BRPI1000802A2 - processo de obtenção de micropartìculas matriciais de copaìfera langsdorffii (partes aéreas) e isolamento dos princìpios ativos; micropartìculas e compostos assim obtidos, com atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti- espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, suas formulações, produtos e usos - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENçãO DE MICROPARTìCULAS MATRICIAIS DE COPAìFERA LANGSDORFFII (PARTES AéREAS) E ISOLAMENTO DOS PRINCìPIOS ATIVOS; MICROPARTìCULAS E COMPOSTOS ASSIM OBTIDOS, COM ATIVIDADE ANTILITIáSICA (CáLCULO RENAL), ANALGéSICA, ANTI-ESPASMóDICA, ANTI-INFLAMATóRIA, DIURéTICA E ANTI-SéPTICA, SUAS FORMULAçõES, PRODUTOS E USOS. Refere-se o presente invento a um processo de obtenção de micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii (partes aéreas) e do isolamento dos compostos ativos e/ou marcadores das partes aéreas da referida planta, bem como as atividades biológicas encontradas para tais microparticulas matriciais e dos compostos isolados, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, bem como a utilização destes nos tratamentos de litiase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.). Refere-se também as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, além das formulações que podem ser originadas com as microparticulas matriciais de Copaifera Iangsdorffii; e/ou seus compostos isolados, como medicamentos, produtos de higiene pessoal, cosméticos, alimentos, produtos veterinários e odontológicos, etc.

Description

Processo de obtenção de micropartículas matriciais de copaífera Iangsdorffii (partes aéreas) e isolamento dos princípios ativos; micropartículas e compostos assim obtidos, com atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti- espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, suas formulações, produtos e usos.

Refere-se o presente invento a um processo de obtenção de micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii (partes aéreas) e do isolamento dos compostos ativos e/ou marcadores das partes aéreas da referida planta, bem como as atividades biológicas encontradas para tais micropartículas matriciais e dos compostos isolados, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, bem como a utilização destes nos tratamentos de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.). Refere-se também as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, além das formulações que podem ser originadas com as micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii; e/ou seus compostos isolados, como medicamentos, produtos de higiene pessoal, cosméticos, alimentos, produtos veterinários e odontológicos, etc.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Atualmente, o mercado mundial de fitoterápicos representa uma parcela significativa no setor de medicamentos, movimentando globalmente 21,7 bilhões de dólares por ano. A principal movimentação do mercado mundial de fitoterápicos se concentra na Europa, sendo 50% na Alemanha. Em seguida, aparecem Ásia e Japão. Entretanto, nenhum outro mercado cresce tanto quanto o mercado norte- americano (CALIXTO, 2000). No Brasil, não existem dados oficiais atualizados, porém estima-se que esse mercado gira em torno de 160 milhões de dólares por ano (CARVALHO et al., 2008).

A maior biodiversidade vegetal do mundo, estimada em cerca de 200.000 espécies vegetais está localizada no Brasil e, segundo alguns autores, pelo menos a metade pode ter alguma propriedade terapêutica útil à população. Porém, os dados revelam que apenas 15 a 17% das espécies foram estudadas quanto a seu potencial medicinal, justificando a busca de maior desenvolvimento nesta área (GUERRA & NODARI, 2001). Esse imenso patrimônio genético tem atualmente valor econômico inestimável, com grande potencial para o desenvolvimento de novos medicamentos.

No caso da litíase renal, são descritas mais de 70 espécies com propriedades antilitiásicas. Destaca-se a espécie vegetal Phyllanthus niruri, denominada popularmente por quebra-pedra, para tratamento de urolitíase (UNANDER et a/, 1991; CALIXTO et al, 1998, BOIM e SCHOR, 2003).

O Phyllanthus niruri é uma planta usada na medicina popular para o tratamento de urolitiase. Previamente foi demonstrado que o P. niruri não apresenta toxicidade, aumentou a eliminação de cálculos em pacientes litiásicos, reduziu o crescimento de cálculos vesicais em modelo experimental em ratos e inibiu a adesão e internalização de cristais de oxalato de cálcio (CaOx) em células MOCK. Para adicionar evidências do papel protetor do P. niruri, foi avaliado o efeito do seu extrato aquoso na cristalização do CaOx in vitro (0,25 mg/mL de urina). A presença do P. niruri não inibiu a precipitação do CaOx sendo que até um número maior de cristais foi observado, porém de menor tamanho. Além disso, na presença de P. niruri houve predominância de cristais na forma diidratada, que é menos aderente. Quando os cristais foram observados 24 horas após a cristalização, verificou-se grande agregação na ausência do P. niruri, sendo que na sua presença a agregação foi inibida. Os resultados obtidos demonstram que o P. niruri interfere no crescimento e agregação dos cristais em urina humana sugerindo um potencial papel desta planta de prevenção do desenvolvimento do cálculo urinário (BARROS, 2002).

Além da planta quebra-pedra (Phyllanthus niruri), acima apresentada, é comum a utilização de Uva-ursi (Arctostaphylos uva-ursi), medicamento fitoterápico tradicional reconhecido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) com a atividade biológica aprovada como anti-séptico urinário. Assim, a mesma é indicada para pacientes que apresentam cistite e muitas vezes também para os que apresentam litíase renal, porém, sendo apenas um composto para alívio e assepsia do trato urinário, não apresentando efeito antilitiásico.

A grande variedade de espécies popularmente indicadas para tratamento de litíase pode ser atribuída à alta prevalência da doença. É bastante curioso observar que, apesar da grande quantidade de espécies (incluindo produtos comercializados com estes fins), existem poucos estudos científicos sérios que pretendam estabelecer o quão verdadeiras são estas propriedades. Exemplo disso é inexistência no Brasil de patentes relativas a princípios ativos e/ou medicamentos capazes de exercerem efetivamente tal ação.

Atualmente, no banco de pedidos de patentes do INPI constam somente quatro processos referentes a cálculos renais, sendo:

- um (i), de origem americana, aborda a utilização de compostos obtidos de "terra-rara", basicamente a base de lantânio, com propriedades de quelarem o oxalato no trato gastrointestinal, e por essa razão serem preventivos da formação de cálculos renais por impedirem a absorção de oxalato (PI 0209072-4 - Aplicação de compostos de terra-rara para a prevenção de cálculo renal)]

- outro (ii), de origem chinesa, aborda a utilização de solução de ácido clorídrico (HCI) para tratamento de hipertensão e cálculos em geral (PI0608022-7 A2 - Processo para fabricação de um medicamento para fabricação de um medicamento para tratar hipertensão, formulação anti-hipertensão e processo para fabricação de um medicamento para tratar cálculo)]

- um terceiro (iii), de origem brasileira, intitulado "Processo de obtenção e utilização de extratos, frações e substâncias isoladas de espécies de Copaifera no tratamento de Iitiase urinária em seres humanos e animais" (PI0401631-9 A2), depositado em 22/04/2004;

- e por fim, (iv) uma concessão a um pedido de origem japonesa, intitulado "Derivados do ácido-amino-etil-fenoxi-acético e fármacos para a remissão da dor e promover a remoção de cálculos na Iitiase urinária" (PI9811483-2 B1), com depósito efetuado em 15/07/1998 e a concessão em janeiro de 2010.

Percebe-se que não há nenhum pedido relativo a um produto tecnológico, dotado de atividade inventiva relativo à utilização de derivados de origem vegetal, como vantajosamente é o nosso caso, já que o pedido referente a espécies de Copaifera, conforme PI0401631-9 A2, descrito acima, não é susceptível de concessão, uma vez que se trata de uma descoberta, como bem estabelecido na Lei de Propriedade Industrial. Já que como de conhecimento, chás, drogas vegetais, extratos não são dotados de atividade inventiva, mas sim, estão sujeitos a descobertas científicas, e estas sim, podem ser utilizadas como matéria para o desenvolvimento tecnológico e geração de inventos que, se bem caracterizados e cuidadosamente avaliados, podem gerar benefícios à sociedade. Além disso, os pedidos relativos ao descrito no item (i) e (ii), acima detalhados, são pedidos voltados para ação quelante de oxalato e, portanto, somente de caráter preventivo, completamente diferente do objetivo da presente invenção, que vantajosamente é um produto tecnológico, com as atividades antilitiásica, anti-inflamatória, analgésica, antiespasmódica, anti-séptica e diurética, tendo caráter medicamentoso e curativo.

O último pedido (iv) acima exposto trata-se de molécula inovadora obtida por síntese química e seus medicamentos, que não se compara ao invento objeto da presente petição. Já o atual pedido envolve a transformação de uma descoberta em um produto tecnológico inovador e revolucionário para a indústria farmacêutica, ou seja, transforma o que a presente equipe descobriu com a planta Copaifera em um insumo farmacêutico inédito, podendo ser utilizado em formulações farmacêuticas, cosméticas e veterinárias. Devido ao tratamento da nefrolitíase ser caro e em muitos casos invasivo e com muitos efeitos colaterais, considera-se importante a busca de alternativas a esses métodos convencionais usando a fitoterapia. De fato, em muitos países são usadas ervas medicinais que parecem curar pacientes com urolitíase. Porém, a efetividade e o mecanismo pelo qual essas plantas funcionam não foram demonstrados por métodos científicos e objetivos. Assim, é recomendável que sejam pesquisados novos fármacos, a partir de plantas medicinais para o tratamento e prevenção da formação de cálculos renais (ATMANI, 2003; MACIEL et al, 2002) e que tais descobertas científicas sejam transformadas em desenvolvimento tecnológico, como o presente invento, a fim de que tais produtos inovadores sejam aplicados efetivamente no tratamento de doenças e gerem benefícios para a comunidade e o país.

Dentre as plantas de uso medicinal e tradicional está a Copaifera sp, planta nativa brasileira muito utilizada popularmente desde os indígenas do século XVI. A literatura fornece diversos estudos de atividades biológicas do óleo-resina de diversos gêneros de Copaifera sp (CARVALHO, 2004; VEIGA JÚNIOR, 2005; PAIVA et al., 1998; 2003; 2004; BASILE et al., 1988; COSTA-LOTUFO et al., 2002), como sua ação cicatrizante, anti-séptica e anti-inflamatória das vias respiratórias (CARVALHO, 2004). Entretanto, estudos sobre as folhas de Copaifera sp são escassos na literatura exceto pelo estudo de seus constituintes em interações ecológicas (LANGENHEIM et al., 1981; 1986a e 1986b).

- Copaifera langsdorffii

A espécie Copaifera langsdorffi pertence à família botânica Leguminasae, sub-família Caesalpinioideae podendo ser arbustos ou árvores frondosas de 15 a 25 m. Esta espécie apresenta-se nas regiões norte, nordeste, sudeste, centro- oeste e parte da região sul do Brasil, assim como na Venezuela, sul da Bolívia, nordeste da Argentina, e norte do Paraguai. Outras espécies do gênero Copaifera se distribuem pela América do Sul e Central, com citações de ocorrência na porção ocidental da África (CARVALHO, 2004; VEIGA JÚNIOR, 2005; VEIGA JÚNIOR e PINTO, 2002).

Somente no Brasil, ocorrem mais de vinte espécies do gênero Copaifera utilizadas com as mesmas ações terapêuticas. Algumas espécies têm denominação popular própria tanto em português como, eventualmente, em outras línguas. Em particular, a C. Iangsdorffi é denominada de copaíba vermelha, óleo vermelho ou copaíba da várzea no Amazonas, copaibeira de Minas, cupiúva ou podoi no Piauí e no Ceará e de oleiro ou cabimo na Venezuela (CARVALHO, 2004). De maneira geral, o gênero Copaifera tem infinitas denominações que podem ser encontradas na literatura (CARVALHO, 2004; VEIGA JÚNIOR, 2005; VEIGA JÚNIOR e PINTO, 2002). Na literatura consta que o óleo-resina da espécie de C. Iangsdorffi apresenta como constituintes químicos principais diterpenos tetracíclicos da série kaurano como os ácidos kaurenóico e kauranóico (FERRARI et al, 1971), clerodanos como o ácido hardwíckiico (OHSAKI et al., 1994) e diterpenos labdânicos como o ácido copálico (CASCON e GILBERT, 2000; MACIEL et al., 2002) entre outros, bem como sesquiterpenos, predominando β-cariofileno, β-bisaboleno, a-bergamoteno e β-selineno (CARVALHO, 2004; VEIGA JÚNIOR, 2005; VEIGA JÚNIOR e PINTO, 2002).

Já na composição química das folhas de Copaifera Iangsdorffi apresentam-se 3% do aminoácido, N-metil-frans-4-hidroxi-L prolina e sesquiterpenos como o σ-cubebeno, σ-copaeno, cipereno, β-copaeno, cariofileno, β- humuleno, muuroleno, β-selineno, δ-cadinêno e y-cadineno (LANGENHEIM et ai, 1986a; MACEDO e LANGENHEIM, 1989a; MACEDO e LANGENHEIM, 1989b).

Entre as atividades farmacológicas mais estudadas para Copaifera sp (óleo-resina) estão: anti-inflamatória, analgésica, antibacteriana, antitumoral, antioxidante, cicatrizante e gastroprotetora, anti-helmíntica, leishmanicida, tripanomicida, e relaxante muscular (CARVALHO, 2004; VEIGA JÚNIOR, 2005; VEIGA JÚNIOR e PINTO, 2002).

A literatura científica não contempla nenhum dado referente ao estudo das folhas de Copaifera langsdorffii, residindo aqui a principal descoberta utilizada como matéria para o presente invento. Assim, partindo disso, a presente proposta envolveu o estudo de processos de obtenção de micropartículas matriciais contendo extratos das folhas de Copaifera langsdorffii, processos fitoquímicos para o isolamento e identificação de seus compostos químicos, o estudo de sua eficácia e segurança, visando a obtenção de insumos farmacêuticos, medicamentos, produtos para uso médico, veterinário, odontológico, dentre outros.

Estudos realizados pelo nosso grupo demonstraram que o extrato padronizado de C. langsdorffii e/ou suas substâncias isoladas, obtidos das partes aéreas de Copaifera, pelos processos aqui descritos, possuem propriedades antilitiásicas, anti-inflamatórias, analgésicas, antiespasmódicas, anti-sépticas e diurética, descoberta inédita que fundamenta o desenvolvimento tecnológico realizado. Justificando os estudos que originaram a presente invenção, ou seja, o processo de obtenção de micropartículas matriciais que contém extratos de Copaifera langsdorffii, sistema tecnológico muito vantajoso em relação à utilização de extratos liofilizados, que proporciona maior proteção e estabilidade aos compostos identificados no extrato, homogeneidade do sistema, liberação modificada, tamanho reduzido de partícula e morfologia que proporcionam melhor desenvolvimento farmacotécnico, dotadas de excelente atividade biológica para os fins pretendidos no presente pedido. Destaca-se que os extratos Iiofilizados podem sofrer processos de degradação, decomposição dos compostos de interesse, além de oferecerem partículas maiores, com grande variação granulométrica, disformes e difíceis de se manusear farmacotecnicamente. Ainda, destaca-se que a composição química das partes aéreas de Copaifera sp é completamente diferente daquela observada para o óleo de copaíba, o qual é obtido do caule da planta. A composição química das partes aéreas constitui-se, principalmente, de compostos fenólicos majoritariamente solúveis em água. Já o óleo de copaíba é constituído majoritariamente de compostos pertencentes à classe dos terpenos e majoritariamente solúveis em óleo. Portanto, esta invenção não deve ser comparada com o que já foi descrito para o óleo de copaíba, apesar do mesmo não ser indicado para o tratamento da litíase.

Assim, foram realizados diversos estudos como demonstrado nos exemplos apresentados adiante para demonstrar as alegações do presente pedido, como: (a) descrição do processo de obtenção dos extratos padronizados que serão processados e transformados em micropartículas; (b) processo de obtenção das micropartículas matriciais das partes aéreas de Copaifera langsdorffii] (c) das micropartículas propriamente ditas; (d) processo de isolamento de compostos, caracterização e identificação de tais substâncias; (e) segurança e eficácia pré-clínica e clínica (preliminar). Ainda, realizou-se um estudo de atividade antilitiásica comparando a atividade das micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii (conforme EXEMPLO 6) pelo mesmo grupo que avaliou a atividade biológica do chá Phyllanthus niruri, mostrando que os resultados obtidos com o produto tecnológico Micropartículas Matriciais de C. langsdorffii, foram muito superiores aos anteriores, demonstrando a relevância do presente pedido de proteção industrial.

Descrição da Invenção

Refere-se o presente invento a um processo de obtenção de micropartículas matriciais de Copaifera langsdorffii; micropartículas propriamente ditas e do isolamento dos compostos majoritários das folhas de Copaífera, bem como as atividades biológicas das micropartículas matriciais obtidas e os compostos isolados da Copaifera, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti- espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, bem como os seus usos, especialmente na utilização destes nos tratamentos de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.), inflamações e infecções do trato urinário ou outras, bem como as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, além da presente invenção contemplar as micropartículas propriamente ditas, seus compostos isolados e as formulações que podem ser originadas com as mesmas e/ou seus compostos isolados, como: medicamentos, produtos de higiene pessoal, cosméticos, alimentos, produtos veterinários e odontológicos, etc.

Descrição das Figuras

Para melhor entendimento da presente invenção, os exemplos apresentados a seguir a caracterizam detalhadamente, bem como as figuras que podem esclarecer os objetivos, aplicações e reivindicações do presente pedido. Assim, seguem as legendas das figuras:

Figura 1: Fotografias que demonstram as micropartículas matriciais obtidas no processo descrito na presente invenção, em comparação com as fotografias do Iiofilizado do extrato das partes aéreas de Copaifera, mostrando as diferenças e vantagens da obtenção das micropartículas.

Figura 2: Procedimento esquemático para obtenção das Micropartículas Matriciais de Copaifera Iangsdorffii;

Figura 3: Procedimento de fracionamento do Extrato Padronizado de Copaifera para isolamento de compostos;

Figura 4: Perfis cromatográficos apresentando a separação dos compostos: (i) quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e (ii) canferol-3-O-ramnosídeo (segundo majoritário) com metodologia descrita no exemplo referente ao isolamento;

Figura 5: Espectro de massas da quercetrina-3-O-ramnosídeo com EM - EM 447 - caracterizando a identificação do composto;

Figura 6: Espectro de massas do composto canferol-3-O-ramnosídeo - caracterizando a identificação do composto;

Figura 7: Estruturas químicas dos flavonóis quercetrina e kaempferol 3-O-a-L- ramnopiranosídeo isoladas do extrato padronizado das partes aéreas de C. langsdorffii;

Figura 8: Perfil cromatográfico do extrato padronizado de C. langsdorffii (álcool:água - 7:3), em 257 nm. 1 - quercetrina-3-O-ramnosideo e 2 - canferol-3-O-ramnosideo; Figura 9: Perfis cromatográficos das amostras em 257 nm. A - Campus FCFRP- USP; B - Campus FFCLRP-USP; C - Região de Marília - SP. 2 - quercetrina-3- O-ramnosídeo, 3 - canferol-3-O-ramnosídeo e padrão interno (pi): benzofenona; Figura 10: Perfis cromatográficos dos extratos padronizados obtidos, (A) por extração com solução hidroalcoólica 7:3; (B) por extração com solução hidroalcoólica 4:6 por extração aquosa; (C) por extração com água temperatura ambiente e (D) por extração 35 com água fervente. Figura 11: Cálculos renais e satélites retirados dos animais com litíase renal de cada grupo estudado.

EXEMPLOS:

EXEMPLO 1 - Obtenção das Micropartículas de Copaifera langsdorffii;

Etapa 01 - Obtenção dos Extratos: O material vegetal para a obtenção dos extratos foi coletado e adequadamente identificado, cujas exsicatas estão depositadas no herbário do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Peto / Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP), sob o código SPFR 10120. Após a coleta do material vegetal (ramos e principalmente folhas), este foi seco e estabilizado em estufa de ar quente e circulante a 40 0C e, em seguida, foi submetido à moagem em moinho de facas, previamente esterilizado. O pó obtido, após moagem do material vegetal, foi submetido à maceração em solução hidroalcoólica na proporção de 6:4 ou 7:3 seguida de percolação por três vezes, a cada 72 horas. O extrato pode ser ainda obtido por infusão da droga vegetal moída com água fervente. Os extratos são, vantajosamente, PURIFICADOS por processo que consiste na passagem seqüencial em sistema de separação por leito fixo composto de fase estacionária em tripla camada constituída de terra diatomácea, silicato de magnésio ativado e carvão ativo, a fim de se retirar compostos pigmentados e cerosos que dificultam a atividade bioativa desejada para a presente invenção. A droga vegetal, por extração exaustiva em aparelho de Soxhlet, apresenta rendimento de 20 a 40 % de sólidos solúveis, a título de informação. Obtenção das Micropartículas Matriciais: Os extratos obtidos, conforme descrição apresentada acima, purificados, devem ser adicionados de adjuvante de secagem, formador de filme ou película com propriedades farmacotécnicas adequadas à posterior formulação do medicamento, como dióxido de silício coloidal, açúcares e amidos modificados, polímeros celulósicos, acrilatos, biopolímeros bioadesivos ou não, gomas naturais e ceras, bem como goma arábica, goma xantana, quitosana, e outros, incluindo suas misturas ou combinações em quaisquer proporções, nas quantidades relativas, droga/adjuvante, variando de um para dez até dez para um. Segue-se por processo de secagem por nebulização, envolvendo as seguintes condições: temperatura 10-450°C, fluxo de ar 0,01 a 1000 metros cúbicos por minuto e vazão de amostras de 0,1 a 1000 litros por hora. O pó obtido caracterizado por micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii apresenta as seguintes características: tamanho de partícula entre 1 e 200 micrometros, morfologia esférica maciça, e a presença dos marcadores e/ou princípios ativos quercetrina e canferol 3-O-raminosídeo nas concentrações de 2 a 10% e 0,5 a 10%, respectivamente. As micropartículas obtidas podem ser diluídas, com solventes variados, como soluções hidroalcoólicas, água adicionada de conservantes ou sistemas tamponantes, polióis (sorbitol, propilenoglicol, etc.), bem como com excipientes ou veículos de formulações específicas para aplicações diversas, como obtenção de comprimidos, cápsulas, etc.

EXEMPLO 2 - Metodologia para Caracterização do Extrato Padronizado de Cooaifera Iangsdorffii (utilizado na obtenção das micropartículas)

Coletou-se 1 mL do extrato padronizado (contendo 50 μg de benzofenona (Pi)/ml) para filtração através de filtro analítico MiIIex-LCR-PTFE (0,45 μηη χ 13 mm), o qual foi transferido para frasco apropriado para injetor automático (1 mL).

Prosseguindo, uma alíquota de 10 pL de cada amostra foi analisada por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, foi utilizado um cromatógrafo de fase líquida de alta eficiência da marca Shimadzu, equipado com controlador SCL-10Avp, equipado com três bombas LC-10AD, detector de arranjo de diodos modelo SPD - MIOAvp, injetor automático (SIL-10ADvp) e sistema controlador computadorizado com software Shimadzu CIass-VP versão 5.02. Também foram utilizadas duas colunas monolíticas (Onyx™ 100 X 4,6 mm - C18 Phenomenex) interligadas em série protegidas por pré- coluna do mesmo material. Como fase móvel foi utilizada água na fase A e acetonitrila (MeCN) na fase C, sob vazão de 1 mL / min. e um gradiente multilinear desenvolvido da seguinte forma: iniciando-se de 5 - 6 % de fase C em 1 min., 6 - 8 % de C (1 - 2 min.), 8 - 10 % de C (2 - 5 min.), 10 - 15 % de C (5 - 12 min.), mantendo-se 15 % de fase C até 22 minutos, elevando-se de 15-25 % de C (22 - 27 min.), permanecendo 25 % de fase C até 35 minutos, aumentando-se de 25 - 40 % de C (35 - 39 min.), mantendo-se 40 % de fase C até 42 minutos, elevando-se de 40-100 % de C (42 - 47 min.), permanecendo 100 % de fase C por 1 minuto, além de outros 13 min. para retorno às condições iniciais e re-equilíbrio da coluna. Todos os perfis cromatográficos por CLAE foram obtidos na absorção de 257 nm. O método foi validado de acordo com as normas vigentes.

EXEMPLO 3 - Processo de Isolamento dos Compostos da

Copaifera Iangsdorffii

3.1. Fracionamento do extrato bruto por meio de partição líquido-líquido

O extrato padronizado das folhas de Copaifera Iangsdorffii foi submetido à partição com solventes orgânicos com a finalidade de isolarem-se seus constituintes. Para tanto, 100 g deste extrato foram solubilizados em 1000 mL de metanol-água (9:1 v/v) e, em seguida, este foi transferido para funil de separação e particionado 3 vezes com 400 mL de hexano. Nesta fração resultante, denominada hexânica, foi adicionado sulfato de sódio anidro para eliminação de água e, depois, esta foi filtrada para balão de fundo redondo, no qual foi concentrada sob pressão reduzida a 40 °C com auxílio de rotaevaporador. Depois de concentrada, a fração hexânica foi transferida para frasco previamente pesado e a diferença gravimétrica foi calculada.

A solução hidrometanólica restante foi rotaevaporada com o objetivo de eliminar o metanol. Em seguida, à solução aquosa remanescente foram adicionados 600 mL de água destilada e realizou-se o mesmo procedimento de partição descrito para a fração hexânica, porém utilizando-se os solventes diclorometano e acetato de etila em seqüência. O processo de fracionamento do extrato está resumido na Figura 3.

3.2. Por meio de cromatografia em coluna preenchida com sílica gel comum

Depois de realizado trabalho piloto, no qual a fração em acetato de etila foi fracionada por CLV, foi observado que esta poderia ser fracionada usando-se sílica de fase normal, porém aumentando-se a caminho da fase estacionária para melhorar a seletividade. Para isso, cerca de 8 g desta fração foram solubilizadas em 50 mL de acetato de etila e, na seqüência, esta amostra foi aplicada no topo da sílica de fase normal, a qual foi empacotada na proporção de 1 g:100 g em coluna de vidro de 6,5 cm de diâmetro interno por 100 cm de altura. Neste procedimento a fase estacionária compactada mediu 75 cm de altura. Por meio deste, foram coletadas 40 frações com volume de 1 L cada, sendo as seis primeiras com o uso de 100 % acetato de etila e, logo em seguida, obedecendo-se o seguinte gradiente: AcOEt:MeOH 9:1 (frações 7 a 9); 8:2 (10 a 15); 7:3 (16 a 22); 5:5 (23 a 29). A fração 30 foi eluida com 100 % de metanol, o qual foi mantido até a obtenção da fração 40, finalizando o procedimento. 3.3 Por meio de cromatografia em coluna preenchida com Sephadex® LH 20

Objetivando-se o isolamento dos constituintes químicos de interesse com melhor grau de pureza, para servirem como padrões cromatográficos na validação do método e para realização de ensaios biológicos, optou-se por realizar um novo fracionamento modificando procedimento cromatográfico, neste caso com o uso de Sephadex® LH 20 como fase estacionária. Para tanto, uma alíquota de 5 g da fração em acetato de etila foi solubilizada em 50 mL de metanol P. A. com auxílio de aparelho sonicador. Logo na seqüência, esta amostra foi filtrada através de filtro analítico (0,45 μm). Uma alíquota de 1,0 mL do sobrenadante foi colocada sobre a superfície de um vidro de relógio previamente pesado. Esta, por sua vez, foi submetida à secagem por 1 hora em estufa de ar circulante a 50 0C. Depois deste procedimento, fazendo-se a diferença gravimétrica, foi calculado o teor de sólidos solúveis relativo, o qual foi de 91 mg/mL. Aproximadamente 43 mL deste sobrenadante foram usados para realização do procedimento cromatográfico. Portanto, cerca de 4 g da amostra foram aplicadas no topo da Sephadex® LH 20, a qual se encontrava empacotada, na proporção de 1 g:100 g, em coluna de vidro medindo 3,5 cm de diâmetro interno por 120 cm de altura.

As separações cromatográficas de compostos, tendo como fase estacionária Sephadex® LH 20, são influenciadas pelo mecanismo de exclusão molecular. Por isso, as fases móveis utilizadas nesta técnica, normalmente são isocráticas. Assim, neste fracionamento foram coletadas 159 frações, sendo 155 com volume de 25 mL e 4 com volume de 500 mL usando metanol como fase móvel.

Todas as sub-frações obtidas por meio desta metodologia foram analisadas por CCDC usando-se como fase móvel mistura de butanol, ácido acético e água na proporção de 5:1:4 v/v/v. Estas sub-frações foram reunidas com base no perfil de similaridade, o qual foi observado depois da revelação das placas cromatográficas. Luz UV nos comprimento de 254 e 366 nm e ácido sulfúrico 5 % em metanol foram usados como reveladores. Estas reuniões resultaram em 16 frações, as quais foram monitoradas posteriormente por CLAE.

3.4 Purificação das amostras obtidas por cromatografia em coluna

Por meio de CCDC foi possível selecionar as frações promissoras obtidas a partir das metodologias descritas acima. Assim estas frações foram purificadas por CLAE no modo preparativo, visando à obtenção dos compostos de interesse em quantidades adequadas ao desenvolvimento do método analítico. Para tanto, foi utilizado cromatógrafo marca Shimadzu composto por duas bombas Shimadzu LC-6A, detector espectrofotométrico UV/VIS Shimadzu SPD-6AV, sistema controlador SCL-IOAvp, conectado a um computador com software Shimadzu CIass-VP versão 5.02 e injetor automático SIL-10ADvp. Utilizou-se coluna cromatográfica semipreparativa de fase reversa CLC-ODS (M)- Shimadzu, 10 mm x 250 mm, diâmetro das partículas 5μm e pré-coluna de fase reversa C18 fabricada pela mesma companhia. Como fase móvel foi utilizada água na fase A e metanol na fase B, sob vazão de 6 mL/min. e um gradiente iniciando-se de 20 - 60 % de fase B (0-15 min.), mantendo-se 60 % de fase B até 25 minutos, elevando-se de 60-100 % de B (25-35 min.), permanecendo 100 % de fase B até 37 minutos, além de outros 8 min. para retorno às condições iniciais e re-equilíbrio da coluna.

EXEMPLO 4 - Compostos Isolados da Copaifera Iangsdorffii

O estudo da fitoquímica do Extrato Padronizado de Copaifera Iangsdorffi (obtido das partes aéreas) demonstrou que seus constituintes majoritários, aproximadamente 60%, são polares diferindo da composição química da óleo-resina. As estruturas químicas dos metabólitos isolados e purificados foram elucidadas utilizando-se métodos espectroscópicos como espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e de 13C1 IV, UV e espectrometria de massas, além de técnicas espectrométricas bidimensionais, tais como HMBC, HMQC e NOESY. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C foram registrados em espectrômetros Brucker-Advance DRX400, operando em 400 MHz (RMN de 1H) e 100 MHz (RMN de 13C), empregando-se solventes deuterados da marca Aldrich. Além disso, outros métodos podem ser utilizados para auxiliar na identificação, como a determinação do ponto de fusão e a aferição do [a]D. Nas figuras 4, 5, 6 e 7, apresenta-se a caracterização das estruturas (i) quercetrina-3-O-ramnosídeo e (ii) canferol-3-Ο- ramnosídeo.

Tabela 01: Dados de RMN 1H e 13C obtidos para a quercetrina.

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* Os sinais podem estar trocados. * Markham et ai, 1978.8Kosuge et al, 1985.

Tabela 02: Dados de RMN HeC obtidos para o canferol 3-O-α-L-ramnopiranosídeo.

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Nugroho et al„ 2009. 1H e C13= DMSO-d6

EXEMPLO 5 - Padronização do Extrato de Copaifera langsdorffii- que será utilizado para obtenção das micropartículas matriciais

A padronização dos extratos que serão passados pelo processo específico para obtenção das micropartículas matriciais envolve a identificação e a quantificação de pelo menos os compostos: (i) quercetrina-3-O-ramnosídeo e (ii) canferol-3-O-ramnosídeo (figura 7), sendo que os mesmos devem estar compreendidos nas faixas de 0,25 % a 2,0 % correspondentes à droga vegetal ou de 120 a 460 μg/mL nos extratos. Os efeitos farmacológicos objetos da presente invenção consistem de: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, bem como a utilização destes nos tratamentos de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.) e, ainda, as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas. As formulações que podem ser originadas com as micropartículas matriciais de Copaifera langsdorffii e/ou seus compostos isolados, como medicamentos, produtos de higiene pessoal e cosméticos, alimentos, produtos veterinários e odontológicos, etc. deverão considerar a concentração dos compostos isolados na dosagem diária a ser definida para cada produto. Assim, as micropartículas matriciais de Copaifera deverão ser inseridas nas respectivas formulações levando-se em consideração a sua padronização e as concentrações finais desejadas para que os objetivos finais sejam atendidos, sendo que as dosagens efetivas do produto final estão na faixa de 5 a 20g do material vegetal e seus correspondentes em extratos padronizados e marcadores conforme detalhado adiante, para as atividades antilitiásica, anti-séptica; anti-inflamatória; antiespasmódica; analgésica, etc.

EXEMPLO 6 - Atividade Antilitiásica e segurança em modelo pré-clínico

Considerando-se a necessidade de um fármaco para o tratamento da nefrolitíase e o grande potencial de C. langsdorffii, as micropartículas matriciais de Copaifera langsdorffii foram avaliadas em um modelo de litíase experimental em ratos. Nesse modelo, a litíase foi induzida no animal por meio da introdução de uma pastilha de oxalato de cálcio em sua bexiga, a qual serve como nicho para o crescimento do cálculo vesical. O protocolo teve duração de 48 dias, sendo que nos últimos 18 dias os animais foram tratados com as microcápsulas matriciais de C. langsdorffii, na dose de 20 pg/g massa corpórea/dia (concentração referente à massa seca do material vegetal), diluídos em 1 mL de água, por gavagem. O grupo controle foi submetido ao mesmo protocolo, exceto a administração de extrato nos últimos 18 dias (BARROS et ai, 2006). Ao final do experimento, não foram observadas alterações bioquímicas importantes entre os grupos controle e tratado, ou seja, a administração das micropartículas matriciais de C. Iangsdorffii não alterou o volume urinário, a excreção urinária e a concentração sérica de sódio, potássio e creatinina. No entanto, no grupo dos animais tratados, houve redução na massa total (0,286±0,042 vs. 0,164±0,066) e no número total de cálculos formados (25,25±6,96 vs. 7,40±3,67*, P<0,05). Além disso, comparando-se quantitativamente a dureza dos cálculos, foi observado que a pressão necessária para desintegrar os cálculos dos animais do grupo controle é pelo menos duas vezes maior que a necessária para desintegrar os cálculos do grupo tratado (6,90±3,45 vs. 3,00±1,51). Sendo assim, verificou-se que o tratamento não apenas atua na redução do número e massa total de cálculos formados como também modifica a morfologia deles, reforçando a ação terapêutica das micropartículas matriciais de C. Iangsdorffii no tratamento de litíase renal.

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EXEMPLO 7 - Demonstração da segurança das Micropartículas Matriciais de Copaifera Iansdorffii em modelos de citotoxicidade e potencial mutagênico

As micropartículas matriciais de C. langsdorffii foram avaliadas quanto ao potencial mutagênico e ou antimutagênico por meio do teste de micronúcleo (teste para a avaliação de segurança pré-clínica) em sangue periférico de camundongo Swiss. Os resultados apresentaram ausência de citotoxicidade das micropartículas matriciais C. langsdorffi. Além disso, foi observado efeito antimutagênico quando os animais foram tratados simultaneamente com diferentes doses das micropartículas de C. langsdorffi (10, 20, 40 e 80 mg/kg - concentração correspondente à massa seca de material vegetal) e doxorrubicina (15 mg/kg).

Ainda as micropartículas matriciais de C. Iangsdorffii foram avaliadas quanto ao potencial mutagênico e ou antimutagênico em células V79 (fibroblastos de pulmão de hamster) também pelo teste de micronúcleo. Os resultados encontrados demonstraram que as micropartículas de C. langsdorffi não apresentaram atividade mutagênica nas concentrações de 30, 60 e 120 pg/mL (concentração correspondente à massa seca de material vegetal) e, apresentaram efeito quimiopreventivo quando combinadas com metil- metanosulfonato (400 μΜ).

EXEMPLO 8 -Demonstração da atividade antioxidante dos Extratos de Copaifera Iansdorffii "in vitro". Para avaliar a atividade antioxidante utilizou-se o método de Brand-Williams (1995) que utiliza o radical livre 2,2-difenil-1 -picrilhidrazil (DPPH). Os extratos de Copaifera langsdorffii, obtidos conforme exemplo 1, ou seja, extratos (1) aquoso, (2) solução hidroalcoólica 4:6 (etanol:água) e (3) solução hidroalcoólica 7:3 (etanol:água), foram diluídos em etanol até concentração de 50 pg/mL. Em tubos de ensaio, adicionaram-se: 1 mL de tampão acetato de sódio/ácido acético 0,1M, pH 5,5; 1 mL de solução de DPPH 125 M e 50 μί da amostra. Após 30 minutos de repouso, as amostras foram medidas em espectrofotômetro em 517 nm. A concentração de inibição de 50% (CI50) do radical DPPH foi utilizada para comparar a atividade antioxidante entre as amostras. Os resultados demonstraram que a IC50 encontrada para o extrato padronizado aquoso de Copaifera langsdorffii (1) foi de 0,8518 Mg/mL, enquanto para o extrato (2) foi IC50=0,5281 pg/mL e para o (3) foi IC50=O,4716 pg/mL. Quando a atividade antioxidante dos mesmos extratos foi quantificada através dos flavonóides totais dos extratos, obteve-se: (i) IC50=O1IOO Mg/mL para o extrato padronizado (aquoso); (ii) IC50=0,0955 pg/mL (solução hidroalcoólica 40%) e (iii) IC50=O11534 pg/mL para o extrato obtido com solução hidroalcoólica a 70%, demonstrando o poder antioxidante da Copaifera langsdorffii, através da metodologia proposta, matéria usada no presente invento.

EXEMPLO 9 - Demonstração da Segurança Pré-Clínica das Micropartículas Matriciais de Copaifera langsdorffii - pesquisa pré-clínica

Foram realizados ensaios toxicológicos para as fases aguda e sub-crônica das micropartículas matriciais de Copaifera, utilizando-se ratos Wistar e Coelhos. Os resultados obtidos para ambos os protocolos evidenciaram que o tratamento dos animais em doses três vezes superiores as doses recomendadas para humanos, não causou nenhuma alteração nos parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos nos animais estudados. Destaca-se que não foi possível obter a dose letal 50%, o que demonstra a segurança do índice terapêutico (relatório anexado ao protocolo CEP/FAMEMA sob n. 128/05).

EXEMPLO 10 - Demonstração da Segurança Clínica das Micropartículas Matriciais de Copaifera Iangsdorffii- pesquisa clínica fase I

Realizou-se estudo clínico Fase I para avaliação da segurança de uso das Micropartículas de Copaifera Iangsdorffii em 28 voluntários sadios. Para tanto, foram realizados exames laboratoriais de função renal (creatinina, uréia e urina I), hepática (TGO, TGP, gama-GT e tempo de protombina) e cardíaca (pressão e freqüência), antes e após a ingestão do produto. Os voluntários apresentaram idade média de 24,1 anos (DP = 2,6 anos), sendo 9 (32,1%) do gênero feminino e 19 (67,9%) do gênero masculino. Os resultados encontrados para os exames físicos dos voluntários demonstraram a ausência de alterações após a administração das micropartículas, sendo os resultados médios: 111,4 mmHg (DP = 12,4) χ 74,4 mmHg (DP=8,3) para a pressão arterial, 72,2 bat./min (DP=10,9) para a freqüência cardíaca, 18,0 (DP=0,4) para a FR, 36,2 (DP=0,4) para a temperatura corporal, 70,1 kg (DP=12,6) para o peso corporal e 170,0 cm (DP=10,2) para a altura. Os resultados dos exames laboratoriais para a verificação da ocorrência de alterações nas funções renal e hepática apresentaram resultados normais, tanto antes quanto após a ingestão das micropartículas de Copaifera, para todos os parâmetros. Os resultados encontrados nos exames de sangue e urina I mostraram-se normais antes e após a administração das Micropartículas de Copaifera, para todos os parâmetros. Os resultados obtidos com os voluntários sadios, após procedimentos médicos de rotina (anamenese, exame físico e exames laboratoriais complementares para as funções renal e hepática - sangue e urina) demonstraram que a ingestão das micropartículas de Copaifera, equivalente a ingestão diária de 10g do material vegetal (dividido em três tomadas) em tratamento de curta duração, foi desprovido de efeitos tóxicos para os voluntários que participaram do estudo.

EXEMPLO 11 - Demonstração da Eficácia Clínica das Micropartículas de Copaifera Ianpsdorffii- pesquisa clínica fase Il

Em estudo Clínico fase II, relativo à eficácia, dados preliminares demonstrou o grande potencial de uso terapêutico do produto, já que de oito pacientes acometidos por urolitíase, 3 (37,5%) demonstraram eliminação completa do cálculo, 3 (37,5) demonstraram diminuição do diâmetro e alteração de coloração do cálculo e em 2 (25%) pacientes, o tratamento não foi satisfatório. Considerando que o protocolo de estudo clínico abordou três tratamentos distintos, a saber: (i) 1 dose + 1 dose, onde os pacientes ingeriram dose equivalente a 10 g do material vegetal (dividido em três tomadas/dia) por três dias, sofreram reavaliação médica e receberam novamente o equivalente a 10g de material vegetal (dividido em três tomadas/dia) para ser administrado por três dias; (ii) 2 doses + 1 dose, sendo administradas as 10 g de material vegetal (dividido em 3 tomadas/dia) pelo período de seis dias e após uma avaliação médica a administração das 10g/dia (dividido em três tomadas/dia) por mais três dias, e finalmente, (iii) a administração de 10g (dividido em três tomadas/dia) por seis dias, seguido por uma avaliação médica, administração do produto por mais três dias, uma nova avaliação e por fim, o tratamento por mais três dias. Assim, os dados obtidos por somente oito pacientes, já podem inferir resultado satisfatório, já que 75% tiveram resultado satisfatório, sendo 37,5% com eliminação completa do cálculo, resultados dificílimos de obter nos tratamentos convencionais e que apontam para o sucesso do produto.

Descrição Resumida da Invenção

A invenção caracteriza-se pela obtenção e utilização de Micropartículas Matriciais de Copaifera langsdorffii, e das substâncias isoladas (partes aéreas) de Copaifera, principalmente Copaifera langsdorffii Desf., mas também de outras espécies tais como C. beyrichii Hayne.; C. bijuga Hayne.; C. bracteata Bth.; C. confertiflora Bth.; C. coriaceae M.; C. duckei Dwyer.; C. elliptica M.; C. glabra Vog.; C. guianensis Desf.; C. jacquini Desf.; C. jacquimana Desf.; C. jussieuii Hayne.; C. laxa Hayne.; C. luetzelburgii Harms.; etc.

Assim, o presente invento refere-se a um processo de obtenção de Micropartículas Matriciais de Copaifera langsdorffii e do isolamento de seus compostos, bem como as atividades biológicas das micropartículas e os compostos isolados da planta, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti- espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, bem como os seus usos, especialmente na utilização destes nos tratamentos de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.), inflamações e infecções do trato urinário ou outras, bem como as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, além da presente invenção contemplar as micropartículas matriciais propriamente ditas, seus compostos isolados e as formulações que podem ser originadas com as mesmas e/ou seus compostos isolados, como: medicamentos, produtos de higiene pessoal e cosméticos, alimentos, produtos veterinários e odontológicos, etc.

Vale ressaltar que, conforme já apresentado no estado da técnica (anterioridade), atualmente não há no mercado medicamento obtido de planta medicinal, dotado de atividade inventiva, ou seja, que utiliza as descobertas científicas na obtenção de produto tecnológico, que seja eficiente em desintegrar a estrutura do cálculo. Os procedimentos utilizados são os de hidratação do paciente, visando à eliminação do cálculo e tratamentos paliativos, além das plantas estudadas não terem culminado com a obtenção de medicamentos ou produtos eficientes para tratamento de litíase.

Cabe destacar também que, o processo de obtenção das microcápsulas matriciais de Copaifera langsdorffii proporcionam obtenção de sistema tecnológico vantajoso em relação aos Iiofilizados dos extratos convencionalmente obtidos, não só no que tange a atividade biológica do produto mas também com relação ao processo tecnológico industrial. As micropartículas oferecem, vantajosamente, partículas homogêneas, esféricas, maciças, mais estáveis quimícamente em relação a extratos liofilizados, sistemas microencapsulados capazes de oferecer liberação modificada, além de maior facilidade de se obter preparações farmacotécnicas, como comprimidos, cápsulas, soluções, etc. Os liofilizados, por sua vez, são sistemas heterogêneos, sujeitos a processos de oxidação e degradação dos compostos químicos bioativos previamente extraídos da droga vegetal, que não apresentam fluidez, escoabilidade e são difíceis de se manusear farmacotecnicamente. Além disso, os extratos usados como matéria para a obtenção das microcápsulas requerem etapa de purificação, que consiste na passagem do extrato em sistema seqüencial de separação por leito fixo composto de fase estacionária em tripla camada constituída de terra diatomácea, silicato de magnésio ativado e carvão ativo para retirada de materiais pigmentados e compostos cerosos que dificultam a obtenção do efeito biológico desejado. Assim, a presente invenção é relevante socialmente e economicamente, dotada de atividade inventiva e perfeitamente aplicável industrialmente, justificando o presente pedido de propriedade industrial.

Descrição detalhada da invenção

Partes aéreas, folhas e ramos, de espécies de Copaifera são submetidos à processo de secagem em estufa de ar quente e circulante a 40°C e, em seguida, são submetidos a moagem em moinho de facas até obtenção de pó fino. O pó assim obtido é, então, submetido a processos de extração por maceração a frio ou a quente em água ou solução hidroalcoólica 4:6 ou 7:3 (etanol:água). Os extratos são filtrados em lona de filtração para separação da torta vegetal. Após filtração, o extrato é purificado seqüencialmente em sistema de separação por leito fixo composto de fase estacionária em tripla camada constituída de terra diatomácea, silicato de magnésio ativado e carvão ativo. Especificamente, o processo da presente invenção compreende as etapas de:

a) secagem das partes aéreas, folhas e ramos de espécies de Copaifera em estufa de ar quente e circulante a 40°C;

b) moagem do material seco em moinho de facas até obtenção de pó fino;

c) extração por maceração a frio ou a quente, em água ou solução hidroalcoólica 4:6 ou 7:3 (etanohágua);

d) filtração dos extratos em lona de filtração para separação da torta vegetal;

e) etapa, fundamental, de purificação que consiste na passagem seqüencial em sistema de separação por leito fixo composto de fase estacionária em tripla camada constituída de terra diatomácea, silicato de magnésio ativado e carvão ativo.

g) os extratos padronizados obtidos através da (i) extração em água (quente ou fria), maceração seguida de percolação em soluções hidroalcoólicas nas proporções (ii) 4:6 ou (iii) 7:3 (etanol:água), são transformados em microcápsulas matriciais, pela adição de um adjuvante de secagem, formador de filme ou película com propriedades farmacotécnicas adequadas à posterior formulação do medicamento, como dióxido de silício coloidal, açúcares e amidos modificados, polímeros celulósicos, acrilatos, biopolímeros bioadesivos ou não, gomas naturais e ceras, como goma arábica, goma xantana, quitosana e outros, incluindo suas misturas ou combinações em quaisquer proporções, nas quantidades relativas, droga/adjuvante, variando de um para dez até dez para um. Segue-se por processo de secagem por nebulização, envolvendo as seguintes condições: temperatura 10-450°C, fluxo de ar.0,01 a 1000 metros cúbicos por minuto, vazão de amostras de 0,1 a 1000 litros por hora. As micropartículas caracterizam-se pelos perfis químicos apresentados na figura 10 e ainda, por apresentarem os compostos majoritários quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e (ii) canferol-3-Ο- ramnosídeo (segundo majoritário) nas respectivas faixas de concentrações: : (i) 30 - 100 mg/g e 10 - 60 mg/g; (ii) 20 - 200 mg/g e 10 -150 mg/g e (iii) 10-90 mg/g e 5 - 50 mg/g. g) Processo de obtenção dos compostos isolados majoritários da Copaifera, que envolve (Figura 3): fracionamento dos extratos padronizados obtidos das partes aéreas de espécies de Copaifera através de processos de filtração em colunas empacotadas com fases estacionárias a base de sílica gel ou obtenção das frações ricas nos princípios ativos por processos de partição líquido-líquido a partir do extrato hidroalcoólico dos ramos das espécies de Copaifera, utilizando-se hexano, diclorometano e acetato de etila, em seqüência; fracionamento do extrato em acetato de etila, utilizando-se coluna empacota com fases estacionárias à base de sílica gel; purificação da fração rica em componentes majoritários, obtida por meio do fracionamento do extrato em acetato de etila, empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)1 fornecendo os compostos majoritários quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e canferol-3-Ο- ramnosídeo (segundo majoritário) (figura 7) conforme cromatograma obtido em CLAE1 figura 4, bem como outros compostos fenólicos minoritários. Ressaltando que os extratos podem ser fracionados por processos de filtração em colunas empacotadas com fases estacionárias, tais como: sílica gel, silicato de magnésio ativado, sílica de fase reversa (C-8, C-18), Sephadex LH20, etc. As frações podem também ser obtidas a partir de processos de partição utilizando solventes orgânicos, conforme Figura 3. Os solventes orgânicos são eliminados em concentradores a vácuo e as fases aquosas são liofilizadas. h) As micropartículas matriciais de Copaifera podem ser utilizadas como tal ou veiculados em preparações adequadas (medicamentos, produtos de higiene pessoal e cosméticos, produtos de uso veterinário, odontológico ou outros), em tratamentos de três a 28 dias para cada paciente adulto, para os quais são utilizadas três doses diárias de micropartículas, correspondentes de 5 a 20 g do material vegetal seco cada, equivalentes a dose de 1,0 a 5,40 g de micropartículas de C. Iangsdorffii (aquoso), 1,0 a 6,0 g de micropartículas (obtido com álcool 40%) e 1,20 a 7,0 g de micropartículas (obtido com álcool 70%), com os respectivos marcadores guercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e canferol-3-O-ramnosídeo (segundo majoritário). Para tratamento de animais, deve-se empregar de 1,50 a 80 mg /kg de peso corpóreo/dia de micropartículas. i) Micropartículas Matriciais e/ou seus compostos isolados, propriamente ditos ou veiculados em solventes ou excipientes ou veículos de formulações de medicamentos, produtos de higiene pessoal e cosméticos, produtos veterinários, odontológicos ou outros para tratamento de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.), inflamações e infecções do trato urinário ou outras, bem como as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, em função das atividades biológicas do extrato e seus compostos isolados, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica.

j) Não há no mercado medicamentos, sejam eles fitoterápicos ou alopáticos, que sejam eficazes em desintegrar os cálculos renais. Assim, os produtos da presente invenção propiciarão o desenvolvimento de produto inédito, pois os atualmente existentes atuam como diuréticos, anti-inflamatórios, analgésicos e, no máximo, como profiláticos.

Claims (8)

1. Processo de obtenção de micropartículas matriciais de Copaifera Iangsdorffii (partes aéreas) e isolamento dos princípios ativos e/ou marcadores da Copaifera; micropartículas e compostos assim obtidos, com atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, suas formulações, produtos e usos, caracterizados pelo fato de compreenderem as seguintes etapas: a) secagem das partes aéreas, folhas e ramos de espécies de Copaifera em estufa de ar quente e circulante a 40°C; b) moagem do material seco em moinho de facas até obtenção de pó fino; c) extração por maceração a frio ou a quente, em água ou solução hidroalcoólica 4:6 ou 7:3 (etanohágua); d) filtração dos extratos em lona de filtração para separação da torta vegetal; e) purificação dos extratos, seqüencialmente, em sistema de separação por leito fixo composto de fase estacionária em tripla camada constituída de terra diatomácea, silicato de magnésio ativado e carvão ativo; f) Obtenção da Micropartículas Matriciais pela secagem dos extratos adicionados de, preferencialmente, mas não exclusivamente, de adjuvante de secagem, formador de filme ou película com propriedades farmacotécnicas adequadas à posterior formulação do medicamento, como dióxido de silício coloidal, açúcares e amidos modificados, polímeros celulósicos, acrilatos, biopolímeros bioadesivos ou não, gomas naturais e ceras, como goma arábica, goma xantana, quitosana, e outros, incluindo suas misturas ou combinações em quaisquer proporções, nas quantidades relativas, droga/adjuvante, variando de um para dez até dez para um. Segue-se por processo de secagem por nebulização, envolvendo as seguintes condições: temperatura 10-450°C, fluxo de ar 0,01 a 1000 metros cúbicos por minuto, vazão de amostras de 0,1 a 1000 litros por hora;

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das frações serem obtidas por processos de partição utilizando solventes orgânicos, que são eliminados em concentradores à vácuo e as fases aquosas são liofilizadas;

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da espécie de Copaifera ser, preferencialmente, a Copaifera Iangsdorffii Desf.;

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das espécies de Copaifera serem C. beyrichii Hayne.; C. bijuga Hayne.; C. bracteata Bth.; C. confertiflora Bth.; C. coriaceae M.; C. duckei Dwyer.; C. elliptica M.; C. glabra Vog.; C. guianensis Desf.; C. jacquini Desf.; C. jacquimana Desf.; C. jussieuii Hayne.; C. langsdorffii Desf.; C. Iaxa Hayne.; C. Iuetzelburgii Harms.; C. martii Hayne.; C. nitida Hayne.; C. oblongifolia M.; C. officinalis L.; C. publiflora Bth.; C. reticulata Ducke.; C. rígida Bth.; C. rondonii Hoehne.; C. sellowii Hayne ; C. trapezifolia Hayne, entre outras;

5. Micropartículas Matriciais obtidas através da reivindicação -1, sendo os extratos para obtenção das micropartículas obtidos em (i) extração em água (quente ou fria), maceração seguida de percolação em soluções hidroalcoólicas nas proporções (ii) 4:6 ou (iii) 7:3 (etanohágua), com posterior adição dos adjuvantes de secagem e microencapsulação, seguidos de secagem por nebulização, caracterizados pelos perfis químicos contendo os marcadores quercetrina-3-O-ramnosídeo e canferol-3- O-ramnosídeo

6. Micropartículas matriciais obtidos através da reivindicação -1, sendo sendo os extratos para obtenção das micropartículas obtidos (i) extração em água (quente ou fria), maceração seguida de percolação em soluções hidroalcoólicas nas proporções (ii) 4:6 ou (iii) 7:3 (etanol:água), com posterior adição dos adjuvantes de secagem e microencapsulação, seguidos de secagem por nebulização, caracterizados por apresentarem os compostos majoritários quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e (ii) canferol-3-O-ramnosídeo (segundo majoritário) nas respectivas faixas de concentrações: (i) 30- 100 mg/g e 10 - 60 mg/g; (ii) 20 - 200 mg/g e 10 -150 mg/g e (iii) -10-90 mg/g e 5 - 50 mg/g.

7. A utilização ou usos das micropartículas matriciais, objetos da reivindicação 1, 3, 4, 5 e 6, utilizadas como tal ou veiculadas em preparações adequadas (medicamentos, produtos de higiene pessoal e cosméticos, produtos de uso veterinário, odontológico ou outros), para aplicações no tratamento de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.), inflamações e infecções do trato urinário ou outras, bem como as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, em função das atividades biológicas das micropartículas e dos compostos isolados da C. langsdorffii, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti- inflamatória, diurética e anti-séptica;

8. Processo de Isolamento e obtenção dos compostos majoritários de quercetrina-3-O-ramnosídeo e canferol-3-O-ramnosídeo, caracterizado por contemplar as etapas: fracionamento dos extratos padronizados obtidos das partes aéreas de espécies de Copaifera através de processos de filtração em colunas empacotadas com fases estacionárias a base de sílica gel ou obtenção das frações ricas nos princípios ativos por processos de partição líquido-líquido a partir do extrato hidroalcoólico dos ramos das espécies de Çopaifera, utilizando-se hexano, diclorometano e acetato de etila, em seqüência; fracionamento do extrato em acetato de etila, utilizando- se coluna empacota com fases estacionárias a base de sílica gel; purificação da fração rica em componentes majoritários, obtida por meio do fracionamento do extrato em acetato de etila, empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), fornecendo os compostos majoritários quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e canferol-3-O-ramnosídeo (segundo majoritário) (figura 7) conforme cromatograma obtido em CLAE, figura 4, bem como outros compostos fenólicos minoritários. Ressaltando que os extratos podem ser fracionados por processos de filtração em colunas empacotadas com fases estacionárias, tais como: sílica gel, silicato de magnésio ativado, sílica de fase reversa (C-8, C-18), Sephadex LH20, etc. As frações obtidas, ricas nos princípios ativos, podem ser utilizadas em doses que correspondam aos teores equivalentes destes em 10 g do material vegetal seco. As frações podem também ser obtidas a partir de processos de partição utilizando solventes orgânicos, conforme Figura -3. Os solventes orgânicos são eliminados em concentradores a vácuo e as fases aquosas são liofilizadas; 8. Compostos (i) quercetrina-3-O-ramnosídeo (primeiro majoritário) e (ii) canferol-3-O-ramnosídeo (segundo majoritário), obtidos conforme reivindicação 7, para aplicações no tratamento de litíase renal (cálculo renal), artrites, tártaros, dores musculares e espasmódicas em geral (cólicas abdominais, renais, etc.), inflamações e infecções do trato urinário ou outras, bem como as demais doenças relacionadas às atividades previamente citadas, em função das atividades biológicas do extrato e seus compostos isolados, quais sejam: atividade antilitiásica (cálculo renal), analgésica, anti-espasmódica, anti-inflamatória, diurética e anti-séptica, diretamente ou em composições farmacêuticas diversas, como soluções, comprimidos, cápsulas, ou outras.