de 6, por volta de 8, por volta de 10, por volta de 12, ou por volta de 14 átomos de carbono.
Em uma concretização da invenção, a composição de derivado de ácido graxo contém um éster graxo que é produzido a partir de um álcool e um acil-ACP, caracterizado pelo fato do álcool ser pelo menos por volta de 1, por exemplo, pelo menos por volta de 2, por volta de 3, por volta de 4, por volta de 5, por volta de 6, por volta de 7, por volta de 8, por volta de 10, por volta de 12, por volta de 14, por volta de 16, ou por volta de 18 carbonos de comprimento, e a acil-ACP ser pelo menos por volta de 2, por exemplo, por volta de 4, por volta de 6, por volta de 8, por
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80/360 volta de 10, por volta de 12, por volta de 14, por volta de 16, por volta de 18, por volta de 20, por volta de 22, por volta de 24, ou por volta de 2 6 carbonos de comprimento. Em algumas concretizações, o álcool e acil-ACP dos quais o éster graxo é produzido varia em por volta de 2, por volta de 4, por volta de 6, por volta de 8, por volta de 10, por volta de 12 ou por volta de 14 átomos de carbono.
Em uma concretização da invenção, a composição de derivado de ácido graxo consiste de uma mistura de derivados incluindo ácidos graxos livres. Em uma concretização, a porcentagem de ácidos graxos livres por peso é de pelo menos por volta de 0,5%, por exemplo, pelo menos por volta de 1%, por volta de 2%, por volta de 3%, por volta de 4%, por volta de 5%, por volta de 6%, por volta de 7%, por volta de 8%, por volta de 9%, por volta de 10%, por volta de 15%, por volta de 20%, ou por volta de 25%. Em uma certa concretização, a porcentagem de ésteres graxos produzido por peso é de pelo menos por volta de 50%, por exemplo, pelo menos por volta de 55%, por volta de 60%, por volta de 65%, por volta de 70%, por volta de 75%, por volta de 80%, por volta de 85%, ou por volta de 90%. Em uma concretização adicional, a proporção de derivados de ácido graxo exceto ácidos graxos livres para ácidos graxos livres é maior que por volta de 90:1, por exemplo, maior que por volta de 80:1, por volta de 50:1, por volta de 20:1, por volta de 10:1, por volta de 9:1, por volta de 8:1, por volta de 7:1, por volta de 5:1, por volta de 2:1 ou por volta de 1:1, por peso.
Em uma concretização, a composição de derivado de ácido graxo consiste de uma mistura de derivados incluindo ácidos
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81/360 graxos livres. Em uma concretização, a porcentagem de ácidos graxos livres por peso é de pelo menos por volta de 50%, por exemplo, pelo menos por volta de 55%, por volta de 60%, por volta de 65%, por volta de 70%, por volta de 75%, por volta de 80%, por volta de 85%, ou por volta de 90%. Em uma certa concretização, a porcentagem de ésteres graxos produzido por peso é de pelo menos por volta de pelo menos por volta de 0.5%, por exemplo, pelo menos por volta de 1%, por volta de 2%, por volta de 3%, por volta de 4%, por volta de 5%, por volta de 6%, por volta de 7%, por volta de 8%, por volta de 9%, por volta de 10%, por volta de 15%, por volta de 20%, por volta de 25%, por volta de 30%, por volta de 35%, por volta de 40%, por volta de 45%, ou por volta de 50%. Em uma concretização adicional, a proporção de derivados de ácido graxo exceto ácidos graxos livres para ácidos graxos livres é menor que por volta de 60:1, por exemplo, menor que por volta de 50:1, por volta de 40:1, por volta de 30:1, por volta de 20:1, por volta de 10:1, por volta de 1:1, por volta de 1:2; por volta de 1:3, por volta de 1:5, ou por volta de 1:10, por peso.
Em uma concretização da invenção, a composição de derivado de ácido graxo inclui um ou mais ésteres graxos selecionados dentre: etil decanoato, etil dodecanoato, etil tridecanoato, etil tetradecanoato, etil pentadecanoato, etil cis-9hexadecenoato, etil hexadecanoato, etil heptadecanoato, etil cis-11-octadecenoato, etil octadecanoato, metil decanoato, metil dodecanoato, metil tridecanoato, metil tetradecanoato, metil pentadecanoato, metil cis-9-hexadecenoato, metil hexadecanoato, metil heptadecanoato, metil cis-11-octadecenoato, metil octadecanoato, ou uma combinação destes.
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Em uma concretização da invenção, a composição de derivado de ácido graxo inclui um ou mais ácidos graxos livres selecionados dentre: ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico, ácido pentanóico, ácidos cis9-hexadecenóico, ácido cis-11-octadecenóico, ou combinações destes.
Composições contendo os derivados de ácido graxo da invenção podem ser utilizadas como combustíveis. Por exemplo, os derivados de ácido graxo podem ser utilizados como, ou como um componente de, um biodiesel, um álcool graxo, um éster graxo, um triacilglicerídeo, uma gasolina, um diesel, ou um combustível de aviação. Uma composição de gasolina ou biodiesel pode ser utilizada em um motor de combustão interna. Um combustível de aviação pode ser utilizado em um motor de avião. De acordo, composições de combustível contendo derivados de ácido graxo preparados de acordo com a presente invenção são providos aqui.
Composições contendo derivados de ácido graxo da invenção podem ser utilizadas como aditivos de combustíveis. Por exemplo, elas podem ser adicionadas a um diesel ou biodiesel baseado em petróleo para melhorar seu conteúdo de combustível renovável, lubricidade, viscosidade cinemática, número de ácido, ponto de ebulição, estabilidade oxidativa, ponto de entupimento de filtro a frio, perfis de impureza, nível de cinza sulfatada, número de cetano, ponto de turvação, ou ponto de vazamento. De acordo, composições de aditivo de combustível contendo derivados de ácido graxo produzidos de acordo com as presentes revelações são também providas.
Composições contendo derivados de ácido graxo da invenção
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83/360 podem também ser utilizadas como composições de biocrude, que podem servir como matéria-prima para a produção de outros compostos derivados do petróleo. Por exemplo, hidrocarbonos de cadeia longa, olefinas internas ou terminais, alcanos, aldeídos 5 graxos e ésteres graxos obtidos de acordo com a presente invenção podem ser adicionalmente processados para produzir combustíveis, aditivos de combustíveis, mistura de combustíveis e/ou produtos químicos. De acordo, composições de biocrude contendo derivados de ácido graxo preparados de acordo com as presente 10 revelações são providas.
Composições contendo derivados de ácido graxo da invenção podem ser utilizadas como matéria-prima na produção de detergentes e surfactantes, suplementos nutricionais, polímeros, substituintes de parafina, lubrificantes, solventes, produtos de 15 higiene pessoal, aditivos de processamento de borracha, inibidores de corrosão, emulsificantes, plásticos, tecidos têxteis, cosméticos, produtos de papel, coberturas, fluidos para produtos metálicos, dielétricos, agentes de lubrificação, e/ou emolientes. De acordo, composições de matéria-prima preparadas 20 de acordo com as presente revelações são também providas.
DESCRIÇÃO DE ANEXOS, FIGURAS E PRINCIPAIS SEQUENCIAS
O anexo 1 é uma tabela identificando vários genes que podem ser super-expressos ou atenuados para aumentar a produção de derivados de ácido graxo. A tabela também identifica vários genes 25 que podem ser modulados para alterar a estrutura do produto de derivado de ácido graxo. Certos genes que são utilizados para alterar a estrutura do derivado de ácido graxo irão também aumentar a produção de derivados de ácido graxo.
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O anexo 2 é uma listagem dos motivos de sequência de aminoácidos para homólogos CAR.
O anexo 3 descreve motivos de aminoácidos para identificação de tioesterases precursoras úteis na presente invenção.
Os anexos 4 e 5 incluem uma tabela listando os resultados de ensaios identificando tioesterases mutantes com propriedades alteradas. Em particular, anexo 4 inclui listas de mutantes com pontuações Z de pelo menos 3 por atividade (i.e., taxa catalítica) no que diz respeito ao substrato nomeado ou 10 especificidade do substrato nomeado; e anexo 5 é uma tabela de mutantes apresentando produtividade/produção melhorada e/ou aumentada de derivados de ácido graxo com pontuações Z de pelo menos 3.
Os anexos 6-10 incluem tabelas listando os resultados de ensaios identificando tioesterases mutante com produtividade proporcional alterada de ésteres graxos X outros produtos (ex., derivados de ácido graxo com exceção de ésteres graxos). Em particular, anexo 6 é uma tabela mostrando mutantes que apresentam pontuações Z de pelo menos 3 no que diz respeito a 20 produtividade proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos
X ácidos graxos livres. Anexo 7 é uma tabela mostrando mutantes que apresentam pontuações Z menores que -3 no que diz respeito à produtividade proporcional ou de porcentagem de ésteres graxos X ácidos graxos livres. Anexo 8 é uma tabela mostrando mutantes 25 que apresentam pontuações Z de pelo menos 3 no que diz respeito à produtividade in vivo de derivados de ácido graxo. Anexo 9 é uma tabela mostrando mutantes que apresentam pontuações Z de pelo menos 3 no que diz respeito à produtividade proporcional de
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85/360 derivados de ácido graxo de cadeia curta (ex., C8, C9, C10, C11, C12, C13, e/ou C14) X outros derivados de ácido graxo (ex., derivados de ácido graxo com exceção de derivados de ácido graxo de cadeia curta incluindo, por exemplo, derivados de ácido graxo de cadeia longa (ex., C15, C16, C17, C18, C19, e/ou C20)). Anexo 10 é uma tabela mostrando mutantes que apresentam pontuações Z menores que -3 no que diz respeito à produtividade proporcional de derivados de ácido graxo de cadeia curta (ex., C8, C9, C10, C11, C12, C13, e/ou C14) X outros derivados de ácido graxo (ex., derivados de ácido graxo com exceção de derivados de ácido graxo de cadeia curta incluindo, por exemplo, derivados de ácido graxo de cadeia longa (ex., C15, C16, C17, C18, C19, e/ou C20)).
O anexo 11 é um alinhamento de sequência de homólogos de 'TesA utilizando os resíduos de aminoácido de uma 'TesA de E.coli (i.e., TesA sem o peptídeo sinal) como uma sequência de referência para propósitos de numeração.
Anexo 12 compara as regiões de sequência relevantes de tioesterases que ocorrem na natureza que contêm resíduos nas posições que correspondem a mutações em 'TesA que introduzem propriedades alteradas. O resíduo relevante é marcado em cor escura, e alinhado com resíduos correspondentes em tioesterases que ocorrem naturalmente.
O anexo 13 lista Números de Acesso do GenBank de homólogos de 'TesA.
Figura 1 (FIG. 1) é um diagrama ilustrando a via de betaPetição 870190042648, de 06/05/2019, pág. 90/370
86/360 oxidação, incluindo as etapas catalisadas pelas seguintes enzimas (1) acil-CoA sintase (EC 6.2.1.-). (2) acil-CoA desidrogenase (EC 1.3.99.3), (3) enoil-CoA hidratase (EC
4.2.1.17); (4) 3-hidroxibutiril-CoA epimerase (EC 5.1.2.3), e (5) 3-cetoacil-CoA tiolase (EC 2.3.1.16). Essa reação final do ciclo de β-oxidação, libera ácido graxo acetil-CoA e acil-CoA com menos dois carbonos, prontos para passar pelas reações de βoxidação novamente.
Figura 2 (FIG. 2) é um diagrama ilustrando a via biossintética FAS .
Figura 3 (FIG. 3) é um diagrama ilustrando vias biossintéticas que produzem ésteres graxos dependendo dos substratos providos.
Figura 4 (FIG. 4) é um diagrama ilustrando vias biossintéticas que produzem alcoóis graxos.
Figura 5 (FIG. 5) é um gráfico representando a produção de álcool graxo pela cepa co-transformada com pCDFDuet-1-fadD-acr1 e plasmídeos contendo vários genes tioesterase. Alcoóis graxos C10, C12, C14, C16 e C18 saturados foram identificados.
Figura 6 (FIG. 6) é um gráfico representando a produção de álcool graxo pela cepa descrita no Exemplo 3, co-transformada com pCDFDuet-1-fadD-acr1 e plasmídeos contendo vários genes tioesterase. As cepas foram crescidas de maneira aeróbica a 25°C ou 37oC em um meio mineral M9 contendo 0,4% de glicose em frascos de agitação. Alcoóis graxos foram detectados nos precipitados celulares assim como nos sobrenadantes, indicando uma produção
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87/360 extracelular substancial de tais alcoóis. Cultivo a 25oC resultou na liberação de por volta de 25% do produção pelas células, enquanto o cultivo a 37oC resultou na liberação de por volta de 50% do produto pelas células.
Figura 7A-D (Figs. 7A-D) são plotagens representando espectros GC-MS de octanoato de octila (C8C8) produzido através de uma hospedeira de produção expressando uma álcool acetiltransferase (AATs, EC 2.3.1.84) e hospedeiros de produção expressando éster sintase (EC 2.3.1.20, 2.3.1.75). FIG. 7A é um espectro GC-MS apresentando extrato de acetato de etila de cepa C41(DE3, EfadE/pHZ1.43) /pRSET B+pAS004.114B) caracterizado pelo fato do plasmídeo pHZ1.43 expressar ADP1 éster sintase (EC 2.3.1.20, 2.3.1.75). FIG. 7B é um espectro GC-MS apresentando extrato de acetato de etila de cepa C41(DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) caracterizado pelo fato do plasmídeo pHZ1.43 expressando SAAT. FIG. 7C é um espectro GC-MS apresentando extrato de acetato de etila de cepa C41(DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) caracterizado pelo fato do plasmídeo pHZ1.43 não conter ADP1 (uma éster sintase) ou SAAT. FIG. 7D é um espectro GC-MS apresentando o espectro de massa e padrão de fragmentação de C8C8 produzido por C41(DE3, AfadE/pHZ1.43) /pRSET B+pAS004.114B caracterizado pelo fato do plasmídeo pHZ1.43 expressar SAAT).
Figura 8 (FIG. 8) é um gráfico representando a distribuição de etil ésteres feita (de acordo com Exemplo 9) quando a éster sintase de A. baylyí ADP1 (WSadp1) foi co-expressa com uma tioesterase de Cuphea hookeriana em uma hospedeira de produção.
Figura 9 (FIG. 9) é um gráfico representando a produção de
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88/360 etil ésteres por várias éster sintases a 25°C. Os etil ésteres foram produzidos por cepas recombinantes de E. coli carregando vários genes éster sintase. As cepas recombinantes foram (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD com 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376;
(5) pHZ1.97_atfA1; e (6) sem plasmídeo (controle).
Figura 10 (FIG. 10) é um gráfico representando a composição acil de etil ésteres de ácidos graxos (FAEE) produzidos a partir de várias cepas de E. coli. As cepas recombinantes são (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD com 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376;
(5) pHZ1.97_atfA1; e (6) sem plasmídeo (controle).
Figura 11 (FIG. 11) é um gráfico representando a produção de etil éteres por várias éster sintases a 37°C. Os etil ésteres 15 foram produzidos por cepas recombinantes de E. coli carregando vários genes éster sintase. As cepas recombinantes foram (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD com 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376;
(5) pHZ1.97_atfA1; e (6) sem plasmídeo (controle).
Figura 12 (FIG. 12) é um gráfico representando concentrações de ácidos graxos livres (FFA) e etil ésteres de ácidos graxos (FAEE) produzidos a partir de três colônias individuais dentre as transformantes, C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD +pHZ1.97_atfA2. O FFA foi convertido em etil éster de ácido graxo (FAEE) e quantificado por GC/MS.
Figura 13 (FIG. 13) é um diagrama representando as regiões controle para FabA (SEQ ID NO:33) e FabB (SEQ ID NO:34). Os
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89/360 sítios consenso de ligação de FadR e FabR são mostrados em negrito. Setas verticais indicam as posições onde mutações podem ser feitas para alterar a expressão de fabA. A base proposta para cada posição é também indicada pelos colchetes. As duas 5 regiões que constituem as regiões -35 e -10 do promotor típico de E. coli são indicadas pelos colchetes. As mutações propostas que tornam o promotor mais próximo da sequência promotora consenso também são mostradas.
Figuras 14A-B (Figs. 14A-B) são cromatogramas representando 10 análise GC/MS. FIG. 14A é um cromatograma representando os componentes de um extrato de acetato de etila da cultura da cepa LS9001 de E. coli transformada com plasmídeos pCDFDuet-1-fadDWSadp1, pETDuet-1-'TesA. FIG. 14B é um cromatograma representando a etil hexadecanoato e a etil oleato, que foram 15 utilizadas como referências.
Figura 15 (FIG. 15) é um mapa do plasmídeo pOP-80.
Figura 16 (FIG. 16) é um esquema de uma nova via para produção de aldeído graxo.
Figuras 17A-B (Figs. 17A-B) são traços GC/MS de olefina produzido por células de Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456 e células de Jeotgalicoccus halotolerans DSMZ 17274, respectivamente.
Figuras 18A-B (Figs. 18A-B) são traços GC/MS de olefinas produzidas por células de Jeotgalicoccus pinnipedalis DSMZ 17030 e células de Jeotgalicoccus psychrophilus DSMZ 19085, 25 respectivamente.
Figuras 19A-B (Figs. 19A-B) são padrões de fragmentação de
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90/360 espectrometria de massa de duas α-olefinas produzidas por células de Jeotgalícoccus ATCC 8456. O composto A foi identificado como 1-nonadeceno e o composto B como 18-metil-1nonadeceno.
Figura 20 (FIG. 20) é um esquema de uma análise filogenética de rRNA 16s de Jeotgalícoccus ATCC 8456.
Figuras 21A-B (Figs. 21A-B) são traços GC/MS de α-olefinas produzidas por células de Jeotgalícoccus sp. ATCC 8456 mediante alimentação com ácido eicosanóico (FIG. 21A) ou ácido esteárico (FIG. 21B).
Figura 22 (FIG. 22) é um traço GC/MS de α-olefinas (1heptadeceno) produzidas por lisados livres de células de Jeotgalícoccus sp. ATCC 8456, quando comparado com um traço de lisado livre de células sem o substrato de ácido graxo C18, e um traço do próprio substrato de ácido graxo C18.
Figura 23 (FIG. 23) é uma representação digital de um gel de SDS-PAGE de fração final purificada de proteína produtora de α-olefinas a partir de células de Jeotgalícoccus sp. ATCC 8456.
Figura 24 (FIG. 24 ) é um traço GC/MS de α-olefinas produzidas por E. colí mediante expressão de Jeotgalícoccus sp. 8456_orf880 e alimentação de ácido esteárico.
Figura 25 (FIG. 25 ) é um esquema de uma análise filogenética de bootstrap dos homólogos de 8456_orf880 utilizando ClustalW.
Figura 26 (FIG. 26) é um gráfico representando as titulações
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91/360 de FAME e composição para a cepa MG1655 (AfadE) pTrc-'TesA_fadD.
Figura 27 (FIG. 27) é um gráfico representando as titulações de FAME e composição para as cepas MG1655 (AfadE) e C41(AfadE) expressando fadD e ‘tesA em plasmídeos durante uma corrida de fermentação de 25 horas.
Figura 28 (FIG. 28) é um gráfico representando as titulações de FAME e composição para a cepa MG1655 (AfadE) pTrc-'TesA_fadD.
Figura 29 (FIG. 29) é um gráfico representando as titulações de FAME e composição para as cepas MG1655 (AfadE) e C41 (AfadE) expressando fadD e ‘tesA em plasmídeos durante uma corrida de fermentação de 25 horas.
Figura 30 (FIG. 30) é um gráfico representando as titulações de FFA e composição para as cepas MG1655 (AfadE) e C41 (AfadE) expressando fadD e ‘tesA em plasmídeos durante uma corrida de fermentação de 25 horas.
Figura 31 (FIG. 31) é um gráfico representando as titulações de FAME para as cepas de MG1655 (AfadE) expressando ‘tesA de E. coli, ‘tesA de P. luminescens, ‘tesA de V. harveyi e tesB de P. profundum em plasmídeos, durante uma corrida de fermentação de 24 horas. Titulações são representadas em mg/L e mg/L/OD.
Figura 32 (FIG. 32) é um gráfico representando as titulações de FFA para as cepas de MG1655 (AfadE) expressando ‘tesA de E. coli, ‘tesA de P. luminescens, ‘tesA de V. harveyi e tesB de P. profundum em plasmídeos, durante uma corrida de fermentação de 24 horas. Titulações são representadas em mg/L (barras) e mg/L/OD (triângulos).
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Figuras 33A-C (FIG. 33A-C) são gráficos representando especificidade de substrato (pontuação Z) X posições de resíduo de aminoácido correspondendo a sequência 'TesA de SEQ ID NO:31 com símbolos para representar níveis de conservação no alinhamento de cons70 para especificidade de C10 (FIG. 33A), especificidade de C12 (FIG. 33B) e especificidade de C14 (FIG.
33C).
Figura 34 (FIG. 34) é um gráfico de titulações de ácido graxo livre (FFA) e acil metil éster graxo (FAME) em culturas de células de E. coli MG1655 EfadE transformadas com pACYC contendo os homólogos de 'tesA de E. coli (EcolA), Pectobacterium atrosepticum (PatrA), Pseudomonas putida (PputA), Vibrio harveyi (VharA), Photorhabdus luminescens (PlumA), ou com pACYC não contendo inserto (Neg).
Figura 35 (FIG. 35) é um gráfico de titulações de FFA a FAME em culturas de células de E. coli MG1655 EfadE superexpressando fadD e 'tesA de E. coli (Ecoli), Pectobacterium atrosepticum (Patr), Photorhabdus luminescens (Plum), Photobacterium profundum (Ppro), Vibrio harveyi (VhA), Pseudomonas putida (Pput), ou sem 'tesA (Neg). (Dado marcado com um asterisco (*) são de um experimento em separado.)
Figura 36 (FIG. 36) é u im gráfico de titulações de FFA e
FAME em culturas de E. coli MG1655 EfadE expressando a 'tesA
selvagem de E. coli (WT) , o mutante S10C ( (S10C), ou sem 'tesA
(Neg).
Figura 37 (FIG. 37) é um gráfico de produção de FAME contra
o tempo de uma corrida de fermentação com células hospedeiras
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93/360 recombinantes que expressam tioesterase na ausência de éster sintase exógena.
Figura 38 (FIG. 38) é um gráfico de produção de FFA contra o tempo de uma corrida de fermentação com células hospedeiras recombinantes que expressam tioesterase na ausência de éster sintase exógena.
SEQ ID NO:1é a sequência de DNA completa do plasmídeo pOP80.
SEQ ID NO:2é a sequência de DNA para o gene fadD35 com
códon otimizado de E. coli (Número de Acesso do GenBank
NP_217021).
SEQ ID NO:3 é a sequência de DNA para o gene fadDl com
códon otimizado de E. coli (Número de Acesso do GenBank
NP_251989).
SEQ ID NO:4 é o oligo BsyhfLBspHIF baseado na sequência de DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank NC_000964.
SEQ ID NO:5 é o oligo BsyhfLEcoR baseado na sequência de DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank NC_000964.
SEQ ID NO:6 é a sequência de DNA para o gene yhfL de Bacillus subtilis.
SEQ ID NO:7 é o oligo Scfaa3pPciF baseado na sequência de DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank NC_001141.
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SEQ ID NO:8 é o oligo Scfaa3pPciI baseado na sequência de
DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank NC_001141.
SEQ ID NO:9 é a sequência de DNA para o gene faa3 de
Saccharomyces cerevisiae (Número de Acesso do GenBank
NP_012257).
SEQ ID NO:10 é o oligo Smprk59BspF baseado na sequência de
DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank
NZ_AAVZ01000044.
SEQ ID NO:11 é o oligo Smprk59HindR baseado na sequência
de DNA depositada no NCBI com Número de Acesso do GenBank
NZ_ AAVZ01000044.
SEQ ID NO:12 é o oligo PrkBsp.
SEQ ID NO:13 é a sequência de DNA codificando a proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 .
SEQ ID NO:14 é a sequência de proteína de ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17679 .
SEQ ID NO:15 é uma listagem da sequência nucleotídica e SEQ ID NO:16 a sequência de aminoácido correspondente do gene car de Nocardia sp. NRRL 5646.
SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26 são sequências de nucleotídeo e aminoácido de orf880, respectivamente. SEQ ID NO:27 é a sequência parcial do rRNA 16s de Jeotgalicoccus sp. ATCC8456.
SEQ ID NO:31 mostra sequência de aminoácido de uma 'TesA de
E. coli .
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SEQ ID NO:32 mostra uma sequência nucleotídica codificando uma 'TesA de E.coli.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Salvo quando definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente entendido por alguém de habilidade básica na arte a qual essa invenção pertence. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui poderem ser 10 utilizados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais apropriados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui, incluindo sequências de banco de dados do GenBank, são incorporadas por referência na sua íntegra. Em caso 15 de conflito, a presente especificação, incluindo definições, é soberana. Em adição, os materiais, métodos, e exemplos são meramente ilustrativa e não tem como intuito ser limitante.
Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir 20 das reivindicações.
Definições:
Ao longo da especificação, uma referência pode ser feita utilizando uma abreviação de um nome de gene ou um nome de polipeptídeo, porém é entendido que tal nome de gene ou 25 polipeptídeo abreviado representa o gênero de genes ou polipeptídeos, respectivamente. Tais nomes gênicos incluem todos
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96/360 os genes codificando o mesmo polipeptídeo e polipeptídeos homólogos apresentando a mesma função fisiológica. Nomes de polipeptídeo incluem todos os polipeptídeos que apresentam a mesma atividade (ex., que catalisam a mesma reação química 5 fundamental).
Salvo quando indicado o contrário, os números de acesso referenciados aqui são derivados do banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantido pelo National Institute of Health, E.U.A.. Salvo quando indicado o 10 contrário, os números de acesso são como providos no banco de dados de março de 2008.
Números EC são estabelecidos pelo the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) (available at http://www.chem.qmul/ac/uk/iubmb/enzyme/). Os números EC referenciados aqui são derivados do banco de dados KEGG Ligand, mantido pelo Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, financiado em parte pela Universidade de Tóquio. Salvo quando indicado o contrário, os números EC são como providos no banco 20 de dados de março de 2008.
Os artigos um e uma são utilizados aqui para se referir a um ou mais de um (i.e., a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Por meio de exemplo, um elemento significa um elemento ou mais de um elemento.
O termo por volta de é utilizado aqui para significar um valor ± 20% de um dado valor numérico. Logo, por volta de 60% se refere a um valor de 60 ± (20% de 60) (i.e., entre 48 e 70).
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Como utilizado aqui, o termo álcool desidrogenase” (EC 1.1.1.*) é um polipeptídeo capaz de catalisar a conversão de um aldeídos graxos em um álcool (ex., um álcool graxo). Adicionalmente, alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que algumas álcool desidrogenases irão catalisar outras reações também. Por exemplo, algumas álcool desidrogenases irão aceitar outros substratos em adição a aldeídos graxos. Tais álcool desidrogenases não específicas estão, portanto, também inclusas nessa definição. Sequências polinucleotídicas codificando álcool desidrogenases são conhecidas na arte, e tais desidrogenases são publicamente disponíveis.
O termo propriedade alterada” se refere a uma modificação em uma ou mais propriedades de um polinucleotídeo mutante ou proteína mutante com referência a um polinucleotídeo precursor ou proteína precursora. Propriedades que podem ser vantajosamente alteradas no que diz respeito à proteínas feitas de acordo com a presente invenção incluem estabilidade oxidativa, especificidade de substrato, seletividade de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, estabilidade de pH, perfil de atividade de pH, resistência a degradação proteolítica, Km, kcat, proporção kcat/km, dobramento de proteína, indução de resposta imune, habilidade de ligação a um ligante, habilidade de ligação a um receptor, habilidade de ser secretada, habilidade de translocar de uma maneira ativa para uma membrana, habilidade de ser apresentada na superfície da célula, habilidade de oligomerizar, habilidade de sinalizar, habilidade de estimular a proliferação celular, habilidade de inibir a proliferação celular, habilidade de induzir apoptose, habilidade de ser modificada por fosforilação ou glicosilação,
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98/360 habilidade para tratar doença. Em uma concretização da invenção, tioesterases mutantes são providas que derivam de uma tioesterase precursora, caracterizado pelo fato do mutante apresentar pelo menos uma propriedade alterada tanto in vitro ou in vivo, quando comparada às propriedades da tioesterase precursora. Em uma concretização, a propriedade alterada pode ser uma propriedade biofísica tal como estabilidade térmica (Tm de ponto de derretimento), estabilidade de solvente, estabilidade de soluto, estabilidade oxidativa, lipofilicidade, hidrofilicidade, estrutura quaternária, momento dipolo, ou ponto isoelétrico. Em uma concretização, a propriedade alterada pode ser uma propriedade bioquímica tal como pH ideal, temperatura ideal, força iônica ideal, e/ou um parâmetro catalítico de enzima (tal como, por exemplo, distribuição de produto, produtividade proporcional ou de porcentagem de produto, atividade específica, preferência de substrato, afinidade de substrato, inibição de substrato, afinidade de produto, taxa de renovação, inibição de produto, mecanismo cinético, Km, kcat, kcat/Km, e/ou VMax). Em uma concretização, a propriedade alterada é uma preferência modificada para substratos particulares, como refletido em, por exemplo, uma preferência alterada por alcólise ou hidrólise, substratos de proteínas carreadoras acil-CoA ou acil-acil, substratos éster ou tioéster, substratos saturados ou insaturados, posição de insaturações, especificidade abrangente ou restrita (ex., a habilidade de catalisar uma variedade de substratos ou somente substratos de um comprimento de cadeia de carbono específico). Em uma concretização, a propriedade alterada pode ser uma preferência ou atividade alterada para substratos ramificados, substratos apresentado uma posição
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99/360 específica de ramificação, substratos hidróxi-acil, substrato ceto-acil, substratos que resultam em um produto apresentando atributos desejados de combustível (i.e., número de cetano, taxa de octanagem, estabilidade oxidativa, lubricidade, ponto de inflamação, viscosidade, ponto de ebulição, ponto de derretimento, ponto de derramamento, ponto de turvação, ponto de entupimento de filtro a frio, características de fluxo a frio, aromaticidade, e/ou número de iodo). Propriedades alteradas também incluem um decréscimo na atividade ou atenuação de hidrólise de éster, tal como hidrólise de moléculas de produto desejadas, ou um decréscimo na toxicidade da proteína à célula e/ou uma modificação no nível de expressão da proteína na célula. Em uma concretização particular, a pelo menos uma propriedade alterada é, por exemplo, uma modificação na habilidade da tioesterase para catalisar a síntese de ésteres acil graxos diretamente ou indiretamente, in vivo ou in vitro, tal como através de transesterificação.
Como utilizado aqui, uma sequência análoga” é uma caracterizada pelo fato da função do gene ser essencialmente a mesma que de um gene de referência tal como, por exemplo, o gene 'tesA de E. coli. Adicionalmente, gene análogos incluem pelo menos por volta de 20%, por exemplo, pelo menos por volta de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de um gene ou polinucleotídeo de referência tal como, por exemplo, a sequência polinucleotídica ou polipeptídica de um gene 'tesA ou uma tioesterase 'TesA, respectivamente. Em concretizações adicionais mais de uma das propriedades acima se aplica à sequência.
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Sequências análogas são determinadas através de métodos conhecidos de alinhamento de sequência.
O termo alinhamento se refere a um método de comparação de duas ou mais sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas para o propósito de determinação de suas relações umas com as outras. Alinhamentos são tipicamente desempenhados por programas de computador que aplicam vários algoritmos, porém é também possível desempenhar um alinhamento a mão. Programas de alinhamento tipicamente iteram através de potenciais alinhamentos de sequências e pontuam os alinhamentos utilizando tabelas de substituição, empregando uma variedade de estratégias para alcançar uma pontuação de alinhamento ideal potencial. Algoritmos de alinhamento comumente utilizados incluem, porém não se limitam a, CLUSTALW, (veja, Thompson J.D., Higgins D.G.,
Gibson T.J., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994); CLUSTALV, (veja, Larkin M.A., et al., CLUSTALW2, ClustalW and ClustalX version 2,
Bioinformatics 23(21): 2947-2948, 2007); Jotun-Hein, Muscle et al., MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity, BMC Bioinformatics 5: 113, 2004);
Mafft, Kalign, ProbCons, e T-Coffee (veja Notredame et al., TCoffee: A novel method for multiple sequence alignments, Journal of Molecular Biology 302: 205-217, 2000). Programas exemplares que implementam um ou mais dos algoritmos acima incluem, porém não se limitam a MegAlign da DNAStar (DNAStar, Inc. 3801 Regent St. Madison, WI 53705, EUA), MUSCLE, T-Coffee, CLUSTALX, CLUSTALV, JalView, Phylip, e Discovery Studio da Accelrys
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101/360 (Accelrys, Inc., 10188 Telesis Ct, Suite 100, San Diego, CA 92121, EUA). Em um exemplo não limitante, MegAlign é utilizado para implementar o algoritmo de alinhamento CLUSTALW com os seguintes parâmetros: Penalidade de Intervalo 10, Penalidade de
Comprimento de Intervalo 0,20, Atraso de Seqs Divergentes (30%), Peso de Transição de DNA 0,50, Matriz de Peso de Proteína Gonnet Series, Matriz de Peso de DNA IUB.
O termo anticorpos se referem a imunoglobulinas.
Anticorpos incluem porém não são limitados a imunoglobulinas obtidas diretamente de qualquer espécie da qual é desejado para produzir anticorpos. Em adição, a presente invenção engloba anticorpos modificados. O termo também se refere a fragmentos de anticorpo que retêm a habilidade de se ligar ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo intacto também se liga, e inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos anti-idiotipo (anti-ID). Fragmentos de anticorpo incluem, porém não se limitam a regiões de determinação de complementaridade (CDRs), regiões variáveis de fragmento de cadeia simples (scFv), região variável de cadeia pesada (VH), região variável de cadeia leve (VL). Anticorpos policlonais e monoclonais são também englobados pela presente invenção. Preferencialmente, os anticorpos são anticorpos monoclonais.
O termo atenuado significa enfraquecer, reduzir ou diminuir. Em um exemplo, a sensibilidade de uma enzima particular 25 a inibição autógena ou inibição causada por uma composição que não é um produto ou reatante (via específica não autógena) é reduzido de modo que a atividade de enzima não é impactada pela presença de um composto. Em um exemplo particular, a expressão
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102/360 do gene fabH é sensível a temperatura e sua sequência pode ser alterada para diminuir a sensibilidade a flutuações de temperatura. Além disso, a expressão do gene fabH pode ser atenuada quando aminoácidos ramificados são desejados. Em outro exemplo, uma enzima que foi modificada a ser menos ativa pode ser referida como atenuada. Uma modificação funcional da sequência codificando uma enzima pode ser utilizada para atenuar a expressão de uma enzima. Modificações de sequência podem incluir, por exemplo, uma mutação, deleção, ou inserção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência gênica ou uma sequência controlando a transcrição ou tradução de uma sequência gênica, cuja modificação resulta em uma redução ou inibição de produção do produto gênico, ou torna o produto gênica não funcional. Por exemplo, deleção funcional de fabR em E. coli reduz a repressão da via biossintética de ácido graxo e permite que E. coli produza mais ácidos graxos insaturados (UFAs). Em alguns exemplos uma deleção funcional é descrita como uma mutação nula. Outros métodos são disponíveis para atenuação de expressão de uma enzima. Por exemplo, atenuação pode ser alcançada através da modificação da sequência codificando o gene como descrito acima; colocando o gene sob o controle de um promotor menos ativo, expressando RNAs interferentes, ribozimas, ou sequências antissenso que tem como alvo o gene de interesse; através da modificação do ambiente físico ou químico, tal como temperatura, pH, ou concentração de soluto, de modo que a atividade ideal do gene ou produto gênico não seja obtida; ou através de qualquer outras técnicas conhecidas na arte.
O termo biocrude se refere a um biocombustível que pode ser utilizado como um substituto de combustíveis baseados em
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103/360 petróleo.
Em adição, biocrude, como o crude de petróleo, pode ser convertido em outros combustíveis, por exemplo, gasolina, diesel, combustível de aviação, ou óleo de aquecimento. Além disso, biocrude, como o crude de petróleo, pode ser convertido em outros químicos industrialmente úteis para uso em, por exemplo, medicamentos, cosméticos, bens de consumo, processos industriais, etc. Uma composição de biocrude pode conter, por exemplo, hidrocarbonos, produtos de hidrocarbono, ésteres de ácido graxo, e/ou cetonas alifáticas, ou uma combinação destes. Em uma concretização preferencial, uma composição de biocrude é composta de hidrocarbonos, por exemplo, hidrocarbonos alifáticos (ex., alcanos, alcenos, alcinos) ou aromáticos.
O termo biodiesel se refere a um tipo particular de biocombustível que pode ser utilizado em motores a diesel. O biodiesel pode ser um substituto para o diesel tradicional, que é tipicamente derivado de petróleo. O biodiesel pode ser utilizado em motores a diesel de combustão interna tanto na forma pura, que é referida como biodiesel limpo, quanto como uma mistura em qualquer concentração com um diesel baseado em petróleo. Uma composição de biodiesel pode também conter vários aditivos apropriados. O biodiesel pode ser composto por hidrocarbonos ou ésteres. Em uma concretização, o biodiesel é composto de ésteres graxos, tais como metil ésteres de ácido graxo (FAME) ou etil ésteres de ácido graxo (FAEE). Em uma concretização preferencial, esses FAME e FAEE são constituídos de porções de acil graxo apresentando comprimento de cadeia de carbono de por volta de 8-20, 10-18, ou 12-16. Ésteres graxos utilizados como biodiesel pode conter cadeias de carbono que são
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104/360 simples, ramificadas, saturadas, ou insaturadas.
O termo biocombustivel se refere a qualquer combustível derivado de biomassa. Biomassa é um material biológico que pode ser convertido em um biocombustível. Uma fonte exemplar de biomassa é matéria vegetal. Por exemplo, milho, cana-de-açúcar, e Panicum podem ser utilizadas como biomassa. Outro exemplo não limitante de biomassa é matéria animal, por exemplo estrume de vaca. Biomassa também inclui dejetos de indústria, agricultura, engenharia florestal e produtos domésticos. Exemplos de tais dejetos incluem, sem limitação, dejetos de fermentação, palha, serragem, esgoto, lixo e restos de comida e glicerol. Biomassa também inclui fontes de carbono, tais como carboidratos (ex., açúcares). Biocombustíveis podem ser substituídos por combustíveis baseados em petróleo. Por exemplo, biocombustíveis são inclusivos de combustíveis de transporte (ex. , gasolina, diesel, combustível de aviação, etc.), combustíveis de aquecimento, e combustíveis geradores de eletricidade. Um biocombustível é uma fonte de energia renovável. Exemplos não limitantes de biocombustíveis incluem biodiesel, hidrocarbonos (ex. , alcanos, alcenos, alcinos, ou hidrocarbonos aromáticos), e alcoóis derivados de biomassa.
O termo comprimento de cadeia de carbono é definido aqui como o número de átomos de carbono em uma cadeia de carbono de um substrato de tioesterase ou um derivado de ácido graxo. O comprimento de cadeia de carbono de uma molécula particular é marcado como Cx , onde o subscrito x se refere ao número de carbonos na cadeia de carbono. Como utilizado aqui, o termo cadeia longa se refere àquelas moléculas que apresentam uma
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105/360 cadeia de carbono de por volta de 15 a por volta de 20 carbonos de comprimento (ex., C15, C16, C17, C18, C19, ou C20). O termo cadeia curta” se refere àquelas moléculas que apresentam uma cadeia de carbono de por volta de 8 a por volta de 14 carbonos 5 de comprimento (ex., C8, C9, C10, C11, ou C12).
O termo fonte de carbono” significa um substrato ou composto apropriado para uso como fonte de carbono para crescimento celular de procarioto ou eucarioto simples. Fontes de carbono podem ser em várias formas, incluindo, porém não 10 limitado a polímeros, carboidratos, ácidos, alcoóis, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos, gases (ex. , CO e CO2), e similares. Esses incluem, por exemplo, vários monossacarídeos tais como glicose, frutose, manose e galactose; oligossacarídeos tais como fruto-oligossacarídeo e galacto-oligossacarídeo; 15 polissacarídeos tais como xilose, e arabinose; dissacarídeos tais como sacarose, maltose e turanose; material celulósico tais como metil celulose e sódio carbóximetil celulose; ésteres de ácido graxo saturados ou insaturados tais como sucinato, lactato e acetato; alcoóis tal como etanol, etc., ou misturas destes. A 20 fonte de carbono pode adicionalmente ser um produto de fotossíntese, incluindo, porém não limitado a glicose. Glicerol pode também ser uma fonte efetiva de carbono. Fontes apropriadas de carbono podem ser geradas a partir de qualquer número de fontes naturais e renováveis, incluindo particularmente biomassa 25 de lixo agrícola, municipal e industrial, contanto que o material possa ser utilizado como um componente de uma fermentação para prover uma fonte de carbono. Fontes de biomassa incluem restos de milho, cana-de-açúcar, Panicum, matéria animal, ou dejetos.
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O termo integração cromossomal” significa o processo pelo qual uma sequência de entrada é introduzida no cromossomo de uma célula hospedeira. Regiões homólogas do DNA transformante alinham com regiões homólogas do cromossomo. Então, a sequência 5 entre as regiões de homologia pode ser substituída pela sequência de entrada em um crossover” duplo (i.e., recombinação homóloga). Em algumas concretizações da presente invenção, seções homólogas de um segmento cromossomal de inativação de uma construção de DNA alinham com as regiões homólogas flanqueadoras 10 da região cromossomal nativa do cromossomo microbiano.
Subsequentemente, a região cromossomal nativa é deletada pela construção de DNA em um crossover” duplo.
O termo ponto de turvação” se refere à temperatura de um líquido na qual os sólidos dissolvidos não estão mais 15 completamente solúveis, precipitando como uma segunda fase e dando ao fluido uma aparência turva. Esse termo é relevante a um número de aplicações com consequência meio ou completamente diferentes. Na indústria petrolífera, ponto de turvação se refere à temperatura abaixo da qual cera ou outros hidrocarbonos 20 pesados cristalizam em um óleo bruto, óleo refinado ou combustível para formar uma aparência turva. A presença de cera solidificada influencia o comportamento de fluxo do fluido, aumentando a tendência de entupimento de filtros/injetores de combustível e outras partes de máquina, causando o acúmulo de 25 cera em superfícies frias (ex., em superfícies de encanamentos ou superfícies de troca de calor), e alterando até as características de emulsificação com água. Ponto de turvação é uma indicação da tendência do óleo de entupir filtros ou pequenos orifícios em temperaturas de operação a frio. O ponto de turvação
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107/360 de um surfactante não iônico ou solução de glicol é a temperatura na qual a mistura começa a separar em duas ou mais fases, logo se tornando turva. Esse comportamento é característico de surfactantes não iônicos contendo cadeias de polioxietileno, que podem exibir solubilidade reversa X comportamento de temperatura em água, e portanto podem turvar em algum ponto com o aumento da temperatura. Glicóis demonstrando esse comportamento são conhecidos como glicóis de ponto de turvação” e são utilizados como inibidores de piçarra. O ponto de turvação é tipicamente também afetado pela salinidade, sendo geralmente menor em fluidos mais salinos.
O termo aditivo para baixar o ponto de turvação” se refere a um aditivo que pode ser adicionado a uma composição para diminuir ou baixar o ponto de turvação da composição, como descrito acima.
O termo condições que permitem a produção de produto” se refere a qualquer condição de fermentação que permite um hospedeiro de produção produzir um produto desejado, tal como acil-CoA ou derivados de ácido graxo incluindo, por exemplo, ácidos graxos, hidrocarbonos, alcoóis graxos, ceras, ou ésteres graxos. Condições de fermentação geralmente contêm muitos parâmetros. Condições exemplares incluem, porém não se limitam a, variações de temperatura, níveis de aeração, variação de pH, e composição de meio (ex., solventes e solutos). Cada uma das condições, individualmente e em combinação, permite que o hospedeiro de produção cresça. Meios exemplares incluem caldos ou géis. Geralmente, um meio apropriado inclui uma fonte de carbono, tais como glicose, frutose, celulose, ou similares, que
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108/360 pode ser metabolizada pelo microorganismo diretamente. Em adição, enzimas podem ser utilizadas no meio para facilitar a mobilização (ex., a depolimerização de amido ou celulose em açúcares fermentáveis) e metabolismo subsequente da fonte de carbono. Para determinar se as condições de cultura são apropriadas para produção de produto, o hospedeiro de produção pode ser cultivado por aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36, 48, ou 72 horas. Durante o cultivo e após o cultivo, amostras podem ser obtidas e analisadas para determinar se as condições de cultura 10 permitem a produção de produto. Por exemplo, os hospedeiros de produção na amostra ou o meio na qual os hospedeiros de produção foram crescidos podem ser testados para a presença do produto desejado. Para testagem da presença de um produto, ensaios, tal como, porém não limitado a, TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS, 15 assim como aqueles providos nos exemplos aqui, podem ser utilizados.
O termo sequência consenso” ou sequência canônica” se refere a uma sequência de aminoácido arquetípica contra a qual todas as variantes de uma proteína ou sequência de interesse são 20 comparadas. Qualquer um dos termos também se refere a uma sequência que apresenta os nucleotídeos que são mais comumente presentes em uma sequência polinucleotídica de interesse. Para cada posição de uma proteína, a sequência consenso dá o aminoácido que é mais abundante naquela posição no alinhamento 25 de sequência.
Como utilizado aqui, o termo mutação consenso” se refere a uma diferença na sequência de um gene inicial e uma sequência consenso. Mutações consenso são identificadas através de
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109/360 comparação de sequências do gene inicial e a sequência consenso resultante de um alinhamento de sequência. Em algumas concretizações, mutações consenso são introduzidas no gene inicial de modo que ele se torna mais similar à sequência consenso. Mutações consenso também incluem mudanças de aminoácidos que alteram um aminoácido em um gene inicial para um aminoácido que é mais frequentemente encontrado em um alinhamento múltiplo de sequência (MSA) naquela posição relativa à frequência daquele aminoácido no gene inicial. Logo, o termo mutação consenso” se refere a qualquer alteração de aminoácido que substitui um aminoácido do gene inicial por um aminoácido que é mais abundante no MSA do que o aminoácido nativo.
O termo substituições conservativas” ou substituições conservadas” se refere a, por exemplo, uma substituição caracterizada pelo fato de uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos serem feitas: substituição de um aminoácido isoleucina, alifático, tais como alanina, valina, leucina, e por outro aminoácido alifático; substituição de uma serina por uma treonina; substituição de uma treonina por uma serina; substituição de um resíduo ácido, tais como ácido aspártico e ácido glutâmico, por outro resíduo ácido;
substituição de um resíduo carregando um grupamento amida, tais como asparagina e glutamina, por outro resíduo carregando um grupamento amida;
troca de um resíduo básico, tais como histidina, lisina e arginina, por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático, tais como triptofano, fenilalanina tirosina, por outro resíduo aromático; ou substituição de aminoácidos pequenos, tais como glicina, alanina, serina, treonina e metionina, por outro aminoácido
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110/360 pequeno.
Substituições de aminoácidos que não alteram de modo geral a atividade específica são conhecidas na arte e são descritos , por exemplo, por H. Neurath e R.L.
Hill, em
The
Proteins,
Academic
Press, Nova Iorque , 1979.
Modificações conservativas úteis incluem Alanina por
Cisteína,
Glicina, ou
Serina; Arginina por
Isoleucina,
Lisina, Metionina, ou Ornitina;
Asparagina por Ácido aspártico,
Glutamina, Ácido glutâmico, ou
Histidina
Ácido aspártico por
Asparagina, Glutamina, ou Ácido glutâmico
Cisteína por Metionina, Serina, ou
Treonina;
Glutamina por Asparagina, Ácido aspártico, ou Ácido glutâmico;
Ácido glutâmico por Asparagina, Ácido aspártico, ou
Glutamina;
Glicina por Ácido aspártico, Alanina, ou Prolina;
Histidina por
Asparagina, ou Glutamina; Isoleucina por Leucina,
Metionina, ou
Valina; Leucina por Isoleucina, Metionina , ou Valina; Lisina por
Arginina, Glutamina,
Ácido glutâmico, Isoleucina, Metionina, ou
Ornitina; Metionina por Cisteína, Isoleucina, Leucina, ou
Valina; Fenilalanina
Treonina, Triptofano, ou 5-fenilprolina;
por Histidina, L-Dopa, Leucina, Metionina,
Tirosina, 3-fenilprolina, 4-fenilprolina,
Prolina por L-1-tioazolidina-4-ácido carboxílico ou D- ou L-1-oxazolidina-4-ácido carboxílico; Serina por Cisteína, Metionina, ou Treonina; Treonina por Metionina, Serina, ou Valina; Triptofano por Tirosina; Tirosina por L-Dopa, Histidina, ou Fenilalanina; e Valina por Isoleucina, Leucina, ou Metionina.
O termo corresponde a” se refere a um resíduo de aminoácido em uma primeira sequência protéica sendo posicionalmente equivalente a um resíduo de aminoácido em uma segunda sequência protéica de referência devido ao fato de que o resíduo na sequência de referência utilizando técnicas de bioinformática,
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111/360 por exemplo, utilizando os métodos descritos aqui para preparação de uma sequência de alinhamento. O resíduo correspondente na primeira sequência protéica é então designado o número de resíduo na segunda sequência protéica de referência. A primeira sequência protéica pode ser análoga à segunda sequência protéica ou não análogo à segunda sequência protéica, apesar de ser preferido que as duas sequências protéicas sejam sequências análogas. Por exemplo, quando a sequência de aminoácido de uma 'TesA de E.coli, na SEQ ID NO:31, é utilizada como uma sequência de referência, cada um dos resíduos de aminoácidos em outra proteína de interesse alinhada ou uma proteína análoga podem ser designados um número de resíduo correspondendo aos números de resíduo correspondendo ao número de resíduo correspondendo aos números de resíduo 1-182 de SEQ ID NO:31. Por exemplo, no ANEXO 11, as sequências de aminoácido alinhadas são referenciadas ou correspondidas com a sequência de uma 'TesA de E.coli. De acordo, uma dada posição em outra tioesterase de interesse, tanto um precursor ou uma tioesterase mutante, pode ser designada uma posição correspondente na sequência 'TesA, utilizando conhecidas técnicas de bioinformática tais como aquelas descritas aqui.
O termo deleção, quando utilizado no contexto de uma sequência de aminoácido, significa uma deleção em ou a remoção de um resíduo da sequência de aminoácido de um proteína precursora, resultando em uma proteína mutante apresentando menos um resíduo de aminoácido quando comparado à proteína precursora. O termo pode também ser utilizado no contexto de uma sequência nucleotídica, que significa uma deleção em ou a remoção de um resíduo da sequência polinucleotídica de um
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112/360 polinucleotídeo precursor.
O termo derivado a partir de” e obtido a partir de” se refere a, no contexto de uma tioesterase precursora, uma tioesterase produzida ou passível de ser produzida por uma cepa do organismo em questão, e também uma tioesterase codificada por uma sequência polinucleotídica isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo tal sequência polinucleotídica. Adicionalmente, os termos se referem a uma tioesterase que é codificada por uma sequência polinucleotídica de origem sintética e/ou de cDNA e que apresenta características de identificação da tioesterase em questão. Para exemplificar, tioesterases derivadas de Enterobacteriacaea se referem àquelas enzimas apresentando atividade de tioesterase que são produzidas naturalmente por Enterobacteriacaea, assim como a tioesterases como aquelas produzidas por fontes de Enterobacteriacaea porém que, através da utilização de técnicas de engenharia genética, são produzidas por organismos não Enterobacteriocaea transformados com um polinucleotídeo codificando a dita tioesterase.
O termo construção de DNA” e DNA transformante” são utilizados intercambiavelmente aqui para se referir a uma DNA utilizado para introduzir sequências em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. Tipicamente uma construção de DNA é gerada in vitro por PCR ou outra(s) técnica(s) apropriada(s) conhecida(s) por aqueles na arte. Em certas concretizações, a construção de DNA contém uma sequência de interesse (ex., uma sequência de entrada). Em algumas concretizações, a sequência está operacionalmente ligada a elementos adicionais tais como
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113/360 elementos de controle (ex., promotores, etc.). Uma construção de DNA pode adicionalmente conter um marcador de seleção. Ela pode também conter uma sequência de entrada flanqueada por regiões de homologia. Em uma concretização adicional, a construção de DNA 5 contém outras sequências não homólogas, adicionadas às extremidades (ex., sequências de enchimento ou flanqueadores).
Em algumas concretizações, as extremidades da sequência de entrada é fechada de modo que a construção de DNA forma um círculo fechado. As sequências transformantes podem ser 10 selvagem, mutante ou modificada. Em algumas concretizações, a construção de DNA contém sequências homólogas ao cromossomo da célula hospedeira. Em outras concretizações, a construção de DNA contém sequências não homólogas. Uma vez que a construção de DNA é montada in vitro ela pode ser utilizada para: 1) inserir 15 sequências heterólogas em uma sequência alvo desejada de uma célula hospedeira; 2) mutagenizar uma região do cromossomo da célula hospedeira (i.e., substituir uma sequência endógena por uma sequência heteróloga); 3) deletar genes alvo; e/ou (4) introduzir um plasmídeo replicante no hospedeiro.
Um polinucleotídeo é dito a codificar um RNA ou um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado através de métodos conhecidos por aqueles versados na arte, ele pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o RNA, o polipeptídeo, ou um fragmento destes. A fita antissenso de tal 25 polinucleotídeo é também dita a codificar as sequências de RNA ou polipeptídicas. Como é conhecido na arte, um DNA pode ser transcrito por uma RNA polimerase para produzir um RNA, e um RNA pode ser transcrito reversamente por uma transcriptase reversa para produzir um DNA. Logo um DNA pode codificar um RNA, e vice
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114/360 versa.
O termo equivalente, nesse contexto, se refere a enzimas tioesterases que são codificadas por um polinucleotídeo capaz de hibridizar com o polinucleotídeo apresentando a sequência de SEQ
ID NO:31, sob condições de estringência de média a máxima. Por exemplo, sendo equivalente significa equivalente madura contém pelo menos menos menos
80%, pelo menos 85%,
92%, pelo menos 93%,
96%, pelo menos 97%
pelo pelo pelo sequência ,
, ,
menos menos menos que uma tioesterase
70%, pelo menos 75%, pelo
90%, pelo menos 91%, pelo
94%, pelo menos 95%, pelo
e/ou pelo
99% menos
98%, menos de identidade de com a sequência de aminoácido de
SEQ
ID NO:31.
Uma éster sintase é um peptídeo capaz de catalisar uma reação bioquímica para produzir ésteres.
Por exemplo, uma éster sintase é um peptídeo que é capaz de participar na conversão de um tioéster em um éster graxo. Em certas concretizações, uma éster sintase converte um tioéster, acil-CoA, em um éster graxo.
Em uma concretização alternativa, uma éster sintase utiliza um tioéster e um álcool como substrato para produzir um éster graxo.
Éster sintases são capazes de utilizar cadeias curtas e longas de acil-CoAs como substrato. Em adição, éster sintases são capazes de utilizar cadeias curtas e longas de alcoóis como substrato. Exemplos não limitantes de éster sintases incluem sintases de cera, sintases de cera-éster, acil-CoA:álcool transacilases, aciltransferases, acil graxo-coenzima:álcool graxo aciltransferases, acil graxo-ACP transacilase, e álcool acetiltransferase. Uma éster sintase que converte um acil-CoA tioéster em uma cera é chamada de cera sintase. Éster sintases
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115/360 exemplares incluem aquelas classificadas sob o número de classificação EC 2.3.1.75. O termo éster sintase” não engloba enzima que também apresentam atividade tioesterase. As que apresentam tanto a atividade de éster sintase quanto a atividade 5 tioesterase são aqui categorizadas como tioesterases.
O termo genes expressos” se referem a genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) e então traduzidos em proteínas, assim como genes que são transcritos em tipos de RNA, tais como RNA transportador (tRNA), RNA ribossomal (rRNA), e RNA 10 regulatório, que não são traduzidos em proteína.
Os termos cassete de expressão” ou vetor de expressão” se referem a uma construção de polinucleotídeo gerada de maneira recombinante ou sintética, com uma série de elementos específicos que permitem a transcrição de um polinucleotídeo 15 particular em uma célula alvo. Um cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plasmidial, vírus, ou fragmento de polinucleotídeo. Tipicamente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, dentre outras 20 sequências, uma sequência polinucleotídica a ser transcrita e um promotor. Em concretizações particulares, vetores de expressão apresentam a habilidade de incorporar e expressar fragmentos polinucleotídicos heterólogos em uma célula hospedeira. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos estão 25 disponível comercialmente. A seleção de vetores de expressão apropriados está dentro do conhecimento daqueles versados na arte. O termo cassete de expressão” é também utilizado intercambiavelmente aqui com construção de DNA”, e seus
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116/360 equivalentes gramaticais.
O termo derivado de ácido graxo”, como utilizado aqui, se refere a uma composição que é derivada a partir de uma via metabólica, cuja via inclui uma reação de tioesterase. Logo, 5 produtos de derivado de ácido graxo podem ser produtos que são, ou são derivados de, ácido graxo ou ésteres graxos que são produtos de uma reação de tioesterase. Derivados de ácido graxo portanto incluem, por exemplo, produtos que são, ou que são derivados a partir de, ácidos graxos que são o produto de reação 10 direto de uma tioesterase, e/ou um éster graxo que é um produto de reação direto de uma tioesterase. Derivados de ácido graxo exemplares incluem, por exemplo, alcoóis de cadeia curta e longa, hidrocarbonos, e alcoóis e ésteres graxos, incluindo ceras, ésteres de ácido graxo, e/ou ésteres graxos. Exemplos não 15 limitantes específicos de derivados de ácido graxo incluem ácidos graxos, metil ésteres de ácido graxo, etil ésteres de ácido graxo, alcoóis graxos, acil-acetatos graxos, aldeídos graxos, aminas graxas, amidas graxas, sulfatos graxos, éteres graxos, cetonas, alcanos, olefinas internas, olefinas terminais, 20 ácidos dicarboxílicos, ácidos ω-dicarboxílicos, diols e ácidos graxos terminais e/ou internos.
O termo enzimas de derivado de ácido graxo” se refere a, coletivamente e individualmente, enzimas que podem ser expressas ou super-expressas na produção de derivados de ácidos graxos.
Essas enzimas podem ser parte de uma via biossintética de ácido graxo. Exemplos não limitantes de sintases de derivados de ácidos graxos incluem sintases de ácido graxo, tioesterases, acil-CoA sintases, acil-CoA redutases, álcool desidrogenases, álcool
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117/360 acil-transferases, acil-CoA redutase formadora de álcool graxo, decarbonilases de ácido graxo, redutases de ácido carboxílico, acetiltransferases de álcool graxo, e éster sintase. Enzimas de derivado de ácido graxo convertem substratos em derivados de 5 ácido graxo. Em certas circunstâncias, um substrato apropriado pode ser um primeiro derivado de ácido graxo, que é convertido por uma enzima de derivado de ácido graxo em um diferente, segundo derivado de ácido graxo.
O termo álcool graxo” se refere a um álcool apresentando 10 a fórmula ROH. Em certas concretizações, um álcool graxo é um álcool feito a partir de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo. Em uma concretização, o grupamento R é de pelo menos por volta de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 carbonos de comprimento. R pode ser cadeia simples ou 15 ramificada. As cadeias simples podem apresentar um ou mais pontos de ramificação. Em adição, as cadeias ramificadas podem incluir ramificações cíclicas, tais como porções ciclopropano ou epóxido. Além disso, R pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, R pode apresentar um ou mais pontos de insaturação.
Em uma concretização, o álcool graxo é produzido biossinteticamente. Alcoóis graxos apresentam muitos usos. Por exemplo, alcoóis graxos podem ser utilizados para produzir químicos especiais. Especificamente, alcoóis graxos podem ser utilizados como biocombustíveis; como solventes de gordura, 25 ceras, gomas, e resinas; me bálsamos, emolientes e loções farmacêuticas; como aditivos de óleo lubrificante; em detergentes e emulsificantes; como agentes de anti-estática e acabamento em tecidos; como plastificantes; como surfactantes não iônicos; e em cosméticos, por exemplos como espessantes.
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O termo peptídeos formadores de álcool graxo” se refere a peptídeos capazes de catalisar a conversão de acil-CoA em álcool graxo, incluindo acil-CoA redutase formadora de álcool graxo (FAR, EC 1.1.1.*), acil-CoA redutase (EC 1.2.1.50) ou álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1). Adicionalmente, alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que alguns peptídeos formadores de álcool graxo irão catalisar outras reações também. Por exemplo, alguns peptídeos de acil-CoA redutase irão aceitar substratos diferentes de ácidos graxos. Tais peptídeos não específicos são, portanto, também inclusos. Sequências polinucleotídicas codificando peptídeos formadores de álcool graxo são conhecidos na arte e tais peptídeos estão disponíveis publicamente.
O termo aldeido graxo” se refere a um aldeido apresentando a fórmula RCHO caracterizada por um grupamento carbonil 15 insaturado (C=O). Em certas concretizações, um aldeído graxo é um aldeído feito a partir de um ácido graxo ou derivado de ácido graxo. Em uma concretização, o grupamento R é pelo menos por volta de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 carbonos de comprimento. R pode ser cadeia simples ou ramificada. As cadeias ramificadas podem apresentar um ou mais pontos de ramificação. Em adição, as cadeias ramificadas podem incluir ramificações cíclicas. Além disso, R pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, R pode apresentar um ou mais pontos de insaturação. Em uma concretização, o aldeído 25 graxo é produzido biossinteticamente. Aldeídos graxos apresentam muitos usos. Por exemplo, aldeídos graxos podem ser utilizados para produzir químicos especiais. Especificamente, aldeídos graxos podem ser utilizados para produzir polímeros, resinas, corantes, aromatizante, plastificantes, perfumes, remédios, e
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119/360 outros químicos. Alguns são utilizados como solventes, preservativos, ou desinfetantes. Alguns compostos naturais e sintéticos, tais como vitaminas e hormônios, são também aldeídos.
Os termos polipeptídeo biossintético de aldeído graxo”, redutase de ácido carboxílico” e CAR” são utilizados aqui intercambiavelmente.
O termo éster graxo” se refere a um éster apresentando mais que 5 átomos de carbono. Em certas concretizações, um éster graxo é um éster feito a partir de um ácido graxo, por exemplo um éster de ácido graxo. Em uma concretização, um éster graxo contém um lado A (i.e., a cadeia de carbono presa ao oxigênio carboxilato) e um lado B (i.e., a cadeia de carbono contendo o carboxilato parental). Em uma concretização particular, quando um éster graxo é derivado a partir de uma via biossintética de ácido graxo, o lado A é contribuído por um álcool, e o lado B é contribuído por um ácido graxo. Qualquer álcool pode ser utilizado para formar o lado A dos ésteres graxos. Por exemplo, o álcool pode ser derivado a partir da via biossintética de ácido graxo. Alternativamente, o álcool pode ser produzido através de vias biossintéticas de ácidos não graxos. Além disso, o álcool pode ser provido de maneira exógena. Por exemplo, o álcool pode ser provido ao caldo de fermentação em exemplos onde o éster graxo é produzido por um organismo. Alternativamente, um ácido carboxílico, tal como um ácido graxo ou um ácido acético, pode ser provido de maneira exógena em exemplos onde o éster graxo é produzido por um organismo que pode também produzir álcool. As cadeias de carbono contendo o lado A ou lado B pode ser de
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120/360 qualquer comprimento. Em uma concretização, o lado A do éster é de pelo menos por volta de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14,
16, 18, ou 20 carbonos de comprimento. O lado B do éster é de pelo menos por volta de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26 carbonos de comprimento. O lado A e/ou o lado B pode ser cadeia simples ou ramificada. As cadeias ramificadas podem apresentar um ou mais pontos de ramificação. Em adição, as cadeias ramificadas podem incluir ramos cíclicos, tais como porções ciclopropano ou epóxido. Além disso, o lado A e/ou lado 10 B pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, o lado A e/ou lado B pode apresentar um ou mais pontos de insaturação. Em uma concretização, o éster graxo é produzido biossinteticamente. Nessa concretização, primeiramente o ácido graxo é ativado. Exemplos não limitantes de ácidos graxos ativados são acil-CoA, 15 acil ACP, acil-AMP, e acil fosfato. Acil-CoA pode ser um produto direto de biossíntese ou degradação de ácido graxo. Em adição, acil-CoA pode ser sintetizado a partir de um ácido graxo livre, um CoA, e uma adenosina nucleotídeo trifosfato (ATP). Um exemplo de uma enzima que produz acil-CoA é uma acil-CoA sintase. Após 20 o ácido graxo ser ativado, ele pode ser prontamente transferido para um nucleófilo recipiente. Nucleófilos exemplares são alcoóis, tiols, aminas, ou fosfatos. Em outra concretização, o éster graxo pode ser derivado a partir de um acil-tioéster graxo e um álcool. Em uma concretização, o éster graxo é uma cera. A 25 cera pode ser derivada a partir um álcool graxo de cadeia longa e um ácido graxo de cadeia longa. Em outra concretização, o éster graxo é um tioéster de ácido graxo, por exemplo acil Coenzima A (acil-CoA) graxa. Em outras concretizações, o éster graxo é um acil pantotenato graxo, uma proteína carreadora acil (acil-ACP),
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121/360 um éster enzima acil graxo, ou mu éster fosfato graxo. Um éster pode ser formado a partir de um intermediário éster enzima acil através de alcólise da ligação éster para formar um novo éster e a enzima livre. Ésteres graxos apresentam muitos usos. Por 5 exemplo, ésteres graxos podem ser utilizados como, ou como componente de, um biocombustível ou um surfactante.
O termo éster graxo X outros derivados de ácido graxo” como utilizado aqui se refere à produtividade proporcional de éster graxo em comparação com a quantidade total de outros 10 derivados de ácido graxo que não são ésteres graxos. Em outras palavras, a quantidade de ésteres graxos é comparada com a quantidade de derivados de ácido graxo diferentes de ésteres graxos.
O termo produtividade de fermentação” ou produtividade” 15 se refere à taxa de produção de produto e é expressa g L-1h-1.
Produtividade Específica é a produtividade normalizada para concentração do produto de catalisação e é expresso como g/g L1h-1g (produto de catalisação)-1.
O termo titulação de fermentação” ou titulação” se refere à concentração de um produto de reação, geralmente expressa como g/L mas também em outras unidades (í.e., molar, massa/massa, massa/volume, ou volume/volume).
O termo produtividade de fermentação” ou produtividade” se refere à quantidade de produto produzido a partir de uma dada 25 quantidade de material bruto e é geralmente expressa como a proporção de massa do produto produzido dividido pela massa de material bruto consumido (g produto/g material bruto). Ele pode
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122/360 também ser expresso como produtividade molar (moles de produto/moles de material bruto).
O termo fração de carbono moderno” se refere ao parâmetro f m” como definido pelo National Institute of Standards and 5 Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B e 4990C, conhecido como padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental se refere a 0,95 vezes a proporção de isótopo 14C /12C HOxI (referenciado a AD 1950). Isso é equivalente de maneira grosseira a madeira pré-Revolução 10 Industrial com decaimento corrigido. Para a biosfera viva atual (material vegetal), fM é por volta de 1.1.
O termo ensaio funcional” se refere a um ensaio que provê uma indicação da atividade de uma proteína. Em concretizações particularmente preferenciais, o termo se refere a um sistema de 15 ensaio na qual uma proteína é analisada para sua habilidade de funcionar na sua capacidade natural. Por exemplo, no caso de enzimas, um ensaio funcional envolve a determinação da eficácia da enzima em catalisar uma reação.
Gene se refere a um polinucleotídeo (ex., um segmento de
DNA), que codifica um polipeptídeo, e inclui regiões precedendo e seguindo as regiões codificantes assim como sequências intercaladas (íntrons) entre segmentos codificantes individuais (éxons).
O termo genes homólogos” se referem a um par de genes de espécies diferentes porém relacionadas, que correspondem uma com a outra e que são idênticas ou similares uma com a outra. O termo engloba genes que são separados pelo processo de especiação
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123/360 durante o desenvolvimento de novas espécies (ex., genes ortólogos), assim como genes que forma separados por duplicação genética (ex., genes parálogos).
O termo proteína endógena se refere a uma proteína que é nativa a ou que ocorre na natureza de uma célula. Polinucleotídeo endógeno” se refere a um polinucleotídeo que está na célula e não foi introduzido na célula utilizando técnicas de engenharia recombinante. Por exemplo, um gene que estava presente na célula quando a célula foi originalmente isolada da natureza. Um gene é ainda considerado endógeno se as sequências de controle, tais como um promotor ou sequências intensificadoras que ativam a transcrição ou tradução, foram alterados através de técnicas recombinantes. Por outro lado, o termo heterólogo” é também utilizado aqui, e se refere a uma proteína ou um polinucleotídeo que não ocorrem na natureza de uma célula hospedeira.
O termo recombinação homóloga” se refere à troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA ou cromossomos pareados em sítios de sequência nucleotídicas idêntica ou quase idêntica. Em certas concretizações, integração cromossomal é recombinação homóloga.
O termo sequências homólogas” como utilizado aqui se refere a uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica apresentando, por exemplo, por volta de 100%, por volta de 99% ou mais, por volta de 98% ou mais, por volta de 97% ou mais, por volta de 96% ou mais, por volta de 95% ou mais, por volta de 94% ou mais, por volta de 93% ou mais, por volta de 92% ou mais, por volta de 91% ou mais, por volta de 90% ou mais, por volta de 88% ou mais, por
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volta de 85% ou mais, por volta de 80% ou mais, por volta de 75%
ou mais, por volta de 70% ou mais, por volta de 65% ou mais, por
volta de 60% ou mais, por volta de 55% ou mais, por volta de 50%
ou mais, por volta de 45% ou mais, ou por volt a de 40% ou mais
de identidade de sequência com outra sequência polinucleotídica ou polipeptídica quando alinhados de maneira ideal para comparação. Em concretizações particulares, sequências homólogas podem reter o mesmo tipo e/ou nível de uma atividade particular de interesse. Em algumas concretizações, sequências homólogas apresentam 85% e 100% de identidade de sequência, enquanto em outras concretizações têm entre 90% e 100% de identidade de sequência. Em concretizações particulares, têm 95% e 100% de identidade de sequência.
Homologia se refere a similaridade de sequência ou identidade de sequência. Homologia é determinada utilizando técnicas padrão conhecidas na arte (veja, ex., Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; programas tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programas da Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI, EUA); e Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395, 1984). Um exemplo não limitante inclui o uso do programa BLAST (Altschul et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997) para identificar sequências que podem ser ditas a ser homólogas. Uma versão recente tais como versão 2.2.16, 2.2.17, 2.2.18, 2.2.19, ou a última versão, incluindo sub-programas tais como blastp para comparações proteína-proteína, blastn para comparações nucleotídeoPetição 870190042648, de 06/05/2019, pág. 129/370
125/360 nucleotídeo, tblastn para comparações proteína-nucleotídeo, ou blastx para comparações nucleotídeo-proteína, e com parâmetros como se segue: Número máximo de sequências retornadas 10.000 ou 100.000; E-value (expectation value” ou valor esperado) de 1e5 2 ou 1e-5, tamanho de palavra 3, matriz de pontuação BLOSUM62, custo de existência de intervalo 11, custo de extensão de intervalo 1, pode ser apropriado. Um E-value de 1e-5, por exemplo, indica a probabilidade de um pareamento homólogo ocorrer aleatoriamente é de por volta de 1 em 10.000, com isso 10 marcando uma alta confiança de homologia verdadeira.
O termo cepa hospedeira” ou célula hospedeira” se refere a um hospedeiro apropriado para um vetor de expressão contendo um DNA da presente invenção.
O termo hibridização” se refere ao processo pelo qual uma fita de polinucleotídeo se junta com uma fita complementar através de pareamento de bases, como conhecido na arte. Uma sequência polinucleotídica é considerada a ser hibridizável seletivamente” com uma sequência polinucleotídica de referência se as duas sequências hibridizam especificamente uma com a outra sob estringência de hibridização e condições de lavagem de moderada a alta. Condições de hibridização são baseadas na temperatura de derretimento ou separação das fitas (Tm) do complexo de ligação ao polinucleotídeo ou sonda. Por exemplo, estringência máxima” tipicamente ocorre a por volta de Tm-5°C (5°C abaixo da Tm da sonda); alta estringência a por volta de
5-10°C abaixo da Tm; estringência intermediária a por volta de
10-20°C abaixo da Tm da sonda; e baixa estringência a por volta de 20-25°C abaixo da Tm. Funcionalmente, condições de máxima
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126/360 estringência podem ser utilizadas para identificar sequências apresentando identidade estrita ou identidade quase estrita com a sonda de hibridização; enquanto uma hibridização de estringência intermediária ou baixa pode ser utilizada para identificar ou detectar sequências polinucleotídicas de homólogos. Condições de hibridização de estringência moderada e alta são bem conhecidos na arte. Um exemplo de condições de alta estringência inclui hibridização a por volta de 42oC em formamida 50%, SSC 5X, solução de Denhardt 5X, SDS 0,5% e 100 pg/mL de DNA carreador desnaturado seguida por lavagem por duas vezes em SSC 2X e SDS 0,5% a temperatura ambiente e duas vezes adicionais em SSC 0,1X e SDS 0,5% a 42oC. Um exemplo de condições de estringência moderada inclui uma incubação durante a noite a 37°C em uma solução consistindo de formamida 20%, SSC 5X (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), solução de Denhardt 5X, 10% de sulfato dextran e 20 mg/mL de DNA de esperma de salmão sonicado desnaturado, seguido por lavagem de filtros em SSC 1X a por volta de 37 °C a por volta de 50°C. Aqueles versados na arte sabem como ajustar a temperatura, força iônica, e outras condições se necessário para acomodar fatores tais como comprimento de sonda e similares.
O termo hidrocarbono se refere a compostos químicos que contém os elementos carbono (C) e hidrogênio (H). Todos hidrocarbonos consistem de um esqueleto de carbono e átomos de hidrogênio anexados àquele esqueleto. Às vezes, o termo é utilizado como a forma reduzida do termo hidrocarbono alifático. Existem essencialmente três tipos de hidrocarbonos: (1) hidrocarbonos aromáticos, que apresentam pelo menos por volta de um anel aromático; (2) hidrocarbonos saturados, também
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127/360 conhecidos como alcanos, que não apresentam ligações duplas, triplas ou aromáticas; e (3) hidrocarbonos insaturados, que apresentam uma ou mais ligações duplas ou triplas entre átomos de carbono e incluem, por exemplo, alcenos (ex., dienos), e alcinos.
O termo idêntico, no contexto de duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, significa que os resíduos nas duas sequências são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima, como medida utilizando uma comparação de sequência ou análise de algoritmo tais como aqueles descritos aqui. Por exemplo, se quando propriamente alinhados, os segmentos correspondentes de duas sequências apresentam resíduos idênticos em 5 de 10 posições, é dito que as duas sequências apresentam uma identidade de 50%. A maior parte de programas de bioinformática reportam identidade de porcentagem sobre regiões de sequência alinhada, que não são tipicamente as moléculas inteiras. Se um alinhamento é longo o suficiente e contém suficientes resíduos idênticos, um valor esperado pode ser calculado, que indica que o nível de identidade no alinhamento é improvável de ocorrer ao acaso.
O termo mutação de melhoramento ou mutação de aumento de desempenho se refere a uma mutação em uma proteína que leva a propriedades alteradas, que confere desempenho melhorado em termos de um alvo e/ou propriedade desejada de uma proteína quando comparada a uma proteína precursora.
O termo inserção, quando usado no contexto de uma sequência polipeptídica, se refere a uma inserção na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo precursor, resultando em um
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128/360 polipeptídeo mutante apresentando um aminoácido que está inserido entre dois aminoácidos contíguos existentes, i.e., resíduos de aminoácidos adjacentes, que estão presentes no polipeptídeo precursor. O termo inserção, quando usado no contexto de uma sequência polinucleotídica, se refere a uma inserção de um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo precursor entre dois nucleotídeos contíguos existentes, i.e., nucleotídeos adjacentes, que estão presentes nos polinucleotídeos precursores.
O termo introduzido se refere a, no contexto de introduzir uma sequência polinucleotídica em uma célula, qualquer método apropriado para transferência da sequência polinucleotídica para dentro da célula. Tais métodos para introdução incluem porém não são limitados a fusão de protoplasto, transfecção, transformação, conjugação, e transdução (veja, ex., Ferrari et al., Genetics, em Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pág. 57-72, 1989).
O termo isolado(a) ou purificado(a) significa um material que é removido a partir de seu ambiente original, por 20 exemplo, o ambiente natural se ele ocorre na natureza, ou um caldo de fermentação se ele é produzido em um meio de fermentação de célula hospedeira recombinante. Um material é dito ser purificado quando ele está presente em uma composição particular em uma concentração maior ou menor que a concentração 25 que existe antes da(s) etapa(s) de purificação. Por exemplo, no que diz respeito a uma composição normalmente encontrada em um organismo que ocorre na natureza ou selvagem, tal composição é purificada quando a composição final não inclui algum material
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129/360 da matriz original. Como outro exemplo, onde a composição é encontrada em combinação com outros componentes em um meio de fermentação de célula hospedeira recombinante, aquela composição é purificada quando o meio de fermentação é tratada de modo a 5 remover algum componente da fermentação, por exemplo, resto celular ou outros produtos de fermentação, através de, por exemplo, centrifugação e destilação. Como outro exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que ocorre na natureza presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo 10 ou polipeptídeo, separado de algum ou todo o material coexistente no sistema natural, é isolado, tanto se tal processo é através de engenharia genética quanto de separação mecânica. Tais polinucleotídeos podem ser partes de vetores. Alternativamente, tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser partes de 15 composições. Tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser considerados isolados porque os vetores ou composições contendo estes não são parte dos seus ambientes naturais. Em outro exemplo, um polinucleotídeo ou proteína é dita a ser purificada se ele dá origem a essencialmente uma banda em um gel 20 de eletroforese ou um blot.
O termo maduro(a), no contexto de uma proteína, significa a forma de uma proteína ou peptídeo que está em sua forma funcional final. Para exemplificar, uma forma madura de uma tioesterase da presente invenção contém os resíduos de 25 aminoácido 1-182 de SEQ ID NO:31.
O termo derivados de ácido graxo modificado se refere a produtos feitos, pelo menos em parte, a partir de uma parte da via biossintética de ácido graxo de uma célula hospedeira
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130/360 recombinante, caracterizado pelo fato do produto diferir do produto feito pela tal célula hospedeira na ausência da tioesterase mutante da invenção. Logo, onde uma tioesterase mutante (ou equivalente desta que ocorre na natureza) é introduzida em uma célula hospedeira recombinante, resultando na produção de um derivado de ácido graxo que apresenta um perfil de produto diferente, por exemplo, uma concentração maior ou menor de certos derivados de ácido graxo apresentando um comprimento específico de cadeia, ou uma concentração maior ou menor de um certo tipo de derivado de ácido graxo, aquele material de ácido graxo é modificado dentro do contexto dessa invenção.
O termo tioesterase mutante ou tioesterase variante se refere a uma tioesterase que contém uma mutação com referência à tioesterase precursora.
O termo mutação se refere a, no contexto de um polinucleotídeo, uma modificação à sequência polinucleotídica resultando em uma alteração na sequência de um polinucleotídeo com referência a uma sequência polinucleotídica precursora. Uma sequência polinucleotídica mutante pode se referir a uma alteração que não muda a sequência de aminoácido codificada, por exemplo, no que diz respeito a otimização de códon para propósitos de expressão, ou que modifique um códon de modo que como resultado em uma modificação da sequência de aminoácido codificada. Mutações podem ser introduzidas em um polinucleotídeo através de qualquer número de métodos conhecidos por aqueles versados na arte, incluindo mutagênese aleatória, mutagênese sítio-específico, mutagênese direcionada por
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131/360 oligonucleotídeo, embaralhamento de genes, técnicas de evolução direcionada, mutagênese combinatorial, mutagênese de saturação de sítio entre outras.
Mutação ou mutado(a) significa, no contexto de uma proteína, uma modificação na sequência de aminoácidos resultando em uma alteração na sequência de uma proteína com referência a uma sequência de proteína precursora. Uma mutação pode se referir a uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido, uma inserção ou uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos. 10 Especificamente, uma mutação pode também ser a substituição de um aminoácido por um aminoácido não natural, ou por um aminoácido modificado quimicamente ou resíduos similares. Uma mutação pode também ser uma truncagem (ex., uma deleção ou interrupção) em uma sequência ou uma sub-sequência a partir da sequência 15 precursora. Uma mutação pode também ser uma adição de uma subsequência (ex., dois aminoácidos ou mais em uma porção, que são inseridos entre dois aminoácidos contíguos em uma sequência de proteína precursora) dentro de uma proteína, ou em qualquer uma das extremidades de uma proteína, com isso aumentando o 20 comprimento da (ou alongando a) proteína. Uma mutação pode ser feita através de modificação da sequência de DNA correspondendo à proteína precursora. Mutações podem ser introduzidas em uma sequência protéica através de métodos conhecidos na arte, por exemplo, através da criação de sequências de DNA sintéticas que 25 codificam a mutação com referência a proteínas precursoras, ou alterando quimicamente a própria proteína. Um mutante como usado aqui é uma proteína contendo uma mutação. Por exemplo, é também possível fazer um mutante através da substituição de uma porção de uma tioesterase com uma sequência selvagem que
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132/360 corresponde a tal porção porém inclui um variação desejada em uma posição específica que ocorre na natureza na sequência selvagem.
Um(a) equivalente que ocorre na natureza”, no contexto da presente invenção, se refere a uma tioesterase que ocorre na natureza, ou uma porção desta, que contém um resíduo que ocorre na natureza, caracterizado pelo fato do resíduo que ocorre na natureza corresponder a uma mutação em 'TesA (ex., uma mutação em SEQ ID NO:31) que introduziu uma propriedade alterada desejada em 'TesA. Exemplos de tioesterases equivalentes que ocorrem na natureza apresentando tais modificações são providas no anexo 12 .
O termo operacionalmente ligado(a)”, no contexto de uma sequência polinucleotídica, se refere à colocação de uma sequência polinucleotídica em uma relação funcional com outra sequência polinucleotídica. Por exemplo, um DNA codificando um líder secretório (ex., um peptídeo sinal) está operacionalmente ligado a um DNA codificando um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou um intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificantes se ele afeta a transcrição da sequência. Um sítio de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se ele está posicionado de modo a facilitar a tradução. De modo geral, operacionalmente ligado(a)” significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguo e na mesma fase de leitura.
O termo região de operon” se refere a um grupo de genes
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133/360 contíguos que são transcritos como uma unidade de transcrição única a partir de um promotor em comum, e são portanto sujeitos a co-regulação. Em algumas concretizações, o operon inclui um gene regulatório.
O termo alinhamento ideal” se refere ao alinhamento que gera a pontuação de alinhamento geral mais alta.
O termo ortólogos” ou genes ortólogos” se referem a genes em espécies diferentes que evoluíram a partir de um gene ancestral comum através de especiação. Tipicamente, ortólogos retém a mesma função durante o curso de evolução. Identificação de ortólogos encontra uso na predição confiável da função gênica em genomas recém sequenciados.
Super-expresso(a)” ou super-expressão” em uma célula hospedeira ocorre se a enzima é expressa na célula em um nível mais alto que o nível na qual ela é expressa em uma célula selvagem correspondente.
O termo parálogo” ou genes parálogos” se referem a genes que são relacionados através de duplicação dentro de um genoma. Enquanto ortólogos retêm a mesma função através do curso de evolução, parálogos desenvolvem novas funções, mesmo que algumas funções sejam geralmente relacionadas à função original. Exemplos de genes parálogos incluem, porém não se limitam a, genes codificando mioglobina e hemoglobina, que surgiram a partir do mesmo ancestral porém desenvolveram funções diferentes.
O termo coeficiente de partição” significa a concentração
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134/360 de equilíbrio de um composto em uma fase orgânica dividida pela concentração em equilíbrio na fase aquosa (ex., em um caldo de fermentação).
Em uma concretização do sistema bifásico descrito aqui, a fase orgânica é formada pelo derivado de ácido graxo durante o processo de produção. Em certas circunstâncias, uma fase orgânica pode também ser provida, por exemplo, uma camada de octano pode ser provida ao caldo de fermentação para facilitar a separação de produto. Quando descrevendo um sistema de duas fases, o coeficiente de partição,
P, é geralmente discutido em termos de logP. Um composto com um logP de 1 se partiria a 10:1 da fase orgânica. Um composto com um logP de -1 se partiria a
1:10 da fase orgânica. Através da escolha de um caldo de fermentação e fase orgânica apropriados, um derivado de ácido graxo com um valor alto de logP irá se separar em fase orgânica mesmo em concentrações muito baixas no recipiente de fermentação.
Os termos percentual de identidade de sequência”, percentual de identidade de sequência de aminoácido”, percentual de identidade de sequência gênica” e/ou percentual de identidade de sequência polinucleotídica”, no que diz respeito a dois polipeptídeos, polinucleotídeos e/ou sequências gênicas (como apropriado), se referem a porcentagem de resíduos que são idênticos nas duas sequências quando as sequências são alinhadas de maneira ideal. Logo, identidade de sequência de aminoácido de 80% significa que 80% dos aminoácidos nas duas sequências polipeptídicas alinhadas de maneira ideal são idênticos.
O termo plasmídeo” se refere a uma construção de DNA dupla
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135/360 fita (ds) circular utilizado como um vetor de clonagem, e que forma um elemento genético auto-replicante extracromossomal em alguns eucariotos ou procariotos, ou se integra ao cromossomo hospedeiro.
O termo tioesterase precursora” se refere a uma proteína tioesterase a partir da qual uma tioesterase mutante da invenção pode ser derivada, através de, por exemplo, meio recombinantes ou químicos. Exemplos de tioesterases precursoras são as que ocorrem na natureza ou tioesterases selvagens de fontes vegetais, animais ou microbianas. Uma tioesterase precursora pode também ser uma tioesterase que não ocorre na natureza. Um exemplo de uma tioesterase que não ocorre na natureza é uma tioesterase feitas através de, por exemplo, mutação aleatória, síntese química, evolução molecular, ou mutagênese sítio dirigida, que pode servir como um ponto de início útil para o desenho e/ou a confecção de tioesterases mutantes da invenção.
Um oligo” é um oligonucleotídeo, tanto que ocorre na natureza como em uma amostra de digestão de restrição purificada, quanto produzido sinteticamente, que é capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese quando colocado sob condições nas quais a síntese de um produto de extensão de oligo que é complementar a uma fita de polinucleotídeo de referência é induzida. Condições apropriadas incluem, por exemplo, a presença de nucleotídeos e um agente indutor tal como uma DNA polimerase, e uma temperatura e pH apropriados. Um oligo é preferencialmente fita simples para eficiência máxima na amplificação, porém pode alternativamente ser dupla fita. Se dupla fita, um oligo pode ser primeiramente tratado para separar suas fitas antes de ser
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136/360 utilizada para preparar produtos de extensão. Em concretizações particulares, um oligo é um oligodeoxirribonucleotídeo. Em certas concretizações preferenciais, um oligo é suficientemente comprido para iniciar a síntese de produtos de extensão na 5 presença de um agente indutor. Os comprimentos exatos de oligos irão depender de um número de fatores, incluindo temperatura, fonte de oligo, e os métodos utilizados para amplificação.
O termo sonda se refere a um oligonucleotídeo, tanto que ocorre na natureza como em um produto de digestão de restrição 10 purificado quanto produzido sinteticamente, recombinantemente ou através de amplificação por PCR, que é capaz de hibridização com outro oligonucleotídeo de interesse. Uma sonda pode ser fita simples ou dupla fita. Sondas são úteis na detecção, identificação e isolamento de sequências gênicas particulares.
É contemplado que qualquer sonda utilizada na presente invenção será marcada com qualquer molécula repórter de modo que é detectável em qualquer sistema de detecção, incluindo, porém não limitado a sistemas de enzima (ex., ELISA ou outros ensaios histoquímicos baseados em enzima), fluorescentes, radioativos, e luminescentes. Não é o intuito que a presente invenção seja limitada a qualquer sistema de detecção ou marcação particulares.
Um hospedeiro de produção é uma célula utilizada para produzir produtos. Como revelado aqui, um hospedeiro de produção 25 é modificado para expressar ou super-expressar genes selecionados, ou para apresentar expressão atenuada de genes selecionados. Exemplos não limitantes de hospedeiros de produção incluem células vegetais, animais, humanas, bacterianas, de
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137/360 leveduras, de cianobactérias, de algas, e/ou fungos filamentosos.
Um promotor é uma sequência polinucleotídica que funciona para direcionar a transcrição de um gene a jusante. Em concretizações preferenciais, o promotor é apropriado à célula hospedeira na qual o gene alvo está sendo expresso. O promotor, juntamente com outras sequências polinucleotídica regulatórias transcricionais e traducionais (também chamadas de sequências controle) é necessário para expressar um dado gene. Em geral, as sequências regulatórias transcricionais e traducionais incluem, porém não são limitadas a, sequências promotoras, sítios de ligação de ribossomo, sequências de início e término de transcrição, sequências de início e término de tradução, e sequências intensificadoras ou ativadoras.
O termo promotores ou intensificadores se referem a sinais de controle de transcrição em eucariotos. Promotores e intensificadores consistem de pequenos arranjos de sequências de DNA que interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição (Maniatás et al., Science, 236:1237, 1987). Elementos promotores e intensificadores foram isolados de uma variedades de fontes eucarióticas incluindo genes em células de levedura, insetos, mamíferos e plantas. Elementos promotores e intensificadores foram também isolados a partir de vírus. Elementos de controle análogo, tais como promotores e intensificadores, são também encontrados em procariotos. A seleção de um promotor e intensificador particular depende do tipo celular utilizado para expressar a proteína de interesse. Alguns promotores e intensificadores eucarióticos e
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138/360 procarióticos apresentam uma vasta variedade de células hospedeiras de produção enquanto outros são funcionais em um subconjunto limitado de células hospedeiras de produção (veja, ex., Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11:287, 1986; Maniatis et al. , 1987, supra). O termo elemento promotor”, promotor” ou sequência promotora” se refere a uma sequência de DNA que funciona como um interruptor que ativa a expressão de um gene. Se o gene é ativado, ele é dito ser transcrito, ou participante na transcrição. A transcrição envolve a síntese de mRNA a partir do gene. O promotor, portanto, serve como um elemento regulatório transcricional e também provê um sítio para iniciação de transcrição do gene em mRNA.
O termo propriedade” se refere a, no contexto de um polinucleotídeo, qualquer característica ou atributo de um polinucleotídeo que pode ser selecionado ou detectado. Essas propriedades incluem, porém não se limitam a, uma propriedade afetando a ligação a um polipeptídeo, uma propriedade conferida em uma célula contendo um polinucleotídeo particular, uma propriedade afetando a transcrição gênica (ex., força do promotor, reconhecimento do promotor, regulação do promotor, função de intensificador), uma propriedade afetando o processamento de RNA (ex., splicing” de RNA, estabilidade de
RNA, conformação de RNA, e modificação pós-transcricional), uma propriedade afetando a tradução (ex., nível, regulação, ligação de mRNA a proteínas ribossomais, modificação pós-traducional).
Por exemplo, um sítio de ligação para um fator transcricional, polimerase, fator regulatório, e similares, de um polinucleotídeo pode ser alterado para produzir características desejadas ou para identificar características indesejadas.
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O termo propriedade se refere a, no contexto de uma proteína, qualquer característica ou atributo de uma proteína que pode ser selecionada ou detectada.
Os termos proteína e polipeptídeo são utilizados intercambiavelmente aqui. O código de 3 letras assim como o código de 1 letra para resíduos de aminoácidos como definido na conformidade com a IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo dessa revelação. É também entendido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de 10 uma sequência polinucleotídica devido à degeneração do código genético. Uma enzima é uma proteína.
Os termos produtividade proporcional e produtividade de porcentagem são utilizados intercambiavelmente aqui. Eles se referem à quantidade de um produto desejado em relação a outros 15 produtos que são dentro da mesma mistura produzidos por um hospedeiro recombinante da presente invenção. Por exemplo, a produtividade proporcional de um produto desejado pode ser melhorado de modo que ele é mais predominante do que outros componentes na mistura de produto para reduzir a dificuldade de 20 purificação. Em outro exemplo, a produtividade proporcional de um produto indesejado (í.e., um componente que irá precisar ser removido do produto desejado) pode ser reduzida de modo que ele é menos predominante do que o componente desejado na mistura de produto para alcançar o mesmo propósito. Produtividades 25 proporcionais são expressas aqui na forma de x X outros derivados de ácido graxo, que compara a quantidade de x, que é um tipo de derivado de ácido graxo (ex., um éster graxo, um derivado de ácido graxo de um comprimento de cadeia particular),
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140/360 e o termo outros derivados de ácido graxo” significa a quantidade agregada de todos derivados de ácido graxo com exceção de x que são produzidos na mesma corrida de experimento, cultura, ou fermentação.
O termo pró-sequência” se refere a uma sequência de aminoácido entre a sequência sinal e proteína madura que é necessária para a secreção da proteína. Clivagem da prósequência pode levar a uma proteína/enzima ativa madura sob certas circunstâncias e condições apropriadas.
O termo recombinante”, quando utilizado para modificar o termo célula” ou vetor” aqui, se refere a uma célula ou vetor que foi modificado através da introdução de uma sequência polinucleotídica heteróloga, ou que a célula é derivada a partir de uma célula então modificada. Logo, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma idêntica dentro das formas nativas (não recombinantes) das células ou expressam, como um resultado de intervenção humana deliberada, genes nativos que são de outro modo expresso anormalmente, sub-expresso ou, de fato, não expresso. Os termos recombinação”, recombinante” e gerando um polinucleotídeo recombinado” se refere geralmente à montagem de dois ou mais fragmentos de polinucleotídeo caracterizado pelo fato da montagem gerar um polinucleotídeo quimérico feito a partir das partes montadas.
O termo segmento regulatório”, sequência regulatória” ou sequência de controle de expressão” se refere a uma sequência polinucleotídica que está operacionalmente ligada com outra sequência polinucleotídica que codifica a sequência de
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141/360 aminoácidos de uma cadeia polipeptídica para efetuar a expressão daquela sequência de aminoácido codificada. A sequência regulatória pode inibir, reprimir, promover, ou mesmo direcionar a expressão da sequência polinucleotídica operacionalmente 5 ligada codificando a sequência de aminoácidos.
O termo marcador de seleção” ou marcador seletivo” se refere a um polinucleotídeo (ex., um gene) capaz de se expressar em uma célula hospedeira, que permite a facilidade de seleção daqueles hospedeiros contendo o vetor. Exemplos de marcadores de 10 seleção incluem porém não se limitam a marcadores antimicrobianos. Logo, o termo marcador de seleção” se refere a um gene que provê uma indicação quando uma célula hospedeira adquire uma sequência de entrada de interesse ou quando alguma outra reação acontece. Tipicamente, marcadores de seleção são 15 genes que conferem resistência antimicrobiana ou uma vantagem metabólica nas células hospedeiras que permitem que as células que contêm as sequências exógenas sejam distinguidas das células que não receberam as sequências exógenas. Um marcador de seleção residente” é um que está localizado no cromossomo do 20 microorganismo a ser transformado. Um marcador de seleção residente codifica um gene que é diferente do marcador de seleção na construção transformante. Marcadores seletivos são conhecidos por aqueles versados na arte. Como indicado acima, o marcador apropriado é um marcador de resistência antimicrobiano, 25 incluindo, por exemplo, ampR; phleoR; specR; kanR; eryR; tetR;
cmpR; e neoR. Veja, ex., Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337, 1995; Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000; e Trieu-Cuot et al., Gene, 23:331-341, 1983. Outros marcadores úteis de acordo com a invenção incluem, porém não se limitam a, marcadores
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142/360 auxotróficos, tais como triptofano; e marcadores de detecção, tais como 6-galactosidase.
O termo sequência nucleotídica codificando marcador de seleção” se refere a uma sequência polinucleotídica que é capaz de se expressar nas células hospedeiras e onde a expressão do marcador de seleção confere às células contendo o gene expresso a habilidade de crescer na presença de um agente seletivo correspondente ou na ausência de um ou mais nutrientes essenciais.
Uma sequência sinal” ou peptídeo sinal” se refere a uma sequência polinucleotídica ou de aminoácidos que participa na secreção das formas maduras ou precursoras de uma proteína. Essa definição de sequência sinal é uma funcional, com o intuito de incluir aquelas sequências de aminoácidos codificadas pela porção N-terminal do gene da proteína, que participa na efetivação da secreção de proteína. Elas estão, geralmente, porém não universalmente, ligada à porção N-terminal de uma proteína precursora. A sequência sinal pode ser endógena ou exógena. A sequência sinal pode ser uma que está normalmente associada com a proteína (ex., tioesterase), ou pode ser uma originada ou derivada a partir de um gene codificando outra proteína secretada. Uma sequência sinal exógena exemplar contém os primeiros sete resíduos de aminoácido da sequência sinal de subtilisina de Bacillus subtílís fusionada com o restante da sequência sinal da subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536). Outra sequência sinal exemplar contém a sequência sinal de TesA que é removida para produzir 'TesA.
O termo substancialmente idêntico”, no contexto de dois
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143/360 polinucleotídeos ou dois polipeptídeos que contém pelo menos 70% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos
75%, pelo menos pelo menos pelo menos
90%, pelo menos
91%, pelo menos
92%, pelo menos
93%, pelo menos
94%, pelo menos
95%, pelo menos
96%, pelo menos
97%, pelo menos
98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência quando comparado a uma sequência de referência utilizando os programas ou algoritmos (ex., BLAST,
ALIGN, CLUSTAL) utilizando parâmetros padrão. Uma indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos pode ser que o primeiro polipeptídeo tenha reação imunologicamente cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, polipeptídeos que diferem por substituições conservativas de aminoácidos apresenta reação imunologicamente cruzada. Logo, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem somente por uma substituição conservativa. Outra indicação de que duas sequências polinucleotídicas são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma com a outra sob condições estringentes (ex., dentro de um espectro de média a máxima estringência).
Substancialmente purificado(a)” significa moléculas que são pelo menos por volta de 60% livre de, preferencialmente pelo menos por volta de 75% livre de, por volta de 80% livre de, por volta de 85% livre de, e mais preferencialmente pelo menos por volta de 90% livre de outros componentes com os quais eles estão naturalmente associados. Como utilizados aqui, o termo purificado(a) ou purificar” também se refere à remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, a remoção de contaminantes pode resultar em um aumento na porcentagem de
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144/360 derivados de ácido graxo de interesse em uma amostra. Por exemplo, após derivados de ácido graxo serem expressos em células hospedeiras de produção de planta, bactéria, levedura, ou mamífero, os derivados de ácido graxo podem ser purificados através de, ex., remoção de proteínas de célula hospedeira de produção. Essa etapa, também chamada de recuperação, envolve a separação e processamento de composição de derivado de ácido graxo de modo que a composição é útil em aplicações industriais, por exemplo, como um combustível ou um químico. Após purificação, a porcentagem de derivados de ácido graxo na amostra é aumentada. O termo purificado não requer pureza absoluta; ao invés, ele tem com intuito ser um termo relativo. Logo, por exemplo, uma preparação de derivados de ácido graxo purificado é uma na qual o produto é mais concentrado que o produto está no seu ambiente dentro de uma célula. Por exemplo, um éster graxo purificado é um que está substancialmente separado de componentes celulares (ex., polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos, e outros peptídeos) que podem acompanhá-lo. Em outro exemplo, uma preparação de éster graxo purificado é uma na qual o éster graxo está substancialmente livre de contaminantes, tais como aqueles que podem estar presentes seguindo fermentação. Por exemplo, um éster graxo é dito ser purificado quando pelo menos por volta de 50% por peso de uma amostra é composta do éster graxo. Em outro exemplo quando pelo menos por volta de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais por peso de uma amostra é composta pelo éster graxo.
Substituição significa substituir um aminoácido na sequência de uma proteína precursora com outro aminoácido em uma posição particular, resultando em um mutante da proteína
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145/360 precursora. O aminoácido utilizado como um substituto pode ser um aminoácido que ocorre na natureza, ou pode ser um aminoácido sintético ou que não ocorre na natureza.
O termo surfactantes se refere a substâncias que são capazes de reduzir a tensão superficial de um líquido no qual eles estão dissolvidos. Eles são tipicamente compostos de uma cabeça solúvel em água e uma cadeia ou cauda de hidrocarbono. A cabeça solúvel em água é hidrofílica e pode ser tanto iônica quanto não iônica. A cadeia de hidrocarbono é hidrofóbica.
Surfactantes são utilizados em uma variedade de produtos, incluindo detergentes e soluções de limpeza, e são também utilizados como auxiliares em tecido, couro e papel, em processos químicos, em cosméticos e remédios, na indústria alimentícia, na agricultura, e na recuperação de óleo. Em adição, eles podem ser utilizados no auxílio na extração e isolamento de óleos brutos que são encontrados em ambientes de difícil acesso ou em emulsões de água. Existem quatro tipos de surfactantes caracterizada através de variação de usos. Surfactantes aniônicos apresentam atividade do tipo detergente e são geralmente utilizados para aplicações de limpeza. Surfactantes catiônicos contêm cadeias longas de hidrocarbonos e são geralmente utilizados no tratamento de proteínas e polímeros sintéticos ou são componentes de amaciantes de roupas e condicionadores de cabelo. Surfactantes anfotéricos também contêm cadeias longas de hidrocarbono e são tipicamente utilizados em xampus. Surfactantes não iônicos são geralmente utilizados em produtos de limpeza.
O termo sintase se refere a uma enzima que catalisa um
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146/360 processo de síntese. Como utilizado aqui, o termo sintase inclui sintases e sintetases.
O termo propriedade alvo se refere a uma propriedade do gene inicial que é intuito ser alterada.
O termo tioesterase se refere a uma enzima que apresenta atividade de tioesterase. Tioesterases incluem tioéster hidrolases, que são identificadas como membros da Enzyme Classification E.C. 3.1.2 e são obtidas a partir de uma variedade de fontes. Tioesterases vegetais são descritas em, por exemplo, Voelker e Davies, J. Bact., Vol., 176, N°. 23, pág. 7320-27,
1994, U.S. Patent No. 5.667.997, e U.S. Patent No. 5.455.167. Tioesterases são também capazes de ser obtidas a partir de fontes microbianas, tais como aquelas descritas em Akoh et al., Prog. Lipid Res., vol. 43, n°. 6, pág. 534-52, 2004; Diczfalusy e
Alexson, Arch. Biochem. Biophys., vol. 334, n°. 1, pág. 104-12, 1996; Larson e Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys., vol. 237, n°. 1, pág. 27-37, 1985; Lawson et al., Biochemistry, vol. 33, n°. 32, pág. 9382-88, 1994; Lee et al., Eur. J. Biochem., vol. 184, n°. 1, pág. 21-28, 1989; Naggert et al., J. Biol. Chem., vol. 266, n°. 17, pág. 11044-50, 1991; Nie et al., Biochemistry, vol. 47, n°. 29, pág. 7744-51, 2008; Seay e Lueking,
Biochemistry, vol. 25, n°. 9, pág. 2480-85, 1986; Spencer et al., J. Biol. Chem., vol. 253, n°. 17, pág. 5922-26, 1978; e Zhuang et al., Biochemistry, vol. 47, n°. 9, pág. 2789-96, 2008. Tioesterases são também capazes de ser obtidas a partir de, por exemplo, fontes de cianobactéria, algas, mamíferos, insetos e fungos. Uma tioesterase pode apresentar atividade diferente da atividade de tioesterase, por exemplo atividade proteolítica ou
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147/360 atividade de hidrólise de éster de oxigênio. Uma tioesterase particularmente útil é a enzima 'TesA (ou tioesterase I) de E. coli, que é uma versão truncada da enzima tioesterase serina TesA completa que é descrita em Cho e Cronan, J. Biol. Chem., vol., 268, n°. 13, pág. 9238-45, 1992. Um polipeptídeo 'TesA de E. coli contém 182 aminoácidos, e é o produto de uma reação de clivagem caracterizado pelo fato da sequência líder de aminoácidos de TesA de E. coli ser removida. A 'TesA de E. coli, por exemplo, apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:31.
O termo atividade de tioesterase” se refere à capacidade de catalisar uma reação de clivagem de tioéster, que geralmente envolve a hidrólise de um tioéster em um ácido e um tiol no grupamento tiol, porém pode também incluir uma etapa de transesterificação na qual a ligação tioéster é clivada e uma nova ligação éster é formada. Em geral, uma acil-ACP tioesterase é capaz de catalisar a clivagem hidrolítica de tioésteres de proteínas carreadoras acil-acil graxo e/ou tioésteres de acilcoenzima A graxo. Exemplos de enzimas apresentando atividade de tioesterase incluem acetil-CoA hidrolase, palmitoil-CoA hidrolase, sucinil-CoA hidrolase, formil-CoA hidrolase, acilCoA hidrolase, palmitoil-proteína tioesterase, e ubiquitina tioesterase. Atividade de tioesterase pode ser estabelecida através de qualquer um dos seguintes ensaios:
Ensaio de Hidrólise de Acil-CoA:
Um tampão Tris-HCl, 0,1 M, pH 8,0; Palmitoil-CoA, 5 μΜ; DTNB, 0,01 M em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0 são utilizados para preparar uma mistura de ensaio completa. A mistura de ensaio então contém uma concentração final de 10 μmol
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148/360 de tampão Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 pmol de DTNB, e 0,01 pmol de palmitoil-CoA. A mistura de ensaio completa é então misturada com a tioesterase, em um volume final de 2,0 mL.
A taxa de clivagem do substrato de acil-CoA é medida através de monitoramento da alteração na absorbância a 405 nm, utilizando um coeficiente de extinção molar de 13.600 M-1cm-1.
Ensaio In vivo:
A tioesterase de interesse é expressa em um hospedeiro apropriado, tal como uma E. coli. Seguindo a expressão da proteína, a cultura é acidificada com 1 N de HCl a um pH final de por volta de 2,5 e então extraída com um volume igual de acetato de etila. Ácidos graxos livres na fase orgânica são derivatizados com hidróxido de tetrametilamônia (TMAH) para gerar os respectivos metil ésteres, que são então analisados em um equipamento de cromatografia a gás com um detector de ionização de chama.
Ensaio de Hidrólise de Tiolactona:
Uma solução de reagente contendo 25 mM de L-homocisteína tiolactona (L-HcyT) e 0,5 mM de 5,5-ditio-bis-2-ácido nitrobenzóico (DTNB) em 0,1 M de tampão HEPES (pH 7,3) é primeiramente preparada. Enzima é então adicionada à solução de reagente e hidrólise de L-HcyT é monitorada através de detecção do grupamento tiol livre com DTNB a 412 nm (ε = 13.600 M-1cm-1 para 5-tio-2-ácido nitrobenzóico).
Ensaio 4-MU-6S-Palm-eGlc:
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Uma mistura de reação contendo 10 pL de enzima tioesterase e 20 pL de solução de substrato é primeiro preparada. A solução de substrato continha 0, 64 mM de MU-6S-Palm-e-Glc, 15 mM de ditiotreitol (DTT), 0,375% (w/v) de Triton X-100, e 0,1 U de β5 glucosidase de amêndoas em tampão fosfato/citrato de McIlvain, pH 4,0. A mistura de reação é incubada por 1 hora a 37°C. βglucosidase exógena de amêndoa é adicionada para hidrolisar o intermediário de reação, MU-6-tio-e-glucosídeo, quantitativamente. A reação de hidrólise é terminada através da 10 adição de 200 pL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,7, contendo 0,025% de Triton X-100, e a fluorescência da metilumbeliferona (MU) liberada é medida em um fluorômetro (λθχ = 372, Xem = 445 nm).
Ensaio de Lisofosfolipase:
Uma mistura de reação contendo 10 pL de tioesterase misturada com 10 pL de 1-oleoil-fosfatidiletanolamina 3 mM, 25 pL de Tris-HCl 100 mM (pH 7,0), e 5 pL de EDTA 5 mM é preparada. A reação é terminada com a adição de 1,5 mL de CHCl3:CH3OH (1:2), seguido pela adição de água para trazer o volume aquoso total 20 para 0,9 mL. A fase orgânica é então analisada através de fina camada de cromatografia com padrões apropriados, utilizando placas preparadas a partir de 40 g de Sílica Gel H suspendida em 95 mL de tetraborato de sódio 1 mM. O sistema de solvente consiste de CHCl3:CH3OH:H2O (95:35:5).
Ensaio de Substrato de Protease:
Uma mistura de reação contendo 10 pL de enzima misturada com 800 pL de Tris-HCl 12,5 mM (pH 8,0) contendo Triton X-100
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0,25% e 10 pL de Cbz-Phe-ONp dissolvido em DMSO é preparado. O p-nitrofenol liberado via clivagem do substrato é medido através de monitoramento da absorbância a 405 nm.
Ensaio de Hidrólise de Acil-PNP Graxo:
Uma solução de reagente contendo Triton X-100 2% em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, e C12-p-nitrofenol (acil-PNP) 10 mM em acetona é primeiramente preparada. Então uma solução de trabalho de C12-PNP é preparado através de mistura de 600 pL de C12-PNP 10 mM em 9,4-mL de tampão fosfato.
O ensaio é desempenhado através da adição de 40 pL da solução de trabalho de acil-PNP em cada poço de uma placa de 96 poços, seguido da rápida adição de 40 pL de enzima. A solução é misturada por 15 segundos, e a alteração de absorbância é lida a 405 nm em um leitor de placa de microtitulação a 25°C.
Formação de Éster a partir de Tioéster:
Uma mistura de reação contendo 1,5 pM de enzima tioesterase, 100 pM de miristoil-CoA, metanol 10% (v/v), e fosfato de sódio mM, pH 7,0 é preparado. A mistura de reação é incubada por 1 hora a 20°C e terminada com a adição de HCl 1 N para baixar o pH 20 para por volta de 2,5. A mistura é extraída com um volume igual de acetato de etila e a quantidade de éster graxo produzido é determinado via GC-MS ou outros métodos padrão tais como GC-FID, LC-MS, ou cromatografia de camada fina.
Formação de Ester a partir de Éster:
Uma mistura de reação contendo 1,5 pM de enzima tioesterase,
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300 μΜ de lauroil-CoA, metanol 10% (v/v), e fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 é preparado. A mistura de reação é incubada por 1 hora a 20°C e terminada com a adição de HCl 1 N para baixar o pH para por volta de 2,5. A mistura é extraída com um volume igual 5 de acetato de etila e a quantidade de lauril éster produzido é determinado via GC-MS ou outros métodos padrão tais como GC-FID, LC-MS, ou cromatografia de camada fina.
O termo célula transformada ou estavelmente transformada” se refere a uma célula que apresenta uma sequência 10 polinucleotídica não nativa (heteróloga) integrada no seu genoma ou como um plasmídeo epissomal que é mantido por pelo menos duas gerações.
O termo proteína de transporte se refere a uma proteína que facilita o movimento de um ou mais compostos para dentro 15 e/ou fora de um organismo ou organela. Em algumas concretizações, uma sequência de DNA exógena codificando uma proteína de transporte ATP-Binding Cassette (ABC) irá ser funcionalmente expressa pelo hospedeiro de produção de modo que o hospedeiro de produção exporta o derivado de ácido graxo no meio de cultura.
Proteínas de transporte ABC são encontradas em muitos organismos, tais como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Alcaligenes eutrophus (mais tarde renomeada Ralstonia eutropha), ou Rhodococcus erythropolis. Exemplos não limitantes de proteínas de transporte ABC incluem CER5, AtMRP5, AmiS2 e 25 AtPGP1. Em uma concretização preferencial, a proteína de transporte ABC é CER5 (ex., AY734542). Em outras concretizações, a proteína de transporte é uma proteína de efluxo selecionada dentre: AcrAB, TolC, ou AcrEF de E. coli ou tll1618, tll1619,
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152/360 e tll0139 de Thermosynechococcus elongatus BP-1. Em concretizações adicionais, a proteína de transporte é uma proteína de transporte de ácido graxo (FATP) selecionado de Drosophila melanogaster, Caenorhabdítís elegans, Mycobacterium tuberculosis, ou Saccharomyces cerevisiae ou qualquer uma das FATPs de mamífero conhecidas na arte. Proteínas de transporte são úteis, por exemplo, no aumento da secreção ou liberação de produtos que não são de outro modo capazes de secretar espontaneamente o produto. Elas são também úteis quando as células hospedeiras engenheiradas são capazes de secretar ou liberar espontaneamente o produto, porém ou a liberação é lenta ou incompleta. Sob aquelas circunstâncias, as proteínas de transporte podem aumentar a secreção através de aceleração da etapa de secreção ou direcionando a secreção até ser completada.
Variante é utilizado intercambiavelmente aqui com mutante.
Vetor se refere a uma construção polinucleotídica desenhada para introduzir polinucleotídeos em um ou mais tipos celulares.
Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de trânsito, plasmídeos, cassetes e similares.
Em algumas concretizações, construção polinucleotídica contém uma sequência polinucleotídica codificando uma tioesterase (ex., uma tioesterase precursora ou madura) que está operacionalmente ligada a uma pró-sequência apropriada (ex., uma pró-sequência secretória) capaz de efetuar a expressão do polinucleotídeo ou gene em um hospedeiro apropriado.
Uma cera é uma substância contendo, pelo menos em parte,
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153/360 ésteres graxos. Em certas concretizações, um éster graxo apresenta um lado A e um lado B, cada contendo cadeias de carbono de média a longa. Em adição a ésteres graxos, uma cera pode conter outros componentes. Por exemplo, uma cera pode conter hidrocarbonos, ésteres esteróis, aldeídos alifáticos, alcoóis, cetonas, beta-dicetonas, triacilgliceróis e similares. Tipicamente uma cera é um sólido a temperatura ambiente, por exemplo, a 20°C.
Selvagem significa, no contexto de gene ou proteína, uma sequência polinucleotídica ou protéica que ocorre na natureza. Em algumas concretizações, a sequência selvagem se refere a uma sequência de interesse que é um ponto de início para engenharia protéica.
Produção de Derivados de Ácido Graxo
De acordo com uma concretização da presente invenção, as tioesterases inéditas da invenção são expressas em uma célula hospedeira que é capaz de converter uma fonte de carbono em um derivado de ácido graxo. A invenção pertence a duas concretizações distintas: (1) a descoberta de que uma tioesterase mutante pode ser utilizada para otimizar e/ou desenhar uma composição de derivado de ácido graxo de modo a tornar tais composições mais úteis e que mutações diferentes irão prover diferentes propriedades alvo; e (2) a descoberta de que a tioesterase irá agir em uma célula hospedeira recombinante para diretamente produzir produtos de ésteres graxos, sem a presença de uma enzima sintase de cera ou éster sintase.
De acordo com uma concretização da invenção, as composições
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154/360 de derivados de ácido graxo produzidos de acordo com os métodos, vetores, e células daqui apresentando propriedades modificadas ou alteradas quando comparado com os derivados de ácido graxo produzidos utilizando células hospedeiras que não contém as variantes de tioesterase da invenção. Por exemplo, como também descrito aqui, utilizando-se as tioesterases da presente invenção, é possível desenvolver processos de manufatura que produzem derivados de ácido graxo, que, em comparação com um processo similar envolvendo uma tioesterase selvagem, apresenta perfil de composição alterados, por exemplo, porcentagem alteradas de uma variação de ou um grupamento acil de comprimento de cadeia de carbono específico, grupamentos acil saturados ou insaturados, posição de insaturações, grupamentos acil ramificados, posição de ramificação, grupamentos hidroxil-acil, grupamentos ceto-acil, proporção de ésteres ou ácidos graxos livres no produto, proporção de derivados de ácido graxo de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, e/ou C14) X cadeia longa (ex., C15, C16, C17, C18, C19, e/ou C20), ou produção de derivados de ácido graxo. De acordo, produtos com várias propriedades desejadas podem ser engenheiradas de modo que eles apresentem otimização de números de cetano, taxas de octanagem, estabilidade oxidativa, lubricidade, pontos de inflamação, viscosidade, pontos de ebulição, pontos de derretimento, pontos de derramamento, pontos de turvação, pontos de entupimento de filtro a frio, características de fluxo a frio, aromaticidade, e/ou números de iodo.
Derivados de ácido graxo são úteis como, ou como componentes de, biocombustíveis e químicos especiais. Derivados de ácido graxo e produtos feitos a partir deles incluem combustíveis,
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155/360 aditivos de combustíveis, mistura de combustíveis, detergentes e surfactantes, suplementos nutricionais, polímeros, substituintes de parafina, lubrificantes, solventes, produtos de higiene pessoal, aditivos de processamento de borracha, inibidores de corrosão, emulsificantes, plásticos, tecidos, cosméticos, produtos de papel, coberturas, fluídos para produtos metálicos, dielétricos, agentes de lubrificação, e emolientes. Os métodos e composições revelados aqui permitem a produção de derivados de ácido graxo com pontos de ramificação, níveis de saturação, e comprimento de cadeia de carbono particulares. Os métodos e composições daqui também permitem a produção de uma proporção mais alta de ésteres graxos X outros produtos, ou alternativamente, uma proporção mais baixa de ésteres graxos X outros produtos, dependendo se uma produtividade proporcional ou de porcentagem mais alta de ésteres graxos ou uma produtividade proporcional ou de porcentagem mais baixa de ésteres graxos é desejada. Especificamente, por exemplo, os métodos e composições daqui permitem a produção de uma maior proporção de ésteres de ácido graxo X ácidos graxos livres, ou em outras palavras, permitem uma produtividade proporcional ou de porcentagem maior de ésteres de ácido graxo X ácidos graxos livres. Alternativamente, por exemplo, os métodos e composições daqui permitem a produção de uma menor proporção de ésteres de ácido graxo X ácidos graxos livres, quando grandes quantidades de ésteres de ácido graxo são desejadas. Além disso, os métodos e composições daqui permitem a produção de uma produtividade melhorada de derivados de ácido graxo.
Exemplos não limitantes de microorganismos que podem ser utilizados como hospedeiros de produção para produzir derivados
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156/360 de ácido graxo incluem cianobactérias, algas, bactérias, leveduras ou fungos filamentosos. Exemplos adicionais não limitantes de hospedeiros de produção apropriados incluem células vegetais, animais e humanas.
Alcoóis (cadeia curta, cadeia longa, ramificado, ou insaturado) podem ser produzidos através de hospedeiros de produção descritos aqui. Tais alcoóis podem ser utilizados como combustível diretamente ou eles podem ser utilizados para criar um éster graxo. Ésteres graxos, sozinhos ou em combinação com 10 outros derivados de ácido graxo descritos aqui, são também úteis como, ou como componentes de, combustíveis.
Similarmente, hidrocarbonos produzidos a partir de hospedeiros de produção descritos aqui podem ser utilizados como, ou como componentes de, biocombustíveis. Tais combustíveis 15 baseados em hidrocarbono podem ser desenhados para conter pontos de ramificação, graus definidos de saturação, e comprimentos específicos de carbono utilizando os ensinamentos providos aqui. Quando utilizados como biocombustíveis sozinho ou em combinação com outros derivados de ácido graxo, os hidrocarbonos podem ser 20 combinados com aditivos apropriados ou outros combustíveis tradicionais (ex., alcoóis, diesel derivado de triglicerídeos, e combustíveis baseados em petróleo).
O número de cetano (CN), viscosidade, ponto de derretimento, e aquecimento de combustão para vários ésteres graxos foram 25 caracterizados em Knothe, Fuel Processing Technology 86:10591070, 2005, que está incorporado aqui por referência na sua íntegra. Um hospedeiro de produção pode ser engenheirado para produzir qualquer um dos ésteres graxos descritos em Knothe,
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157/360 utilizando os ensinamentos providos aqui.
Produção de Derivados de Ácido Graxo e Modificações para Melhoramento de Produção/Produtividade
O hospedeiro de produção utilizado para produzir acil-CoA e/ou derivados de ácido graxo pode ser recombinantemente modificado para incluir sequências polinucleotídicas que superexpressam peptídeos. Por exemplo, o hospedeiro de produção pode ser modificado para aumentar a produção de acil-CoA e reduzir o catabolismo de derivados de ácido graxo e intermediários na via biossintética de ácido graxo, ou para reduzir inibição autógena em pontos específicos na via biossintética de ácido graxo. Em adição à modificação de genes descritos aqui, recursos celulares adicionais podem ser desviados para super-produzir ácidos graxos. Por exemplo, as vias de lactato, sucinato, e/ou acetato podem ser atenuadas, e acetil-CoA carboxilase (acc) pode ser super-expressa. As modificações no hospedeiro de produção descritas aqui podem ser através de alterações genômicas, adição de sistemas de expressão recombinantes, ou combinações destas. Por exemplo, uma ou mais tioesterases endógenas de um hospedeiro de produção particular podem ser modificadas utilizando-se técnicas apropriadas de modo que o tioéster mutante apresenta pelo menos uma propriedade alterada quando comparada ao precursor endógeno de tioesterase, ou de modo que a célula hospedeira exiba pelo menos uma propriedade alterada, quando comparado à mesma célula hospedeira antes dela ser submetida às etapas de alteração genômica.
As vias biossintéticas de ácido graxo envolvidas estão ilustradas nas FIGs. 2-5. Subseções A-G abaixo descrevem as
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158/360 etapas nessas vias. Várias enzimas catalisam várias etapas na via. De acordo, cada etapa é um lugar potencial para superexpressão do gene para produzir mais enzima(s) e então direcionar a produção de mais ácidos graxos e derivados de ácidos graxos.
Genes codificando as enzimas requeridas para a via podem também ser recombinantemente adicionados a um hospedeiro de produção que não possui tais enzimas. Finalmente, etapas que poderiam competir com a via levando à produção de ácidos graxos e derivados de ácido graxo podem ser atenuados ou bloqueados com 10 o intuito de aumentar a produção dos produtos desejados.
De acordo com as revelações daqui, um pessoa com habilidade básica na arte pode utilizar as tioesterases da invenção para preparar microorganismos que produzem derivados de ácido graxo e para manufaturar vários derivados de ácido graxo utilizando 15 tais microorganismos, caracterizado pelo fato de tais derivados de ácido graxo apresentam propriedades alteradas. É adicionalmente possível preparar microorganismos que produzam tais derivados de ácido graxo mais eficientemente através da presença de níveis desejados de produtividade, ou titulação 20 durante fermentações.
A. Acetil-CoA - Malonil-CoA para Acil-ACP
Ácido graxo sintase (FAS) é um grupo de peptídeos que catalisam a iniciação e elongação de cadeias acil (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). A proteína carreadora acil (ACP) juntamente com as enzimas na via FAZ controlam o comprimento, grau de saturação, e ramificação dos ácidos graxos produzidos. As etapas nessa via são catalisadas por enzimas das famílias gênicas da biossíntese de ácido graxo
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159/360 (fab) e acetil-CoA carboxilase (acc). Dependendo do produto desejado, um ou mais desses genes podem ser atenuados ou superexpressos.
I. Via biossintética de ácido graxo: acetil-CoA ou malonilCoA para acil-ACP
A via biossintética de ácido graxo no hospedeiro de produção utiliza os acetil-CoA e malonil-CoA precursores. As etapas nessa via são catalisadas por enzimas das famílias gênicas da biossíntese de ácido graxo (fab) e acetil-CoA carboxilase (acc). Essa via é descrita em Heath et al., Prog. Lipid Res., 40(6):46797, 2001, que está incorporado aqui por referência.
Acetil-CoA é carboxilada pela acetil-CoA carboxilase (Acc, uma enzima com múltiplas subunidades codificadas por quatro genes em separado, accABCD) para formar malonil-CoA. O grupamento malonato é transferido para ACP pela malonil-CoA:ACP transacilase (FabD) para formar malonil-ACP. Uma reação de condensação então ocorre, onde malonil-ACP fusiona com acetilCoA, resultando em β-cetoacil-ACP. β-cetoacil-ACP sintase III (FabH) inicia o ciclo Faz, enquanto β-cetoacil-ACP sintase I (FabB) e β-cetoacil-ACP sintase II (FabF) estão envolvidos em ciclos subsequentes.
Depois, um ciclo de etapas é repetido até que um ácido graxo saturado do comprimento apropriado seja feito. Primeiramente, a β-cetoacil-ACP é reduzida pela NADPH para formar β-hidróxiacilACP. Essa etapa é catalisada pela β-cetoacil-ACP redutase (FabG). β-hidróxiacil-ACP é então desidratada para formar trans2-enoil-ACP. β-hidróxiacil-ACP desidratase/isomerase (FabA) ou
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160/360 β-hidróxiacil-ACP desidratase (FabZ) catalisam essa etapa. NADPH-dependente trans-2-enoil-ACP redutase I, II, ou III (FabI, FabK, ou FabL, respectivamente) reduz trans-2-enoil-ACP para formar acil-ACP. Ciclos subsequentes são iniciados através da condensação de malonil-ACP com acil-ACP pela β-cetoacil-ACP sintase I ou β-cetoacil-ACP sintase II (FabB ou FabF, respectivamente).
II. Modificação da via biossintética de ácido graxo para aumentar a produção de acil-ACP
Organismos hospedeiros de produção podem ser engenheirados para super-produzir acetil-Coa e malonil-CoA. Tais organismos hospedeiros de produção incluem células vegetais, animais e humanas. Microorganismos tais como cianobactérias, algas, bactérias, leveduras, ou fungos filamentosos podem ser utilizados como hospedeiros de produção. Exemplos não limitantes de microorganismos que podem ser utilizados como hospedeiros de produção incluem E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica, Synechococcus, Synechocystis, Clamydomonas, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp.
cepa M-1, Candida lipolytica, e outros microoganismos oleaginosos. Várias modificações diferentes podem ser feitas, tanto em combinação quanto individualmente, no hospedeiro de produção para obter produção aumentada de acetil-CoA/malonilCoA/ácido graxo e derivado de ácido graxo.
Por exemplo, para aumentar a produção de acetil-CoA, um ou mais dos seguintes genes podem ser expressos em um hospedeiros de produção: pdh, panK, aceEF (que codifica os complexos do componente E1p desidrogenase e do componente E2p
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161/360 dihidrolipoamida aciltransferase do piruvato e da
2-oxoglutarato desidrogenase), fabH, fabD, fabG, acpP, e fabF. Em outros exemplos, genes adicionais codificando acil-CoA graxo redutases e aldeído decarbonilases podem ser expressas no hospedeiro de produção. É conhecido na arte que um plasmídeo contendo um ou mais dos genes previamente mencionados, todos sob o controle de um promotor constitutivo, ou de outro modo controlável, pode ser construído. Números de Acesso do GenBank exemplares para esses genes são listados nos parênteses: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (também conhecido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), e fabF (AAC74179).
Adicionalmente, os níveis de expressão de fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, e/ou ackB podem ser atenuados ou eliminados no microorganismo engenheirado através da transformação com plasmídeos condicionalmente replicativos ou não replicativos contendo mutações nelas ou de deleção dos genes correspondentes, ou através da substituição de sequências promotores e de intensificadores. Números de Acesso do GenBank exemplares para esses genes são listados nos parênteses: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), ldhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356), e ackB (BAB81430). Os hospedeiros de produção engenheirados apresentam níveis de produção aumentados de acetil-CoA quando crescidos em um ambiente apropriado.
Além disso, a superprodução de malonil-CoA pode ser afetada pelo engenheiramento do hospedeiro de produção como descrito
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162/360 acima com accABCD (ex., Número de Acesso do GenBank AAC73296, EC 6.4.1.2) incluído no plasmídeo sintetizado de novo. Superprodução de ácido graxo pode ser alcançada através da inclusão adicional de um gene codificando lipase (ex., Números
de Acesso do GenBank CAA89087 e CAA98876) no plasmídeo
sintetizados de novo.
Como um resultado, em alguns exemplos, uma acetil-CoA
carboxilase é super-expressa para aumentar a concentração
intracelular destes em pelo menos por volta de 2 vezes, pelo menos por volta de 5 vezes, ou pelo menos por volta de 10 vezes, relativo aos níveis de expressão nativa.
Em adição, um mutante PlsB (ex., Número de Acesso do GenBank AAC77011) D311E pode ser utilizado para aumentar a quantidade de acil-CoA disponível.
Em adição, super-expressão de um gene sfa (supressor de FabA, ex. , Número de Acesso do GenBank AAN79592) pode ser incluído no hospedeiro de produção para aumentar a produção de ácidos graxos monoinsaturados (Rock et al. , J. Bacteriology, 178:5382-5387, 1996).
B. Acil-ACP e/ou Acil-CoA para Éster Graxo Utilizando Tioesterase
Em um modelo de processo microbiano típico para síntese de ácido graxo, acetil-CoA e malonil-CoA são convertidos através de uma série de etapas para formar as cadeias acil-ACP. Acil-ACP é então convertido via uma série de etapas enzimáticas alternativas para vários produtos finais, incluindo derivados de
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163/360 ácido graxo. Por exemplo, tipicamente acil-ACP é convertido a ésteres graxo através de reações consecutivas combinadas de uma tioesterase, uma acil-CoA ligase/sintetase e um éster sintase. Uma limitação ao uso comercial dessas enzimas em uma via metabólica é a necessidade de produzir o substrato acil-CoA graxo a partir de um precursor de acil ACP graxo, que requer pelo menos duas etapas enzimáticas e o gasto de energia metabólica a partir de duas ligações fosfoanidrido. Uma produção direta de ésteres graxos com tioesterase mitiga a perda de ATP causada por essas 10 duas etapas enzimáticas. Recentemente foi demonstrado que lípases (cujo substrato de álcool natural é água) pode também ser utilizado in vitro para catalisar a reação de transesterificação que faz o biodiesel (i.e. a conversão do triacil glicerídeo e metanol em etil éster de ácido graxo e 15 glicerol). Porém, lípases são geralmente tóxicas às células quando produzidas intracelularmente.
Apesar de apresentar uma especificidade publicada pela água, a presente invenção descreve a descoberta que, na presença de uma quantidade suficiente de um álcool, o álcool pode se 20 tornar um substrato aceitável para uma tioesterase. Naquele caso, tioesterases podem catalisar a alcólise dos intermediários de enzima de acil graxo, igualmente como a lípase faz in vitro. Logo, sob as condições certas, uma enzima que aceita um éster graxo como substrato para formar um intermediário de enzima graxa 25 que é subsequentemente clivado através tanto de hidrólise quanto de transesterificação pode ser utilizada para sintetizar ésteres de ácido graxo desejados se um nível suficiente de um álcool apropriado for provido para direcionar alcólise. Exemplos de enzimas apresentando essa capacidade, que podem produzir ésteres
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164/360 diretamente a partir de acil-ACP inclui, em adição a tioesterases, aciltransferases, lípases, esterases, e proteases. Tioesterases úteis podem ser tioesterases precursoras e/ou que ocorrem na natureza como definida aqui, ou que podem ser tioesterases mutantes preparadas de acordo com as revelações daqui. Alguém com habilidade básica na arte é capaz de determinar a conveniência de uso de uma enzima particular para diretamente produzir ésteres graxos a partir de Acil-ACP. Por exemplo, os ensaios providos no Exemplo 32 são úteis na determinação da produção de éster direta.
De acordo com esse aspecto da invenção, a tioesterase pode ser utilizada para produzir diretamente ésteres graxos tanto na presença ou na ausência de uma éster sintase e/ou uma acil CoA graxa ligase/sintetase. Por exemplo, expressão de uma tioesterase que pode catalisar a produção direta de ésteres graxos em uma cepa de hospedeiro recombinante pode ser utilizada no suplemento da produção de éster graxo onde a cepa também expressa uma éster sintase. Adicionalmente, expressão de uma tioesterase que pode catalisar a produção direta de ésteres graxos em uma célula de hospedeiro recombinante pode ser utilizada onde não existe ou existe baixa expressão da éster sintase.
Uma tioesterase mutante pode ser utilizada que foi modificada para apresentar propriedades alteradas comparadas à tioesterase precursora.
C. Acil-ACP para Ácido Graxo
I. Via biossintética de ácido graxo: acil-ACP para ácidos
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Como descrito acima, acetil-CoA e malonil-CoA são processados em várias etapas para formar cadeias acil-ACP. A enzima sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase (PlsB) catalisa a 5 transferência de um grupamento acil a partir de acil-ACP ou acilCoA para a posição sn-1 do glicerol-3-fosfato. Logo, PlsB é uma enzima reguladora chave na síntese de fosfolipídeo, que é uma parte da via de ácido graxo. A inibição de PlsB leva ao aumento nos níveis de acil-ACP de cadeia longa, cuja regulação autógena 10 irá inibir etapas iniciais na via, que envolvem genes tais como, por exemplo, accABCD, fabH, e fabl. A desconexão dessa regulação, por exemplo através de super-expressão de tioesterase, leva ao aumento da produção de ácido graxo.
II. Modificação da via biossintética de ácido graxo para produzir os tipos ou proporções desejadas de ácidos graxos
De acordo com a invenção, a tioesterase expressa apresenta propriedades alteradas quando comparada à tioesterase nativa ou endógena na cepa hospedeira. Para engenheirar uma hospedeiro de produção para a produção de uma população homogênea de derivados 20 de ácidos graxos, um ou mais genes endógenos podem ser atenuados ou funcionalmente deletados e, como um resultado, uma ou mais tioesterases de acordo com a invenção podem ser expressas. Por exemplo, derivados de ácido graxo C10 (i.e., derivados de ácido graxa cada um contendo uma cadeia de carbono que possui 10 25 carbonos de comprimento) pode ser produzida através de tioesterase atenuada C18 (ex., Números de Acesso do GenBank
AAC73596 e P0ADA1), que utiliza C18:1-ACP, e através da expressão de uma tioesterase alterada que apresenta especificidade para
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166/360 e/ou atividade (ex., taxa catalítica) aumentada no que diz respeito a substratos C10 (i.e., substratos cada um contendo uma cadeia de carbono que tem 10 carbonos de comprimento). Esse resultado em uma população mais homogênea de derivados de ácido 5 graxo que apresentam um aumento em ácidos graxos apresentando uma cadeia de carbono de comprimento de 10. Em outro exemplo, derivados de ácido graxo C12 podem ser produzidos através de atenuação de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não C12 e expressam uma tioesterase alterada que apresenta uma 10 especificidade por e/ou atividade (i.e., taxa catalítica) aumentadas no que diz respeito a substratos C12. Em outro exemplo, derivados de ácido graxo C14 podem ser produzidos através de atenuação de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não C14 e expressam uma tioesterase alterada que apresenta uma 15 especificidade por e/ou atividade (i.e., taxa catalítica) aumentadas no que diz respeito a substratos C14. Em outro exemplo, uma produtividade proporcional mais alta de derivados de ácido graxo de cadeia curta (ex., Cs, C9, C10, C11, C12, C13, e/ou C14) X outros derivados de ácido graxo de cadeias não curtas na mistura 20 de produto. Em ainda outro exemplos, uma produtividade proporcional mais baixa de derivados de ácido graxo de cadeia curta (ex., C8, C9, C10, C11, C12, C13, e/ou C14) X outros derivados de ácido graxo de cadeias não curtas na mistura de produto também pode ser atingida. Em um exemplo adicional, uma produtividade 25 maior e/ou melhorada de derivados de ácido graxo livre pode ser produzida através da expressão de uma tioesterase alterada que apresenta taxa catalítica e/ou produção ou produtividade melhoradas in vivo. Em ainda outro exemplo, uma produtividade proporcional ou de porcentagem maior ou menor de ésteres graxos
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X outros produtos, tais como ácidos graxos livres, pode ser produzida através da aplicação de uma ou mais de certas tioesterases mutantes. A superprodução de acetil-CoA, malonilCoA, e ácido graxo pode ser verificada utilizando-se métodos 5 conhecidos na arte, por exemplo através de precursores radioativos, HPLC, LC-MS, e GC-MS subsequente à lise celular.
Em uma concretização alternativa, uma tioesterase mutante da invenção pode ser expressa na cepa hospedeira em combinação com uma tioesterase endógena. Em ainda outra concretização 10 alternativa, uma ou mais tioesterases endógenas podem ser modificadas utilizando técnicas apropriadas de alteração genômica que são conhecidas por aqueles versados na arte, de modo que tioesterases mutantes apresentam pelo menos uma propriedade alterada quando comparada aos precursores endógenos 15 de tioesterases, e/ou de modo que a célula hospedeira exiba pelo menos uma propriedade alterada quando comparada com a célula hospedeira antes de tais técnicas de alteração genômica terem sido aplicadas.
D. Ácido Graxo para Acil-CoA
I. Conversão de ácidos graxos em acil-CoA
Acil-CoA sintase (ACS) esterifica ácidos graxos livres para acil-CoA através de um mecanismo de duas etapas. Esse ácido graxo livre primeiramente é convertido em um intermediário acil-AMP (um adenilato) através de pirofosforólise de ATP. O carbonil 25 carbono ativado do adenilato é então acoplado ao grupamento tiol de CoA, liberando AMP e o produto final acil-CoA. Veja Shockey et al., Plant Physiol. 129:1710-1722, 2002.
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A enzima ACS FadD de E. coli e a proteína de transporte de ácido graxo FadL são tipicamente componentes importantes de um sistema de absorção de ácido graxo. FadL medeia o transporte de ácidos graxos na célula bacteriana, e FadD medeia a formação de ésteres acil-CoA. Quando nenhuma outra fonte de carbono está disponível, ácidos graxos exógenos são retirados pela bactéria e convertidos em ésteres acil-CoA, que se ligam ao fator de transcrição FadR e desrreprime a expressão dos genes fad que codificam as proteínas responsáveis pelo transporte (FadL), ativação (FadD), e β-oxidação (FadA, FadB, FadE, e FadH) de ácidos graxos. Quando fontes alternativas de carbono estão disponíveis, bactérias sintetizam ácidos graxos como acil-ACPs, que são então utilizados para síntese de fosfolipídeo, ao invés de servir como substrato para β-oxidação. Logo, acil-CoA e acilACP são fontes independentes de ácidos graxos que levam a produtos finais diferentes. Veja Caviglia et al. , J. Biol. Chem., 279(12):1163-1169, 2004.
II.Modificação da via biossintética de ácido graxo para aumentar a conversão de ácidos graxos em acil-CoA
Hospedeiros de produção podem ser engenheirados utilizando peptídeos conhecidos para produzir ácidos graxos de vários comprimentos que podem ser convertidos em acil-CoA. Um método de produção de derivados de ácido graxo envolve o aumento da expressão de, ou expressão de formas mais ativas de, um ou mais peptídeos de acil-CoA sintase (EC 6.2.1.-).
Uma lista de acil-CoA sintases que podem ser expressas para produzir acil-CoA e derivados de ácido graxo é mostrada na Tabela 1. Essas Acil-CoA sintases podem ser examinadas para otimizar
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169/360 qualquer via que utiliza acil-CoAs graxos como substrato. Utilizando bioinformática e genes sintéticos, genes fadD heterólogos podem ser expressos nas cepas de produção e avaliados pela suas capacidades de produzir biodiesel e potencialmente 5 biocrude.
Tabela 1: Acil-CoA sintases
Nome do Gene/Lócus Fonte N- de Acesso do GenBank % de Identidade com FadD de E. coli % de Similaridade com FadD de E. coli
fadD E. coli NP 416319 - -
fadK E. coli YP 416216 28 46
fadD Acinetobacter sp. ADP1 YP 045024 51 70
fadD Haemophilus influenza RdKW20 NP 438551 64 78
BH3103 Bacillus halodurans C-125 NP 243969 40 58
yhfL Bacillus subtilis NP 388908 39 57
pfl-4354 Pseudomonas fluorescens Pfo-1 YP 350082 52 71
EAV15023 Comamonas testosterone KF-1 ZP 01520072 55 72
fadDl Pseudomonas aeruginosa NP 251989 54 72
fadD2 Pseudomonas aeruginosa PAO1 NP 251990 55 72
fadD Rhizobium etli CFN42 YP 533919 55 72
RPC 4074 Rhodopseudomonas palustris Bis B18 YP 533919 56 72
fadD1 Rasltonia solanacearum GMI 1000 NP 520978 56 72
fadDD35 Mycobacterium tuberculosis H37Rv NP 217021 28 46
fadDD22 Mycobacterium tuberculosis H37Rv NP 217464 23 42
PRK0059 Stenotrophomonas maltophilia R551-3 ZP 01644857 59 75
Baseado nos seus graus de similaridade com fadD de E.coli, os seguintes genes homólogos são selecionados para serem sintetizados e avaliados:
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170/360 fadDD35 de M. tuberculosis HR7Rv [NP_217021].
yhfL de B. subtilis [NP_388908].
fadDl de P. aeruginosa PAO1 [NP_251989].
Homólogo de fadD, codificando Faa3p de Saccharomyces cerevisiae [NP 012257].
Acil-CoA sintases de ácido graxo adicionais de organismos eucarióticos, que podem ser utilizados para produzir acil-CoA assim como derivados de ácido graxo, incluem aqueles descritos em Shockey et al. , Plant Physiol., 129: 1710-1722, 2002 (Arabidopsis), Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279: 1163-1169, 2004 (rato), e Knoll et al., J. Biol. Chem., 269(23):16348-56, 1994 (levedura). Sequências gênicas codificando essas sintetases são conhecidas na arte. Veja, ex. , Johnson et al., J. Biol. Chem., 269: 18037-18046, 1994; Shockey et al. , Plant Physiol., 129: 1710-1722, 2002; Black et al. , J. Biol. Chem., 267: 2551325520, 1992. Essas acil-CoA sintases eucarióticas, apesar de não possuírem alta homologia com sequências FadD de E. coli, podem complementar a atividade FadD em mutantes FadD nulos de E. coli.
A. Acil-CoA para Álcool Graxo
1. Conversão de acil-CoA para álcool graxo
Acil-CoA é reduzido a um aldeído graxo por uma NADHdependente acil-CoA redutase (ex., Acr1). O aldeído graxo é então reduzido a um álcool graxo por uma NADPH-dependente álcool desidrogenase (ex. , YqhD). Alternativamente, álcool graxo formador de acil-CoA redutase (FAR) catalisa a redução de uma
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171/360 acil-CoA em um álcool graxo e CoASH. FAR utiliza NADH ou NADPH como um cofator nessa redução de quatro elétrons. Apesar das reações de FAR geradoras de álcool procederem através de um aldeído intermediário, um aldeído livre não é liberado. Logo, os 5 FARs formadores de álcool são distintos das enzimas que conduzem reduções de dois elétrons de acil-CoA e geram aldeído graxo livre como um produto. (Veja Cheng e Russell, J. Biol. Chem., 279(36):37789-37797, 2004; Metz et al. , Plant Physiol., 122:635644, 2000).
2. Modificação de vias biossintéticas de ácido graxo para aumentar a conversão de acil-CoA para álcool graxo
Hospedeiros de produção podem ser engenheirados utilizando polipeptídeos conhecidos para produzir alcoóis graxos a partir de acil-CoA. Um método de obter alcoóis graxos envolve o aumento 15 da expressão de, ou expressão de formas mais ativas de, acilCoA redutase formadora de álcool graxo (codificado por um gene tal como acrl, EC 1.2.1.50/1.1.1), acil-CoA redutases (EC 1.2.1.50), e/ou álcool desidrogenases (EC 1.1.1.1).
Álcoois graxos são geralmente descritos como surfactantes 20 baseados em hidrocarbonos. Eles também servem como componentes apropriados de surfactantes. Para produção de surfactante, o hospedeiro de produção é modificado de modo que ele produza um surfactante a partir de uma fonte renovável de carbono. Tal hospedeiro de produção inclui uma primeira sequência exógena 25 codificando uma proteína capaz de converter um ácido graxo em um aldeído graxo e uma segunda sequência polinucleotídica exógena codificando uma proteína capaz de converter um aldeído graxo em um álcool. Em alguns exemplos, a primeira sequência
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172/360 polinucleotídica exógena codifica uma redutase de ácido graxo. Em uma concretização, a segunda sequência polinucleotídica exógena codifica uma aldeído microssomal redutase de mamífero ou desidrogenase de aldeído de cadeia longa. Em um exemplo adicional, a primeira e segunda sequências polinucleotídicas exógenas são provenientes de Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1, ou Candida lipolytica. Em uma concretização, a primeira e segunda sequências polinucleotídicas heterólogas formam um complexo multienzimático proveniente de Acinetobacter sp. cepa M-1 ou proveniente de Candida lipolytica.
Fontes adicionais de sequências de DNA heterólogas codificando ácido graxo para proteínas convertoras de álcool de cadeia longa que podem ser utilizadas em produção de surfactante incluindo, porém não limitado a, Mortierella alpina (ATCC 32222), Cryptococcus curvatus, (também referido como Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), Acinetobacter sp. HO1-N (ATCC 14987) e Rhodococcus opacus (PD630 DSMZ 44193).
Em um exemplo, o derivado de ácido graxo é um produto surfactante saturado ou insaturado apresentando um comprimento de cadeia de carbono de por volta de 6 a por volta de 36 átomos de carbono, por volta de 8 a por volta de 30 átomos de carbono, por volta de 10 a por volta de 26 átomos de carbono, por volta de 12 a por volta de 20 átomos de carbono, ou por volta de 12 a por volta de 16 átomos de carbono. Em outro exemplo, o produto surfactante apresenta um comprimento de cadeia de carbono de por volta de 10 a por volta de 18 átomos de carbono, ou por volta de
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173/360 a por volta de 14 átomos de carbono.
Hospedeiros de produção para produção de surfactantes incluem microorganismos eucarióticos ou procarióticos. Hospedeiros de produção exemplares incluem Arthrobacter AK 19, 5 Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1, Arabídopsís thalíana, Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, cianobactéria tais como Synechocystis spp. e Synechococcus spp., Algas tal como Clamydomonas, e E. coli engenheirados para superexpressar acetil-CoA carboxilase. Hospedeiros de produção que 10 demonstram uma habilidade inata para sintetizar altos níveis de precursores de surfactantes na forma de lipídeos e óleos, tais como Rhodococcus opacus, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, E. coli engenheirados a expressar acetil CoA carboxilase, e outras cianobactérias, bactérias, leveduras, e 15 fungos oleaginosos podem também ser utilizados.
B. Alcoóis Graxos para Ésteres Graxos
Hospedeiros de produção podem ser engenheirados utilizandose polipeptídeos conhecidos para produzir ésteres graxos de vários comprimentos. Um método de produção de ésteres graxos 20 incluem aumento da expressão de, ou expressão de formas mais ativas de, um ou mais peptídeos de álcool O-acetiltransferase (EC 2.3.1.84). Esses peptídeos catalisam a acetilação de um álcool através da conversão de um acetil-CoA e um álcool em um CoA e um éster. Em alguns exemplos, os peptídeos álcool O25 acetiltransferase podem ser expressos em conjunção com peptídeos tioesterase selecionados, peptídeos FAZ, e peptídeos formadores de álcool graxo, então permitindo o controle de comprimento de cadeia de carbono, níveis de saturação, e graus de ramificação.
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Em alguns casos, o operon bkd pode ser co-expresso com o intuito de produzir precursores de ácido graxo ramificado.
Como utilizado aqui, peptídeos álcool O-acetiltransferase incluem peptídeos no número de classificação de enzimas EC
2.3.1.84, assim como qualquer outro peptídeo capaz de catalisar a conversão de um acetil-CoA e um álcool para formar um CoA e um éster. Adicionalmente, alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que peptídeos álcool O-acetiltransferase podem também catalisar outras reações.
Por exemplo, alguns peptídeos álcool O-acetiltransferase podem aceitar outros substratos em adição a alcoóis graxos e/ou acetil-CoA tioésteres, tais como outros alcoóis e outros acilCoA tioésteres. Tais peptídeos álcool O-acetiltransferase não específicos ou de especificidade divergente são, portanto, também inclusos. Várias sequências peptídicas álcool Oacetiltransferase estão disponíveis publicamente. Ensaios para medição da atividade de peptídeos álcool O-acetiltransferase são conhecidos na arte. Além disso, O-aciltransferases podem ser engenheiradas para registrar novas atividades e/ou especificidades para o grupamento doador acil ou a porção aceptora álcool. Enzimas engenheiradas podem ser geradas através de abordagens racionais e evolucionárias bem documentadas.
C. Acil-CoA para Ésteres Graxos
1. Produção de ésteres graxos
Ésteres graxos são sintetizados por uma acil-CoA:álcool graxo aciltransferase (ex., éster sintase), que conjuga um
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175/360 álcool graxo de cadeia longa com um acil-CoA graxo via uma ligação de éster. Éster sintases e os genes codificantes são conhecidos da planta jojoba e da bactéria Acinetobacter sp. cepa ADP1 (antes conhecida como Acinetobacter calcoaceticus ADP1). A éster sintase bacteriana é uma enzima bifuncional, exibindo atividade éster sintase e a habilidade de formar triacilgliceróis a partir de substratos diacilglicerol e acilCoAs graxos (atividade acil-CoA:diglicerol aciltransferase (DGAT)). O gene wax/dgat codifica tanto éster sintase quanto DGAT. Veja Cheng et al. , J. Biol. Chem., 279(36):37798-37807, 2004; Kalscheuer e Steinbuchel, J. Biol. Chem., 278:8075-8082, 2003. Éster sintases podem também ser utilizadas para produzir certos ésteres graxos que podem ser utilizados como um combustível, tal como biodiesel, como descrito aqui.
2. Modificação da via biossintética de ácido graxo para produzir ésteres graxos utilizando éster sintase
A produção de ésteres graxos, incluindo ceras, a partir de acil-CoA e alcoóis, pode ser engenheirada utilizando polipeptídeos conhecidos. Um método de produção de ésteres graxos incluem o aumento da expressão de, ou expressão de formas mais ativas de, uma ou mais éster sintases (EC 2.3.1.20, 2.3.1.75). Várias sequências peptídicas de éster sintase estão publicamente disponível. Métodos de determinação da atividade de éster sintase são providos em U.S. Patent No. 7.118.896, que é aqui incorporada por referência na sua íntegra.
Em certas concretizações, se o produto desejado é um biocombustível baseado em éster, um hospedeiro de produção pode ser modificado de modo que ele produza um éster a partir de uma
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176/360 fonte de energia renovável. Tal hospedeiro de produção inclui genes exógenos codificando uma éster sintase que é expressa de modo a conferir ao dito hospedeiro de produção a habilidade de sintetizar um éster graxo saturado, insaturado, ou ramificado a partir de uma fonte de energia renovável. Em algumas concretizações, o organismo pode também expressar genes codificando as seguintes proteínas exemplares:
elongases de ácido graxo, acil-CoA redutases, aciltransferases, éster sintases, acil graxo transferases, diacilglicerol aciltransferases, tioesterases, e/ou álcool de cera acil-CoA aciltransferases. Em uma concretização alternativa, o organismo expressa um gene codificando uma éster sintase/acilCoA:diacilglicerol aciltransferase bifuncional. Por exemplo, a éster sintase/acil-CoA:diacilglicerol aciltransferase bifuncional pode ser selecionada a partir de complexos multienzimáticos provenientes de Simmondsia chinensis, Acínetobacter sp. cepa ADP1 (antes conhecida como Acínetobacter calcoaceticus ADP1), Alcanívorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundíbacter jadensis, Arabidopsis thaliana, ou Alcaligenes eutrophus (mais tarde renomeada Ralstonía eutropha). Em uma concretização, elongases de ácido graxo, acil-CoA redutases, ou cera sintases são obtidas e/ou derivadas a partir de um complexo multi-enzimático proveniente de Alcaligenes eutrophus (mais tarde renomeada Ralstonia eutropha) ou outros organismos conhecidos na literatura por produzir ésteres tais como ceras ou ésteres graxos.
Fontes adicionais de sequências de DNA heterólogas codificando proteínas de síntese de éster úteis na produção de éster graxo incluem, porém não são limitados a, Mortierella
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177/360 alpina (ex., ATCC 32222), Cryptococcus curvatus (também referida como Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (ex., T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), Acinetobacter sp. HO1-N, (ex. , ATCC 14987) e Rhodococcus opacus (ex., PD630, DSMZ 44193).
Hospedeiros de produção úteis para produção de ésteres graxos podem ser microorganismos eucarióticos ou procarióticos.
Exemplos não limitantes de hospedeiros de produção para produção de ésteres graxos incluem Saccharomyces cerevisiae,
Synechococcus, Synechocystis, Clamydomonas, Candida lipolytica, 10 E. coli, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins,
Acinetobacter sp. cepa M-1, Candida lipolytica, e outros microorganismos oleaginosos.
Em um exemplo, a éster sintase proveniente de Acinetobacter sp. ADP1 no lócus AAO17391 (descrita em Kalscheuer e Steinbuchel, 15 J. Biol. Chem., 278:8075-8082, 2003, incorporada aqui por referência) é utilizada. Em outro exemplo, a éster sintase proveniente de Simmondsia chinensis no lócus AAD38041 é utilizada.
Em certas concretizações, os ésteres produzidos de acordo com os métodos e composições daqui são secretados ou liberados das células hospedeiras, e então podem ser recuperados extracelularmente. Opcionalmente, um exportador de éster tal como um membro da família FATP pode ser utilizado para facilitar a liberação de ésteres para o ambiente extracelular. Um exemplo 25 não limitante de um exportador de éster apropriado é proteína de transporte de ácido graxo (cadeia longa) CG7400-PA, isoforma A, proveniente de Drosophila melanogaster, no lócus NP_524723.
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D. Acil-ACP, Acil-CoA para Hidrocarbono
1. Hidrocarbonos____provenientes____de____microorganismos particulares
Um conjunto diverso de microorganismos é conhecido por produzir hidrocarbonos, tais como alcanos, olefinas, e isoprenóides. Muitos destes hidrocarbonos são derivados a partir da biossíntese de ácido graxo. A produção desses hidrocarbonos pode ser controlada através do controle dos genes associados com biossíntese de ácido graxo nos hospedeiros de produção nativos.
Por exemplo, a biossíntese de hidrocarbono na alga
Botryococcus braunii ocorre via a decarbonilação de aldeídos graxos. Os aldeídos graxos são produzidos através da redução de tioésteres de acil graxo através de uma enzima tal como a acilCoA graxo redutase. Logo, a estrutura dos alcanos finais podem 15 ser controladas através do engenheiramento de B. braunii para expressar genes específicos, tal como tioesterases, que controlam o comprimento de cadeia de ácidos graxos sendo canalizados para a biossíntese de alcano. A expressão de enzimas que resultam na biossíntese de ácido graxo de cadeia ramificada 20 em B. braunii irá resultar na produção de alcanos de cadeia ramificada. A introdução de genes que afetam a produção de ácidos graxos dessaturados irá resultar na produção de olefinas. Combinações adicionais desses genes podem prover controle adicional sobre a estrutura final dos hidrocarbonos que serão 25 produzidos.
Para produzir altos níveis de hidrocarbonos nativos ou engenheirados, os genes envolvidos na biossíntese de ácidos
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179/360 graxos e seus precursores, ou a degradação de outros produtos podem ser expressos, super-expressos, ou atenuados. Cada uma dessas abordagens podem ser aplicadas na produção de alcanos em Vibrio furnissii M1 e outras cepas de Vibrio furnissii, que 5 produzem alcanos através da redução de alcoóis graxos. Em adição a Vibrio furnissii, outros organismos produtores de alcanos que utilizam a via de ácido graxo podem ser utilizados.
Cada uma dessas abordagens podem também ser aplicadas à produção das olefinas produzidas pelas cepas de Micrococcus 10 leuteus, Stenotrophomonas maltophilia, e microorganismos relacionados. Esses microorganismos produzem olefinas de cadeia longa que são derivadas a partir de condensação cabeça-cabeça de precursores de ácido graxo. O controle da estrutura e nível dos precursores de ácido graxo utilizando os métodos descritos aqui 15 irá resultar na formação de olefinas de diferentes comprimentos de cadeia, características de ramificação, e níveis de saturação.
Cianobactérias podem também ser utilizadas como hospedeiros de produção apropriados para a produção de derivados de ácido 20 graxo tais como alcoóis graxos, ésteres graxos, e hidrocarbonos.
Por exemplo, Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus elongatus PCC7942 podem servir como hospedeiros de produção e podem ser engenheiradas utilizando-se técnicas padrão de biologia molecular (Thiel, Genetic analysis of cyanobacteria, em THE 25 Molecular Biology of Cyanobacteria, Advances in Photosynthesis and Respiration 581-611 (Kluwer Academic Publishers), 1994; Koksharova e Wolk, Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 123-137, 2002, os conteúdos dos quais estão incorporados aqui por referência. Genes da
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180/360 biossíntese de ácido graxo podem ser prontamente identificados e isolados nesses organismos.
Além disso, muitas cianobactérias são produtores naturais de hidrocarbonos, tal como heptadecano, e portanto contêm genes da biossíntese de hidrocarbono que podem ser desregulados e super-expressos em conjunção com a manipulação dos seus genes de biossíntese de ácido graxo, com o intuito de aumentar a produção de hidrocarbono.
Diferentes de outras bactérias, algumas cianobactérias (ex., Synechocystis sp. PCC6803) contêm ácidos graxos poliinsaturados nos seus lipídeos (Murata, Plant cell Physiol., 33: 933-941, 1992), e com isso apresentam a capacidade inerente de produzir derivados de ácido graxo poli-insaturados. Mais importantemente, cianobactérias são organismos fotossintéticos que sintetizam todo carbono celular através da captação de luz solar e fixação de dióxido de carbono. Portanto, derivados de ácido graxo produzidos em cianobactéria são diretamente derivados de CO2.
2. Produzindo hidrocarbonos a partir de redução de 20 alcoóis primários
Hidrocarbonos podem também ser produzidos utilizando oxidoredutases evoluídas para redução de alcoóis primários. Utilização de alcoóis graxos primários para produzir alcanos em microorganismos, tal como Vibrio furnissii M1, é conhecido.
Veja, ex., Park, J. Bacteriol., 187:1426-1429, 2005, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência. Um exemplo de uma oxidoredutase que pode ser utilizada para produzir hidrocarbonos
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181/360 a partir de alcoóis graxos é NAD(P)H-dependente oxidoredutase.
NAD(P)H dependente oxidoredutases sintéticas podem ser produzidas através da utilização de engenharia evolucionária e podem ser expressas em hospedeiros de produção para produzir 5 derivados de ácido graxo.
O processo de evolução de uma álcool graxo redutase para apresentar a atividade desejada é conhecida e praticada por aqueles versados na arte (Kolkman e Stemmer, Nat. Biotechnol., 19:423-8, 2001; Ness et al., Adv. Protein Chem., 55:261-92, 2000;
Minshull e Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:284-90, 1999;
Huisman e Gray, Curr. Opin. Biotechnol., 13:352-8, 2002; U.S.
Patent Publication No. 2006/0195947), os conteúdos de todos os quais estão incorporados aqui por referência.
Uma biblioteca de NAD(P)H-dependente oxidoredutases é 15 gerada através de métodos padrão, tais como PCR suscetível de erros, mutagênese aleatória sítio específica, mutagênese de saturação sítio específica, ou mutagênese específica sítio dirigida. Adicionalmente, uma biblioteca pode ser criada através de embaralhamento de sequências codificantes de NAD(P)H20 dependente oxidoredutase que ocorrem na natureza. A biblioteca é expressa em um hospedeiro de produção apropriado, tal como uma
E. coli. Colônias individuais expressando um membro diferente da biblioteca de oxidoredutase são então analisadas para expressão de uma oxidoredutase que possa catalisar a redução de um álcool 25 graxo.
Por exemplo, cada célula pode ser testada como uma bioconversão de célula inteira, um extrato celular, ou uma célula permeabilizada. Enzimas purificadas a partir da célula podem ser
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182/360 analisadas também. Álcool graxo redutases são identificadas através de monitoramento por espectrofotometria ou fluorometria da oxidação dependente de álcool graxo de NAD(P)H. A produção de alcanos é monitorada através de GC-MS, TLC, ou outros métodos 5 apropriados.
Uma oxidoredutase identificada dessa maneira é utilizada para produzir alcanos, alcenos, e hidrocarbonos ramificados relacionados. Isso é alcançado tanto in vitro quanto in vivo. O último é alcançado através da expressão do gene da álcool graxo 10 redutase evoluída em um organismo que produz alcoóis graxos, tais como os descritos aqui. Os alcoóis graxos agem como substratos para a álcool redutase, que produz alcanos. Outras oxidoredutases podem também ser engenheiradas para catalisar essa reação, tais como aquelas que utilizam hidrogênio 15 molecular, glutationa, FADH, ou outras coenzimas redutivas.
3. Conversão de Acil-ACP em Cetona e/ou Olefinas
Acil-ACP pode ser convertido em uma cetona e/ou uma olefina interna através da ação de enzimas condensadoras de acil, como descrito em PCT Publication No. 2008/147781 A2, as revelações 20 das quais são incorporadas aqui por referência. Como descrito na publicação '781, peptídeos condensadores de acil incluem peptídeos que são capazes de catalisar a condensação de acilACP, acil-CoA, acil-AMP, ácidos graxos, e misturas destes utilizando os métodos descritos lá. Em algumas concretizações, 25 esses peptídeos condensadores de acil apresentam especificidade de substrato alta, média ou baixa. Em certos exemplos, os peptídeos condensadores de acil são mais específicos de substratos e irão somente aceitar substratos de um comprimento
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183/360 de cadeia específica. Adicionalmente, alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que alguns peptídeos condensadores de acil irão catalisar outras reações também. Exemplos de enzimas condensadoras de acil são reveladas na publicação '781. Em 5 adição, a publicação '781 descreve proteínas adenilantes, desidratases, e desidrogenases que podem ser utilizadas na produção de hidrocarbonos tal como olefinas internas.
Organismos recombinantes podem ser engenheirados utilizando polinucleotídeos e proteínas, por exemplo, aqueles revelados na 10 publicação '781, para produzir hidrocarbonos e cetonas alifáticas que apresentam características estruturais definidas (ex., graus de ramificação, níveis de saturação, ou comprimentos de cadeia de carbono). Um método de produção de hidrocarbonos envolve o aumento da expressão de, ou expressão de formas mais 15 ativas de, uma ou mais enzimas condensadoras de acil (enzimas que condensam dois ou mais de acil-CoA, acil-ACP, acil-AMP, aciléster, ácido graxo, ou misturas destes). Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que os produtos produzidos a partir de tais reações de condensação variam dependendo da cadeia acil 20 que é condensada. Produtos que podem ser produzidos incluem, por exemplo, hidrocarbonos e intermediários de hidrocarbono, tal como cetonas alifáticas. As cetonas alifáticas, hidrocarbonos, e intermediários de hidrocarbonos podem ser engenheirados para apresentar características específicas de cadeia de carbono 25 através da expressão de várias enzimas ou atenuação da expressão de várias enzimas no organismo recombinante. De acordo com a presente invenção, as tioesterases mutantes da invenção podem ser utilizadas para manipular a variação de comprimento das cadeias de carbono de espécies acil. Logo, através da utilização
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184/360 de uma tioesterase mutante apresentando uma especificidade ou seletividade de substrato particulares, é possível afetar as reações subsequentes de modo a resultar em um perfil de produto de olefina ou cetona pré-determinado.
Conversão de Ácido Graxo em Aldeído
Ácidos graxos resultantes da clivagem de tioesterase podem ser convertidos em um aldeído através da ação do gene da ácido carboxílico redutase. Aldeídos podem ser produtos úteis por si só, ou eles podem servir como substratos para reações de catálise enzimática adicionais, por exemplo, na produção de alcoóis graxos via uma reação enzimática de álcool desidrogenase, ou na produção de alcanos via uma reação enzimática de decarbonilases. De acordo com as composições e métodos daqui, os substratos de ácido graxo da ácido carboxílico redutase podem ser manipulados de modo a atingir um perfil de produto pré-determinado no produto aldeído ou álcool graxo.
Liberação de Derivados de Ácido Graxo - Com ou Sem Proteínas de Transporte
Como descrito aqui, os derivados de ácido graxo produzidos de acordo com os métodos, composições, vetores, e células hospedeiras aqui podem ser secretados ou liberados espontaneamente de modo permitir recuperação extracelularmente dos produtos de derivado de ácido graxo. A velocidade de secreção espontânea pode ou não ser suficientemente rápida, e o nível de liberação pode ou não ser suficientemente completo. Portanto, opcionalmente, proteínas de transporte podem ser utilizadas para facilitar a exportação de
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185/360 derivados de ácidos graxos para fora do hospedeiro de produção. Proteínas de transporte e efluxo são conhecidas por excretar uma grande variedade de compostos, e podem naturalmente ser modificadas para serem seletivas para tipos particulares de derivados de ácidos graxos. Exemplos não limitantes de proteínas de transporte apropriadas são proteínas de transporte ATPBinding Cassette (ABC), proteínas de efluxo, e proteínas transportadora de ácido graxo (FATP). Exemplos não limitantes adicionais de proteínas de transporte apropriadas incluem as proteínas de transporte ABC proveniente de organismos tais como Caenorhabdítís elegans, Arabídopsís thalíana, Alkalígenes eutrophus, e Rhodococcus erythropolís. Proteínas de transporte ABC exemplares incluem CER5, AtMRP5, AmiS2, ou AtPGP1. Em uma concretização preferencial, a proteína de transporte ABC é uma CER5 (ex., AY734542)). Vetores contendo genes que expressam proteínas de transporte apropriadas podem ser inseridas em hospedeiros de produção de proteína para aumentar ou direcionar a liberação de derivados de ácido graxo.
Produção de produtos de derivados de ácido graxo de acordo com a presente invenção não requer modificação de proteína de transporte ou efluxo e é possível selecionar hospedeiros de produção pela sua habilidade endógena de liberação derivados de ácido graxo. Além disso, simplesmente através da construção de células hospedeiras de acordo com a presente revelação, por exemplo, produtos de derivado de ácido graxo que não são diferentemente conhecidos podem ser secretados ou espontaneamente liberados. A eficiência de produção de produto e liberação no caldo de fermentação podem ser expressas como uma proporção de produto intracelular para produto extracelular. Em
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alguns exemplos, a proporção pode ser de por volta de 100:1,
50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2: 1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5,
1:10, 1:20, 1:30, 1:40 ou 1:50.
Seleção de Características de Cadeia de Carbono de Derivados de Ácidos Graxos
Derivados de ácidos graxos com pontos de ramificação, níveis de saturação, comprimento de cadeia de carbono, e características de éster particulares podem ser produzidos como desejado. Microorganismos que produzem naturalmente derivados particulares podem ser selecionados como hospedeiros de produção, e em certas circunstâncias, enzimas endógenas destes podem ser manipuladas para produzir derivados de ácido graxo de características desejadas. Alternativamente, genes que expressam enzimas que irão produzir derivados de ácido graxo particulares podem ser apropriadamente inseridos nos microorganismos hospedeiros de produção.
Em alguns exemplos, expressão de genes FAZ exógenos originados a partir de diferentes espécies ou variantes engenheiradas pode ser alcançada em um hospedeiro de produção, resultando na biossíntese de ácidos graxos que são estruturalmente diferentes (em, por exemplo, comprimento, nível de ramificação, grau de insaturação, etc.) daqueles do hospedeiro de produção nativo. Esses produtos de gene heterólogo podem também ser selecionados ou engenheirados a não serem afetados por mecanismos regulatórios naturais nas células de hospedeiro de produção, e desse modo permitir controle da produção do produto comercial desejado. Por exemplo, as enzimas FAZ provenientes de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae,
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Streptomyces spp., Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria,
Brevibacteria, Mycobacteria, levedura oleaginosas, ou similares podem ser expressas em um hospedeiro de produção apropriado. A expressão de tais enzimas exógenas irá alterar a estrutura do 5 ácido graxo produzido.
Quando um hospedeiro de produção é engenheirado para produzir um ácido graxo com um nível específico de insaturação, ramificação, ou comprimento de cadeia de carbono, o ácido graxo engenheirado resultante pode ser utilizado na produção de 10 derivados de ácidos graxos. Derivados de ácidos graxos gerados a partir de hospedeiros de produção podem apresentar as características do ácido graxo engenheirado.
Por exemplo, um hospedeiro de produção pode ser engenheirado para gerar ácidos graxos ramificados, de cadeia curta, que podem 15 então ser utilizados pelo hospedeiro de produção para produzir alcoóis graxos ramificados, de cadeia curta. Similarmente, um hidrocarbono pode ser produzido através do engenheiramento de um hospedeiro de produção para produzir um ácido graxo apresentando um nível de ramificação, insaturação, e/ou comprimento de cadeia 20 de carbono definidos, e com isso produzir um população de hidrocarbono homogêneo. Etapas adicionais podem ser empregadas para melhorar a homogeneidade do produto resultante. Por exemplo, quando um álcool insaturado, éster graxo, ou hidrocarbono é desejado, o organismo hospedeiro de produção pode 25 ser engenheirado para produzir baixos níveis de ácidos graxos saturados, e em adição pode ser modificado para expressar uma desaturase adicional e com isso diminuir a produção de produto saturado.
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Porções Ramificadas e Cíclicas
Engenheiramento de derivados de ácidos graxos ramificados e cíclicos
Ácidos graxos são intermediários chave na produção de derivados de ácido graxo. Derivados de ácido graxo contendo pontos de ramificação, porções cíclicas, e combinações destas podem ser preparadas utilizando ácidos graxos ramificados ou cíclicos.
Por exemplo, E. coli produz naturalmente ácidos graxos de cadeia simples (sFAs). Para engenheirar E. coli para produzir ácidos graxos de cadeia ramificada (brFAs), vários genes que provêm precursores ramificados (ex., um operon bkd) podem ser introduzidos no hospedeiro de produção e expressos para permitir a iniciação de biossíntese de ácido graxo a partir de precursores ramificados (ex., fabH). As famílias gênicas bkd, ilv, icm, e fab podem ser expressas ou super-expressas para produzir derivados de ácido graxo de cadeia ramificada. Similarmente, para produzir ácidos graxos cíclicos, genes que provêm precursores cíclicos podem ser introduzidos no hospedeiro de produção e expresso para permitir a iniciação de biossíntese de ácido graxo a partir precursores cíclicos. As famílias gênicas ans, chc, e plm podem ser expressas ou super-expressas para produzir ácidos graxos cíclicos.
Adicionalmente, um hospedeiro de produção pode ser engenheirado para expressar genes codificando proteínas para a elongação de brFAs (ex., genes codificando ACP, FabF, etc.) e/ou para deletar ou atenuar os genes correspondentes de E. coli que
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189/360 normalmente levam a sFAs. Nesse sentido, genes endógenos que iriam competir com os genes introduzidos (ex., fabH, fabF) são deletados ou atenuados.
Os acil-CoA ramificados (ex., 2-metil-butiril-CoA, isovaleril-CoA, isobutiril-CoA, etc.) são os precursores de brFA. Na maioria dos microorganismos contendo brFA, os brFA são sintetizados em duas etapas a partir de aminoácidos ramificados (ex., isoleucina, leucina, ou valina) (Kadena, Microbiol. Rev., 55:288, 1991). Um hospedeiro de produção pode ser engenheirado a expressar ou super-expressar uma ou mais enzimas envolvidas nessas duas etapas para produzir brFAs, ou para super-produzir brFAs. Por exemplo, o hospedeiro de produção pode apresentar uma enzima endógena que pode realizar uma etapa levando a brFA, portanto somente genes codificando enzimas envolvidas na segunda etapa necessitam ser introduzidos recombinantemente.
As tioesterases mutantes da invenção podem ser engenheiradas a apresentar uma ou mais propriedades alteradas, por exemplo, especificidade alterada e/ou atividade aumentada (ex., taxa catalítica), no que diz respeito aos compostos acil20 CoA ou acil-ACP de cadeia ramificada ou cíclica descritos aqui.
De acordo a célula recombinante produzindo derivados de ácido graxo pode ser feita para produzir preferencialmente um produto derivado de ácido graxo de cadeia ramificada ou cíclica desejada que possa apresentar alto valor como produto final.
Formação de ácidos graxos ramificados e derivados de ácido graxo ramificado
A primeira etapa na formação de brFAs é a produção dos
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190/360 α-ceto ácidos correspondentes através de uma aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada. Hospedeiros de produção podem incluir endogenamente genes codificando tais enzimas, ou alternativamente, tais genes podem ser introduzidos recombinantemente. E. coli, por exemplo, expressa endogenamente tal enzima, IlvE (EC 2.6.1.42; N- de Acesso do GenBank YP_026247). Em alguns hospedeiros de produção, uma aminotransferase heteróloga de aminoácido de cadeia ramificada pode não ser expressa. Porém, a IlvE proveniente de E. coli ou qualquer outra aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada (ex., IlvE proveniente de Lactococcus lactis (N° de Acesso do GenBank AAF34406), IlvE proveniente de Pseudomonas putida (N° de Acesso do GenBank NP_745648), ou IlvE proveniente de Streptomyces coelicolor (N° de Acesso do GenBank NP_629657)), se não endógeno, pode ser introduzido. Se uma reação de aminotransferase é limitante de taxa na biossíntese de brFA no organismo hospedeiro de produção escolhido, então a aminotransferase pode ser super-expressa.
A segunda etapa é a decarboxilação oxidativa dos α-ceto ácidos em acil-CoAs de cadeia ramificada correspondentes. Essa reação pode ser catalisada através de um complexo de desidrogenase de α-ceto ácido de cadeia ramificada (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al., J. Bacteriol., 177:3504, 1995), que consiste das subunidades Ε1α/β (decarboxilase), E2 (dihidrolipoil transacilase) e E3 (dihidrolipoil desidrogenase). Esses complexos de desidrogenase de α-ceto ácido de cadeia ramificada são similares aos complexos de desidrogenase de piruvato e α-cetoglutarato. Cada microorganismo que possui brFAs e/ou cresce em aminoácidos de cadeia ramificada pode ser
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191/360 utilizado como uma fonte para isolar genes bkd para expressão em hospedeiros de produção tal como, por exemplo, E. coli. Além disso, E. coli apresenta o componente E3 como parte de seu complexo da piruvato desidrogenase (codificado por, por exemplo, lpd, EC 1.8.1.4, N- de Acesso do GenBank NP_414658), logo pode ser suficiente somente expressar os genes E1 α/β e E2 bkd. Tabela recita exemplos não limitantes de genes bkd a partir de vários microorganismos que podem ser recombinantemente introduzidos e expressos em um hospedeiro de produção para prover precursores de acil-CoA de cadeia ramificada. Microorganismos apresentando tais genes bkd podem também ser utilizados como hospedeiros de produção.
Tabela 2: Genes bkd provenientes de microorganismos selecionados
Organismo Gene N- de Acesso do GenBank
Streptomyces coelicolor bkdAl (E1a) bkdBl (Ε1β) bkdC1 (E2) NP 628006 NP 628005 NP 638004
Streptomyces coelicolor bkdA2 (E1a) bkdB2 (Ε1β) bkdC2 (E2) NP 733618 NP_628019 NP 628018
Streptomyces avermitilis bkdA (E1a) bkdB (E1b) bkdC (E2) BAC72074 BAC72075 BAC72076
Streptomyces avermitilis bkdF (E1a) bkdG (Ε1β) bkdH (E2) BAC72088 BAC72089 BAC72090
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Bacillus subtilis bkdAA (Ε1α) bkdAB (Ε1β) bkdB (E2) NP 390288 NP 390288 NP 390288
Pseudomonas putida bkdAI (Ε1α) bkdA2 (Ε1β) bkdC (E2) AAA65614 AAA65615 AAA65617
Em outro exemplo, isobutiril-CoA pode ser obtida em um hospedeiro de produção, por exemplo em E. coli, através da co-expressão de uma crotonil-CoA redutase (Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1) e isobutiril-CoA mutase (subunidade maior IcmA, EC 5.4.99.2; subunidade menor IcmB, EC
5.4.99.2 ) (Han e Reynolds, J. Bacteriol., 179:5157, 1997). CrotonilCoA é um intermediário na biossíntese de ácido graxo em E. coli e outros microorganismos. Exemplos não limitantes de genes ccr e icm a partir de microorganismos selecionados são dados na Tabela 3.
Tabela 3: Genes ccr e icm provenientes de microorganismos selecionados
Organismo Gene N- de Acesso do GenBank
Streptomyces coelicolor ccr NP 630556
icmA NP_629554
icmB NP 630904
Streptomyces ccr AAD53915
cinnamonensis
icmA AAC08713
icmB AJ246005
Em adição à expressão dos genes bkd, a iniciação da biossíntese de brFA utiliza β-cetoacil-acil-proteína-carreadora sintase III (FabH, EC 2.3.1.41) com especificidade para acilCoAs de cadeia ramificada (Li et al., J. Bacteriol., 187:379515 3799, 2005). Exemplos não limitantes de tais enzimas FabH são
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193/360 listadas na Tabela 4. Genes fabH que são envolvidos na biossintese de ácido graxo de qualquer microorganismo contendo brFA podem ser expressos em um hospedeiro de produção. As enzimas Bkd e FabH provenientes de hospedeiros de produção que não produzem naturalmente brFA podem não suportar a produção de brFA, portanto Bkd e FabH podem ser expressos recombinantemente. Vetores contendo os genes bkd e fabH podem ser inseridos em tal hospedeiro de produção. Similarmente, o nivel endógeno de produção de Bkd e FabH pode não ser suficiente para produzir brFA, portanto, eles podem ser super-expressos. Adicionalmente, outros componentes da via de biossintese de ácido graxo pode ser expressos ou super-expressos, tais como proteínas carreadoras acil (ACPs) e β-cetoacil-acil-proteína-carreadora sintase II (codificado por fabF, EC 2.3.1.41) (exemplos não limitantes de candidatos estão listados na Tabela 4). Em adição à expressão desses genes, alguns genes na via de biossintese de ácido graxo endógena podem ser atenuados no hospedeiro de produção. Genes codificando enzimas que competem por substrato(s) com as enzimas da via que resultam na produção de brFA podem ser atenuados para aumentar a produção de brFA. Por exemplo, em E. coli os candidatos mais prováveis a interferir com a biossintese de brFA são os genes fabH (N2 de Acesso do GenBank NP_415609) e/ou fabF (N2 de Acesso do GenBank NP 415613).
Tabela 4: Genes fabH, ACP e fabF selecionados a partir de microorganismos selecionados com brFAs
Organismo Gene N- de Acesso do GenBank
Streptomyces fabHl NP 62 6634
coelicolor
ACP NP 626635
fabF NP 626636
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Streptomyces avermitilis fabH3 fabC3 (ACP) fabF NP 823466 NP 823467 NP 823468
Bacillus subtilis fabH A fabH_B ACP fabF NP 389015 NP 388898 NP 389474 NP 389016
Stenotrophomonas maltophilia SmalDRAFT 0818 (fabH) SmalDRAFT 0821 (ACP) SmalDRAFT 0822 (fabF) ZP 01643059 ZP 01643063 ZP 01643064
Legionella pneumophila FabH ACP fabF YP 123672 YP 123675 YP 123676
Como mencionado abaixo, alcoóis de cadeia ramificada podem ser produzidos através da combinação de genes expressos que suportam a síntese de brFA e síntese de álcool. Por exemplo, quando um gene codificando um álcool redutase, tal como acr1 proveniente de Acinetobacter baylyi ADP1, é co-expresso com um operon bkd em uma célula hospedeira de E. coli, a célula hospedeira pode sintetizar isopentanol, isobutanol, ou 2-metil butanol. Similarmente, quando acrl é co-expresso como os genes ccr/icm em uma célula hospedeira de E. coli, a célula hospedeira 10 pode sintetizar isobutanol.
Formação de ácidos graxos cíclicos e derivados de ácido graxo cíclico
Para converter um hospedeiro de produção tal como uma E.
coli em um organismo capaz de sintetizar ácidos graxos ω-cíclicos
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195/360 (cyFA), um gene que provê o precursor cíclico ciclohexilcarbonil-CoA (CHC-CoA) (Cropp et al. , Nature Biotech., 18:980-983, 2000) é introduzido e expresso no hospedeiro de produção. Uma conversão similar é possível para outros hospedeiros de produção, ou exemplo, bactéria, levedura e fungos filamentosos.
Exemplos não limitantes de genes que provêm CHC-CoA em E. coli incluem: ansJ, ansK, ansL, chcA, e ansM proveniente do aglomerado gênico de ansatrienina de Streptomyces collínus (Chen et al., Eur. J. Biochem., 261: 98-107, 1999), ou plmJ, plmK, plmL, chcA, e plmM proveniente do aglomerado gênico de foslactomicina B de Streptomyces sp. HK803 (Palaniappan et al. , J. Biol. Chem., 278:35552-35557, 2003) juntamente com o gene chcB (Patton et al., Biochem., 39:7595-7604, 2000) proveniente de S. collinus, S. avermitilis, ou S. coelicolor (veja Tabela 5 para Nü de Acesso do GenBank). Os genes listados abaixo na Tabela 4 podem então ser expressos para permitir a iniciação e elongação dos ácidos graxos ω-cíclicos. Alternativamente, os genes homólogos podem ser isolados a partir de microorganismos que produzem cyFA e expressam em E. coli.
Tabela 5: Genes para a síntese de CHC-CoA
Organismo Gene N- de Acesso do GenBank
Streptomyces collinus ansJK U72144*
ansL
chcA
ansM
chcB AF268489
Streptomyces HK803 sp. pmlJK AAQ84158
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pmlL AAQ84159
chcA AAQ84160
pmlM AAQ84161
Streptomyces coelicolor chcB/caiD NP 629292
Streptomyces avermitilis chcB/caiD NP 629292
*Somente chcA é anotado no GenBank entry U72144, ansJKLM são de acordo com Chen et al., Eur. J. Biochem., 261:98-107, 1999.
Os genes listados na Tabela 4 (fabH, ACP, e fabF) são suficientes para permitir a iniciação e elongação dos ácidos graxos ω-cíclicos porque eles tipicamente apresentam ampla especificidade de substrato. Se a co-expressão de qualquer um desses genes com os genes ansJKLM/chcAB ou pmlJKLM/chcAB da Tabela 5 não gera cyFA, então homólogos fabH, ACP, e/ou fabF a partir de microorganismos que geram cyFAs podem ser isolados (ex. , através da utilização de oligos de PCR degenerados ou sonda de sequência de DNA heterólogo) e co-expressos. Tabela 6 lista exemplos não limitantes de microorganismos que contêm ácidos graxos ω-cíclicos.
Tabela 6: Exemplos não limitantes de microorganismos que contêm ácidos graxos ω-cíclicos
Organismo Referência
Curtobacterium pusillum ATCC19096
Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC49025
Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009
Alicyclobacillus cycloheptanicus * Moore, J. Org. Chem., 62:pp. 2173, 1997.
*Utiliza cicloheptilcarbonil-CoA e não ciclohexilcarbonilPetição 870190042648, de 06/05/2019, pág. 201/370
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CoA como precursor para biossíntese de cyFA.
Saturação
Ácidos graxos são os intermediários chave na produção dos derivados de ácido graxo. Os graus de saturação nos derivados de ácido graxo podem ser controlados através da regulação dos graus de saturação dos intermediários de ácido graxo. As famílias gênicas sfa, gns, e fab podem ser expressas ou super-expressas para controlar a saturação de ácidos graxos.
Hospedeiros de produção podem ser engenheirados para 10 produzir ácidos graxos insaturados através do engenheiramento do hospedeiro de produção para super-expressar fabB, ou através do crescimento do hospedeiro de produção a temperaturas baixas (ex., menos que 37°C). FabB apresenta preferência por cis-δ3 decenoil-ACP, e resulta na produção de ácido graxo insaturado em 15 E. coli. Super-expressão do gene fabB resulta na produção de uma porcentagem significativa de ácidos graxos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol. Chem., 258:2098-101, 1983). O gene fabB pode ser inserido em e expresso nos hospedeiros de produção que não apresentam naturalmente o gene. Esses ácidos graxos 20 insaturados podem então ser utilizados como intermediários nos hospedeiros de produção que são engenheirados para produzir derivados de ácido graxo, tais como alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, olefinas, alcanos, e similares.
Alternativamente, repressores da biossíntese de ácido 25 graxo, por exemplo, um repressor (N° de Acesso do GenBank
NP_418398 ) codificado por fabR, pode ser deletado. Isso também irá resultar em produção aumentada de ácido graxo insaturado em
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E. coli (Zhang et al. , J. Biol. Chem., 277:15558, 2002). Deleções similares podem ser feitas em outros hospedeiros de produção. Aumento adicional em ácidos graxos insaturados podem ser alcançados, por exemplo, através da super-expressão de fabM (codificando trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerase, N- de Acesso do GenBank DAA05501) e expressão controlada de fabK (codificando trans-2-enoil-ACP redutase II, N- de Acesso do GenBank NP_357969) proveniente de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem., 277: 44809, 2002), enquanto deletando fabI de E.
coli (codificando trans-2-enoil-ACP redutase, N_ de Acesso do GenBank NP_415804). Adicionalmente, para aumentar a porcentagem dos ésteres graxos insaturados, o hospedeiro de produção pode também super-expressar fabB (codificando β-cetoacil-ACP sintase I, N_ de Acesso do GenBank BAA16180, EC:2.3.1.41), sfa (codificando um supressor de fabA, N_ de Acesso do GenBank AAC44390), e gnsA e gnsB (ambos codificando supressores mutante nulos secG, N- de Acesso do GenBank ABD18647.1 e N- de Acesso do GenBank AAC74076.1, respectivamente). Em alguns exemplos, o gene endógeno fabF pode ser atenuado, com isso aumentando o 20 porcentagem do palmitoleato (C16:1) produzido.
As tioesterases mutantes da invenção podem ser engenheiradas para apresentar propriedades alteradas, por exemplo, especificidade alterada e/ou atividade aumentada, no que diz respeito a compostos acil-CoA ou acil-ACP substituído ou 25 não substituído que são preparados como descritos aqui. De acordo a célula recombinante produzindo derivados de ácido graxo podem ser feitas para produzir preferencialmente um perfil de saturação desejado em um produto de derivado de ácido graxo que podem apresentar alto valor como um produto final.
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Comprimentos de Cadeia e Características de Éster
Comprimentos de cadeia e produção de cadeias de número ímpar
Os métodos descritos aqui permitem a produção de ésteres graxos e derivados de ácido graxo de comprimentos de cadeia variada através da seleção de uma tioesterase mutante apropriada que apresenta especificidade e/ou seletividade por um substrato de um comprimento de cadeia de carbono específico. Através da expressão das tioesterases específicas, ácidos graxos e derivados de ácido graxo apresentando comprimentos de cadeia de carbono desejado podem ser produzidos. Em algumas concretizações, uma tioesterase endógena pode ser mutada utilizando técnicas de alteração genômica conhecidas. Ou, um gene codificando uma tioesterase particular pode ser introduzido heterologamente em um hospedeiro de produção de modo que um ácido graxo ou derivado de ácido graxo de um comprimento de cadeia de carbono particular é produzido. Em certas concretizações, expressão de tioesterases endógenas é suprimida. As tioesterases mutantes da invenção podem ser engenheiradas para apresentar propriedades alteradas, por exemplo, especificidade alterada e/ou atividade aumentada, no que diz respeito aos comprimentos de cadeia específicos de compostos acil-CoA ou acil-ACP descritos aqui. De acordo, a célula recombinante produtora dos derivados de ácido graxo pode ser feita para preferencialmente produzir um produto derivado de ácido graxo com o comprimento de cadeia e/ou alto valor desejado como um produto final.
Em uma concretização, o derivado de ácido graxo contém uma cadeia de carbono de por volta de 4 a 36 átomos de carbono, por volta de 6 a 32 átomos de carbono, por volta de 10 a 30 átomos
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200/360 de carbono, por volta de 10 a 18 átomos de carbono, por volta de 24 a 32 átomos de carbono, por volta de 26 a 30 átomos de carbono, por volta de 26 a 32 átomos de carbono, por volta de 5 a 10 átomos de carbono, por volta de 10 a 16 átomos de carbono, ou por volta de 12 a 18 átomos de carbono. Em uma concretização alternativa, o derivado de ácido graxo contém uma cadeia de carbono menor que por volta de 20 átomos de carbono, menor que por volta de 18 átomos de carbono, ou menor que por volta de 16 átomos de carbono. Em outra concretização, o produto de éster graxo é um produto de éster graxo saturado ou insaturado apresentando um átomo de carbono contendo entre 24 e 46 átomos de carbono. Em uma concretização, o produto de éster graxo apresenta um conteúdo de átomo de carbono entre 24 e 32 átomos de carbono. Em outra concretização, o produto de éster graxo apresenta um conteúdo de carbono de 14 e 20 carbonos. Em outra
concretização, o éster graxo é o metil éster de C18:1 . Em outra
concretização, o éster graxo é o etil éster de C16:1. Em outra
concretização, o éster graxo é o metil éster de C16:1. Em ainda
outra concretização, o éster graxo é octadecil éster de octanol.
Certos microorganismos produzem preferencialmente ácidos graxos e derivados de ácido graxo de cadeia de carbono de número par ou ímpar. Por exemplo, E. coli normalmente produz ácidos graxos e etil ésteres de ácido graxo (FAEE) de cadeia de carbono de número par. Surpreendentemente, os métodos revelados aqui podem ser utilizados para alterar aquela produção. Por exemplo, E. coli pode ser feita para produzir ácidos graxos e FAEE de cadeia de carbono de número ímpar sob certas circunstâncias.
Características de Éster
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Um éster tipicamente inclui o que pode ser designado um lado A e um lado B. O lado B pode ser contribuído por um ácido graxo produzido a partir de síntese de novo no organismo hospedeiro de produção. Em algumas concretizações, onde o hospedeiro de produção é adicionalmente engenheirado a fazer alcoóis, incluindo alcoóis graxos, o lado A é também produzido pelo organismo hospedeiro de produção. Em ainda outras concretizações, o lado A pode ser provido através do meio de crescimento. Através da seleção dos genes de tioesterase desejados, o lado B (e o lado A quando alcoóis graxos estão sendo feitos) pode ser desenhado para apresentar certas características de cadeia de carbono desejadas. Essas características incluem, por exemplo, pontos de ramificação, pontos de insaturação, e comprimentos de cadeia de carbono desejados. Logo, as tioesterases mutantes da invenção podem ser engenheiradas para apresentar propriedades alteradas, por exemplo, especificidade alterada e/ou atividade aumentada, no que diz respeito à preferência de aceitar certos compostos acilCoA ou acil-ACP como uma cadeia de lado A como descrito aqui. De acordo a célula recombinante produzindo os derivados de ácido graxo podem ser feitos de modo a produzir preferencialmente um produto de derivado de ácido graxo desejado que seja valoroso como um produto final.
Quando genes de tioesterases particulares são selecionados, os lados A e B irão apresentar características de cadeia de carbono similares quando eles são ambos contribuídos pelo hospedeiro de produção utilizando intermediários da via biossintética de ácido graxo. Por exemplo, pelo menos pro volta de 50%, 60%, 70%, ou 80% dos ésteres graxos produzidos irão
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202/360 apresentar lados A e B que variam em por volta de 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14 carbonos de comprimento. O lado A e o lado B podem também apresentar níveis de ramificação e saturação similares.
Em adição a produzir alcoóis graxos que contribuem para o lado A, o hospedeiro de produção pode produzir outros alcoóis de cadeia curta tais como etanol, propanol, isopropanol, isobutanol, e butanol para incorporação do lado A utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Por exemplo, butanol pode ser feito através do organismo hospedeiro de produção. Para criar 10 células produtoras de butanol, a cepa LS9001, por exemplo, pode ser adicionalmente engenheirada para expressar atoB (acetil-CoA acetiltransferase) proveniente de Escherichia coli K12, βhidroxibutiril-CoA desidrogenase proveniente de Butyrivibrio fibrisolvens, crotonase proveniente de Clostridium beijerinckii, 15 butiril CoA desidrogenase proveniente de Clostridium beijerinckii, aldeído desidrogenase acetiladora de CoA (ALDH) proveniente de Cladosporium fulvum, e adhE codificando um aldeído-álcool desidrogenase de Clostridium acetobutylicum no vetor de expressão pBAD24 sob o sistema promotor prpBCDE. Outros 20 organismos hospedeiros de produção podem ser similarmente modificados para produzir butanol ou outros alcoóis de cadeia curta. Por exemplo, etanol pode ser produzido em um hospedeiro de produção utilizando os métodos descritos por Kalscheuer et al., Microbiology, 152:2529-2536, 2006, que estão incorporados aqui por referência.
Engenharia Genética de Cepa de Produção para
Aumentar/Melhorar a Produção/Produtividade de Derivados de
Ácidos Graxos
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Sequências polinucleotídicas heterólogas envolvidas em uma via biossintética para a produção de derivados de ácido graxo podem ser introduzidas estavelmente ou transientemente em uma célula hospedeira de produção utilizando técnicas conhecidas na arte. Exemplos não limitantes de tais técnicas incluem eletroporação, precipitação mediada por DEAE-dextran, com fosfato de cálcio, transfecção transfecção mediada por lipossomo, conjugação, transdução, e integração genética.
Para transformação estável, uma sequência de DNA pode adicionalmente incluir um marcador de seleção, incluindo, por exemplo, marcadores para resistência a antibióticos, e genes que complementam deficiências auxotróficas.
Por outro lado, polinucleotídeos endógenos envolvidos na via biossintética para a produção de derivados de ácido graxo podem também ser mutados utilizando técnicas conhecidas de alteração genômica. Essas estratégias podem ser aplicadas separadamente ou em combinação.
Várias concretizações daqui utilizam um vetor de expressão que inclui uma sequência de DNA heterólogo codificando uma proteína envolvida em uma via metabólica ou biossintética. Vetores de expressão apropriados incluem, porém não se limitam a, vetores virais (tais como vetores de baculovírus), vetores de fago (tais como vetores de bacteriófagos), plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos artificias de bactéria, vetores virais (ex., vetores virais baseados no vírus vaccinia, poliovírus, adenovírus, vírus adeno-associado, SV40, vírus herpes simplex, e similares), cromossomos artificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura, e qualquer outros vetores para hospedeiros de produção de interesse (tais como E. coli, Pseudomonas pisum, e
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Saccharomyces cerevisiae).
Vetores de expressão úteis podem incluir um ou mais genes marcadores de seleção para prover um traço fenotípico para seleção de células hospedeiras de produção transformadas. O gene marcador de seleção codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras de produção transformadas em um meio de cultura seletivo. Células hospedeiras de produção não transformadas com o vetor contendo o gene marcador de seleção não irá sobreviver no meio de cultura.
Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas (ex., ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina); (b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c) suplementam nutrientes críticos não disponíveis no meio complexo (ex. , o gene que codifica mistura racêmica de D-alanina para Bacilli). Em concretizações alternativas, o gene marcador de seleção é um que codifica dihidrofolato redutase ou confere resistência a neomicina (para utilização em cultura de célula eucariótica), ou uma que confere resistência a tetraciclina ou ampicilina (para utilização em uma célula hospedeira de produção procariótica, tal como em E. coli).
No vetor de expressão, a sequência de DNA codificando o gene na via biossintética está operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão apropriada (ex., promotores, intensificadores, e similares) para direcionar a síntese do produto gênico codificado. Tais promotores podem ser derivados a partir de fontes microbianas ou virais, incluindo, por exemplo, provenientes de CMV e SV40. Dependendo do sistema de hospedeiro
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205/360 de produção/vetor utilizado, qualquer número de elementos de controle de transcrição e tradução apropriados podem ser utilizados no vetor de expressão, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, e similares. Veja, ex., Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987.
Promotores apropriados para utilização em células hospedeiras de produção procarióticas incluem, porém não são limitadas a, promotores capazes de reconhecer as polimerases T4, T3, Sp6 e T7, os promotores PR e PL de bacteriófago lambda, os promotores trp, recA, heat shock, e lacZ de E. coli, os promotores alfa-amilase e específico de sigma de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, o promotor int de bacteriófago lambda, o promotor bla do gene da beta-lactamase de pBR322, e o promotor CAT do gene da cloramfenicol acetil transferase. Promotores procarióticos são revisados por Glick, J. Indust. Microbiol., 1:277, 1987; Watson et al. , Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (1987), Benjamin Cummins (1987); e Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência. Exemplos não limitantes de promotores eucarióticos apropriados para utilização dentro de um hospedeiro de produção eucariótico são virais em origem e incluem o promotor do gene metalotioneína I de camundongo (Hamer et al. , J. Mol. Appl. Gen., 1:273, 1982); o promotor TK de herpes vírus (McKnight, Cell, 31:355, 1982); o promotor inicial SV40 (Benoist et al. , Nature, 290:304, 1981); o promotor de citomegalovírus (Foecking et al., Gene, 45:101, 1980); o promotor do gene gal4
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206/360 de levedura (Johnston et al., PNAS (USA), 79:6971, 1982; Silver et al., PNAS (USA), 81:5951, 1984); e o promotor IgG (Orlandi et al. , PNAS (USA), 86:3833, 1989), os conteúdos dos quais estão incorporados aqui por referência.
O hospedeiro de produção pode ser geneticamente modificado com uma sequência gênica heteróloga codificando um produto gênico de via biossintética que está operacionalmente ligado a um promotor induzível. Promotores induzíveis são conhecidos na arte. Exemplos não limitantes de promotores induzíveis 10 apropriados incluem promotores que são afetados por proteínas, metabólitos, ou químicos. Esses incluem, porém não são limitados a: um promotor de vírus de leucemia bovina, um promotor de metalotioneína, um promotor MMTV induzível por dexametasona, um promotor SV40, um promotor polIII de MRP, um promotor CMV 15 induzível por tetraciclina (tal como o promotor CMV inicial imediato de humano) assim como aqueles provenientes dos operons trp e lac.
Em alguns exemplos, um hospedeiro de produção é geneticamente modificado com uma sequência gênica heteróloga 20 codificando um produto gênico de via biossintética que está operacionalmente ligado a um promotor constitutivo. Promotores constitutivos apropriados são conhecidos na arte e incluem promotores tardios principais constitutivos de adenovírus, um promotor MPSV constitutivo, ou um promotor CMV constitutivo.
Em alguns exemplos, um hospedeiro de produção modificado é um que é geneticamente modificado com uma sequência gênica exógena codificando um proteína única envolvida em uma via biossintética. Em outras concretizações, um hospedeiro de
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207/360 produção modificado é um que é geneticamente modificado com sequências gênicas exógenas codificando duas ou mais proteínas envolvidas em uma via biossintética, por exemplo, uma primeira e segunda enzimas em uma via biossintética.
Quando um hospedeiro de produção é geneticamente modificado para expressar duas ou mais proteínas envolvidas em um via biossintética, aquelas sequências gênicas podem cada estar contidas em um único vetor de expressão ou em vetores de expressão separados. Quando aquelas sequências gênicas estão contidas em um único vetor de expressão, em algumas concretizações, as sequências polinucleotídicas estarão operacionalmente ligadas a um elemento de controle em comum caracterizado pelo fato do elemento de controle em comum controlar a expressão de todas as sequências gênicas codificando proteínas da via biossintética no único vetor de expressão (ex., um promotor).
Quando um hospedeiro de produção modificado é geneticamente modificado com sequências de DNA heterólogo codificando duas ou mais proteínas envolvidas em uma via biossintética, uma das sequências de DNA pode estar operacionalmente ligada a um promotor induzível, e uma ou mais das sequências de DNA podem estar operacionalmente ligada a um promotor constitutivo.
Em algumas concretizações, a concentração intracelular
Figure BRPI0923572B1_D0013
Figure BRPI0923572B1_D0014
a concentração dentro do hospedeiro de produção modificado geneticamente) de um intermediário de via biossintética pode ser aumentada para estímulo adicional da produtividade do produto final
A concentração intracelular do intermediário pode ser aumentada de várias maneiras, incluindo,
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208/360 porém não limitado a, aumento da concentração no meio de cultura de um substrato para uma via biossintética;
aumento da atividade catalítica de uma enzima que é ativa na via biossintética;
aumento da quantidade intracelular de um substrato (ex. , um substrato primário) para uma enzima que é ativa na via biossintética; e similares.
Em alguns exemplos, derivado de ácido graxo ou intermediário é produzido no citoplasma do hospedeiro de produção. A concentração citoplasmática pode ser aumentada de várias maneiras, incluindo, porém não limitada a, ligação do ácido graxo a coenzima A para formar um acil-CoA tioéster.
Adicionalmente, a concentração de acil-CoA pode ser aumentada através do aumento da biossíntese de CoA na célula, tal como através da super-expressão de genes associados com a biossíntese de pantotenato (ex. , panD) ou através da eliminação de genes associados com a biossíntese de glutationa ex. , glutationa sintase).
Sequências regulatórias, sequências codificantes, combinações destas, podem ser introduzidas ou alteradas no cromossomo do hospedeiro de produção. Em alguns exemplos, integração da sequência recombinante desejada na sequência genômica do hospedeiro de produção não requer a utilização de um marcador de seleção tal como um antibiótico. Em alguns exemplos, as alterações genômicas incluem mudança da sequência de controle dos genes alvo através da substituição do(s) promotor(es) nativo(s) por um promotor que é insensível a regulação. Existem numerosas abordagens para fazer isso. Por exemplo, Valle e
Flores, em Methods Mol. Biol., 267:113-122,
2006, descrevem um
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209/360 método baseado em PCR para super-expressar genes cromossomais em E. coli. O conteúdo de Valle e Flores está incorporado aqui por referência. Outra abordagem é baseada na utilização de oligonucleotídeos de fita simples para criar mutações 5 específicas diretamente no cromossomo, utilizando a técnica desenvolvida por Court et al., PNAS(USA), 100:15748-15753, 2003, o conteúdo do qual está também incorporada aqui por referência.
Essa técnica é baseada na utilização da super-expressão da proteína Beta proveniente do bacteriófago lambda para aumentar 10 a recombinação genética. As vantagens dessa abordagem incluem que oligonucleotídeos sintéticos com 70 bases (ou mais) de comprimento podem ser utilizados para criar mutações pontuais, inserções, e deleções, com isso eliminando quaisquer etapas de clonagem. Além disso, o sistema é suficientemente eficiente de 15 modo que nenhum marcador é necessário para isolar as mutações desejadas.
Com essa abordagem a região regulatória de um gene pode ser modificada para criar um promotor mais forte e/ou eliminar o sítio de ligação de um repressor. De acordo, um gene desejado 20 pode ser super-expresso no organismo hospedeiro de produção.
Fermentação
Maximizando a Eficiência de Produção
Produção e isolamento de derivados de ácido graxo podem ser melhorados através do emprego de técnicas de fermentação 25 específicas. Um método para maximizar a produção enquanto reduzindo custos é o aumento da porcentagem da fonte de carbono que é convertida em produtos de hidrocarbono.
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Durante ciclos de vida celular normais, o carbono é utilizado em funções celulares para produzir lipídeos, sacarídeos, proteínas, ácidos orgânicos, e polinucleotídeos. A redução da quantidade de carbono necessário para atividades 5 relacionadas ao crescimento podem aumentar a eficiência da conversão da fonte de carbono para produto final. Isso pode ser alcançado primeiramente através de crescimento de microorganismos a uma densidade desejada, que é alcançado no pico da fase log de crescimento. Depois, a replicação dos genes 10 de ponto de checagem pode ser bloqueada para parar o crescimento das células. Especificamente, mecanismos sensor de quórum (como revisado em Camilli e Bassler, Science, 311:1113, 2006; Venturi, FEMS Microbio. Rev., 30:274-291, 2006; e Reading e Sperandio,
FEMS Microbiol. Lett., 254:1-11, 2006, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência) podem ser utilizadas para ativar genes associados com a fase estacionária.
Genes que podem ser ativadas para parar a replicação e crescimento celulares em E. coli inclui os genes umuDC, a superexpressão dos quais para a progressão da fase estacionária até 20 o crescimento exponencial (Murli et al., J. of Bact., 182:1127, 2000). UmuC é uma DNA polimerase que pode conduzir a síntese trans-lesão sobre lesões não codificantes - a base da mecânica da maioria das mutagênese por UV e químicas. Os produtos gênicos umuDC são utilizados para o processo de síntese de trans-lesão 25 e também servem como pontos de checagem de dano de sequência polinucleotídica. Os produtos gênicos umuDC incluem UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2, e/ou UmuD2. Nesse meio tempo, os genes produtores de produto podem ser ativados, com isso minimizando a necessidade para vias de replicação e manutenção para ser
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211/360 utilizada enquanto o derivado de ácido graxo está sendo feito. Microorganismos hospedeiros de produção podem também ser engenheirados a expressar umuC e/ou umuD provenientes de E. coli em pBAD24 sob o sistema promotor prpBCDE através de síntese de novo desses genes com os genes de produção de produto final apropriados.
A porcentagem de carbonos iniciais convertidos a ésteres graxos ou produtos de hidrocarbono é um direcionador de custo. Quanto mais eficiente o processo (i.e. , quanto maior a porcentagem de carbonos iniciais convertidos em ésteres graxos ou produtos de hidrocarbono), menos caro ele custa. Para fontes de carbono contendo oxigênio (ex., glicose e outras fontes baseadas em carboidrato), o oxigênio é liberado na forma de dióxido de carbono. Para cada 2 átomos de oxigênio liberados, um átomo de carbono é também liberado, levando a uma eficiência metabólica teorética máxima de por volta de 34% (w/w) (para produtos derivados de ácido graxo). Essa figura, porém, muda para outros produtos de hidrocarbono e fontes de carbono. Eficiências típicas na literatura são de por volta de <5%. Hospedeiros de produção engenheirados a produzir produtos de hidrocarbono podem apresentar eficiência maior que por volta de 1%, por exemplo, maior que por volta de 3%, 5%, 10%, 15%, 20%,
25%, ou 30%. Em um exemplo, hospedeiros de produção irão exibir uma eficiência de por volta de 10% a por volta de 25%. Em outros exemplos, tais hospedeiros de produção irão exibir uma eficiência de por volta de 25% a por volta de 30%. Em outros exemplos, tais hospedeiros de produção irão exibir eficiência >30%.
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O hospedeiro de produção pode ser adicionalmente engenheirado a expressar celulossomas recombinantes, tais como aqueles descritos em PCT application number PCT/US2007/003736, incorporado aqui por referência na sua íntegra, que pode permitir ao hospedeiro de produção para utilizar material celulósico como uma fonte de carbono. Por exemplo, o hospedeiro de produção pode ser adicionalmente engenheirado para expressar invertases (EC 3.2.1.26) de modo que a sacarose possa ser utilizada como uma fonte de carbono.
Similarmente, o hospedeiro de produção pode ser engenheirado utilizando os ensinamentos descritos em U.S. Patent Nos. 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; e 5.602.030, todos incorporados aqui por referência na sua íntegra, de modo que o hospedeiro de produção possa assimilar carbono eficientemente e utilizar materiais celulósicos como fontes de carbono.
Em um exemplo, a câmara de fermentação engloba uma corrida/mistura de fermentação que está sofrendo uma redução contínua. Nesse exemplo, um ambiente redutivo estável é criado. O balanço de elétron é mantido através da liberação de dióxido de carbono (na forma gasosa). Esforços para aumentar o balanço NAD/H e NADP/H podem também facilitar na estabilização do balanço de elétrons.
A disponibilidade de NADPH intracelular pode também ser aumentada através do engenheiramento do hospedeiro de produção para expressar uma NADH:NADPH transidrogenase. A expressão de uma ou mais NADH:NADPH transidrogenases converte o NADH produzido em glicólise em NADPH o que melhora na produção de
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213/360 derivados de ácido graxo.
Produção de Hidrocarbono em Pequena Escala
Para produção de produto de hidrocarbono em pequena escala, células BL21(DE3) de E. coli contendo pBAD24 (com resistência a ampicilina e via de síntese de produto final) assim como pUMVC1 (com resistência a canamicina e sistema de super-expressão de acetil CoA/malonil CoA) são incubados ao longo da noite em frascos de 2 Litros a 37°C, agitados a >200 rpm em 500 mL de meio LB suplementados com 75 pg/mL de ampicilina e 50 pg/mL de canamicina até as culturas atingirem uma DO600 de >0,8, células são suplementadas com propionato de sódio 25 mM (em pH 8,0) para ativar os sistemas de genes engenheirados para produção, e para parar a proliferação celular através da ativação de proteínas UmuC e UmuD. A etapa de indução é desempenhada por 6 horas a 30°C. Após incubação, o meio é examinado para produto de hidrocarbono utilizando GC-MS.
Produção de Hidrocarbono em Larga Escala
Para produção de produto em larga escala, os hospedeiros de produção engenheirados são crescidos em levas de 10 Litros, 100 Litros, ou mais; fermentados; e induzidos a expressar os produtos desejados baseados em genes específicos codificados nos plasmídeos apropriados contidos neles.
Por exemplo, células BL21(DE3) de E. coli contendo pBAD24 (com resistência a ampicilina e via de síntese de produto final) assim como pUMVC1 (com resistência a canamicina e sistema de super-expressão de acetil CoA/malonil CoA) são incubadas em
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214/360 cultura de semeadura de 500-mL para uma corrida de fermentação de 10-Litros (ou uma cultura de semeadura de 5-Litros para uma corrida de fermentação de 100-Litros) em um meio LB (livre de glicerol) contendo 50 pg/mL de canamicina e 75 pg/mL de ampicilina a 37°C, que é agitada a >200 rpm até a cultura atingirem uma DO600 de >0,8, um processo que tipicamente leva em torno de 16 horas. O meio de fermentação é continuamente suplementado com um fosfato de sódio de 25 mM, em pH 8,0, com o intuito de ativar os sistemas de genes engenheirados para produção, e para parar a proliferação celular através da ativação de proteínas UmuC e UmuD. O meio também é continuamente suplementado com glicose para manter uma concentração de 25 g/100 mL.
Após a primeira hora de indução, uma alíquota de não mais que 10% do volume de célula total é removido a cada hora e permitido a assentar sem agitação, o que por sua vez permite que produto(s) de hidrocarbono vá(ão) para a superfície, sofrendo uma separação de fase espontânea. O componente de hidrocarbono é coletado e a fase aquosa é retornada à câmara de reação. A câmara de reação é operada continuamente. Quando a DO600 cai abaixo de por volta de 0,6, as células são substituídas com uma nova leva crescida a partir de uma cultura de semeadura.
Para produção de éster de cera, os ésteres de cera são isolados, lavados brevemente em 1 M de HCl, e retornados ao pH 7 através de lavagem extensiva com água destilada.
Processamento Pós Produção
Os derivados de ácido graxo produzidos durante a fermentação
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215/360 podem ser separadas a partir do meio de fermentação. Qualquer técnica conhecida para separação de derivados de ácido graxo do meio aquoso pode ser utilizada. Um processo de separação exemplar é o processo de separação de duas fases (bifásico). Esse processo envolve a fermentação dos hospedeiros de produção engenheirados geneticamente sob condições suficientes para produzir um derivado de ácido graxo, permitindo ao derivado coletar em uma fase orgânica, e separando a fase orgânica do caldo de fermentação aquoso. Esse método pode ser praticado tanto em configuração de leva ou fermentação contínua.
A separação bifásica leva vantagem na relativa imiscibilidade dos derivados de ácido graxo para facilitar a separação. Imiscibilidade se refere a relativa inabilidade de um composto a dissolver em água e é definido e/ou determinado através de coeficiente de partição de compostos. Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que através da escolha de um caldo de fermentação e fase orgânica de modo que o derivado de ácido graxo sendo produzido apresente um alto valor logP, o derivado de ácido graxo irá separar na fase orgânica no recipiente de fermentação, mesmo em concentrações baixas.
Os derivados de ácido graxo produzido de acordo com as composições, vetores, células, e métodos daqui serão relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, assim como no citoplasma. Portanto, o derivado de ácido graxo irá coletar em uma fase orgânica intracelularmente e/ou extracelularmente. A coleção dos produtos na fase orgânica irá reduzir o impacto dos derivados de ácido graxo na função celular, e irá permitir ao hospedeiro de produção a produzir uma maior quantidade de produto
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216/360 por mais tempo.
Os alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, e hidrocarbonos produzidos de acordo com as revelações daqui permitem a produção de compostos homogêneos caracterizados pelo fato de pelo menos por volta de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% dos alcoóis graxos, ésteres graxos, e ceras produzidos de maneira apropriada apresentam comprimentos de cadeia de carbono que variam em menos que por volta de 6, menos que por volta de 4 carbonos, ou menos que por volta de 2 carbonos. Esses compostos podem também ser produzidos de modo que eles apresentam grau de saturação relativamente uniforme, por exemplo, pelo menos por volta de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, ou 95% dos alcoóis graxos, ésteres graxos, hidrocarbonos e ceras são monoinsaturados, di-insaturados, ou tri-insaturados. Esses compostos podem ser utilizados diretamente como produtos ou componentes de produtos, por exemplo, como combustíveis, detergentes, lubrificantes, aditivos de higiene pessoal, suplementos nutricionais etc.
Esses compostos podem também ser utilizados como matéria-prima para reações subsequentes para fazer outros produtos, incluindo, por exemplo transesterificação, hidrogenação, quebra hidrogenação, pirólise, ou ambos), ou reações catalítica (via de epoxidação.
Os alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, e hidrocarbonos produzidos de acordo com as composições, vetores, células, e métodos daqui contêm baixos níveis de elementos indesejados, incluindo, porém não limitado a, metais pesados. Em algumas concretizações, os alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, e hidrocarbonos produzidos como descrito aqui contêm de maneira
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217/360 apropriadas menos que por volta de 50 ppm de arsênico; menos que por volta de 300 ppm de cálcio; menos que por volta de 200 ppm de cloro; menos que por volta de 50 ppm de cobalto; menos que por volta de 50 ppm de cobre; menos que por volta de 300 ppm de ferro; menos que por volta de 2% por peso de água; menos que por volta de 50 ppm de chumbo; menos que por volta de 50 ppm de manganês; menos que por volta de 0,2 ppm de mercúrio; menos que por volta de 50 ppm de molibdênio; menos que por volta de 1% por peso de nitrogênio; menos que por volta de 200 ppm de potássio; menos que por volta de 300 ppm de sódio; menos que por volta de 3% por peso de enxofre; menos que 50 ppm de zinco; e/ou menos que 700 ppm de fósforo.
Em algumas concretizações, os alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, e hidrocarbonos produzidos de acordo com as revelações daqui contêm entre por volta de 50% e por volta de 90% carbono; entre por volta de 5% e por volta de 25% hidrogênio; ou entre por volta de 5% e por volta de 25% oxigênio. Em outras concretizações, os alcoóis graxos, ésteres graxos, ceras, e hidrocarbonos produzidos como descritos aqui contêm entre por volta de 65% e por volta de 85% carbono; entre por volta de 10% e por volta de 15% hidrogênio; ou entre por volta de 10% e por volta de 20% oxigênio.
Composições de Combustível
Como provido aqui, certos derivados de ácido graxo feitos de acordo com os métodos e composições descritos aqui possuem várias características vantajosas para uso como um combustível. Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que, dependendo do propósito pretendido do combustível, diferentes derivados de
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218/360 ácido graxo podem apresentar vantagens quando comparados a outros derivados de ácido graxo. Por exemplo, derivados de ácido graxo ramificados podem ser mais desejáveis como combustíveis automotivos ou componentes de combustíveis automotivos que tem como intuito a utilização em climas frios. Similarmente, para certas aplicações, pode ser vantajoso produzir um combustível que é tanto mais ou menos oxigenado ou mais ou menos saturado.
Utilizando os métodos descritos aqui, combustíveis contendo derivados de ácido graxo relativamente homogêneos que ao mesmo tempo apresentam as características/qualidades desejadas podem ser produzidos. Tais combustíveis baseados em derivados de ácido graxo podem ser caracterizados através de fingerprinting de carbono, e sua falta de impurezas, quando comparado a combustíveis derivados de petróleo ou biodiesel derivado a partir de triglicerídeo, é também vantajosa. Os combustíveis baseados em derivados de ácido graxo podem ser combinados com outros combustíveis ou aditivos de combustíveis para produzir combustíveis apresentando propriedades desejadas.
Os hospedeiros de produção e métodos revelados aqui podem ser utilizados para produzir ácidos graxos livres e ésteres graxos. Em algumas concretizações, os hospedeiros de produção e métodos revelados aqui podem ser utilizados para produzir um titulação ou produtividade aumentada e/ou melhorada de derivados de ácido graxo, incluindo, por exemplo, ácidos graxos livres e/ou ésteres graxos. Em algumas concretizações, a porcentagem de ácidos graxos livres no produto produzido pelo hospedeiro de produção é de pelo menos por volta de 1%, por exemplo, pelo menos por volta de 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, ou
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25%. Em algumas concretizações, a porcentagem de ésteres graxos no produto produzido pelo hospedeiro de produção é de pelo menos por volta de 50%, por exemplo, pelo menos por volta de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ou 90%. Em algumas concretizações, a proporção de ésteres graxos para ácidos graxos livres no produto produzido pelo hospedeiro de produção é de por volta de 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 5:1, 2:1, ou 1:1. Em certas concretizações, o éster graxo produzido pelo hospedeiro de produção é etil dodecanoato, etil tridecanoato, etil tetradecanoato, etil pentadecanoato, etil cis-9-hexadecenoato, etil hexadecanoato, etil heptadecanoato, etil cis-11-octadecenoato, etil octadecanoato, ou combinações destes. Em certas outras concretizações, o éster graxo produzido pela produção é metil dodecanoato, metil tridecanoato, metil tetradecanoato, metil pentadecanoato, metil cis-9-hexadecenoato, metil hexadecanoato, metil heptadecanoato, metil cis-11-octadecenoato, metil octadecanoato, ou combinações destes. Em certas concretizações, o ácido graxo produzido pelo hospedeiro de produção é ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico, ácido pentadecanóico, ácido cis-9-hexadecenóico, ácido hexadecanóico, ácido cis-11octadecenóico, ou combinações destes.
Os hospedeiros de produção e métodos revelados aqui podem ser utilizados para produzir proporções diferentes de ácidos graxos livres e ésteres graxos. Em algumas concretizações, a proporção de ácidos graxos livres no produto pode ser modificada de acordo com os métodos, composições, vetores e células descritas aqui de modo que a proporção é maior ou menor X os ésteres graxos que são produzidos. Em certas concretizações relacionadas, a proporção de ésteres graxos no produto pode
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também ser modificado de acordo com as revelações daqui, de modo que a proporção é maior ou menor X outros produtos, por exemplo, ácidos graxos livres, que são produzidos. Em certas outras concretizações, a produtividade proporcional de derivado de ácido graxo com certos comprimentos de cadeia de carbono pode ser aumentada ou diminuída.
Fingerprinting de Carbono
Derivados de ácido graxo produzidos biologicamente representam uma nova fonte de combustíveis, tais como alcoóis, diesel, e gasolina. Biocombustíveis feitos de acordo com os métodos e composições descritas aqui não foram até agora produzidas a partir de fontes renováveis e são novas composições do assunto. Esses novos combustíveis podem ser distinguidos de combustíveis derivados de carbono petroquímico com bases no fingerprinting isotópico duplo de carbono. Adicionalmente, a fonte específica de carbono de fonte biológica (ex., glicose X glicerol) pode ser determinada através de fingerprinting isotópico duplo de carbono (veja U.S. Patent No. 7.169.588, que está incorporada aqui por referência na sua íntegra, em particular, na col. 4, linha 31, a col. 6, linha 8).
Os derivados de ácido graxo e biocombustíveis, químicos, e misturas associadas podem ser distinguidos a partir das seus equivalentes derivado de petróleo com base no 14C (fM) e fingerprinting isotópico duplo de carbono.
Os derivados de ácido graxo descritos aqui têm utilidade na produção de biocombustíveis e químicos. Os novos produtos baseados em derivados de ácido graxo providos pela presente
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221/360 invenção adicionalmente podem ser distinguidos com base no fingerprinting isotópico duplo de carbono daqueles materiais derivados somente de fontes petroquímicas. A habilidade de distinguir esses produtos é beneficial no rastreamento desses materiais no comércio. Por exemplo, combustíveis ou químicos contendo perfis de isótopo de carbono tanto novo quanto velho podem ser distinguidos de combustíveis e químicos feito apenas de materiais velhos. Logo, os presentes materiais podem ser seguidos ou rastreados no comércio ou identificados no comércio como um biocombustível com base nos seus perfis únicos. Em adição, outros materiais competidores podem ser identificados como sendo derivados biologicamente ou derivados de um fonte petroquímica.
Em alguns exemplos, uma composição de biocombustível é feita, o que inclui um derivado de ácido graxo apresentando õ13C de desde por volta de -10,9 a por volta de -15,4, caracterizada pelo fato do derivado de ácido graxo ser responsável por pelo menos por volta de 85% do matéria de fonte biológica (i.e., derivado de fontes renováveis tais como, por exemplo, materiais celulósicos e açúcares) na composição. Em outros exemplos, a composição de biocombustível inclui um derivado de ácido graxo apresentando a fórmula:
X—(CH(R)) nCH3
Caracterizado pelo fato de
X = CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; ou -C(O)NR3R4;
R = para cada n, independentemente ausente, um H, ou um
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222/360 alifático inferior;
n = um número inteiro desde por volta de 8 a por volta de 34, preferencialmente um número inteiro desde por volta de 10 a por volta de 24;
R1, R2, R3, R4 = independentemente selecionado a partir de um H ou um alquil inferior.
Tipicamente, quando R é um grupamento alifático inferior, R representa uma porção alquil inferior ou alcenil inferior ramificada, não ramificada ou cíclica. Grupamentos R exemplares incluem, sem limitação, metil, isopropil, isobutil, sec-butil, ciclopentenil, e similares. O derivado de ácido graxo é adicionalmente caracterizado como apresentando um õ13C de desde por volta de -10,9 a por volta de -15,4, e o derivado de ácido graxo é responsável por pelo menos por volta de 85% do material de fonte biológica na composição. Em alguns exemplo o derivado de ácido graxo na composição de biocombustível é caracterizada através da presença de uma fração de carbono moderno (fM 14C) de pelo menos por volta de 1,003, 1,010, ou 1,5.
Impurezas
Os derivados de ácido graxo preparados de acordo com as revelações daqui são úteis como componentes de ou para fazer biocombustíveis assim como químicos industriais. Esses derivados de ácido graxo são feitos diretamente a partir de ácidos graxos e não a partir de processamento químico de triglicerídeos. De acordo, combustíveis e outros químicos industriais contendo os derivados de ácido graxo revelados geralmente apresentam menos
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223/360 impurezas do que está normalmente associado com, por exemplo, produtos derivados a partir de triglicerídeos tais como combustíveis de óleos e gorduras vegetais.
Os biocombustíveis brutos de derivado de ácido graxo preparado de acordo com as revelações daqui (antes de misturar o derivado de ácido graxo com outros combustíveis tais como combustíveis baseados em petróleo) contêm menos produtos de catálise de transesterificação do que diesel baseado em petróleo ou outro biodiesel produzido via uma ou mais etapas de 10 transesterificação. O derivado de ácido graxo pode conter menos que por volta de 2,0%, por exemplo, menos que por volta de 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% do produto de catálise de transesterificação ou uma impureza resultante de um produto de catálise de transesterificação. Exemplos não limitantes de 15 produtos de catálise de transesterificação incluem produto de catálise de hidróxido, tais como NaOH, KOH, e LiOH; e produtos de catálise ácidos, tais como produtos de catálise ácidos minerais e produtos de catálise de ácido de Lewis. Exemplos não limitantes de produtos de catálise e impurezas resultando de 20 produtos de catálise de transesterificação incluem estanho, chumbo, mercúrio, cádmio, zinco, titânio, zircônio, háfnio, boro, alumínio, fósforo, arsênico, antimônio, bismuto, cálcio, magnésio, estrôncio, urânio, potássio, sódio, lítio, e combinações destes.
Os biocombustíveis brutos de derivado de ácido graxo preparados de acordo com as revelações daqui (antes de misturar os derivados de ácido graxo com um ou mais combustíveis) tendem a apresentar um baixo ponto de gelificação, especialmente quando
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224/360 o produto de derivado de ácido graxo contém um C16:1 etil éster ou um C18:1 etil éster, quando comparado aos pontos de gelificação de outros tipos de biocombustíveis.
Similarmente, os biocombustíveis brutos de derivado de ácido graxo preparados de acordo com as revelações daqui (antes de misturar o derivado de ácido graxo com outros combustíveis tais como dieseis baseados em petróleo ou outros biodieseis) contendo menos glicerol (ou glicerina) que biocombustíveis feitos a partir de triglicerídeos. O(s) derivado(s) de ácido graxo contém(êm) menos que por volta de 2,0%, por exemplo, menos que por volta de 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% por peso de glicerol.
Biocombustíveis brutos derivados de derivados de ácido graxo aqui também contêm menos álcool(óis) livre(s) (ex., alcoóis que são utilizados para criar um éster) que biodieseis feitos a partir de triglicerídeos. Isso é devido em parte à eficiência de utilização dos alcoóis pelos hospedeiros de produção da presente revelação. Por exemplo, o9s) derivado(s) de ácido graxo pode(m) conter menos que por volta de 2,0%, 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% por peso de álcool livre.
Biocombustível derivado a partir de derivados de ácido graxo podem ser adicionalmente caracterizados pela sua baixa concentração de enxofre quando comparado a diesel derivado de petróleo. Biocombustível derivado a partir de derivados de ácido graxo pode apresentar menos que por volta de 2,0%, por exemplo, menos que por volta de 1,5%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 0,05%, ou 0% por peso de enxofre.
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Aditivos e Composições de Combustível
Aditivos de combustível são utilizados para melhorar o desempenho de um combustível ou motor. Por exemplo, aditivos de combustível podem ser utilizados para alterar os pontos de congelamento/gelificação, pontos de turvação, lubricidade, viscosidade, estabilidade oxidativa, qualidade de ignição, níveis de octanagem, e pontos de inflamação. Nos Estados Unidos, todos os aditivos de combustível devem ser registrados na Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency). Os nomes de aditivos de combustível e as companhias que vendem os aditivos de combustível estão disponíveis publicamente através de contato com a EPA ou através de busca na página da internet da agência. Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que os derivados de ácido graxo descritos aqui podem ser misturados com um ou mais aditivos de combustível para gerar uma qualidade desejada.
Os derivados de ácido graxo descritos aqui podem ser formulados em aditivos de combustível apropriados, o que aumenta o desempenho de combustíveis ou motores. Por exemplo, os derivados de ácido graxo descritos aqui podem ser formulados em melhoradores de lubricidade, que geram propriedades desejadas tal como proteção contra desgaste das partes do motor. De acordo, composições de aditivos contendo os derivados de ácido graxo produzidos de acordo com as revelações daqui são providas. Em outro exemplo, os derivados de ácido graxo descritos aqui podem ser formulados em inibidores de corrosão.
Os derivados de ácido graxo descritos aqui podem ser misturados com outros combustíveis tais como um ou mais
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226/360 biodieseis derivados de triglicerídeos, vários alcoóis tais como etanol e butanol, e produtos derivados de petróleo tais como gasolina ou diesel. Sob certas circunstâncias, um derivado de ácido graxo com um baixo ponto de gelificação, tais como um C16:1 etil éster ou um C18:1 etil éster, é produzido. Esse derivado de ácido graxo de baixo ponto de gelificação pode ser misturado com um ou mais biodieseis feitos de triglicerídeos para reduzir o ponto de gelificação do combustível resultante quando comparado com um combustível contendo somente um ou mais biodieseis feitos de triglicerídeos. Similarmente, um derivado de ácido graxo, tal como um C16:1 etil éster ou um C18:1 etil éster, podem ser misturados com um diesel derivado de petróleo para prover uma mistura que contém pelo menos por volta de, e frequentemente maior que por volta de, 5% por peso de biodiesel. Em alguns exemplos, a mistura de combustível inclui pelo menos por volta de 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, e 60% por peso de derivado de ácido graxo.
Em algumas concretizações, a composição de combustível pode adicionalmente conter um combustível sintético. Qualquer combustível sintético obtido a partir de carvão, gás natural, ou biomassa pode ser apropriadamente utilizado. Em concretizações adicionais, o combustível sintético contém um combustível baseado em Fischer-Tropsch, um combustível baseado em Bergius, um combustível baseado em
Mobil, um combustível baseado em
Karrick, ou uma combinação destes.
adicionais, o combustível sintético
Em concretizações ainda contém um combustível baseado em Carvão-para-Líquidos (combustível baseado em CTL), um combustível baseado em Gás-para-Líquidos (combustível baseado em GTL), um combustível baseado em Biomassa-para-Líquidos
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227/360 (combustível baseado em BTL), um combustível baseado em Carvão e Biomassa-para-Líquidos (combustível baseado em CBTL), ou uma combinação destes. Em uma concretização exemplar, o combustível sintético contém um combustível baseado em Fischer-Tropsch.
A quantidade de combustível sintético na composição de combustível revelado aqui pode ser desde por volta de 5% a por volta de 90%, desde por volta de 5% a por volta de 80%, desde por volta de 5% a por volta de 70%, desde por volta de 5% a por volta de 60%, ou desde por volta de 5% a por volta de 50%.
Em certas concretizações, uma composição de biocombustível pode ser feita que inclua pelo menos por volta de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de um derivado de ácido graxo que inclui uma cadeia de carbono que é 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ou 22:3. Tais composições de biocombustível podem adicionalmente incluir pelo menos um aditivo selecionado a partir de um aditivo capaz de baixar o ponto de turvação que podem baixar o ponto de turvação para menos que por volta de 5°C, ou menos que por volta de 0°C; um surfactante; uma microemulsão; pelo menos por volta de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de combustível diesel a partir de triglicerídeos; uma gasolina derivada de petróleo; ou um combustível diesel a partir de petróleo.
Em algumas concretizações, a composição de combustível contendo os ésteres graxos produzidos de acordo com os métodos, vetores, células e composições daqui adicionalmente contêm um ou mais aditivos de combustível diesel. Aditivos apropriados são
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228/360 desejadamente aqueles que geram desempenho melhorado porém também compatibilidade com os componentes na composição de combustível e dispositivos que são tipicamente associados com motores a diesel. Exemplos ilustrativos de outros aditivos de 5 combustível apropriados incluem melhoradores de ignição ou melhoradores de número de cetano, detergentes, dispersantes, agentes anti-desgaste, modificadores de índice de viscosidade, modificadores de fricção, melhoradores de lubricidade, estabilizadores, antioxidantes, inibidores de corrosão, 10 biocidas, desativadores de metal, e quantidades mínimas de outros aditivos opcionais, incluindo, sem limitação, agentes anti-espuma e fixadores de selagem.
Em concretizações particulares, melhoradores de ignição ou melhoradores de número de cetano são frequentemente adicionados 15 para melhorar o desempenho de motor a diesel. Melhoradores de número de cetano exemplares incluem 2'-etilhexil nitrato, e outros acil nitratos. Melhoradores de número de cetano podem ser adicionados a uma composição de combustível em uma quantidade que é por volta de 0,01 wt.% a por volta de 1,0 wt.%, por exemplo, 20 por volta de 0,05 wt.% a por volta de 0,5 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível.
Em certas concretizações, vários detergentes e/ou dispersantes podem ser incluídos na composição de combustível contendo o éster graxo produzido de acordo com as presentes 25 revelações para associar e dispersar ou remover depósitos danosos das partes de motor diesel. Detergentes apropriados tipicamente contêm uma cabeça polar contendo um sal metálico de um composto orgânico ácido e uma longa cauda hidrofóbica.
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Detergentes exemplares incluem sais carbonato boratados, sais sulfonato boratados, que são preferencialmente sobrebase. Veja, ex., U.S. Patent Nos. 4.744.920, 4.965.003, as revelações das quais estão incorporadas aqui. Dispersantes exemplares incluem, sem limitação, dispersantes carboxílicos, dispersantes sucinimida, dispersantes amina, e dispersantes Mannich. Veja, ex., U.S. Patent Nos. 3.172.892, 3.438.757, 3.980.569, e 6.165.235, as revelações das quais são incorporadas por referência aqui. Dispersantes podem estar presentes na composição de combustível em uma quantidade de por volta de 0,01 wt.% a por volta de 0,1 wt.%, por exemplo, 0,03 a por volta de 0,05 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível.
Em certas concretizações, agentes anti-desgaste, incluindo por exemplo, sais metálicos dihidrocarbil ditiofosfato, podem ser adicionados à composição de combustível para prover benefícios tanto anti-desgaste quanto antioxidantes. Veja, ex., U.S. Patent No. 5.898.023, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência.
Em concretizações particulares, a quantidade de melhorador de lubricidade na composição de combustível pode variar desde por volta de 1 ppm a por volta de 50.000 ppm, por exemplo, por volta de 10 ppm a por volta de 20.000 ppm, ou por volta de 25 ppm a por volta de 10.000 ppm. Exemplos não limitantes de melhoradores de lubricidade incluem ésteres e ácidos graxos, que podem ou não ser o mesmo daqueles produzidos de acordo com os métodos descritos aqui.
Em concretizações particulares, a quantidade de estabilizadores, que melhora a estabilidade de armazenagem da
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230/360 composição de combustível, pode variar desde por volta de 0,001 wt.% a por volta de 2 wt.%, por exemplo por volta de 0,01 wt.% a por volta de 1 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível. Um estabilizador exemplar é uma amina primária acil terciário.
Antioxidantes previnem a formação de depósitos de goma nos componentes do sistema de combustível devido à oxidação dos combustíveis na armazenagem e/ou inibição da formação de compostos de peróxido em certas composições de combustível. A quantidade de antioxidantes pode variar desde por volta de 0,001 wt.% a por volta de 5 wt.%, por exemplo, desde por volta de 0,01 wt.% a por volta de 1 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível.
Inibidores de corrosão protegem metais ferrosos nos sistemas de manuseio de combustível, tais como canos e tanques de armazenagem, da corrosão. Certos inibidores de corrosão são também conhecidos por gerar lubricidade adicional, e desse modo são particularmente apropriados quando lubricidade adicional é desejada. O inibidor de corrosão pode estar presente na composição de combustível em uma quantidade de por volta de 0,001 wt.% a por volta de 5 wt.%, por exemplo, desde por volta de 0,01 wt.% a por volta de 1 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível.
Biocidas são utilizadas para combater crescimento microbiano na composição de combustível, que pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de por volta de 0,001 wt.% a por volta de 5 wt.%, por exemplo, desde por volta de 0,01 wt.% a por volta de 1 wt.%, baseado no peso total da
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231/360 composição de combustível.
Desativadores de metal suprimem os efeitos catalíticos de alguns metais, particularmente cobre, na oxidação de combustível, o que pode estar presente na composição de combustível em uma quantidade de por volta de 0,001 wt.% a por volta de 5 wt.%, por exemplo, a 0,01 wt.% a por volta de 1 wt.%, baseado no peso total da composição de combustível.
Em adição, melhoradores de viscosidade, que são tipicamente materiais poliméricos de pesos moleculares médio de número de desde por volta de 5.000 a por volta de 250.000, e modificadores de fricção, que são tipicamente compostos organo-molibdênio contendo enxofre podem ser adicionados em pequenas quantidades. Inibidores de espuma, que tipicamente incluem polímeros acil metacrilato ou polímeros dimetil sílica, podem também ser adicionados à composição de combustível em uma quantidade de menos que por volta de 10 ppm. Além disso, fixadores de selagem podem ser adicionados para garantir selagem de elastômero apropriada e prevenir falha de selagem prematura podem ser incluídos na composição de combustível.
EXEMPLOS
Os exemplos que seguem ilustram o engenheiramento de hospedeiros de produção para produzir derivados de ácidos graxos específicos. As vias biossintéticas envolvidas na produção de derivados de ácido graxo estão ilustradas nas figuras.
Por exemplo, FIG. 2 é um diagrama da via FAS ilustrando as enzimas diretamente envolvidas na síntese de acil-ACP. Para
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232/360 aumentar a produção de derivados de ácido graxo, tais como ceras, ésteres graxos, alcoóis graxos, e hidrocarbonos, uma ou mais das enzimas descritas lá podem ser super-expressas ou mutadas para reduzir a inibição autógena, com o intuito de aumentar a quantidade de acil-ACP produzido. Adicionalmente, enzimas que metabolizam os intermediários para fazer produtos baseados em ácidos não graxos (ex., reações extras) podem ser funcionalmente deletadas ou atenuadas para aumentar o fluxo de carbono através da via biossintética de ácido graxo (FAS). Nos exemplos abaixo, muitos hospedeiros de produção são descritos que foram modificados para aumentar a produção de ácido graxo.
FIGs. 4 e 5 ilustram via biossintéticas que podem ser engenheiradas para fazer ésteres graxos e alcoóis graxos, respectivamente. A conversão de cada substrato (ex. , acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graxo, e acil-CoA) para cada produto (ex. , acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graxo, acil-CoA, aldeídos graxos, ésteres graxos, e alcoóis graxos) pode ser alcançada utilizando vários polipeptídeos diferentes que são membros das classes de enzima indicadas.
Os exemplos abaixo descrevem microorganismos que foram engenheirados ou podem ser engenheirados a produzir alcoóis graxos, ésteres graxos, e hidrocarbonos específicos.
EXEMPLO 1. CONSTRUÇÃO DE HOSPEDEIRO DE PRODUÇÃO
Um hospedeiro de produção exemplar é LS9001. LS9001 foi produzido através da modificação C41(DE3) desde super-expressão (Saint Beausine, França) até mutante nulo do gene fadE (acilCoA desidrogenase).
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Resumidamente, a cepa mutante nulo de fadE de E. coli foi preparada utilizando oligos YafV_NotI e Ivry_Ol para amplificar por volta de 830 pb a montante de fadE e oligos Lpcaf_ol e LpcaR_Bam para amplificar por volta de 960 pb a jusante de fadE. PCR de sobreposição foi utilizado para criar uma construção para deleção em fase do gene fadE completo. A construção de deleção de fadE foi clonada no plasmídeo sensível a temperatura pKOV3, que contém um gene sacB para contra-seleção, e uma deleção cromossomal de fadE foi feita de acordo com o método Link et al. , J. Bact. 179:6228-6237, 1997. A cepa resultante não foi capaz de degradar ácidos graxos e acil-CoAs graxos. Essa cepa mutante nulo é aqui designada como E. coli (DE3, AfadE).
Outra cepa de deleção fadE, MG1655, foi construída de acordo com os procedimentos descritos por Datsenko et al., PNAS(USA), 97:6640-6645 (2000), com as modificações descritas abaixo. Os dois oligos utilizados para criar a deleção foram:
Del-fadE-F: 5'AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATC CGTCGACC; (SEQ ID NO:69) e
Del-fadE-R: 5'AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGC TGCTTC (SEQ ID NO:70).
Os oligos Del-fadE-F e Del-fadE-R cada contêm 50 bases de homologia com o gene fadE de E. coli e foram utilizados para amplificar o cassete de resistência a canamicina a partir do plasmídeo pKD13 através de PCT como descrito. O produto de PCR resultante foi utilizado para transformar células de E. coli
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MG1655 eletrocompetentes contendo pKD46. As células foram previamente induzidas com arabinose por 3-4 horas como descrito por Datsenko, supra. Seguindo 3 horas de crescimento em meio SOC a 37oC, as células foram plaqueadas em placas de ágar Luria 5 contendo 50 pg/mL de canamicina. Colônias resistentes foram isoladas após uma incubação durante a noite a 37oC. Disrupção do gene fadE foi confirmada em algumas das colônias através de amplificação por PCR utilizando oligos fadE-L2 e fadE-R1, que foram desenhados a flanquear o gene fadE.
fadE-L2 5'-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC (SEQ ID NO:71); e fadE-R1 5'-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG (SEQ ID NO:72)
Após a deleção fadE apropriada foi confirmada, uma colônia foi utilizada para remover o marcador KmR utilizando o plasmídeo pCP20. A cepa resultante é designada como MG1655 (AfadE).
Os hospedeiros com fadE deletados foram submetidos para ajustes adicionais. Um plasmídeo carregando os quatro genes que são responsáveis para atividade acetil-CoA carboxilase em E. coli (accA, accB, accC, e accD, N— de Acesso do GenBank:
NP_414727, NP_417721, NP_417722, NP_416819, EC 6.4.1.2) foram introduzidos. Os genes accABCD foram clonados em duas etapas como operons bicistrônicos nos sítios NcoI/HindIII e NdeI/AvrII de pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, WI, EUA), e o plasmídeo resultante foi designado como pAS004.126. Alternativamente, o hospedeiro de produção foi engenheirado a expressar accABCD 25 proveniente de Lactobacillus plantarum.
Modificações adicionais que foram incluídas em um
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235/360 hospedeiro de produção incluem os seguintes: super-expressão de aceEF (codificando o componente E1p desidrogenase e o componente
E2p dihidrolipoamida aciltransferase dos complexos piruvato e 2oxoglutarato desidrogenase); e fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (codificando FAS) proveniente de E. coli, Nitrosomonas europaea (ATCC 19718), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria, e levedura oleaginosa. Similarmente, hospedeiros de produção foram engenheirados a expressar accABCD (codificando acetil CoA carboxilase) proveniente de Pisum savitum. Porém, quando o hospedeiro de produção estava também produzindo butanol foi menos desejado expressar o homólogo de Pisum savitum.
Em alguns hospedeiros de produção, genes foram eliminados ou atenuados utilizando o método de Link, et al., J. Bacteriol. 179:6228-6237, 1997. Genes que foram eliminados ou atenuados incluíram gpsA (codificando sn-glicerol 3-fosfato desidrogenase biossintética, N_ de Acesso do GenBank NP_418065, EC: 1.1.1.94); ldhA (codificando lactato desidrogenase, N- de Acesso do GenBank
NP_415898, EC: 1.1.1.28); pflb (codificando formato acetiltransferase 1, N- de Acesso do GenBank P09373, EC:
2.3.1.54); adhE (codificando álcool desidrogenase, N_ de Acesso do GenBank CAA47743, EC: 1.1.1.1, 1.2.1.10); pta (codificando fosfotransacetilase, N_ de Acesso do GenBank NP_416800, EC:
2.3.1.8); poxB (codificando piruvato oxidase, N- de Acesso do
GenBank NP_415392, EC: 1.2.2.2); ackA (codificando acetato quinase, N- de Acesso do GenBank NP_416799, EC: 2.7.2.1), e combinações destes.
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Similarmente, a mutação PlsB[D311E] foi introduzida em
LS9001 para atenuar plsB para a deleção fadE. Essa mutação diminui a quantidade de carbono desviada da produção de fosfolipídeo. Um alelo codificando PlsB[D311E] foi feito através da substituição do códon GAC para aspartato 311 por um códon a GAA para glutamato. O alelo alterado foi preparado através de síntese gênica e o alelo selvagem plsB cromossomal foi trocado pelo alelo mutante plsB [D311E] utilizando o método de Link et al. (veja supra).
EXEMPLO 2. MODIFICAÇÕES DE HOSPEDEIROS DE PRODUÇÃO
Os seguintes plasmídeos foram construídos para a expressão de várias proteínas que são utilizadas na síntese de derivados de ácido graxo. As construções foram preparadas utilizando métodos padrão de biologia molecular. Todos os genes clonados 15 foram colocados sob o controle de promotores induzidos por IPTG (ex., um promotor T7, um promotor tac, ou um promotor lac).
O gene 'tesA (gene da tioesterase A, N- de Acesso do GenBank NP_415027 sem sequência líder (SEQ ID NO:31) (Cho e Cronan, J.
Biol. Chem., 270:4216-9, 1995, EC: 3.1.1.5, 3.1.2.-)) de E.
coli foi clonado em um vetor pETDuet-1 digerido com NdeI/AvrII (pETDuet-1 descrito aqui está disponível através da Novagen, Madison, WI, EUA). Genes codificando tioesterases (TEs) vegetais do tipo FatB proveniente de Umbellularia californica, Cuphea hookeriana, e Cinnamonum camphorum (N°2 de Acesso do GenBank:
UcFatB1=AAA34215, ChFatB2=AAC49269, ChFatB3=AAC72881,
CcFatB=AAC49151) foram individualmente clonados em três vetores diferentes: (i) pETDuet-1 digerido com NdeI/AvrII;
(ii) pBluescript KS+ digerido com XhoI/HindIII (Stratagene, La
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Jolla, CA, EUA, para criar proteínas de fusão lacZ::TE Nterminais); e (iii) pMAL-c2X digerido com Xbal/HindlII (New
England Lab, Ipswich, MA, EUA) (para criar fusões malE::TE Nterminais). O gene fadD (codificando acil-CoA sintase) proveniente de E. coli foi clonado em um derivado de pCDFDuet-1 digerido com NcoI/HindIII, que continha o gene acrl (acil-CoA redutase) proveniente de Acinetobacter baylyi ADP1 dentro de seus sítios NdeI/AvrII.
Tabela 7 provê um resumo dos plasmídeos gerados para fazer vários hospedeiros de produção exemplares.
Tabela 7: Resumo dos plasmídeos utilizados em hospedeiros de produção
Plasmídeo Organismo Fonte N- de Acesso do
GenBank & Número EC
Produto Gênico
pETDuet-1-'TesA coli Acessos: NP 415027,
'TesA EC: 3.1.1.5, 3.1 2.-
pETDuet-1-Teuc Umbellularia californica Q41635
pBluescript-TEuc UcFatB1
pMAL-c2X-TEuc AAA34215
pETDuet-1-Tech Cuphea hookeriana ABB71581
pBluescript-TEch ChFatB2 AAC49269
pMAL-c2X-TEch ChFatB3 AAC72881
pETDuet-1-Tecc Cinnamonum camphorum
pBluescript-TEcc CcFabB AAC49151
Teci
pETDuet-1-atFatA3 Arabidopsis thaliana NP 189147
pETDuet-1-HaFatA1 Helianthus annuus AAL769361
pCDFDuet-1-fadD- E. coli fadD:Acessos
acr1 NP 416319, 6.2.1.3 EC
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Plasmídeo Organismo Fonte Produto Gênico N- de Acesso GenBank & Número do EC
acrl:Acessos YP 047869
pETDuet-1-'TesA coli Acessos: NP 415027, EC: 3.1.1.5,-3.1.2.-
'TesA
pETDuet-1-Teuc Umbellularia californica Q41635
pBluescript-TEuc UcFatB1 AAA34215
pMAL-c2X-TEuc
pETDuet-1-Tech Cuphea hookeriana ABB71581
pBluescript-TEch ChFatB2 AAC49269
pMAL-c2X-TEch ChFatB3 AAC72881
pETDuet-1-Tecc Cinnamonumcamphorum
pBluescript-TEcc CcFatB AAC49151
Teci
pCDFDuet-1-fadD- acrl E. coli fadD:Acessos NP 416319, 6.2.1.3 EC
acrl :Accessions YP 047869
Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que diferentes plasmídeos e modificações genômicas podem ser utilizadas para obter cepas similares.
Os plasmídeos de expressão selecionados continham replicons e marcadores de resistência a antibióticos compatíveis para produzir sistema de expressão de quatro plasmídeos.
Em algumas concretizações, LS9001 pode ser co-transformada com: (i) qualquer um dos plasmídeos expressando TE; (ii) o plasmídeo expressando fadD, que também expressa acrl; e (iii) plasmídeo de expressão da éster sintase.
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Com será claro para alguém com habilidade básica na arte, quando LS9001 é induzido com IPTG, a cepa resultante irá produzir concentrações aumentadas de alcoóis graxos a partir de fontes de carbono tal como glicose.
EXEMPLO 3. PRODUÇÃO DE ÁLCOOL GRAXO NA CEPA RECOMBINANTE DE E. COLI
Alcoóis graxos foram produzidos através da expressão de um gene da tioesterase e um gene da acil-CoA redutase exogenamente 10 em um hospedeiro de produção. Mais especificamente, plasmídeos pCDFDuet-1-fadD-acrl (acil-CoA redutase) e pETDuet-1-'TesA (tioesterase) foram transformados na cepa de E. coli LS9001 e transformantes correspondentes foram selecionados utilizando placas LB suplementado com espectinomicina 100 mg/L e 15 carbenicilina 50 mg/L. Quatro transformantes de LS9001/pCDFDuet1-fadD-acrl foram independentemente inoculados em 3 mL de um meio M9 suplementado com carbenicilina 50 mg/L e espectinomicina 100 mg/L. As amostras contendo os transformantes foram cultivados a 25°C em um agitador (agitando a por volta de 250 rpm) até eles atingirem DO600 0,5. Depois, 1,5 mL de cada amostra foi transferido em um frasco 250 mL contendo 30 mL do meio M9 descrito acima. A cultura resultante foi crescida a 25°C em um agitador até atingir uma DO600 entre 0,5-1,0. IPTG foi então adicionada a uma concentração final de 1 mM. O crescimento celular continuou por 40 horas.
As células foram então centrifugadas e precipitadas a 4.000 rpm. O precipitado celular foi suspendido em 1,0 mL de metanol.
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240/360 mL de acetato de etila foi então misturado com as células suspendidas, seguida pela adição de 3 mL de H2O. Após, a mistura foi sonicada por 20 minutos. A amostra resultante foi centrifugada a 4.000 rpm por 5 minutos. Então a fase orgânica (a fase superior), que continha álcool(óis) graxo(s), foi submetida à análise GC/MS. O álcool total (incluindo tetradecanol, hexadecanol, hexadecenol, e octadecenol) foi titulado em por volta de 1-10 mg/L. Quando uma cepa de E. coli carregando somente vetores vazios foi cultivado sob as mesmas condições e seguindo o mesmo protocolo, uma titulação de alcoóis graxos de apenas 0,2-0,5 mg/L foi obtida.
EXEMPLO 4. PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS (FA) E ETIL ÉSTERES DE
ÁCIDO GRAXO (FAEE) CONTENDO CADEIAS DE CARBONO DE NÚMERO ÍMPAR
SEM METAIS PESADOS
Produção de amostra de biodiesel #23-30
A amostra de biodiesel #23-30 (amostra #23-30”) foi produzida através de cultivo de biorreator de uma cepa de E. coli (C41 DE3 hfadE hfabR 'TesA fadD adplws) engenheirada para produzir ésteres graxos. Um protocolo de inóculo em dois estágios foi utilizado para expansão da cultura. O primeiro estágio consistiu na inoculação de 50 mL de meio LB (suplementado com carbenicilina 100 pg/L e espectinomicina 100 pg/L) em um frasco balão de agitação de 250 mL com um 1 mL de ampola estoque congelada de cepa de E. coli de produção de éster. Esse frasco de semeadura foi incubado a 37°C por aproximadamente 7 horas (DO600 final = 4,5, pH 6,7), após os quais 3 mL da cultura primária foram transferidos para cada um dos três frascos balão de 2 L contendo 350 mL de meio F1 mínimo tamponado que também continha
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241/360 carbenicilina 100 pg/L e espectinomicina 100 pg/L. O tampão do frasco de agitação utilizado foi Bis-Tris propano em uma concentração final de 200 mM (pH 7,2). Esses frascos de semeadura secundários foram incubadas a 37°C por aproximadamente 18 horas (DO600 final = 12, pH 5,5) e os conteúdos foram utilizados para inocular três biorreatores de 14 L com um volume inicial de 6,5 litros de meio F1 mínimo tamponado seguindo de inoculação. Esses biorreatores também contêm carbenicilina 100 pg/L e espectinomicina 100 g/L.
Esses biorreatores de 14 L foram inicialmente cultivados a 37°C, e os níveis de oxigênio dissolvido foram mantidos a 30% de saturação, utilizando a agitação e as voltas de cascata de enriquecimento de oxigênio. O pH da mistura de fermentação foi mantido a 7,2, utilizando H2SO4 1 M e gás amônia anidro. Uma alimentação de nutrientes consistindo primariamente de 43% (w/v) de glicose foi iniciada em cada biorreator quando a carga original de glicose 5 g/L no meio basal foi exaurida. A taxa de alimentação de solução de glicose foi então manualmente ajustada para a duração da corrida de fermentação para manter a glicose residual a um valor baixo (porém não zero) pela duração da corrida de fermentação. Culturas foram induzidas com uma concentração final de IPTG 1 mM quando a DO600 das culturas atingiu 30. Nesse ponto de indução, a temperatura de cultivo de biorreator foi reduzido para 30°C, e por volta de 15 mL/L (em uma base de volume de 6,5 a 7-Litros) de etanol foi adicionado à cultura e monitorada através de HPLC ao longo do experimento. Etanol adicional foi adicionado periodicamente aos biorreatores para manter as concentrações residuais em por volta de 20 mL/L. Os conteúdos dos biorreatores foram coletados após por volta de
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242/360 horas de cultivo, com por volta de 10 L do caldo coletado de cada um dos três biorreatores.
Esses caldos coletados foram combinados e extraídos com um volume equivalente de acetato de etila sendo misturados a temperatura ambiente por duas horas. Os extratos de caldo foram então centrifugados (3.500 rpm, 30 minutos) para separar as camadas líquidas, seguido pela remoção da camada orgânica para processamento adicional. Acetato de etila foi quase completamente removido (<0,3% de resíduo, como determinado através de GC/FID) da camada orgânica utilizando evaporação rotatória (Büchi, R-200), deixando por volta de 90 mL de um líquido escuro, oleoso. Esse líquido foi referido como amostra #23-30.
Quantificação de FA e FAEE na amostra #23-30
GC-MS foi desempenhada utilizando sistema Agilent 5975B MSD equipado com uma coluna DB-5 de 30 m x 0,25 mm (filme de 0,10 pm). A temperatura da coluna foi de isotérmico de 3 minutos a 100°C. A temperatura foi programada a subir de 100°C a 320°C a uma taxa de 20°C/min. Quando a temperatura final de 320oC foi alcançada, a coluna se manteve isotérmica por 5 minutos naquela temperatura. O volume de injeção foi de 1 pL. O gás carreador, hélio, foi liberado a 1,3 mL/min. O espectrômetro de massa foi equipado com uma fonte de ionização de impacto de elétrons. A temperatura da fonte de ionização foi ajustada para 300°C.
Padrões de FAEE (ex., etil dodecanoato, etil tetradecanoato, etil crs-9-hexadecenoato, etil hexadecanoato, etil octadecanoato, todos >99%); padrões de metil éster de ácido graxo (FAME) (ex. , metil dodecanoato, metil tetradecanoato, metil
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243/360 pentadecanoato, metil cis-9-hexadecenoato, metil hexadecanoato, metil cis-11-octadecenoato, todos >99%);
trimetilsilildiazometano (TMSD, 2 M em hexano); ácido hidroclorídrico (37%); metanol (>99,9%); e acetato de etila (>99,9%) quando comprados da Sigma-Aldrich e aplicados sem purificação prévia.
A amostra #23-30 foi derivatizada através da adição de 50 pL de trimetilsilildiazometano (TMSD), 8 μΐ de HCl, e 36 μΐ de metanol a 1 mL de amostra (1 mg/mL em acetato de etila). A 10 mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora.
Antes da quantificação, o FAEE e FAME em amostra #23-30 foram identificadas utilizando dois métodos. Primeiro, o tempo de retenção GC de cada composto foi comparado ao tempo de retenção de um padrão conhecido. segundo, identificação de cada 15 composto foi confirmado através da comparação do espectro de massa do composto com um espectro de massa do padrão na biblioteca de espectros de massa.
Quando um padrão para um FAEE ou FAME estava disponível, a quantificação do FAEE ou FAME foi determinado através da geração 20 de uma curva de calibração (concentração X resposta do instrumento). Uma relação linear entre a resposta do instrumento e a concentração do analito foi então obtida. A concentração do composto na amostra foi determinada através da obtenção sua reposta de instrumento e referenciando à curva de calibração.
Quando um padrão para um FAEE não estava disponível, uma resposta média de instrumento foi utilizada para determinar as concentrações de composto. Foi tirada uma média da inclinação e
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244/360 interseção para todas as curvas de calibração existentes. A partir dessas médias, uma relação linear entre concentrações e resposta do instrumento foi determinada. As concentrações de compostos desconhecidos foram então determinadas através de referência das respostas de instrumento com a relação linear entre resposta de instrumento e concentração utilizando Equação 1.
Equação 1: concentração = (resposta de instrumento interseção média)/inclinação média
Após identificação e quantificação do FAME, a concentração dos ácidos graxos livres associados foi determinada baseado na concentração de FAME e a proporção de peso molecular de FA para FAME. Finalmente, a concentração de FAEE e FA em mg/L foi convertida em porcentagem na amostra de biodiesel (w/w %).
As concentrações de FAEE e FA na amostra #23-30 são listadas na Tabela 8. A concentração total de FAEEs e FAs foi de 80,7%. O resto dos compostos desconhecidos pode ser analisado através do método LC/MS/MS. Etil pentadecanoato, etil cis-9hexadecenoato, etil hexadecanoato e etil cis-11-octadecenoato foram os componentes principais da amostra #23-30.
Tabela 8: Porcentagem de FAEE e FA na amostra #23-30
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Figure BRPI0923572B1_D0022
*Porcentagem é w/w %.
Surpreendentemente, amostra #23-30 continha FA e FAEE de número ímpar.
Análise de elementos quantitativa de amostra #23-30
Metais pesados são conhecidos por contaminar os produtos de catálise utilizados na quebra catalítica. Para medir os níveis de metais pesados na amostra #23-30, amostra #23-30 foi enviada
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246/360 para Galbraith Laboratories, Inc., para análise de elementos quantitativa de arsênico, cálcio, carbono, cloro, cobalto, cobre, hidrogênio, ferro, água de Karl Fisher, chumbo, manganês, magnésio, mercúrio, molibdênio, nitrogênio, potássio, sódio, enxofre, zinco, oxigênio, e fósforo. Métodos preparatórios e analíticos são descritos abaixo. Resultados são mostrados na Tabela 9. Todas as quantidades na Tabela 9 estavam abaixo do nível de quantificação (LOQ) exceto para carbono (73,38%), cloro (91 ppm), hidrogênio (12,1%), água de Karl Fisher (0,998%), mercúrio (0,057 ppm), oxigênio (14,53%), e fósforo (343 ppm). Portanto, amostra #23-30 não continha altos níveis de metais pesados em questão.
Método G-52, Rev 6: Digestão em micro-ondas de amostras para análise de metais
Uma quantidade apropriada de amostra foi pesada em um frasco para micro-ondas próximo a 0,001 g. Os reagentes apropriados foram então adicionados ao frasco para micro-ondas. Se uma reação visível foi observada a reação foi permitida a cessar antes de se tampar o frasco. O frasco foi então selado e colocado no micro-ondas de acordo com as instruções do fabricante. A temperatura de cada frasco atingiu um mínimo de 180 ± 10°C em 5 minutos. Ele foi mantido a um mínimo de 180 ± 10°C por 10 minutos. No final do programa de micro-ondas os frascos foram permitidos a resfriar por um mínimo de 5 minutos antes da remoção. Os frascos foram então destampados e transferidos para frascos volumétricos para análise por técnico apropriado.
Método G-55, Rev 3: Combustão de bomba de oxigênio Parr para a determinação de halógenos
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Amostras foram pesadas em um copo de combustão, e óleo mineral foi adicionado com um auxiliar de combustão. Para medições de cloro (Cl) e bromo (Br), solução de peróxido de hidrogênio 1% foi adicionada na bomba. Para medições de enxofre (S), uma solução de hidróxido de sódio 0,01 N foi adicionada. A amostra e copo foram selados em uma bomba de combustão de oxigênio Parr juntamente com uma solução de absorção apropriada. A bomba foi purgada com oxigênio, então pressurizada a uma pressão de oxigênio de 25-30 atm, e foi dada a ignição. Depois, 10 os conteúdos da bomba foram bem misturados e transferidos para um beaker para análises subsequentes.
Método G-30B, Rev 7: Digestão de cinza úmida de compostos inorgânicos e orgânicos para análise de metais
A amostra foi queimada utilizando H2SO4. Quando analisando para metais que formam sulfatos insolúveis, HClO4 e HNO3 foram utilizados para queimar o material orgânico. Após queima da amostra, HNO3 foi adicionada e a amostra foi ressuspendida para solubilizar os metais presentes. Quando a solução se tornou turva, HCl foi adicionado para auxiliar na completa digestão. HF pode ser utilizado quando silício estava presente na amostra porém somente se silício não era um analito de interesse. Todos HF utilizados foram restritos a frascos de Teflon. O produto de digestão translúcido foi quantitativamente transferido para uma frasco volumétrico Classe A e completado ao volume final. A amostra foi então analisada.
Método ME-4A Rev 2: Determinação de ânions suprimidos através de cromatografia de íon
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Instrumento Dionex Model DX500
Coluna de Dionex IonPac AS9-SC 4 x 250 mm
Cromatografia
Eluente Na2CO3 2.4 NaHCO3 1,8 mM
mM
Preparação Amostras aquosas podem ser analisadas sem
preparação. Amostras solúveis em água são
tipicamente transferidas por peso para um volume
conhecido. Outros materiais sólidos que não são
solúveis em água podem ser extraídos para
determinar quantidades capazes de ser extraídas de
vários ânions ou sofrer combustão para determinar
quantidades totais de um elemento tais como Cl ou
Br.
Calibração Padrões para concentração de amostra nos
colchetes. 0,2 mg/L - 4,0 mg/L
Introdução da Auto injeção (Hitachi Model AS7200)
Amostra
Determinação Detecção de condutividade/regressão linear
Limite de Geralmente 0,2 mg/L em solução.
quantificação
Interferências Ânions com tempo de retenção similares; picos
sobrepostos dos principais ânions constituintes.
Método S-300 Rev 7: Determinação de água através de titulação coulométrica (Karl Fischer)
Esse método combina coulometria com a titulação de Karl
Fischer. A amostra foi misturada com uma mistura de amino-metanol contendo predominantemente íon iodo (I-) e dióxido de enxofre.
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O iodo produzido no anodo através de eletrólise foi permitido a reagir com água. Em tais casos, iodo foi produzido em proporção direta com a quantidade de eletricidade de acordo com a Lei de Faraday. Também, devido ao fato de 1 mole de água reagir estequiometricamente com 1 mole de iodo, 1 mg de água foi equivalente a 10,71 coulombs de eletricidade. Utilizando esse princípio, o Moisture Meter determinou a quantidade de água diretamente do número de coulocombs requeridos para a eletrólise. Esse procedimento inclui tanto introdução direta e uma técnica de pré-tratamento de vaporizador.
Preparação Pesar para obter 100 pg a 3 mg de H2O; Proteger Amostras de umidade atmosférica durante pesagem e transferência.
Instrumento Mitsubishi Moisture Meter MCl Model CA-06 (Inst. #569) Mitsubishi Moisture Vaporizer, Model CA/VA-06 (Inst. #568)
Controle Monoidrato tartrato de sódio (15,66%); Frequência: a cada 10 amostras, um a cada dia no mínimo, 95-105% de recuperação
Introdução de amostra Porta de entrada, Transferência direta; capilar, seringa, ou concha B. Fornalha, cápsulas de estanho (Water Vaporizer VA06); Temperatura varia, 200°C é o valor padrão utilizado para padrões. Maioria das amostras analisadas a 160°C. Outras temperaturas mediante solicitação.
Determinação Titulação coulométrica de reagente Karl Fischer via
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titulador automático
Limite de Quantificação 100 pg de H2O
Precisão & Acurácia Monidrato Tartrato de Sódio RSD 1,35% 1,34% RE -0,54% -2,13% INSTR# 569 568
Equações (2I- - 2e- I2); (I2 + SO2 + 3C5H5N + H2O 2C5H5N HI + C5H5N SO3) pg H2O / spl wt (g) = ppm H2O pgH2O x 0,1 / spl wt (mg) = % H2)
Interferências (transferência direta somente) álcali livre; agente oxidador, redutor; mercaptanos
Método E16-2, rev 9 (Traço E16-2A): Determinação de enxofre utilizando LECO SC-432DR
O SC-432DR Sulfur Analyzer é um instrumento de infravermelho não dispersivo, controlado digitalmente desenhado para medir o conteúdo de enxofre em uma variedade de materiais orgânicos e inorgânicos. A amostra sofreu combustão a 1350 ± 50°C em uma atmosfera de oxigênio puro. O enxofre foi oxidado a dióxido de enxofre e quantificado através de absorção de infravermelho. O 10 SC-432DR foi equipado com dois detectores, uma célula infravermelha de alta abrangência e uma de baixa abrangência.
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Instrumento LECO SC-432DR Sulfur Analyzer
Introdução da Pesar amostra em aproximadamente 0, 01 mg. Pesar
Amostra amostras diretamente em recipiente de pesagem
tarado em balança eletrônica. Peso
automaticamente transferido para banco de dados
SC432. Cobrir amostra com acelerador de combustão
LECO Com-Cat como requisitado para tipo de
amostra.
Calibração Três condicionadores de cisteína 5- 10 mg. Sete
padrões de calibração de 30-175 mg de NIST SRM
8415 Whole Egg Powder (0,512% S) Calibração
interna utilizando uma curva regressiva
quadrática.
Controle NIST SRM 1549 Milk Powder (0,351%); outros para
combinar tipo de amostra.
Frequência: um para cada dez amostras.
Determinação Combustão de O2 atmosférico a 1350°C.
Determinação de SO2 resultante através de
detector de infravermelho.
Limite de 0,08 mg S
Quantificação
Cálculos Internos
Precisão & RSD (%) Recuperação de Média (%)
Acurácia (leite
2,60 97,97
em pó)
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Método ME-2, Rev 14: Determinação de carbono, hidrogênio, e nitrogênio
Esse instrumento queima amostra em oxigênio puro a 950°C sob condições estáticas para produzir produtos de combustão de
CO2, H2O, e N2. O PE-240 automaticamente analisa esses produtos em um analisador auto-integrante, de condutividade termal em estado de equilíbrio. Anidrido de tungstênio pode ser adicionado para auxiliar na combustão. Um tempo de combustão estendido (ex., modo “burn hard”) pode ser empregado em amostras de difícil 10 combustão.
Instrumento PerkinElmer 240 Elemental Analyzer (Instrument # 409, 410)
Introdução da Amostra Pesar 1,0-2,5 mg em cápsula de Al capsule; frisar (Veja Procedimento GLI G-6) para líquidos; lavado com solvente antes de pesar se requisitado
Decomposição Combustão a >950°C, redução a >675°C = CO2, H2O, N2
Calibração Ciclohexanona-2,4-dinitrofeilhidrazona (1- 2,5 mg)
Controle s-1409, 2-1410: Ciclohexanona-2,4- dinitrofeilhidrazona (51,79% C, 5,07% H, 20,14% N)
Determinação CO2, H2O, N2 através de analisador de condutividade termal
Quantificação 0,5% C, 0,5% H, 0,5% N
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Precisão & Acurácia RSD% Recuperação média (%) Instrument #409 Instrument #410
C H N C H N
0.28 1026 0.39 0.35 1.12 0.41
99.94 101.25 99.86 100.13 100.40 100.04
Interferências Metais e alguns halógenos causam combustão incompleta. Auxiliares de combustão e/ou um tempo de combustão estendido podem ser utilizados para aliviar esse problema.
Cálculos Instrumento calcula e imprime resultados w/w para %C, %H, e %N. Para amostras frisadas em uma cápsula de alumínio, o %N é corrigido com um fator;
(pV/pg amostra/K) x 100 = % Elemento, onde K = calibração = pV/pg de C, ou H, ou N
Método ME-70, Rev 4: Espectrometria de emissão atômica de plasma induzivelmente acoplada
Esse método descreve determinações multi-elementares através de ICP-AES utilizando sistemas óticos simultâneos e observação axial ou radial do plasma. O instrumento mede os espectros característicos através de espectrometria ótica.
Amostras foram nebulizadas e o aerossol resultante foi transportado para a tocha de plasma. Espectro de emissão específico de elemento foram produzidos através de plasma 10 induzivelmente acoplado de radio frequência. Os espectros foram dispersos através de um espectofotômetro de grade, e as
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254/360 intensidades das linhas de emissão foram monitoradas através de dispositivos fotossensíveis. Correção de ruído foi requerida para determinação de elemento de traço. O ruído foi medido para linhas de analitos em amostras durante a análise. A posição 5 selecionada para a medição de intensidade de ruído, em qualquer um ou ambos os lados da linha analítica, foi determinada através da complexidade do espectro adjacente à linha do analito. Em um modo de análise, a posição utilizada deveria ser o mais livre possível de interferência de espectro e deveria refletir a mesma 10 mudança em intensidade de ruído como ocorre no comprimento de onda do analito medida. Correção de ruído não é requerida em casos de alargamento de linha onde a medição de correção de ruído seria na verdade degradar o resultado analítico.
Instrumento ICP-OES Optima 5300, 3300DV e 4300DV, ou equivalente
Decomposição Antes da análise, amostras devem ser acidificadas ou digeridas utilizando Métodos de Preparação de Amostra apropriados.
Calibração 0,01 ppm - 60 ppm mais calibrações específicas de matriz
Introdução da Bomba peristáltica, nebulizador de fluxo cruzado,
Amostra nebulizador GemCone, câmara de spray tipo Scott da Ryton e câmara de spray ciclônico de quartzo
Determinação Emissão atômica através de plasma de radio frequência induzivelmente acoplado de espectros de emissão específico de elemento através de espectrofotômetro de grade monitorado por dispositivos fotossensíveis.
Limite de Específico de elemento e calibração variando de 0,01-2
Quantificação ppm
Precisão & ± 10% RSD
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Acurácia
Interferências De espectro, química, física, memória
Cálculos wt % = (fc χ v/10 x D)/spl ppm = (fc x v x D)/SPL Onde fc = concentração final em pg/mL; v = volume de amostra em mL; D = fator de diluição; spl = massa de amostra em mg; SPL = massa de amostra em g
Método E80-2, Rev 4: Determinação de mercúrio (técnica de vapor frio automatizada)
Esse procedimento é baseado em EPA SW846 Método 7471A.
Absorção Atômica de Vapor Frio é baseada na teoria geral de absorção atômica, que acredita que átomos livres do analito absorve energia a partir de uma fonte de lâmpada que é proporcional à concentração do analito. Através da utilização de uma lâmpada contendo o metal a ser medido, o comprimento de onda exato necessário para absorção foi produzido e interferências 10 foram fortemente reduzidas. Absorção Atômica de Vapor Frio utiliza esse princípio, e os átomos de mercúrio foram liberados através da redução de íons de mercúrio com Cloreto de Estanho (II) (SnCl2). Gás de nitrogênio carregou os átomos através de uma célula ótica, com a lâmpada de Hg em uma extremidade e o 15 detector na outra extremidade. Devido ao fato do método de vapor frio ter sido empregado, ao invés de um método de chama, compostos orgânicos não digeridos foi uma preocupação de interferência, devido as suas amplas bandas de comprimento de onde da absorção.
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Instrumento PerkinElmer FIMS 400 Automated Mercury Analyzer ou equivalente
Decomposição Variável, geralmente digestão de micro-ondas ou
digestão em banho de água quente de permanganato
Calibração 0,1 - 5,0 pg/L
Introdução da Coletor de amostra automatizado, bomba
Amostra peristáltica
Determinação Comprimento de onda primário 253,7 nm, utilizando
um detector de estado sólido
Limite de Varia com o método de preparação e matriz de
Detecção amostra
Precisão & Para digestão em micro- Para digestão com MnO 4
Acurácia ondas: :
RE -2,47% 4,90%
RSD 7,48% 5,20%
Interferências Compostos orgânicos não digeridos
Cálculos pg/L em solução x volume (mL) x fator
de diluição
ppb Hg =
peso de amostra (g)
Tabela 9: Análise quantitativa de elementos da amostra #2330
Elemento Método de Preparação Método Analítico Resultado
Arsênico G-52 ME-70 <25 ppm
Cálcio G-30B ME-70 <119 ppm
Carbono N/A ME-2 73,38%
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Cloro G-55 ME-4a 91 ppm
Cobalto G-30B ME-70 <23 ppm
Cobre G-30B ME-70 <23 ppm
Hidrogênio N/A ME-2 12,1%
Ferro G-30B ME-70 <136 ppm
Água Karl Fisher N/A S-300 0,998%
Chumbo G-52 ME-70 <25 ppm
Manganês G-30B ME-70 <23 ppm
Magnésio G-30B ME-70 <23 ppm
Mercúrio G-52 E80-2 0,057 ppm
Molibdênio G-30B ME-70 <23 ppm
Nitrogênio N/A ME-2 < 0,5%
Potássio G-30B ME-70 <103 ppm
Sódio G-30B ME-70 <140 ppm
Enxofre N/A E16-2a <0,140%
Zinco G-30B ME-70 <23 ppm
Oxigênio N/A Subtração* 14,53%
Fósforo G-30B ME-70 343 ppm
Resultados apresentados como “< estão abaixo do LOQ. * Conteúdo de oxigênio foi determinado através da subtração dos resultados observados para todos os outros elementos a partir de 100%.
EXEMPLO 5. PRODUÇÃO E LIBERAÇÃO DE ÁLCOOL GRAXO A PARTIR DE
HOSPEDEIRO DE PRODUÇÃO acrl (codificando uma acil-CoA redutase) foi expressa em E.
coli cultivada com glicose como a única fonte de carbono e energia. A E. coli produziu pequenas quantidades de alcoóis 10 graxos tais como dodecanol (C12:0-OH), tetradecanol (C14:0-OH), e hexadecanol (C16:0-OH). Em outras amostras, FadD (acil-CoA sintase) foi expressa junto com acrl em E. coli. Um aumento de cinco vezes na produção de álcool graxo foi observada.
Em outras amostras, acrl, fadD, e accABCD (acetil-CoA carboxilase), em um plasmídeo carregando accABCD construído como
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258/360 descrito no EXEMPLO 1, foram expressos juntamente com várias tioesterases individuais (TEs) em E. coli C41 (DE3) selvagem e uma E. coli C41 (DE3 EfadE, uma cepa sem acil-CoA desidrogenase). Isso resultou em aumentos adicionais na produção de álcool graxo e modulação dos perfis de alcoóis graxos (veja FIG. 5). Por exemplo, super-expressão de E. coli 'TesA (pETDuet-1-'TesA) nesse sistema atingiu um aumento de por volta de 60 vezes em C12:0-OH, C14:0-OH e C16:0-OH, com C14:0-OH sendo o álcool graxo majoritário. Um resultado muito similar foi obtido quando a enzima ChFatB3 (FatB3 proveniente de Cuphea hookeriana em pMAL-c2X-TEcu) foi expressa. Quando a enzima UcFatB1 (FatB1 proveniente de Umbellularia californicain em pMAL-c2X-TEuc) foi expressa, a produção de álcool graxo aumentou em por volta de 20 vezes e C12:0-OH foi o álcool graxo predominante.
Expressão de ChFatB3 e UcFatB1 também levou à produção de quantidades significativas dos alcoóis graxos insaturados C16:1OH e C14:1-OH, respectivamente. Alcoóis graxos foram também encontrados no sobrenadante de amostras geradas a partir da expressão de 'tesA. A 37°C, por volta de quantidades iguais de alcoóis graxos foram encontrados no sobrenadante e no precipitado celular. Enquanto a 25°C, por volta de 25% dos alcoóis graxos foi encontrado no sobrenadante. Veja FIG. 6.
EXEMPLO 6. PRODUÇÃO DE ÁLCOOL GRAXO UTILIZANDO UMA VARIEDADE DE ACIL-COA REDUTASES
Esse exemplo descreve produção de álcool graxo utilizando uma variedade de acil-CoA redutases. Alcoóis graxos podem ser o produto final. Alternativamente, as células de hospedeiro de produção podem ser engenheiradas a expressar/super-expressar
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259/360 adicionalmente éster sintases para produzir ésteres graxos.
Cada um dos quatro genes codificando acil-CoA graxo redutases (Tabela 10) provenientes de várias fontes foram otimizados em relação ao códon para expressão em E. coli e sintetizados pela Codon Devices, Inc. (Cambridge, MA, EUA). Cada um dos genes sintetizados foi clonado como um fragmento NdelAvrlI no vetor pCDFDuet-1-fadD (descrito no Exemplo 2). Cada um dos plasmídeos carregando esses genes de acil-CoA redutase com o gene fadD de E. coli foi transformado na cepa de E. coli cepa C41 (DE) (obtido da Over-expression).
As cepas recombinantes foram cultivadas em 3 mL de um caldo LB (suplementado com espectinomicina 100 mg/L) a 37°C durante a noite. 0,3 mL da cultura crescida durante a noite foi transferida para 30 mL de um meio M9 fresco (contendo espectinomicina 100 mg/L) e cultivada a 25°C. Quando as culturas atingiram DO600 de 0,5, 1 mM de IPTG foi adicionado. Cada cultura foi alimentada com 0,1% de um dos três ácidos graxos dissolvidos em H2O a pH 7,0. Os três ácidos graxos alimentados foram dodecanoato de sódio, miristato de sódio, ou palmitato de sódio. Uma cultura sem a adição de ácido graxo foi também incluída como um controle. Após indução, as culturas foram permitidas a crescer na mesma temperatura por 40 horas adicionais a 25°C.
A quantificação de produtividade de ácido graxo ao final da fermentação foi desempenhada utilizando GC-MS como descrito no EXEMPLO 3 e/ou EXEMPLO 4. O álcool graxo resultante produzido a partir do ácido graxo correspondente é mostrado na Tabela 11. Os resultados indicaram que três acil-CoA redutases - Acr1, AcrM, e BmFAR - foram capazes de converter todos os três ácidos graxos
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260/360 em alcoóis graxos correspondentes. Os resultados também indicaram que hFAR e JjFAR apresentaram atividade quando miristato e palmitato eram o substrato. Porém, não houve ou houve pouca atividade quando dodecanoato era o substrato. mFAR1 e mFAR2 5 somente demonstraram pequena atividade com miristato e não demonstraram atividade com os outros dois ácidos graxos.
Tabela 10: Acil-CoA redutases
Acil-CoA redutase Número Identidade de Acesso da Proteína Fontes de Proteína
mFAR1 AAH07178 Mus musculus
mFAR2 AAH55759 Mus musculus
JjFAR AAD38039 Simmondsia chinensis
BmFAR BAC79425 Bombyx mori
Acr1 AAC45217 Acinetobacter baylyi ADP1
AcrM BAB85476 Acinetobacter sp. Ml
hFAR AAT42129 Homo sapiens
Tabela 11: Produção de álcool graxo
coli Genes Acil- CoA Área de Picoc
Dodecanoa to Miristato Palmitato Sem suplemento de ácido graxoa
C41(DE3 ) Redutas e /dodecano lb /tetradecano lb /hexadecano lb /hexadecan ol
mFARl 7.400 85.700 8.465 70.900
mFAR2 2.900 14.100 32.500 25.800
JjFAR 5.200 8.500 53.112 33.800
BmFAR 35.800 409.000 407.000 48.770
acrl 202.000 495.000 1.123.700 58.515
acrM 42.500 189.000 112.448 36.854
hFARl 5.050 59.500 109.400 94.400
controle vetor do 4.000 1.483 32.700 27.500
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controle do meio 10.700 1.500 25.700 25.000
Nota: a Somente hexadecanol foi quantificada nesse caso. b Ácido graxo alimentado/álcool graxo produzido. cA área de pico do álcool graxo produzido.
EXEMPLO 7. ÉSTERES GRAXOS DE CADEIA MÉDIA
Álcool acetil transferases (AATs, EC 2.3.1.84), que são responsáveis pela produção de acetato de acila em várias plantas, pode ser utilizada para produzir ésteres graxos de comprimento de cadeia médio, tais como octanoato de octila, decil octanoato, decil decanoato, e similares. Ésteres graxos, sintetizados a partir de álcool de cadeia média (tal como C6 e C8) e acil-CoA ou ácidos graxos de cadeia média (tal como C6 e C8) apresentam pontos de derretimento relativamente baixos. Por exemplo, hexil hexanoato apresenta um ponto de derretimento de por volta de -55°C e octanoato de octila apresente um ponto de derretimento de por volta de -18°C a por volta de -17°C. Os baixos pontos de derretimento desses compostos os tornam apropriados para uso como biocombustíveis.
Nesse exemplo, um gene SAAT codificando uma tioesterase foi co-expresso em um hospedeiro de produção E. coli C41(DE3, bfadE) (como descrito em International Application No. PCT/US08/058788, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência) com fadD proveniente e E. coli e acrl (álcool redutase proveniente de A. baylyi ADP1). Ácido octanóico foi provido no caldo de fermentação. Isso resultou na produção de octanoato de octila. Similarmente, quando e o gene da éster sintase proveniente de A. baylyi ADP1 foi expresso no hospedeiro de
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262/360 produção ao invés do gene SAAT, octanoato de octila foi produzido.
Um gene recombinante SAAT foi sintetizado pela DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025, EUA). A sequência de DNA sintetizada foi 5 baseada na sequência gênica publicada (N° de Acesso do GenBank AF193789), porém modificada para eliminar o sítio NcoI. O gene SAAT sintetizado (como um fragmento BarnHI-HindlII) foi clonado em pRSET B (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA), linearizado com BarnHI e HindIII. O plasmídeo resultante, pHZ1.63A foi co10 transformado em uma E. coli hospedeira de produção com pAS004.114B, que carrega um gene fadD proveniente de E. coli e gene acrl proveniente de A. baylyi ADP1. Os transformantes foram cultivados em 3 mL de um meio M9 contendo glicose 2%. Após indução com IPTG e adição de ácido octanóico 0,02%, a cultura 15 foi permitida a crescer a 25°C por 40 horas. 3 mL de acetato de etila foi então adicionado a cultura inteira e misturado várias vezes utilizando um misturador. A fase de acetil acetato foi analisada através de GC/MS.
Surpreendentemente, nenhum acetato de acila foi observado 20 no extrato de acetil acetato. Porém, octanoato de octila foi observado. Porém, a cepa controle sem o gene SAAT (C41(DE3, AfadE)/pRSET B+pAS004.114B) não produziu octanoato de octila. Além disso, a cepa (C41(DE3, AfadE)/pHZ1.43 B+pAS004.114B) na qual o gene da éster sintase proveniente de A. baylyi ADP1 foi 25 carregado pelo pHZ1.43 produziu octanoato de octila (veja FIGs
8A-D).
A descoberta de que a atividade de SAAT produz octanoato de octila torna possível a produção de ésteres graxos de cadeia
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263/360 média, tais como octanoato de octila e decanoato de octila, que apresenta baixos pontos de derretimento e são apropriados para uso como biocombustíveis e para substituição de biodiesel baseado em triglicerídeos.
EXEMPLO 8. PRODUÇÃO DE ÉSTERES GRAXOS NA CEPA DE E. COLI LS9001
Ésteres graxos foram produzidos através de engenheiramento de um hospedeiro de produção para expressar uma acil-CoA redutase, tioesterase formadora de álcool graxo, e uma éster sintase. Logo, o hospedeiro de produção produziu tanto o lado A quanto o lado B do éster e a estrutura de ambos os lados foi influenciada pela expressão do gene de tioesterase.
A cepa LS9001 foi transformada com plasmídeos carregando um gene de éster sintase proveniente de A. baylyí ADP1 (plasmídeo pHZ1.43), um gene de tioesterase proveniente de Cuphea hookeríana (plasmídeo pMAL-c2X-Tech), e um gene fadD proveniente de E.colí (plasmídeo pCDFDuet-1-fad).
Plasmídeo pHZ1.43 carregando a éster sintase (WSadp1, N_ de Acesso do GenBank AA017391, EC 2.3.175) foi construído como se segue. Primeiro o gene para Wsadp1 foi amplificado com os seguintes oligos utilizando sequência de DNA genômico proveniente de A. baylyí ADP1 como molde:
WSadp1_NdeI, 5'-TCATATGCGCCCATTACATCCG -3' (SEQ ID NO: 35); e
WSadp1_Avr, 5'- TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3' (SEQ ID NO:36).
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Depois, o produto de PCR foi digerido com NdeI e AmrII e clonado em pCOLADuet-1 para gerar pHZ 1.43. O plasmídeo carregando wSadpl foi então co-transformado em E. coli cepa LS9001 com tanto pETDuet-1'TesA quanto pCDFDuet-1-fadD-acrl, e transformantes foram selecionados em placas de LB suplementados com 50 mg/L de canamicina, 50 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L e espectinomicina.
Três transformantes foram inoculados em 3 mL de LBKCS (caldo LB suplementado com canamicina 50 mg/L, carbenicilina 50 mg/L, espectinomicina 100 mg/L, e glicose 10 g/L) e incubada a 37°C em um agitador (agitando a 250 rpm). Quando as culturas atingiram uma DO600 de por volta de 0,5, 1,5 mL de cada cultura foi transferido para frascos de 250 mL contendo 50 mL de LBKCS. Os frascos foram então incubados em um agitador (250 rpm) a 37°C até a cultura atingir uma DO600 de por volta de 0,5 a por volta de 1,0. IPTG foi então adicionado a uma concentração final de 1 mM. As culturas induzidas foram incubadas a 37°C em uma agitador (250 rpm) por mais 40-48 horas.
As culturas foram então transferidas em tubos cônicos de 50 mL e as células foram centrifugadas a 3.500 X g por aproximadamente 10 minutos. Cada um dos precipitados celulares foi então misturado com 5 mL de acetato de etila. Os extratos de acetato de etila foram analisados com GC/MS. A titulação de ésteres graxos (incluindo C16C16, C14:1C16, C18:1C18:1, C2C14, C2C16, C2C16:1, C16C16:1 e C2C18:1) foi de por volta de 10 mg/L. Quando uma cepa de E. coli carregando somente vetores vazios foi cultivada sob as mesmas condições e seguindo o mesmo protocolo, somente 0,2 mg/L de ésteres graxos foram encontrados no extrato de
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265/360 acetato de etila.
EXEMPLO 9. PRODUÇÃO E LIBERAÇÃO DE ETIL ÉSTER GRAXO A PARTIR DE HOSPEDEIRO DE PRODUÇÃO
A cepa LS9001 foi transformada com plasmídeos carregando um gene de éster sintase proveniente de A. baylyi (plasmídeo pHZ1.43), um gene de tioesterase proveniente de Cuphea hookeriana (plasmídeo pMAL-c2X-TEcu) e um gene fadD proveniente de E. coli (plasmídeo pCDFDuet-1-fadD).
Essa cepa recombinante foi cultivada a 25°C em 3 mL de um meio M9 contendo canamicina 50mg/L, carbenicilina 100 mg/L, e espectinomicina 100 mg/L. Após indução com IPTG, o meio foi ajustado a uma concentração final de etanol 1% e glicose 2%.
A cultura foi permitida a crescer por 40 horas após indução com IPTG. As células foram separadas do meio gasto através de centrifugação a 3.500 X g por 10 minutos. O precipitado celular foi ressuspendido com 3 mL do meio M9. A suspensão celular e o meio gasto foram então extraídos com 1 volume de acetato de etila. As fases de acetato de etila da suspensão celular e sobrenadante foram submetidos à análise GC-MS.
O etil éster C16 foi a espécie de éster mais proeminente para essa tioesterase e 20% do éster graxo produzido foi liberado da célula. Veja FIG. 8. Uma E. coli controle cepa C41(DE3, kfadE) contendo pCOLADuet-1 (vetor vazio para o gene da éster sintase), pMAL-c2X-TEuc (contendo fatB proveniente de U. california) e pCDFDuet-1-fadD (gene fadD proveniente de E. coli) falharam em produzir quantidades detectáveis de etil ésteres de ácido graxo.
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Os ésteres de ácido graxo foram quantificados utilizando etil éster de ácido palmítico comercial como referência.
Ésteres graxos foram também feitos utilizando os métodos descritos aqui exceto que metanol ou isopropanol foi adicionado ao caldo de fermentação. Os éteres graxos esperados foram produzidos.
EXEMPLO 10. A INFLUÊNCIA DE VÁRIAS TIOESTERASES NA COMPOSIÇÃO DE ETIL ÉSTERES GRAXOS PRODUZIDOS EM CEPAS RECOMBINANTES DE E. COLI.
As tioesterases FatB3 (C. hookeriana), 'TesA (E. coli), e FatB (U. california) foram expressas simultaneamente com éster sintase (proveniente de A. baylyi). Um plasmídeo, pHZ1.61, que contém um esqueleto de pCDFDuet-1 (Novagen, Madison, WI, EUA) com o gene fadD, foi construído através da substituição do fragmento NotI-AvrII (carregando o gene acrl) com o fragmento NotI-AvrII de pHZ1.43 de modo que fadD e a éster sintase ADP1 estivessem em um plasmídeo e cada uma das sequências codificantes estivesse sob o controle de um promotor T7 em separado. A construção de pHZ1.61 tornou possível o uso de um sistema de dois plasmídeos ao invés de um sistema de três plasmídeos.
pHZ1.61 foi então co-transformado em E. coli C41(DE3, EfadE) com
um dos plasmídeos, cada um carregando um gene diferente de
tioesterase como descrito aqui.
O total de etil ésteres de ácido graxo (tanto no
sobrenadante quanto no fluído etil de ácido graxo intracelular) produzido por esses transformantes foram avaliados utilizando a técnica descrita aqui. As titulações e a composição dos etil
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267/360 ésteres de ácido graxo estão resumidos na Tabela 12.
Tabela 12: Titulações (mg/L) e composição de etil ésteres de ácido graxo pela E. coli C41(DE3, AíadE)/pHZ1.61 recombinante e plasmídeos carregando vários genes tioesterase.
Tioeste rases C2C10 C2C12:1 C2C12 C2C14:1 C2C14 C2C16:1 C2C16 C2C18:1 Tota l
‘TesA 0, 0 0, 0 6, 5 0, 0 17,5 6, 9 21,6 18,1 70,5
ChFatB3 0, 0 0, 0 0, .0 0, 0 10,8 12,5 11,7 13,8 48,8
ucFatB 6, 4 8,5 25,3 14,7 0, 0 4,5 3,7 6,7 69,8
pMAL 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 5, 6 0, 0 12,8 7,6 26,0
Nota: 'TesA, pETDuet-1-'TesA; chFatB3, pMAL-c2X-TEcu; ucFatB, pMAL-c2X-TEuc; pMAL, pMAL-c2X, o vetor vazio para genes de tioesterase utilizados no estudo.
EXEMPLO 11. UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS ÉSTER SINTASES PARA PRODUZIR BIOCOMBUSTÍVEL
Quatro genes codificando éster sintases foram sintetizados baseados em sequências polinucleotídicas correspondentes reportadas no NCBI GenBank com pequenas modificações. Essas modificações incluem a remoção de sítios de restrição internos de NcoI, NdeI, HindIII, e AurII sem introduzir outras modificações à sequência de aminoácido correspondente. Os quatro genes de interesse foram cada sintetizados com um sítio NdeI na extremidade 5' e um AurII na extremidade 3'. As sequências foram então clonadas no sítio NdeI e AurII de pCOLADuet-1 (Novagene) para produzir pHZ1.97-376, pHZ1.97-377, pHZ1.97-atfA1 e pHZ1.97atfA2. Os plasmídeos carregando cada um dos quatro genes de interesse juntamente com os respectivos números de Acesso do GenBank e números de Acesso do GenPeptide estão listados na
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Tabela 13 abaixo.
Tabela 13: Éster sintases
Plasmídeos Identidade Fontes originais de sequência de DNA N- de Acesso do GenBank N- de Acesso do GenPeptide
pHZ1.97-376 FES376(376) Marinobacter aquaeolei VT8 CP000514.1 ABM17275
pHZ1.97-377 FES377(377) Marinobacter aquaeolei VT8 CP000514.1 ABM20141
pHZ1.97- atfA1 FESA1(AtfA1) Alcanivorax borkumensis SK2 NC 008260.1 YP 694462
pHZ1.97- atfA2 FESA2(AtfA2) Alcanivorax borkumensis SK2 NC 008260.1 YP 693524
Cada um dos quatro plasmídeos foi transformado em E. coli C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD. Três transformantes de cada transformação foram selecionados para estudos de fermentação para determinar suas habilidades de sintetizar etil ésteres de ácido graxo. A etapa de fermentação foi desempenhada como descrito no EXEMPLO 6, porém em duas temperaturas diferentes, 25°C ou 37°C. Cepa C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.43 (expressando ADP1 éster sintase) foi utilizada como um controle positivo e C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1fadD como um controle negativo.
A expressão de cada um dos genes de éster sintase na cepa de E. coli com atividade atenuada de fadE e fabR e superexpressando 'tesA e fadD permitiu a cada cepa produzir por volta de 250 mg/L de FAEE a 25°C. Essa foi a mesma quantidade produzida pelo controle positivo que expressou ADP1 éster sintase. Em contraste, a cepa de controle negativa produziu menos que 50 mg/L de FAEE sob as mesmas condições a 25°C (veja, FIG. 9). A composição de acil graxo de FAEE produzida a partir dessas quatro
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269/360 éster sintases foi similar ao daquelas ADP1 éster sintases (veja,
FIG. 10)
Resultados das fermentações desempenhadas a 37°C indicaram que cepas carregando pHZ1.97_aftA2 e cepas carregando pHZ1.97_376 produziu mais FAEE que o carregando pHZ1.43 (veja, FIG.
11). As cepas carregando pHZ1.97_aftA2 e as cepas carregando pHZ1.97 controle positivo
376 também produziu grande quantidade de ácido graxo livre (veja, FIG. 12). Enquanto isso, a cepa carregando pHZ.143 não acumulou ácido graxo livre. Os resultados demonstraram que essas quatro éster sintases foram capazes de aceitar etanol e um amplo espectro de acil-CoA como substratos.
EXEMPLO 12. UTILIZAÇÃO DE ÉSTER SINTASE EUCARIÓTICA PARA
PRODUZIR BIOCOMBUSTÍVEL
Esse exemplo descreve a clonagem e expressão de uma éster sintase proveniente de Saccharomyces cerevisiae. Plasmídeos foram gerados utilizando técnicas padrão de biologia molecular.
Tabela 14: Plasmídeos com eebl
Nome Dado Esqueleto do Vetor Construção
pGL10.59 pCOLADuet-1 (Novagen) Gene eebl* inserido entre sítios BamHI e HindIII (KanR)
pGL10.104 pMAL c2x (NEB) Gene eebl* inserido entre sítios BamHI e HindIII (AmpR)
pMAL-c2X-Teuc pMAL c2x (NEB) Veja Tabela 7 acima
pCDFDuet-1- acr1 pCDFDuet-1 (Novagen) Veja Tabela 7 acima
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O gene eebl de Saccharomyces cerevisiae (Número de Acesso do GenBank YPL095C) foi amplificado por PCR a partir de sequência de DNA genômico de S. cerevisiae utilizando oligos que introduziram os sítios 5' BamHI e 3' HindIII.
Uma E. coli C41 (DE3 bfadE) hospedeira de produção foi utilizada para expressar vários plasmídeos. As células de E. coli foram cultivadas em um meio mínimo M9 (contendo 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4 , 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1 mg/L de tiamina (vit. B1), 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl2, 0,4% (w/v) ou 2% (w/v) de glicose). Todas as soluções estoques de ácido graxo foram preparadas dissolvendo-se o sal de sódio ou potássio de ácido graxo em água destilada e deionizada em pH 7.0. Estoque de ácido octanóico foi comprado da Sigma, St. Louis, MO, EUA.
Fermentações foram desempenhadas utilizando a cepa C41 (DE3 bfadE) contendo plasmídeos pCDFDuet-1-acr1, pMAL-c2X-TEuc (ucFatB), e pGL10.59 (eebl). A cepa controle foi a cepa C41 (DE3 BfadE) carregando pCDFDuet-1-acr1, pMAL-c2X-TEuc, e o vetor vazio pCOLADuet-1. Cada uma das três colônias de cada transformação foram utilizadas para inocular uma cultura inicial de M9 + 0,4% de glicose suplementada como carbenicilina (100 pg/mL), espectinomicina (100 pg/mL), e canamicina (50 pg/mL). As culturas foram permitidas a crescer a 37°C durante a noite. Culturas de produção foram estabelecidas através da diluição de 1:100 da cultura inicial para inocular 3 mL de meio M9 + 0,4% de glicose. As culturas de produção foram permitidas a crescer a 37°C até DO600 = 0,6 antes de serem induzidas com 1 mM de IPTG, alimentadas com 1% de etanol, e cultivadas por 40 horas adicionais a 25°C. Culturas de células inteiras foram extraídas
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271/360 com igual volume de acetato de etila através de utilização de vórtex vigorosamente por 30 segundos. A fase orgânica foi retirada e examinada no GC/MS utilizando o método alkane_1_splitless_ctc.m para detecção de FAEE, que foi descrito acima no EXEMPLO 4, parte 2, Quantificação de FA e FAEE na amostra #23-30”.
Nenhum pico de FAEE foi detectado nas amostras. Com o intuito de determinar se eebl foi expresso corretamente, culturas induzidas por IPTG e não induzidas foram analisadas através de SDS-PAGE. Nenhuma banda correspondendo ao tamanho de Eeb1 (por volta de 52 kDa) foi detectada. Isso sugere que, para esse sistema plasmidial particular, Eeb1 não foi bem expresso.
Experimentos de expressão adicionais foram desempenhados utilizando um vetor de expressão diferente. O gene foi clonado no vetor pMALc2x, que expressou a proteína alvo como uma fusão com proteína de ligação a maltose (MBP). Análise de SDS-PAGE de lisados de células inteiras revelaram que culturas induzidas com 1 mM de IPTG geraram uma banda de tamanho apropriado correspondendo à fusão Eeb1-MBP (por volta de 92 kDa). A banda não estava presente em células não induzidas. Esse experimento foi descrito em detalhes no International Application No. PCT/US08/058788, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência na íntegra.
A atividade enzimática de Eeb1 foi acessada utilizando a cepa C41 (DE3 AfadE) de E. coli carregando os plasmídeos pCDFDuet-1-acrl e pGL10.104 (eebl). Uma C41 (DE3 AfadE) com pCDFDuet-1-acrl e pMALc2x serviu como a cepa controle. Três colônias foram escolhidas de cada transformação e cada uma foi
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272/360 utilizada para inocular uma cultura inicial de M9 + 0,4% de glicose durante a noite suplementada com carbenicilina (100 pg/mL) e espectinomicina (100 pg/mL). Uma diluição de 1:100 da cultura inicial foi utilizada para inocular 10 mL de cultuas de produção com M9 + 0,4% de glicose. As culturas de produção foram permitidas a crescer a 37°C até DO600 = 0,4 - 0,5 antes de serem induzidas com 1mM de IPTG. As culturas foram cada uma alimentada com por volta de 1% de etanol, ácido octanóico (a por volta de 0,01% ou por volta de 0,02% do volume final), e/ou ácido decanóico (a por volta de 0,02% do volume final). Fermentações foram permitidas a continuar por 24 horas a 25°C. Extrações foram conduzidas através de adição de 1/10 do volume de 12 M de HCl e um volume igual de acetato de etila à cultura e utilização de vórtex por 30 segundos. Amostras foram analisadas através de GC/MS como descrito acima.
Dados de GC/MS revelaram que um pico correspondendo ao etil éster de ácido octanóico pode ser detectado para células expressando eebl e alimentadas com ácido octanóico e etanol. A cepa do controle de vetor também apresentou um pico de C2C8, porém um pico menor que aquele obtido com as células expressando eebl.
Células que foram alimentadas com 0,02% de ácido decanóico não cresceram bem; portanto, os estudos seguintes foram conduzidos utilizando 0,01% ou 0,005% de ácido decanóico. Para testar a habilidade de Eeb1 para utilizar alcoóis outros senão etanol na síntese de ésteres de ácido graxo, fermentações foram conduzidas utilizando a mesma cepa: C41 (DE3 EfadE) com pCDFDuet1-acr1 e pGL10.104. Células foram cultivadas como previamente
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273/360 descrito. Na indução, as células foram alimentadas com 0,02% de ácido octanóico com 1% de metanol, etanol, propanol, ou isopropanol. Células foram também alimentadas com 0,01% ou 0,005% de ácido decanóico e etanol 1%. Fermentações foram permitidas a continuar pós-indução por 24 hours a 25°C. Para preparar para análise através de GC/MS, culturas foram centrifugadas para separar o precipitado e o sobrenadante. O precipitado foi ressuspendido em um volume igual de um meio fresco M9 + 0,4% de glicose. Tanto a amostra do precipitado ressuspendido quanto do sobrenadante foram extraídas como descrito acima e analisadas através de GC/MS.
Todas as amostras de sobrenadante continham grandes quantidades de ácido graxo porém não houve detecção de ésteres de ácido graxo. Similarmente, as amostras de precipitado do controle de vetor não continha picos de éster de ácido graxo, como determinado utilizando-se GC/MS. Porém, células alimentadas com um ácido graxo C10 apresentou picos que foram identificados como representando ácido decanóico.
As amostras de precipitado derivadas de células expressando Eeb1 e alimentadas com um ácido graxo C8 e propanol ou etanol apresentaram pequenos picos correspondendo a propil ou etil ésteres. Nenhum pico foi detectado a partir das células que foram alimentadas com metanol ou isopropanol. Culturas alimentadas com 0,01% ou 0,005% de um ácido graxo C10 e etanol também produziram um FAEE C2C10, porém o FAEE não foi encontrado nas amostras de precipitado.
Os resultados indicaram que Eeb1 foi capaz de sintetizar FAEEs utilizando ácidos octanóico ou decanóico, e também foi
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274/360 capaz de utilizar metanol para gerar o metil éster octanóico. Porém, esses compostos foram altamente voláteis e desse modo os dados de GC/MS poderiam não ter refletido as verdadeiras titulações de maneira acurada. Para medir de maneira mais acurada 5 a formação de produto uma cobertura de hexadecano foi utilizada para captura de FAEEs mais voláteis.
Atividade de Eeb1 no que diz respeito a substratos de ácido graxo foi acessada utilizando cepa C41 (DE3 RfadE) com pCDFDuet1-acr1 e pGL10.104, que foi alimentada com ácidos graxos de 10 cadeia com diferentes comprimentos. Células foram cultivadas como descrito acima, porém foram induzidas em DO600 = 0,8 - 0,9 de modo a promover melhor crescimento celular pós indução. Nesse ponto, células foram alimentadas com 1% de etanol e 0,02% de um ácido graxo C8 ou 0,01% de uma combinação dos seguintes ácidos 15 graxos: C10, C12, C14, e C16. Culturas que foram alimentadas com ácidos graxos C8 ou C10 foram cobertas com 20% do volume total de hexadecano. Fermentações foram conduzidas por 24 horas adicionais a 25°C pós-indução. Para análise de produto, culturas inteiras (sem separação do sobrenadante e precipitado) foram 20 extraídas como descrito aqui, com 1/10 do volume de HCl e um volume igual (ao volume da cultura) de acetato de etila. Amostras tratadas com hexadecano foram injetadas diretamente no GC/MS utilizando o programa hex_1_splitless_ctc.m, que está descrito acima no EXEMPLO 4, parte 2, Quantificação de FA e FAEE na 25 amostra #23-30”.
Nenhum dos controles de vetor apresentou qualquer pico detectável de FAEE. Para células alimentadas com C8 e C10, picos grandes de C2C8 e C2C10 foram detectados nas amostras dos
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275/360 hexadecanos, porém não nas amostras de acetato de etila. Isso demonstra que hexadecano foi capaz de imobilizar os FAEEs voláteis. Para o resto das amostras de acetato de etila, pequenos picos foram detectados para FAEEs C2C12 e C2C14, porém nenhum FAEE C2C16 foi detectado. Logo, Eeb1 gerou etil ésteres utilizando ácidos graxos com comprimentos de cadeia de C8 a C14. Eeb1 favoreceu C8 e C10 em detrimento de ácidos graxos de cadeia maiores.
EXEMPLO 13. INTEGRAÇÃO GENÕMICA DE SEQUÊNCIAS RECOMBINANTES PARA FAZER UM HOSPEDEIRO DE PRODUÇÃO QUE SUPER-EXPRESSA OS GENES DE E. COLI FABA E/OU FABB.
É conhecido que o produto do gene fabR age como repressor da expressão dos genes fabA e fabB. É também conhecido que FadR trabalha como um ativador dos mesmos genes. As sequências de ligação de FabR e do consenso predito foram previamente publicadas por Zhang et al., J. Biol. Chem. 277: 15558-15565, 2002. As sequências de ligação consenso e suas localizações relativas aos genes fabA e fabB de E. coli são mostradas na FIG.
13.
Uma cepa mutante nulo de fabR de E. coli foi criada. Oligos TrmA_R_NotI e FabR_FOP foram utilizados para amplificar por volta de 1.000 pb a montante de fabR, e oligos SthA_F_Bam e FabR_ROP foram utilizados para amplificar por volta de 1000 pb a jusante de fabR. PCR de sobreposição foi aplicado para criar uma construção da deleção em fase do gene fabR completo. A construção de deleção de fabR foi clonada no plasmídeo sensível a temperatura pKOV3, que continha SacB para contra-seleção. Uma deleção cromossomal de fabR foi feita de acordo com o método
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276/360 descrito em Link et al., J. Bact., 179:6228-6237, 1997.
Tabela 15: Oligos do nulo fabR
Nome do Oligo Sequência do Oligo (5'-3')
TrmA R Not ATAGTTTAGCGGCCGCAAATCGAGCTGGATCAGGATTA (SEQ ID NO:37)
FabR FOP AGGATTCAGACATCGTGATGTAATGAAACAAGCAAATCAAGATAGA (SEQ ID NO:38)
SthA F Bam CGCGGATCCGAATCACTACGCCACTGTTCC (SEQ ID NO:39)
FabR ROP TTGATTTGCTTGTTTCATTACATCACGATGTCTGAATCCTTG (SEQ ID NO:40)
EXEMPLO 14. CONSTRUÇÃO DE HOSPEDEIRO DE PRODUÇÃO
Tabela 16 identifica os homólogos de certos genes descritos aqui, que são conhecidos a serem expressos em microorganismos que produzem biodieseis, alcoóis graxos, e hidrocarbonos. Para aumentar a produção de ácido graxo e, portanto, produção de hidrocarbono nos hospedeiros de produção tais como aqueles identificados na Tabela 16, genes heterólogos podem ser expressos, tais como aqueles provenientes de E. coli.
Alguém de habilidade básica na arte irá apreciar que genes que são endógenos aos microorganismos providos na Tabela 16 podem também ser expressos, super-expressos, ou atenuados utilizando os métodos descritos aqui. Além disso, genes que são descritos na Tabela 16 podem ser expressos, super-expressos, ou atenuados nos hospedeiros de produção que produzem endogenamente hidrocarbonos que permitem a produção de hidrocarbonos específicos com comprimento de cadeia de carbono definida, pontos de saturação, e pontos de ramificação.
Tabela 16: Hospedeiros de produção de hidrocarbonos
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Organismo Nome do Gene N° de Acesso/SEQ ID/Loci EC No.
Desulfovibrio desulfuricans G20 accA YP 388034 6.4.1.2
Desulfovibrio desulfuricans G22 accC YP 388573/YP 388033 6.3.4.14, 6.4.1.2
Desulfovibrio desulfuricans G23 accD YP 388034 6.4.1.2
Desulfovibrio desulfuricans G28 fabH YP 388920 2.3.1.180
Desulfovibrio desulfuricans G29 fabD YP 388786 2.3.1.39
Desulfovibrio desulfuricans G30 fabG YP 388921 1.1.1.100
Desulfovibrio desulfuricans G31 acpP YP 388922/YP 389150 3.1.26.3, 1.6.5.3, 1.6.99.3
Desulfovibrio desulfuricans G32 fabF YP 388923 2.3.1.179
Desulfovibrio desulfuricans G33 gpsA YP 389667 1.1.1.94
Desulfovibrio desulfuricans G34 ldhA YP 388173/YP 390177 1.1.1.27, 1.1.1.28
Erwinia (micrococcus) amylovora accA 942060 - 943016 6.4.1.2
Erwinia (micrococcus) amylovora accB 3440869 - 3441336 6.4.1.2
Erwinia (micrococcus) amylovora accC 3441351 - 3442697 6.3.4.14, 6.4.1.2
Erwinia (micrococcus) amylovora accD 2517571 - 2516696 6.4.1.2
Erwinia (micrococcus) amylovora fadE 1003232 - 1000791 1.3.99.-
Erwinia (micrococcus) amylovora plsB(D311E) 333843 - 331423 2.3.1.15
Erwinia (micrococcus) amylovora aceE 840558 - 843218 1.2.4.1
Erwinia (micrococcus) amylovora aceF 843248 - 844828 2.3.1.12
Erwinia (micrococcus) amylovora fabH 1579839 - 1580789 2.3.1.180
Erwinia (micrococcus) amylovora fabD 1580826 - 1581749 2.3.1.39
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Nome do N° de Acesso/SEQ
Organismo Gene ID/Loci EC No.
Erwinia (micrococcus) amylovora fabG CAA74944 1.1.1.100
3.1.26.3,
Erwinia
(micrococcus) 1.6.5.3,
amylovora acpP 1582658 - 1582891 1.6.99.3
Erwinia (micrococcus) amylovora fabF 1582983 - 1584221 2.3.1.179
Erwinia (micrococcus) amylovora gpsA 124800 - 125810 1.1.1.94
Erwinia 1.1.1.27,
(micrococcus) amylovora ldhA 1956806 - 1957789 1.1.1.28
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 accA ZP 00618306 6.4.1.2
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 accB ZP 00618387 6.4.1.2
Kineococcus radiotolerans ZP 00618040 6.3.4.14,
SRS30216 accC /ZP 00618387 6.4.1.2
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 accD ZP 00618306 6.4.1.2
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 fadE ZP 00617773 1.3.99.-
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 plsB(D311E) ZP 00617279 2.3.1.15
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 aceE ZP 00617600 1.2.4.1
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 aceF ZP 00619307 2.3.1.12
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 fabH ZP 00618003 2.3.1.180
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Organismo Nome do Gene N° de Acesso/SEQ ID/Loci EC No.
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 fabD ZP 00617602 2.3.1.39
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 fabG ZP 00615651 1.1.1.100
Kineococcus radiotolerans 3.1.26.3,
SRS30216 acpP ZP 00617604 1.6.5.3, 1.6.99.3
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 fabF ZP 00617605 2.3.1.179
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 gpsA ZP 00618825 1.1.1.94
Kineococcus radiotolerans
SRS30216 ldhA ZP 00618879 1.1.1.28
Rhodospirillum rubrum accA YP 425310 6.4.1.2
Rhodospirillum rubrum accB YP 427521 6.4.1.2
YP 427522/YP 425144/YP
427028/YP 426209/
Rhodospirillum rubrum accC YP 427404 6.3.4.14, 6.4.1.2
Rhodospirillum rubrum accD YP 428511 6.4.1.2
Rhodospirillum rubrum fadE YP 427035 1.3.99.-
Rhodospirillum rubrum aceE YP 427492 1.2.4.1
Rhodospirillum rubrum aceF YP 426966 2.3.1.12
Rhodospirillum rubrum fabH YP 426754 2.3.1.180
Rhodospirillum rubrum fabD YP 425507 2.3.1.39
Rhodospirillum rubrum fabG YP 425508/YP 425365 1.1.1.100
3.1.26.3,
Rhodospirillum rubrum acpP YP 425509 1.6.5.3, 1.6.99.3
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Organismo Nome do Gene N° de Acesso/SEQ ID/Loci EC No.
Rhodospirillum rubrum fabF YP 425510/YP /YP 425285 425510 2.3.1.179
Rhodospirillum rubrum gpsA YP 428652 1.1.1.94
1.1.1.27
Rhodospirillum rubrum ldhA YP 426902/YP 428871 1.1.1.28
Vibrio furnissii accA 1, 16 6.4.1.2
Vibrio furnissii accB 2, 17 6.4.1.2
Vibrio furnissii accC 3, 18 6.3.4.14, 6.4.1.2
Vibrio furnissii accD 4, 19 6.4.1.2
Vibrio furnissii fadE 5, 20 1.3.99.-
Vibrio furnissii plsB(D311E) 6, 21 2.3.1.15
Vibrio furnissii aceE 7, 22 1.2.4.1
Vibrio furnissii aceF 8, 23 2.3.1.12
Vibrio furnissii fabH 9, 24 2.3.1.180
Vibrio furnissii fabD 10, 25 2.3.1.39
Vibrio furnissii fabG 11, 26 1.1.1.100
3.1.26.3,
Vibrio furnissii acpP 12, 27 1.6.5.3, 1.6.99.3
Vibrio furnissii fabF 13, 28 2.3.1.179
Vibrio furnissii gpsA 14, 29 1.1.1.94
1.1.1.27,
Vibrio furnissii ldhA 15, 30 1.1.1.28
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 accA ZP 01643799 6.4.1.2
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 accB ZP 01644036 6.4.1.2
Stenotrophomonas maltophilia R551-3 accC ZP 01644037 6.3.4.14, 6.4.1.2
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 accD ZP 01644801 6.4.1.2
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 fadE ZP 01645823 1.3.99.-
Petição 870190042648, de 06/05/2019, pág. 285/370
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Organismo Nome do Gene N° de Acesso/SEQ ID/Loci EC No.
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 plsB(D311E) ZP 01644152 2.3.1.15
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 aceE ZP 01644724 1.2.4.1
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 aceF ZP 01645795 2.3.1.12
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 fabH ZP 01643247 2.3.1.180
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 fabD ZP 01643535 2.3.1.39
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 fabG ZP 01643062 1.1.1.100
Stenotrophomonas maltophilia R551-3 acpP ZP 01643063 3.1.26.3 1.6.5.3, 1.6.99.3
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 fabF ZP 01643064 2.3.1.179
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 gpsA ZP 01643216 1.1.1.94
Stenotrophomonas maltophilia
R551-3 ldhA ZP 01645395 1.1.1.28
Synechocystis sp. PCC6803 accA NP 442942 6.4.1.2
Synechocystis sp. PCC6803 accB NP 442182 6.4.1.2
Synechocystis sp. PCC6803 accC NP 442228 6.3.4.14, 6.4.1.2
Synechocystis sp. PCC6803 accD NP 442022 6.4.1.2
Synechocystis sp. PCC6803 fabD NP 440589 2.3.1.39
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Organismo Nome do Gene N° ID/ de Acesso/SEQ 'Loci EC No.
Synechocystis PCC6803 sp. fabH NP 441338 2.3.1.180
Synechocystis PCC6803 sp. fabF NP 440631 2.3.1.179
Synechocystis PCC6803 sp. fabG NP 440934 1.1.1.100, 3.1.26.3
Synechocystis PCC6803 sp. fabZ NP 441227 4.2.1.60
Synechocystis PCC6803 sp. fabl NP 440356 1.3.1.9
Synechocystis PCC6803 sp. acp NP 440632
Synechocystis PCC6803 sp. fadD NP 440344 6.2.1.3
Synechococcus elongates
PCC7942 accA YP 400612 6.4.1.2
Synechococcus elongates
PCC7942 accB YP 401581 6.4.1.2
Synechococcus elongates 6.3.4.14,
PCC7942 accC YP 400396 6.4.1.2
Synechococcus elongates
PCC7942 accD YP 400973 6.4.1.2
Synechococcus elongates
PCC7942 fabD YP 400473 2.3.1.39
Synechococcus elongates
PCC7942 fabH YP 400472 2.3.1.180
Synechococcus elongates
PCC7942 fabF YP 399556 2.3.1.179
Synechococcus elongates 1.1.1.100,
PCC7942 fabG YP 399703 3.1.26.3
Synechococcus elongates
PCC7942 fabZ YP 399947 4.2.1.60
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Organismo Nome do Gene N- de Acesso/SEQ ID/Loci EC No.
Synechococcus elongates PCC7942 fabl YP 399145 1.3.1.9
Synechococcus elongates PCC7942 acp YP 399555
Synechococcus elongates PCC7942 fadD YP 399935 6.2.1.3
Os Números de Acesso da Tabela 16 são do GenBank, Versão 159.0 de 15 de abril de 2007, Números EC da Tabela 16 são do KEGG, Versão 42.0 de abril de 2007 (mais atualizações diárias até e incluindo 9 de maio de 2007), resultados para cepa Ea273 de Erwinia amylovora foram obtidas a partir do centro de sequenciamento de Sanger, sequência shotgun completada como a de 9 de maio de2007, posições para Erwinia representam localizações no pseudo-cromossomo de Sanger, sequências provenientes de Víbrío furnísíí M1 são do pseudo-cromossomo VFM1, montagem v2, como a de 28 de setembro de 2006, e incluem o gene inteiro, e podem também incluir sequências flanqueadoras.
EXEMPLO 15. CEPAS DE PRODUÇÃO EXEMPLARES ADICIONAIS
Tabela 17 provê cepas de produção exemplares adicionais. Duas vias biossintéticas exemplares são descritas para a produção de ácidos graxos, alcoóis graxos, e ésteres de cera. Por exemplo, Tabela 17 provê exemplos 1 e 2 que produzem ácidos graxos. A cepa hospedeira de produção utilizada para produzir ácidos graxos no exemplo 1 é uma célula hospedeira de produção que é engenheirada para apresentar as atividades enzimáticas sintéticas desejadas. Cada x marca os genes correlacionado com
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284/360 as atividades, por exemplo, atividade de acetil-CoA carboxilase, tioesterase, e acil-CoA sintase. Células hospedeiras de produção podem ser selecionadas a partir de bactérias, leveduras, e fungos. Como provido na Tabela 17, hospedeiros de produção
5 adicionais podem ser criados utilizando os genes exógenos
indicados.
Tabela 17: Combinação de genes úteis para gerar cepas de
produção geneticamente engenheiradas
Peptídeo Fontes dos genes Genes Ácidos graxos Alcoóis graxos Cera /ésteres graxos
exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2
acetil- CoA carboxil ase E. coli accABC D X X X X X X
tioesterase E. coli 'TesA X X X X
Cinnamomu m camphora ccFatB
Umbellula ria californi ca umFatB X X
Cuphea hookerian a chFatB 2
Cuphea hookerian a chFatB 3
Cuphea hookerian chFatA
Arabidops is thaliana AtFatA 1
Arabidops is thaliana AtFatB 1[M141 T]
acil-CoA sintase E. coli fadD X X X X X X
acil-CoA redutase Bombyx mori bFAR
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Peptídeo Fontes dos genes Genes Ácidos graxos Alcoóis graxos Cera /ésteres graxos
exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2
Acinetoba cter baylyi ADP1 acr1 X X
Simmondsi a chinesis jjFAR X X
Triticum aestivum TTA1
Mus musculus mFAR1
Mus musculus mFAR2
Acinetpba cter sp M1 acrM1
Homo sapiens hFAR
Éster sintase/ álcool aciltransfer ase Fundibact er jadensis DSM 12178 WST9
Acinetoba cter sp. HO1-N WSHN X
Acinetoba cter baylyl ADP1 WSadp1 X
Mus musculus mWS
Homo sapiens hWS
Fragaria x ananassa SAAT
Malus x domestica MpAAT
Simmondsi a chinensis JjWS (AAD38 041)
Decarbon ilase Arabidops is thaliana cer1
Oryza sativa cer1
Proteína de transpor Acinetoba cter sp. HO1-N descon hecido X X
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Peptídeo Fontes dos genes Genes Ácidos graxos Alcoóis graxos Cera /ésteres graxos
exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2 exemp lo 1 exemp lo 2
te Arabidops is thaliana Cer5
EXEMPLO 16. UTILIZAÇÃO DE ACIL-COA SINTASES ADICIONAIS PARA
SUPER-PRODUZIR ACIL-COA
Homólogos de fadD de E. coli podem ser expressos em E. coli através de síntese de genes com códon otimizado baseado em uma sequência desejada proveniente de M. tuberculosis HR7Rv (NP_217021, FadDD35), B. subtilis (NP_388908, YhfL), Saccharomyces cerevisiae (NP_012257, Faa3p) ou P. aeruginosa PAO1 (NP_251989). Os genes sintéticos podem ser desenhados para incluir as protrusões compatíveis de NcoI e HindIII. As acilCoA sintases podem então ser clonados em um vetor pTrcHis2 digerido com NcoI/HindIII (Invitrogen Corp., Carlsbad, California) como descrito acima e expresso em E. coli cepa MG1655 AfadE. A expressão em E. coli pode levar a uma produção aumentada de acil-CoA.
Derivados de ácido graxo tais como um FAEE pode também ser produzido através de co-transformação da E. coli cepa MG1655 AfadE com várias acil-CoA sintases no vetor pTrcHis2 com um plasmídeo compatível derivado de pCL1920, que contém o gene de tioéster proveniente de Cuphea hookeriana com ou sem uma éster sintase proveniente de A. baylyi. O hospedeiro de produção resultante irá produzir FAEE quando cultivado em um meio contendo etanol como descrito acima.
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EXEMPLO 17. UTILIZAÇÃO DE ACIL-COA SINTASES ADICIONAIS PARA SUPER-PRODUZIR ACIL-COA
Sequências de DNA ou sequências de proteína de muitos homólogos de FadD de E. coli são conhecidos. Porém, as propriedades bioquímicas de somente poucas foram descritas. Veja, ex., Knoll et al., J. Biol. Chem. 269(23):16348-56, 1994; Shockey et al., Plant Physiol. 132: 1065-1076, 2003. Além disso, suas capacidades de serem expressas em uma forma ativa em níveis suficientemente altos para propósitos comerciais é desconhecido. Para explorar a possibilidade de utilizar acil-CoA sintases heterólogas para produção de ésteres, vários genes de acil-CoA sintase foram clonados e expressos como se segue. Apesar de esse exemplo descrever a transformação do hospedeiro de produção com plasmídeos separados para a tioesterase, éster sintase, e genes acil-CoA sintase, esse genes podem alternativamente ser incorporados em um único plasmídeo para transformar o hospedeiro de produção.
Construção do plasmídeo pOP-80
Para super-expressar os genes, um plasmídeo baixa cópia baseado no vetor comercial pCL1920 (Lerner e Inouye, NAR 18:
4631, 1990) carregando um promotor transcricional forte foi construído através de digestão de pCL1920 com enzimas de restrição AflII e SfoI (New England BioLabs Inc. Ipswich, MA, EUA). Os três fragmentos de sequência de DNA foram produzidos através dessa digestão. O fragmento de 3737 pb foi purificado do gel utilizando um kit de purificação de gel (Qiagen, Inc. Valencia, CA, EUA). Em paralelo, um fragmento contendo o promotor trc e a região lacI do plasmídeo comercial pTrcHis2 (Invitrogen,
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Carlsbad, CA, EUA) foi amplificado através de PCR utilizando os oligos LF302: 5'-ATATGACGTCGGCATCCGCTTACAGACA-3'(SEQ ID NO:41); e LF303: 5'-AATTCTTAAGTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3'(SEQ ID NO:42). Esse dois oligos também introduziram sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição ZraI (gacgtc) e AflII(cttaag), respectivamente, na extremidade dos produtos de PCR. Após amplificação, os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen, Inc. Valencia, CA, EUA) e digeridos com ZraI e AflII seguindo as condições recomendadas pelo fabricante (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA, EUA). Após digestão, o produto de PCR foi purificado do gel e ligado com o fragmento de sequência de DNA de 3737 pb derivado de pCL1920.
Após transformação com a mistura de ligação em células quimio-competentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), transformantes foram selecionados em placas de Agar Luria contendo 100 pg/mL de espectinomicina. Muitas colônias foram visíveis após incubação durante a noite a 37°C. Plasmídeos presente nessas colônias foram purificados, analisados com enzimas de restrição, e então sequenciados. Um plasmídeo produzido dessa forma foi retido, chamado pOP-80, e utilizado para experimentos adicionais. Um mapa de pOP-80 é mostrado na Figura 15.
As sequências de DNA de regiões relevantes do plasmídeo pOP-80 foram verificadas. Foi encontrado nas junções onde os dois fragmentos foram ligados que 3 a 4 bases de cada extremidade estavam ausentes. Isso foi provavelmente causado por uma atividade exonucleásica contaminando uma das enzimas de
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289/360 restrição. É provável que essas pequenas deleções não afetaram qualquer função relevante do plasmídeo. O plasmídeo resultante foi utilizado para todos os experimentos de expressão descrito nesse exemplo. A sequência completa do plasmídeo é revelada como SEQ ID NO:1 na FIG.17.
Clonagem de fadD35 proveniente de Mycobacteríum tuberculosis HR7Rv
Um gene de E. coli com códon otimizado foi sintetizado pela DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA, EUA), utilizando a sequência protéica do gene fadD35 depositado no NCBI com N- de Acesso do GenBank NP_217021 como um ponto de início. O gene sintético continha um único sítio NcoI na extremidade 5' e um único sítio EcoRI na extremidade 3'. O gene sintético foi provido pela DNA 2.0 Inc. e clonado em plasmídeo pJ201:16084. O gene fad35 foi liberado a partir desse plasmídeo através de digestão com NcoI e EcoRI. A sequência desse fragmento é mostrado em SEQ ID NO:2 na FIG. 18. O fragmento de sequência de DNA resultante revelado em SEQ ID NO:2 foi ligado com pOP-80, que foi previamente digerido com NcoI e EcoRI. A mistura de ligação foi transformada em células quimio-competentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), que foram então plaqueadas em placas de ágar Luria contendo 100 pg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C durante a noite. Colônias que apareceram no dia seguinte foram varridas, e uma cepa contendo o plasmídeo correto foi identificada. O plasmídeo foi chamado pDS9.
Clonagem de fadD1 proveniente de Pseudomonas aeruginosa
PAO1
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Um gene de E. coli com códon otimizado foi sintetizado pela DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA, EUA), utilizando a sequência protéica do gene fadDl depositado no NCBI com N_ de Acesso do GenBank NP_251989 como um ponto de início. O gene sintético continha um único sítio BspHI na extremidade 5' e um único sítio EcoRI na extremidade 3'. O gene sintético foi provido pela DNA 2.0 Inc. e clonado em plasmídeo pJ201:16083. O gene fadl foi liberado a partir desse plasmídeo através de digestão com BspHI e EcoRI. A sequência desse fragmento é mostrada em SEQ ID NO:3. O fragmento de sequência de DNA resultante revelado em SEQ ID NO:3 foi ligado com pOP-80, que foi previamente digerido com NcoI e EcoRI. A mistura de ligação foi transformada em células quimio-competentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), que foram então plaqueadas em placas de ágar Luria contendo 100 pg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C durante a noite. Colônias que apareceram no dia seguinte foram varridas, e uma cepa contendo o plasmídeo correto foi identificada. O plasmídeo foi chamado pDS8.
Clonagem de yhfL proveniente de Bacillus subtilis
O gene yhfL foi amplificado através de PCR utilizando sequência de DNA cromossomal de Bacillus subtilis I168 como um molde, e dois oligos desenhados baseados na sequência de DNA depositado no NCBI com N- de Acesso do GenBank NC_000964. As sequências dos 2 oligos foram:
BsyhfLBspHIF: 5'-CATCATGAATCTTGTTTC-3' (SEQ ID NO:4)
BsyhfLEcoR: 5'- CGGAATTCTTATTGGGGCAAAATATC-3' (SEQ ID NO:5)
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Esses dois oligos introduziram um sítio de reconhecimento de BspHI na extremidade 5' e um sítio de reconhecimento de EcoRI na extremidade 3'. O produto de PCR foi clonado diretamente em um vetor pCR-Blunt II-TOPO utilizando kit de clonagem Zero 5 Blunt TOPO PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Um plasmídeo carregando o gene yhfL foi chamado pDS1. Para sub-clonar yhfL, plasmídeo pDS1 foi digerido com BspHI e EcoRI. O fragmento de sequência de DNA resultante SEQ ID NO:6 foi purificado do gel e clonado em pOP-80, que foi previamente digerido com NcoI e EcoRI.
O plasmídeo carregando o gene yhfL de B. subtílís em pOP-80 foi chamado pDS4.
Clonagem de faa3p proveniente de Saccharomyces cerevisiae (NP 012257)
O gene faa3p foi amplificado através de PCR utilizando sequência de DNA cromossomal ATCC 204508D (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) de Saccharomyces cerevisiae como um molde, e dois oligos que foram desenhados baseado na sequência de DNA depositada no NCBI com N_ de Acesso do GenBank NC_001141 como um molde. As sequências dos dois oligos foram:
Scfaa3pPciF: 5'-CGACATGTCCGAACAACAC-3' (SEQ ID NO:7)
Scfaa3pPciI: 5'-GCAAGCTTCTAAGAATTTTCTTTG-3' (SEQ ID NO:8)
Esses dois oligos introduziram um sítio de reconhecimento de PciI na extremidade 5' e um sítio de reconhecimento de HindIII na extremidade 3'.
O produto de PCR foi clonado diretamente em um vetor pCRBlunt II-TOPO utilizando kit de clonagem Zero Blunt TOPO PCR
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292/360 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Um plasmídeo carregando o gene faa3p foi chamado pDS2. Para sub-clonar faa3p, plasmídeo pDS2 foi digerido com PciI e HindIII. O fragmento de sequência de DNA resultante (SEQ ID NO:9) foi purificado do gel e clonado em pOP80, que foi previamente digerido com NcoI e HindIII. O plasmídeo carregando o gene faa3p de S. cerevisiae em pOP-80 foi chamado pDS5.
Clonagem de ZP 01644857 proveniente de Stenotrophomonas maltophilia R551-3
A sequência do gene estrutural para a proteína ZP_01644857 está disponível no NCBI como parte do lócus NZ_AAVZ01000044. O gene foi amplificado através de PCR utilizando sequência de DNA cromossomal de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 como molde, e dois oligos desenhados baseados na sequência de DNA depositada. As sequências dos dois oligos foram:
Smprk59BspF: 5'- AGTCATGAGTCTGGATCG-3' (SEQ ID NO:10)
Smprk59HindR: 5'- GGAAGCTTACGGGGCGGGCG-3' (SEQ ID NO:11)
Esses dois oligos introduziram um sítio de reconhecimento de BspHI na extremidade 5' e um sítio de reconhecimento de HindIII na extremidade 3'.
O produto de PCR foi clonado diretamente em um vetor pCRBlunt II-TOPO utilizando kit de clonagem Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Um plasmídeo carregando o gene codificando a proteína ZP_01644857 foi chamado pDS3. Para facilitar sub-clonagem adicional do gene, um sítio BspHI interno foi removido através de mutagênese sítio dirigida utilizando o
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293/360 oligo PrkBsp:5'-GCGAACGGCCTGGTCTTTATGAAGTTCGGTGG-3'(SEQ ID NO:12) e o kit de mutagênese QuikChange Multi Site-Directed (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Após mutação apropriada foi corroborada através de sequenciamento de DNA, o plasmídeo resultante foi digerido com PciI e HindIII. O fragmento de sequência de DNA resultante (SEQ ID NO:9) foi purificado do gel e clonado em pOP-80, que foi previamente digerido com BspHI e HindIII, e foi chamado pDS6. O fragmento de sequência de DNA resultante foi purificado do gel e clonado em pOP-80, que foi previamente digerido com NcoI e HindIII. O plasmídeo carregando o gene codificando a proteína ZP_01644857 clonado em pOP-80 foi chamado pDS7. A sequência protéica de ZP_01644857 é revelada na (SEQ ID NO:13).
Construção de cepas para produzir ésteres graxos.
Uma cepa de E. coli BL21(DE3) foi primeiro transformada com plasmídeo pETDuet-1-'TesA (descrito no EXEMPLO 2) carregando o gene 'tesA de
9) carregando
Ambos os genes
E. coli, e plasmídeo pHZ1.97 (descrito no EXEMPLO o gene da éster sintetase atfA2, respectivamente.
estavam sob o controle de um promotor T7 induzível por IPTG. Dois transformante independentes carregando ambos os plasmídeos foram transformados com cada um dos plasmídeos recombinantes carregando os genes fadD heterólogos, selecionado em placas de ágar
Luria contendo 100 pg/mL de carbenicilina, pg/mL de canamicina, e 100 pg/mL de espectinomicina.
Três colônias independentes carregando os três plasmídeos foram avaliadas para produção de éster graxo.
Análise de ésteres graxos produzidos utilizando ZP 01644857 proveniente de Stenotrophomonas maltophilia R551-3
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Para avaliar a utilização da proteína ZP_01644857 proveniente de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 em um hospedeiro de produção para produzir ésteres graxos, uma cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada com plasmídeo pETDuet-1-'TesA (descrito no EXEMPLO 2) carregando o gene 'tesA de E. coli, plasmídeo pHZ1.97 (descrito no EXEMPLO 9) carregando o gene codificando a proteína ZP_01644857 (descrito acima no presente exemplo). Esse hospedeiro de produção foi fermentado para produzir ésteres graxos descritos no EXEMPLO 4. Como um controle, uma segunda E. coli cepa BL21(DE3)AfadE contendo plasmídeos pETDuet-1-'TesA, pHZ1.97, e pCL1920 foi utilizado como um hospedeiro de produção para produzir ésteres graxos.
Tabela 18 abaixo indica as produtividades de éster graxo a partir desses hospedeiros de produção.
Tabela 18. Produtividades de éster graxo a partir de um hospedeiro de produção que produziu ZP_01644857
Tipo de éster: C2C12: 1 mg/L C2C12:0 mg/L C2C14:1 mg/L C2C14:0 mg/L C2C16:1 mg/L C2C16:0 mg/L C2C18:1 mg/L C2C18: 0 mg/L Tota l mg/L c
Controlea 0, 0 0, 0 0,0 1,78 9, 80 5, 65 33,7 0, 00 50,9 3
fadD ZP 0164485 7b 1, 49 3,57 3,68 33,22 52,77 43,09 91,11 10,0 8 239, 01
a Controle: cepa BL21(DE3) D fadE, contendo plasmídeos pETDuet-1-'TesA, pHZ1.97 e pCL1920.
b Cepa BL21(DE3) D fadE, contendo plasmídeos pETDuet-1'TesA, pHZ1.97 e pDS7.
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295/360 c Esses valores representam a média de 3 culturas.
EXEMPLO 18. REPRESSÃO DE BETA-OXIDAÇÃO
Esse exemplo descreve a criação de uma E. coli cepa MG1655 AfadE AydiO.
A degradação de ácido graxo pode ser eliminada ou atenuada através da atenuação de qualquer uma das reações enzimáticas de β-oxidação descritas aqui (veja, FIG. 1). Por exemplo, a E. coli cepa MG1655 AfadE pode ser adicionalmente engenheiradas utilizando oligos para amplificar a montante de ydiO e oligos adicionais para amplificar a jusante de ydiO. PCR de sobreposição pode então ser utilizado para criar uma construção para uma deleção em fase do gene ydiO completo. A construção de deleção de ydiO é então clonada em um plasmídeo sensível a temperatura pKOV3, que contém um gene sacB para contra-seleção. Uma deleção cromossomal de ydiO é então feita de acordo com o método de Link et al. , J. Bact. 179:6228-6237, 1997. A cepa resultante não é capaz de degradar ácidos graxos e acil-CoAs graxos. Métodos adicionais para gerar um duplo mutante nulo de fadE e ydiO são descritos, por exemplo, em Campbell et al. , Mol. Microbiol. 47:793-805, 2003.
Também é possível evitar a degradação de ácido graxo através de seleção ou emprego de um hospedeiro de produção que não contenha a via de β-oxidação. Por exemplo, várias espécie de Streptococcus foram sequenciadas e nenhum gene de β-oxidação foi encontrado.
EXEMPLO 19. IDENTIFICAÇÃO DE ÉSTER SINTASES ADICIONAIS
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Esse exemplo provê éster sintases adicionais e métodos de utilização de tais sintases para produção de ésteres graxos.
Utilizando bioinformática, éster sintases adicionais foram identificadas. Essas éster sintases contêm motivos que diferem de outros motivos conhecidos, tais como os motivos encontrados em ADP1. As diferenças nos motivos são notados na Tabela 19, abaixo.
Tabela 19: Comparação de motivos de éster sintase
Motivos ADP1 HHAXVDG V NDVVL A GALRXY L PLXAMV P ISNVPG P REPLYXNG A
Proteína hipotética BCG 3544c [Mycobacteriu m bovis BCG str. Pasteur 1173P2] gi/121639399 HHSLIDG Y NDVAL A GGLRRF L SLIVVL P VSNVPG P EDVLYLRG S
Proteína de função desconhecida UPF0089 [Mycobacteriu m gilvum PYRGCK] gi/145221651 HHALVDG Y NDVAL A GGLRKF L SLIAFL P VSNVPG P REPLYFNG S
Proteína de função desconhecida UPF0089 [Mycobacteriu m vanbaalenii PYR-1] gi/120406715 HHALVDG Y NDVAL A GGLRKF L SLIAFL P VSNVPG P REPLYFNG S
As sequências identificadas podem ser clonadas utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Essas sequências podem ser expressas utilizando os vetores descritos aqui e utilizados para fazer vários ésteres graxos. Os motivos podem também ser utilizados para identificar outras éster sintases.
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EXEMPLO 20. CARACTERIZAÇÃO DE PRODUTO
Para caracterizar e quantificar os alcoóis graxos e ésteres graxos, cromatografia de gases (GC) acoplada com detecção de espectro de massa (MS) de impacto de elétron foi utilizada.
Amostras de álcool graxo foram primeiro derivatizadas com um excesso de N-trimetilsilil (TMS) imidazol para aumentar a sensibilidade de detecção. Ésteres graxos não requerem derivatização. Derivados de álcool graxo-TMS e ésteres graxos foram dissolvidos em um solvente volátil apropriado, tal como, 10 por exemplo, acetato de etila.
As amostras foram analisadas em uma coluna de capilar de 30 m DP-5 utilizando o seguinte método. Após uma injeção splitless de 1 μΐ na coluna de GC/MS, o forno foi mantido a 100°C por 3 minutos. A temperatura foi gradualmente aumentada para 320°C a 15 uma taxa de 20°C/minuto. O forno foi mantido a 320°C por 5 minutos adicionais. A taxa de escoamento do gás hélio carreador foi de 1,3 mL/minuto. O quadrupolo de MS varreu de 50 a 550 m/z. Tempos de retenção e padrões de fragmentação dos picos de produto foram comparados com referências autênticas para confirmar 20 identidade de pico.
Por exemplo, etil éster de ácido hexadecônico eluiu a 10,18 minutos (Figs. 14A-B). O íon parental de 284 unidades de massa foi prontamente observado. Mais abundante foram os íons filhos produzidos durante a fragmentação de massa. O íon filho mais 25 prevalente foi o de 80 unidades de massa. O hexadeconol-TMS de álcool graxo derivatizado eluiu a 10,29 minutos e o íon parental de 313 foi observado. O íon mais prevalente foi o íon M-14 de 299 unidades de massa.
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Quantificação foi conduzida através de injeção de várias concentrações das referências autênticas apropriadas utilizando o método GC/MS como descrito aqui. Essa informação foi utilizada para gerar uma curva padrão com resposta (contagem de íon 5 integrada total) versus concentração.
EXEMPLO 21. IDENTIFICAÇÃO E RECLASSIFICAÇÃO DE UM
MICROORGANISMO PERTENCENTE AO GÊNERO JEOTGALICOCCUS QUE É UM PRODUTOR DE α-OLEFINA
Micrococcus candicans ATCC 8456 foi previamente reportado a sintetizar hidrocarbonos alifáticos com comprimentos de cadeia de carbono variando de C18 a C20 (Morrison et al. , J. Bacteriol. 108:353-358, 1971). Para identificar os hidrocarbonos produzidos por essa cepa, células ATCC 8456 foram cultivadas em 15 mL de meio TSBYE (3% de caldo de Soja Tríptica + 0,5% de Extrato de
Levedura), por 40-48 horas a 30 °C. Células proveniente de 5 mL de cultura foram precipitadas, ressuspendidas em 1 mL de metanol, sonicadas por 30 minutos, e extraídas com 4 mL de hexano. Após evaporação do solvente, amostras foram ressuspendidas em 0,1 mL de hexano e analisadas através de GC-MS. Os hidrocarbonos foram identificados a ser as seguintes α-olefinas: 15-metil1-heptadeceno (a-C18), 16-metil-1-heptadeceno (i-C18), 1nonadeceno (n-C19), 17-metil-1-nonadeceno (a-C20) e 18-metil-1nonadeceno (1-C20) (veja FIG. 17 (i=iso, a=anteiso, n=cadeia simples) e FIG. 36).
Baseado nas seguintes análises, foi determinado que ATCC
8456 foi previamente erroneamente identificada como pertencente ao gênero Micrococci. A classificação filogenética de ATCC 8456 foi re-acessada através de amplificação e sequenciamento do gene
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299/360 parcial 16s utilizando oligos Eubac27 e 1492R (veja DeLong et al. , PNAS 89:5685, 1992). A sequência de 16s rRNA de ATCC8456 foi analisada utilizando o programa de classificação do Ribosomal Database Project II (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Baseado nessa análise, a cepa foi identificada como pertencente ao gênero Jeotgalícoccus.
O gênero Jeotgalícoccus foi previamente descrito (Jung-Hoon et al. , Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:595-602, 2003).
Análise adicional utilizando o conteúdo G+C de ATCC 8456 foi conduzida. Jeotgalícoccus são bactérias Gram-positiva de baixo conteúdo G+C relacionadas ao gênero Staphylococcus (veja Figura 20). Micrococci, por outro lado, são bactérias Grampositivas de alto conteúdo G+C. As extremidades de vários clones proveniente de uma biblioteca de cosmídeo do DNA genômico de
ATCC 8456 foram sequenciadas. Baseada na sequência de DNA de por volta de 4.000 pb, o conteúdo G+C foi determinado a ser por volta de 36%. Buscas de sequência nucleotídica contra banco de dados de proteína não redundante revelaram que todas as sequências com identificação com uma entrada do banco de dados eram similares a proteínas de bactérias Gram-positiva de baixo conteúdo G+C, tais como espécies pertencendo ao gênero Staphylococcus ou Bacíllus, porém não de espécies pertencendo ao gênero Mícrococcus.
Após, uma análise do genoma inteiro de ATCC 8456 foi conduzido. Baseado em uma sequência de DNA de por volta de 2,1
MB, o conteúdo G+C do genoma inteiro foi determinada a ser por volta de 36,7%. Em contraste, bactéria do gênero Mícrococcus são conhecidas a apresentar genomas com alto conteúdo G+C, ex. , o
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300/360 genoma de Micrococcus luteus NCTC 2665 apresenta um conteúdo G+C de 72,9% (N° de Acesso do GenBank ABLQ01000001-68). Baseado na análise de conteúdo de G+C, foi determinado que o microorganismo ATCC 8456 não pertence ao gênero Micrococcus.
Cepa adicionais de Jeotgalicoccus forma também examinadas para determinar se eles produzem α-olefinas. As seguintes cepas de Jeotgalicoccus foram examinadas: Jeotgalicoccus halotolerans DSMZ 17274, Jeotgalicoccus psychrophilus DSMZ 19085, e Jeotgalicoccus pinnipedalis DSMZ 17030. Cada cepa foi cultivada em 15 mL de meio TSBYE (3% de caldo de Soja Tríptica + 0,5% de Extrato de Levedura) e os hidrocarbonos foram isolados e analisados através de GC-MS como descrito acima. Todas as três cepas produziram α-olefinas similares àquelas produzidas por ATCC 8456 (FIGS. 17B, 17C e 17D representam traços GC-MS para hidrocarbonos produzidos por células Jeotgalicoccus halotolerans DSMZ 17274, células Jeotgalicoccus pinnipedalis DSMZ 17030, e células Jeotgalicoccus psychrophilus DSMZ 19085, respectivamente). Esses dados indicam que a habilidade de produzir α-olefinas é espalhada ao longo do gênero Jeotgalicoccus.
EXEMPLO 22. PRODUÇÃO DE NÍVEIS AUMENTADOS DE OLEFINAS E αOLEFINAS NÃO NORMALMENTE PRODUZIDAS POR CÉLULAS ATCC 8456 UTILIZANDO ALIMENTAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
Os ácidos graxos ácido eicosanóico (ácido graxo C20 de cadeia simples), ácido 16-metil octadecanóico e ácido 17-metil octadecanóico (ácidos graxos C19 de cadeia ramificada) foram identificado como componentes dos lipídeos de ATCC 8456. Esses ácidos graxos foram deduzidos a ser precursores diretos, após
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301/360 decarboxilação, para biossíntese de 1-nonadeceno, 15-metil-1heptadeceno e 16-metil-1-heptadeceno, respectivamente. Com o intuito de melhorar a produção de α-olefina para produzir olefinas não normalmente produzidas por células ATCC 8456, experimentos de alimentação de ácido graxo foram conduzidos como descrito abaixo.
Células ATCC 8456 foram cultivadas em 15 mL de um meio TSBYE (contendo 3% de caldo de Soja Tríptica + 0,5% de Extrato de Levedura). Ácidos graxos foram adicionados ao meio de cultura a 10 uma concentração final de 0,5 g/L (0,05%). Após crescimento para 40-48 hrs a 30 °C, células provenientes de 5 mL de cultura foram precipitadas, ressuspendidas em 1 mL de metanol, sonicadas por 30 minutos e extraídas com 4 mL de hexano. Após evaporação de solvente, amostras foram ressuspendidas em 0,1 mL hexano e 15 analisadas através de GC-MS.
Quando culturas foram alimentadas com ácido eicosanóico, um aumento na produção de 1-nonadeceno de por volta de 18 vezes foi observado (veja FIG. 21A; traços pretos representam sem e traços cinza representam com alimentação de ácido graxo). Quando 20 culturas foram alimentadas com ácido esteárico ou ácido palmítico, um aumento na produção de α-olefinas 1-pentadeceno e 1-heptadeceno, respectivamente, foi observado (veja FIG. 21B). Essas olefinas não são normalmente produzidas pelas células ATCC 8456. Isso indicou que ácidos graxos eram os precursores diretos 25 para α-olefinas e que bactéria Jeotgalícoccus pode ser utilizado para converter enzimaticamente ácidos graxos em α-olefinas ín vivo.
Alternativamente, células Jeotgalícoccus em repouso podem
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EXEMPLO 23. SÍNTESE IN VITRO DE α-OLEFINAS UTILIZANDO EXTRATOS CELULARES E PROTEÍNAS PARCIALMENTE PURIFICADAS
Um extrato livre de células de ATCC 8456 foi utilizado para converter ácidos graxos livres em α-olefinas. O extrato livre de células foi gerado utilizando o seguinte procedimento: células ATCC 8456 foram cultivadas em um meio TSBYE (contendo 3% de caldo de Soja Tríptica + 0,5% de Extrato de Levedura) a 30 °C por 24 hrs com agitação. As células foram então precipitadas a partir da cultura através de centrifugação a 3.700 rpm por 20 minutos. O precipitado celular foi então ressuspendido em tampão Tris 50 mM pH 7,5 com 0,1 M de NaCl e 2,0 mM de ditiotreitol a uma concentração de 0,1 g/mL de células. A essa pasta fluida celular, 200 unidades/mL de lisostafina (Sigma) foram adicionadas em gelo. A reação de lise celular continuou por 30 minutos. As células foram então sonicadas a 12 W em gelo por três ciclos de 1,5 segundos de sonicação seguido por 1,5 segundos de descanso. A sonicação durou um total de 9 segundos. Esse procedimento foi repetido 5 vezes com um intervalo de 1 minuto entre ciclos de sonicação. As células lisadas foram então submetidas a centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos para precipitar os restos celulares. O sobrenadante (extrato livre de células) foi removido e utilizado para a conversão de ácidos graxos livres em α-olefinas.
Após obtenção de extrato livre de célula, os ácidos graxos livres ácido esteárico e ácido eicosanóico foram convertidos em α-olefinas utilizando o extrato livre de células como descrito
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303/360 abaixo. Primeiro, uma solução estoque de estearato de sódio ou potássio 5% foi feita em solução de Tergitol 1% (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Próximo, 6 μΐ da solução estoque foram adicionados a 1 mL do extrato livre de células a temperatura ambiente para obter uma concentração final de sal de ácido graxo livre 1 mM. A reação foi conduzida a temperatura ambiente por 3 hrs. As α-olefinas foram recuperadas através de adição de 200 μΐ de acetato de etila à mistura, utilizando um vórtex brevemente, centrifugando brevemente, e então removendo a fase orgânica. As α-olefinas foram identificadas e/ou detectada através de GC/MS.
FIG. 22 mostra o traço de GC/MS para os produtos resultantes. Na amostra 1, nenhum ácido esteárico foi adicionado ao extrato livre de célula. Na amostra 2, o extrato livre de células foi substituído por tampão Tris 50 mM pH 7.5 com cloreto de sódio 0,1 M ao qual ácido esteárico foi adicionado. Na amostra, ácido esteárico foi adicionado ao extrato livre de células. O pico a 7,62 minutos apresentou o mesmo tempo de retenção e o mesmo espectro de massa que 1-heptadeceno (Sigma). Quando ácido eicosanóico foi adicionado sob condições similares, 1-nonadeceno foi formado.
Fervura do extrato livre de células eliminou a produção de α-olefinas mediante adição de ácidos graxos livres. Esse dado
sugere baseado fortemente que o em proteína. produto de catálise de ATCC 8456 era
O extrato livre de células de ATCC 8456 não requereu co-
fatores adicionais para produzir α- olefinas. Quando o extrato
livre de células foi suplementado com vários co-fatores em concentrações de 1 mM, nenhum aumento na síntese de α-olefina
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304/360 foi observado. Os co-fatores examinados foram NAD+, NADP+, NADH, NADPH, FADH2, SAM, ATP, e CoA. Em adição, Mg2+ foi examinado, porém a uma concentração de 10 mM. O requerimento de cofator foi também testado através de diálise do extrato livre de células 5 com uma membrana com limite de exclusão de 10 kDa por 1,5 hrs em um volume que era 200 vezes maior que o volume do extrato celular utilizando um tampão de diálise: 50 mM de Tris, pH 7,5 com cloreto de sódio 0,1 M. Nenhum decréscimo na síntese de α-olefina foi observado após diálise. Adicionalmente, nenhum decréscimo na 10 síntese de α-olefina foi observado quando 10 mM de EDTA pH 7,5 foi adicionado à mistura de reação.
O extrato livre de células de ATCC 8456 foi adicionalmente enriquecido através de condução de precipitação por sulfato de amônia. Primeiro, sulfato de amônia suficiente foi adicionado ao 15 extrato livre de células para trazer a concentração de sulfato de amônio a saturação de 50% (wt/vol). A mistura foi homogeneizada gentilmente em gelo por 60 minutos e então centrifugada a 13.000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi recuperado e sulfato de amônia adicional foi adicionado para 20 trazer a concentração de sulfato de amônia a 65% (wt/vol). A mistura foi permitida a misturar em gelo por 60 minutos e foi novamente centrifugada por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado. O precipitado foi então ressuspendido em tampão Tris 50 mM pH 7,5 com cloreto de sódio 0,1 M. Essa mistura foi então 25 dialisada no tampão previamente mencionado para remover o sulfato de amônia. O extrato livre de células.
EXEMPLO 24. PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA QUE CONVERTE ÁCIDOS GRAXOS EM α-OLEFINAS
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Para isolar a proteína necessária para produção de α-olefina a partir de células ATCC 8456, o seguinte procedimento de purificação de proteína foi conduzido. Primeiro, 6 L de células ATCC 8456 foram cultivados em meio TSBYE a 30°C por 24 horas com agitação. As células foram precipitadas através de centrifugação a 3.700 rpm por 20 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi descartado. O precipitado celular foi ressuspendido em uma solução de 100 mL de 50 mM de Tris pH 8,0, 0,l M de NaCl, 2,0 mM de DTT, e inibidores de protease bacteriano. A pasta fluida celular foi então passada por uma prensa francesa uma vez a uma pressão de 30.000 psi. Após, a pasta fluida celular foi sonicada como descrita no Exemplo 3 para quebrar o DNA. O extrato livre de células foi centrifugado a 10.000 rpm por 60 minutos a 4°C. O sobrenadante foi então removido e sulfato de amônia foi adicionado a uma concentração final de 50% (wt/vol). A mistura foi gentilmente homogeneizada a 4°C por 60 minutos e então centrifugada a 10.000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi então removido e sulfato de amônia adicional foi adicionado à saturação de 65% (wt/vol). A mistura foi homogeneizada novamente por 60 minutos a 4°C e centrifugada a 10.000 rpm por 30 min. O sobrenadante foi descartado. O precipitado restante foi ressuspendido em 50 mL de Tris 50 mM pH 8,0 e 2,0 mM de DTT.
A mistura foi passada através de uma coluna de 5 mL HiTrap SP (GE Healthcare) a 3 mL/min e 4°C. Os seguintes tampões foram utilizados como um gradiente de eluição: tampão A continha Tris 50 mM pH 8,0 e 2,0 mM de DTT; tampão B continha Tris 50 mM pH 8,0, 1,0 M de NaCl, e DTT 2,0 mM. Após a coluna ter sido carregada com a mistura, a coluna foi lavada com tampão B 40%. Depois um gradiente de 20 minutos de tampão B 40% a tampão B 100% a 3,0
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306/360 mL/min foi conduzido. Frações de 5 mL foram coletados durante o gradiente de eluição. Cada fração foi testada para atividade como descrito no Exemplo 3. Frações contendo atividade de produção de α-olefina tipicamente eluiu entre concentração de 600 e 750 mM de NaCl. Frações contendo atividade foram então reunidas e dialisadas em tampão A.
A fração de proteína dialisada foi então carregada em uma coluna de 1 mL ResourceQ (GE Healthcare) a 4 mL/min a 4°C. Tampão B utilizado com a coluna HiTrap SP foi também utilizado para a coluna ResourceQ. Um gradiente de eluição de 7 minutos entre tampão B 0% e tampão B 25% foi corrido a 4 mL/min. Frações de 1,5 mL foram coletados e testados para atividade. Frações ativas eluíram entre concentrações de 150 e 200 mM de NaCl. Frações contendo atividade foram então reunidas e concentradas com um concentrador de proteína Millipore Amicon (4 mL e limite de exclusão de 10 kDa) para por volta de 50 pL. A concentração de proteína aproximada foi determinada com um ensaio de Bradford (Bio-Rad). Concentrações finais de proteína variaram de por volta de 5 mg/mL a por volta de 10 mg/mL. 30 pL de proteína foi então aplicados em um gel SDS PAGE (Invitrogen) juntamente com um marcador de peso molecular de proteína apropriado. O gel foi corado com corante Simple Safe Coomassie (Invitrogen). FIG. 23 representa um gel representativo. Duas bandas intensas de proteína a 50 kDa e 20 kDa foram observadas.
Para determinar a identidade das bandas de proteínas, as bandas foram excisadas do gel, digeridas com tripsina, e analisadas utilizando LC/MS/MS. O dado de LC/MS/MS foi analisado utilizando o programa Mascot (Mann et al. , Anal. Chem. 66:4390
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4399, 1994). O genoma de ATCC 8456 foi sequenciado. O dado genômico foi utilizado para interpretar o dado de LC/MS/MS e para determinar a identidade das bandas de proteína. A banda de 50 kDa apresentou uma forte correlação com ORF880. A pontuação Mascot designada a essa correlação foi 919, uma pontuação alta. Além disso, ORF880 apresenta um peso molecular predito de 48.367 Da. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos de orf880 são apresentadas nas SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, respectivamente.
EXEMPLO 25.______EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA ORF880 DE JEOTGALÍCOCCUS ATCC 8456 EM E. COLI
A Orf880 de Jeotgalícoccus ATCC 8456 foi identificada como uma das duas principais proteínas em uma fração enzimática altamente purificada que catalisou a conversão de ácidos graxos livres em α-olefinas. O DNA genômico codificando ATCC 8456_orf880 foi clonado em pCDF-Duet1 sob o controle do promotor T7, e E. colí foi transformada com vários vetores, como descrito abaixo. As células de E. colí foram cultivadas e os hidrocarbonos produzidos pelas células foram analisados como descrito no Exemplo 23. Quando 0,05% de ácido esteárico foi alimentado ás culturas de E. colí transformadas com o vetor contendo 8456_orf880, a expressão de 8456_orf880 levou à formação de 1-heptadeceno em E. colí (veja FIG. 24 , que representa traços de GC/MS de α-olefinas provenientes de E. colí tanto com (cinza) quanto sem (preto) expressão de 8456_orf880). Em contraste, a adição de 0,05% de ácido esteárico às culturas de E. colí transformadas com o controle de vetor (não contendo ATCC_orf880) não resultou na produção de 1-heptadeceno. Isso demonstrou que 8456 orf880 sintetizou α-olefinas a partir de ácidos graxos
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308/360 livres em uma E. coli hospedeira heteróloga. Esse resultado indica que a biossíntese de α-olefina pode ser desempenhada em organismos heterólogos. Adicionalmente, quando células de E. coli expressando a proteína de 8456_orf880 foram alimentadas com 0,05% de ácido palmítico ou 0,05% de ácido eicosanóico, a produção de 1-pentadeceno ou 1-nonadeceno, respectivamente, foi observada.
EXEMPLO 26. SÍNTESE IN VITRO DE α-OLEFINAS UTILIZANDO ORF880 EXPRESSA DE MANEIRA HETERÓLOGA EM E PURIFICADA A PARTIR DE E. COLI
O DNA genômico codificando ATCC8456_orf880 foi clonado nos sítios NdeI e XhoI do vetor pET15b (Novagen) sob o controle de um promotor T7 para expressão em e purificação a partir de E. coli. Esse plasmídeo expressou uma versão com His-tag na porção N-terminal da 8456_orf880.
Uma E. coli cepa BL21 (DE3) (Invitrogen) foi transformada com pET15b-ORF 880 utilizando técnicas rotineiras de transformação química. Expressão de proteína foi conduzida através de, primeiro, inoculação de uma colônia da cepa de E. coli em 5 mL de meio LB suplementado com 100 mg/L de carbenicilina e agitação durante a noite a 37°C para produzir uma cultura inicial. Essa cultura inicial foi utilizada para inocular 1 L de um meio LB suplementado com 100 mg/L de carbenicilina. A cultura foi agitada a 37°C até ela atingir um valor de DO600 de 0,6. A cultura foi colocada em gelo por 10 minutos antes de IPTG ter sido adicionado a uma concentração final de 250 μΜ. A cultura foi então agitada a 18°C por aproximadamente 18 horas. A cultura foi então centrifugada a
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3.700 rpm por 20 minutos a 4°C. O precipitado foi ressuspendido em 30 mL de tampão contendo tampão fosfato de sódio 100 mM a pH 7,2, suplementado com Bacterial ProteaseArrest (GBiosciences). As células foram sonicadas a 12 W em gelo por 9 segundos com 1,5 segundos de sonicação seguido por 1,5 segundos de descanso. Esse procedimento foi repetido 5 vezes com intervalos de 1 minuto entre cada ciclo de sonicação. O extrato livre de células foi centrifugado a 10.000 rpm por 30 minutos a 4°C. 5 mL de Ni-NTA (Qiagen) foi adicionado ao sobrenadante e a mistura foi gentilmente homogeneizada a 4°C. A pasta fluida foi passada pro uma coluna para remover a resina do lisado. A resina foi então lavada com 30 mL de tampão contendo tampão fosfato de sódio 100 mM a pH 7,2, e imidazol 30 mM. Finalmente, a proteína foi eluída com 15 mL de tampão fosfato de sódio 100 mM a pH 7,2 mais imidazol
250 mM. A solução de proteína foi dialisada com 200 volumes de tampão fosfato de sódio 100 mM a pH 7,2. Concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de Bradford (Bio-Rad). 125 pg/mL de proteína foi obtido.
Para testar a especificidade de substrato de ácido graxo ín vítro de ORF880, sais de potássio dos seguintes ácidos graxos foram preparados: ácido tetradecanóico, ácido hexadecanóico, ácido octadecanóico, ácido eicosanóico, e ácido behênico (Sigma). As soluções de ácido graxo foram feitas com etanol e 2% de solução Tergitol (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a uma concentração final de 20 mM.
A cinética da reação de decarboxilação e produção foi determinada. Uma mistura de reação de 200 pl foi preparada contendo os seguintes reagentes: 1,25 pM de ORF880, 200 pM de
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310/360 octadecanoato de potássio, 200 μΐ de ditiotreitol , e tampão fosfato de sódio 100 mM a pH 7,2. A mistura de reação foi incubada a temperatura ambiente e pontos de tempo foram tirados em duplicadas entre 5 minutos e 120 minutos. A reação foi esmorecida e extraída através de adição de 100 μΐ de acetato de etila contendo 1-octadeceno a 5 mg/L como uma referência interna. Amostras foram analisadas utilizando GC/MS utilizando o método alkane 1 splitless, utilizando os seguintes parâmetros: tempo de corrida: 20 min; coluna: HP-5-MS Part No. 19091S-433E (comprimento de 30 metros; I.D.: 0,25 mm narrowbore; filme: 0,25μΜ); amostra: extração padrão de acetato de etila; injeção: 1 μΐ de entrada Agilent 6850; entrada: 300oC splitless; gás carreador: hélio; escoamento: 1,3 mL/min; temperatura do forno: 100oC mantido por 5 min, 320 a 20oC/min, 320 mantido por 5 min; det: Agilent 5975B VL MSD; det. temp: 300oC; varredura: 50-500 M/Z. Curvas de calibração foram gerados utilizando 1-heptadeceno dissolvido em acetato de etila. Baseado nessa análise, a produção
do produto foi minutos. determinada a ser linear de 5 minutos a 60
Para testar as taxas de reação de diferentes substratos de
ácido graxo, as seguintes misturas de reação de 200 μl foram
preparadas: enzima ORF 880 1 μΜ, 200 μΜ de sal teste de ácido graxo, 200 μl de ditiotreitol, e 100 mM de tampão fosfato de sódio a pH 7,2. As reações foram conduzidas a temperatura ambiente e pontos de tempo foram tirados em triplicatas a 20 minutos e 47 minutos utilizando os procedimentos de extração e análise como descrito acima. Curvas de referência foram geradas utilizando padrões químicos disponíveis. Em alguns exemplos, os padrões químicos não estavam disponíveis. Sob aquelas
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311/360 circunstâncias, por exemplo, cis-9-heneicoseno foi utilizado como uma referência para 1-heneicoseno, e 9-tricoseno foi utilizado como uma referência para 1-tricoseno. Atividades foram calculadas através da diferença entre as concentrações médias de α-olefina para cada substrato a 47 minutos e 20 minutos e então dividindo a diferença pelo do ponto de 27 minutos. Os resultados estão resumidos na Tabela 20.
Tabela 20: Atividade de ORF880 com os diferentes substratos de ácido graxo
Substrato Atividade (nM alceno produzido/min)
ácido tetradecanóico 22, 9
ácido hexadecanóico 181,9
ácido octadecanóico 77,2
ácido eicosanóico 19, 7
ácido behênico 30, 6
Esses resultados demonstraram que ORF880 expressa de maneira heteróloga foi capaz de converter substratos de ácido graxo em olefinas in vitro. Esses dados também mostraram que ORF880 apresentou atividade maior quando ácido hexadecanóico foi o substrato de ácido graxo.
EXEMPLO 27. PRODUÇÃO DE α-OLEFINAS A PARTIR DE GLICOSE ATRAVÉS DE EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE JEOTGALICOCCUS ATCC 8456 ORF880 EM E. COLI MG1655 AFadD
Construção de cepa de deleção de fadD
O gene fadD de E. coli MG1655 foi deletado utilizando o sistema lambda red (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645, 2000) como se segue:
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O gene da cloramfenicol acetiltransferase proveniente de pKD3 foi amplificado utilizando os oligos fad1: 5'TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGA GCTGCTTCG-3' (SEQ ID NO:43); e fad2: 5'-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCAT
TTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-3'(SEQ ID
NO:44). Esse produto de PCR foi eletroporado em E. coli MG1655 (pKD46). As células foram plaqueadas em L-cloramfenicol (30 pg/mL)(L-Cm) e cultivadas durante a noite a 37oC. Colônias individuais foram selecionadas e plaqueadas em outra placa L-Cm e cultivadas a 42oC. Essas colônias foram transferidas para placas L-Cm e L- carbenicilina (100 mg/mL) (L-Cb) e cultivadas a 37oC durante a noite. Colônias que eram CmR e CbS foram avaliadas adicionalmente através de PCR para garantir que o produto de PCR inseriu no sítio correto. Verificação de PCR foi desempenhado em lisados de colônias dessas bactérias utilizando oligos fadF: 5'- CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3'(SEQ ID NO:45); e fadR: 5'-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3'(SEQ ID NO:46). O tamanho esperado da deleção AfadD::Cm foi de por volta de 1200 pb (FIG. 9). O gene de resistência a cloramfenicol foi eliminado utilizando um plasmídeo helper FLP como descrito em Datsenko et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645, 2000. Verificação por PCR da deleção foi desempenhado com os oligos fadF e fadR. A cepa MG1655 AfadD não foi capaz de crescer em placas de ágar M9 + oleato (oleato como fonte de carbono). Ela também não foi capaz de crescer em meio líquido M9 + oleato.
Expressão de Jeotgalicoccus ATCC 8456 orf880 em E. coli MG1655 AfadD
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O DNA genômico codificando ATCC 8456_orf880, que teve códon otimizado para expressão em E. coli, foi clonado em vetor OP80 (derivado de pCL1920) sob o controle de um promotor Ptrc, e E. coli MG1655 AfadD foi transformada com o vetor resultante. As células de E. coli foram cultivadas a 37°C em um meio mineral M9 suplementado com 20 gg/mL de uracila e 100 gg/mL de espectinomicina. Glicose (1%, w/v) foi a única fonte de carbono e energia. Quando a cultura atingir uma DO600 de 0,8 a 1,0, IPTG (1 mM) foi adicionado e a temperatura foi alterada para 25°C.
Após crescimento por 18 a 24 horas adicionais a 25°C, células a partir de 10 mL de cultura foram precipitadas, ressuspendidas em 1 mL de metanol, sonicadas por 30 minutos, e extraídas com 4 mL de hexano. Após evaporação de solvente, amostras foram ressuspendidas em 0,1 mL de hexano e analisada através de GC15 MS. Em contraste com o controle contendo somente o vetor, células de E. coli transformadas com o vetor contendo orf880 produziu as α-olefinas 1-pentadeceno e heptadecadieno. Esse resultado indica que a expressão de ORF880 confere a habilidade para biossintetizar α-olefinas para E. coli quando cultivadas em glicose, e que os precursores diretos são os ácidos graxos mais abundantes em E. coli, chamados ácido hexadecanóico e ácido vacênico (ácido 11-cis-octadecenóico).
EXEMPLO 28. IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS DE ÁCIDO CARBOXÍLICO
REDUTASE (CAR)
A ácido carboxílico redutase (CAR) proveniente de Nocardia sp. cepa NRRL 5646 pode reduzir ácidos carboxílicos em aldeídos correspondentes sem separar enzimas de ativação, tais como acilCoA sintases (Li et al. , J. Bacteriol. 179:3482-3487, 1997; He et
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314/360 al. , Appl. Environ. Microbiol. 70:1874-1881, 2004)). Uma busca com BLAST utilizando a sequência de aminoácidos NRRL 5646 CAR (N° de Acesso do Genpept AAR91681) como a sequências isca identificou por volta de 20 sequências homólogas. Três homólogos, listados na Tabela 21, foram avaliados em relação a suas habilidades de converter ácidos graxos em aldeídos graxos in vivo quando expressos em E. coli. Em relação a sequência nucleotídica, carA, carB, e fadD9 (demonstraram 62,6%, 49,4%, e 60,5% de homologia, respectivamente, com o gene car (AY495697) de Nocardia sp. NRRL 5646. Em relação a sequência de aminoácido, CARA, CARB, e FadD9 demonstraram 62,4%, 59,1% e 60,7% de identidade, respectivamente, com CAR de Nocardia sp. NRRL 5646.
Tabela 21: Proteína CAR-like e as correspondentes sequências codificantes.
Acesso do Genpept Locus tag Anotação no GenBank Nome do gene
NP 217106 Rv 2590 Provável ácido graxo-CoA ligase (FadD9) fadD9
ABK75684 MSMEG 2956 proteína da família NAD dependente epimerase/desidratase carA
YP 889972.1 MSMEG 5739 proteína da família NAD dependente epimerase/desidratase carB
EXEMPLO 29. EXPRESSÃO DE HOMÓLOGOS CAR EM E. COLI
Construção de Plasmídeo
Três plasmídeos de expressão de E. coli foram construídos para expressar os genes codificando os homólogos CAR listado na Tabela 22, abaixo. Primeiro, fadD9 foi amplificado a partir de
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DNA genômico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (obtido da University of British Columbia, and Vancouver, BC Canada) utilizando os oligos fadD9F e FadDR (veja Tabela 22). O produto de PCR foi primeiro clonado em PCR-blunt (Invitrogen) e então liberado como um fragmento NdeI-AvrII. O fragmento NdeI-AvrII foi então clonado entre os sítios NdeI e AvrII de pACYCDuet-1 (Novogen) para gerar pACYCDuet-1-fadD9.
Os genes carA e carB foram amplificados a partir de DNA genômico de Mycobacterium smegmatis MC2 155 (obtido a partir de ATCC (ATCC 23037D-5)) utilizando oligos CARMCaF e CARMCaR ou CARMCbF e CARMCbR, respectivamente (veja, Tabela 22). Cada produto de PCR foi primeiro clonado em PCR-blunt e então liberado como um fragmento NdeI-AvrII. Cada um dos dois fragmentos foi então sub-clonado entre os sítios NdeI e AvrII de pACYCDuet-1 (Novogen) para gerar pACYCDUET-carA e pACYCDUET-carB.
Tabela 22. Oligos utilizados para amplificar genes codificando homólogos de CAR
fadD9F CAT ATGTCGATCAACGATCAGCGACTGAC (SEQ ID NO:47)
fadD9R CCTAGG TCACAGCAGCCCGAGCAGTC (SEQ ID NO:48)
CARMCaF CAT ATGACGATCGAAACGCG (SEQ ID NO:49)
CARMCaR CCTAGG TTACAGCAATCCGAGCATCT (SEQ ID NO:50)
CARMCbF CAT ATGACCAGCGATGTTCAC (SEQ ID NO:51)
CARMCbR CCTAGG TCAGATCAGACCGAACTCACG (SEQ ID NO:52)
Avaliação de Produção de Aldeído Graxo
Plasmídeos codificando os homólogos CAR (pACYCDUET-fadD9, pACYCDUET-carA, e pACYCDUET-carB) foram separadamente cotransformados em E. coli cepa C41 (DE3, AfadE) (descrita em PCT/US08/058788) juntamente com pETDuet-1-'TesA (descrita em
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PCT/US08/058788, as revelações das quais estão incorporadas aqui por referência).
As E. coli transformantes foram cultivadas em 3 mL de um meio LB suplementado com carbenicilina (100 mg/L) e cloramfenicol (34 mg/L) a 37°C. Após crescimento durante a noite, μΐ de cultura foram transferidos em 2 mL de um meio LB fresco suplementado com carbenicilina e cloramfenicol. Após 3,5 horas de crescimento, 2 mL de cultura foram transferidas para frascos de 125 mL contendo 20 mL de um meio M9 com glicose 2% e com 10 carbenicilina e cloramfenicol. Quando a DO600 da cultura atingiu
0,9, 1 mM de IPTG foi adicionado em cada frasco. Após 20 horas de crescimento a 37°C, 20 mL de acetato de etila (com 1% de ácido acético, v/v) foi adicionado com cada frasco para extrair os compostos orgânicos produzidos durante a fermentação. O extrato bruto de acetato de etila foi diretamente analisado com GC/MS como descrito abaixo. A co-expressão do 'TesA sem líder e qualquer um dos três genes car em E. coli resultou em produção detectável de aldeído graxo. Em uma fermentação,
LS9001/pACYCDUET carB+ pETDuet-1-'TesA produziu uma média de 120 20 mg/L de aldeídos graxos. Os tempos de retenção eram de 6,959 minutos para dodecanal, 8,247 minutos para 7-tetradecenal, 8,37 minutos para tetradecanal, 9,433 minutos para 9-hexadecenal, 9,545 minutos para hexadecanal, e 10,945 minutos para 11octadecenal. A presença de grandes quantidades de aldeídos graxos é consistentes com CAR sendo uma ácido graxo redutase geradora de aldeído (AFAR). Esse mecanismo é diferente do das acil-CoA graxo redutases (FAR) geradoras de álcool, por exemplo,
JjFAR, e acil-CoA graxo redutases, tal como Acr1.
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Preferência de Substrato de Homólogos de CAR
Preferências de substrato distintas foram observadas dentre os três homólogos CAR avaliados. FadD9 exibiu uma forte preferência para ácidos graxos C12 relativo a outros ácidos graxos com comprimentos de cadeia de carbono maiores que 12. Ambos CarA e CarB demonstraram variações de substrato mais amplas que FadD9.
Quantificação e Identificação de Aldeídos Graxos
Um experimento GC-MS foi desempenhado utilizando um sistema Agilent 5975B MSD equipado com uma coluna DB-5 de 30mx0,25mm (filme de 0,10pm). A temperatura foi de 3 minutos isotérmicos a 100°C. A coluna foi programada a aumentar de 100°C para 320°C a uma taxa de 20°C/min. Quando a temperatura final foi atingida, a coluna se manteve isotérmica por 5 minutos a 320°C. O volume de injeção foi de 1 pL. O gás carreador, hélio, foi liberado a 1,3 mL/min. O espectrômetro de massa foi equipado com uma fonte de ionização de impacto de elétron. A temperatura da fonte de ionização foi ajustada para 300°C.
Antes da quantificação, vários aldeídos foram identificados utilizando dois métodos. Primeiro, o tempo de retenção GC de cada composto foi comparado com o tempo de retenção de um padrão conhecido, tal como laurilaldeído (dodecanal). Segundo, identificação de cada composto foi confirmada através de comparação de espectro de massa do composto com o espectro de massa de um padrão na biblioteca de espectro de massa.
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EXEMPLO 30. PRODUÇÃO DE ÁLCOOL GRAXO ATRAVÉS DE EXPRESSÃO
HETERÓLOGA DE HOMÓLOGOS CAR EM E. COLI MG1655 (DE3, AFADD)
Construção de cepa de deleção de fadD
O gene fadD de E. coli MG1655 foi deletado utilizando o sistema lambda red (Datsenko et al., PNAS (USA). 97: 6640-6645, 2000) com se segue: O gene da cloramfenicol acetiltransferase de pKD3 foi amplificado com os oligos fadl: 5'TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGA GCTGCTTCG-3'(SEQ ID NO:43); e fad2: 5'CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATC CTCCTTTAGTTCC-3'(SEQ ID NO:44). Esse produto de PCR foi eletroporado em E. coli MG1655 (pKD46). As células foram plaqueadas em L-cloramfenicol (30 pg/mL) (L-Cm) e cultivados durante a noite a 37°C. Colônias individuais foram selecionadas e plaqueadas em outra placa L-Cm e cultivadas a 42°C. Essas colônias foram transferidas para placas L-Cm e L- carbenicilina (100 mg/mL) (L-Cb) e cultivadas a 37oC durante a noite. Colônias que eram CmR e CbS foram avaliadas adicionalmente através de PCR para garantir que o produto de PCR inseriu no sítio correto. Verificação de PCR foi desempenhado em lisados de colônias dessas bactérias utilizando oligos fadF: 5'- CGTCCGTGGTAATCATTTGG3'(SEQ ID NO:45); e fadR: 5'-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3'(SEQ ID NO:46). O tamanho esperado da deleção ΔfadD::Cm foi de por volta de 1200 pb. O gene de resistência a cloramfenicol foi eliminado utilizando um plasmídeo helper FLP como descrito em Datsenko et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645, 2000.
Verificação por PCR da deleção foi desempenhado com os oligos fadF e fadR. A cepa MG1655 ΔfadD não foi capaz de crescer em
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319/360 placas de ágar M9 + oleato (oleato como fonte de carbono). Ela também não foi capaz de crescer em meio líquido M9 + oleato. O defeito de crescimento foi complementado por um gene fadD de E. coli transferido em trans (em pCL1920-Ptrc).
Construção de cepa MG1655(DE3, AfadD)
Para gerar uma cepa responsiva a T7, o kit XDE3 Lysogenization (Novagen) foi utilizado, que é desenhado para integração sítio-específica do pró-fago XDE3 em um cromossomo hospedeiro de E. coli, de modo que o hospedeiro lisogenizado pode ser utilizado para expressar genes alvo clonados em vetores de expressão T7. XDE3 é um fago recombinante carregando o gene clonado para a T7 RNA polimerase sob controle de lacUV5. Resumidamente, a cepa hospedeira foi cultivada em um meio LB suplementado com 0,2% de maltose, 10 mM de MgSO4, e antibióticos a 37°C, a uma DO600 de 0,5. Depois, 108 XDE3 pfu, 108 Fago Helper pfu, e 108 Fago de Seleção pfu foram incubados com 10 μΐ de células hospedeiras. A mistura hospedeiro/fago foi incubada a 37°C por 20 minutos para permitir ao fago ser adsorvido no hospedeiro. Finalmente, a mistura foi pipetada em placa LB suplementada com antibióticos. A mistura foi espalhada uniformemente utilizando contas de plaqueamento, e as placa foram placas invertidas e incubadas a 37°C durante a noite.
Candidatos XDE3 lisogênicos foram avaliados para suas habilidades de suportar o crescimento do Fago de Testagem T7. O Fago de Testagem T7 é um fago T7 mutante de deleção que é completamente defectivo salvo quando T7 RNA polimerase ativa é provida pela célula hospedeira. O Fago de Testagem T7 foram placas muito grandes em XDE3 lisogênicos autênticos na presença
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320/360 de IPTG, enquanto placas bem menores são observadas na ausência do indutor. O tamanho relativo das placas na ausência de IPTG é uma indicação do nível de expressão basal da T7 RNA polimerase no lisógeno, e podem variar amplamente entre diferentes backgrounds de célula hospedeira.
O seguinte procedimento foi utilizado para determinar a presença de lisogenia de DE3. Primeiro, colônias candidatas foram cultivadas em meio LB suplementado com 0,2% de maltose, 10 mM de MgSO4, e antibióticos a 37°C, a uma DO600 de 0,5. Uma 10 alíquota do Fago de Testagem T7 foi então diluído em Tampão de
Diluição de Fago 1X a uma titulação de 2 χ 103 pfu/mL. Em tubos em duplicata, 100 μΐ de células hospedeiras foram misturadas com 100 μΡ de fago diluído. A mistura hospedeiro/fago foi incubada a temperatura ambiente por 10 minutos para permitir ao fago ser 15 adsorvido no hospedeiro. Após, 3 mL de top agarose” derretida foi adicionada em cada tubo contendo hospedeiro e fago. Os conteúdos de uma duplicata foram plaqueados em placa LB e a outra duplicata em uma placa LB suplementada com 0,4 mM de IPTG (isopropil-b-tiogalactopiranosídeo) para avaliar a indução da T7 20 RNA polimerase. Placas foram permitidas a repousar por 5 minutos até a solidificação da top agarose”. As placas foram então invertidas a 30°C durante a noite.
Construção de cepa MG1655(DE3, AfadD, yjgB::kan)
A cepa mutante nulo yjgB, MG1655(DE3, AfadD, yjgB::kan), foi construída utilizando o seguinte protocolo do sistema lambda red (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645, 2000):
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O gene de resistência a canamicina do pKD13 foi amplificado com oligos yjgBRn: 5'GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAG CTGCTTCG-3'(SEQ ID NO:53); e yjgBFn: 5'CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATC CGTCGACC-3'(SEQ ID NO:54). Esse produto de PCR foi eletroporado em E. coli MG1655 (DE3, AfadD)/pKD4 6. As células foram plaqueadas em L-cloramfenicol (30 pg/mL) (L-Cm) e cultivados durante a noite a 37°C. Colônias individuais foram selecionadas e plaqueadas em outra placa L-Cm e cultivadas a 42°C. Essas colônias foram transferidas para placas L-Cm e L- carbenicilina (100 mg/mL) (LCb) e cultivadas a 37oC durante a noite. Colônias que eram CmR e CbS foram avaliadas adicionalmente através de PCR para garantir que o produto de PCR inseriu no sítio correto. Verificação de PCR foi desempenhado em lisados de colônias dessas bactérias utilizando oligos BF: 5'- GTGCTGGCGATACGACAAAACA-3'(SEQ ID NO:55); e BR: 5'-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3'(SEQ ID NO:56). O tamanho esperado da deleção yjgB::kan foi de por volta de 1450 pb.
Avaliação de FadD em relação a produção de álcool graxo utilizando cepa MG1655 (DE3, AfadD)
No Exemplo 2, uma cepa de deleção fadE foi utilizada para produção de aldeído graxo e álcool graxo proveniente de 'TesA, homólogos de CAR, e álcool desidrogenase(s) endógenas em E. coli. Para demonstrar que homólogos de CAR utilizaram ácidos graxos ao invés de acil-CoA como um substrato, o gene codificando para acil-CoA sintase em E. coli (fadD) foi deletado de modo que ácidos graxos produzidos não forma ativados com CoA. E. coli
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322/360 cepa MG1655 (DE3, AfadD) foi transformada com pETDuet-1-'TesA e pACYCDuet-1-carB. As transformantes foram avaliadas para produção de álcool graxo utilizando os métodos descritos aqui. Esses transformantes produziram por volta de 360 mg/L de alcoóis graxos (dodecanol, dodecenol, tetredecanol, tetredecenol, cetil, hexadecenol, e octadecenol).
YjgB é uma álcool desidrogenase. Para confirmar que YjgB foi uma álcool desidrogenase responsável para converter aldeídos graxos em seus alcoóis graxos correspondentes, pETDuet-1-'TesA e pACYCDuet-1-fadD9 foram co-transformados em MG1655(DE3, AfadD) ou MG1655(DE3, AfadD, yjgB::kan). Ao mesmo tempo, MG1655(DE3, AfadD, yjgB::kan) foi transformada com pETDuet-1-'tesA-yjgB e pACYCDuet-1-fadD9.
As transformantes de E. coli foram cultivadas em 3 mL de um meio LB suplementado com carbenicilina (100 mg/L) e cloramfenicol (34 mg/L) a 37°C. Após crescimento durante a noite, 15 pL de cultura foi transferida em 2 mL de um meio LB fresco suplementado com carbenicilina e cloramfenicol. Após 3,5 hrs de crescimento, 2 mL de cultura foi transferido em um frasco de 125 mL contendo 20 mL de um meio M9 contendo glicose 2%, carbenicilina, e cloramfenicol. Quando a DO600 da cultura atingiu 0,9, 1 mM de IPTG foi adicionada a cada frasco. Após 20 horas de crescimento a 37oC, 20 mL de acetato de etila (com 1% de ácido acético, v/v) foi adicionada a cada frasco para extrair os alcoóis graxos produzidos durante a fermentação. O extrato bruto de acetato de etila foi diretamente analisado utilizando GC/MS como descrito aqui.
A cepa mutante nulo de yjgB resultou em acúmulo
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323/360 significativo de dodecanal e uma titulação mais baixa de álcool graxo. A expressão de yjgB proveniente de pETDuet-1-'tesA-yjgB na cepa mutante nulo de yjgB efetivamente removeu o acúmulo de dodecanal. O dado indicou que YjgB foi envolvido em converter dodecanal em dodecanol e que pode haver outras álcool desidrogenase(s) presentes em E. coli para converter outros aldeídos em alcoóis. Dodecanal acumulou na cepa mutante nulo de yjgB, porém não foi observado tanto na cepa selvagem (MG1655(DE3, AfadD)) quanto na cepa mutante nulo de yjgB com o plasmídeo de expressão de yjgB.
EXEMPLO 31. GERAÇÃO DE BIBLIOTECA ‘TesA
Nesse Exemplo, métodos são descritos para preparação de uma biblioteca mutante de 'TesA. Um vetor de expressão apropriado tal como pACYC-'TesA que codifica 'TesA, a TesA truncada faltando o peptídeo sinal, permite produção de uma proteína 'TesA na cepa hospedeira. O plasmídeo pACYC-'TesA inclui a sequência ‘tesA sob a regulação de um promotor trc, um terminador de transcrição, um origem de replicação p15a, uma fase aberta de leitura codificando lacIq, e o gene de resistência a antibiótico beta-lactamase.
A sequência de aminoácidos da proteína 'TesA é provida em SEQ ID NO:31.
O kit QuikChange Mutagenesis (Stratagene) permite a fácil construção de grande número de mutantes. A utilização desse kit para construir cada mutante 'TesA começa com dois oligos complementares contendo um ou mais bases não pareadas requeridos
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324/360 para alterar o aminoácido codificado na posição desejada. Os oligos têm 25-45 nucleotídeos de comprimento, com temperatura de separação das fitas >78°C como calculado utilizando a fórmula:
Tm = 81,5 + 0,41(%GC) 675/N onde Tm é a temperatura de separação das fitas, %GC é o percentual de resíduos no oligo que são guanosina ou citidina, e N é o número de nucleotídeos no oligo. Por exemplo, os oligos:
CACGTTATTGATTCTGGGTAATAGCCTGAGCGCCGGGTATCG (SEQ ID NO:57) e
CGATACCCGGCGCTCAGGCTATTACCCAGAATCAATAACGTG (SEQ ID NO:58) onde utilizados para mutar o ácido aspártico no resíduo 9 para asparagina, onde as bases sublinhadas indicam o códon que foi alterado.
Os oligos foram utilizados em uma reação da polimerase em cadeia com pACYC-'TesA como molde, utilizando o seguinte programa de ciclagem de temperatura: 1 minuto a 95°C; seguido por 18 ciclos de 50 segundos a 95°C, 50 segundos a 60°C, e 5 minutos a 68°C; e 7 minutos a 68°C. Os produtos de reação foram então digeridos utilizando as enzimas de restrição DpnI, para seletivamente degradar o DNA molde metilado. O DNA restante foi então transformado em E. coli para isolar os clones plasmidiais, que foram então sequenciados para verificar que as substituições foram obtidas.
EXEMPLO 32. ENSAIOS
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Nos seguintes Exemplos, ensaios para determinação de conteúdo de proteína, níveis de ácido graxo livre, e hidrólise de substratos acil-PNP e acil-CoA são descritos. Ensaios específicos utilizados aqui são também publicados abaixo.
Ensaios para Determinação de Conteúdo Protéico em Lisados
Celulares
Lisados celulares de culturas de expressão de E. coli produzindo variantes 'TesA foram preparados para caracterização. Para gerar as culturas de expressão, culturas de semeadura foram 10 crescidas durante a noite a 37°C em um meio LB contendo glicose 1% (w/v) e 100 pg/mL de carbenicilina. As culturas de semeadura foram então diluídas 1:100 no mesmo meio e crescidas por 3 horas a 37°C com agitação (200 rpm). Uma alíquota de 40 pL de cada cultura foi então adicionada a 360 pL de meio LS9-1 (descrito 15 abaixo) suplementado com 100 pg/mL de carbenicilina e crescida em uma placa de 96 poços. Após 3 horas adicionais de crescimento, isopropil e-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG, a uma concentração final de 1 mM) e Bis-Tris Propano (pH 7,0, a concentração final de 0,1 M) foram adicionados, e as culturas foram permitidas a 20 crescer durante a noite.
Precipitados celulares foram coletados através de centrifugação das culturas de expressão (10 minutos a 3.500 rpm). O meio de crescimento é descartado e os precipitados celulares é armazenado a -80°C. Para preparar extratos solúveis, os 25 precipitados celulares congelados são lisados em BugBuster (EMD Biosciences, N_ Cat. 70584-4) 50% em fosfato de sódio 25 mM, pH
7,0. Após 40 minutos de agitação, os lisados celulares são clarificados através de centrifugação (10 minutos a 3.500 rpm).
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A concentração de proteína no sobrenadante dos lisados celulares é então medida utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA), de acordo com o protocolo provido pelo fabricante (Thermo
Scientific, N_ Cat. 23225). O ensaios descritos abaixo.
Meio:
Solução de Sal
Na2HPO4 30 g
KH2PO4 15 g
NaCl 2,5 g
NH4Cl 5 g
dH2O para 1 L
soluções estoque:
mg/mL de Tiamina
MgSO4 1M
CaCl2 1M
Glicose 20% sobrenadante é então utilizado nos concentração final 1X g/L g/L
0,5 g/L g/L concentração final:
Vitamina B1) 1 mg/L mM
0,1 mM
2,00%
Água estéril mg/mL de uracila gg/mL alto pH
Minerais-traço 1000x
1x
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Para 1 L de meio LS9-1 com 1,0 % de glicose:
200 mL de Solução de Sal 5x
100 pL de Tiamina (B1) ml de MgSCg
100 pL de CaCl2 mL Glicose 20% mL de minerais-traço mL de Uracila
Água para 1L (pré-preparo em 750 mL)
Solução TM (esterilizado em filtro):
g/L de FeCl3 - 6 H2C g/L de ZnCl2 - 4H2C g/L de CaCl2 - 6H2C g/L de Na2MoC4 - 2H2C g/L de CUSC4 - 5H2C
0.5 g/L de H3BC3
100 mL/L de HCl concentrado
q.s. c/ água Milli-Q
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Análise de Ácido Graxo Livre
Variantes 'TesA são produzidas em culturas de expressão de E. colí, e os ácidos graxos livres produzidos pelas culturas foram analisados. Para gerar as culturas de expressão, culturas de semeadura foram primeiro crescidas durante a noite a 37°C em um meio LB contendo glicose 1% (w/v) e 100 pg/mL de carbenicilina, e então diluído 1:100 no mesmo meio e crescidas por 3 horas a 37°C com agitação (200 rpm). 40 pL de cada cultura foi então adicionada a 360 pL de meio LS9-1 suplementado com 100 pg/mL de carbenicilina e crescida em uma placa de 96 poços. Após 3 horas adicionais de crescimento, isopropil β-Ό-1tiogalactopiranosídeo (IPTG, a uma concentração final de 1 mM) e Bis-Tris Propano (pH 7,0, a concentração final de 0,1 M) foram adicionados, e as culturas foram permitidas a crescer durante a noite.
As culturas foram então acidificadas com HCL 1N a um pH final de por volta de 2,5 e então extraídas com 600 pL de acetato de etila. Ácidos graxos livres na fase orgânica foram derivatizados com hidróxido de tetrametilamônia (TMAH) para gerar os respectivos metil ésteres, que foram então analisados em um cromatógrafo de gases equipado com um detector de ionização de chama.
Ensaio de Hidrólise de Acil-PNP Graxo
Nesse sistema de ensaio, as soluções de reagente utilizadas foram:
Triton X-100 2% em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0
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329/360 acil-para-nitrofenol (acil-PNP) 10 mM em acetona
Para preparar um solução de uso de acil-PNP, 600 μL de acilPNP estoque foi adicionado a 9,4 mL de tampão fosfato e misturado bem.
O ensaio foi desempenhado através de adição de 40 μL de solução de uso de acil-PNP em cada poço de uma placa de 96 poços, seguido pela rápida adição de 40 μL de lisado celular clarificado. As soluções foram misturadas por 15 segundos, e a alteração de absorbância foi lida a 405 nm em um leitor de placa de microtitulação a 25°C. A atividade de esterase foi expressa como a proporção de (AA405/sec) mut/(AA405/sec) wt, caracterizado pelo fato de (AA405/sec) mut ser a alteração de absorbância a 405 nm por segundo em amostras contendo 'TesA mutante, e (AA405/sec) wt ser a alteração de absorbância a 405 nm por segundo em amostras contendo 'TesA selvagem.
Ensaio de Hidrólise de Acil-CoA
Nesse sistema de ensaio, as soluções de reagentes utilizadas foram:
acil-coenzima A (acil-CoA) 10 mM em fosfato de sódio 50 mM, pH 7, 0 fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, monobromobimano (MBB) (Novagen, N_ Cat. 596105) 50 mM em acetonitrila. Para preparar solução de uso de acil-CoA, 0,5 mL de acil-CoA estoque e 0,5 mL MBB estoque foram adicionados a 29 mL de tampão fosfato seguido por homogeneização.
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O ensaio foi desempenhado através de adição de 60 pL de solução de uso de acil-CoA em cada poço de uma placa preta de 96 poços, seguido pela rápida adição de 40 pL de lisado celular clarificado. Após homogeneização por 15 segundos, o progresso da reação foi monitorado através de fluorescência (λθχ = 380 nm, Xem = 480 nm) em um leitor de placa de microtitulação a 25°C. A atividade de acil-CoA tioesterase foi expressa como a proporção de (ARFU/sec) mut/(ARFU/sec) wt, caracterizado pelo fato de
(ARFU/sec: ) mut ser a alteração de unidades de fluorescência
relativa por segundo em amostras contendo 'TesA mutante, e
(ARFU/sec: wt ser a alteração de unidades de fluorescência
relativa por segundo em amostras contendo 'TesA selvagem.
Aplicando a Metodologia de Pontuação Z
Uma determinação de pontuação Z foi conduzida seguindo a metodologia de pontuação Z como se segue.
A pontuação Z para uma amostra é definida como o número de desvios padrão que o sinal da amostra difere da média de sinal da população controle. A pontuação Z foi utilizada para ranquear os mutantes de acordo com as propriedades de interesse tais como, por exemplo, especificidade de comprimento de cadeia de substrato, preferência relativa para ligações éster sobre tioéster, preferência relativa para ligações tioéster sobre éster, e a proporção ou porcentagem de éster produzido. A pontuação Z é medida utilizando o seguinte cálculo:
Z= (valor da amostra - média do controle)/Desvio padrão dos controles
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O controle positivo utilizado para gerar a biblioteca de 'TesA mutante aqui foi 'TesA selvagem.
Em uma distribuição normal, por volta de 2,1% dos dados irão conter 2 ou mais desvios padrão acima da média, e por volta 5 de 0,1% dos dados irão conter 3 ou mais desvios padrão acima da média. Portanto, pontuações Z de 2 ou mais, 3 ou mais, -2 ou menos, -3 ou menos e assim por diante são utilizados para definir classe cada vez mais estringentes de dados que não são prováveis de ocorrer ao acaso.
Aquelas variantes que apresentam uma pontuação Z maior que foram marcadas como apresentando um desempenho melhorado em termos de preferência para substratos de certos comprimentos de cadeia e/ou taxa catalítica. Além disso, aquelas variantes que apresentam uma pontuação Z maior que 3 foram marcadas, sob outras circunstâncias, como provendo uma produtividade proporcional ou de porcentagem melhorada ou aumentada para ésteres graxos X ácidos graxos livres. Adicionalmente, aquelas variantes que apresentam uma pontuação Z de -3 ou menos foram marcadas, em ainda outras circunstâncias, como provendo uma produtividade proporcional ou de porcentagem reduzida para ésteres graxos X ácidos graxos livres.
Números de especificidade de substrato são definidos com a curva cinética de um dado mutante para um substrato, dividido pelo total de curvas cinéticas para os três substratos estudados 25 no ensaio PNP (C10, C12, C14), onde a curva cinética é a taxa inicial observada para a hidrólise de um dado substrato de éster.
Por exemplo, para calcular um número de especificidade de
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332/360 substrato para C10:
C10 EspecSubs = Curva do Mutante C10 / (Curva do Mutante
C10 + C12 + C14)
Após, a pontuação Z de especificidade de substrato foi calculada. A Média e Desvios Padrão dos números de especificidade de substrato para os controles positivos foram primeiro calculados (para cada placa), e a seguinte fórmula foi aplicada:
Pontuação Z EspecSub C10 Mutante = (EspecSub C10 Mutante MédiaEspecSub)/DPEspecSub
Como outro exemplo, para calcular um número de especificidade de éster:
EspecÉster = Curva Mutante C14-PNP / Curva Mutante C14-CoA
Depois, uma pontuação Z de especificidade de éster foi calculada. A Média e Desvios Padrão dos números de especificidade 15 de éster para os controles positivos foram primeiro calculados (para cada placa), e a seguinte fórmula foi aplicada:
Pontuação Z de Especificidade de Éster Mutante = (EspecÉster Mutante - MédiaEspecÉster)/DPEspecÉster
Aquelas variantes que apresentam uma pontuação Z de 20 Especificidade de Éster maior que 3 foram definidas e marcadas como apresentando uma preferência para éster sobre tioéster, e/ou como apresentando atividade melhorada (í.e., taxa catalítica) no que diz respeito a éster sobre tioéster. Aquelas variantes que apresentam uma pontuação Z de Especificidade de
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Éster menor que -3 foram marcadas como apresentando uma preferência por tioéster sobre éster.
EXEMPLO 33. ANÁLISE DE ÁCIDO GRAXO LIVRE DE VARIANTES DE ‘TesA
Nesse Exemplo, resultados de ensaios identificando várias propriedades de variantes de 'TesA são providos. A análise foi conduzida utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32. Nas tabelas das FIGs. 45 e 46, as mutações são apresentadas utilizando Códigos Variantes”, cada um do qual provê o aminoácido selvagem, seguido pela posição na sequência de aminoácido, seguido pelo aminoácido de substituição (ex., S10A” indica que a serina na posição 10 na sequência de aminoácido foi substituída pela alanina nessa variante particular).
EXEMPLO 34. ANÁLISE DE VARIANTES DE ‘TesA
Resultados de ensaio para variantes de 'TesA são providas nos anexos 4-10. A análise foi conduzida utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32. Como mostrado nos anexos 4 e 5, níveis de atividade em substratos C10, C12 e C14 e especificidade de substrato foram analisados.
Os anexos 4 e 5 representam índices de desempenho de certas variantes de 'TesA da biblioteca de 'TesA mutante, que demonstra desempenho melhorado comparado com a enzima selvagem. Os anexos 4 e 5 representam índices de desempenho de mutantes 'TesA em termos de especificidade para substratos de certos comprimentos de cadeia.
ANEXO 6 representa mutantes 'TesA que proveram
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334/360 produtividade proporcional ou de porcentagem aumentada ou melhorada de ésteres graxos X ácidos graxos livres. ANEXO 7 representa mutantes 'TesA que proveram produtividade proporcional ou de porcentagem reduzida de ésteres graxos X ácidos graxos livres. Somente mutantes que apresentaram pontuações Z acima de 3 são ilustradas na tabela e outros mutantes apresentando atividades menores não estão incluídos. Apesar da apresentação de dados, é submetido que uma pontuação Z mais baixa pode identificar mutantes valorosos e a ponto de corte da pontuação Z de 3 provido nos ANEXOS 4 E 5 não tem como intuito limitar o escopo da invenção.
Os resultados são representados graficamente juntamente com o comprimento inteiro da molécula 'TesA nas Figs. 33A-C.
Atividade de Produção de Ácido Graxo para Variantes de 'TesA
Resultados de ensaio para atividade de produção de ácido graxo nas variantes 'TesA são conduzidos utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32.
Ensaio de Acil-PNP Graxo de Variantes de 'TesA
Resultados de ensaio para atividade de acil-PNP graxo de variantes de 'TesA são providos nos ANEXOS 4 E 5. A análise foi conduzida utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32.
Análise de Acil-CoA de Variantes 'TesA
Resultados de ensaio para atividade de acil-CoA de variantes de 'TesA são providos nos ANEXOS 4 E 5. A análise foi conduzida utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32.
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Preferência por Tioéster (Acil-CoA) sobre Éster (Acil-PNP)
Resultados de ensaio para atividade de acil-CoA e atividade de acil-PNP de variantes de 'TesA são conduzidos utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32.
Preferência por Éster (Acil-PNP) sobre Tioéster (Acil-CoA)
Resultados de ensaio para atividade de acil-CoA e atividade de acil-PNP de variantes de 'TesA são conduzidos utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 32.
EXEMPLO 35. PRODUÇÃO DIRETA DE ÉSTERES GRAXOS NA AUSÊNCIA DE ÉSTER SINTASE
Nesse exemplo, a habilidade de 'TesA para catalisar a transesterificação de um acil-CoA graxo no éster graxo correspondente na presença de um álcool ín vitro é demonstrado. Enzima 'TesA de E.coli foi expressa recombinantemente e purificada a homogeneidade como uma proteína com 6X His-tag Nterminal. Em particular, o gene 'TesA codificando a enzima tioesterase I proveniente de E.coli (SEQ ID NO:31) foi inserido em um vetor pET15-b (Novagen), cujo vetor carregava um 6X Histag N-terminal , e transformado em células BL21-DE3 para expressão. Células foram cultivadas em meio LB a 37oC, 200 rpm, até atingir DO600 de 1,0, induzidas com IPTG 0,5 mM (final), e então permitidas a crescer a 28oC por 5 horas adicionais. Após coletado a 6.000 rpm, o precipitado foi ressuspendido em 40mL de Tris-HCl 100mM, pH 7,4, sonicado e centrifugado a 10.000 rpm por 20 minutos. Lisado clarificado foi então aplicado a uma coluna His-bind (Calbiochem) e a proteína foi purificada de acordo com
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336/360 as instruções do fabricante. Proteína eluída foi então dialisada em um tampão contendo fosfato de sódio 25mM, pH 7,2, e glicerol para armazenamento e uso. A atividade de tioesterase da enzima 'TesA purificada foi determinada.
Catálise de acil-CoA graxo em éster graxo por 'TesA envolve um ataque nucleofílico através de um álcool no centro carbonil subsequente à saída da porção de coenzima A do sítio ativo. A taxa de transesterificação espontânea de ácido palmítico por etanol na ausência de 'TesA foi analisado para provar que etanol pode substituir água como o nucleófilo para formar ésteres graxos ao invés de ácidos graxos.
De acordo, uma alíquota de 4 mM (por volta de 1 mg/mL) de ácido palmítico (C16-COOH) (Sigma) foi incubada com quantidades variáveis de etanol por diferentes períodos de tempo a temperatura ambiente. Amostras foram extraídas com proporção volumétrica 1:1 de acetato de etila e o extrato foi analisado utilizando GC-MS para a presença de etil palmitato. Os resultados estão compilados na Tabela 23 abaixo, que indicou que transesterificação espontânea entre etanol e ácido palmítico ocorre a uma taxa de conversão de menos que 0,01 mole/mole de ácido palmítico.
Tabela 23
% Etanol (v/v) C2C16 formado*, mg/L % conversão (g/g) % conversão (mole/mole)
0 0 0 0
20 0,34 0, 034 0, 030
30 0,25 0, 025 0, 022
40 0,25 0, 025 0, 022
50 0,35 0, 035 0, 031
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337/360 *: Média de dois pontos de dados.
A taxa de transesterificação in vitro catalisada por 'TesA em substrato palmitoil-CoA foi analisada. Reações foram conduzidas a temperatura ambiente por 1 hora em um tampão contendo 100 μΜ de palmitoil-CoA, 100 μΜ de tampão Fosfato pH 7,0 e BSA 1mM, tanto na presença quanto na ausência de 1,5 μΜ de 'TesA purificada. Concentrações de etanol variaram entre 0-60% (v/v). Proporção volumétrica de 1:1 acetato de etila foi utilizada para esmorecimento e subsequente extração. Formação de etil palmitato foi monitorada utilizando GC-MS. Tabela 24 resume os resultados.
Tabela 24
Etanol Etil palmitato (mg/L) Etil palmitato formado % conversão % conversão
% v/v - 'TesA + 'TesA (mg/L) (g/g de C16- CoA) (mole/mole)
0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
10 0 4,12 4,12 4,12 14,57
20 0 6, 64 6, 64 6, 64 23,49
40 0 1,88 1, 88 1,88 6, 65
60 0 1,74 1,74 1,74 6, 15
Os resultados indicam que tioesterase 'TesA eficientemente catalisa a transesterificação de um acil-CoA, palmitoil-CoA, em etil palmitato na presença de etanol. Produtividade máxima obtida foi 23,5 mole/mole de palmitoil-CoA. Dado que produtividades para conversão espontânea de ácido palmítico em éster palmítico são extremamente baixas comparadas àquelas na presença de 'TesA (i.e., indicando um aumento > 1.000 vezes) a conversão ocorre enzimaticamente. Baseado em nossos dados, produtividade máximas de transesterificação ocorreram a níveis de etanol 10-20% (v/v). Concentrações mais altas de álcool
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338/360 afetam a estabilidade de enzima e/ou atividade adversamente e, portanto, resultam em produtividades menores de éster.
Desse resultados, uma conclusão foi atingida que a tioesterase pode catalisar a esterificação direta de um substrato acil-CoA na presença de álcool. Será possível modificar o produto de éster através da mudança do álcool (ex., utilizando metanol, propanol ou butanol) e/ou a concentração de álcool.
EXEMPLO 36. PRODUÇÃO IN VIVO DE ÉSTERES GRAXOS PELA TIOESTERASE
Nesse exemplo, a habilidade de 'TesA produzir ésteres in vivo na ausência de éster sintase expressa de maneira heteróloga foi investigada. A formação de éster na ausência de uma éster sintase expressa de maneira heteróloga foi observada na E. coli cepa MG1655 (EfadE), que também carrega um operon artificial contendo 'tesA e fadD sob o controle de um promotor trc, juntamente com um gene marcador de canamicina. O operon foi integrado no cromossomo, interrompendo o gene lacZ nativo. Essa cepa foi testada em uma fermentação em frasco de agitação utilizando meio contendo 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1 mg/L de tiamina, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl, suplementado com NH4Cl extra (1 g/L adicional), tampão Bis-Tris (0,2 M), Triton X-100 (0,1% v/v), e mineraistraço (27 mg/L de FeCl3-6 H2O, 2 mg/L de ZnCl2 - 4H2O, 2 mg/L de CaCl2 - 6H2O, 2 mg/L de Na2MoO4 - 2H2O, 1,9 mg/L de CuSO4 - 5H2O, 0,5 mg/L de H3BO3, 100 mL/L de HCl concentrado).
Uma cultura pré-semeadura de LB + antibióticos foi inoculada com uma raspa de um estoque de glicerol ou a partir de uma
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339/360 colônia isolada. Ela foi cultivada por 6 a 8 horas até atingir uma DO600 > 1,0. Uma cultura de semeadura crescida durante a noite contendo meio de fermentação mais glicose 2% (w/v) + antibióticos foi inoculada com a o LB de cultura pré-semeadura a 4% (v/v). 15 5 mL de culturas de produção contendo meio de fermentação + glicose 3% (w/v) + antibióticos foram preparadas em frascos do tipo balão de agitação de 125 mL. Uma quantidade apropriada da cultura de semeadura durante a noite foi utilizada para inocular a cultura de produção de modo que a DO600 inicial era de por volta de 0,5.
Os frascos foram permitidos a crescer até a DO600 neles atingirem 1,0, o ponto no qual as culturas foram induzidas com IPTG 1mM (concentração final) e alimentadas com metanol ou etanol (a 2% v/v). As corridas de fermentação foram permitidas a continuar para a quantidade de tempo indicada pós-indução. Todas as etapas 15 de cultura foram desempenhados a 32°C com agitação a 200 rpm.
Extrações de caldo bruto foram desempenhadas utilizando um procedimento de micro-extração padrão. Brevemente, 500 pl de caldo foi transferido para um tubo de micro-centrífuga, ao qual 100 pl de HCl 1M foi adicionado. As culturas acidificadas foram 20 extraídas com 500 pl de acetato de etila, submetidos ao vórtex por 5 minutos, e centrifugada a velocidade máxima por 1 minuto. A camada orgânica foi analisada utilizando GC-FID para tanto quantificação simultânea de metil éster de ácido graxo (FAME) e ácido graxo livre (FFA) quanto quantificação simultânea de etil 25 éster de ácido graxo (FAEE) e FFA.
Em amostras contendo FAEE e FFA, os FFA foram derivatizados com Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida antes da quantificação.
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A cepa MG1655 (AfadE) pTrc-'TesA_fadD, que foi cultivada e alimentada com metanol 2% na indução, produziu 2 g/L de FAMEs totais no ponto de tempo de 24 horas e 3,5 g/L de FAMEs totais ao final da fermentação a 48 horas (FIG. 26). Quantidades mínimas de FFAs foram detectadas, por volta de 100 mg/L no total. As culturas atingiram sua densidade mais alta, DO600 por volta de 11, após 24 horas e não continuou a crescer nas próximas 24 horas. A produtividade específica foi calculada para ser por volta de 200 mg/L/DO a 24 horas, e por volta de 300 mg/L/DO a 48 horas. Esses dados indicam que, com a super-expressão de 'tesA e fadD, mesmo na ausência de uma sintase de cera, a produção de FAME foi observada.
Para avaliar a habilidade de FadD ou 'TesA de independentemente produzir FAME, uma segunda fermentação foi conduzida testando duas cepas diferentes de E. coli carregando plasmídeos com fadD ou 'tesA, ou com ambos fadD e 'tesA. Os plasmídeos eram todos baseados em pACYC e a expressão era direcionada por um promotor trc. Três cepas diferentes de MG1655 (AfadE) foram testadas, uma com somente um plasmídeo fadD, uma com somente um plasmídeo 'tesA, e uma com 'tesA e fadD com 'tesA estando localizado a montante de fadD. Duas C41 (AfadE) foram testadas, ambas carregando 'tesA e fadD, porém com genes em ordem diferente relativa ao promotor. Essas cepas foram cultivadas no meio descrito acima e alimentadas com metanol 2% na indução e crescidas por 25 horas adicionais pós-indução. A cepa expressando somente fadD não produziu quaisquer FAMEs enquanto a cepa 'tesA produziu somente por volta de 150 mg/L de FAMEs (FIG. 27). A presença de ambos 'TesA e fadD apresenta melhora na produção de FAME comparado com 'TesA sozinho. As duas cepas C41
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341/360 produziram um aumento adicional na produção de FAME, como observado na cepa carregando um plasmídeo no qual fadD está a montante de 'tesA, comparado com a cepa expressando 'tesA e fadD na ordem oposta. Isso sugere que expressão mais alta de FadD aumentou a habilidade de 'TesA de produzir ésteres. Já que 'TesA pode clivar tanto acil-ACPs quanto acil-CoAs, é provável que a produção de acil-CoAs por FadD está permitindo aos FFAs gerados por 'TesA a serem reciclados de volta à tioesterase para ou serem convertidos de volta nos FFAs através de hidrólise ou até se tornarem FAMEs através de alcólise. Examinação das titulações de FFA leva à conclusão de que somente a cepa expressando 'TesA produziu quantidades significativas de FFA, enquanto as cepas expressando fadD produziram muito pouco FFA (FIG. 28).
'TesA foi testada para sua habilidade de utilizar etanol para a formação direta de etil éster de ácido graxo (FAEE). As duas cepas MG1655 (AfadE) do experimento descrito acima, a cepa de super-expressão de fadD e a cepa de super-expressão de 'TesA, foram testadas. Também incluído nesse experimento foi a MG1655 (AfadE) com o operon 'tesA_fadD integrado sob o controle de um promotor trc. Todas as cepas foram cultivadas utilizando o protocolo descrito acima. Na indução, todas as cepas foram alimentadas com 2% (v/v) de metanol ou 2% (v/v) de etanol. Em adição, a cepa MG1655 (AfadE) + fadD foi alimentada com 0,05% (w/v) de ácido graxo C14:0 para garantir que substrato de ácido graxo livre suficiente estava disponível para FadD catalisar a reação de alcólise potencial. As fermentações foram permitidas a continuar por 24 horas.
Sob essas condições de fermentação, FadD sozinho não foi
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342/360 novamente capaz de produzir o FAME CiCi4:0 ou FAEE C2Ci4:0 requisito, indicando que FadD não foi suficiente para formação de éster (FIG. 29). Porém, 'TesA sozinho foi capaz de produzir FAEEs e como antes, super-expressão de 'tesA e fadD estimula produção geral de FAEEs sobre tendo 'tesA sozinho. Enquanto as titulações gerais de FAEE foram menores que as titulações de FAME, esse dado demonstra que 'TesA pode também utilizar etanol em adição ao metanol para a formação de ésteres graxos. Análise de formação de FFA sob essas condições de fermentação indica que as cepas se comportaram similarmente com alimentação com etanol como com a alimentação com metanol (FIG. 30).
O FFA presente nas amostras fadD foi contribuído quase que integralmente pelo FFA Ci4:0 alimentado durante a fermentação. A cepa expressando 'tesA produziu uma grande quantidade de FFA, enquanto a cepa expressando 'tesA e fadD apresentou muito pouco acúmulo de FFA. Na presença de 'TesA, somente 14% de conversão de FFA em FAME ou 2,3% de FFA em FAEE foi observada. Na presença de 'TesA e FadD, uma conversão de quase i00% de FFA em ou FAME ou FAEE foi observada. Esses dados sugerem que 'TesA é necessário e suficiente para formação de álcool éster de ácido graxo, porém a super-expressão de FadD juntamente com 'TesA é importante para formação de FAME e FAEE aumentada.
Os resultados prévios sugerem que 'TesA de E. coli pode produzir FAME e FAEE quando alimentada com os alcoóis apropriados durante a fermentação. Para determinar quando essa é uma função única a 'TesA de E. coli, a habilidade de outras tioesterases expressas de maneira heteróloga de produzir FAMEs foi investigada. Homólogos de 'TesA provenientes de Photorhabdus
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343/360 luminescens e Vibrio harveyi juntamente com uma TesB proveniente de Photobacterium profundum foram super-expressas a partir de plasmídeos baseados em pACYC na cepa MG1655 (PfadE) e testados juntamente com a cepa de E. coli com super-expressão 'TesA 5 provenientes das fermentações prévias. Fermentações em frasco de agitação foram conduzidas em meio de fermentação e permitidas a continuar por 24 horas após-indução. Os resultados indicaram que os dois homólogos 'TesA foram também capazes de gerar FAMEs (FIG.
31). 'TesA de P. luminescens produziram FAME a um nível comparável a 'TesA de E. coli, enquanto a 'TesA de V. harveyi foi capaz de produzir muito mais FAME que 'TesA de E. coli. Quando olhando as titulações de FFA, a 'TesA de P. luminescens produziu menos FFA que a 'TesA de E. coli, porém novamente, a 'TesA de V. harveyi produziu titulações muito maiores de FFA 15 quando comparado com sua contraparte de E. coli (FIG. 32).
Interessantemente, a 'TesA de V. harveyi foi altamente ativa e foi capaz de produzir titulações mais altas de FAME e FFA que a cepa controle expressando 'TesA de E. coli; além disso, sua taxa de conversão de FFA em FAME foi acima de 30% em comparação com 20 os 14% de 'TesA de E. coli. Adicionalmente, apesar de produzir titulações de FAME total mais baixas, a cepa expressando 'TesA de P. luminescens mostrou que FAME constituiu mais de 60% da titulação total FAME + FFA.
Atividade de Éster Sintase em Outros Homólogos de 'TesA
Os homólogos de 'TesA provenientes de Escherichia coli,
Pectobacterium atrosepticum, Photobacterium profundum, Photorhabdus luminescens, Pseudomonas putida, e Vibrio harveyi foram clonados no vetor de expressão pACYC sob o controle de um
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344/360 promotor trc. Todas as sequências foram clonadas como genes truncados sem o peptídeo sinal, com o intuito de obter expressão citoplasmática. Sequências de DNA e aminoácidos para os homólogos são mostrados na Tabela 26. Um alinhamento das sequências de aminoácidos é mostrado na Tabela 27.
Os plasmídeos foram transformados em E. coli MG1655 AfadE e cultivado durante a noite a 37°C em placas de ágar LB contendo 100 pg/mL de carbenicilina. Colônias individuais foram selecionados e cultivados a 37°C e, um caldo LB contendo glicose 1% (w/v) e 100 pg/mL de carbenicilina até DOóoo ter atingido um valor de por volta de 1,0. 200 pL da cultura foi então diluída em 1,8 mL de um meio M9 contendo 100 pg/mL de carbenicilina. Após crescimento das culturas por 3 horas a 37°C, IPTG (concentração final de 1 mM), assim como tampão Bis-Tris Propano (0,1 M, pH 7,0), e metanol (2% v/v) foram adicionados.
Após 20 horas de crescimento a 37°C, 1 mL de cultura foi extraído através de adição de 100 pL de HCl 1 N e 250 pL de acetato de etila. Um padrão interno de ácido graxo livre C20 foi incluído na solução de acetato de etila.
Os ácidos graxos e metil ésteres foram analisados em um cromatógrafo de gases Trace GC Ultra (Thermo Electron Corp) equipado com um detector de ionização de chama. A quantidade total de ácido graxo (FFA) e metil éster de acil graxo (FAME) produzido variou dentre os homólogos estudados (veja FIG. 34).
'TesA de E. coli produziu por volta de 300 mg/L nos produtos graxos totais, enquanto o homólogo de Pseudomonas putida gerou quase 4 vezes aquela quantidade. A proporção de FAME produzido
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345/360 foi também dependente de qual homólogo de 'TesA foi expresso.
Enquanto somente 3% do produto total gerado por 'TesA proveniente de Pseudomonas putída foi FAME, mais de 25% do produto total gerado pela 'TesA de Víbrío harveyí foi FAME. Esses resultados 5 indicam que formação de éster é catalisado e influenciado pela 'TesA, ao invés de ser um processo puramente químico que não é afetado pela enzima. Além disso, essa atividade é uma função da sequência de aminoácido da enzima e que ela pode ser engenheirada para aumentar ou diminuir a propensão para produção de éster.
Para determinar quando a super-expressão de FadD iria aumentar titulações de FAME, os plasmídeos foram então transformados em E. colí MG1655 AfadE carregando o gene fadD no plasmídeo pCL1920, sob o controle de um promotor trc. As células transformadas foram cultivadas durante a noite a 37°C em placas 15 de ágar LB contendo 100 pg/mL de carbenicilina e 100 pg/mL de espectinomicina. Colônias individuais foram selecionadas e cultivadas a 37°C em caldo LB contendo glicose 1% (w/v), 100 pg/mL de carbenicilina, e 100 pg/mL de espectinomicina até DO600 ter atingido um valor de por volta de 1,0. 200 pL da cultura foi 20 então diluída em 1,8 ml de um meio M9 contendo 100 pg/mL de carbenicilina e 100 pg/mL de espectinomicina. Após crescimento das culturas por 3 horas a 37°C, IPTG (concentração final de 1 mM), assim como tampão Bis-Tris Propano (0,1 M, pH 7,0) e metanol (2% v/v) foram adicionados.
Após 20 horas de crescimento a 37°C, 1 ml de cultura foi extraída através de adição de 100 pL de HCl 1 N e 250 pL de acetato de etila. Um padrão interno de ácido graxo livre C20 foi incluído na solução de acetato de etila.
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Os ácidos graxos e metil ésteres foram analisados em um cromatógrafo Trace GC Ultra (Thermo Electron Corp) equipado com um detector de ionização de chama. Como observado previamente com 'TesA de E. colí, co-expressão de FadD aumentou a proporção 5 de FAME produzido para todos os homólogos testados (Veja FIG.
35). Portanto, co-expressão de um acil-CoA sintase em conjunção com homólogos de 'TesA pode ser utilizada para aumentar a produção de éster. Interessantemente, a titulação total de FFA mais FAME produzido pela 'TesA proveniente de P. putída foi muito 10 menor quando FadD foi co-expressa. Isso sugere que 'TesA de P.
putída pode ser mais específica para substratos acil-ACP que acil-CoAs, e pode ser co-expressa com uma éster sintase ou outra tioesterase com maior atividade contra acil-CoAs para aumentar adicionalmente a produção de éster.
Síntese de Éster Aumentada por uma Mutante 'TesA
Como mencionado acima, os estudos de homólogos de 'TesA indicaram que a atividade de éster sintase em 'TesA em um traço capaz de ser engenheirado; ou seja, que pode sofrer alterações na sequência de aminoácidos da enzima para melhorar a produção 20 de ésteres. Para esse fim, um mutante de 'TesA de E. colí foi construído com atividade de éster sintase aumentada. Substituindo Ser10, o resíduo de serina nucleofílico no sítio ativo de 'TesA, com cisteína para gerar o mutante S10C leva a uma enzima 'TesA melhorada que produz um proporção maior de FAME.
Plasmídeos codificando 'TesA selvagem de E. colí, o mutante
S10C, ou nenhuma 'TesA foram transformadas em E. colí MG1655 PfadE e cultivadas durante a noite a 37°C em placas de ágar LB contendo 100 pg/mL de carbenicilina. Colônias individuais foram
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347/360 selecionadas e cultivadas a 37°C em caldo LB contendo glicose 1% (w/v) e 100 μg/mL de carbenicilina. As culturas foram então diluídas 1:100 em um meio LB fresco suplementado com glicose 1% (w/v) e 100 μg/mL de carbenicilina, e cultivados a 37°C até DO600 ter atingido um valor de por volta de 1,0. 200 μL da cultura foi então diluída em 1,8 ml de um meio M9 contendo 100 μg/mL de carbenicilina. Após crescimento das culturas por 3 horas a 37°C, IPTG (concentração final de 1 mM), assim como tampão Bis-Tris Propano (0,1 M, pH 7,0) e metanol (2% v/v) foram adicionados.
Após 20 horas de crescimento a 37°C, 1 mL de cultura foi extraído através de adição de 100 μL de HCl 1 N e 250 μL de acetato de etila. Um padrão interno de ácido graxo livre C20 foi incluído na solução de acetato de etila.
Os ácidos graxos e metil ésteres foram analisados em um cromatógrafo a gás Trace GC Ultra (Thermo Electron Corp) equipado com um detector de ionização de chama. A quantidade total de ácido graxo (FFA) e metil éster de acil graxo (FAME) foi maior em culturas de 'TesA selvagem de E. coli (316 mg/L) comparado ao mutante S10C (136 mg/L), porém a proporção de FAME em S10C (47%) foi maior que aquela observada com a 'TesA selvagem (9%). Isso demonstra que a sequência de 'TesA pode ser modificada para afetar a proporção de ésteres produzidos (Veja FIG. 36).
Tabela 26: Sequências de homólogos de 'TesA estudados no Exemplo 36
Espécie Sequência de DNA Sequência de Aminoácido
Escherichia coli ATGGCGGACACGTTATTGATTCTGGGTG ATAGCCTGAGCGCCGGGTATCGAATGTC TGCCAGCGCGGCCTGGCCTGCCTTGTTG MADTLLILGDSLSAGYRMSASAAWP ALLNDKWQSKTSVVNASISGDTSQQ GLARLPALLKQHQPRWVLVELGGND
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AATGATAAGTGGCAGAGTAAAACGTCGG TAGTTAATGCCAGCATCAGCGGCGACAC CTCGCAACAAGGACTGGCGCGCCTTCCG GCTCTGCTGAAACAGCATCAGCCGCGTT GGGTGCTGGTTGAACTGGGCGGCAATGA CGGTTTGCGTGGTTTTCAGCCACAGCAA ACCGAGCAAACGCTGCGCCAGATTTTGC AGGATGTCAAAGCCGCCAACGCTGAACC ATTGTTAATGCAAATACGTCTGCCTGCA AACTATGGTCGCCGTTATAATGAAGCCT TTAGCGCCATTTACCCCAAACTCGCCAA AGAGTTTGATGTTCCGCTGCTGCCCTTT TTTATGGAAGAGGTCTACCTCAAGCCAC AATGGATGCAGGATGACGGTATTCATCC CAACCGCGACGCCCAGCCGTTTATTGCC GACTGGATGGCGAAGCAGTTGCAGCCTT TAGTAAATCATGACTCATAA (SEQ ID NO:32) GLRGFQPQQTEQTLRQILQDVKAAN AEPLLMQIRLPANYGRRYNEAFSAI YPKLAKEFDVPLLPFFMEEVYLKPQ WMQDDGIHPNRDAQPFIADWMAKQL QPLVNHDS (SEQ ID NO:31)
Pectobacterium atrosepticum ATGGCTGATACATTATTAATTCTGGGTG ATAGCCTCAGTGCGGGCTACCAGATGCC GGCCGCTAACGCCTGGCCAACGCTGCTG AACACGCAGTGGCAGACGCAGAAAAAGG GCATCGCCGTGGTTAACGCCAGCATTAG CGGCGACACCACCGCACAGGGGCTGGCG CGACTTCCTGCCTTACTGAAACAACATC AGCCGCGTTGGGTGTTGATTGAACTGGG CGGCAATGACGGGCTTCGGGGGTTTCCG GCACCCAATATCGAGCAGGATCTGGCGA AAATCATTACGCTAGTCAAACAGGCTAA MADTLLILGDSLSAGYQMPAANAWP TLLNTQWQTQKKGIAVVNASISGDT TAQGLARLPALLKQHQPRWVLIELG GNDGLRGFPAPNIEQDLAKIITLVK QANAKPLLMQVRLPTNYGRRYTESF SNIYPKLAEQFALPLLPFFMEQVYL KPEWIMEDGIHPTRDAQPFIAEWMA KQLEPLVNHES (SEQ ID NO:59)
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CGCTAAGCCTCTGCTGATGCAGGTTCGT TTGCCAACCAACTATGGCCGCCGCTACA CCGAGTCATTCAGCAACATTTACCCCAA ACTCGCGGAGCAGTTTGCGCTTCCTCTG CTGCCTTTCTTTATGGAGCAGGTGTATC TTAAACCGGAGTGGATCATGGAAGATGG CATCCATCCAACCCGTGATGCCCAACCG TTTATCGCAGAATGGATGGCGAAGCAGC TGGAACCCTTAGTTAACCATGAGTCTTA A (SEQ ID NO:60)
Photobacterium profundum ATGGGCAACACATTACTGGTTGTCGGTG ATAGCTTGAGCGCGGGCTATCAAATGCG GGCAGAACAAAGCTGGCCGGTGTTACTG CAACCCGCATTAAAGCAACAAGGTCACG AAATCACCGTTGTAAATGCCAGTATTTC AGGCGATACAACAGGAAACGGCTTGGCT CGATTGCCTACATTATTACAACAACATA AACCAGCTTACGTCATAATTGAACTCGG GGCGAATGATGGCTTACGTGGTTTCCCT CAAGGTACTATACGTAACAATCTCAGCC AAATGATCACTGAAATTCAAAATGCTGA TGCCAAGCCAATGCTCGTGCAGATAAAA GTGCCGCCCAATTACGGCAAACGCTACA GTGATATGTTCAGTTCTATTTACCCTCA ACTCAGTAAAGAGTTAGCCACACCACTG TTACCTTTCTTTTTAGAGCAGATCATTT TAAAACAAGAATGGATGATGAATGACGG TTTGCATCCTAAATCTGATGCTCAGCCA TGGATTGCCGAATATATGGCTGAGAATA MAWGNTLLVVGDSLSAGYQMRAEQS WPVLLQPALKQQGHEITVVNASISG DTTGNGLARLPTLLQQHKPAYVIIE LGANDGLRGFPQGTIRNNLSQMITE IQNADAKPMLVQIKVPPNYGKRYSD MFSSIYPQLSKELATPLLPFFLEQI ILKQEWMMNDGLHPKSDAQPWIAEY MAENIAPYL (SEQ ID NO:61)
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TCGCGCCTTATTTATAA (SEQ ID NO:62)
Photorhabdus luminescens ATGGCTGATACCCTTCTGATTCTCGGTG ATAGCCTTAGTGCCGGTTACCATCTGCC TATTGAGCAGTCATGGCCTGCTTTGATG GAAAAAAAGTGGCAAAAATCCGGCAATA AAATCACGGTCATCAACGGCAGCATCAG CGGCAACACCGCCGCTCAGGGCCTTGAG CGGCTACCTGAATTACTTAAACAACATA AACCCCGTTGGGTACTGATAGAGCTGGG TGCCAACGATGGATTACGCGGTTTTCCT CCACAACACACCGAACAAGATCTACAAC AGATCATTACTTTAGTGAAACAAGCTAA TATTCAGCCTTTATTGATGCAGATCCGT CTACCACCAAACTATGGGCGCCGTTATA CCGAGTCTTTTGCCAAGATTTACCCCAA ACTGGCAGAATATAATCAAATTCCCCTG CTCCCGTTTTATATGGAGCAAGTCGCCA TTAAACCGGAGTGGGTGCAACAAGATGG GTTACATCCTAATCTGGCAGCCCAACCA TTTATCGCCGATTGGATGTCTGACACAC TATCAGCACATCTTAATTATTCTTAA (SEQ ID NO:64) MADTLLILGDSLSAGYHLPIEQSWP ALMEKKWQKSGNKITVINGSISGNT AAQGLERLPELLKQHKPRWVLIELG ANDGLRGFPPQHTEQDLQQIITLVK QANIQPLLMQIRLPPNYGRRYTESF AKIYPKLAEYNQIPLLPFYMEQVAI KPEWVQQDGLHPNLAAQPFIADWMS DTLSAHLNYS (SEQ ID NO:63)
Pseudomonas putida ATGGCAGGAACACTGCTGGTTGTTGGCG ATAGTATCAGCGCCGGTTTTGGCCTGGA TAGCCGTCAGGGCTGGGTGTCTCTCTTG CAGGCCCGTCTCAGGGACGAAGGTTTTG ACGACAAAGTGGTCAATGCTTCGATCAG TGGCGATACCAGCGCAGGTGGCCAGGCG MAGTLLVVGDSISAGFGLDSRQGWV SLLQARLRDEGFDDKVVNASISGDT SAGGQARLPALLAAHKPSLVVLELG GNDGLRGQPPAQLQQNLASMIERSR QAGAKVLLLGMRLPPNYGVRYTTAF AKVYEQLAADKQVPLVPFFLEGVGG
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CGGCTGCCGGCGCTGCTTGCAGCACATA AACCGAGCCTGGTGGTGCTGGAGCTGGG CGGCAACGATGGCCTGCGCGGGCAGCCG CCTGCACAATTGCAACAAAATCTTGCCT CGATGATCGAGCGTTCGCGTCAGGCAGG GGCCAAGGTGCTGCTATTGGGCATGCGC CTGCCGCCCAATTATGGTGTGCGTTACA CCACCGCCTTTGCCAAGGTGTATGAACA GCTGGCAGCGGACAAACAGGTTCCCTTG GTGCCGTTTTTCCTCGAAGGGGTAGGGG GCGTACCTGAACTGATGCAGGCTGATGG CATCCATCCGGCCCAGGGGGCTCAGCAG CGCCTGCTGGAAAATGCCTGGCCAGCGA TAAAACCCTTGCTGTGA (SEQ ID NO:66) VPELMQADGIHPAQGAQQRLLENAW PAIKPLL (SEQ ID NO:65)
Vibrio harveyi ATGAGCGAAAAGCTACTTGTTTTGGGCG ACAGCCTGAGCGCTGGTTATCAAATGCC TATAGAGGAGAGTTGGCCTAGCTTACTC CCAGGCGCGTTATTAGAACATGGCCAAG ATGTAAAAGTTGTAAACGGTAGCATCTC TGGTGACACCACAGGCAATGGCCTTGCA CGGTTACCTTCTCTCCTTGAGCAACACA CGCCCGATTTGGTACTGATTGAGCTTGG CGCTAACGATGGCCTACGCGGTTTCCCA CCTAAACTTATTACGTTAAACCTATCGA AAATGATTACCATGATCAAAGATTCTGG TGCGGATGTCGTCATGATGCAAATCCGC GTCCCACCAAATTATGGTAAGCGTTACA GCGATATGTTCTACGACATCTACCCTAA MSEKLLVLGDSLSAGYQMPIEESWP SLLPGALLEHGQDVKVVNGSISGDT TGNGLARLPSLLEQHTPDLVLIELG ANDGLRGFPPKLITLNLSKMITMIK DSGADVVMMQIRVPPNYGKRYSDMF YDIYPKLAEHQQVALMPFFLEHVII KPEWMMDDGLHPKPEAQPYIADFVA QELVKHL (SEQ ID NO:67)
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ACTGGCAGAACATCAGCAAGTAGCGCTA ATGCCGTTCTTCTTAGAGCATGTCATCA TTAAACCAGAATGGATGATGGACGATGG CTTGCACCCAAAACCGGAAGCTCAACCC TACATTGCTGACTTTGTCGCTCAAGAAT TGGTTAAACATCTCTAA (SEQ ID NO:68)
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Tabela 27: Alinhamento de sequências ‘TesA__________________________________ 'TesA —MADTLLILGDSLSAGYRMSASAAWPALLNDKWQSKT---SVVNASISGDTSQQGLARL
PatrA —MADTLLILGDSLSAGYQMPAANAWPTLLNTQWQTQKKGIAVVNASISGDTTAQGLARL
PlumA —MADTLLILGDSLSAGYHLPIEQSWPALMEKKWQKSGNKITVINGSISGNTAAQGLERL
PproA MAWGNTLLVVGDSLSAGYQMRAEQSWPVLLQPALKQQGHEITVVNASISGDTTGNGLARL
VhA —MSEKLLVLGDSLSAGYQMPIEESWPSLLPGALLEHGQDVKVVNGSISGDTTGNGLARL
PputA —MAGTLLVVGDSISAGFGLDSRQGWVSLLQARLRDEGFDDKVVNASISGDTSAGGQARL 'TesA PALLKQHQPRWVLVELGGNDGLRGFQPQQTEQTLRQILQDVKAANAEPLLMQIRLPANYG
115
PatrA PALLKQHQPRWVLIELGGNDGLRGFPAPNIEQDLAKIITLVKQANAKPLLMQVRLPTNYG
PlumA PELLKQHKPRWVLIELGANDGLRGFPPQHTEQDLQQIITLVKQANIQPLLMQIRLPPNYG
PproA PTLLQQHKPAYVIIELGANDGLRGFPQGTIRNNLSQMITEIQNADAKPMLVQIKVPPNYG
VhA PSLLEQHTPDLVLIELGANDGLRGFPPKLITLNLSKMITMIKDSGADVVMMQIRVPPNYG
PputA PALLAAHKPSLVVLELGGNDGLRGQPPAQLQQNLASMIERSRQAGAKVLLLGMRLPPNYG 'TesA RRYNEAFSAIYPKLAKEFDVPLLPFFMEEVYLKPQWMQDDGIHPNRDAQPFIADWMAKQL
175
PatrA RRYTESFSNIYPKLAEQFALPLLPFFMEQVYLKPEWIMEDGIHPTRDAQPFIAEWMAKQL
PlumA RRYTESFAKIYPKLAEYNQIPLLPFYMEQVAIKPEWVQQDGLHPNLAAQPFIADWMSDTL
PproA KRYSDMFSSIYPQLSKELATPLLPFFLEQIILKQEWMMNDGLHPKSDAQPWIAEYMAENI
VhA KRYSDMFYDIYPKLAEHQQVALMPFFLEHVIIKPEWMMDDGLHPKPEAQPYIADFVAQEL
PputA VRYTTAFAKVYEQLAADKQVPLVPFFLEGVGGVPELMQADGIHPAQGAQQRLLENAWPAI 'TesA QPLVNHDS 183
PatrA EPLVNHES
PlumA SAHLNYS
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PproA APYL
VhA VKHL
PputA KPLL.
EXEMPLO 37. PRODUÇÃO DE FAME NA AUSÊNCIA DE UMA CERA SINTASE EM FERMENTADORES
Esse Exemplo demonstra que um processo como descrito no Exemplo 36, supra, pode ser escalonado para produzir ésteres de ácido graxo em escala comercial de acordo com a presente invenção.
Células provenientes de um estoque congelado foram reavivadas em um caldo LB por 4-8 horas e então cultivadas em um meio definido contendo: 1,5 g/L de KH2PO4, 4,54 g/L de trihidrato de K2HPO4, 4 g/L de (NH4HSO4, 0,15 g/L de heptahidrato de MgSO4, 20 g/L de glicose, 200 mM de tampão Bis-Tris (pH 7,2), 1,25, e 1,25 mL/L de uma solução de vitamina. solução de metais-traço consistia de 27 g/L de FeCl3 · 6H2O, 2 g/L de ZnCl2 ·4H2O, 2 g/L de CaCl2 · 6H2O, 2 g/L de Na2MoO4 · 2H2O, 1,9 g/L de CuSO4 · 5H2O, 0,5 g/L de H3BO3, e 100 mL/L de HCl concentrado. A solução de vitamina consistia de 0,42 g/L de riboflavina, 5,4 g/L de ácido pantotênico, 6 g/L de niacina, 1,4 g/L de piridoxina, 0,06 g/L de biotina, e 0,04 g/L de ácido fólico.
100 mL de uma cultura crescida durante a noite foi utilizada para inocular 2 litros do mesmo meio, porém com somente 2 g/L de glicose, em um fermentador sob temperatura, pH, agitação, aeração e oxigênio dissolvido extremamente controlados. As condições no fermentador eram 32°C, pH 6,8, nível de oxigênio
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355/360 dissolvido (DO) igual a 30% de saturação. O pH foi mantido pela adição de NH4OH, que também agiu como uma fonte de nitrogênio para crescimento celular. Quando a glicose inicial se tornou quase consumida, uma alimentação contendo glicose 60%, 3,9 g/L heptahidrato de MgSO4 e 10 mL/L da solução de minerais-traço foi suprido ao fermentador. A taxa de alimentação foi ajustada para coincidir com a taxa de crescimento celular para evitar acúmulo de glicose no fermentador. Evitando-se o acúmulo de glicose, é possível reduzir ou eliminar a formação de produtos secundários 10 tais como acetato, formato e etanol, que são por sua vez comumente produzidos por E.coli. Durante as primeiras 16-24 horas, a alimentação foi suprida exponencialmente, permitindo as células a crescer a uma taxa de crescimento fixa. Uma vez a taxa de alimentação tendo atingido um máximo desejado (de 6 a 10 g 15 glicose/L fermentador/h) ela foi mantida naquele nível para o restante da corrida de fermentação. Nas fases iniciais do crescimento, a produção de FAME foi induzida pela adição de 1 mM de IPTG e 25 mL/L de metanol puro. A fermentação foi permitida a continuar por um período de 3 dias. Metanol foi adicionado 20 várias vezes durante a corrida para recarregar o que foi consumido pelas células, porém a maior parte do que foi perdido por evaporação no gás de exaustão. As adições foram utilizados para manter a concentração de metanol no caldo de fermentação entre 10 e 30 mL/L, de modo a garantir produção eficiente 25 enquanto evitando inibição de crescimento celular.
A progressão da fermentação foi seguido por medições de DO600 (densidade ótica a 600 nm), consumo de glicose, e produção de éster.
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Consumo de glicose ao longo da fermentação foi analisado por Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC). A análise de HPLC foi desempenhada de acordo com métodos comumente utilizados para certos açúcares e ácidos orgânicos na arte, utilizando, por exemplo, as seguintes condições: Agilent HPLC 1200 Series com detector Refractive Index; Coluna: Aminex HPX-87H, 300 mm x 7,8 mm; temperatura da coluna: 35o C; fase móvel: 0,01 M H2SO4 (aquosa); taxa de escoamento: 0,6 mL/min; volume de injeção: 20 pl.
A produção de metil e etil ésteres de ácido graxo foi analisada através de cromatografia de gases com um detector de ionização de chama (GC-FID). As amostras do caldo de fermentação foram extraídos com acetato de etila em uma proporção de 1:1 vol/vol. Após agitação forte com vórtex, as amostras foram centrifugadas e a fase orgânica foi analisada através de cromatografia a gás (GC). As condições de análise foram como se seguem:
Instrumento: Trace GC Ultra, Thermo Electron Corporation com detector de ionização de chama (FID);
Coluna: DB-1 (1% de difenil siloxano; 99% de dimetil siloxano) CO1 UFM 1/0,1/5 01 DET da Thermo Electron Corporation, pH de fase 5, FT: 0,4 pm, comprimento 5m, id: 0,1mm;
Condições de entrada: splitless de 250°C, 3,8 minute método split 1/25 utilizado dependendo da concentração de amostra com escoamento split de 75 mL/min;
Gás carreador, taxa de escoamento: Hélio, 3,0 mL/min;
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Temperatura do bloco: 330°C;
Temperatura do forno: 0,5 minuto mantido a 50°C;
100°C/minuto a 330°C; 0,5 minuto mantido a 330°C;
Temperatura do detector: 300°C;
Volume de injeção: 2 pL;
Tempo de corrida/taxa de escoamento: 6,3 min/3,0 mL/min (método splitless), 3,8 min/1,5 mL/min (método split 1/25), 3,04 min/1,2 mL/min (método split 1/50).
Esse protocolo foi aplicado nas corridas de fermentação de 10 duas cepas diferentes: ID1 (MG1655 AfadE::PTRC tesA-fadD) e IDG5 (MG1655 AfadE AfhuA Aadh Aldh ApflB :: Ptrc tesA., PT5LfadD) , nenhuma das quais continha o gene codificando para uma éster sintase. Células foram induzidas a 4 horas após inoculação por uma adição de IPTG, e metanol foi alimentado aos fermentadores 15 para prover o álcool para produção de FAMEs. Em experimentos separados, as culturas foram alimentadas com glicose em duas taxas máximas de alimentação: 6 e 10 g/L/h.
Com ambas as cepas e em cada taxa de alimentação de glicose, as culturas indicaram uma preferência para a produção de FAME 20 sobre ácidos graxos livres, como mostrado nas FIG. 37 e FIG. 38.
Em fermentações de 70 horas, ID1 produziu por volta de 19 g/L de FAME e menos que 1 g/L de FFA quando alimentado a 6 g/L/h, e produziu 28 g/L de FAME e por volta de 1 g/L de FFA quando alimentado a 10 g/L/h. IDG5 produziu 20 g/L de FAME e menos que 25 1 g/L de FFA em alimentação com glicose menor, e produziu 25 g/L de FAME e por volta de 10 g/L de FFA em alimentação com glicose
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358/360 maior .
EXEMPLO 38. IDENTIFICAÇÃO DE TIOESTERASES QUE OCORREM NA
NATUREZA PARA PROPRIEDADES ALTERADAS BAEADAS EM RESULTADOS DE
ENGENHARIA DE PROTEÍNAS
Experimentos de engenharia de 'TesA de E.coli conduzidos aqui são úteis na identificação de muitos resíduos de aminoácidos, as mutações das quais levam a propriedades alteradas. 'TesA é uma enzimas que pertence à família SGNH, uma ampla categoria de enzimas. É provável que outros homólogos de 'TesA possam também ser utilizados na produção de biodiesel utilizando as vias descritas aqui. Esse exemplo identifica homólogos de 'TesA com propriedades potencialmente alteradas como comparado com 'TesA. O método é descrito abaixo.
Homólogos de 'TesA foram identificados utilizando a estratégia descrita abaixo.
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Esquema Sequência protéica de TesA deE.coli
BLAST utilizando banco de dados, ponto de corte do E-value de 10, máximo de acertos de 500, matriz de pontuação BLOSUM62 com todos outros parâmetros padrão utilizando o programa Discovery Studio > t (Accelrys, CA)
Lista de homólogos
-Remover sequências que não contenham resíduos de Sítio ativo correspondendo a SerlO, Aspl54, Hisl57 de TesA de E.coli
-Alinhamento múltiplo de sequência com alinhamento rápido par a par, matriz de pontuação-BLOSUM, penalidade de abertura de intervalo-10, penalidade de extensão de intervalo-0.05, com todos outros parâmetros padrão utilizando o programa Discovery Studio
V (Accelrys, CA)
Lista final de homólogos
Identificar homólogos que contenham substituições correspondendo a posições identificadas em tela TesA
V
Exemplos de homólogos que contenham substituições identificadas em tela TesA
Os homólogos com substituições nas posições correspondendo àqueles identificados na tela 'TesA são mostrados no anexo 12.
A ID do homólogo e o alinhamento de sequência próximo às posições de interesse são também mostrados.
EQUIVALENTES
Enquanto os exemplos específicos das invenções do assunto são explicitamente revelados aqui, a especificação e exemplos 10 aqui acima são ilustrativos e não restritivos. Muitas variações das invenções irão se tornar aparentes àqueles versados na arte após revisão dessa especificação incluindo os exemplos. O escopo completo das invenções devem ser determinados por referência aos
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360/360 exemplos, juntamente com seu escopo completo de equivalentes, e a especificação, juntamente com tais variações.
Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, e outras referências citadas nessa aplicação estão aqui 5 incorporadas por referência na sua íntegra como se cada publicação, patente, pedido de patente ou outra referência fosse especificamente e individualmente indicada a ser incorporada por referência.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Enzima tioesterase modificada que converte um substrato acil-ACP C10, C12 ou C14 em um derivado de ácido graxo com uma atividade maior quando comparado à tioesterase selvagem apresentando a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID NO:31, caracterizada pelo fato da tioesterase modificada apresentar uma substituição em uma ou mais posições de aminoácidos selecionados dentre os resíduos 45, 73, 78, 80, 101, 108, 111, 117, 118, 122, 145, 152 e 178 de SEQ ID NO:31, em que a metionina está na posição 0 e alanina está na posição 1 de SEQ ID NO:31, e em que (a) o resíduo de aminoácido na posição 45 ser alanina ou valina; (b) o resíduo de aminoácido na posição 73 ser cisteína ou valina; (c) o resíduo de aminoácido na posição 78 ser metionina; (d) o resíduo de aminoácido na posição 80 ser triptofano; (e) o resíduo de aminoácido na posição 101 ser leucina, alanina ou valina; (f) o resíduo de aminoácido na posição 108 ser triptofano; (g) o resíduo de aminoácido na posição 111 ser
    tirosina ou triptofano; (h) o resíduo de aminoácido na posição 117 ser arginina; (i) o resíduo de aminoácido na posição 122 ser arginina; (j) o resíduo de aminoácido na posição 145 ser alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, isoleucina, leucina , metionina , glutamina, arginina , serina ou treonina; (k) o resíduo de aminoácido na posição 152 ser arginina; e (l) o resíduo de aminoácido na
    posição 178 ser treonina ou triptofano.
  2. 2. Tioesterase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do resíduo de aminoácido na posição 73 ser uma cisteína, o resíduo de
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    2/3
    aminoácido na posição 101 ser leucina, o resíduo de aminoácido na posição 111 ser tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 145 ser cisteína e o resíduo de aminoácido na posição 178 ser treonina. 3. Tioesterase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do resíduo de aminoácido na posição 111 ser tirosina e o resíduo de aminoácido na posição 145 ser cisteína. 4. Tioesterase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do resíduo de aminoácido na posição 78 ser metionina, o resíduo de aminoácido na posição 108 ser triptofano e o resíduo de aminoácido na posição 145 ser cisteína. 5. Tioesterase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do resíduo de aminoácido na posição 78 ser metionina, o resíduo de aminoácido na posição 108 ser triptofano e o resíduo de
    aminoácido na posição 145 ser leucina.
    6. Polinucleotídeo que codifica a tioesterase modificada caracterizado por consistir na SEQ ID NO: 32.
    7. Vetor de expressão caracterizado por compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6, operacionalmente ligado a um promotor.
    8. Célula hospedeira de microorganismo caracterizada por compreender o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 6, ou o vetor de expressão, como definido na reivindicação 7, em que a célula de microorganismo compreende uma célula de bactéria, cianobactéria, fungo, levedura ou alga.
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  3. 3/3
    9. Método de fabricação de composição de derivado de ácido graxo C10, C12 ou C14 utilizando microorganismos, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
    (a) cultivar a célula hospedeira, como definida na
  4. 5 reivindicação 8, sob condições de cultura apropriada para expressão da tioesterase modificada, e (b) recuperar a composição de derivado de ácido graxo a partir do sobrenadante da cultura da referida célula;
    em que a composição de derivado de ácido graxo inclui
  5. 10 um ou mais ésteres graxos selecionados dentre: etil decanoato, etil dodecanoato, etil tridecanoato, etil tetradecanoato, etil pentadecanoato, etil cis-9hexadecenoato, etil hexadecanoato, etil heptadecanoato, etil cis-11-octadecenoato, etil octadecanoato, metil decanoato,
  6. 15 metil dodecanoato, metil tridecanoato, metil tetradecanoato, metil pentadecanoato, metil cis-9-hexadecenoato, metil hexadecanoato, metil heptadecanoato, metil cis-11octadecenoato, metil octadecanoato, octanoato de octila (C8C8) ou uma combinação destes; ou
  7. 20 em que a composição de derivado de ácido graxo inclui um ou mais ácidos graxos livres selecionados dentre: ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico, ácido pentanóico, ácidos cis-9hexadecenóico, ácido cis-11-octadecenóico, ou combinações
  8. 25 destes; ou em que a composição de derivado de ácido graxo inclui um ou mais álcoois graxos selecionados dentre: álcool graxo C10, C12, C14, C16 e C18 saturado.
BRPI0923572-8A 2008-12-23 2009-12-23 Enzima tioesterase modificada que converte um substrato acil-acp c10, c12 ou c14 em um derivado de ácido graxo, polinucleotídeo codificando a tioesterase modificada, vetor de expressão, célula hospedeira de microrganismo e método de fabricação de composição de derivado de ácido graxo c10, c12 ou c14 BRPI0923572B1 (pt)

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BR122019009204-4A BR122019009204B1 (pt) 2008-12-23 2009-12-23 Célula hospedeira de microrganismo compreendendo enzima tioesterase modificada e cultura de célula compreendendo a referida célula

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