BRPI1008083B1 - Processo para a produção de uma linhagem de células amniócitos humanas permanentes, processo para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas recombinantes com o emprego da referida linhagem de células, e emprego da referida linhagem de células - Google Patents

Abstract

processo para a produção de uma linhagem de células amniócitos humanas permanentes, linhagem de células humanas aminióciticas, processo para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas recombinantes com o emprego de uma linhagem, emprego das células e polipeptídeo ou proteína. a presente invenção se refere a uma linhagem de células humanas permanente, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais e1a e e1b e a sequência de ácidos nucleicos para o antígeno t grande de sv40 ou o antígeno-1 nuclear do vírus de epstein-barr (ebv) (ebna-1). a presente invenção se refere ainda a um processo para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas recombinantes na linhagem de células humanas permanentes.

Description

A presente invenção se refere a uma linhagem de células humanas permanentes, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e a sequência de ácidos nucleicos para o antígeno T grande SV40 ou antígeno-1 nuclear do Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1). A presente invenção se refere ainda a um processo para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas recombinantes na linhagem de células humanas permanentes.

Além de bactérias, são empregadas leveduras e células vegetais, e especialmente células animais, para a produção de polipeptídeos ou proteínas recombinantes. Aproximadamente 60-70% de todas as proteínas terapêuticas são hoje produzidas em células de mamíferos (Wurm, Natl. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004). A produção de polipeptídeos ou proteínas recombinantes para fins terapêuticos, diagnósticos ou técnicos em cultura de células, isto é, in vitro, pode se produzir essencialmente de dois modos diferentes. Em linhagens de células estáveis, permanentes ou constantes estabelecidas o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo ou proteína é integrado em pelo menos uma cópia ao DNA cro- mossômico da célula, e é transferida durante a divisão celular com o conjunto de cromossomos celular às células filhas (a expressão chamada estável em linhagens de células de produção). Para a produção destas linhagens de células de produção estável é necessário que pelo menos um dos ácidos nucleicos introduzidos por transfecção na célula tenha uma função genética, que confira à célula uma vantagem de seleção durante o desenvolvimento na cultura celular. O ácido nucleico, que contém tal função genética não precisa necessariamente ocorrer na mesma molécula em que o cassete de expressão para o polipeptídeo ou proteína desejado. A função genética consiste ou em um gene de resistência contra antibióticos ou quimioterápicos em meio (frequentemente empregado, por exemplo, em células de mamíferos; Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004), um gene cujo produto genético complementa um trajeto de metabolismo deficiente (empregado, por exemplo, em células de levedura), ou uma função genética transformante (indicada para células humanas aminióciti- cas; Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). Deste modo fica garantido que tais células em que se produz uma integração estável do ácido nucleico transfectado no DNA cromossômico da célula e em que é produzido o produto genético superam outras células desprovidas de tal integração e podem ser selecionadas. Na obtenção das células de produção por transfecção na linhagem de células hospedeiras, por um lado o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo recombinante (o transgene) é transferido juntamente com os elementos de regulação transcricionais necessários, por outro lado um segundo cassete de expressão é transferido com um gene que codifica um marcador de seleção e seu produto genético confere à célula uma determinada vantagem de seleção. Alguns dias depois da transferência genética, enquanto são cultivadas as células, por exemplo, em um meio de cultura sem reagente de seleção, é acrescentado ao meio um reagente de seleção adequado. Na presença do reagente de seleção sobrevivem e crescem somente as células que tiverem absorvido os ácidos nucleicos que serão utilizados para a transfecção e que expressam o marcador de seleção. Marcadores de seleção frequentemente utilizados são o gene de resistência à neomicina, o gene de resistência à higromicina e à diidrofolato reductase (DHFR) (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004; Wurm e Jordan, 309-333 em: Ma- krides (Editor), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). A seleção se produz adequadamente no meio de cultura com os reagentes de seleção como os antibióticos neomicina ou higromicina ou com o glicocorticóide sintético meto- trexato, respectivamente. Geralmente, as células dotadas com o marcador de seleção e com o transgene, que sobrevivem ao processo de seleção e proliferam (transformantes), são em seguida habitualmente divididas (clonadas) para garantir que todas as células na cultura são geneticamente idênticas e para separar as linhagens de células de produção desejadas que apresentem as melhores taxas de produção das linhagens de células que têm uma produção menor.

No caso da expressão denominada transitória, no entanto, o ácido nucleico introduzido na célula por transfecção e que codifica o polipeptídeo ou a proteína desejada não é integrado ao DNA cromossômico da célula não é selecionado para este evento, respectivamente. Portanto, o ácido nucleico introduzido via de regra durante a divisão celular, geralmente, vai se diluindo e se perde na divisão celular durante o crescimento da cultura. Isto pressupõe a natureza temporária, transitória deste processo de expressão. A seleção de linhagens de células de produção estáveis com uma boa eficiência de expressão dura alguns meses e representa custos consideráveis. Com a expressão transitória, podem, por outro lado ser produzidas em alguns dias quantidades em miligramas do polipeptídeo ou proteína desejada. Rapidez e custos são fatores essenciais no desenvolvimento industrial de produtos biofarmacêuticos e diagnósticos. A expressão transitória de proteínas em pe-quenas quantidades, ou de variantes diferentes de uma proteína, por este motivo, exceto na pesquisa pura, é conduzida para o desenvolvimento precoce de exploração e pré-clínico, na identificação de alvo, por exemplo, no desenvolvimento de ensaios, na caracterização bioquímica dos produtos genéticos para testes toxicológicos e farmacocinéticos assim como farmacodinâmicos (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007; Pham et ai., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006). A produção industrial de proteínas numa escala de gramas a quilogramas para a condução de estudos clínicos maiores e o abastecimento do mercado se produzem, por outro lado, com a ajuda de linhagens de células de produção estáveis.

Em EP 1948789 é descrito, por exemplo, um processo para a produção de uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes por transfecção de um fator transformador de células sem o emprego de um marcador de seleção.

Proteínas secretadas, periféricas de membrana e intracelulares puderam até agora ser produzidas por expressão genética transitória. Células de mamíferos são os sistemas de expressão convencionais atuais adequados para muitas proteínas complexas, especialmente quando as proteínas devem ser empregadas para fins terapêuticos, uma vez que sistemas de células eucarióticas inferiores e procarióticas (tais como leveduras, por exemplo) são nitidamente prejudicadas no tocante a modificações pós-traducionais. Para a expressão transitória de proteínas foram empregadas até agora essencialmente quatro linhagens de células de mamíferos: Células COS-1 e COS-7, que são oriundas da linhagem de células renais símias CV-1 de macaco Chlorocebus africano; células BHK, que derivam de células renais neonatais de hamster; células CHO, que se originam de células ovarianas de hamster chinês; e células HEK293, uma linhagem de células renais embrionárias humanas com características neuronals (Pham et ai., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006; Wurm et Bernard, Current Opoinion in Biotechnology 10, 156-159, 1999). Além do emprego de veto- res de expressão virais tais como vírus de Semliki Forest ou adenovirus, que são eficientes, mas dispendiosos e associados com elevadas exigências de segurança e por este motivo são pouco disseminados, a expressão transitória nestas linhas de células de mamíferos se baseia em geral na transfecção de um vetor de plasmídeo que contém o cassete de expressão com a sequência codificadora para o produto genético desejado. Para a transferência de DNA em células de mamíferos cultivadas foi desenvolvida uma multiplicidade de métodos físicos e químicos. Aos métodos físicos de transferência genética pertencem a eletropora- ção, a nucleofecção e a microinjeção. No caso do processo de transfecção química utilizam- se substâncias inorgânicas (coprecipitação de fosfato de cálcio/DNA, por exemplo) polímeros catiônicos (processo de polietileno-imina, DEAE/dextrano, por exemplo) ou lipídios ca- tiônicos (denominada lipofecção). O fosfato de cálcio e polietileno-imina são os reagentes de transfecção que são empregados com maior frequência para a transferência de ácidos nu- cleicos em grande escala (até alguns litros) (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007).

Os processos descritos para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas com base em linhagens de células há muito conhecidas têm inconvenientes em diferentes sentidos. Um problema associado com o processo transitório consiste nos rendimentos de expressão mínimos. Para melhorar os rendimentos de expressão celular foram utilizados diferentes sistemas genéticos, para elevar o número de cópias genéticas por célula com o auxílio de replicação epissomal do ácido nucleico introduzido. Células COS exprimem o An- tígeno T grande do Vírus Símio 40 (SV40), um fator de replicação que produz com um número elevado de cópias uma replicação epissomal de plasmídeos que portam uma origem de replicação de SV40 (SV40 ori). O evento inicial desta replicação é a ligação do antígeno T à origem de replicação de SV40 (SV40 ori), sendo deste modo recrutados fatores de replicação celular no complexo DNA/antígeno T e sendo introduzida uma replicação por meio de DNA polimerase celular. Da linhagem de células HEK293, que foi gerada há uns 30 anos atrás por transformação de células renais embrionárias humanas com DNA do tipo 5 de adenovirus clivado, e que é bem transfectado, foram descritas duas variantes genéticas, que também expressam o antígeno T grande de SV40 (HEK293T) ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) (HEK293E ou 293EBNA-1). Estas linhagens de células devem garantir uma replicação epissomal ou amplificação de plasmídeos, que contêm um SV40-ori ou um EBV-oriP. O fator de replicação EBNA-1 interage neste último caso com a origem de replicação de EBV oriP. Pelo menos para as células HEK293E é comprovada uma elevação do rendimento de expressão com o emprego de plasmídeo de expressão contendo oriP. Ao contrário do emprego de EBNA-1 em combinação com a origem de replicação oriP diversos estudos indicam que não se produz nenhuma replicação intensa de plasmídeos contendo SV40-ori em células HEK293T (Durocher et al., Nucleic Acid Research 30, e9, 2002). Das células CHO foi gerada uma variante estável que expressa o antígeno T grande (LT) de vírus polioma (Epi-CHO) e pode ser empregada em combinação com um plasmídeo, que porta a origem de replicação do vírus polioma (PyOri) (Kunaparaju et ai., Biotechnology and Bioengineering 91, 670-677, 2005). Com tais sistemas de células de mamíferos são obtidos em média com a expressão transitória de proteínas recombinantes rendimentos de aproximadamente 10-20 mg/litro (Baldi et ai., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007). Com linhagens de células de produção estáveis permanentes, no entanto, são perfeitamente habituais rendimentos na área de muitas gramas por litro, conforme descrito, aliás, com dispêndio consideravelmente mais elevado de tempo e custos.

Um outro inconveniente dos sistemas de células empregados para a expressão de proteínas recombinantes consiste no fato de que muitas linhagens de células, devido a uma boa capacidade de transfecção e da capacidade de amplificação de plasmídeos epissomal realmente se prestam para a expressão transitória (células HEK293T, por exemplo, ou HEK293E), mas outras linhagens de células, devido às suas características de cultura e rendimentos, são empregadas de preferência para a produção de linhagens de células estáveis (células CHO, por exemplo). Como sistemas de células se distinguem, no entanto, nitidamente em diversos aspectos da modificação pós-traducional, depois da expressão transitória (principalmente na fase inicial de desenvolvimento de produtos protéicos terapêuticos) os dados para a estrutura e função dos produtos genéticos obtidos em um sistema celular determinado somente podem ser transferidos para a estrutura e função destes produtos ge-néticos depois da expressão em linhagens estáveis de um distinto sistema celular (principalmente na fase de desenvolvimento posterior, para estudos clínicos e abastecimento de mercado). No caso de muitos candidatos a produtos terapêuticos modificações pós- traducionais, tais como, por exemplo, glicosilação, fosforilação, carboxilação, palmitilação ou clivagens específicas, são de grande significado para diversas propriedades dos produtos de expressão. Elas podem ter influência essencial sobre a atividade, solubilidade, meia-vida, estabilidade ou imunogenicidade. Por este motivo sistemas de células humanas representam para a produção de proteínas terapêuticas um papel cada vez maior; somente células humanas garantes como estados de produção uma modificação humana autêntica dos produtos de expressão e reduzem assim o risco de qualidades de produto prejudiciais ou efeitos secundários indesejáveis. Assim, para a eritropoietina recombinante, por exemplo, que é utilizada na terapia humana, sabe-se que a proteína produzida por células CHO (Epoetina Alfa) apresenta resíduos de ácido N-glicolil-neuramínico nas suas cadeias laterais de carboidratos, ao passo que a proteína produzida em células humanas (Epoetina Delta) - tal como a eritropoietina humana natural - não contém tais resíduos de carboidratos. Sabendo- se que o ser humano forma de modo comprovado anticorpos circulantes contra tais estruturas de açúcares “estranhas”, o emprego de um sistema de expressão humano parece vantajoso (Varki, Am. J. Phys. Anthropol. 33, 54-69, 2002). Atualmente não existe disponível nenhum sistema de células humanas, que seja adequado para a expressão transitória e também para a produção estável de linhagens de células de produção e que assim garanta um perfil reproduzível de produto abrangendo o desenvolvimento total de um produto terapêutico à base de proteína.

As células humanas são especialmente bem adaptadas para a produção de biote- rápicos humanos, uma vez que elas expressam polipeptídeos complexos - ao contrário de outras células de outros mamíferos ou de células animais - com um padrão de modificação pós-traducional autêntico. O padrão de glicosilação de proteínas recombinantes complexas, portanto a estrutura e a disposição de resíduos de açúcares na molécula, reproduzirá em uma produção em células humanas essencialmente melhor o padrão do polipeptídeo humano autêntico do que em uma produção em sistemas de produção não humanos. Este padrão de glicosilação tem frequentemente um significado decisivo para características importantes do polipeptídeo, tais como atividade biológica, estabilidade, solubilidade e imunogenicidade.

Por este motivo a presente invenção tem por objetivo propor um sistema de células humanas que seja muito adequado para a expressão transitória de polipeptídeos e também para a produção de linhas de células de produção estáveis.

Este objetivo é atingido com o objeto definido nas reivindicações da patente.

As Figuras a seguir ilustram a invenção.

A Figura 1 mostra esquematicamente a construção dos plasmídeos para a expressão permanente do antígeno T. Em pGS158 (Figura 1a) o antígeno T é expresso sob o controle do promotor CAG humano (um promotor híbrido constituído pelo Immediate early- Enhancer do citomegalovírus e por um promotor β-actina de galinha modificado com o primeiro íntron) (Niwa et ai., Gene 108: 193-199, 1991), em pGS159 (Figura 1b) sob o controle do promotor RSV (Vírus de Sarcoma de Rous) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) e em pGS161 (Figura 1c) sob o controle do promotor CMV (citomegalovírus) humano (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

A Figura 2 mostra esquematicamente a construção dos plasmídeos para a expressão transitória da alfa1 -antitripsina humana (hAAT) ou da eritropoietina (Epo) humana, respectivamente sob o controle do promotor CMV humano. O plasmídeo pGS116 (Figura 2a) e pGS151 (Figura 2b) têm cassetes de expressão idênticas para hAAT, pGS151 contém, além disso, o ponto de início da replicação de DNA do Vírus Símio 40 (SV40 ori). pGS177 contém também, além do cassete de expressão de Epo, a SV40 ori.

A Figura 3 mostra esquematicamente a quantidade de hAAT transitoriamente expressa no sobrenadante de cultura em diferentes linhagens de células amniócitos que expressam antígeno T (CAP-T Z582, Z583 e Z597) em comparação com a linhagem de amniócitos genitores (CAP) sem expressão de antígeno T. Em Z582 o antígeno T é expresso sob o controle do promotor CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), em Z583 sob o controle do promotor RSV (Vírus de Sarcoma de Rous) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) e em Z597 sob o controle do promotor CMV (virus de citomegalia) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

A Figura 4 mostra esquematicamente a quantidade de hAAT (Barras) expressas transitoriamente no sobrenadante de cultura e o número de células viva (linhas) a pontos diferentes no tempo depois da transfecção de um plasmídeo sem SV40 ori (haat/número de células-ori, Plasmídeo pGS116) ou com SV40 ori (hAAT/número de células + ori, Plasmídeo pGS151)

A Figura 5 mostra esquematicamente a quantidade de hAAT transitoriamente expressas no sobrenadante de cultura (barras) e o número de células vivas (linhas) em diversos pontos no tempo depois da transfecção de pGS151 (com SV40 ori) em células CAP-T e HEK293T.

A Figura 6 mostra esquematicamente o número de cópias intracelulares dos plasmídeos pGS116 (sem SV40 ori) ou pGS151 (com SV40 ori) a diversos pontos no tempo depois de transfecção em células CP-T e HEK293.

A Figura 7 mostra esquematicamente a quantidade de hAAT expressa transitoriamente no sobrenadante de cultura (barras) e o número de células vivas (linhas) a diferentes pontos no tempo depois da transfecção de pGS151 (com SV40 ori) em CAP-T com polietile- no imina (PEI) como reagente de transfecção.

Com o termo “amniócitos”, conforme empregado no presente documento, indica-se, em um sentido amplo, todas as células que existem no líquido amniótico e que podem ser obtidas por amniocentese. As células são oriundas do líquido amniótico ou do tecido fetal, que está em contato com o líquido amniótico. Foram descritas tres classes principais de amniócitos, que são distinguidos por critérios morfológicos: células do tipo de fibroblastos (células F) células epitelóides (células E) e células do líquido amniótico (Amniotic Fluid Cells, células AF) (Hohn et al., Pediat. Res. 8: 746-754, 1974). As células AF consistem no tipo predominante de células.

Com o termo “cassete de expressão”, é indicada especialmente uma molécula de ácido nucleico ou uma região de uma molécula de ácido nucleico que contém um elemento regulador que se encontra antes da região codificadora ou promotor, uma região codificadora ou um quadro de leitura aberto, assim como um elemento determinação transcricional que se encontra atrás da região codificadora. O elemento regulador e o promotor, respectivamente, que se encontra antes da região codificadora pode ser um promotor constitutivo, isto é um promotor ativador permanente da transcrição (promotor CMV, por exemplo) ou um promotor regulável, isto é um promotor que pode ser ligado e/ou desligado (promotor regulável por tetraciclina, por exemplo). A região codificadora do cassete de expressão pode ser um quadro de leitura totalmente aberto, como no caso de um cDNA dotado com um códon de iniciar na extremidade 5’ e um códon de terminação na extremidade 3’. A região codificadora pode consistir em um arranjo genômico ou uma combinação nova de éxons codificadores com introns não codificadores dispostos entre eles. A região codificadora do cassete de expressão, no entanto, também pode ser constituída por uma multiplicidade de quadros de leitura abertos, que são separados pelos denominados IRES (Internal Ribosome Entry Sites).

Com o termo “linhagens de células permanentes”, conforme empregado no presente documento, são indicadas células que são de tal modo geneticamente alteradas que elas podem continuar a se desenvolver permanentemente na cultura de células em condições de cultura adequadas. Tais células são também denominadas células imortalizadas.

Com o termo “polipeptídeo” ou “polipeptídeo recombinante”, conforme empregado no presente documento, são indicados peptídeos compostos por pelo menos 2 aminoácidos. O polipeptídeo pode ser modificado co-traducionalmente e/ou pós-traducionalmente, afixando-se radicais de açúcares, por exemplo, ou por modificação de radicais de aminoácidos. O polipeptídeo pode ser linear, cíclico ou ramificado. Além disso, o polipeptídeo pode ser cons- tituído por mais de uma cadeia de aminoácidos, podendo as cadeias assumir estruturas espaciais mais ou menos complexas (tais como estrutura secundária, terciária, quaternária) por meio de ligações intramoleculares e/ou intermoleculares. Se o polipeptídeo for constituído por uma cadeia de aminoácidos, esta pode assumir também estruturas mais ou menos complexas através de ligações intramoleculares. Os polipeptídeos podem ser polipeptídeos farmacologicamente ou imunologicamente ativos ou serem polipeptídeos empregados para fins diagnósticos.

Com o termo “células primárias”, conforme empregado no presente documento, são indicadas células que foram obtidas por retirada direta de um organismo ou de um tecido e colocadas em cultura. As células primárias possuem uma duração de vida somente muito limitada.

Com o termo “linhagens de células de produção”, conforme empregado no presente documento, são indicadas linhagens de células permanentes que foram alteradas geneticamente de modo estável por introdução de um transgene que codifica o polipeptídeo desejado a ser produzido.

Com o termo “CAP”, conforme empregado no presente documento, são indicadas linhagens de células humanas amnióciticas permanentes, que foram geradas com funções genéticas adenovirais E1A e E1B por imortalização de amniócitos humanos primários.

Com o termo “CAP-T”, conforme empregado no presente documento, indicadas células CAP que foram transfectadas de modo estável ainda com uma sequência do antígeno T grande de SV40 contendo uma molécula de ácido nucleico.

Com o termo “transfecção”, conforme empregado no presente documento, é indicado qualquer processo que se presta para a introdução do(s) ácido nucleico(s) citado(s) nas células. Como exemplos podem ser citados o método clássico de fosfato de cálcio, eletropo- ração, sistema lisossômico de qualquer tipo e combinações destes processos.

Com o termo “expressão transitória”, conforme empregado no presente documento, é indicado qualquer processo em que são introduzidos por transfecção ácido nucleico(s) na célula,, sem que sejam selecionadas linhagens de células estáveis por meio de um processo de seleção adequado, podendo estas linhagens continuar a ser cultivadas continuamente na cultura de células.

Com o termo “expressão estável”, conforme empregado no presente documento, é indicada a expressão de um transgene nas linhagens de células de produção.

Com o termo “transgene”, conforme empregado no presente documento, é indicada a sequência que codifica um polipeptídeo recombinante.

Um objeto da presente invenção se refere a um processo para a produção de uma linhagem de células humanas permanentes que compreende as seguintes etapas: a) a transfecção de células humanas primárias com uma molécula de ácido nuclei- co compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para as funções genéticas adenovirais E1Ae E2A; denominada primeira transfecção, e b) a transfecção subsequente da linhagem de células humanas permanentes com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica parra o antígeno T grande de SV40, denominada segunda transfecção.

Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico da etapa b) do processo de acordo com a presente invenção para produção de uma linhagem de células humanas permanentes compreende, de preferência, uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma forma não clivada do antígeno T grande de SV40.

Durante a transfecção na etapa b) do processo de acordo com a presente invenção a linhagem de células humanas permanentes é transfectada alternativamente com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1), denominada segunda transfecção. A molécula de ácido nucleico compreende, de preferência, uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma forma não clivada do Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

Com as transfecções conduzidas no processo de acordo com a presente invenção são transfectadas de preferência estavelmente as células humanas primárias, isto é, o DNA transfectado é integrado ao genoma da célula.

Com a transfecção das células humanas primárias com a molécula de ácido nucleico que compreende as sequências de ácidos nucleicos que codificam para E1A e E1B, as células são imortalizadas. A molécula que é empregada para a imortalização das células humanas primárias compreende sequências de ácidos nucleicos de E1A e E1B, que derivam, de preferência, de adenovirus humanos, especialmente do sorotipo 5 de adenovirus humano. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico empregada para a imortalização compreende além das sequências de ácidos nucleicos que codificam para E1A e E1B, a sequência de ácido nucleico que codifica para a função genética pIX adenoviral. O polipeptídeo pIX, uma proteína estrutural virai, atua como um ativador de transcrição sobre diversos promotores virais e celulares, tais como, por exemplo, o promotor de timidina quinase e de beta-globina. Uma sequência exemplar se encontra no Genbank tendo o número Acc. Nr. X02996. Em particular, as moléculas de ácidos nucleicos compreendem especialmente os nucleotídeos 1 a 4344 (SEQ ID NO: 1 abrange as sequências de ácidos nucleicos que codificam para E1A, E1B e pIX), 505 a 3522 (SEQ ID NO: 2 compreende se-quências de ácidos nucleicos que codificam para E1A e E1B) ou os nucleotídeos 505 a 4079 (SEQ ID NO: 3 abrange as sequências de ácidos nucleicos que codificam E1A, E1B e pIX) do sorotipo 5 do adenovirus humano.

Em particular, são especialmente transfectadas as células humanas com as se- quências de ácidos nucleicos a serem expressas que codificam para a função genética desejada na forma de um cassete de expressão. O cassete de expressão compreende uma molécula de ácido nucleico, que contém um elemento regulador que se encontra antes da região codificadora ou promotor, uma região codificadora ou um quadro de leitura aberto, assim como um elemento de terminação transcricional que se encontra atrás da região codificadora.

Em particular, em uma modalidade o cassete de expressão ou a molécula de ácido nucleico contém a sequência de ácidos nucleicos para o antígeno T grande de SV40 (sequência 4), a sequência de ácido nucleico para um promotor selecionado do grupo de promotor CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG (Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991) e promotor RSV (número de acesso do Genbank Acc. Nr. DQ075935), a sequência para SV40 SD/AS (intron) (SEQ ID NO: 6) e a sequência de ácido nucleico para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7).

Em uma modalidade adicional, o cassete de expressão ou a molécula de ácido nucleico contém em particular a sequência de ácido nucleico para Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) (SEQ ID NO: 8), a sequência de ácido nucleico para um promotor selecionado do grupo CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG (Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991) e promotor RSV (número de acesso do Genbank Acc. Nr. DQ075935), a sequência de ácido nucleico para SV40 SD/AS (intron) (SEQ ID NO: 6) e a sequência de ácido nucleico para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7).

As células humanas primárias são obtidas por retirada direta do organismo ou de um tecido retirado do organismo e colocados em cultura. São preferidas aquelas células humanas primárias que podem ser bem convertidas em linhagens de células humanas permanentes através da expressão de E1A e E1B adenovirais, especialmente amniócitos, células de retinas embrionárias e origens neuronais de células embrionárias.

É preferível se produzir linhagens de células humanas aminióciticas permanentes com o processo de acordo com a presente invenção.

O processo de acordo com a presente invenção, também pode ser conduzido com as linhagens de células humanas imortalizadas já existentes em vez da etapa a), em particular com as linhagens de células humanas aminióciticas imortalizadas já existentes, que apresentam em seu genoma as sequências de ácido nucleico para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B. As células humanas imortalizadas compreendem, de preferência, no seu genoma, as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e pIX. As células humanas imortalizadas existentes, em particular ascélulas humanas aminióciticas imortalizadas, são transfectadas caso necessário com a molécula de ácido nucleico, descrita acima, -que contém um cassete de expressão que codifica para o antígeno T grande de SV40 ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1). Os versados na técnica observarão que a segunda transfecção temporária somente depende da primeira transfecção da célula humana primária na medida em que ela deve se produzir depois da primeira transfecção. Não é necessário que a segunda transfecção seja conduzida imediatamente depois da primeira transfecção. Portanto, células huma-nas imortalizadas com E1A e/ou E1B e já estabelecidas há alguns anos, também, podem ser transfectadas caso necessário, com a molécula de ácido nucleico citada acima em uma segunda transfecção. Podem ser empregadas, de preferência,, amniócitos humanos imortalizados, células de retina embrionária humanas imortalizadas, especialmente células PER.C6, ou células embrionárias de origem neuronal humanas imortalizadas, especialmente células HEK293.

Um objeto da presente invenção se refere a uma linhagem de células humanas permanentes compreendendo as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e a sequência de ácido nucleico para o antígeno T grande de SV40 ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1). A presente invenção se refere, de preferência, a uma linhagem de células humanas permanentes compreendendo as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e pIX e a sequência de ácido nucleico para o antígeno T grande de SV40 ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1). A presente invenção se refere de modo especial a uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes que compreende as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e a sequência de ácido nucleico para o antígeno T grande de SV40 ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1). Mais preferivelmente, a presente invenção se refere a uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes que compreende- as sequências de ácidos nucleicos para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B e pIX e a sequência de ácido nucleico para o antígeno T grande de SV40 ou o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

Em particular, um outro assunto da presente invenção se refere -a uma linhagem de células humanas permanentes, de preferência uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes que se obtém com o emprego do processo de acordo com a presente invenção.

Um outro assunto da presente invenção se refere a um processo para a expressão transitória de polipeptídeos ou proteínas recombinantes com o emprego da linhagem de células humanas permanentes de acordo com a presente invenção e que compreende as seguintes etapas: a) transfecção da linhagem de células humanas permanentes com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo ou proteína recombinante desejada e um sítio de reconhecimento ou de ligação para o antígeno T grande de SV40 ou para o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1), b) cultura da linhagem de células humanas permanentes transfectadas obtidas na etapa a) em condições que permitem a expressão do polipeptídeo ou proteína recombinante desejada, e em seguida c) isolamento do polipeptídeo ou proteína recombinante desejada a partir das células ou a partir do sobrenadante da cultura.

Uma modalidade preferencial da presente invenção se refere a um processo para a expressão transitória de polipeptídeos ou proteínas recombinantes como emprego da linhagem de células humanas aminióciticas permanentes de acordo com a presente invenção compreendendo as seguintes etapas: a) transfecção da linhagem de células humanas aminióciticas permanentes com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo ou proteína recombinante desejada e um sítio de reconhecimento ou de ligação para o antígeno T grande de SV40 ou para o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1), b) cultura da linhagem de células humanas aminióciticas permanentes transfectadas obtidas na etapa a) em condições que permitem a expressão do polipeptídeo ou proteína recombinante desejada, e em seguida, c) isolamento do polipeptídeo ou proteína recombinante desejada a partir das células ou a partir do sobrenadante da cultura.

Se a linhagem de células humanas permanentes de acordo com a presente invenção contiver uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica para o antígeno T grande de SV40, a linhagem de células é transfectada, por exemplo, com um plasmídeo de expressão que contém um cassete de expressão ou uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codificada para o transgene a ser expresso e para a origem de replicação de SV40 (SV40 ori). O antígeno T grande de SV40 expresso intracelularmente de modo estável na linhagem de células se liga à origem de replicação de SV40 do plasmídeo de expressão introduzido na linhagem de células por transfecção e produz uma replicação epissomal do plasmídeo de expressão e assim uma amplificação do número de cópias do transgene a ser expresso. O produto genético desejado codificado pelo transgene pode ser obtido depois de se cultivar as células durante alguns dias ou das células ou do sobrenadante de cultura. O transgene é assim expresso transitoriamente.

Se a linhagem de células humanas permanentes de acordo com a presente invenção contiver uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica para o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1), a li- nhagem de células, é transfectada com um plasmídeo de expressão, por exemplo, que contém um cassete de expressão ou uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para o transgene a ser expresso e para a origem de replicação de EBV (EBV oriP) (Durocher et al., Nucleic Acids Research Vol. 30 nr. 2 e 9, 2002; Tuvesson et al. Cytotechnology 56: 123-136, 2008). O EBNA-1 de EBV expresso intracelularmente de modo estável na linhagem de célula se liga à origem de replicação oriP do plasmídeo de expressão introduzido por transfecção na linhagem de células e produz uma replicação epissomal do plasmídeo de expressão e deste modo a amplificação do número de cópias do transgene a ser expresso. O produto genético desejado codificado pelo transgene pode ser obtido das células ou do sobrenadante de cultura depois da cultura das células durante alguns dias. O transgene é assim expresso de modo transitório.

As células de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em condições convencionais para a cultura de células eucarióticas a uma temperatura de aproximadamente 37 °C, umidade do ar a 95%, e 8% de CO2. As células de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em meio contendo soro, ou isento de soro, em cultura aderente ou em cultura em suspensão. A cultura em suspensão pode se produzir em diversos recipientes de fermentação, em reatores químicos, por exemplo, reatores “Wave”, em recipientes shaker ou spinner ou nos recipientes denominados “Roller Bottles”. As células são assim adequadas para uma expansão de processo em escala industrial. A transfecção das células para expressão transitória pode se produzir com diferentes métodos de transfecção, que foram descritos acima. A transfecção e a expressão transitória podem ser conduzidas também no formato ou screening de “High-Throughput”, tal como em formato de 96 ou de 384 poços, por exemplo.

O antígeno T de Simian Virus 40 (SV40) é uma fosfoproteína multifuncional, que controla tanto a replicação virai como também as funções celulares depois da infecção. O antígeno T é um agente transformante e interfere através da interação com a proteína supressora de tumor p53 no ciclo celular. Durante a replicação do genoma virai 0 antígeno T é necessário como DNA-helicase, para desenrolar 0 genoma de dois filamentos. O antígeno T é a única proteína virai que é necessária para a replicação. As demais funções são exercidas por proteínas celulares. Na primeira etapa da replicação de DNA, 12 moléculas de antígeno T se ligam como duplos hexâmeros no ponto de início da replicação de DNA (ori) no genoma de SV40. A este complexo de helicase se ligam então as proteínas celulares necessárias tais como DNA-polimerase e desenrolam e replicam 0 DNA. A origem denominada “ori mínima” consiste em uma sequência “Core” de 63 pb de comprimento. Em uma transfecção transitória de plasmídeos circulares na célula alvo não se produz nenhuma integração ao genoma do hospedeiro, 0 que tem como resultado que a concentração do plasmídeo depois da divisão celular se reduz constantemente e a expressão de um gene codificador que se encontra no plasmídeo é somente temporária. A introdução do fragmento ori de SV40 no plasmídeo de expressão e a expressão do antígeno T de SV40 na célula de produção levam a um número de cópias mais elevado do plasmídeo e assim a um maior rendimento de expressão.

O processo de acordo com a presente invenção para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas tem a vantagem, de que, no tocante à quantidade e qualidade do produto genético recombinante ele tem um maior rendimento e consequentemente nos termos do processo total do desenvolvimento industrial dos produtos terapêuticos à base de proteína também é mais econômico do que os processos empregados até agora. Em particular, é vantajoso que o sistema de expressão transitório extremamente seja proposto com base em uma linhagem de células humanas, linhagem esta que em primeiro lugar ao contrário das células de mamíferos não humanos ou de células não de mamíferos, proteínas humanas são modificadas de modo autenticamente pós-traducional, e em segundo lugar são igualmente muito adequadas para o estabelecimento de linhagens de células de produção estáveis no processo de produção industrial. Deste modo, pode ser garantido que no decor-rer do desenvolvimento de produtos terapêuticos ou diagnósticos, as características qualitativas do produto genético, depois da expressão transitória na fase de desenvolvimento inicial e depois da expressão estável em linhagens de células de produção permanentes na fase tardia e durante a produção industrial, apresentem a maior identidade possível especialmente no tocante às diferenças entre estas características que podem ser baseadas na natureza do sistema celular.

Uma outra vantagem da presente invenção consiste no fato de que as linhagens humanas permanentes de acordo com a presente invenção apresentam altos rendimentos de expressão durante a expressão transitória. Assim durante a expressão transitório nas linhagens de amniócitos produtores de antígeno T de SV40 depois da transfecção com o vetor de plasmídeo, que porta além da sequência codificadora para o produto desejado genético um origem de replicação de SV40 (SV40 ori), foram constatados rendimentos muito elevados e inesperados de produto no sobrenadante de cultura da ordem de até 60 mg/L. Os rendimentos do produto eram mais de 70 vezes maiores do que na expressão transitória em uma linhagem de amniócitos que não expressavam nenhum antígeno T.

Uma outra vantagem da linhagem de células humanas permanentes de acordo com a presente invenção consiste no fato de que é proposto um sistema de células humanas, baseado, de preferência, nos amniócitos humanos imortalizados, sistema este que se presta tanto para a expressão transitória de proteínas como também para a expressão estável de proteínas em linhagens de células de produção permanentes (Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). Em comparação com o emprego de diferentes sistemas de células para a expressão transitória (HEK293 ou variantes de HEK293, por exemplo) e a expressão está (CHO, por exemplo) fica, assim, minimizado o risco de que as características estruturais ou funcionais dos produtos de expressão oriundos de produção transitória e estável, que são baseados na natureza do sistema de expressão, sejam diferentes. Deste modo o processo de desenvolvimento pode ser mais bem planejado, acarretando menos perda de tempo e custos.

As sequências de ácidos nucleicos para a expressão da pelo menos um polipeptídeo recombinante ocorrem em pelo menos um cassete de expressão. Os cassetes de expressão contêm promotores e sequências de terminação transcricional. Como promotores podem servir, por exemplo, promotor CMV (Citomegalovírus) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003), pro- motor EP-1α (Kim et al., Gene 91:217-223, 1990), promotor CAG (um promotor híbrido proveniente do Immediate Early-Enhancer do citomegalovírus humano e um promotor de β- actina de galinha modificado com primeiro intron) (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), promotor pgk (fosfoglicerato quinase) humano ou murino (Adra et al., Gene 60: 65-74, 1987), promotor RSV (VÍRUS DO SARCOMA DE Rous) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) ou promotor SV40 (/simian Virus 40) (Makrides, 9-26 em: Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). Como sítios de poliadenilação podem servir, por exemplo, as sequências de poliadenilação do antígeno T grande de SV40 (Número do Genbank Acc. Nr. J02400) ou do gene de G-CSF (fator estimulador de colônias de granu- lócitos, granulocyte colony stimulating factor) humano (Mizushima e Nagata, Nucl. Acids. Res. 18:5322, 1990).

Um outro assunto da presente invenção se refere ao polipeptídeo ou proteína que é obtido com o emprego do processo de acordo com a presente invenção.

O polipeptídeo recombinante do processo de acordo com a presente invenção pode ser uma proteína terapêutica, tal como, por exemplo, alfa 1 -antitripsina humana ou fatores de crescimento como eritropoietina ou interleucina 2. A alfa 1-antitripsina humana (hAAT) é um inibidor de proteinase, que inibe a elastase e outras proteinases, e com uma falta considerável de hAAT, que leva a danos graves aos pulmões e fígado é terapeuticamente efetivo. No caso da eritropoietina trata-se de um fator de crescimento importante para eritrócitos (glóbulos sanguíneos vermelhos) que no caso de anemia assim como em pacientes de transplantes tem um efeito de formação de sangue. A interleucina-2 (II-2) pertence aos mensageiros celulares do sistema imunológico e tem um grande significado na ativação de resposta imune celular, tal como, por exemplo, em doenças tumorais. Aos polipeptídeos terapeuticamente eficazes pertencem também fatores de coagulação sanguínea tais como, por exemplo, fator VIII e fator IX, que são empregados em paciente hemofílicos com transtornos da coagulação. O polipeptídeo recombinante do processo de acordo com a presente inven- ção pode ser um hormônio. Os hormônios produzidos por biotecnologia são empregados em terapia de substituição em pacientes com perturbações hormonais. Exemplos deles são o hormônio insulina que reduz o açúcar no sangue, sendo a ela indicados muitos pacientes de diabetes melito, a somatropina (hormônio de crescimento) para o tratamento de nanismo, e os fatores gonadotrópicos como o hormônio estimulante de folículos (FSH) ou hormônio lu- teinizante (LH) para o tratamento de transtornos da fertilidade. O polipeptídeo recombinante pode, além disso, ser uma enzima que modifica pós-traducionalmente outros polipeptídeos recombinantes expressos simultaneamente intracelularmente ou no sobrenadante de cultura, tal como uma enzima que participa da glicosilação. Os produtos genéticos E1A, E1B e pIX expressos na linhagem de células humanas permanentes de acordo com a presente invenção, assim como o antígeno T grande de SV40 e o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) não pertencem ao polipeptídeo desejado a ser produzido.

O polipeptídeo recombinante do processo de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo recombinante que pode ser empregado para fins terapêuticos ou diagnósticos. Os anticorpos contra o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) são empregados em pacientes com artrite reumatóide, os anticorpos contra o receptor celular do fator de crescimento epidérmico (EGFR) são empregados em pacientes com câncer. Os anticorpos empregados para fins diagnósticos podem ser, por exemplo, componentes de kits diagnósticos comerciais, que se baseiam em processos tais como o teste de imuno-adsorção por enzima ligada (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) ou teste de imuno-adsorção radioativo (Radio Immuno Sorbent Assay, RIA). Os anticorpos servem nestes processos de teste para provar a presença dos antígenos de causadores da infecção, tal como, por exemplo, do vírus de hepatite B humana.

Os anticorpos ou imunoglobulinas (lg) são compostos por uma cadeia pesada e uma leve, constituídos cada um deles de regiões variáveis e constantes ou domínios. As sequências de ácidos nucleicos da molécula de ácido nucleico transfectada para a expressão de um anticorpo podem conter dois cassetes de expressão separados, dos quais um codifica uma cadeia leve e o outro a cadeia pesada da molécula de imunoglobulina. Depois da expressão das duas cadeias na célula de acordo com a presente invenção, estas formam uma molécula de anticorpo ativo. Os cassetes de expressão das duas cadeias podem ser apresentadas em moléculas de ácido nucleico separadas ou em uma mesma molécula. As sequências codificadoras para a cadeia leve e a pesada podem, no entanto, também se encontrar dentro do mesmo cassete de expressão e ser separadas por uma sequência IRES (internal ribosome entry site, sítio de ligação ribossômico interno), sequência esta que garante uma expressão tanto da cadeia pesada como da leve. As sequências codificadoras para a cadeia leve e a pesada podem em princípio também se encontrar no interior do mesmo cassete de expressão e serem separadas por uma sequência que codifica um sítio de clivagem enzimática para uma proteinase (tal como trombina, por exemplo), que então é expressa simultaneamente na célula e que faz a clivagem do pré-polipeptídeo constituído por uma sequência de cadeia leve e pesada em cadeias ativas leve e pesada.

Os anticorpos recombinantes que são codificados pela sequência de ácido nucleico na célula de acordo com a presente invenção podem ser constituídos também por fragmentos de um anticorpo, em vez de ser por uma cadeia completa leve e pesada. Os anticorpos denominados de cadeia simples (scFv, single chain variable fragments) consistem em domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma leve que são ligadas por uma sequência de aminoácidos (denominada linker), que garante um mobilidade livre dos dois domínios. Por ligação intramolecular dos dois domínios se produz uma estrutura que se liga a antígeno, e que corresponde à região variável de uma molécula de imunoglobulina. Anticorpos de cadeia simples bi-específicos (bis-scFv) consistem em dois grupos de tais cadeias simples constituídos por domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma leve, que por seu lado novamente se conectam por uma sequência de ligação e se deslocam um contra a outra; tais moléculas podem se ligar simultaneamente a dois sítios de ligação de antígeno (epíto- po) e deste modo ligar de modo não covalente duas estruturas moleculares. Diacorpos bi- específicos são constituídos por duas cadeias simples expressas separadamente, contendo cada uma delas domínios variáveis de uma cadeia leve e de uma pesada, separadas somente por um linker muito curto ou então sem linker. A presença do linker curto ou a sua ausência impede acúmulo intramolecular por acúmulo de um domínio variável pesado e leve por sua vez se cria uma molécula ativa dotada com duas valências de ligação.

O polipeptídeo recombinante codificado pela molécula de ácido nucleico transfecta- da no processo acima pode ser uma proteína virai, bacteriana ou parasitária, que deve ser produzida para um emprego como vacina profilática ou terapêutica. Neste caso pode se tratar tanto de um polipeptídeo estrutural como também de um polipeptídeo ativo do ponto de vista regulador ou enzimático de vírus, bactérias ou parasitas. Uma proteína virai pode ser, por exemplo, o antígeno de Superfície do vírus da hepatite B (HBV Surface Antigen) ou a proteína estrutura L1 do papilomavírus humano. Uma proteína bacteriana que depois da expressão em linhagens de células de produção se considera para a produção de vacinas são, por exemplo, subunidades de enterotoxina de Escherichia coli enterotoxinogênica (ETEC) ou proteínas que se ligam a transferrina (Transferrin binding proteins Tbp A e B) de Neisseria gonorrhoeae. Um polipeptídeo de parasitas que poderia ser codificado pela molécula de ácido nucleico transfectada no processo da presente invenção, consiste, por exemplo, na proteína de superfície de merozoíto (Merozoite Surface Protein, MSP) do causador de malária Plamodium falciparum ou Glutathion S-transferase (GST) de Schistosoma japoni- cum.

O polipeptídeo recombinante codificado pela molécula de ácido nucleico transfecta- da no processo da presente invenção pode, além disso, ser uma proteína virai, que permite na linhagem de células uma produção de vetores de transferência genética virais recombi- nantes. Esta proteína virai, também denominada fator de complementação é expressa na linhagem de células e consiste nos componentes enzimáticos ou estruturais que são necessários para a produção dos vetores de transferência genética, componentes estes que não são codificados na molécula de ácido nucleico do vetor de transferência genética. Em tais vetores de transferência genética, as funções genéticas virais determinadas são geralmente deletadas por motivos de segurança. Aos vetores de transferência genética, cujos fatores de complementação podem ser codificados por transgenes introduzidos com o processo descrito, pertencem, por exemplo, vetores que se baseiam em adenovirus, em vírus associado ao adenovirus (AAV), em retrovirus ou lentivírus, ou em vírus da herpes. O fator de com-plementação expresso na linhagem de células pode também complementar em sua produção vírus deletados ou recombinantes, que não contêm nenhum gene a ser transferido e não funcionam, portanto, como vetores de transferência genética, mas são empregados, por exemplo, como vacina.

O polipeptídeo expresso transitoriamente com o processo da presente invenção pode ainda consistir em um polipeptídeo receptor, que está localizado especialmente na superfície celular e é responsável pela infecção da célula por um vírus ou pela transdução da célula por um vetor de transferência genética virai. Como receptor virai para a etapa inicial da infecção de células com o sorotipo 2 ou 5 de adenovirus, dos quais são derivados a maioria de vetores adenovirais convencionais, foi identificado o receptor denominado receptor de Coxsackie e Adenovirus, CAR (Bergelson et ai., Science 275: 1320-1323, 1997). A expressão suficiente de CAR na superfície é uma condição necessária para que uma célula seja adequada como célula de produção para os vetores de transferência genética adenovirais. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo recombinante do receptor de Coxsackie e Adenovirus (CAR). A sobre-expressão do polipeptídeo de receptor pode melhorar consideravelmente a capacidade de infecção e consequentemente a eficiência de produção destas células no tocante a vetores adenovirais. Além disso, a molécula de ácido nucleico além de CAR pode codificar receptores secundários ou receptores de internalização, tais como, por exemplo, determinadas integrinas, que proporcionam a absorção do vírus ou do vetor de transferência genética pela célula, e cuja expressão adicional na produção de células de produção é recomendada para vetores adenovirais.

O processo descrito pode, dentre outros fins, ser empregado para a produção de polipeptídeos terapêuticos, fatores de coagulação sanguínea e de crescimento, hormônios e anticorpos assim como de polipeptídeos bacterianos virais ou parasitários para emprego como vacina. Além disso, as células de acordo com a presente invenção podem ser empregadas para a produção de proteínas relevantes do ponto de vista diagnóstico, tais como antígenos virais, bacterianos ou parasitários ou de anticorpos específicos correspondentes. Alem disso, as células da presente invenção podem ser empregadas para a produção de proteínas relevantes do ponto de vista técnico ou industrial, tal como, de enzimas para catálise de processos de síntese técnicos ou para a decomposição de substâncias nocivas. As células de acordo com a presente invenção podem expressar um ou mais polipeptídeos diferentes recombinantes. O número dos polipeptídeos que podem ser expressos depende do número de sequências de ácidos nucleicos diferentes que codificam para os polipeptídeos recombinantes com o processo de acordo com a presente invenção que são transfectados de modo transitório nas células.

A presente invenção se refere ainda ao emprego das linhagens de células humanas permanentes produzidas com o processo de acordo com a presente invenção, especialmente de linhagens de células humanas aminióciticas permanentes para a produção de um polipeptídeo ou proteína.

Os exemplos abaixo explicam a invenção e não devem ser considerados como uma limitação. Na medida em que não for declarado em contrário, foram empregados métodos padrão da biologia molecular, tais como descrito por Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York.

1. Clonaαem a. Plasmídeos para a transformação de amniócitos primários: DSTK146. DGS119. PGS122

O plasmídeo pSTK146 foi descrito em detalhes em EP 1 230 354 B1 e compreende o promotor fosfoglicerato quinase (pgk) murina, sequências de nucleotideos (nt.) 505 a 3522 do sorotipo 5 de adenovirus (Ad5) e o sinal spliceossômico e sinal de poliadenilação de SV40. As sequências adenovirais de pSTK146 compreendem a região codificadora de E1A e E1B, sendo regulada a expressão de E1A a partir do promotor pgk.

O plasmídeo pGS119 foi descrita exaustivamente em WO 2007/056994 e contém o promotor pgk murino, sequências Ad5 nt. 505-3522 (compreendendo a região E1A e E1B), o sinal spliceossômico e sinal de poliadenilação de SV40 seguido pela região pIX de Ad5 nt. 3485-4079.

O plasmídeo pGS122 foi exaustivamente descrito em WO 2007/056994 e compreende as sequências adenovirais nt. 1-4344, compreendendo as regiões E1A, EIB e pIX incluindo as sequências respectivamente reguladoras de promotor e de poliadenilação. As sequências adenovirais em pGS122 são flanqueadas por sítios de clivagem Pmel.

b. Plasmídeos de expressão de antígeno T: pGS158, DGS1 59, DGS1 61

Todos os plasmídeos pGS158, pGS159 e pGS161 contêm o cassete de expressão para o antígeno T de SV40 (SEQ ID NO: 4), flanqueado por um intron de SV40 (SEQ ID NO: 6) e um sítio de poliadenilação (SEQ ID NO: 7). Além disso, pGS158 contém o promotor CAG (promotor híbrido constituído pelo CMV-Enhancer e pelo promotor de β-actina de galinha) (Niwa et ai., Gene 108: 193-199, 1991), pGS159 contém o promotor RSV (promotor originário do vírus do sarcoma de Rous) (Genbank Acc. Nr. DQ075935) e pGS161 contém o promotor CMV (anteriormente promotor do citomegalovírus humano) (SEQ ID NO: 5). Para a geração de linhagens de células estáveis os plasmídeos pGS158, pGS159 e pGS161 contêm um cassete de expressão de blasticidina com o promotor de ubiquitina (pUB/Bsd, Invi- trogen # V512-20). Em uma primeira etapa foi inserido um fragmento de 2,6 kb, que contém as sequências que codificam o antígeno T, e o plasmídeo pGS140. O plasmídeo pGS140 contém o promotor CMV humano (SEQ ID NO: 5), uma região de íntron oriunda de SV40 com doadora spliceossômico/sítio de receptor spliceossômico (SEQ ID NO: 6), um sítio de divagem de restrição Notl singular e uma sequência poliA oriunda de SV40 (SEQ ID NO: 7). Para a introdução do fragmento de antígeno T pGS140 foi linearizado com Notl, o pendente 5’ foi preenchido e ligado com o fragmento isolado. O plasmídeo assim obtido recebeu a designação pGS149.

Para o plasmídeo pGS158 o pGS149 foi digerido com Xbal e foi isolado um fragmento de aproximadamente 2 kb contendo a sequência de íntron, antígeno Tea sequência de poliA. Este fragmento foi introduzido no sítio de divagem Notl (pendente 5’) preenchido) de pGS152. pGS152 se originou por introdução de um fragmento de promotor CAG tendo 1,1 kb (Niwa et ai., Gene 108:193-199, 1991) no sítio de divagem EcoRV de pUB/Bsd.

Para o plasmídeo pGS159 o fragmento de Xbal de 3 kb oriundo de pGS149 contendo antígeno T foi introduzido no sítio de divagem Notl preenchido de pGS153. pGS153 contém um fragmento de promotor RSV de aproximadamente 0,6 kb, introduzido no sítio de divagem EcoRV de pUB/Bsd.

Para o plasmídeo pGS161, o pGS149 foi digerido com Sphl, os pendentes 3’ foram preenchidos, o fragmento de 3,6 kb contendo o promotor CMV, o íntron de SV40, a sequência de antígeno Tea poliA, foi isolado e introduzido no sítio de divagem EcoRV de pUB/Bsd.

c. Plasmídeos de expressão de hAAT: pGS116, pGS151

O plasmídeo pGS116 foi descrito com detalhes em EP1948789 e contém o promotor CMV humano seguido por um doador spliceossômico/sítio de receptor spliceossômico de SV40, do hAAT-cDNA (SEQ ID NO: 12) e pelo sítio de poliadenilação de SV40.

O plasmídeo pGS151 (Figura 2b) contém este cassete de expressão de hAAT e o sítio inicial da replicação de DNA (origin of replication, ori) de SV40. Com o auxílio de DNA de SV40 e do iniciador ori 1 (CCGGAATTCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC)(SEQ ID NO:9) e ori 2 (CCGGAATTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT) (SEQ ID NO: 10) as sequências de SV40 foram amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), digeridas com EcoRI (sendo um sítio de clivagem de EcoRI localizado em cada iniciador) e introduzidas no sítio de clivagem EcoRI de pGS116.

d. Plasmídeos de expressão de Epo: pGS177

O plasmídeo pGS127 foi descrito em detalhes em EP1948789 e contém o promotor CMV humano seguido por um doador spliceossômico/sítio de receptor spliceossômico de SV40, por cDNA para a eritropoietina humana (Epo) e pelo sítio de poliadenilação de SV40.

Para o plasmídeo pGS177 o fragmento ori oriundo de SV40 descrito acima foi amplificado com os iniciadores ori 1 e ori 2 e introduzido em pGS127.

2. Exame das Construções a. Análise das sequências

O caráter completo de todos os plasmídeos descritos acima foi examinado por digestão com enzimas de restrição. Além disso, foi confirmada a sequência correta e a orientação correta do fragmento ori de SV40 em pGS151 e pGS177 por análise de sequências. As sequências adenovirais em pSTK146, pGS119 e pGS122 foram determinadas por meio da análise de sequências e coincidiram perfeitamente com a sequência de tipo selvagem de Ad5.

b. Exame da Expressão transitória

Os plasmídeos pSTK146, pGS119 e pGS122 foram transfectados para células He- La e a expressão das proteínas de E1A e E1B foi analisada por meio de Western Blot com o emprego de anticorpos monoclonais (Merck Bioscience). Os plasmídeos pGS158, pGS159, pGS161 foram transfectados para células HEK293, e a expressão do antígeno T foi provada por meio de Western Blot e um anticorpo monoclonal (Abeam, Cambridge, Reino Unido). Os plasmídeos pGS116 e pGS151 foram transfectados para células CAP e a expressão e a secreção de alfal-antitripsina humana (hAAT) foram provadas no sobrenadante de cultura por meio de ELISA (veja 6.).

Os plasmídeos pGS127 e pGS177 foram também transfectados para células CAP e a expressão de Epo humana foi provada por meio de ELISA (veja 6.).

3. Cultura de Células a. Linhagens de células

Amniócitos transformadas (células CAP e CAP-T) foram cultivadas em meio 293SFMII (Invitrogen #11686-029), antimicótico/antibiótico a 0,5% (Invitrogen #15240-062), L-glutamina a 4 mM (Invitrogen #25030-024) a 37°C, 95% de umidade de ar, 8% de CO2. O meio de cultura de células CAP-T continha ainda adicionalmente 5 pg/mL de blasticidina (Invitrogen #R210-01). As células foram habitualmente infectadas com uma densidade inicial de 2-4 x 105 células/mL em um volume de 12 mL em um frasco de agitação e foram cultivadas em uma incubadora de agitação a 100 rpm durante 3-4 dias. Com uma densidade de 1- 2 x 106 células/mL as células foram coletadas por centrifugação e ainda mais cultivadas com a densidade inicial descrita acima em meio fresco.

Células HEK293, HEK293-T (ATCC# CRL-11268) e HeLa foram cultivadas no meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagles Medium (Advanced D-MEM, Invitrogen #12491-015) com 10% de soro fetal bovino de modo aderente em placas de cultura celular. As células HEK293-T foram gradualmente adaptadas ao crescimento em suspensão isenta de soro em meio 293-SFMII, e cultivadas em frascos de agitação a 100 rpm, 37°C, 95% de umidade do ar e 8% de CO2.

b. Amniócitos primários

Os amniócitos primários foram obtidos dentro do quadro de uma punção de líquido amniótico, de acordo com métodos rotineiros correspondentes. Deste punção foram cultivados 1-2 ml_ com 5 ml_ de meio Ham’s F10 Medium (Invitrogen #31550-023), 10% de soro fetal bovino, 2% de Ultroser G (CytoGen GmbH), 1 x antibiótico/antimicótico (Invitrogen #15240-062) a 37°C, 95% de umidade do ar e 5% de CO2 em placas de cultura celular Primaria de 6 cm (Falcon). Depois de 4-6 dias os amniócitos começaram a se tornar aderentes e foram acrescentados 3 ml_ de meio fresco acrescido de aditivos (veja frase anterior). Se as células estivessem totalmente aderentes, 0 meio era retirado e substituído por 5 ml_ de meio fresco com aditivos. Para a passagem seguinte as células confluentes foram lavadas com PBS, diluídas com tripsina (TrypleSelect, Invitrogen #12563011) e transferidas em 10 e 25 ml_ de meio fresco acrescido de aditivos para placas de 10 cm e 15 cm, respectivamente.

4. Transformação de amniócitos primários a. Transfecção

Os amniócitos primários cultivados (veja 3b) foram transformados com cada um dos plasmídeos pSTK146, pGS119 ou pGS122. Neste ínterim, cada um dos plasmídeos foram linearizados por meio de digestão com enzimas de restrição adequadas (pSTK146, pGS119: Seal; pGS122: Pmel). Antes da transfecção os amniócitos foram gradualmente adaptados ao meio Opti-Pro (Invitrogen #12309-019) com Ultroser a 2%. Para tal fim as células foram combinadas sempre depois de cada 2-3 dias com meio fresco Ham’s F10 Medium (com aditivos veja 3b) acrescido de meio Opti-Pro Medium (com Ultroser a 2%) numa relação de 75:25%, 50:50%, 25:75% e 0:100%. Para a transfecção as células de uma placa de 15 cm com 80% de confluência foram distribuídos em seis placas de 6 cm, 0 que correspondeu a uma contagem de células de 5-7 x 105 células por placa. NO dia seguinte as células em cada uma das cinco placas foram transfectadas com 2 pg de pSTK146, pGS119 ou pGS122 linearizadas como emprego de reagente de transfecção Effectene (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Uma placa foi ainda cultivada como controle sem ter sido trans- fectada. No seguinte dia as células foram lavadas com PBS dissolvidas com TrypleSelect e cada uma delas transferida a uma placa de 15 cm. As células foram cultivadas durante outros 10-15 dias, sendo 0 meio substituído a cada 3-4 dias por meio fresco. Durante este tempo reduziu-se a adição de Ultroser para 1%. Depois de aproximadamente 10-15 dias as células estavam confluentes e foram transferidas, conforme descrito acima para cada duas placas de 15 cm.

b. Isolamento de clone celular transformado

Algumas semanas depois da transfecção todas as ilhas de células clonais em todas as transfecções foram observadas, e se distinguiam nitidamente morfologicamente dos amniócitos não transformados. Estas ilhas de células foram coletadas e transferidas para placas de 24 poços (corresponde a passagem 1). As células foram ainda multiplicadas e foram transferidas primeiro para placas de 6 cm e em seguida para placas de 15 cm. A expressão de proteínas E1 nas linhagens de células clonais respectivas foi provada em análises por Western Blot com o emprego de anticorpos monoclonais (veja 2b).

A produção de linhagens de células que exprimem antígeno T com base em linhagens de amniócitos transformado será descrita a seguir a título de exemplo para uma linhagem de células originadas de transfecção com pGS119 (denominada doravante linhagem de células GAP). Depois do isolamento e da expansão das ilhas de células clonais foram produzidas linhagens geneticamente uniformes a partir dos clones de células, por clonagem de células individuais em processo denominado “limited-dilution-\/erfahren”. Foi composta para tal uma célula do clone a ser clonado e disposta em um poço de uma placa de 96 poços e a expansão real de uma única célula foi controlada microscopicamente no decorrer dos dias seguintes. As linhagens que se originaram das células individuais foram gradualmente expandidas até placas de 15 cm. Por diluição gradual do meio de cultura Opti-Pro/1 % de Ultroser com meio 293SMFII Medium as células foram adaptadas a um crescimento em suspensão em meio isento de soro. As linhagens de células individuais foram examinadas para expressão de proteína estável e transitório e altas densidades de crescimento, sendo um clone com as melhores qualidades selecionado e em seguida novamente empregado.

5. Produção de Combinação de células que expressam o antígeno T

As 1 x 107 células GAP (que se originaram da transfecção de amniócitos com o plasmídeo pGS119, adaptadas a crescimento em suspensão em meio isento de soro) foram transfectadas com 5 pg cada de DNA de plasmídeo pGS158, pGS159, e pGS161, e foram cultivadas em reatores de laboratório em condições descritas acima. A células transfectadas estáveis durante a seleção foram acrescentados, 48 horas depois da transfecção, 5 pg/mL de blasticidina e as células continuaram a ser cultivadas até se produzirem conjuntos de células de crescimento estável depois de 3-4 semanas. Os conjuntos de células receberam a designação Z582 (transfecção com pGS158, antígeno T expresso pelo promotor CAG), Z583 (transfecção com pGS159, antígeno T expresso pelo promotor RSV) e Z597 (transfecção com pGS161, antígeno T expresso pelo promotor CMV). Como é desconhecido se uma concentração aumentada de antígeno T seja eventualmente tóxica para células CAP, ten- tou-se exprimir o antígeno T com o auxílio de promotores de intensidades diferentes. Pode ser mostrado que a expressão de uma proteína de referência em células CAP é interrompida ao máximo com o emprego de promotor CMV, ligeiramente mais fraca com o promotor CAG e nitidamente mais fraca com o promotor RSV. Como todos os tres promotores puderam ser gerados conjuntos de crescimento estável, e todos os tres conjuntos de células expressavam antígeno T intracelular.

6. Expressão transitória de proteína em células CAP e CAP-T

O fragmento ori de 359 pb empregado aqui contém em comparação com o ori mínimo de 63 pb de comprimento, além desta sequência “Core” ainda e sequências de repetição de 21 pb e de 72 pb (SEQ ID NO: 11). Estas duas sequências de repetição são principalmente importantes para a função do promotor que se sobrepõe à ori, no entanto existem indicações de que elas também reforçam a replicação de DNA de SV40 (Chandrasekharap- pa e Subramanian, J. Virol., 61,2973-2980, 1987).

Para se testar se a concentração de antígeno T na célula tem uma influência sobre a expressão de uma proteína de referência, foram testados tres conjuntos de células Z582, Z583 e Z597, que expressam o antígeno T sob o efeito de promotores de diferentes intensidade, e comparados com a expressão transitória em células CAP que não exprimem o antígeno T. Para tal fim 1 x 107 células foram transfectadas com o plasmídeo pGS151 circular com o auxílio de tecnologia de nucleofector (Amaxa/Lonza, Programm X-001, tampão V) e foram cultivadas em um volume inicial de 12 ml_. Tres e seis dias depois da transfecção o meio foi trocado, elevando-se então no dia D também o volume para 15 ml_. A partir do terceiro ao sétimo dia inclusive, depois da transfecção e no nono dia depois da transfecção foi extraída de cada um uma alíquota que determina o número de célula e a expressão de hAAT foi determinada com o auxílio do método ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) com o emprego de anticorpos anti-hAAT policlonais (não acoplados e acoplados a HRP; ICN Biomedicals). Como controle foi empregado hAAT purificado proveniente de plasma humano (ICN Biomedicals).

O resultado deste experimento é ilustrado graficamente na Figura 3. Em todos os conjuntos de células CAP-T foi obtida uma expressão transitória mais elevada em comparação com as células CAP. A expressão transitória em Z582 se encontra 8 vezes acima, em Z583 25 vezes acima e em Z597 70 vezes acima da das células CPA. Um segundo conjunto de células CAP-T com expressão de antígeno T resultante de promotor CMV produziu também uma expressão elevada comparável à de Z597. Estes dados indicam que tanto a expressão de antígeno T permanente em células CAP como também a intensidade da expressão de antígeno T tem uma influência na intensidade da expressão transitória.

Em um outro experimento foram determinadas as intensidades de expressão transitória de hAAT no conjunto de células Z597 depois da transfecção transitória do plasmídeo pGS116 ou pGS151. Estes dois plasmídeos se distinguem somente pela presença do fragmento ori de SV40 em pGS151. A transfecção e a análise quantitativa de hAAT foram conduzidos conforme já foi descrito acima, foi determinada tanto a intensidade de expressão de hAAT como também o desenvolvimento do número de células vivas durante o período de testes de 9 dias. O resultado deste teste é graficamente ilustrado na Figura 4. A presença do fragmento ori de SV40 no plasmídeo de expressão leva a uma expressão transitória 30 vezes maior. Ao todo puderam ser expressos por transfecção de 1 x 107 células CPA-T, dentro de 9 dias, 2,5 mg de hAAT em um volume de 40 ml_, o que corresponde a um rendimento de expressão de aproximadamente 60 mg/L e até 40 pg/célula/dia. Aproximadamente 3 dias depois da transfecção foi interrompido o crescimento das células, a vitalidade das células permaneceu ainda durante todo o período do teste acima de 80%.

Para se demonstrar que este rendimento de expressão transitória não é específico a hAAT, foi expressa de modo transitório uma outra proteína extremamente glicosiladas a eritropoietina (Epo) em células CAP-T. Tal como foi descrito para hAAT, foram transfectadas 1 x 107 células CAP-T a partir do conjunto de células Z597 com o plasmídeo pGS177 (contém o cassete de expressão de epo e o fragmento ori de SV40) e quantificou-se Epo no sobrenadante de cultura de células por meio de ELISA (R&DSystems, Quantikine IVD, Human Epo Immunoassay, DEP00) Duro período de teste de 7 dias puderam ser expressos 0,73 mg de Epo com um rendimento de expressão de 32 mg/L.

7. Comparação com a expressão transitória em outros sistemas de células

Uma linhagem de células humanas já descrita antes, a linhagem de Células HEK293-T, exprime de modo estável o antígeno T de SV40 e é baseada na linhagem de células HEK293 humana transformada por adenovirus (DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7, 379-387, 1987). Em comparação com Z597 foram transfectadas 1 x 107 células HEK293-T (meio isento de soro, cultura em suspensão) com 5 pg de plasmídeo circular pGS151 com o auxílio de Tecnologia de nucleofector Amaxa de acordo com instruções do produtor (Pro- gramm X-001, Tampão V) e foram cultivadas. O resultado deste experimento é ilustrado graficamente na figura 5. Embora o número de células 293-T no dia 9 fosse nitidamente mais elevado do que com CAP-T, a expressão transitória em CAP-T em comparação com 293-T era de aproximadamente 40 vezes mais elevada.

8. Ensaio de replicação

Em um ensaio de replicação devia ser demonstrado se a expressão de ant T em células CAP-T levou a um número elevado de cópias do plasmídeo de expressão que contém ori, e deste explica a expressão de proteína transitória nitidamente elevada. Para tal fim células de Z597 e de HEK293-T foram transfectadas respectivamente com os plasmídeos pGS116 e pGS151 e cultivadas conforme descrito acima. Depois de 6, 12, 24, 48, 72 e 96 horas foram de cada uma delas retiradas 1 x 105 células, que foram centrifugadas e absorvi- das em PBS e foram submetidas a lise por acréscimo de urn volume igual de NaOH a 0,8N. Os Usados celulares foram testados em um aparelho SlotBlot sobre uma membrana de náilon de carga positiva (GE Healthcare, Hybond-N+). Para controle foram acrescentadas quantidades crescentes de plasmídeos pGS116 e pGS151 às 1 x 105 células Z597, sendo estas submetidas a lise, como descrito acima, e absorvidas. Este padrão correspondeu a 1000, 2500, 5000, 10000 e 15000 cópias por célula. O DNA foi fixado depois de incubação da membrana a 120°C e com a ajuda de uma sonda de PCR marcada de modo não radioa-tivo a partir de cDNA de hAAT de acordo com instruções do fabricante (AlkPhos Direct Labelling and Detection System, GE Healthcare, RPN 3680 e 3682) fol tornado visível. O número de cópias em células transfectadas com pGS 116 e com pGS 151 foi determinado com base na concentração conhecida do plasmídeo padrão. O resultado deste ensaio de replicação é ilustrado graficamente na figura 6. Conforme era de se esperar, somente pGS 151, mas não pGS 116 se replicou em CAP-TZ597. Com um número de células que permanece constante, o número de cópias de pGS151 subiu de aproximadamente 1500 cópias/célula 6 horas depois de transfecção para quase 7.000 cópias/célula 72 horas depois da transfecção. Por outro lado o número de cópias de pGS151 em HEK293-T depois de 96 permanece constante. Como o número de células 293-T durante este período de tempo foi dobrado, pode-se depreender de uma replicação fraca de pGS151 nestas células que ele se encontra, no entanto, nitidamente abaixo da taxa de replicação de Z597.

A prova da expressão de antígeno T nas linhagens de amniócitos e de células HEK293-T foi conduzida por meio de análise por Western Blot. Dos tres conjuntos de células CAP-T e das células HEK293-T foram absorvidas 1 x 106 células cada em 50 pL de Tris a 50 mM/HCI, pH 8, NaCI a 140 mM, NP40 a 0,5%, EDTA a 4 mM, EGTA a 2 mM, PMSF a 0,5 mM, glicerol a 5%, e foram incubadas sobre gelo durante 30 minutos. A mistura de proteínas foi centrifugada durante 10 minutos a 13.000 rpm e a concentração de proteínas no sobre- nadante foi determinada com a ajuda de um kit de determinação de proteínas (Coomassie, Bradford, Thermo Life Science # 23200). Sobre um gel de poliacrilamida de SDS a 12% foram separadas respectivamente 10 pg de proteína, sendo transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) e foram tornadas visíveis com a ajuda de um anticorpo específico a antígeno T (Abeam, antígeno T anti-SV40 ab 16879). Com este experimento pôde ser demonstrado que em Z597 é expresso mais antígeno T do que nos dois outros conjuntos e do que em células HEK293-T.

9. Transfecção com polietileno imina

Como o método de transfecção descrito acima somente pode ser graduado em de-terminadas condições, foi testado um outro reagente de transfecção, a polietileno imina (PEI, Polysciences, # 23966), que foi descrita principalmente para transfecções em grande escala PEI linear (peso molecular = 25.000) foi dissolvido de acordo com instruções do fa- bricante com uma concentração de 1 mg/mL e empregado numa relação de DNA:PEI = 1:3. Para a transfecção 10 pg de pGS 151 foram misturados com 30 pg de PEI, incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente e adicionados a 1 x 107 células CAP-T Z597 em 6 ml_ de meio FreeStyle-Medium (Invitrogen #12338-018). Depois de 5 horas foram acrescen- 5 tados 6 ml_ de meio 293-SFMII e as células foram incubadas durante 7 dias. Tres dias depois da transfecção o meio foi trocado por 293-SFMII e devido ao crescimento intenso das células, o volume foi elevado para 30 ml_. O resultado deste experimento é ilustrado na Figura 7. Com a transfecção com PEI foi atingida uma expressão transitória de proteína elevada em CAP-T. Aliás, o rendimento máximo de proteína se encontrava aproximadamente 2 10 vezes abaixo da expressão atingida com a nucleofecção. É notável o fato de que as células, depois da transfecção com PEI, crescem nitidamente com uma maior rapidez e intensidade, e depois de 7 dias é atingida uma contagem de células de aproximadamente 10 vezes a obtida com a nucleofecção.

Claims (9)

1. Processo para a produção de uma linhagem de células amniócitos humanas permanentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) transfecção de células aminióciticas humanas primárias com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B, e b) transfecção subsequente da linhagem de células aminióciticas humanas perma-nentes obtidas na etapa a) com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma se-quência de ácidos nucleicos que codifica para o Antígeno T grande de SV40 (SEQ ID NO: 4) ou para o Antígeno-1 Nuclear de Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) (SEQ ID NO: 8).

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos que codifica para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B é derivada de um adenovirus humano.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o adenovirus humano é o sorotipo 5 do adenovirus humano.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos que codifica para as funções genéticas adenovirais E1A e E1B compreende os nucleotídeos 1 a 4344 (SEQ ID NO: 1), 505 a 3522 (SEQ ID NO: 2) ou os nucleotídeos 505 a 4079 (SEQ ID NO: 3) do sorotipo 5 do adenovirus humano.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o antígeno T grande de SV40 compreende ainda a sequência de ácidos nucleicos para um promotor selecionado do grupo de promotor CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG e promotor RSV, a sequência de ácidos nucleicos para SV40 SD/AS (íntron) (SEQ ID NO: 6) e a sequência de ácidos nucleicos para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7), e a sequência de ácidos nucleicos para o antígeno-1 nuclear do Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) compreende ainda a sequência de ácidos nucleicos para um promotor selecionado do grupo promotor CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG e promotor RSV, a sequência de ácidos nucleicos para SV40 SD/AS (íntron) (SEQ ID NO: 6) e a sequência de ácidos nucleicos para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7).

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que, em vez da etapa a), são empregadas linhagens de células humanas aminióciticas já imortalizadas.

7. Processo para a expressão transitória de polipeptídeos e proteínas recombinantes com o emprego de uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o processo CARACTERIZADO por compreender as seguintes etapas: a) a transfecção da linhagem de células humanas aminióciticas permanentes com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um polipeptídeo ou proteína recombinante desejado e um sítio de reconhecimento ou de ligação para o antígeno T grande de SV40 (SEQ ID NO: 4) ou para o antígeno- 1 nuclear do Vírus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) (SEQ ID NO: 8), b) a cultura da linhagem de células humanas aminióciticas permanentes transfecta- das obtidas na etapa a) sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo ou proteína recombinante desejada, e em seguida c) o isolamento do polipeptídeo ou proteína recombinante desejado a partir das células ou do sobrenadante da cultura.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo ou proteína recombinante é um hormônio, um fator plasmático, um fator de coagulação sanguínea, um fator de crescimento, um receptor celular, uma proteína de fusão, um receptor de coxsackie e adenovirus (CAR), um anticorpo, um antígeno virai, bacte- riano ou parasitário, ou fatores de complementação para a produção de vírus recombinan- 15 tes.

9. Emprego de uma linhagem de células humanas aminióciticas permanentes obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um polipeptídeo ou proteína.

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