BRPI1009752B1 - Vetor de expressão ou uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão e métodos para sua produção e sua seleção, bem como processo para produzir um produto de interesse e uso de um meio de cultura seletivo - Google Patents

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Abstract

vetor de expressão ou uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão e métodos para sua produção e sua seleção, bem como processo para produzir um produto de interesse e uso de um meio de cultura seletivo a presente invenção refere-se a um vetor de expressão ou a uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão compreendendo pelo menos (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse ou um local de inserção para incorporar um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm i); (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm ii), o qual é diferente do primeiro marcador de seleção (sm i), em que a atividade de um marcador de seleção (sm i) ou (sm ii) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção e no qual os marcadores de seleção (sm i) e (sm ii) estão envolvidos no metabolismo do folato. a invenção refere-se também a células hospedeiras adequadas, aos métodos de seleção e aos métodos para a produção de polipeptídeos com alto rendimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR DE EXPRESSÃO OU UMA COMBINAÇÃO DE PELO MENOS DOIS VETORES DE EXPRESSÃO E MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO E SUA SELEÇÃO, BEM COMO PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE INTERESSE E USO DE UM MEIO DE CULTURA SELETIVO".
Campo da Invenção [001 ] A presente invenção refere-se a um novo sistema de seleção adequado para selecionar as células hospedeiras, em particular, as células hospedeiras de mamíferos, expressando um produto de interesse. O dito sistema de seleção é baseado no uso de pelo menos dois marcadores de seleção (sm I e sm II) em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção. A presente invenção refere-se a vetores de expressão adequados, células hospedeiras e métodos para a seleção de células hospedeiras expressando um produto de interesse com um alto rendimento. Além disso, a presente invenção pertence a um método para produzir polipeptídeos, de forma eficiente, com um alto rendimento. Antecedentes da Invenção [002] A capacidade de clonar e expressar os produtos de interesse, tais como os peptídeos e as proteínas recombinantes em grandes quantidades tem se tornado cada vez mais importante. A capacidade de purificar altos níveis de proteínas é importante no campo farmacêutico e de biotecnologia humana, por exemplo, para a produção de produtos farmacêuticos de proteínas, bem como na definição de pesquisa básica, por exemplo, para cristalizaras proteínas para permitir a determinação de sua estrutura tridimensional. As proteínas que são de outra forma difíceis de serem obtidas em quantidade podem ser sobre-expressas em uma célula hospedeira e, posteriormente, isoladas e purificadas.
[003] A escolha de um sistema de expressão para a produção de proteínas recombinantes depende de muitos fatores, incluindo as características de crescimento da célula, os níveis de expressão, a expressão intracelular e extracelular, as modificações pós-translacionais e a atividade biológica da proteína de interesse, bem como as questões regulatórias e as considerações econômicas na produção de proteínas terapêuticas. As principais vantagens das células de mamíferos mais outros sistemas de expressão, tais como bactérias ou leveduras, são a capacidade de realizar o dobramento adequado de proteínas, a glicosilação do complexo ligado a N e a glicosilação autêntica ligada a O, bem como um amplo espectro de outras modificações pós-translacionais. Devido às vantagens descritas, as células eucarióticas e, em particular, as células de mamíferos são atualmente o sistema de expressão de escolha para a produção de complexos de proteínas terapêuticas, tais como os anticorpos monoclonais.
[004] A abordagem mais comum para obter a alta expressão de células hospedeiras (também chamadas de altos produtores) gera um vetor de expressão adequado para expressar o produto de interesse, como uma primeira etapa. O vetor de expressão conduz à expressão do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse na célula hospedeira e fornece, pelo menos, um marcador de seleção para gerar a linhagem de célula recombinante. Os elementos principais dos vetores de expressão de mamífero costumam incluir um promotor constitutivo ou induzido capaz de atividade transcricional robusta; processamento de mRNA otimizado e sinais de translação, que geralmente incluem uma sequência de Kozak, um códon de terminação translacional, a divagem do mRNA e os sinais de poliadenilação, uma transcrição do terminal e os marcadores de seleção para a preparação de linhagens de células estáveis e para a amplificação do gene; além disso, uma origem procariótica de replicação e de marcadores de seleção para a propagação de vetores em bactérias pode ser fornecida por meio do vetor de expressão.
[005] Nos últimos anos, o foco do desenvolvimento foi concentrando-se no design de vetores melhorados para a expressão do gene em células hospedeiras e, em particular, células de mamíferos. Apesar da infinidade de vetores disponíveis, no entanto, a produção de polipeptídeo/proteína robusto com um alto rendimento em células de mamíferos ainda é um desafio.
[006] Um procedimento estabelecido para a obtenção de alta produção de linhagens de células expressando o produto de interesse com alto rendimento é a transfecção estável das células hospedeiras. No entanto, a integração estável no genoma é um evento raro e apenas um pequeno subconjunto de células transfectadas estavelmente são alto produtores.
[007] Os marcadores de seleção e os sistemas de seleção são amplamente utilizados na engenharia genética, na tecnologia de DNA recombinante e na produção de produtos recombinantes a fim de obter as células hospedeiras que expressam o produto de interesse com alto rendimento. Os respectivos sistemas também são úteis para gerar e para identificar os clones estavelmente transfectadas. O principal objetivo do uso de marcadores de seleção e dos respectivos sistemas de seleção consiste em introduzir um gene de seleção que após a exposição a condições de crescimento seletivo permite a identificação de células capazes de alto nível de produção do produto recombinante de interesse. O aumento do rendimento do produto de expressão pode ser, por exemplo, alcançado por meio da amplificação do gene usando linhagens de células, por exemplo, deficientes em uma enzima, tal como a redutase de di-hidrofolato (DHFR) ou a sintetase de glutamina (GS) em conjunto com vetores de expressão contendo os genes que codificam estas enzimas e agentes do marcador de seleção, tais como o metotrexato (MTX), que inibe a DHFR, e metionina sulfoxamina (MSX), que inibe a GS. Também as formas mutantes mais sensíveis dos respectivos marcadores de seleção podem ser usadas em conjunto com as células do tipo selvagem. Usando os vetores de expressão contendo o gene recombinante sob controle de um promotor forte e genes que codificam os marcadores de seleção, tais como DHFR ou GS, transfectantes da DHFR+ (positiva) ou GS+ (positiva), respectivamente, são os primeiros obtidos e a amplificação do gene é então obtida por meio do crescimento dos transfectantes em concentrações de MTX ou MSX aumentando progressivamente. O objetivo de proporcionar tal pressão de seleção é para isolar as células que expressam os marcadores de seleção e, consequentemente, o produto de interesse com um alto rendimento.
[008] Portanto, um sistema de seleção de alto rigor é crucial para enriquecer a alta produção de células a partir da população transfectada. Quanto maior o rigor do sistema de seleção, menor será o número de produtores em baixa após o processo de seleção e maior a chance de encontrar a produção bem rara ultra-alta de clones.
[009] É o objetivo da presente invenção fornecer um sistema de seleção rigoroso para a seleção de células hospedeiras produzindo um produto de interesse com alto rendimento, bem como os vetores de expressão adequados e as células hospedeiras.
Sumário da Invenção [0010] A presente invenção refere-se a um sistema de seleção para a seleção de células hospedeiras expressando um produto de interesse com um alto rendimento e a produção de produtos respectivos, em particular, os polipeptídeos.
[0011 ] De acordo com uma modalidade, a presente invenção refere- se a um vetor de expressão ou a uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão compreendendo pelo menos (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse ou um local de inserção para incorporar um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), que difere do primeiro marcador de seleção (sm I), [0012] Em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção e, em que, os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos no metabolismo do folato.
[0013] A presente invenção também refere-se a uma célula hospedeira, em particular, uma célula hospedeira de mamíferos, incluindo pelo menos (a) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (c) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I); em que a atividade de um marcador de selação (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção e em que os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos no metabolismo do folato.
[0014] Além disso, um método é fornecido para selecionar pelo menos uma célula hospedeira capaz de expressar um produto de interesse, compreendendo (a) proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras, incluindo pelo menos (i) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (ii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (iii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I); em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção e em que os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos no metabolismo do folato; (b) cultivar a dita pluralidade de células hospedeiras em condições de crescimento seletivas para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II), obtendo assim uma célula hospedeira que expressa o produto de interesse.
[0015] Também é fornecido um meio de cultura seletivo, que pode ser usado no método de seleção de acordo com a presente invenção, o qual compreende o folato em uma concentração limitante e um antifolato. O termo "meio de cultura seletivo" é um meio de cultura de célula útil para a seleção das células hospedeiras.
[0016] A presente invenção também refere-se a um processo para produzir um produto de interesse, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção, ou uma célula hospedeira selecionada de acordo com os ensinamentos da presente invenção em condições que permitam a expressão do produto de interesse.
[0017] A presente invenção também refere-se ao uso de um primeiro marcador de seleção (sm I) em combinação com um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I). A atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção, para selecionar uma célula eucariótica, em particular, uma célula hospedeira de mamífero que expressa um produto de interesse. Os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) são de preferência envolvidos no mesmo ou em um processo metabólico concertado ou em uma via essencial para a viabilidade da célula ou a proliferação da célula. De preferência, os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos no metabolismo do folato.
[0018] A estratégia da presente invenção para usar dois marcadores de seleção (sm I) e (sm II) em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção e em que ambos os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos na mesma via metabólica essencial para a viabilidade das células ou resultados da proliferação da célula em condições de seleção muito rigorosas. Isso será explicado aqui na base da concretização preferida no qual ambos os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão envolvidos no mecanismo de folato. O metabolismo do folato é uma via metabólica essencial que é crucial para a sobrevivência e crescimento da célula. Como a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) influencia a atividade do outro marcador de seleção e ambos os marcadores de seleção estão envolvidos no metabolismo do folato, as funções de metabolismo do folato em condições de cultura seletivo só é eficaz, se ambos os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) forem expressos em quantidades suficientes e, por conseguinte, são expressos com um alto rendimento na célula hospedeira destinatária. Portanto, a pressão de seleção sobre a célula hospedeira é notavelmente aumentada.
[0019] Em uma modalidade preferida, a qual também explica como a atividade de um marcador de seleção (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade de um marcador de seleção (sm I), o marcador de seleção (sm I) é composto por um polipeptídeo transportador, o qual incorpora um folato na célula hospedeira. O marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico processando como substrato o folato incorporado por meio de um marcador de seleção (sm I) ou um produto subsequentes obtido ou gerado a partir do dito folato importado. Um exemplo preferido de um polipeptídeo respectivo catalítico é DHFR. Acredita-se que nesta modalidade, o segundo marcador de seleção (sm II) funciona com maior eficiência ou uma maior taxa de volume de negócios, se o transportador de folato (sm I) incorpora uma quantidade suficiente de folato para as células hospedeiras. Sem estar vinculado a teoria, acredita-se que uma forte expressão do transportador de folato como primeiro marcador de seleção (sm I) permite que as células hospedeiras importem mais folato a partir do meio de cultura em que a célula e, consequentemente, permite que as células hospedeiras tolerem menores concentrações de folato no meio de cultura. Uma forte expressão do transportador de folato (sm I) que resulta em substrato suficiente para o polipeptídeo catalítico (sm II) (ou precursor do dito substrato) é importada para a célula hospedeira e, portanto, está disponível para o polipeptídeo catalítico (sm II). Dessa maneira, a atividade do polipeptídeo catalítico (sm II) é influenciada por meio da atividade do transportador de folato (sm I), como a atividade do polipeptídeo catalítico (sm II) depende de que uma quantidade suficiente de folato seja importada para a célula hospedeira por meio do transportador de folato (sm I). Portanto, a viabilidade das células é mantida/acrescida no caso de que a célula hospedeira fortemente expressa o primeiro marcador de seleção (sm I) e, dessa maneira, importa quantidades suficientes de folato na célula, a fim de manter o metabolismo do folato, mesmo se a concentração de folato no meio de cultura seja muito baixa. Devido à atividade do transportador de folato (sm I), a disponibilidade do substrato para o polipeptídeo catalítico (sm II) é aumentada. O meio de cultura seletivo pode incluir um inibidor do polipeptídeo catalítico (sm II), por exemplo, um concorrente ou seu substrato real. As células fortemente expressando o polipeptídeo catalítico (sm II) tolera altas concentrações do dito inibidor, especialmente em altas concentrações de substrato, a dita concentração sendo pelo menos parcialmente dependente da atividade do transportador de folato utilizado como marcador de seleção (sm I). Este acoplamento da funcionalidades/atividade dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) tem o efeito de que a viabilidade da célula hospedeira e/ou a taxa de crescimento é consideravelmente maior em condições de cultura seletivas, se ambos os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) forem fortemente expressos. As células hospedeiras sobrevivem/proliferam que, apesar das condições de cultura seletivas podem manter o metabolismo do folato de modo suficiente para permitir a sobrevivência e crescimento das células.
[0020] O design único do sistema de expressão de acordo com a presente invenção fornece um sistema de seleção muito rigoroso que permite o enriquecimento de altas células produtoras a partir da população transfectada da célula hospedeira. Este alto rigor do sistema de seleção de acordo com a presente invenção reduz o número de baixos produtores na população após a seleção e aumenta a chance de encontrar a bem rara ultra-alta produção de clones. Isso aumenta a produtividade da população de células sobreviventes seleção. Os exemplos mostram que as células hospedeiras obtidas com o sistema de seleção de acordo com a presente invenção produzem o produto de interesse com um alto rendimento.Também a produtividade média dos clones produtores individuais é aumentada. Dessa maneira, o sistema de seleção de acordo com a presente invenção aumenta as chances de encontrar os clones de alta produção com menor esforço de triagem. [0021] As premissas acima refletem o atual entendimento do mecanismo subjacente, mas não são, contudo vinculativas pois pode haver outras explicações para a dependência/aumento observada da pressão de seleção ao usar marcadores de seleção (sm I) e (sm II) que estão ambos envolvidos no metabolismo do folato. Além disso, como também é descrito na descrição detalhada, o princípio geral da presente invenção é também aplicável a outros processos metabólicos ou caminhos e outros marcadores de seleção (sm I) e (sm II). No entanto, é importante que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) seja pelo menos parcialmente influenciada e, em particular, depende da atividade do outro marcador de seleção, a fim de aumentar a pressão de seleção. Dessa maneira, outros objetivos, características, vantagens e aspectos do presente pedido de patente se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica da seguinte descrição e reivindicações em anexo. Deve ser entendido, no entanto, que a seguinte descrição, reivindicações em anexo, e os exemplos específicos, enquanto indicando as modalidades preferidas da aplicação, são dadas a título de ilustração apenas. Várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção descrita irão tornar-se facilmente perceptíveis para aqueles versados na técnica de ler o seguinte. Descrição Detalhada da Invenção [0022] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão ou uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão, incluindo pelo menos (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse ou um local de inserção para incorporar um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), que difere do primeiro marcador de seleção (sm I), em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção.
[0023] Um "marcador de seleção" (sm), que é expresso por meio do polinucleotídeo introduzido permite, sob condições seletivas de cultura apropriadas, a seleção de células hospedeiras expressando o dito marcador de seleção. Um marcador de seleção é de preferência uma biomolécula, em particular um polipeptídeo. Os marcadores de seleção adequados são descritos em detalhes abaixo.
[0024] O termo "vetor", de acordo com a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo capaz de transportar pelo menos um fragmento de polinucleotídeo. Um vetor funciona como um veículo molecular, fornecendo fragmentos de ácidos nucleicos, respectivamente polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Pode incluir pelo menos um cassete de expressão compreendendo as sequências regulatórias para expressar adequadamente um polinucleotídeo incorporado. Os polinucleotídeos (por exemplo, que codificam o produto de interesse ou os marcadores de seleção) para serem introduzidos na célula podem ser inseridos no (s) cassete (s) de expressão do vetor, a fim de serem expressos a partir deles. O vetor, de acordo com a presente invenção, pode estar presente em uma forma circular ou linear (izada) e também engloba os fragmentos do vetor. O termo "vetor" também compreende os cromossomos artificiais ou polinucleotídeos similares respectivos permitindo a transferência de fragmentos de ácido nucleico estrangeiros.
[0025] O termo "polinucleotídeo" refere-se a um polímero de nucleotídeos, os quais são geralmente ligados a partir de uma ou desoxirribose ou ribose para outro e refere-se ao DNA, bem como RNA, dependendo do contexto. O termo "polinucleotídeo" não compreende nenhuma das restrições de tamanho e também engloba os polinucleotídeos compreendendo as modificações, em particular, os nucleotídeos modificados.
[0026] O termo um "polinucleotídeo introduzido" refere-se a um polinucleotídeo que foi introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, pelo uso de técnicas recombinantes tais como a transfecção. A célula hospedeira pode ou não incluir um polinucleotídeo endógeno correspondente a, respectivamente, sendo idêntico ao polinucleotídeo introduzido. A introdução pode ser conseguida por exemplo, por meio da transfecção de um vetor adequado que pode integrar no genoma da célula hospedeira (transfecção estável). Os vetores adequados permitindo a introdução de polinucleotídeos dentro da célula hospedeira são descritos em detalhes abaixo. No caso do polinucleotídeo introduzido não ser inserido no genoma, o polinucleotídeo introduzido pode ser perdido na fase posterior, por exemplo quando as células sofrem mitose (transfecção transitória). Os vetores adequados também podem ser mantidos na célula hospedeira, sem integração no genoma, por exemplo, por meio da replicação epissomal. No entanto, outras técnicas também são conhecidas no estado da técnica para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira que são descritas em detalhe mais adiante.
[0027] O termo "produto de interesse" refere-se ao produto a ser expresso nas ditas células hospedeiras. O produto de interesse pode ser, por exemplo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo, tais como RNA. De preferência, o produto de interesse é um polipeptídeo, em particular, uma molécula de imunoglobulina. Os exemplos são descritos abaixo.
[0028] O termo "polipeptídeo" refere-se a uma molécula que compreende um polímero de aminoácidos ligados entre si por meio de ligação(ões) peptídica(s). Os polipeptídeos incluem polipeptídeos de qualquer comprimento, incluindo proteínas (por exemplo, possuindo mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, possuindo de 2 a 49 aminoácidos). Os polipeptídeos incluem proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade. Os exemplos adequados são descritos abaixo.
[0029] O recurso, que a "atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção" particularmente significa que a atividade de um marcador de seleção é influenciada por meio de e/ou depende de pelo menos até certo ponto, direta ou indiretamente, na atividade, respectivamente, funciona do outro marcador de seleção (e, opcionalmente, vice-versa). O termo "atividade", neste contexto, particularmente, descreve qualquer função ou ação de um marcador de seleção que fornece, promove e/ou aumenta a resistência à pressão seletiva e inclui, mas não se limita à, atividade catalítica, a taxa de rotatividade, a taxa de reação cinética e/ou a taxa de transporte de um marcador de seleção. Esta dependência/interação dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) pode aumentar consideravelmente a pressão de seleção sobre a célula hospedeira em condições de cultura seletivas. De preferência, o marcador de seleção (sm I) e um marcador de seleção (sm II) estão envolvidos no mesmo ou em um processo metabólico concertado ou o caminho essencial para a viabilidade das células ou das proliferação. Os exemplos adequados dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) e os processos metabólicos e os caminhos são descritos em detalhes abaixo.
[0030] Posteriormente, descreveu-se as modalidades e as vantagens do vetor de expressão ou as combinações de vetores de expressão de acordo com a presente invenção. Quando apropriado, descreveu-se essas vantagens em conjunção com o uso do(s) dito(s) vetor(es) de expressão na seleção de células hospedeiras expressando o produto de interesse.
[0031] De acordo com os ensinamentos da presente invenção, a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (smsm II) é influenciada por meio de e, consequentemente, é pelo menos parcialmente dependente da atividade do outro marcador de seleção em condições de cultura seletivas para os dois marcadores de seleção.Devido a essa interação dos marcadores de seleção (sm I) e (smsm II), a pressão seletiva sobre as células hospedeiras é aumentada. Devido ao seu design único, um sistema de seleção muito rigoroso é fornecido permitindo o enriquecimento de alta produção de células a partir da população transfectadas da célula hospedeira. Este alto rigor do sistema de seleção de acordo com a presente invenção reduz o número de baixos produtores na população após a seleção e aumenta a chance de encontrar a bem rara ultra-alta produção de clones.
[0032] De acordo com uma modalidade preferida, os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) estão ambos envolvidos no processo metabólico, o qual é de preferência essencial para a viabilidade da célula e/ou proliferação; por exemplo, a síntese de ácidos nucleicos ou polipeptídeos. Dessa maneira, quando o vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão é introduzida na célula hospedeira destinatária, a atividade/presença dos ditos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) em conjunto com as condições de cultura seletivo influenciam/atacam o mesmo processo metabólico da célula hospedeira destinatária. Consequentemente, a atividade dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) influencia mutuamente, no prazo do dito processo metabólico, aumentando assim a pressão de seleção sobre a célula hospedeira. As células hospedeiras sobrevivem/proliferam em condições de cultura seletivas que, apesar das condições de cultura seletivas, podem manter suficientemente o dito processo metabólico, a fim de permitir a sobrevivência e o crescimento das células. A sobrevivência/crescimento é promovido, se as ditas células hospedeiras expressarem tanto os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) quanto, consequentemente, o(s) vetor(es) de expressão introduzido(s) com alto rendimento. Portanto, as células hospedeiras são selecionadas as quais também expressam o produto de interesse com alto rendimento.
[0033] O termo "processo metabólico" particularmente descreve um processo na célula hospedeira, o qual é essencial para a viabilidade da célula e/ou a proliferação da célula. Os exemplos de processos metabólicos são a síntese de ácidos nucleicos ou a síntese de polipeptídeos. O termo "via metabólica", em particular, refere-se a um subgrupo de um processo metabólico e descreve uma série definida de reacções químicas que ocorrem dentro de uma célula. Em cada via, uma substância química principal é modificada por meio das reações químicas. Um exemplo clássico de uma via metabólica é a síntese de nucleotídeos (que pertencem ao processo metabólico da síntese de ácido nucleico), em particular na biossíntese de purina ou de pirimidina, ou a síntese de aminoácidos (que pertencem ao processo metabólico da síntese de polipeptídeos). Existem vários níveis de vias metabólicas, os quais também são muitas vezes interdependentes e, portanto, conectados. Portanto, estes termos devem ser entendidos, preferidos funcionalmente como as vias metabólicas individuais e também os processos metabólicos que muitas vezes se sobrepõem.
[0034] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) estão envolvidos em um processo metabólico ou em uma via a qual é selecionada a partir a) a síntese de ácidos nucleicos e/ou a síntese de polipeptídeos, b) a síntese de nucleotídeos e/ou a síntese de aminoácidos, e c) o metabolismo do folato.
[0035] Os processos/vias metabólicos mencionados são importantes para manter a viabilidade da célula da célula hospedeira e/ou para a proliferação das células hospedeiraws. Portanto, elas são adequadas para os pontos de trabalho para o sistema de seleção de acordo com a presente invenção. Dessa maneira, estas vias metabólicas são muito adequadas para a escolha de marcadores de selação adequados envolvidos nele como marcador de seleção (sm I) e marcador de seleção (sm II) e condições de seleção adequadas permitindo a seleção de células hospedeiras expressando os ditos marcadores. Os marcadores de seleção adequados envolvidos nas vias metabólicas respectivas, bem como nas células hospedeiras adequadas e condições de seleção adequadas são conhecidos no estado da técnica e estão descritos abaixo e podem, dessa maneira, serem usados em conjunto com a presente invenção.
[0036] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) é um marcador de seleção de células eucarióticas. O termo "marcador de seleção de células eucarióticas" permite a seleção de células hospedeiras eucarióticas compreendendo expressar respectivamente o dito marcador de seleção. O dito marcador de seleção de células eucarióticas pode ser um marcador de seleção metabólico e, dessa maneira, um marcador que está envolvido em um processo metabólico ou caminho da célula, por exemplo, ácido nucleico ou síntese de polipeptídeos.
[0037] Além disso, o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) pode ser um marcador de seleção amplificável. Um marcador de seleção amplificável permite a seleção de um vetor contendo as células hospedeiras e promove a amplificação do gene. Os exemplos de marcadores de seleção respectivos amplificáveis são conhecidos no técnica anterior, tais como DHFR e GS.
[0038] O primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) pode ser um polipeptídeo catalítico ou um polipeptídeo transportador. Muitos marcadores de seleção respectivos adequados existem os quais podem ser usados em conjunto com a presente invenção e serão explicados em detalhes abaixo.
[0039] De acordo com uma modalidade, o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico processando (a) um substrato o qual é um composto que é incorporado por meio de um primeiro marcador de seleção (sm I) na célula hospedeira ou por meio de um produto subsequente obtido a partir do dito composto incorporado e/ou (b) um substrato o qual, ou um precursor do qual, é obtido por meio de uma atividade do primeiro marcador de seleção (sm I). [0040] Por isso, o dito polipeptídeo catalítico usado como um marcador de seleção (sm II) pode processar um substrato que é importado para a célula hospedeira por meio de uma atividade do primeiro marcador de seleção (sm I). Ele também pode processar um substrato que é produzido por meio de uma atividade do primeiro marcador de seleção (sm I). O dito composto que é, por exemplo, incorporado na célula hospedeira por meio do primeiro marcador de seleção (sm I) também pode ser um precursor do substrato real que é processado por meio do segundo marcador de seleção (sm II). Dessa maneira, o polipeptídeo catalítico (sm II) também pode processar um substrato que é um produto subseqüentes obtido a partir do composto que é incorporado à célula hospedeira por meio de uma atividade do primeiro marcador de seleção (sm I). O mesmo se aplica no caso de um marcador de seleção (sm I) que é um polipeptídeo catalítico em vez de um polipeptídeo transportador.
[0041] Sem estar vinculado à teoria, supõe-se que nesta modalidade, a atividade do segundo marcador de seleção (sm II) depende fortemente da atividade do primeiro marcador de seleção (sm I) sob condições de cultura seletivas para ambos os marcadores. A presença e/ou a quantidade de substrato para o segundo marcador de seleção (sm II) depende de, pelo menos, até certo ponto, da expressão/atividade adequada de um marcador de seleção (sm I). A superexpressão forte do primeiro marcador de seleção (sm I), leva a uma maior disponibilidade do substrato para o segundo marcador de seleção (sm II). A maior disponibilidade do substrato aumenta a atividade do segundo marcador de seleção (por exemplo, a taxa de rotatividade). No entanto, se o marcador de seleção (sm I) não é expresso com um rendimento suficiente, nenhum ou pouco substrato é gerado para o marcador de seleção (sm II), cuja atividade, consequentemente, também diminui.
[0042] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) é um polipeptídeo transportadorresponsável para a introdução/incorporação de um composto a partir do meio de cultura dentro da célula hospedeira, o qual é o substrato ou um precursor de um substrato do segundo marcador de seleção (sm II). De preferência, o dito composto é essencial para a viabilidade da célula e/ou para a proliferação. Acredita-se que nesta modalidade, o segundo marcador de seleção (sm II) funciona com maior eficiência, ou taxa de rotatividade, se o primeiro marcador de seleção (sm I) incorporar uma quantidade suficiente do dito composto nas células hospedeiras. Sem estar vinculado à teoria, acredita-se que uma superexpressão forte do primeiro marcador de seleção (sm I) permite que as células hospedeiras importem mais do dito composto a partir do meio de cultura na célula e, consequentemente, permite que as células hospedeiras toleem asr concentrações mais baixas dos ditos compostos no meio de cultura. Isto também leva a uma maior disponibilidade do dito composto e, portanto, o substrato (ou precursor do dito substrato) do segundo marcador de seleção (sm II) na célula hospedeira. Os mesmos princípios se aplicam no caso do primeiro marcador de seleção (sm I) ser um polipeptídeo catalítico produzindo um substrato ou um precursor de um substrato que é processado/utilizado por meio do segundo marcador de seleção (sm II). Esta hipótese reflete a atual compreensão do mecanismo subjacente, mas é, no entanto, não-ligada pois pode haver outras explicações para a dependência/aumento observado da pressão de seleção.
[0043] A atividade dos marcadores de seleção (sm I) ou (sm II) influencia a atividade do outro marcador de seleção e ambos alvejam o mesmo processo ou via metabólica em causa, por exemplo, a síntese de nucleotídeos ou o metabolismo do folato, o qual consequentemente funciona de forma mais eficaz em condições de cultura seletivas, se ambos os marcadores de seleção forem expressos em quantidades suficientes e, por conseguinte, são expressos com um alto rendimento na célula hospedeira. Isso resulta em condições de seleção altamente rigorosas.
[0044] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) opera a montante do segundo marcador de seleção (sm II). Isto significa que, por exemplo, dentro da mesma via metabólica ou concertada, o primeiro marcador de seleção (sm I) pode, por exemplo, operar no início dda dita via e que o segundo marcador de seleção (sm II) opera a jusante de um marcador de seleção (sm I).
[0045] De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende um polipeptídeo transportador. O termo "polipeptídeo transportador" é, em particular, um polipeptídeo que media a transferência de um composto a partir de um compartimento para outro, em particular, a partir do meio de cultura dentro da célula hospedeira. Os exemplos de polipeptídeos transportadores adequados incluem os polipeptídeos receptores, canais e transportadores.
[0046] Como um polipeptídeo transportador, o dito marcador de seleção (sm I) de preferência importa um composto dentro da célula hospedeira que está envolvido e/ou é essencial para a viabilidade da célula ou para a proliferação da célula hospedeira. Dessa maneira, a viabilidade a proliferação das células depende, pelo menos parcialmente da importação de tais compostos na célula hospedeira. O segundo marcador de seleção (sm II) usado em combinação com o polipeptídeo transportador (sm I) é de preferência uma enzima que está envolvida em uma via ou processo metabólico que é dependente/influenciado por meio de uma atividade transportadora do primeiro marcador de seleção (sm I), como faz, por exemplo, uso dos compostos importados ou um produto posterior do mesmo. Nesta modalidade, a atividade e, em particular, a taxa de volume do dito segundo marcador de seleção (sm II) depende, pelo menos parcialmente, da atividade do polipeptídeo transportador (sm I), o qual importa o dito composto dentro da célula hospedeira.Em conjunto com esta modalidade, um meio de cultura seletivo pode ser usado, o qual compreende uma concentração limitante do dito composto que é importado por meio do polipeptídeo transportador (sm I) na célula hospedeira.
[0047] O termo "concentração limitante" refere-se a uma concentração do dito composto no meio de cultura seletivo o qual oferece uma pressão seletiva sobre a célula hospedeira. Consequentemente, o dito composto não é compreendido no meio de cultura seletivo em abundância, proporcionando, assim, uma pressão de seleção sobre as células hospedeiras. Dessa maneira, o meio de cultura seletivo pode por exemplo, ser privado de, respectivamente, pode conter pequenas quantidades dos ditos compostos que são incorporados/transportados pelo polipeptídeo transportador (sm I) na célula.
[0048] Portanto, a viabilidade das células é mantida/acrescida no caso de que a célula hospedeira sobre-expressa o primeiro marcador de seleção (sm I) e, dessa maneira, importa as quantidades suficientes do dito composto dentro da célula, a fim de manter a via metabólica em causa, mesmo que a concentração de tais compostos no meio de cultura seja muito baixa. Se a expressão e, consequentemente, a atividade do polipeptídeo transportador (sm I) for aumentada, a disponibilidade do substrato para o segundo marcador de seleção (sm II) é aumentada. Quando o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico, o meio de cultura seletivo pode incluir um inibidor do dito segundo marcador de seleção (sm II), por exemplo, um concorrente do substrato real do segundo marcador de seleção (sm II). As células fortemente superexpressam o segundo marcador de seleção (sm II) que toleram as altas concentrações do dito inibidor, especialmente em altas concentrações de substrato (que é pelo menos parcialmente dependente da atividade de um marcador de seleção (sm I)). Isso tem o efeito de que a viabilidade da célula hospedeira é consideravelmente maior em condições seletivas, se ambos os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) forem fortemente expressos. Portanto, a taxa de expressão do produto de interesse é maior. Dessa maneira, o acoplamento da atividade/funcionalidade dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) resultam em condições de seleção muito rigorosas, que permitem a seleção de alta e também ultra-alta expressão de clones das células. O mesmo princípio se aplica no caso de que o primeiro marcador de seleção (sm I) é uma enzima envolvida na geração/produção do substrato para o segundo marcador de seleção (sm II) (vide acima).
[0049] De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro marcador de seleção (sm I) e o segundo marcador de seleção (sm II) estão envolvidos no metabolismo do folato. Um folato de acordo com a presente invenção pode, por exemplo ser um folato oxidado (isto é, ácido fólico) ou um folato reduzido ou um derivativo do mesmo. Em geral, um folato é útil dentro da presente invenção, desde que tal folato seja capaz de ser levado para uma célula hospedeira, em particular uma célula hospedeira de mamífero. O folato oxidado, isto é, o ácido fólico, bem como os derivados reduzidos de ácido fólico, conhecidos como folatos reduzidos ou tetra-hidrofolatos (THF), são um grupo de vitaminas B-9 que são cofatores e/ou coenzimas essenciais para a biossíntese de purinas, timidilato e certos aminoácidos em células eucarióticas, em particular dos mamíferos. Os cofatores de THF são particularmente cruciais para a replicação do DNA e, consequentemente, a proliferação da célula. Especificamente, cofatores de THF funcionam como doadores de unidades de um carbono de uma série de vias metabólicas interligados que envolvem a nova biossíntese das purinas e timidilato, aminoácidos, bem como metabolismo do grupo metila, incluindo a metilação da ilha CpG do DNA. Especificamente, os cofatores de THF que incluem 10-formil-THF (10-CHO-THF) contribuem com unidades de um carbono em duas reações de formiltransferase chave novas envolvidas na biossíntese das novas purinas. Um exemplo preferido de um folato oxidado é o ácido fólico. Exemplos preferidos de folatos reduzidos são ácido 5-metil-tetrahidrofólico, ácido 5-formil-tetrahidrofólico, ácido 10-formil-tetra-hidrofólico e ácido 5,10-metileno-tetrahidrofólico.
[0050] Em contraste com a maioria dos procariontes, plantas e fungos os quais sintetizam seus próprios folatos, mamíferos e outras espécies eucarióticas são desprovidos de biossíntese do cofator de THF e deve, portanto, obtê-los a partir de fontes exógenas, geralmente o meio de cultura. Três sistemas independentes de transporte são atualmente conhecidos para mediar a absorção de folatos e antifolatos em células de mamíferos: a) o sistema de transporte de célula predominante de cofatores de folato reduzidos é o carreador de folato reduzido (RFC). O RFC (também conhecido como família veículo de soluto de 19 membros 1, SLC19A1) é uma glicoproteína de membrana de ~ 85 kDa expressa de forma ubíqua funcionando como um veículo bidirecional facilitador que medeia o transporte trabalhoso de folatos reduzidos por meio da troca de fosfatos orgânicos, tais como nucleotídeos adenina, que são conhecidos por acumularem para níveis intracelulares muito elevados, bem como mono- e pirofosfato de tiamina RFC exibe uma alta afinidade para cofatores de THF incluindo leucovorina (5-formil-THF; Kt = 1 uM), enquanto abrigam apenas uma afinidade muito pobre de transporte (Kt = 2-400 mM) de ácido fólico, uma folato oxidado. b) outra via de absorção de folato é o transportador de folato acoplado aos prótons (PCFT, também conhecido como SLC46A), o qual foi recentemente clonado. PCFT parece ser expresso de forma independente do RFC, funciona de forma otimizada em pH acídico (5.5) e medeia a entrada de ambos os cofatores oxidados (ácido fólico, por exemplo) e de THF (isto é, folatos reduzidos), bem como vários antifolatos hidrofílicos incluindo MTX. PCFT, o qual mostra um meio de transporte ideal de folatos e antifolatos em pH acídico (5,5), mas nenhum em um pH fisiológico (7,4), tem um papel fundamental na absorção de ambos os folatos e antifolatos no intestino delgado. c) a terceira via de transporte envolve os receptores de folato (FRS). FRs são de alta afinidade de glicoproteínas de ligação ao folato codificados por três genes distintos FR alfa, FR beta e FR gama. FR alfa é também conhecido como Proteína de Ligação ao Folato Adulto ou FDP, como folato do Receptorl ou FOLR (em camundongos folbpl), e como antígeno associado ao câncer de ovário ou MOv 18. FR beta é também conhecido como FOLR2 (fetal), e como FBP/PL-1 (placenta). FR gama é também conhecido como FOLR3 e como FR-G (revisado por MD Salazar e Ratnam M., Câncer Metastasis Rev. 2007 26 (1), pp. 141 a 52.). Os FRs maduros, que estão bem caracterizados, são proteínas homólogas com ~ 70 a 80% de identidade de aminoácido e contêm de 229 a 236 aminoácidos, assim como dois a três locais de N-glicosilação. FR alfa e FR beta são ligados à membrana, em particular glicosilfosfatidilinositol (GPI) ancorada, glicoproteínas de superfície da célula, enquanto FR gama é desprovido de uma âncora de GPI e é uma proteína secretada. FR alfa e FR beta exibem uma alta afinidade para o ácido fólico (Kd = 0,1 a 1 nM), ácido 5,10-dideazatetra-hidrofólico (DDATHF; lometrexol; Ki = 0,4 a 1,3 nM usando [3H] ácido fólico como substrato) e BGC945 (o qual é baseado em ciclopenta [g] quinazolina, inibidor de de sintase de timidilat especificamente transportado de forma exclusiva via FR alfa e não por meio do transportador de folato reduzido) (Kd = 1 nM), mas a afinidade muito menor para MTX (Kd nM> 100). A absorção dependente de FR do folato e antifolatos procede através de um mecanismo clássico de endocitose mediado por receptores.
[0051] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) é um polipeptídeo transportador, o qual importa, pelo menos, um folato a partir do meio de cultura dentro da célula hospedeira. Em geral, uma folato é útil dentro da presente invenção, desde que tais folatos sejam capazes de serem levados até uma célula hospedeira, em particular, uma célula hospedeira de mamífero, por meio do primeiro marcador de seleção (sm I).
[0052] De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende o carreador de folato reduzido (RFC), ou uma variante ou fragmento funcional do mesmo. RFC é uma glicoproteína da membrana expressa de forma ubíqua que serve como um transportador importante para a absorção de folatos reduzidos, tais como 5-metil-THF e 5-formil-THF na célula. No entanto, RFC exibe uma afinidade muito pobre para o folato oxidado, ácido fólico. Assim, as células que não possuem a expressão de RFC ou que tenham sido excluídas do lócus de RFC genômico podem servir como recipientes para a transfecção do gene marcador de seleção de RFC (como (sm I)), sob condições em que reduziram-se os folatos, tais como 5-formil- THF estão gradualmente privados de meio de crescimento, forçando assim as células de expressarem os níveis aumentados do transportador de folato.
[0053] De acordo com uma modalidade preferida, que também é descrita em detalhes na seção de exemplo, o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende um polipeptídeo transportadordo folato e, de preferência, é um receptor funcional do folato. O uso de um receptor do folato ou uma variante ou fragmento funcional do mesmo possui várias vantagens sobre o uso do sistema de seleção de RFC. Não é necessário o uso de células, em que o locus de FR endógena foi nocauteado ou inativado por meio do nocaute ou perda da função de mutações alvo. Além disso, RFC tem uma afinidade deficiente de transporte de ácido fólico e, dessa maneira, este folato oxidado não pode ser usado no meio de cultura para a seleção. Contudo, o ácido fólico pode ser processado por meio de um receptor de folato. Além disso, o receptor de folato baseado no sistema de seleção é um sistema de absorção de folato unidirecional, em que RFC é um transportador de folato bidirecional que apresenta importação e exportação igualmente potentes de folatos. Dessa maneira, o uso do receptor de folato tem várias vantagens importantes. No entanto, também pode ser usado em combinação com RFC como marcador de seleção.
[0054] Os respectivos receptores de folato podem ser introduzidos na célula eucariótica destinada a produzir um produto de interesse através do vetor de expressão ou através da combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção. Após a introdução de um polinucleotídeo que codifica um receptor de folato como primeiro marcador de seleção (sm I), bem como o polinucleotídeo que codifica um produto de interesse (como um polipeptídeo) e o polinucleotídeo que codifica o segundo marcador de seleção (sm II), as células são cultivadas em um meio seletivo contendo concentrações limitantes de folatos. Quanto menor a concentração de folato no meio de cultura, mais rigorosas são as condições de seleção aplicadas. De preferência, quando o primeiro marcador de seleção (sm I) é composto por um receptor ou folato, o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico o qual processa um substrato que é tanto um folato e/ou um produto obtido a partir de um folato subsequente. Assim, as células que mais expressam o receptor de folato introduzido podem levar até uma quantidade suficiente de folatos para sustentar o crescimento das células, a replicação de DNA e, dessa maneira, a proliferação da célula. Este efeito é ainda mais reforçado devido ao fato de que a atividade do segundo marcador de seleção (sm II) é dependente/influenciada por meio da atividade do primeiro marcador de seleção (sm I), aqui a atividade de transporte do receptor de folato (vide acima). Isso tem o efeito de que apenas as células que sobrevivem fortemente superexpressam os marcadores de seleção introduzidos (sm I) e (sm II) e, consequentemente, superexpressam o produto de interesse. Essa abordagem requer, dependendo da modalidade escolhida, não-exclusão prévia de um gene do receptor de folato endógeno (FR), mesmo que isso constitua uma modalidade possível. [0055] O receptor de folato introduzido na célula hospedeira eucariótica, por meio de um vetor de expressão utilizado de acordo com a presente invenção, pode ser derivado a partir de qualquer espécie, desde que ele seja funcional dentro da presente invenção, isto é, compatível com a célula eucariótica utilizada. De preferência, um receptor de folato derivado de uma espécie de mamífero será usado, por exemplo, derivado de um roedor, ou, de uma forma mais preferida, um receptor de folato humano.
[0056] Em geral, o transportador de folato, em particular os receptores de folato introduzidos na célula hospedeira eucariótica e utilizados como marcadores de seleção, podem ser homólogos ou heterólogos a um receptor de folato endógena da célula hospedeira. Se ele é homólogo, será derivado a partir da mesma espécie como a célula hospedeira, e pode, por exemplo, ser idêntico a um receptor de folato endógeno da célula hospedeira. Se for heterólogo, será derivado de outra espécie do que a célula hospedeira, podendo, dessa maneira, ser diferente de um receptor de folato endógeno da célula hospedeira. Normalmente, o transportador de folato introduzido, de preferência, o receptor utilizado como marcador de seleção será heterólogo para a célula hospedeira. Por exemplo, um receptor de folato de origem humana pode ser usado como marcador de seleção de uma célula hospedeira de roedores, por exemplo, uma célula CHO.
[0057] De acordo com uma modalidade, o receptor de folato é um receptor de folato ligado à membrana funcional. O dito receptor pode ser um receptor ligado à membrana funcional capaz de importar de forma unidirecional ou absorção de um folato ou derivado do mesmo em uma célula eucariótica. O receptor de folato ligado à membrana funcional pode ser derivado de qualquer espécie como é descrito acima. [0058] O receptor de folato ligado à membrana funcional usado como o primeiro marcador de seleção (sm I), pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um receptor alfa folato, um receptor beta folato, um receptor gama folato, um receptor folato possuindo ou compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ. ID. N°. 1,2 ou 3 e variantes funcionais do exposto. De preferência, é um receptor alfa humano fólico ou uma variante funcional dos mesmos.
[0059] Uma variante funcional compreende um derivado de um receptor de folato o qual é funcional, de uma forma fisiológica, isto é, capazes de absorção de folato por meio das células hospedeiras (o qual é, em particular, uma célula eucariótica e, de preferência, uma célula hospedeira de mamífero) e contribui para a viabilidade da célula através do metabolismo da célula de folato. Por exemplo, uma forma variante do receptor de folato pode incluir uma ou mais mutações de aminoácidos (s), como uma substituição, eliminação e/ou adição de um ou mais aminoácidos. Também abrangido pelo dito termo variante são as proteínas de fusão compreendendo um receptor de folato respectivo. [0060] De preferência, o receptor de folato é um receptor alfa de folato humano, um receptor beta de folato humano, ou uma variante funcional dos mesmos. Mais preferido é um receptor alfa de folato humano que possui ou que compõe a sequência de aminoácido seguinte (SEQ. ID N° 1, código de uma letra, mostrada na direção do terminal N para o terminal C): MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMN AKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRF NWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERV LNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGA ACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQG NPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS
[0061] Outra modalidade preferida diz respeito a um receptor beta de folato humano que possui ou que compõe a sequência de aminoácido seguinte (SEQ. ID N° 2, o código de uma letra, mostrada na direção do terminal N para o terminal C): MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHK TKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHC
GKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLC KEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTF ESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNE EVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG
[0062] Em alternativa, um receptor de folato é usado como primeiro marcador de seleção (sm I) que não é naturalmente ligado à membrana. Como um receptor ligado a uma não membrana pode ser alterado para tornar-se ligado à membrana. Por exemplo, uma âncora de membrana pode ser fornecida e/ou o dito receptor de folato pode ser expresso como uma proteína de fusão compreendendo o receptor de folato ligado à não-membrana e uma região transmembrana de outro polipeptídeo. Da mesma forma, outras variantes podem ser usadas o que seria prontamente disponível para um versado na técnica. Os exemplos preferidos a este respeito seriam baseados no receptor gama de folato solúvel, de preferência o receptor gama de folato solúvel humano. Em uma modalidade preferida dele, o receptor gama de folato solúvel humano teria/compreenderia a sequência de aminoácido amino seguinte (SEQ. ID N° 3, código de uma letra, mostrada na direção do terminal N para o terminal C): MDMAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPRSARARTDLLNVCM NAK HHKTQPSPEDELYGQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNW DHC GKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQVNQSWRKERILNVPLCK ED CERWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTFESYFP TPA ALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAA AM NAGAPSRGIIDS
[0063] O dito receptor pode ser mutado ou não geneticamente alterado, derivatizado ou modificado para formar um receptor de folato ligado à membrana funcional capaz de captação de folato no contexto da presente invenção.
[0064] Como se torna evidente a partir do acima, o (s) marcador (es) de seleção (sm I) e/ou (sm II) podem ser ou podem incluir um polipeptídeo catalítico envolvido na síntese do ácido nucleico e/ou no metabolismo do folato. De acordo com uma modalidade, o primeiro marcador de seleção (sm I) é composto por um transportador ou incorporar um composto envolvidos e/ou essencial para a síntese de ácido nucleico na célula hospedeira e o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico envolvido na síntese de ácidos nucleicos, por exemplo, a geração de nucleotídeos. De preferência, o segundo marcador de seleção (sm II) é um catalisador de polipeptídeos, de preferência, uma enzima envolvida na síntese de ácidos nucleicos, em particular, no metabolismo do folato. Isto é particularmente útil, se o primeiro marcador de seleção (sm I) transportar o folato na célula hospedeira e é, por exemplo, um receptor de folato.
[0065] No processo de síntese de ácidos nucleicos, a primeira enzima, transformilase de ribonucleotídeo de glicinamida (GARTF), está envolvida na formação do anel de imidazol das purinas, enquanto que a reação mais a jusante mediada por meio da 5-aminoimidazol-4-carboxamida transformilase de ribonucleotídeo (AICARTF) produz o intermediário de purina de inosina 5'-monofosfato (IMP). Este último serve como um precursor-chave para a biossíntese regulamentada de AMP e GMP. Além disso, 5,10-metileno-THF (5,10-CH2-THF), é uma outra coenzima de THF importante que funciona como um cofator crucial para a sintase de timidilato da enzima (TS). TS catalisa a formação de monofosfato de timidina (dTMP) a partir de dUMP usando 5,10-metileno-THF (5,10-CH2-THF), tornando assim ácido diidrofólico. Redutase de di-hidrofolato (DHFR) catalisa a redução dependente de NADP do ácido di-hidrofólico (DHF) ao ácido tetra-hidrofólico (THF). THF é então interconvertido a 10-formil-THF e 5,10-metileno-THF que são usados na biossíntese de novo de purinas e timidilato, respectivamente. Esta reação é catalisada pela serina hidroximetiltransferase (SHMT).DHF é, portanto, o subproduto da atividade catalítica de sintase de timidilato (TS), o qual catalisa a conversão de dUMP para dTMP em uma reação dependente de 5,10-metileno-THF. Dessa maneira, DHFR é crucial para a reciclagem de cofatores de THF que são essenciais para a biossíntese de nucleotídeos de purina e pirimidina que são necessários para a replicação do DNA.
[0066] As enzimas descritas as quais são determinadas de certa medida de folato são mediadoras-chave da biossíntese de novo de nucleotídeos de purina e timina essenciais para a replicação do DNA e são adequadas como o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou (sm II), como eles são envolvidos no mesmo processo metabólico, ou seja, síntese de ácidos nucleicos.
[0067] De acordo com uma modalidade, o segundo marcador de seleção (sm II) processa um substrato o que é um folato, um derivado de folato e/ou um produto que pode ser obtido por meio do processamento de folato, tais como DHF ou THF ou uma variante ou um derivado funcional do que precede. Os substratos são importantes para a produção de ácidos nucleicos. De preferência, o dito segundo marcador de seleção (sm II) é ou compreende a redutase de di-hidrofolato (DHFR) ou uma enzima operacional a jusante/respectivamente, em conjunto com DHFR, como TS e SHMT. Esta modalidade é particularmente adequada se o marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato.
[0068] Várias enzimas de DHFR adequadas e, consequentemente, os genes, são conhecidas no estado da técnica, as quais podem ser usadas em conjunto com a presente invenção. A DHFR pode ser uma DHFR do tipo selvagem ou uma variante ou derivado funcional do mesmo. O termo uma "variante" ou "derivado" inclui as enzimas de DHFR tendo uma ou mais trocas das sequências de aminoácidos (por exemplo, exclusões, substituições ou adições) com relação à sequência de aminoácidos da respectiva enzima de DHFR, as proteínas de fusão compreendendo uma enzima de DHFR ou um fragmento funcional do mesmo e enzimas de DHFR, as quais foram modificadas para fornecer uma estrutura e/ou função adicional, bem como fragmentos funcionais do exposto, que ainda tem pelo menos uma função de uma enzima de DHFR. Por exemplo, uma enzima de DHFR pode ser usada como um marcador de seleção (sm II), que é, por exemplo, mais ou menos sensível para antifolatos, tal como MTX do que a enzima de DHFR do tipo selvagem e/ou a enzima de DHFR endogenamente expressa por meio da célula hospedeira, se expressa. A enzima de DHFR pode ser derivada de qualquer espécie, desde que ela seja funcional dentro da presente invenção, isto é, compatível com a célula hospedeira utilizada. Por exemplo, um camundongo mutante de DHFR com uma grande resistência contra a MTX tem sido amplamente utilizado como um marcador dominante de seleção que aumenta significativamente a aquisição de alto nível de resistência à MTX em células transfectantes. De preferência, uma enzima de DHFR é usada como marcador de seleção, que é menos suscetível a um inibidor de DHFR, tal como MTX, do que a enzima de DHFR endogenamente expressa em uma célula hospedeira DHFR+ (positiva).
[0069] De acordo com uma modalidade, um íntron ou um fragmento do mesmo é colocado na extremidade 3' da estrutura de leitura aberta do gene de DHFR. Isto tem efeitos vantajosos sobre a taxa de expressão/ampliação do constructo. O íntron utilizado no cassete de expressão de DHFR está levando a uma menor variante não funcional do gene de DHFR (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59 a 65). Assim, o nível de expressão do gene de DHFR é reduzido e pode, assim, aumentar ainda mais o rigor do sistema de seleção. Assim, a célula hospedeira pode incluir um polinucleotídeo introduzido que codifica uma enzima de DHFR, o dito polinucleotídeo compreendendo um íntron que está localizado na extremidade 3' da sequência de codificação de DHFR. Os métodos alternativos de fazer uso de um íntron para reduzir o nível de expressão do gene de DHFR são descritos em EPO 724 639 e também poderíam ser usados.
[0070] De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e do segundo marcador de seleção é uma variante da enzima de DHFR, que é menos sensível ao MTX do que a enzima de DHFR do tipo selvagem e/ou a enzima de DHFR endogenamente expressa pela célula hospedeira. A dita variante de DHFR de preferência também compreende um íntron como é descrito acima. Uma combinação do respectiivo marcador é particularmente preferida em combinação com as células de DHFR+ (positiva).
[0071] O ensino da presente invenção pode ser realizado utilizando as modalidades diferentes dos vetores de expressão e/ou combinações de pelo menos dois vetores de expressão como aqui descritos. O polinucleotídeo que codifica um produto de interesse ou o local de inserção para incorporar um respectivo polinucleotídeo, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) e os elementos do vetor, opcionalmente adicionais, tais como os marcadores adicionais de seleção que podem ser localizados no mesmo ou em vetores de expressão em separado.
[0072] Por exemplo, usando um vetor de expressão compreendendo pelo menos todos os elementos decisivos descritos acima, isto é, o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse (ou um local de inserção para incorporar um respectivo polinucleotídeo), o polinucleotídeo que codifica o primeiro marcador de seleção (sm I) e o polinucleotídeo que codifca o segundo marcador de seleção (sm II), tem a vantagem de apenas um vetor de expressão precisar ser introduzido na célula hospedeira. Além disso, em particular, quando se estabelece uma linhagem estável de expressão, as chances são maiores de que todos os elementos sejam igualmente expressos ou pelo menos com uma taxa similar por meio da célula hospedeira, como integrariam juntos no genoma.
[0073] No entanto, também é possível e dentro do escopo da presente invenção, usar uma combinação de pelo menos dois ou três vetores de expressão para a transfecção, em que os respectivos polinucleotídeos estão localizados nos vetores de expressão diferentes. A dita combinação dos vetores de expressão é, em seguida, transferida para a célula hospedeira. Ao usar uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão, de preferência uma configuração é usada, em que pelo menos um polinucleotídeo que codifica o produto de interesse (ou o local de inserção para a introdução do polinucleotídeo de interesse) e pelo menos um dos marcadores de seleção (sm I) ou (sm II) é arranjado no mesmo vetor de expressão. Isto, em particular, quando a combinação dos vetores de expressão é usada a fim de estabelecer uma expressão de linhagem de célula estável, a fim de assegurar uma ligação forte da expressão do marcador de seleção ((sm I) e/ou (sm II)) para a expressão do produto de interesse. O outro marcador de seleção (sm I) ou (sm II) pode ser localizado em um vetor de expressão separado da dita combinação do vetor de expressão. O dito vetor de expressão em separado, o qual consequentemente compreende o outro marcador de seleção ((sm I) ou (sm II)) pode incluir um polinucleotídeo que codifica um produto adicional de interesse. Uma respectiva definição pode por exemplo ser usada para expressar as moléculas de imunoglobulinas. No entanto, está também dentro dos ensinamentos da presente invenção que todos os polinucleotídeos (os quais codificam o produto de interesse, (sm I) e (sm II)) estão localizados em separado e, dessa maneira, em vetores de expressão individuais. [0074] De acordo com uma modalidade, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende um local de inserção para inserir o polinucleotídeo que codifica um produto de interesse, mas ainda não compreendendo o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse. Um respectivo vetor de expressão "vazio" pode ser usado para inserir o polinucleotídeo que codifica o produto desejado de interesse, obtendo-o assim pronto para usar o vetor de expressão que pode ser incorporado dentro da célula hospedeira para expressar o produto de interesse. A incorporação pode ser conseguida por meio de métodos de clonagem apropriados, por exemplo, utilizando as enzimas de restrição, a fim de inserir o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse. Para efeito, o vetor de expressão pode incluir, por exemplo um local múltiplo de clonagem (MCS), o qual pode, por exemplo, ser usado em todas as estruturas de leitura. Um local de clonagem múltiplo respectivo como um exemplo de um local de inserção pode ser localizado dentro de um cassete de expressão. Um respectivo vetor de expressão "vazio" fornece uma ferramenta útil para expressar diferentes produtos de interesses como o vetor de expressão pode ser facilmente adaptado para o uso pretendido, inserindo o polinucleotídeo que codifica o produto desejado de interesse.
[0075] O vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão pode, adicionalmente, incluir os elementos do vetor adicional. Por exemplo, pode ser fornecido pode ser fornecido, pelo menos, um polinucleotídeo adicional que codifica um produto adicional ainda de interesse. Esta modalidade é particularmente adequada para expressar as moléculas de imunoglobulinas. Elementos do vetor em geral adicionais que podem ser úteis são conhecidos no estado da técnica e incluem, mas não estão limitados às origens de replicação, os marcadores de seleção adicionais, os promotores para a expressão em células hospedeiras diferentes ou na expressão in vitro. [0076] O vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina e pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional da cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina. Os ditos polinucleotídeos podem estar localizados nos mesmos ou em diferentes vetores de expressão no caso de uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão ser usada. Está também dentro do escopo da presente invenção usar uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão, em que um vetor de expressão compreende pelo menos um polinucleotídeo que codifica o primeiro marcador de seleção (sm I) e pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional de uma cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina e/ou um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada da molécula de imunoglobulina e o outro vetor de expressão da dita combinação compreende pelo menos polinucleotídeo que codifica o segundo marcador de seleção (sm II) e pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional de uma cadeia leve da dita molécula de imunoglobulina e/ou um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada da dita molécula de imunoglobulina. A respectiva definição também é descrita nos exemplos. Após a expressão dos ditos polinucleotídeos em uma célula hospedeira, uma molécula de imunoglobulina funcional é obtida. O polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina e o polinucleotídeo que codifica pelo menos um fragmento funcional da cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina podem ser compreendidos no mesmo cassete de expressão ou em cassetes de expressão diferentes, como também é descrito abaixo.
[0077] O vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção pode ainda compreender um ou mais polinucleotídeo (s) adicional (is) que codifica (m) um ou mais marcador (es) de seleção adicional (is). O (s) dito (s) marcador (es) adicional (is) pode (m) estar envolvido (s) no mesmo ou em um processo metabólico concertada, ou em uma via, como os marcadores de seleção (sm I) e (sm II). No entanto, também podem estar envolvidos em uma via metabólica diferente. Em uma modalidade da presente invenção, a co-seleção utilizando o sistema da presente invenção, juntamente com um ou mais sistema (s) de seleção diferente (s) (por exemplo, sistemas de seleção de resistência a antibióticos, tais como neo/G418) pode ser aplicada para melhorar o desempenho. Além dos marcadores de seleção de células eucarióticas adicionais que permitem a seleção de células hospedeiras eucarióticas, os marcadores de seleção de células procarióticas também podem ser usados. O termo "marcador de seleção de células procarióticas" refere-se a um marcador de seleção que permite a seleção nas células hospedeiras procarióticas em condições de seleção apropriadas. Os exemplos de marcadores de seleção procarióticos respectivos são marcadores que proporcionam uma resistência aos antibióticos, tais como por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina e/ou cloranfenicol.
[0078] Os vetores usados para expressar os produtos de interesse geralmente contêm os elementos de controle transcricionais adequados para conduzir a transcrição, como por exemplo, promotores, realçadores, sinais de poliadenilação, transcrição pausada ou sinais de terminação como elemento de um cassete de expressão. Se o produto desejado é uma proteína, os elementos de controle de translação adequados são de preferência incluídos no vetor, como, por exemplo, as regiões não traduzidas no terminal 5' que conduzem as estruturas de revestimento no terminal 5' adequadas para o recrutamento dos ribossomos e os códons de parada para finalizar o processo de tradução. Em particular, o polinucleotídeo servindo como genes marcadores de seleção, bem como o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse pode ser transcrito sob o controle dos elementos de transcrição presentes em promotores apropriados. As transcrições resultantes dos genes marcadores de seleção e que do produto de interesse do porto dos elementos de tradução funcionais que facilitam os níveis substanciais de expressão da proteína (isto é,tradução) e terminação correta de tradução. Uma unidade de expressão funcional, capaz de conduzir corretamente a expressão de um polinucleotídeo incorporado, também é referida como um "cassete de expressão" aqui. O(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) o produto de interesse e os polinucleotídeos que codificam os marcadores de seleção sm (I) e (sm II) são de preferência compostos de um cassete de expressão. As diversas modalidades são adequadas, por exemplo, cada um do(s) dito(s) polinucleotídeo(s) pode ser composto em um cassete de expressão diferente. No entanto, está também no escopo da presente invenção que pelo menos dois dos respectivos polinucleotídeos sejam formados em um cassete de expressão.
[0079] Assim, o vetor de expressão ou a combinação dos vetores de expressão de acordo com a presente invenção podem compreender pelo menos um promotor e/ou um elemento promotor/realçador como elemento de um cassete de expressão. Embora as fronteiras físicas entre estes dois elementos de controle nem sempre sejam claras, o termo "promotor" geralmente se refere a um local na molécula de ácido nucleico para ao qual uma RNA polimerase e/ou quaisquer fatores associados se ligam e em que a transcrição é iniciada. Os realçadores potencializam a atividade do promotor, temporariamente, bem como espacialmente. Muitos promotores estão transcricionalmente ativos em uma ampla gama de tipos de células. Os promotores podem ser divididos em duas classes, aqueles que funcionam constitutivamente e aqueles que são regulados por meio da indução ou da desrepressão. Ambos são adequados em conjunto com os ensinamentos da presente invenção. Os promotores usados para alto nível de produção de proteínas em células de mamíferos devem ser fortes e de preferência ativos em uma ampla gama de tipos de células. [0080] Os promotores constitutivos fortes que conduzem a expressão em vários tipos de células incluem, mas não estão limitados ao, promotor principal de adenovírus retardado, o promotor imediato de citomegalovírus humano precoce, o promotor do vírus SV40 e o promotor do vírus Rous Sarcoma e o promotor quinase murino 3-fosfoglicerato, EF1a. Bons resultados são alcançados com o vetor de expressão da presente invenção, quando o promotor e/ou realçador é obtido tanto a partir de CMV quanto a partir de SV40. Os promotores de transcrição podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um promotor SV40, um promotor CMV, um promotor EFIalfa, um promotor RSV, um promotor BROAD3, uma promotor 26 rosa murino, um promotor pCEFL e um promotor β-actina.
[0081] A modalidade preferida refere-se a um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, em que o polinucleotídeo que codifica um produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) estão sob o controle de promotores de transcrição distintos. Em geral, um promotor capaz de promover a expressão, em particular a transcriçãor, dos polinucleotídeos essenciais em uma célula hospedeira, em particular uma célula hospedeira eucariótica será apropriado. Os promotores de transcrição distintos conduzem a expressão a partir de polinucleotídeos que podem ser os mesmos ou diferentes.
[0082] De acordo com uma modalidade, um forte promotor e/ou realçador é usado para conduzir a expressão do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse do que para conduzir a expressão do polinucleotídeo que codifica o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou (sm II). Esse arranjo tem o efeito de que mais transcrição é gerada para o produto de interesse do que para os marcadores de seleção. É vantajoso que a produção do produto de interesse seja dominante sobre a produção dos marcadores de seleção, uma vez que a capacidade da célula individual para produzir produtos heterólogos não é ilimitada e que deveria, dessa maneira, ser voltada para o produto de interesse. Além disso, o processo de seleção ocorre apenas nos estágios iniciais de criação de uma expressão da linhagem de células, que então produz constantemente o produto de interesse. Dessa maneira, é vantajoso focalizar os recursos das células para a expressão/produção do produto de interesse. Além disso, usando um promotor menos forte para expressar o (s) dito (s) marcador (es) de seleção (sm I) e/ou (sm II) do que o polipeptídeo de interesse adicional que aumenta a pressão de seleção.
[0083] De acordo com uma modalidade, o promotor que conduz a expressão do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse é um promotor CMV e o promotor que conduz a expressão do polinucleotídeo que codifica o marcador de seleção (sm I) e/ou (sm II) é um promotor SV40. O promotor CMV é conhecido por ser um dos promotores mais fortes disponíveis para de expressão de mamífero e leva a uma taxa de expressão muito boa. Considera-se dar significativamente mais transcrição do que o promotor SV40.
[0084] De acordo com uma modalidade adicional, o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) estão sob o controle do mesmo promotor de transcrição. Os promotores adequados estão descritos acima. Nesta modalidade, uma transcrição longa é obtida a partir do respectivoa cassete de expressão que está sob o controle do dito promotor de transcrição. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento IRES é funcionalmente localizado entre o polinucleotídeo quue codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II). Assim, é garantido que os produtos de tradução separados sejam obtidos a partir da dita transcrição.
[0085] O vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão pode incluir um local de terminação da transcrição apropriado como elemento de um cassete de expressão. Esta transcrição, como continuou a partir de um promotor a montante através de uma segunda unidade de transcrição pode inibir a função do promotor a jusante, um fenômeno conhecido como oclusão promotora ou interferência de transcrição. Este evento tem sido descrito em ambas as células procarióticas e eucarióticas. A colocação adequada dos sinais de terminação da transcrição entre duas unidades de transcrição pode prevenir a oclusão promotora. Os locais de terminação de transcrição são bem caracterizados e a sua incorporação em vetores de expressão tem sido demonstrada que têm múltiplos efeitos benéficos sobre a expressão do gene.
[0086] De preferência, a célula hospedeira utilizada é uma célula eucariótica, em particular, uma célula hospedeira de mamífero. A maioria dos mRNAs eucarióticos nascentes possuem uma cauda poli A na sua extremidade 3’, que é adicionada durante um processo complexo que envolve a divagem da transcrição primária e uma reação de poliadenilação acoplada. A cauda poli é vantajosa para a estabilidade e transferibilidade do mRNA. Assim, os cassetes de expressão do vetor de acordo com a presente invenção geralmente compreendem um local de poliadenilação. Existem vários sinais poli A eficientes que podem ser usados em vetores de expressão de mamífero, incluindo os derivados de hormônio de crescimento bovino (BGH), camundongo beta-globina, a unidade de transcrição precoce SV e o virus do gene da timidina quinase Herpes simplex. No entanto, os locais de poliadenilação sintéticos também são conhecidos (vide, por exemplo, o vetor de expressão neo-pCI da Promega que se baseia na Levitt el al, 1989, Genes Dev 3, (7):. 1019 a 1025). O local de poliadenilação pode ser selecionado do grupo consistindo no local SV40 poli A, tais como o SV40 retardado e o local poli-A precoce (vide, por exemplo plasmídeo pSV2-DHFR, conforme descrito no Subramani et al, 1981, Mol.Cell. Biol. 854 a 864), um local poli A sintético (vide, por exemplo, o vetor de expressão neo-pCI da Promega que se baseia na Levitt el al, 1989, Genes Dev 3, (7.): 1019 a 1025) e um local de bgh poli A (hormônio de crescimento bovino).
[0087] Além disso, um cassete de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica o segundo marcador de seleção (sm II) pode incluir pelo menos um íntron. Esta modalidade é particularmente adequada quando uma célula eucariótica, em particular uma célula hospedeira de mamíferos, é utilizada para a expressão. A maioria dos genes de células eucarióticas superiores contêm íntrons, que são removidos durante o processamento de RNA. Os respectivos constructos são expressos de forma mais eficiente em sistemas transgênicos do que em constructos idênticos faltando íntrons. Normalmente, os íntrons são colocados na extremidade 5' da estrutura de leitura aberta, mas também podem ser colocados na extremidade 3'. Assim, um íntron pode ser compreendido no (s) cassete (s) de expressão a fim de aumentar a taxa de expressão. O dito íntron pode estar localizado entre o promotor e ou elemento (s) promotor (es)/realçador (es) e a extremidade 5‘ da estrutura de leitura aberta do polinucleotídeo a ser expresso.Vários íntrons adequados são conhecidos no estado da técnica os quais podem ser usados em conjunto com a presente invenção.
[0088] De acordo com uma modalidade, o íntron usado com os cassetes de expressão para expressar o produto de interesse, é um íntron sintético, tais como o íntron SIS ou o íntron RK. O íntron RK é um íntron sintéticoo forte que é, de preferência, colocado antes do códon de partida ATG do gene de interesse. O íntron RK consiste no sítio de fatia doadora do íntron do promotor CMV e o sítio da fatia aceitadora da região variável do camundongo da IgG de cadeia pesada (vide, por exemplo Eatonetal., 1986, Bioquímica 25, 8343-8347, Neubergeretal., 1983, EMBO J. 2 (8), 1373 a 1378, que pode ser obtido a partir do vetor PRK-5 (BD PharMingen)).
[0089] O vetor de expressão ou a combinação de vetores de acordo com a presente invenção pode ser transfectado dentro da célula hospedeira em sua forma circular. As moléculas do vetor superenrolado normalmente serão convertidas em moléculas lineares dentro do núcleo, devido à atividade de endo e exonucleases. No entanto, a linearização do vetor de expressão antes de transfecção muitas vezes melhora a eficiência de uma transfecção estável. Isso também como ponto de linearização pode ser controlado, se o vetor de expressão for linearizado antes da transfecção. Assim, de acordo com uma modalidade da presente invenção, o vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão compreende pelo menos um sítio de restrição predefinido, o que pode ser usado para a linearização do(s) vetor(es) antes da transfecção. A colocação inteligente da dita linearização do sítio de restrição é vantajosa, porque o dito sítio de restrição determina onde o vetor é aberto/linearizado e, dessa maneira, determina a ordem/disposição dos cassetes de expressão quando o constructo é integrado no genoma das células eucarióticas, em particular, células de mamíferos. No caso, o vetor é usado como um vetor de expressão padrão destinado, por exemplo, a ser como uma ferramenta para a expressão de vários produtos/polipeptídeos diferentes, é vantajoso para fornecer a linearização do um sítio de restrição compreendendo múltiplos sítios de reconhecimento para enzimas que possuem uma frequência de corte baixa.As enzimas de restrição escolhidas para a linearização não devem cortar de preferência dentro dos cassetes de expressão para o produto de interesse, os marcadores de seleção ou outras sequências de estrutura principal do vetor, a fim de garantir que a enzima corte apenas uma vez para a linearização adequada do vetor. Ao fornecer a linearização de um sítio de restrição compreendendo os múltiplos sítios de reconhecimento para enzimas de restrição com uma frequência de corte baixas, o usuário pode optar por uma enzima de restrição adequada para a linearização entre as opções fornecidas, a fim de evitar a restrição de forma segura dentro do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse. No entanto, como é descrito acima, os sítios de restrição adicionais podem ser mutados ou a digestão parcial da restrição podería ser realizada. De acordo com uma modalidade, o local de linearização é organizado de tal forma, que após a linearização, um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção amplificável de células eucarióticas está localizado na extremidade 5' do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse. Este arranjo é vantajoso para a amplificação do gene. No caso de um marcador de seleção de células procarióticas ser adicionalmente usados, o polinucleotídeo que codifica o dito marcador está localizado na extremidade 3' do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse. Isso tem o efeito que o gene marcador de seleção das células procarióticas está na extremidade 3' e, dessa maneira, "fora" das partes dos "mamíferos" do vetor do ácido nucleico linearizado. Este arranjo é favorável desde que genes procarióticos sejam presumivelmente não-vantajosos para as células eucarióticas e na expressão de mamíferos, em particular, como as sequências procarióticas que pode levar a metilação aumentada ou outros efeitos de silenciamento em células de mamíferos.
[0090] O vetor de expressão pode incluir elementos adicionais para permitir a combinação do método de seleção de acordo com a presente invenção com outros sistemas de seleção conhecidos no estado da técnica. Um método de seleção estabelecido conhecido no estado da técnica é baseado no uso da citometria de fluxo, em particular, na classificação da fluorescência ativada da célula (FACS). Os métodos de seleção que empregam a citometria de fluxo tem a vantagem de que um grande número de células pode ser rastreado rapidamente. Em um método de seleção que é particularmente útil para identificar os clones de alta produção de células, uma parte do produto de interesse, por exemplo um anticorpo é expresso como a fusão do polipeptídeo ligado a membrana. Assim, uma parte do produto é apresentada como a fusão do polipeptídeo na superfície da célula. Como a quantidade de fusão do polipeptídeo produzido correlaciona-se com a taxa de expressão em geral, as células hospedeiras podem ser selecionadas através de citometria de fluxo com base na quantidade de fusão do polipeptídeo exibido na superfície da célula. Isto permite a seleção rápida de alta produção de células hospedeiras. Verificou-se que o sistema de seleção de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente combinado com os respectivos métodos de seleção que são baseados no uso da citometria de fluxo. Para permitir a seleção eficiente usando FACS, de preferência um cassete de expressão especial é usado para expressar o produto de interesse. Dessa maneira, de acordo com uma modalidade, o vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção compreende um cassete de expressão para expressar o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse que é projetado de tal forma que uma porção do produto expressa de interesse compreende uma âncora da transmembrana.Existem várias opções para alcançar esse resultado.
[0091] De acordo com uma modalidade, o dito cassete de expressão compreende pelo menos (a) o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, (b) pelo menos um códon de parada a jusante do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, e (c) o polinucleotídeo adicional a jusante do códon de parada que codifica uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana.
[0092] Este design do cassete de expressão tem o efeito de que por meio dos processos de translação através da leitura (o códon de parada é "leaky") uma parte do produto de interesse é produzida como uma fusão do polipeptídeo que compreende uma âncora de membrana. Como resultado, esta fusão do polipeptídeo é exibida na superfície da célula e as células exibem altos níveis de polipeptídeo de fusão ancorados à membrana que podem ser selecionadas por meio da citometria de fluxo, de preferência por FACS. Assim, as células hospedeiras as quais são selecionadas possuem uma alta taxa de expressão. Os detalhes e as modalidades preferidas deste códon de parada com base na tecnologia estão descritas no W02005/073375 e PCT/EP2009/006246. E é referido a esta descrição.
[0093] De acordo com uma modalidade alternativa, o dito cassete de expressão compreende pelo menos (a) o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, (b) um íntron que compreende um local da fatia doadora da extremidade 5' e um local da fatia aceitadora da extremidade 3' e que compreende um códon de parada na estrutura da translação e um sinal de poliadenilação e (c) um polinucleotídeo a jusante do dito íntron que codifica uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana [0094] Este design do cassete de expressão tem o efeito que, por meio de transcrição e por meio do processamento de transcrição, pelo menos, dois mRNAs maduros diferentes (mRNA POI) e (mRNA POI-ANCHOR) são obtidos a partir do cassete de expressão. A tradução do mRNA-POI-ANVHOR resulta no produto de interesse. A tradução do mRNA-POI-ANCHOR resulta em uma fusão do polipeptídeo que compreende o produto de interesse e uma âncora de membrana. Como resultado, esta fusão do polipeptídeo é novamente exibida na superfície da célula e as células exibindo altos níveis da fusão do polipeptídeo ancorado à membrana que podem ser selecionados por meio da citometria de fluxo, de preferência FACS. Assim, as células hospedeiras são selecionadas que possuem uma alta taxa de expressão. Detalhes e modalidades preferidas deste íntron com base na tecnologia são descritos em WO2007/131774. É que o é referido a esta descrição. [0095] De acordo com uma modalidade preferida que é em particular útil para a expressão dos anticorpos como produto de interesse, a âncora de membrana é uma âncora de transmembrana da imunoglobulina. Outras âncoras de membrana adequadas e modalidades preferidas de uma âncora de transmembrana da imunoglobulina são descritas nos WO2007/131774, W02005/073375 e PCT/EP2009/006246.
[0096] Também é fornecida uma célula hospedeira, compreendendo pelo menos (a) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (c) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I); em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção.
[0097] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira compreende um vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão, tal como descrito em detalhes acima e nas reivindicações. Faz-se referência à descrição acima.
[0098] Além disso, a célula hospedeira pode ter pelo menos uma das seguintes características: [0099] A célula hospedeira é de preferência uma célula hospedeira eucariótica. A dita célula eucariótica é, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula de mamíferos, uma célula do inseto, uma célula vegetal e uma célula de fungos. As células de fungos e as células vegetais podem ser prototróficas de folatos (isto é, tais células podem sintetizar de forma autônoma os seus próprios folatos necessários para a sua viabilidade da célula, isto é, o crescimento e a proliferação da célula). A presente invenção compreende em particular tais células de fungos e células vegetais que são ou podem tornar-se auxotróficas de folatos. Isso pode ser por exemplo, devido à manipulação genética, isto é, as células são agora incapazes de sintetizar as quantidades suficientes de folatos necessárias para a sua viabilidade da célula. Por exemplo, a capacidade de tais células de fungos ou células vegetais para endogenamente biossintetizar os folatos, por exemplo,através de uma via metabólica adequada, pode ser inativada, por exemplo, por meio da ruptura dogene ou por meio do silenciamento do gene de genes alvo apropriados, ou inibição das enzimas-chave, etc, de preferência, a célula hospedeira é uma célula de mamíferos. A dita células de mamíferos é de preferência selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula de roedores, uma célula humana e uma célula do macaco. Particularmente preferida é uma célula de roedores, a qual de preferência é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NSO, um camundongo de células de fibroblastos 3T3, e uma célula SP2/0. Uma célula de roedores mais particularmente preferida é uma célula CHO.Também preferido é uma célula humana, que, de preferência, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula HEK293, uma célula MCF-7, uma célula PerC6, e uma célula HeLa. Mais preferida é uma célula do macaco, que, de preferência, é selecionada a partir do grupo que consiste em um COS-1, uma célula COS-7 e uma célula Vero.
[00100] A célula hospedeira e os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) incorporados devem ser compatíveis, o que significa que a combinação escolhida da célula hospedeira e os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) permitem a seleção de células hospedeiras expressando os respectivos marcadores em condições de cultura seletivas. A expressão dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) devem fornecer uma vantagem seletiva em condições de cultura seletivas. Dessa maneira, de preferência, uma célula hospedeira é escolhida, a qual é suscetível à seleção por meio dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) sob condições de crescimento seletivas. Por exemplo, no caso de uma certa enzima ser usada como marcador de seleção (sm I) e/ou (sm II), a célula hospedeira pode não expressar a respectiva enzima endogenamente ou pode, pelo menos, expressar a dita enzima não em quantidades suficientes ou com uma atividade suficiente, a fim de permitir que a célula funcione/cresça adequadamente em condições de cultura seletivas, na ausência de uma expressão suficiente dos polinucleotídeos heterólogos que codificam os marcadores de seleção (sm I) e (sm II). Dessa maneira, a célula hospedeira só pode apenas sobreviver/proliferar com uma taxa suficiente, se a célula hospedeira expressar os marcadores introduzidos de seleção e, consequentemente,o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse com um rendimento suficiente para sobreviver as condições de crescimento seletivas. A escolha/design das células hospedeiras adequadas dependem dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) escolhidos. As células hospedeiras adequadas são conhecidas no estado da técnica, ou poderíam ser geradas por meio do desenvolvimento adequado de linhagens da célulaes, por exemplo, por meio da engenharia genética (por exemplo, mutagênese, gene knock-out; silenciamento do gene e similares). Estes princípios são bem-conhecidos no estado da técnica e, dessa maneira, não precisam de explicação detalhada aqui.
[00101] Por exemplo, as células hospedeiras (por exemplo, células CHO) que não possuem o gene da DHFR (por exemplo, por meio da exclusão do gene alvo, também chamadas de DHFR - células hospedeiras) podem ser usadas como destinatários para a transfecção do gene de DHFR como gene marcador de seleção em um meio que é livre de nucleotídeos. No entanto, também é possível usar as células hospedeiras que expressam DHFR endogenamente (DHFR+ (positiva) células hospedeiras) ao realizar uma seleção de DHFR se for o caso de as condições de cultura seletivas serem usadas. Neste caso, de preferência, a enzima de DHFR é usada como marcador de seleção (sm II), que é menos sensível ao MTX do que a enzima de DHFR endógena expressa por DHFR+ (positiva) da célula hospedeira. Após a transfecção com os polinucleotídeos heterólogos, por exemplo, um vetor de expressão de acordo com a presente invenção que compõem o gene de DHFR, por exemplo, como o segundo marcador de seleção (sm II), as células podem ser sujeitas a um aumento gradual nas concentrações de inibidores da DHFR. Um exemplo são antifolatos, tal como MTX, que é um inibidor potente da DHFR (Kd = 1 pM). A presença do antifolato, tal como MTX, no meio força as células a produzirem níveis elevados de DHFR, a fim de sobreviver. Após várias rodadas múltiplas de seleção, a DHFR do marcador de seleção frequentemente sofre amplificação do gene significativo, a fim de conseguir isso. A técnica anterior deve usar bastante concentrações altas de antifolato/MTX, a fim de alcançar uma amplificação suficiente do gene e, consequentemente, o aumento na produção do produto de interesse. Esta é uma desvantagem como antifolatos são tóxicos e podem alterar a célula hospedeira. A nova abordagem da presente invenção para combinar dois marcadores de seleção (sm I e sm II), que estão envolvidos no mesmo ou em uma via metabólica concertada (de preferência o metabolismo do folato) tem a vantagem de que o rigor de seleção é aumentado consideravelmente já em baixos níveis inibidores (por exemplo MTX). Dessa maneira, menos inibidores e, assim, agentes tóxicos são necessários com os ensinamentos da presente invenção em comparação com as abordagens da técnica anterior para fornecer condições de seleção muito rigorosas.
[00102] Os exemplos adequados para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II), bem como as combinações dos mesmos, são descritos em detalhe acima; faz-se referência à descrição acima.
[00103] O polinucleotídeo que codifica um produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) pode ser introduzida de forma estável na dita célula hospedeira. A introdução estável, respectivamente, a transfecção é vantajosa para o estabelecimento da expressão de linhagens de células e, em particular, para a produção em larga escala e consequentemente industrial do produto de interesse.
[00104] O polinucleotídeo que codifica um produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) pode ser localizado no mesmo ou em vetores de expressão em separado compostos nas ditas células hospedeiras. Os detalhes sobre estas modalidades foram descritos acima; faz-se referência à descrição acima.
[00105] De acordo com uma modalidade, a viabilidade da célula ou a taxa de proliferação da célula hospedeira utilizada pode dependente da absorção de um composto (tais como, por exemplo, folato) que é incorporada por meio do primeiro marcador de seleção (sm I) na célula hospedeira. Como é descrito acima, o primeiro marcador de seleção (sm I) pode codificar um polipeptídeo transportadorcapaz de importar em um composto no dito hospedeiro. De acordo com uma modalidade descrita em detalhes acima, o primeiro marcador de seleção (sm I) importa pelo menos um folato na célula hospedeira e, de preferência, é um receptor de folato como é descrito acima. Esta modalidade funciona particularmente bem quando se usa DHFR como um segundo marcador de seleção (sm II). De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e o segundo marcador de seleção é uma variante da enzima de DHFR, que é menos sensível ao MTX do que a enzima DHFR do tipo selvagem. Uma combinação do respectivo marcador é particularmente preferida em combinação com as células DHFR+ (positiva). Neste caso, de preferência, uma enzima de DHFR é usado como marcador de seleção (sm II), que é menos sensível ao MTX do que a enzima DHFR endógena expressa por DHFR+ (positiva) da célula hospedeira. Os detalhes estão descritos acima e abaixo.
[00106] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira está faltando a plena atividade de pelo menos um receptor folato ligado à membrana endógena funcional. As respectivas linhagens de células podem ser obtidas por meio do processo de seleção/triagem ou por meio de técnicas de engenharia genética, por exemplo, a fim de gerar linhagens de célula knock-out. Dessa maneira, uma célula hospedeira é também fornecida, em que o sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional, por exemplo, compreendendo pelo menos uma receptor folato ligado à membrana endógena funcional, está faltando plena atividade, isto é, é atenuado. A atenuação pode ser fornecida por exemplo, por meio de qualquer tipo de mutagênese do sistema de transporte de folato endógeno em questão, por exemplo, receptor folato ligado à membrana endógena funcional, por exemplo, mutação pontual, a interrupção do gene, e similares. A atenuação pode ser parcial ou completa. Em último caso, a célula eucariótica de acordo com a presente invenção não contém um sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional, por exemplo, um receptor folato ligado à membrana endógena funcional.
[00107] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional, além do receptor folato ligado à membrana endógena funcional introduzido na dita célula hospedeira, por exemplo, através do vetor de expressão acima descrito, em particular, um ou mais receptor (es) folato ligado (s) à membrana endógena funcional. É uma vantagem da presente invenção que o sistema de seleção aqui descrito pode ser utilizado mesmo na presença de um tal sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional, isto é, onde o tal sistema endógeno é mantido. Este, como o uso das respectivas células hospedeiras para a produção subsequente do produto de interesse sob condições não seletivas é mais fácil de manusear, se o sistema endógeno for mantido e, assim, funcional.
[00108] Consequentemente, uma modalidade preferida adicional refere-se a uma célula hospedeira da presente invenção, compreendendo pelo menos um sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional, em que tal sistema de transporte de folato endógeno unidirecional funcional de preferência compreende pelo menos um receptor folato ligado à membrana endógena funcional. Em uma modalidade preferida do mesmo, o receptor folato ligado à membrana endógena funcional é selecionado a partir do grupo constituído pelo receptor alfa folato e o receptor beta folato.
[00109] Combinações adequadas adicionais são a escolha de um receptor de folato como primeiro marcador de seleção (sm I) combinado com um mutante da DHFR como segundo marcador de seleção (sm II), que é menos suscetível a um inibidor da DHFR, como MTX do que a enzima de DHFR endogenamente expressa em uma célula hospedeira DHFR+ (positiva). A dita célula hospedeira também pode ser RFC+ (positiva) como é descrita acima.
[00110] Também é fornecido um método para produzir uma célula hospedeira, como descrito acima, compreendendo a etapa de introduzir na dita célula hospedeira, pelo menos, (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I); em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção.
[00111] Existem vários métodos apropriados conhecidos no estado da técnica para a introdução de polinucleotídeos e vetores de expressão em uma célula hospedeira, incluindo as células eucarióticas, tais como as céllulas hospedeira de mamíferos. Os respectivos métodos incluem mas não estão limitados a transfecção de fosfato de cálcio, eletroporação, lipofílico, biobalística e polímero mediada por transferência de genes. Além dos métodos com base na integração aleatória tradicional, também as abordagens mediadas pela recombinação, podem ser usados para transferir o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II) para o genoma da célula hospedeira. Os métodos de recombinação podem incluir o uso de recombinases de local específico, como Cre, FLP ou Φ C31 (vide, por exemplo Oumard et al, Citotecnologia (2006) 50: 93 a 108), que podem mediar a inserção dirigida de transgenes. Alternativamente, o mecanismo de recombinação homóloga pode ser usado para inserir os ditos polinucleotídeos (revisto em Sorrell et al, Avanços da biotecnologia 23 (2005) 431 a 469).A inserção de gene baseada na recombinação permite minimizar o número de elementos a serem incluídos no ácido nucleico heterólogo que é transferido/introduzido na célula hospedeira. Por exemplo, um locus de inserção pode ser usado que já forneça promotor e local poli-A (exógeno ou endógeno) de tal forma que apenas os elementos restantes (por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, o polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II)) precisa ser transferido/transfectado para a célula hospedeira. As modalidades de um vetor de expressão adequado ou a combinação dos vetores de expressão de acordo com a presente invenção, bem como as células hospedeiras adequadas são descritas em detalhes acima; faz-se referência à descrição acima.
[00112] Os polinucleotídeos que codificam os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) adequados, bem como as combinações dos mesmos, são descritos em detalhe acima, Faz-se referência à descrição acima. De acordo com uma modalidade, um vetor de expressão ou uma combinação dos vetores de expressão de acordo com a presente invenção é introduzido na célula hospedeira. O vetor de expressão e uma combinação de vetores de expressão são descritos em detalhes acima e nas reivindicações.
[00113] Também é fornecido um método para selecionar pelo menos uma célula hospedeira capaz de expressar um produto de interesse, compreendendo (a) proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras, incluindo pelo menos (i) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (ii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I); (iii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere em forma do primeiro marcador de seleção (sm I); em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) é pelo menos parcialmente influenciada por meio da atividade do outro marcador de seleção; (b) cultivo da dita pluralidade das células hospedeiras em condições seletiva para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II), obtendo assim uma célula hospedeira que expressa o produto de interesse.
[00114] O termo "seleção", como utilizado aqui, em particular, refere-se a um processo de utilização de um marcador de seleção e as condições de cultivo seletivas para selecionar e, consequentemente, obter as células hospedeiras que incorporaram a combinação do vetor ou um vetor de acordo com a presente invenção. Assim, as células hospedeiras com sucesso transfectadas podem ser isoladas e/ou enriquecidas a partir da população de células hospedeiras transfectadas.
[00115] As células hospedeiras que não tenham sido incorporadas com sucesso a combinação de vetor ou vetor de acordo com a presente invenção de preferência, morrem ou são prejudicadas em crescimento sob as condições de cultura seletivas em relação às células hospedeiras que têm incorporado com sucesso a combinação de vetor ou vetor de acordo com a presente invenção. Durante a seleção, as células hospedeiras que têm incorporado com sucesso a combinação de vetor ou vetor de acordo com a presente invenção podem ser enriquecidas como pool a partir da população de células hospedeiras transfectadas. Também, as células hospedeiras individuais podem ser isoladas a partir da população de células hospedeiras transfectadas durante a seleção (por exemplo, por meio da seleção clonal). As modalidades adequadas dos processos de seleção, a fim de obter as células hospedeiras com sucesso transfectadas (por exemplo, FACS classificação ou diluição limitadas) são bem conhecidas no estado da técnica e, consequentemente, não precisam de descrição detalhada.
[00116] As células hospedeiras adequadas e as modalidades específicas, em particular, quanto à escolha dos marcadores de seleção (sm I) e (sm II) e suas combinações são descritas em detalhes acima.Faz-se referência à descrição acima.
[00117] Dependendo das células hospedeiras utilizadas e, consequentemente, os marcadores de seleção escolhidos (sm I) e (sm II), as condições de crescimento são adaptadas de modo a exercerem uma pressão de seleção sobre a célula hospedeira. Por exemplo, o meio de cultura seletivo pode incluir os inibidores adequados para os polipeptídeos catalíticos escolhidos como marcadores de seleção (sm I) e/ou (sm II). Por exemplo, os antifolatos, tal como MTX, podem ser utilizados, a fim de inibir a atividade da enzima de DHFR, quando DHFR é usada como marcador de seleção (sm II). Dependendo da concentração usada de tal inibidor no meio de cultura (a qual também pode ser aumentada gradualmente), o rigor das condições de seleção é aumentada. Além disso, a fim de manter a pressão de seleção, o meio de cultura não deve incluir uma quantidade suficiente de metabólitos que permitam contornar a atividade dos marcadores de seleção (sm I) e/ou (sm II). Por exemplo, se DHFR é usada como marcador de seleção (sm II), é vantajoso que o meio de cultura seletivo não inclua os nucleotídeos relevantes. Os metabólitos, em geral, interferindo a dita estratégia de seleção devem ser controlados, por exemplo, evitados. [00118] Além disso, caso o primeiro marcador de seleção (sm I) seja um polipeptídeo transportador, o meio de cultura seletivo deve incluir uma concentração limitante dos ditos compostos essenciais para o crescimento de células que são importados por meio do primeiro marcador de seleção (sm I), por exemplo, folatos no caso de o primeiro marcador de seleção (sm I) transportar o folato na célula hospedeira. Os princípios de escolha de tais condições seletivas são conhecidos no estado da técnica e também podem ser determinados experimentalmente e, dessa maneira, não precisam de descrição detalhada. As concentrações adequadas para os folatos e antifolatos adequados, em particular, para rápido crescimento de células em suspensão também são descritas aqui.
[00119] A condição de seleção para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) pode ser aplicada simultaneamente. Isso aumenta a pressão seletiva e permite um processo mais rápido de seleção, poupando uma etapa de seleção, quando as condições ideais são usadas. Isso reduz o tempo para a obtenção de linhagens de células adequadas. Por exemplo, para a combinação do marcador de seleção o receptor/DHFR de folato de um crescimento médio pode ser usado, que compreende uma quantidade reduzida de folatos e que compreende um inibidor da DHFR. Os inibidores adequados são antifolatos, tais como por exemplo, MTX.
[00120] No caso de um marcador de seleção ser usado, além de (sm I) e (sm II) as condições para o dito marcador de seleção podem ser aplicadas antes (por exemplo, em uma etapa de pré-selecção) ou simultaneamente com a aplicação das condições seletivas para os marcadores de seleção (sm I) e/ou (sm II). Por exemplo, no caso do gene neomicina de fosfotransferase (neo) ser usado como marcador de seleção adicional, as células podem ser cultivadas primeiro em um meio, por exemplo, contendo G418, a fim de selecionar as células que incorporaram o vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a presente invenção. Este primeiro meio também pode já ser seletivo para, pelo menos, um dos marcadores de seleção (sm I) ou (sm II).Posteriormente, as condições seletivas para o marcador de seleção (sm I) e/ou (sm II) são aplicadas.Este procedimento é particularmente útil no caso de um dos marcadores de seleção (sm I) e/ou (sm II) serem um marcador amplificável de seleção.
[00121] Como é descrito acima, de preferência, (sm I) é um transportador de folato, em particular um receptor de folato e, por conseguinte, uma modalidade da presente invenção é baseada na disponibilidade limitada de um folato no meio de cultura da célula. O sistema será amplamente aplicável, e em particular a uma célula eucariótica a qual a viabilidade da célula depende da absorção de um folato. Esta modalidade pode ser usada para a seleção acelerada, triagem e estabelecimento de células hospedeiras, em particular, células eucarióticas, por exemplo, mamíferos, clones de células que superexpressam de preferência de forma estável em altos níveis de produtos recombinantes. Ainda mais, e em contraste com outros sistemas de seleção conhecidos, não há necessidade essencial (embora isso às vezes seja possível) para as células modificadas, fornecidas, por exemplo, por meio da mutação ou nocauteando o (s) gene (s)endógeno (s).Uma vez que por exemplo, FR alfa exibe uma maior afinidade para FA (Kd = 0,1 nM) do que, por exemplo, RFC para leucovorina (Kt = 1 mM), e transporta ácido fólico nas células através de uma via unidirecional presente invenção prevê a utilização de FR alfa e outros receptores folato como uma acentuada melhoria do marcador de seleção metabólico dominante, em particular, através da privação do folato gradual (ácido fólico, por exemplo) a partir do meio de crescimento. Esta seleção baseada em folato é uma excelente estratégia, que é bem adequada para o nível acelerado, estável e de alta sobre-expressão de proteínas-alvo em culturas de células de mamíferos.
[00122] A estratégia da presente invenção para usar dois a um certo grau de marcadores de seleção (sm I) e (sm II) interdependentes que são de preferência envolvidos em um processo metabólico comum ou concertado ou via que tem a vantagem de um rigor muito elevado que é obtido devido aos efeitos aditivos/sinérgicos das condições de seleção visando uma via metabólica. Dessa maneira, a produtividade da seleção da população de células sobrevivente é notavelmente aumentada. Os exemplos têm mostrado que as células hospedeiras obtidas após o método de seleção produzem o produto de interesse com um alto rendimento. Também a produtividade média das células hospedeiras individuais é aumentada. Dessa maneira, as chances são melhoradas para encontrar clones de alta produção com menor esforço de triagem. Dessa maneira, o sistema de seleção de acordo com a presente invenção é superior aos sistemas de seleção utilizados no estado da técnica. Em particular, para a combinação preferida do uso de um receptor de folato em conjunto com uma enzima de DHFR como marcadores de seleção (sm I) e (sm II) de células hospedeiras é obtido, que possuem maior produtividade em comparação com o uso dos respectivos marcadores de seleção sozinhos. Dessa maneira, devido ao maior rigor das condições de seleção, o processo de seleção é otimizado.
[00123] O método de selecção de acordo com a presente invenção também pode ser realizado de forma mais rápida e de forma mais eficiente do que estratégias de seleção convencionais conhecidas no estado da técnica, como a seleção para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) pode ser realizado em uma única etapa de seleção, se as condições de cultura de célula ideais são usadas.
[00124] O método pode ainda incluir uma etapa de (c) selecionar pelo menos uma célula hospedeira a qual expressa o produto de interesse com o rendimento desejado.
[00125] As células obtidas como resultado do processo de triagem/seleção rigoroso da presente invenção geralmente são isoladas e podem ser enriquecidas a partir de células não selecionadas da população da célula original. Elas podem ser isoladas e cultivadas como células indivi-duais. É, no entanto, também possível a utilização de uma população enriquecida. As células hospedeiras obtidas também podem ser usadas em uma ou mais rodadas adicionais de seleção, opcionalmente para a análise qualitativa ou análise quantitativa adicional, ou podem ser usadas, por exemplo, no desenvolvimento de uma linhagem de células para a produção de proteínas. De acordo com uma modalidade, uma população enriquecida de produção de células hospedeiras selecionadas, como descrito acima, é usada diretamente como uma população para a produção do polipeptídeo de interesse com um bom rendimento.
[00126] De preferência, uma célula hospedeira é selecionada de forma estável, a qual expressa o produto de interesse. As vantagens de uma transfecção/expressão estável são descritas em detalhes acima. Faz-se referência à descrição acima.
[00127] Em uma modalidade mais preferida do método para a seleção, a pluralidade de células hospedeiras compreende as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, isto é, como descrito aqui. Faz-se referência à informação acima detalhada, em particular, os marcadores de seleção (sm I) e (sm II) adequados e as combinações dos mesmos.
[00128] Mais modalidades preferidas, em particular, com relação às células hospedeiras e do vetor de expressão, respectivamente, a combinação de vetores de expressão são descritas em detalhes acima. Faz-se referência à descrição acima.
[00129] De preferência, o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor/transportador que é capaz de transportar folato na célula hospedeira. Esta modalidade do sistema de seleção de acordo com a presente invenção não requer uma deleção genômica ou atenuação do receptor alfa de folato endógeno, os genes beta ou gama antes da transfecção e, portanto, pode ser aplicada a qualquer célula receptora, mesmo quando alguma expressão do gene receptor de folato endógenos está presente (vide acima). Esta vantagem principal é baseada no fato de que após a transfecção dos receptores alfa de folato, as células podem ser expostas a uma privação abrupta e grave de folatos (ácido fólico, por exemplo) a partir do meio de crescimento. Consequentemente, apenas as células transfectantes que expressam as quantidades significativas do marcador de seleção do receptor alfa de folato podem transportar folato suficiente para sustentar a replicação do DNA e a proliferação da célula. Isso ocorre na ausência de qualquer aumento significativo na expressão do gene do receptor alfa de folato endógeno. Além disso, esta modalidade do sistema de seleção de acordo com a presente invenção não sofre a perda de rigor da seleção, devido à diminuição da pressão seletiva através do aumento da expressão de rotas alternativas de captação de folato, incluindo o aumento da expressão do RFC endógeno. Essa vantagem é importante devido ao fato de que, enquanto o receptor alfa de folato tem uma afinidade excepcional para o ácido fólico (Kd = 0,1 nM), RFC exibe uma afinidade extremamente pobre para o ácido fólico (Km = 0,2 a 0,4 mM). [00130] Quando (sm II) é outra enzima de DHFR ou da via de síntese de ácidos nucleicos ou especificamente do metabolismo do folato, o meio de cultura seletivo contém, adicionalmente, um inibidor de uma respectiva enzima, por exemplo antifolatos, como por exemplo, MTX, a fim de proporcionar as condições seletivas.
[00131] O meio de cultura seletivo, que é usado em pelo menos uma etapa de seleção pode incluir um ou mais tipos de folato. O folato formado no meio de cultura seletivo em uma concentração limitante é capaz de ser levado para ser processado por meio da célula hospedeira. Os folatos e em particular os derivados de folato que não seriam processados por meio da célula hospedeira não contribuiríam para a pressão de seleção e, portanto, não contribuíram para a concentração limitante. O meio de cultura seletivo pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma concentração limitante de folato, de preferência em uma concentração de cerca de 500nm ou menos, cerca de 250nm ou menos, cerca de 150nm ou menos, cerca de 100 nm ou menos, cerca de 75nm ou menos, cerca de 50 nm ou menos, cerca de 25nm ou menos, cerca de 15nm ou menos, cerca de 10nM ou menos, cerca de 5nm ou menos, ou até cerca de 2,5 nM e em que o dito folato é o ácido fólico, de preferência, e/ou (b) compreende ácido fólico em uma concentração de cerca de 500nm ou menos, cerca de 250nm ou menos, cerca de 150nm ou menos, cerca de 100 nm ou menos, cerca de 75nm ou menos, e de preferência cerca de 50nm ou menos, e/ou (c) compreende um inibidor da DHFR; e/ou (d) compreende um antifolato; e/ou (e) compreende um antifolato em uma concentração de cerca de 500nm ou menos, cerca de 350nm ou menos, cerca de 200nM ou menos, de preferência cerca de 150nm ou menos; e/ou (f) compreende MTX como um antifolato; e/ou (g) compreende MTX em uma concentração de cerca de 350nm ou menos, 200nM ou menos, de preferência cerca de 150nm ou menos; e/ou (h) compreende ácido fólico em uma concentração de até 100 nM, de preferência até 50 nm, e uma concentração equimolar de até 20 vezes de um antifolato.
[00132] As concentrações preferidas de folato e, em particular, ácido fólico, são selecionadas a partir de: (a) cerca de 500nm a 100PM; (b) cerca de 250nm a 1 nm; de preferência cerca de 250nm a 2,5 nM ou cerca de 250nm a 5 ou 10nM; (c) cerca de 150nm a 1nm, de preferência cerca de 150nm a 2,5 nM ou cerca de 150nm a 5 ou 10nM; (d) cerca de 100 nm a 1nm, de preferência cerca de 100 nm a 2,5 nm ou cerca de 100 nm a 5 ou 10nM; (e) cerca de 75nm a 1nm, de preferência cerca de 75nm a 2,5 nM ou cerca de 75nm a 5 ou 10nM; (f) sobre 50nm a 1nm, de preferência cerca de 50nm a 2,5 nM ou cerca de 50nm a 5 ou 10nM; (g) , cerca de 50nm a 12,5 nM e (h) cerca de 25nm a 2,5 nm ou cerca de 25nm a 5nm.
[00133] As concentrações preferidas de antifolato e, em particular, MTX são selecionadas a partir de: (a) cerca de 500nm a 5nm; (b) cerca de 350 nM a 5nm; (c) cerca de 200 nM a 5 nM; (d) cerca de 100 nM a 10 nM; (e) cerca de 50 nM a 10 nM e (f) cerca de 50 nM.
[00134] As concentrações preferidas e as faixas de concentração de folato e antifolato descritas acima podem ser combinadas entre si. Em uma modalidade, uma concentração de folato de cerca de 12,5 nM a 50nm é usada em combinação com uma concentração de antifolato de 10nM a 100 nm. Como descrito, o ácido fólico, de preferência, é usado como folato e MTX como antifolato.
[00135] Além disso, foi também descoberto que as concentrações de folato e de antifolato usadas podem influenciar o outro. Dessa maneira, além da concentração absoluta de folatos e antifolatos, também a relação pode ser um fator para fornecer as condições de seleção adequadas. A concentração de antifolatos (de preferência MTX), pode ser de até cerca de 20 vezes da concentração de folato (ácido fólico, de preferência). A concentração de antifolato (de preferência MTX) pode ser cerca de 10 vezes da concentração de folato (ácido fólico, de preferência). De preferência, o meio de cultura seletivo compreende um folato e um antifolato em uma faixa de concentração de 1: 10 a 10: 1, de preferência em uma faixa de concentração de 1: 5 a 5:1. Resultados muito bons são obtidos se as concentrações equimolares aproximadamente de ácido fólico e antifolato forem usadas. Como é mostrado por meio dos exemplos, estas faixas proporcionam condições de cultura seletivas muito adequadas para a obtenção de alta produção de células hospedeiras. O meio de cultura seletivo descrito acima também constitui um elemento individual da presente invenção como a presente invenção também fornece um respectivo meio de cultura seletivo adequado para a seleção de células hospedeiras de acordo com o método da presente invenção.
[00136] As concentrações descritas acima são particularmente adequadas para o rápido crescimento das células em suspensão, que é um fenótipo preferido para linhagens de células de produção comercial. No entanto, as linhagens de células diferentes podem ter diferentes propriedades de consumo de ácido fólico. Além disso, as concentrações limitantes podem variar dependendo do folato usado, respectivamente antifolato. Portanto, as concentrações de folato limitantes, em particular, o ácido fólico e antifolato, em particular MTX, assim como o ácido fólico adequado para as faixas de MTX podem variar dependendo das células hospedeiras e folato escolhidos, respectivamente antifolato. As concentrações adequadas, no entanto, podem facilmente serem determinadas experimentalmente pelo versado na técnica.
[00137] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiras são pré-cultivadas em um meio de cultura livre de folato ou em meio de cultura que compreende uma concentração limitante de folato antes da transfecção e/ou seleção. As concentrações limitantes adequadas de folato estão descritas acima. De preferência, o dito meio de cultura para pré-cultura das células hospedeiras compreende folato, em particular, ácido fólico em uma concentração de 50 nM ou menos.
[00138] Como é descrito acima, o método de seleção de acordo com a presente invenção pode ser combinado com métodos de seleção baseados na citometria de fluxo conhecidos no estado da técnica. Dessa maneira, de acordo com uma modalidade, uma etapa de seleção envolvendo a citometria de fluxo é realizada após as células hospedeiras terem sido selecionadas de acordo com o método da presente invenção, a fim de selecionar as células hospedeiras as quais expressam o produto de interesse com um alto rendimento. Para esta finalidade, de preferência pelo menos uma parte do produto de interesse é expressa como uma membrana ancorada na fusão de polipeptídeo que é exibido na superfície da célula da célula hospedeira. Com base na quantidade de fusão de polipeptídeo apresentada, as células hospedeiras podem ser selecionadas por meio da citometria de fluxo, de preferência usando FACS, as quais expressam o produto de interesse com um alto rendimento.
[00139] De acordo com uma modalidade preferida, o polinucleotídeo de interesse é, dessa maneira, expresso a partir de a) um cassete uma expressão que compreende pelo menos aa) o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, bb) pelo menos, um códon de parada a jusante dopolinucleotídeo que codifica o produto de interesse, e cc) um polinucleotídeo a jusante do códon de parada que codifica uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana; ou b) um cassete de expressão o qual compreende pelo menos aa) o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, bb) um íntron que compreende uma fatia do local do doador na extremidade 5' e uma fatia do local do aceitador da extremidade 3' e que compreende um códon de parada na estrutura de translação e um sinal de poliadenilação, e cc) um polinucleotídeo a jusante do dito íntron que codifica uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana.
[00140] Os detalhes a respeito do design de tais cassetes de expressão foram discutidos acima. Faz-se referência à respectiva descrição. Para a seleção, as células hospedeiras são cultivadas para permitir a expressão do produto de interesse tal que pelo menos uma parte do produto de interesse é expressa como uma fusão de polipeptídeo que compreende a âncora de membrana, em que o dito polipeptídeo de fusão está sendo exibido na superfície da dita célula hospedeira e em que pelo menos uma célula hospedeira é selecionada com base na quantidade da fusão de polipeptídeo exibida na superfície da célula. Como é discutido acima, as células hospedeiras são de preferência selecionadas por meio da citometria de fluxo, em particular, FACS. Como é mostrado nos exemplos, a combinação do método de seleção de acordo com a presente invenção com uma abordagem de selação baseada no fluxo de citometria é muito vantajosa e as células hospedeiras são identificadas, as quais possuem taxas de expressão muito boas.
[00141] De acordo com uma modalidade, a presente invenção também fornece um meio de cultura seletivo que compreende folato em uma concentração limitante e um antifolato. Como é descrito acima, o folato formado no meio de cultura seletivo em uma concentração limitante é capaz de ser levado para ser processado por meio da célula hospedeira. Os folatos e, em particular, os derivados de folato que não seriam processados por meio da célula hospedeira não contribuiríam para a pressão de seleção e, portanto, não contribuiríam para a concentração limitante. O dito meio de cultura seletivo de preferência tem uma ou mais das características descritas acima para o meio de cultura seletivo utilizado em conjunto com o método de seleção descrito da presente invenção, em particular, no que diz respeito à concentração do folato e antifolato compreendido no meio e nas modalidades preferidas. Também as vantagens foram apresentadas detalhadamente acima. É que o que faz-se referência à descrição acima da qual também se aplica aqui. O dito meio de cultura seletivo pode ser usado em conjunto com o sistema de seleção da presente invenção.
[00142] Também é fornecido um processo para produzir um produto de interesse, compreendendo a etapa de cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção e/ou uma célula hospedeira selecionada de acordo com os ensinamentos da presente invenção em condições que permitam a expressão do produto de interesse.
[00143] Usando as células hospedeiras de acordo com a presente invenção para produzir um produto de interesse, em particular, um polipeptídeo que tem a vantagem de que o produto de interesse pode ser produzido com um rendimento muito alto. Este, em particular, quando executando o método de seleção de acordo com a presente invenção para a seleção de células hospedeiras adequadas para expressão. Dessa maneira, a presente invenção fornece um método melhorado para produzir um polipeptídeo de interesse. As células hospedeiras adequadas estão descritos acima; faz-se referência à descrição acima.
[00144] O produto de interesse expresso pode ser obtido por meio do interrompimento das células hospedeiras. Os polipeptídeos também podem ser expressos, por exemplo, secretados para o meio de cultura e podem ser obtidos. Também, as combinações dos respectivos métodos são possíveis. Dessa maneira, os produtos, em particular, os polipeptídeos podem ser produzidos e obtidos/isolados de forma eficiente com alto rendimento. O produto obtido pode também ser sujeito às etapas de processamento, tais como: por exemplo, as etapas de purificação e/ou de modificação a fim de produzir o produto de interesse na qualidade desejada. De acordo com uma modalidade, as ditas células hospedeiras são cultivadas em condições livres de soro. [00145] O método para produzir o produto de interesse pode incluir pelo menos uma das seguintes etapas: - isolar o produto de interesse a partir do tal meio de cultura da célula e/ou a partir da dita célula hospedeira e/ou; - transformar o produto isolado de interesse.
[00146] O produto de interesse, por exemplo, um polipeptídeo, produzido de acordo com a presente invenção pode ser recuperado, adicionalmente purificado, isolado e/ou modificad por meio dos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o produto pode ser recuperado a partir do meio nutriente por meio de procedimentos convencionais, incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, ultrafiltração, extração ou precipitação. A purificação pode ser realizada por meio de uma variedade de procedimentos bem-conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbico e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio) ou extração.
[00147] O produto de interesse pode ser qualquer produto biológico capaz de ser produzido por meio da transcrição, tradução ou qualquer outro evento de expressão da informação genética codificada por meio do dito polinucleotídeo. A este respeito, o produto será um produto de expressão. O produto de interesse pode ser selecionado a partir do grupo que consiste nos polipeptídeos e ácidos nucleicos, RNA, em particular. O produto pode ser um composto farmacêutico ou terapeuticamente ativo, ou uma ferramenta de pesquisa para ser utilizada em ensaios e similares. Em uma modalidade particularmente preferida, o produto é um polipeptídeo, de preferência um polipeptídeo farmacêutico ou terapeuticamente ativo, ou uma ferramenta de pesquisa para ser utilizada em diagnóstico ou outros ensaios e similares. Um polipeptídeo é, portanto, não limitado a qualquer proteína ou grupo específico de proteínas, mas pode, pelo contrário, ser qualquer proteína, de qualquer tamanho, função ou origem, o que se deseja selecionar e/ou expressar através dos métodos descritos neste documento. Assim, vários polipeptídeos diferentes de interesse podem ser expressos/produzidos. O termo "polipeptídeo" refere-se a uma molécula que compreende um polímero de aminoácidos ligado entre si por meio de uma ligação peptídica (s). Os polipeptídeos incluem os polipeptídeos de qualquer comprimento, incluindo as proteínas (por exemplo, as que possuem mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, os que possuem de 2 a 49 aminoácidos). Os polipeptídeos, as proteínas e/ou os peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade, incluindo, por exemplo os polipeptídeos bioativos, tais como as proteínas enzimáticas ou os peptídeos (por exemplo, proteases, quinases, fosfatases), as proteínas receptoras ou os peptídeos, as proteínas transportadoras ou os peptídeos, as proteínas de ligação à bactericida e/ou endotoxina, as proteínas estruturais ou os peptídeos, os polipeptídeos imune, as toxinas, os antibióticos, os hormônios, os fatores de crescimento, as vacinas ou similares. O dito polipeptídeo pode ser selecionado a partir do grupo consistindo nos hormônios peptídicos, interleucinas, ativadores de plasminogênio de tecido, citocinas, imunoglobulinas, em particular, os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos funcionais ou variantes dos mesmos. Em uma modalidade mais preferida ainda, o polipeptídeo é uma molécula de imunoglobulina ou anticorpos, ou uma variante funcional do mesmo, por exemplo, um quimérico, ou um anticorpo parcial ou totalmente humanizado. Tal anticorpo pode ser um anticorpo de diagnóstico, ou um anticorpo farmacêutica ou terapeuticamente ativo.
[00148] Também é fornecido um produto obtido por meio de um método de acordo com a presente invenção, tal como definido acima e nas reivindicações. O dito produto é de preferência um polipeptídeo, em particular, uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional do mesmo.
[00149] Um outro aspecto da presente invenção pertence ao uso de um primeiro marcador de seleção (sm I) em combinação com um segundo marcador de seleção (sm II), o qual difere do primeiro marcador de seleção (sm I), em que a atividade de um marcador de seleção (sm I) ou (sm II) são pelo menos parcialmente influenciados por meio da atividade do outro marcador de seleção, para a seleção de uma célula hospedeira sendo capaz de expressar um produto de interesse.
[00150] O primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) pode ter pelo menos uma das seguintes características: (a) o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) estão envolvidos em um processo ou uma via metabólica selecionada a partir de (aa) a síntese de ácidos nucleicos e/ou a síntese de polipeptídeo; (ab) síntese de nucleotídeos e/ou síntese de aminoácidos e (ac) o metabolismo do folato e/ou; (b) o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico ou um polipeptídeo transportador e/ou; (c) o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico processando (ca) um substrato o qual é um composto que é importado por meio do primeiro marcador de seleção (sm I) em uma célula hospedeira ou um produto subsequente obtido a partir dito composto incorporado e/ou (cb) um substrato o qual, ou um precursor o qual, é produzido por meio da atividade do primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou; (d) o primeiro marcador de seleção (sm I) opera a montante do segundo marcador de seleção (sm II), e/ou (e) o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende um polipeptídeo veículo importando um composto envolvido e/ou essencial para a viabilidade da célula e/ou para a proliferação em uma célula hospedeira; e/ou (f) o primeiro marcador de seleção (sm I) que transporta/incorpora pelo menos um folato na célula hospedeira; e/ou (g) o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende um receptor de folato ligado à membrana funcional; e/ou (h) o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico que processa um substrato o qual é tanto um folato um e/ou um produto subsequente obtido a partir de um folato; e/ou (i) o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de folato ligado à membrana funcional o qual é ou inclui um receptor de folato tendo uma ou mais das seguintes características (ia) o receptor de folato é selecionado a partir do grupo que consiste em um receptor alfa de folato, um receptor beta de folato, um receptor gama de folato e variantes funcionais do exposto, e/ou (ib) o receptor de folato é um receptor humano de folato ou uma variante funcional do mesmo, e/ou (ic) o receptor de folato é um receptor alfa humana de folato ou uma variante funcional do mesmo, e/ou (id) o receptor de folato é um receptor de folato tendo ou compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ. ID. N°. 1,2 ou 3 ou uma variante funcional do exposto, e/ou (j) o (s) marcador (es) de seleção (sm I) e/ou (sm II) é (são) ou compreende (m) um polipeptídeo catalítico envolvido na síntese do ácido nucleico e/ou o metabolismo do folato, de preferência, DHFR ou uma variante ou fragmento funcional do mesmo, e/ou (k) o primeiro marcador de seleção (sm I) é composto por um polipeptídeo transportadorincorporando um composto envolvido e/ou essencial para a síntese de ácido nucleico em uma célula hospedeira e o segundo marcador de seleção (sm II) é um polipeptídeo catalítico envolvido na síntese de ácidos nucleicos; e/ou; (l) o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) é um marcador de seleção de células eucarióticas, e/ou (m) o primeiro marcador de seleção (sm I) e/ou o segundo marcador de seleção (sm II) é um marcador amplificável de seleção. [00151] Os detalhes, as combinações e as vantagens destas modalidades estão descritos acima. Faz-se referência à descrição acima. Particularmente preferida é uma combinação de um transportador de folato, tal como um receptor de folato com a DHFR, ou uma variante ou derivado funcional funcional do mesmo.
[00152] Os conteúdos completos dos textos e documentos mencionados aqui são incorporados por referência e, portanto, fazem parte da descrição presente.
[00153] Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção, sem de forma alguma limitar o escopo da mesma. Em particular, os exemplos se relacionam com as modalidades preferidas da presente invenção.
Exemplos [00154] Em geral, os materiais adequados, tais como reagentes, estão familiarizados para aqueles versados na técnica, disponíveis comercialmente e podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Os exemplos são realizados de acordo com as instruções descritas. 1. Exemplo 1 - Seleção [00155] Um experimento de cotransfecção em células CHO é feito usando vetores que possuem cassetes de expressão idênticos para a mesma proteína de interesse (anticorpo monoclonal), mas diferentes combinações de marcadores de seleção. Este experimento demonstra que uma seleção combinada de MTX e as concentrações limitantes de ácido fólico no meio de cultura da célula permite a geração de populações de células altamente superexpressando o produto de interesse, aqui uma molécula de imunoglobulina, e que a produtividade destas populações é maior em comparação com as estratégias usando DHFR ou receptor alfa de ácido fólico (FolR) como marcador de seleção metabólico sozinho. 1.1. Materiais e Métodos 1.1.1. Construção do vetor: [00156] VETOR I contém um cassete de expressão da DHFR (mutante para linhagens de células DHFR+ (positiva). O dito vetor plasmidial (VETOR I), adequado para expressão em células eucarióticas, em particular as células CHO, porta: (i) um cassete de expressão o qual compreende um polinucleotídeo que codifica um cassete de expressão da cadeia pesada que codifica a cadeia leve de um anticorpo humano recombinante secretado do tipo lgG1. A expressão do anticorpo recombinante está sob controle de um promotor CMV e um sinal de poliadenilação padrão (SV40); (ii) um cassete de expressão distinto, o qual compreende um polinucleotídeo que codifica uma DHFR (uma forma mutante que possui uma menor sensibilidade para MTX) como gene marcador de seleção (sm II). A expressão da DHFR está sob controle de um promotor SV40 e um sinal de poliadenilação padrão (SV40).
[00157] O vetor plasmídeo (VETOR II) compreende um receptor alfa humana de ácido fólico como o primeiro marcador de seleção (sm I), em vez de DHFR. Dessa maneira, dois vetores contêm um gene de resistência G418 (neo), mas diferentes marcadores adicionais, nomeadamente DHFR ou o receptor alfa humano do ácido fólico. VETOR I e VETOR II incluem os seguintes elementos principais: 1.1.2. Transfecção e seleção de células CHO-: [00158] O cultivo, a transfecção e a triagem das células são realizados em frascos de agitação com suspensão de cultivo de células CHO em um meio de cultura convencional. A fim de reduzir os reservatórios intracelulares de ácido fólico nas células hospedeiras e evitar a cotransferência de ácido fólico a partir do meio de pré-cultivo para o meio de seleção, as células são várias passadas para o meio livre de ácido fólicoou o meio com teor de ácido fólico reduzido (por exemplo, 50 nM) antes da transfecção e seleção.
[00159] As células são cotransfectadas com o VETOR I e o VETOR II por meio da eletroporação. Dependendo da viabilidade da célula, uma primeira etapa de seleção é iniciada 24 a 48 horas após a transfecção, adicionando G418 e ácido fólico a 10 nM contendo o meio seletivo para as células. Assim como as células recuperadas para uma viabilidade acima de 80%, uma segunda etapa de seleção é aplicada por meio da passagem das células ao meio livre de G418, contendo MTX a 100 nM e ácido fólico a 10 nM. A concentração de ácido fólico pode ser aumentada para 20 nM e 100 nM, posteriormente, se as células não se recuperam nas condições mais severas. Os pools, onde ainda não há crescimento, mas o aumento da viabilidade pode ser visto nas células que são transferidas para meio de cultura contendo ácido fólico a 11,3 mM e não MTX. Após esta transferência, as populações cotransfectadas de células que começam a crescer são expandidas para posterior análise. 1.1.3. Determinação da produtividade do pool: [00160] A produtividade das populações de células selecionadas é analisada após as etapas de seleção inicial e final através das culturas de batelada de frascos de agitação supercrescidas, em um meio contendo ácido fólico a 11,3 mM sem G418 e MTX.
[00161] As culturas de batelada são semeadas em um frasco de agitação 125 com 50 ml de volume de trabalho e cultivadas em um armário de agitação (não umidificado) a 150 rpm e 10% de CO2. A viabilidade das células tem que ser > 90% ao iniciar 0 ensaio. A densidade da semeadura das células é de aproximadamente 2x105 c/ml. A determinação do título acontece no dia 13. Os anticorpos títulos no sobrenadante de cultura de células são determinados por meio das proteínas HPLC A 13 dias após 0 início da cultura. 1.2. Resultados [00162] Para demonstrar a eficácia de uma estratégia de seleção usando DHFR e FolR como marcadores de seleção, é feita uma cotransfecção dos vetores que codificam DHFR (VETOR I) e FolR (VETOR II) e um anticorpo monoclonal idêntica. Ambos os vetores também contêm um gene de resistência G418 (vide acima). 1.2.1. Etapa da Primeira Seleção: [00163] Em primeiro lugar, as populações de células transfectadas são selecionadas através da adição de G418 e reduzindo a concentração de ácido fólico para 10 nm. Esta etapa de pré-seleção inicial ajuda a matar as células não-transfectadas e em paralelo força as células a consumirem os seus reservatórios intracelulaes de ácido fólico antes que as condições de seleção mais rigorosas são aplicadas na segunda etapa de seleção. Sob estas primeiras condições de seleção, todas as populações de células transfectadas geralmente se recuperam e a produtividade é avaliada como descrita nos materiais e nos métodos. As células transfectadas selecionadas em G418 e ácido fólico a 10 nM contendo meio são analisadas em culturas de batelada de frascos de agitação. No dia 13 da cultura, as amostras do meio de cultura são tomadas e analisadas quanto ao teor de anticorpos por meio da Proteína-A HPLC. A Tabela 1 resume os resultados de produtividade obtidos em um exemplo de atuação: Tabela 1: Produtividade de populações de células após a primeira etapa de seleção sem MTX
[00164] Todas as populações de células produzem anticorpos. As células transfectadas com o vetor FolR (VETOR II) em combinação com o vetor de DHFR (VETOR I), respondem com maior produtividade média para a seleção do que os métodos convencionais da técnica anterior (por exemplo, DHFR sozinho). O teor de ácido fólico limitado no meio de cultura promove o crescimento de células superexpressando FolR. 1.2.2. Segunda Etapa de Seleção: [00165] Para aumentar o rigor de seleção, a próxima etapa é remover G418, mas a adição de MTX a 100 nM para o meio de cultura e para manter a concentração de ácido fólico a 10 nM. Sob essas condições, a viabilidade das células de todas as populações transfectadas dramaticamente cai e permanece em níveis baixos. Além disso, nenhum crescimento da célula é normalmente detectado. A pressão seletiva pode ser reduzida através do aumento do primeiro teor de ácido fólico a 20 nM e depois para 100 nM. A fim de impulsionar o crescimento das populações seleccionadas para avaliação da produtividade, as células viáveis recuperadas podem ser transferidas para um meio sem MTX e com ácido fólico a 11,3 mM. Um pool já parcialmente recuperado a partir da transfecção dupla é mantido separadamente e em um meio contendo ácido fólico a 100 nM, enquanto os outros pools de cada combinação do vetor são combinados para aumentar a densidade de células e, dessa maneira, as chances de sobrevivência. As células duplas transfectadas respondem com crescimento rápido, são mais alargadas e a produtividade é analisada. A Tabela. 2 mostra os resultados: Tabela 2: Produtividade das populações de células após a segunda etapa de seleção [00166] As populações de células selecionadas de G418 e ácido fólico a 10 nM são selecionadas adicionalmente por meio da adição de MTX a 100 nM e um aumento gradual da concentração de ácido fólico. Finalmente, as células são transferidas para MTX livre e ácido fólico 11,3 mM contendo o meio e as populações recuperadas são analisadas em culturas de batelada do frasco de agitação. No dia 13 da cultura, as amostras do meio de cultura são tomadas e analisadas quanto ao teor de anticorpos por meio da Proteína A HPLC.
[00167] A produtividade das populações de células duplas transfectadas após este processo de seleção é surpreendentemente alta. Em comparação com a primeira etapa de seleção, os anticorpos título aumentaram cerca de 20 vezes no caso do pool 1 atingindo mais de 1 g/L e 10 vezes no caso dos pools combinados 2 a 5. Além disso, em comparação aos procedimentos de selecção muito mais intensivamente otimizados usando, por exemplo, DHFR sozinho em combinação com o G418 como marcadores de seleção, as produtividades encontradas após a seleção dupla são muito mais altas com a combinação de vetores de acordo com a presente invenção. Os experimentos anteriores, utilizando uma combinação DHFR/G418 para o mesmo anticorpo resultaram em títulos de pool consideravelmente menores.
[00168] Dessa maneira, a seleção combinada usando DHFR e FolR como marcadores de seleção gera células altamente superexpressando uma proteína de interesse. Esta combinação também é superior ao estado dos sistemas de seleção da técnica (por exemplo DHFR/G418). 2. Exemplo 2: Otimização das condições de seleção 2.1. Caracterização, transfecção e seleção do clone 2.1.1. Transfecção e Seleção: [00169] Para a otimização das condições de seleção, as combinações adicionais de ácido fólico e as concentrações de MTX são testadas em duas etapas de seleção sequenciais. Em primeiro lugar, em um meio contendo G418 a 0,8 g/L, as concentrações de ácido fólico a 12,5 nM, 25 nM, 50 nM e 11,3 mM (referência) são combinadas com MTX a 2,5 nM, 5 nM, 10 nM ou sem MTX. As populações de células que foram recuperadas sob estas condições em uma segunda etapa de seleção são transferidas para meio sem G418 contendo a concentração de ácido fólico, mas a uma concentração de MTX 10 vezes maior como na primeira etapa de seleção. As células de referência são transferidas para o meio contendo MTX a 500 nM de acordo com um protocolo padrão de seleção de DHFR. 2.1.2. A caracterização e a Clonagem e do Clone [00170] A clonagem é realizada por meio da limitação da diluição com as células semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 0,5 célula por poço. Posteriormente, as células são expandidas primeiro às placas de 24 poços e,, em seguida, aos frascos de agitação para a triagem da produtividade.
[00171] A produtividade dos clones é analisada em batelada e os experimentos de batelada de alimentação utilizando diferentes formatos. A triagem inicial é feita em ensaios de batelada de placas de 24 poços semeando as células nas placas de 24 poços agitadas. Os anticorpos título no sobrenadante de cultura de células são determinados por meio das proteínas quantitativa A-HPLC 10 dias após o início da cultura. A maior produção de clones é posteriormente analisada em modelos de frasco de agitação em batelada e em um modo de batelada alimentado. As culturas de batelada em um meio de cultura contendo ácido fólico a 11,3 mM são semeadas em frascos de agitação (500 mL ou 250 mL de capacidade) com 100 mL ou 50 mL de volume de trabalho e são cultivadas em um armário de agitação (não-umidificado) a 150 rpm, 36,5Ό e 10% de CO 2. A viabilidade das células é > 90% ao iniciar 0 ensaio. A densidade da semeadura de células é 2x105 c/mL. Os anticorpos título, 0 número de células e a viabilidade podem ser determinados em momentos definidos cultura. Os experimentos da batelada de alimentação são feitos usando as mesmas condições, mas com uma densidade da célula inicial de 4x105 c/mL e com adição regular de alimentos a partir das densidades de células viáveis acima de 7x106 c/mL. A estabilidade clonal é avaliada por meio da cultura das células ao longo de um período de até 19 semanas, com medições de produtividade utilizando 0 modelo de frasco de agitação aproximadamente a cada duas semanas. 2.2. Resultados: 2.2.1. Primeira Etapa de seleção: [00172] As células transfectadas são selecionadas em uma primeira etapa de seleção em concentrações de ácido fólico variando de 12,5 nM a 50 nM em combinação com concentrações de MTX de 2,5 nM a 10 nM. Como uma referência, também ácido fólico a 11,3 μ M (FA) é testado. As produtividades obtidas após a primeira etapa de seleção estão resumidas na tabela 3.
Tabela 3: Produtividade das células após a primeira etapa de seleção em diferentes combinações de ácido fólico e as concentrações de MTX. Todos os valores são mg/L.
[00173] Verificou-se que as mais altas produtividades são obtidas após a seleção com MTX a 10 nM. As células cotransfectadas com VETOR I e VETOR II produziram quantidades surpreendentemente elevadas do produto (até 887 mg/L). Isso é significativamente mais do que a produtividade das células transfectadas com DHFR sozinho (referêcnia de dhfr sozinho). 2.2.2. Segunda Etapa de Seleção: [00174] Uma segunda etapa de seleção é aplicada às populações recuperadas por meio da transferência de células para meio livre de G418, mantendo a concentração de ácido fólico da primeira etapa de seleção, mas o aumento da concentração de MTX 10 vezes. A produtividade é analisada para a população de células que recuperou sob essas condições. Os resultados estão resumidos na tabela 4.
Tabela 4: Produtividade das células após a segunda etapa de seleção em diferentes combinações de ácido fólico e as concentrações de MTX. Todos os valores são mg/L.
[00175] Surpreendentemente, descobriu-se que, em condições de seleção apropriadas, as células transfectadas com VETOR I e VETOR II e, consequentemente, uma combinação de acordo com a presente invenção, têm uma produtividade muito maior (até 1,5 g/L) em comparação com as células transfectadas com o VETOR I sozinho. Isso mostra que a combinação de DHFR e FolR como marcadores de seleção fornece um rigor de seleção altamente aumentado. Dessa mmaneira, a presente invenção proporciona uma melhoria considerável sobre a técnica anterior. 2.2.3. Comparação da produtividade clonal [00176] Os clones são gerados por meio da clonagem de diluição limitante dos pools cotransfectados após a seleção. A maior produção dos clones identificada na triagem de placa de 24 poços é ampliada para os frascos de agitação. A produtividade é analisada em um ensaio de batelada do frasco de agitação superexpresso e em comparação com os resultados dos clones acima obtidos com os vetores individuais em experiências anteriores.
Tabela 5: Produtividade dos 5 clones top a partir da limitação da diluição da clonagem em um modelo de batelada do frasco de agitação. Todos os valores são g/L de anticorpos nos dias 13 a 15 da cultura.
[00177] A maior produção de clones são obtidas por meio da co-transfecção dos vetores contendo DHFR e folR como marcadores selecionáveis e por meio da seleção das células transfectadas sob as concentrações de ácido fólico limitantes e MTX. 2.2.4. Análise da Estabilidade de Produção Clonal [00178] A estabilidade da produção clonal dos clones cotransfectadose selecionados DHFR/folR top 10 é determinada por meio de um período de 19 semanas tendo início a partir do descongelamento dos frascos e a primeira avaliação de produtividade na semana 5 após o descongelamento. As células são cultivadas sob condições seletiva em ácido fólico a 50 nM e MTX a 50 nM. Ensaio de produtividade são realizados com meio de cultura contendo ácido fólico a 11,3 mM.
Tabela 6: Estabilidade da produção clonal dos clones top 10 a partir da limitação da diluição da clonagem em um modelo de batelada do frasco de agitação. Todos os valores são mg/L de anticorpos nos dias 13 a 15 da cultura.
[00179] Oito dos dez clones analisados mostram alta estabilidade da produção com mais de 19 semanas e todos os dez clones mostram estabilidade suficiente durante 12 semanas.
3. Exemplo 3 - Seleção usando um vetor de combinação e classificação FACS 3.1. Construção do vetor: [00180] Um vetor III contendo os marcadores de seleção de DHFR e FolR em uma estrutura principal é gerado, o qual também permite maior seleção usando a classificação FACS. O dito VETOR III compreende um cassete de expressão para expressar a cadeia pesada de anticorpos a qual compreende um códon de parada "leaky" e uma âncora da transmembrana de imunoglobulina. Como é descrito acima na descrição, este design do cassete de expressão tem o efeito (devido à leitura de translação através de processos) de que uma parte dos anticorpos é produzida como proteínas de fusão que são ancoradas à superfície da célula da célula hospedeira. O VETOR III compreende os seguintes elementos principais: [00181] Este Vetor DHFR/FoIR-FACS (VETOR III) é comparado a um vetor de referência DHFR-FACS que contém o gene neo como um segundo marcador de seleção (VETOR IV). VETOR IV compreende os seguintes elementos principais: Ό0182] Além disso, para experimentos da cotransfecção utilizando dois vetores de expressão e classificação FACS, VETOR V é criado, o qual compreende nenhum gene de DHFR, mas o gene neo e o huFoIR.O VETOR V compreende os seguintes elementos principais: 3.2. Caracterização, clonagem e seleção do clone: [00183] As células transfectadas com a combinação do VETOR III são selecionadas em um meio contendo ácido fólico a 12,5 nM e MTX a 5 nM. As células transfectadas com o vetor de referência são selecionadas em um meio contendo ácido fólico a 12,5 nM, MTX a 5 nM e G418 a 0,8 g/L. Em uma segunda etapa de seleção, aplicada após um ciclo de enriquecimento FACS a concentração MTX é aumentada para 50 nM enquanto que a concentração de ácido fólico é mantida constante e G418 é removido. As populações de células recuperadas (pools) são selecionadas para a produtividade em culturas de batelada de frascos de agitação.
Análise de FACS,Enriquecimento e Clonagem das Células [00184] A rotulagem das células: 2x10E7 transfectadas por pool são centrifugadas e lavadas com 5 mL de PBS gelado e ressuspensas em 1 mL de PBS frio. A quantidade adequada de anticorpo anti-lgG rotulado FIITC (fornecedor) é adicionada para as células e é incubada no gelo por 30 minutos no escuro. Posteriormente, as células são lavadas duas vezes em temperatura ambiente com 5 mL de PBS, ressuspensas em 1 mL de PBS, filtradas e dispensadas em um tubo FACS para a análise, a triagem e a clonagem. A separação das células é realizada com um FACSAria (Becton Dickinson) equipada com uma unidade automática de deposição da célula (ACDU) usando um software FACSDiva. Um laser de baixa potência refrigerado a ar e de estado sólido (Coherent® Sapphire ™ estado sólido) ajustado para 488 nm é usado para excitar os corantes de fluoresceína ligados ao anticorpo secundário. A intensidade relativa de fluorescência FITC é medida em um detector E através do filtro BP 530/30. Cinco porcento da células fluorescentes mais altas do FITC são fechadas e separadas tanto em bloco quanto como em células isoladas em placas de 96 poços.
[00185] Os clones são gerados quer por meio da limitação de diluição a partir dos pools enriquecidos por FACS ou por meio de clonagem dos pools enriquecidos ou não enriquecidos por FACS.
Determinação da Produção de Anticorpos e Estabilidade Clonal [00186] A produtividade dos clones é analisada em batelada e os experimentos de batelada alimentados utilizando diferentes formatos. A triagem inicial é feita em ensaios de batelada de placas de 24 poços por meio da semeadura das células em placas de 24 poços agitadas. Os anticorpos título no sobrenadante da cultura de células são determinados por meio de proteínas quantitativas A-HPLC 10 dias após o início da cultura. A maior produção de clones é posteriormente analisada em modelos de frasco de agitação em uma batekada e em um modo de batelada alimentado. As culturas de batelada em um meio de cultura contendo ácido fólico a 11,3 mM são semeadas em frascos de agitação(500 mL ou 250 mL de capacidade) com 100 mL ou 50 mL de volume de trabalho e são cultivadas em um armário de agitação (não umidificado) a 150 rpm, 36,50 e 10% de CO 2. A viabilidade das células deve se r> 90% ao iniciar 0 ensaio. A densidade de semeadura de células é 2x105 c/mL. Os anticorpos título, 0 número de células e a viabilidade podem ser determinados em momentos de cultura definidos. Os experimentos de batelada de alimentação são feitos usando as mesmas condições, mas com uma densidade da célula de partida de 4x105 c/mL e com a adição regular de alimentos a partir das densidades de células viáveis acima de 7x106 c/mL.A estabilidade clonal é avaliada através da cultura das células ao longo de um período de até 19 semanas, com medições de produtividade utilizando 0 modelo de batelada defrascos de agitação aproximadamente a cada duas semanas. 3.3. Resultados: [00187] Cinco populações de células, transfectadas com 0 vetor de combinação DHFR/FolR (VETOR III) e três populações de células transfectadas com 0 vetor de referência (VETOR IV) são geradas e selecionadas como descrito acima. A produtividade dos pools de células recuperadas nas culturas de batelada de frascos de agitação é resumida na tabela 5.
Tabela. 7: Produtividade das células após uma etapa de seleção, transfectadas com um vetor de combinação DHFR/FolR ou um vetor de DHFR/Neo (de referência). Todos os valores são mg/L.
[00188] Uso do vetor de combinação DHFR/FolR (VETOR III) leva a produtividades surpreendentemente boas já depois de apenas uma etapa de seleção.
[00189] Os pools são tratados posteriormente por meio da aplicação de um ciclo de enriquecimento de FACS e uma segunda etapa de seleção com 10 vezes maiores de concentrações de MTX. Novamente, as produtividades de pool muito alta são obtidas através do qual o vetor de combinação funciona tão bem como a abordagem da cotransfecção (vide Tabela 8).
Tabela. 8: Modelo de batelada de frasco de agitação: Pools enriquecidos por FACS após a segunda etapa de seleção (MTX a 50 nM). Todos os valores são mg/L.
[00190] Os clones são gerados por meio da limitação de diluição a partiir de um pool enriquecido por FACS e expandidos para as placas de 24 poços para a triagem principal. Os melhores produtores são ampliados para agitar os frascos. A produtividade é analisada em culturas de batelada de frasco de agitação e em comparação com os resultados dos clones top obtidos em experimentos anteriores com o vetor de referência DHFR por meio da clonagem FACS.
[00191] A produtividade dos clones transfectados com a combinação do VETOR III em um modelo de batelada do frasco de agitação é significativamente maior em comparação com os clones que foram transfectados com a referência do vetor IV, que compreende apenas o gene de DHFR (vide Tabela 9) Tabela 9: Modelo de batelada de frasco de agitação: Os clones top 5 do vetor de referência DHFR (VETOR IV) e o vetor de combinação (VETOR III). Todos os valores são g/L.
[00192] Os clones transfectados com o VETOR III são ainda analisados para a estabilidade da produção clonal por meio do descongelamento dos frascos criopreservados e monitoramento de produtividade em um modelo de batelada de frasco de agitação. A produtividade é monitorada a partir de 5 semanas após o descongelamento à semana 19 após o descongelamento e comparada com a produtividade antes da criopreservação. Os clones são cultivados em condições seletivas, enquanto que as culturasde batelada dos frascos de agitação são realizadas em meios com alto teor de ácido fólico (11,3 mM).
Tabela 10: Análise da estabilidade de produção clonal [00193] Apenas um dos 12 clones analisados mostra a perda de mais de 25% na produtividade em um período de 19 semanas, todos os outros mostram alta estabilidade de produção. IV. Exemplo 4 - Produção em grande escala de polipeptídios com células CHO transfectadas [00194] A produção de polipeptídeos em larga escala pode ser feita, por exemplo, em biorreatores de aço de vidro, de onda, ou aço inoxidável. Para o efeito, as células são expandidas, geralmente a partir de um único frasco congelado, por exemplo um frasco de um banco de células. As células são descongeladas e expandidas através de várias etapas. Os biorreatores de escala diferentes são inoculados com quantidades adequadas de células. A densidade das células pode ser aumentada por meio da adição de soluções de alimentação e os aditivos para o biorreator. As células são mantidas a uma alta viabilidade por um tempo prolongado. As concentrações do produto no reator que variam de algumas centenas de miligramas por litro até vários gramas por litro são obtidos em grande escala. A purificação pode ser feita por meio da metodologia de cromatografia padrão, a qual pode incluir afinidade, troca iônica, interação hidrofóbica ou etapas do tamanho cromatografia de exclusão. O tamanho do biorreator pode ser de até vários litros de volume mil na escala final (vide também, por exemplo F. Wurm, Nature Biotechnology vol. 22, 11,2004, 1393 a 1398).
REIVINDICAÇÕES

Claims (22)

1. Vetor de expressão ou uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse ou um local de inserção para incorporar um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I), em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato; e (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), em que o segundo marcador de seleção (sm II) é uma redutase de di-hidrofolato (DHFR)smsm.
2. Vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de folado ligado à membrana ou um carreador de folato reduzido (RFC); (b) o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de folato ligado à membrana, e/ou (c) em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e o segundo marcador de seleção é uma variante da enzima de DHFR, que é menos sensível para MTX do que a enzima de DHFR do tipo selvagem e/ou a enzima de DHFR endogenamente expressa por meio da célula hospedeira.
3. Vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro marcador de seleção (sm I) é ou compreende um receptor de folato humano ou uma variante funcional do mesmo e/ou o primeiro marcador de seleção é um receptor de folato tendo ou compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ. ID. N°. 1,2 ou 3 ou uma variante funcional do que precede.
4. Vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse é composto de um cassete de expressão o qual compreende pelo menos (a) o polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, (b) pelo menos um códon de parada a jusante do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse, e (c) um polinucleotídeo a jusante do códon de parada que codifica uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana.
5. Método para produzir uma célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de introduzir em uma célula hospedeira, pelo menos, (a) um polinucleotídeo que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I), em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato; (c) um polinucleotídeo que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), em que o segundo marcador de seleção (sm II) é uma redutase de di-hidrofolato (DHFR); em que uma célula hospedeira é fornecida que compreende (a) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (b) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I), em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato; e (c) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), em que o segundo marcador de seleção (sm II) é a redutase de di-hidrofolato (DHFR)smsm.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um vetor de expressão ou uma combinação dos vetores de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, é introduzido na célula hospedeira.
7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula DHFR+ (positiva) em o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e o segundo marcador de seleção (sm II) é uma variante de DHFR que é menos sensível ao MTX do que a enzima de DHFR selvagem e/ou a enzima de DHFR endógena expressa pela célula hospedeira.
9. Método para selecionar pelo menos uma célula hospedeira capaz de expressar um produto de interesse recombinantemente, caracterizado pelo fato de que compreende (a) proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras, incluindo pelo menos (i) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (ii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I), em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato; e (iii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), em que o segundo marcador de seleção (sm II) é uma redutase de di-hidrofolato (DHFR); smsm(b) cultivar a dita pluralidade de células hospedeiras em condições seletivas para os marcadores de seleção (sm I) e (sm II), obtendo assim uma célula hospedeira a qual expressa o produto de interesse.
10 . Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de (c) selecionar pelo menos uma célula hospedeira a qual expressa o produto de interesse.
11 . Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que um meio de cultura seletivo é usado em pelo menos uma etapa de seleção, o qual compreende folato em uma concentração limitante e em um antifolato.
12 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão ou uma combinação dos vetores de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
13 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO.
14 . Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula DHFR+ (positiva) em o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e o segundo marcador de seleção (sm II) é uma variante de DHFR que é menos sensível ao MTX do que a enzima de DHFR selvagem e/ou a enzima de DHFR endógena expressa pela célula hospedeira.
15 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que um meio de cultura seletivo é usado em pelo menos uma etapa de seleção, o qual compreende folato em uma concentração limitante e um antifolato e em que o meio de cultura seletivo é composto de folato na concentração de 20nM a 500nM, de preferência 20nM a 100 nM, e/ou em que o meio de cultura seletivo compreende um antifolato em uma concentração de 100 nM ou menos.
16 . Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura seletivo compreende folato em uma concentração limitante de 20nM a 50nM e um antifolato em uma concentração de 10nM a 100nM.
17 . Processo para produzir um produto de interesse recom-binantemente, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de (a) uma célula hospedeira que compreende (i) um polinucleotídeo introduzido que codifica um produto de interesse; (ii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um primeiro marcador de seleção (sm I), em que o primeiro marcador de seleção (sm I) é um transportador de folato; e (iii) um polinucleotídeo introduzido que codifica um segundo marcador de seleção (sm II), em que o segundo marcador de seleção (sm II) é uma redutase de di-hidrofolato (DHFR); (b) uma célula hospedeira selecionada como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 16 em condições que permitam a expressão do produto de interesse.
18 . Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que inclui pelo menos uma das seguintes etapas: (a) isolar o produto de interesse a partir do dito meio de cultura da célula e/ou a partir da dita célula hospedeira; e/ou (b) o processamento do produto isolado de interesse.
19 . Processo de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende um vetor de expressão ou uma combinação dos vetores de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
20 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO.
21 . Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula DHFR+ (positiva) em o primeiro marcador de seleção (sm I) é um receptor de ácido fólico e o segundo marcador de seleção (sm II) é uma variante de DHFR que é menos sensível ao MTX do que a enzima de DHFR selvagem e/ou a enzima de DHFR endógena expressa pela célula hospedeira.
22 . Uso de um meio de cultura seletivo compreendendo um antifolato em uma concentração de 20nM a 100nM e folato em uma concentração limitante de 500nM ou menos, caracterizado pelo fato de ser em um método como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 16.
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