BRPI1010130B1 - Cepa de levedura e uso da cepa de levedura - Google Patents
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Abstract
aperfeiçoamento da produção de etanol e a redução do acúmulo de biomassa na cepa recombinante de saccharomyces cerevisiae superexpressando enzimas de degradação de atp. é descrita uma nova abordagem para o aumento da produção de etanol durante a fermentação alcoólica por meio da redução do acúmulo da biomassa usando as enzimas que degradam o atp. a parte do gene ssb1 saccharomyces cerevisiae que codifica o domínio atpase citosólico da chaperona associada ao ribossomo clonada no cassete de expressão sob controle do promotor (gpd1) do gene glicerol-3-fosfato desidrogenase foi introduzida na cepa s. cerevisiae by4742. as cepas recombinantes foram testadas quanto à capacidade de crescer e de produzir etanol durante os cultivos anaeróbicos e aeróbicos da glicose. as cepas que superexpressam o domínio atpase da ssb1 possuíram concentração reduzida do atp intracelular. acumularam quantidades elevadas de etanol e foram caracterizadas pelo reduzido acúmulo da biomassa quando comparado à cepa do tipo selvagem em ambas as condições anaeróbica como aeróbica. de forma similar, o gene apirase apy da fosfatase hidrolisante atp/adp que codifica o e. coh e o domínio atpase do gene ssb1 do s. cerevisiae foram coexpressos sob o controle do promotor gali induzível da galactose. as cepas da s. cerevisiae recombinantes revelaram uma pequena redução do acúmulo da biomassa, enquanto aumentaram a atividade atpase específica, o acúmulo e a produção do etanol durante a fermentação alcoólica da galactose em condições semi-anaeróbicas.
Description
[001] A presente revelação se refere a uma levedura modificada para a maior produção de etanol por fermentação, mais particularmente a levedura modificada para a produção de menos ATP quando cultivado sob condições para a produção do etanol, e adicionalmente mais particularmente à superexpressão de uma atividade ATP em S. cerevisiae, com ou sem a co-expressão de uma atividade apirase, ambas resultando em uma redução simultânea do ATP na célula, uma redução no acúmulo da biomassa celular e um aumento na produção do etanol sob condições de crescimento anaeróbico e aeróbico para a produção do etanol.
[002] Este pedido reivindica prioridade com relação ao pedido internacional N°: PCT/US10/40167 depositado em 28 de junho de 2010 e ao pedido provisório norte-americano No. 61/220,814 depositado em 26 de junho de 2009.
[003] A fermentação alcoólica é um catabolismo anaeróbico da glicose e de algumas outras hexoses que levam à produção do etanol extracelular e CO2. Durante o processo catabólico, o ATP é formado e usado com finalidades anabólicas que resultam no crescimento e na propagação celular (Bai et al., 2008). A eficiência da síntese do ATP durante o catabolismo da glicose anaeróbica é bastante lenta, variando, dependendo do caminho catabólico particular da glicose, de um mol de ATP (Entner-Doudoroff ou caminho ED) a dois mols de ATP (Embden-Meyerhof-Parnas ou caminho EMP) por mol de glicose consumida, em contraste com o catabolismo aeróbico, onde um mol da glicose resulta na produção de 36 mols de ATP. De forma correspondente, a eficiência da conversão da glicose em biomassa celular por crescimento e divisão celular é mais baixo durante o caminho ED catabólico anaeróbico e mais alto durante a oxidação da glicose aeróbica.
[004] Em base de volume, a fermentação alcoólica representa um dos maiores campos de biotecnologia industrial sendo usado para a produção de bebidas alcoólicas tradicionais (vinho, cerveja, bebidas alcoólicas fortes, etc.) assim como o etanol industrial e para combustível. Devido a razões econômicas e ambientais, ocorreu um crescimento exponencial na produção do etanol combustível durante a última década (Schubert, 2006). Apesar de a lignocelulose ser considerada como o material mais promissor para a produção do etanol combustível no futuro, a atual produção industrial do etanol combustível se baseia na fermentação de materiais tradicionais como a sacarose (de cana de açúcar ou de beterraba para açúcar) e na glicose obtida dos materiais de amido (milho, batatas, etc.). O único organismo atualmente usado para a produção do etanol industrial é a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Essa levedura cataboliza a glicose pelo caminho EMP glicólico, produzindo 2 mols de ATP por mol de glicose consumida. Devido ser baixa a eficiência metabólica desse caminho, a produção máxima de biomassa é de somente cerca de 7%, enquanto a produção de etanol de glicose fica entre 90 e 93% do valor teórico (Ingledew, 1999). Não obstante, na escala industrial, 7% da biomassa é uma enorme quantidade de subprodutos, que apesar de ter algum valor econômico como ingrediente alimentar animal, adicionalmente reduz de forma significativa a produção potencial do produto primário, isto é, de etanol que poderia ser teoricamente obtido. Como a produção anual de etanol atinge cerca de 50 bilhões de litros, um aumento mínimo na produção de etanol de cerca de 1-2% poderia fornecer outras centenas de milhões a bilhões de litros de etanol e melhorar de forma significativa os parâmetros econômicos da produção do etanol.
[005] Em contraste com a S. cerevisiae, a bactéria Zymomonas mobilis fermenta a glicose pelo caminho ED, que dá somente 1 mol de ATP por mol de glicose, e direciona somente 3% da glicose para a biomassa, obtendo uma produção de etanol de até 97% do valor teoricamente possível (Sprenger, 1996). Além disso, a Z. mobilis tem outra vantagem importante: é muito mais rápida na fermentação da glicose para etanol quando comparada com a S. cerevisiae (Sprenger, 1996, Panesar et al., 2006), entretanto, esta peculiaridade é na maior parte explicada por uma maior taxa de coleta do açúcar e subsequente catabolismo, ao invés de uma menor produção de ATP. Foram consideradas tentativas de substituição do S. cerevisiae pelo Z. mobilis para a produção do etanol industrial como uma forma possível para o aumento da produção de etanol por fermentação, cerca de 3-4%, que se traduziriam em centenas de milhões de litros anualmente em escala mundial. Entretanto, a Z. mobilis não está isenta de sérias desvantagens que prejudicam seu uso industrial, agora e no futuro próximo. São: (i) tem uma faixa de substrato muito estreita (a sacarose tem fermentação difícil, tendo então baixas produções), (ii) tem auxotrofia natural para a lisina, metionina e certas vitaminas, (iii) tem condição não-GRAS, que evita o uso do subproduto da biomassa como um aditivo alimentar (Jeffries, 2005; Bai et al., 2008). Além disso, como a principal ferramenta de trabalho para a produção do etanol, a tecnologia das células de levedura para fermentação alcoólica é bem desenvolvida, considerando que a tecnologia da fermentação para células bacterianas como a Z. mobilisé bem menos desenvolvida.
[006] Uma abordagem da técnica anterior tentou a substituição dos componentes essenciais do caminho EMP na levedura pelos do caminho ED das bactérias que possuem genes desse caminho, como a Z. mobilis. Essa abordagem incluiu a expressão dos genes da ED desidratase e da ED aldolase edd e eda em um mutante deficiente de fosfofructoquinase da S. cerevisiae (Lancashire et al., 1998). Os transformantes de levedura resultantes cresceram e fermentaram a glicose em etanol, apesar de as atividades da ED desidratase e da ED aldolase não terem sido medidas. Aparentemente, essa abordagem não vê outro desenvolvimento na literatura científica. Uma explicação, pode ser que muito frequentemente as enzimas procarióticas exibem baixa ou nenhuma atividade nos hospedeiros S. cerevisiae (Hahn-Hagerdal et al., 2007), provavelmente devido à inadequada dobradura ou à instabilidade. Além disso, pode haver dificuldades na regeneração NADP na levedura modificada para uso no caminho ED, porque a NADPH produzida pela glicose-6-fosfato desidrogenase deve ser reoxidada pela reação de desidrogenase alcoólica. Entretanto, as principais desidrogenases alcoólicas na S. cerevisiae usam NADH, mas não a NADPH e a levedura não possui transhidrogenase NADH/NADPH (Lescovac et al., 2002; Jeffries and Jin, 2004).
[007] Portanto, existe uma necessidade constante na técnica de encontrar formas para o aumento da produção do etanol com levedura, como a S. cerevisiae. A presente invenção fornece métodos para a redução simultânea do acúmulo da biomassa e o aumento da produção do etanol com a levedura por meio da manipulação dos níveis de ATP na levedura.
[008] A presente revelação revela formas para o aumento da produção do etanol pela redução do nível do ATP no citosol da levedura, que imita os efeitos do caminho ED das bactérias sem a necessidade da expressão dos genes ED. O resultado tem vários aspectos e realizações distintas, porém relacionadas.
[009] Um aspecto é as cepas de levedura. Essas realizações incluem dois tipos de cepas de levedura que incluem um ácido nucléico recombinante que codifica uma proteína que degrada o ATP que reduz os níveis de ATP no citosol da levedura em que o nucléico recombinante inclui um promotor operável ligado operativamente para superexpressar um ácido nucléico que codifica a proteína que degrada o ATP. Em um aspecto, a proteína que degrada o ATP é uma ATPase solúvel em citosol. Em outro aspecto, a proteína que degrada o ATP é uma apirase.
[0010] Em uma realização, a cepa de levedura contém um ácido nucléico recombinante que somente codifica a ATPase solúvel em citosol. Uma realização particular de uma ATPase solúvel em citosol é uma parte N-terminal solúvel de uma proteína S. cerevisiae.SSB2. Uma realização exemplar de uma parte N-terminal solúvel da proteína S. cerevisiae.SSB2 está de acordo com a SEQ ID No: 3, e em um caso particular, o ácido nucléico que codifica a parte N-terminal da proteína S. cerevisiae.SSB2 está de acordo com a SEQ ID No: 2.
[0011] Em outra realização, a cepa de levedura contém um ácido nucléico recombinante que somente codifica a apirase. Em um caso particular, a apirase é uma E. coli apirase. Uma realização exemplar da E. coli apirase está de acordo com a SEQ ID No: 6 e um ácido nucléico exemplar que codifica a apirase está de acordo com a SEQ ID No: 5.
[0012] Em certas realizações, tanto a ATPase solúvel em citosol como a apirase são superexpressas. Realizações exemplares e particulares incluem combinações das mesmas sequências mencionadas acima.
[0013] Apesar de a ATPase solúvel e/ou a apirase poder ser expresso em qualquer levedura, uma realização preferida é onde uma cepa de levedura for S. cerevisiae.
[0014] Em outro aspecto, são providos métodos para a ampliação da produção do etanol pela fermentação da levedura usando qualquer uma das cepas de levedura acima. Os métodos incluem, o crescimento da cepa da levedura recombinante superexpressando uma proteína que degrada o ATP em uma fonte de carboidrato sob condições em que a fonte de carboidrato é fermentada para a produção do etanol. A quantidade de etanol fabricada pela cepa da levedura recombinante em condições de crescimento é maior que a quantidade de etanol feita em uma parente da cepa da levedura recombinante que não possui o ácido nucléico recombinante que superexpressa a proteína que degrada o ATP.
[0015] As realizações desse método para a ampliação da produção do etanol incluem o crescimento da levedura em condições aeróbicas, ou condições anaeróbicas para o crescimento da levedura em condições aeróbicas para um primeiro período de tempo e então cultivar a levedura em condições anaeróbicas por um segundo período de tempo e onde a produção ampliada do etanol ocorre nas condições anaeróbicas de crescimento.
[0016] Outro aspecto é o ácido nucléico recombinante usado nas cepas de levedura acima. Esses ácidos nucléicos recombinantes compreendendo um elemento promotor operável para superexpressar um ácido nucléico na levedura ligado de forma operativa a um ácido nucléico que codifica pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste de uma ATPase solúvel em citosol e uma apirase. Realizações exemplares e particulares desse aspecto incluem quaisquer e todas as sequências das sequências supramencionadas.
[0017] A Figura 1 mostra mapas linearizados de: A. o plasmídeo pGPD1P transportando o promotor GPD1 e o terminador CYC1 (o cassete de expressão). B, o plasmídeo pUSgpdp-zeo transportando NSSB1 sob o promotor GPD1 e terminado com o terminador CYC1; ZeoR, o gene ble que confere resistência à zeocina. C, o plasmídeo pYES2-apy transportando o gene apy sob o promotor GPD1 e terminado com o terminador CYC1. D, o plasmídeo pYES2-NSSB transportando o gene NSSB1 sob o promotor GPD1 e terminado com o terminador CYC1; marcador selecionável de auxotrofia URA3.
[0018] A Figura 2A mostra a sequência nucleotídica de todo o ORF do gene S. cerevisiaeSSB2 (SEQ ID No: 1) que codifica a chaperona molecular associada ao ribossomo; a Figura 2B mostra o fragmento al,233 bp do ORF que codifica um N terminal solúvel em citosol (411 como região que possui uma atividade ATPase (NSSB2) (SEQ ID No: 2); e a Figura 3C mostra a sequência de aminoácido codificada pelo N-terminal (SEQ ID No: 3).
[0019] A Figura 3 mostra o acúmulo de biomassa (3A) e etanol (3B) pelas cepas recombinantes do NSSB2S. que abriga o S.Cerevisiae acionado pelo promotor GPD1 após 5 dias de crescimento nas condições anaeróbicas em 2% glicose suplementada pelo meio YPD. 18, 19, 21 - cepas recombinantes estáveis. BY - a cepa do tipo selvagem BY4742.
[0020] A Figura 4 mostra o acúmulo de biomassa (A) e etanol (B) e a taxa etanol para biomassa (C) das cepas S. cerevisiae que abrigam o NSSB2 sob o promotor GPD1 após 5 dias de crescimento nas condições anaeróbicas em 4% glicose suplementada pelo meio YPD. 18, 19, 21 - cepas recombinantes estáveis. BY - a cepa do tipo selvagem BY4742.
[0021] A Figura 5 ilustra a dinâmica do acúmulo do etanol pelas cepas S. cerevisiae que abrigam o NSSB2 acionado pelo promotor GPD1 nas condições aeróbicas. 18, 19, 21 - cepas recombinantes estáveis. BY - a cepa do tipo selvagem BY4742.
[0022] A Figura 6 mostra o acúmulo de biomassa (A) e etanol (B) e a taxa etanol para biomassa (C) para as cepas de S. cerevisiae que abrigam o NSSB2 acionado pelo promotor GPD1 após 5 dias de crescimento nas condições aeróbicas em 4% glicose suplementada pelo meio YPD. 18, 19, 21 - cepas recombinantes estáveis. BY - a cepa do tipo selvagem BY4742.
[0023] A Figura 7 mostra a cinética do acúmulo da biomassa para os transformantes S. cerevisiae com plasmídeos pYES2 (controle), pYES2-apy (que abriga o gene apy acionado pelo promotor GAL1) e pYES2-NSSB (que abriga o NSSB1 acionado pelo promotor GAL1) em condições semi-anaeróbicas em meio SD suplementado por 1% glicose + 10% galactose (A) ou 5% glicose + 10% galactose (B).
[0024] A Figura 8 ilustra o acúmulo do Etanol para os transformantes S. cerevisiae com os plasmídeos pYES2 (controle), pYES2-apy (abrigando o gene apy acionado pelo promotor GAL1) e pYES2-NSSB (abrigando NSSB1 acionado pelo promotor GAL1) sob condições semi-anaeróbicas em meio SD suplementado por 1% glicose + 10% galactose (A) ou 5% glicose + 10% galactose (B).
[0025] A Figura 9 ilustra a produção de etanol para os transformantes S. cerevisiae com plasmídeos pYES2 (controle), pYES2-apy (abrigando o gene apy acionado pelo promotor GAL1) e pYES2-NSSB (abrigando NSSB1 acionado pelo promotor GAL1) sob condições semi-anaeróbicas em meio SD suplementado por 1% glicose + 10% galactose (A) ou 5% glicose + 10% galactose (B).
[0026] A Figura 10A mostra as sequências nucleotídicas de um ORF completo do gene apy E. coli codificando a apirase (SEQ ID No: 4) ; 10B mostra um fragmento 675 bp de uma sequência nucleotídica que codifica uma região 224 aa da apirase sem a sequência objetivando o periplasma N- terminal (SEQ ID No: 5); e 10C mostra a sequência protéica da região 224 aa da apirase (SEQ ID No: 6).
[0027] Os inventores descobriram que reduzindo o nível de produção do ATP durante o crescimento para a fermentação alcoólica em células de levedura pode aumentar as produções de etanol e simultaneamente reduzir a conversão do substrato para biomassa. Isto é feito pela construção de cepas de levedura que produzem menos ATP durante a fermentação alcoólica (por ex., um mol de ATP, como Z. mobilis faz no caminho ED), mas sem transferir as atividades do caminho ED na levedura. As cepas de levedura resultantes combinam todas as vantagens disponíveis da levedura com a alta produção de etanol tipificada por Z. mobilis. Podem ser usadas duas abordagens para a construção dessas cepas de levedura.
[0028] Os inventores descobriram que para manter baixo o nível do ATP durante a fermentação alcoólica da levedura pelo caminho EMP, não é necessário substituí-lo pelas atividades do caminho ED para reduzir a eficiência do ATP. É possível manter o caminho EMP inalterado, mas para reduzir o nível do ATP tanto por ativação ou por superexpressão de uma ATPase citosólica ou uma apirase exógena, ou pela introdução de agentes que induzem um ciclo fútil na levedura que dissipa o pool celular do ATP.
[0029] A presente revelação descreve a redução com sucesso do ATP celular pela superexpressão da parte 5' do gene endógeno S. cerevisiae SSB2 que codifica o domínio ATPase citosólico. As cepas modificadas mostraram nível celular ATP reduzido durante o cultivo anaeróbico e aeróbico e foram caracterizadas pela redução na produção de biomassa e um aumento correspondente na produção de etanol durante a utilização da glicose em condições anaeróbicas, aeróbicas ou semi-anaeróbicas. As cepas também foram modificadas para superexpressarem uma apirase E. coli, que é uma enzima que faz a clivagem de dois fosfatos do ATP, e algumas dessas cepas de co-expressão também geraram maior produção de etanol e reduzidos acúmulos da biomassas. Essas abordagens são úteis para a construção de nova geração de cepas industriais de S. cerevisiae que se caracterizam pela melhor produção de etanol a partir de matérias-primas convencionais (glicose, sacarose) ou de outras matérias-primas não convencionais baseadas em carboidratos (lignocelulose).
[0030] A cepa Saccharomyces cerevisiae BY4742 (MATα, his3Δl, leu2ΔO, lys2ΔO, ura3ΔO; Giaever et al., 2002) foi usada para a expressão da parte 5' da codificação SSB2 ORF do domínio ATPase. A Escherichia coliDH5α (Φ80dlacZΔAM15, recAl, endAl, gyrA96, thi-l, hsdRl7 (rK-, mK+), supE44, relAl, deoR, Δ(lacZYA-argF) U169) foi usada para propósitos gerais e subclonagem de rotina.
[0031] Para a isolação do DNA plasmídeo E. coli foram cultivadas cepas em meio LB a 37°C por 18 horas, como descrito (Sambrook and Rusell 2001). As cepas de S. cerevisiae foram incubadas a 30°C. Para aplicação de rotina, foram mantidas cepas de levedura em YPD rico (0,5% de extrato de levedura, 1% peptona e 2% glicose) ou meio SD (0,67%, base de levedura nitrogenada sem aminoácidos, DIFCO). Para a fermentação de etanol, foi usado meio YPD ou meio SD suplementado com 2 ou 4% glicose ou com 10% de galactose. Quando foi necessária a seleção antibiótica, as cepas foram incubadas com ampicilina (100 μg ml-1), zeocina (25μg ml-1 para E.coli e 150μg ml-1 para S. cerevisiae). Quando necessário, foi adicionada histidina (20 mg L-1), leucina (60 mg L-1), lisina (20 mg L1) ou uracil (20 mg L-1). O substrato cromogênico X-gal e o promotor indutor IPTG (Fermentas, Vilnius, Lithuania) foram usados de acordo com as especificações do fabricante.
[0032] O DNA genômico das cepas S. cerevisiae foi isolado usando o kit de purificação Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA). O DNA plasmídeo da E.coli foi isolado usando o sistema de purificação Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). Foram usadas a mistura polimerase Taq e High Fidelity, T4 DNA ligase, T4 DNA polimerase e enzimas de restrição de acordo com a recomendação do fornecedor (Fermentas). A transformação da S. cerevisiae foi feita pelo protocolo padrão (Sambrook and Rusell 2001).
[0033] Preparação do cassete de expressão. O promotor GPD1 (o promoter do gene GPD1 que codifica a S. cerevisiae glicerol-3-fosfato desidrogenase, Albertyn et al., 1994) foi amplificado como fragmento 874 bp do cromossomo de S. cerevisiae BY4742 com os primers GPDIPF (TGAGCTCAGCGTGTAGACGTAGTATAAC); e GPDIPR (TCTAGATCTCTATCAGCAGCAGCAGACAG) e T/A clonados no sítio EcoRV de pBluescriptIlSK+. A região do promoter respectivo foi recuperada como fragmentos Sacl-XbaI (os sítios para endonucleases de restrição Sacl e Xbal estão sublinhados) e clonada no sítio correspondente do vetor pUC57 que resulta no plasmídeo pUGPD1P. A região do terminador do gene S. cerevisiae CYC1 foi amplificada com os primers CYC1F (ATCCCGGGAAGCCTGTGAGTAAACAGGC) e CYC1R (TAGTCGACTGTTA CATGCGTACACGCGT) do cromossomo de BY4742S. cerevisiae como fragmento 234 bp (os sítios para endonucleases de restrição SmaI e SalI estão sublinhados) e clonada no sítio EcoRV de pBluescriptIlSK+, então recuperada como fragmento SmaI-SalI e clonada no sítio respectivo do plasmídeo pUGPD1P para produzir a construção pGPD1P (o cassete de expressão está mostrado na Fig. IA).
[0034] O fragmento 1.233 bp de SSB2 ORF que codifica os resíduos aminoácidos N-terminal 411 de SSB2 que possuem atividade ATPase (NSSB2; Fig. 2) e 12 bp que precede o códon de partida do ORF foram amplificados a partir do cromossomo dos primers BY4742 S. Cerevisiae com SSB2F (ATCTAGATCCTCATTAACAATGGCTGAAGGT) e SSB2R (ATCCCGGGAATTCAACCTTGCATACCAACACC) (os sítios para endonucleases de restrição Xbal e SmaI estão sublinhados) e T/A clonado em pUC57. O plasmídeo obtido foi digerido com as endonucleases de restrição Xbal e Smal e NSSB2 foi subclonado nos sítios XbaI-Smal do cassete de expressão pGPD1P sob controle do promotor GPD1 que produziu pUSgpdp. O plasmídeo pUSgpdp foi digerido com HindIII, com extremidade cega e o cassete de resistência da zeocina foi clonado no plasmídeo para dar pUSgpdp-zeo (Fig. 1B). A construção obtida foi linearizada com SacI e transformada em S. Cerevisiae BY4742. Os transformantes foram estabilizados e a presença da construção recombinante (NSSB2 sob o promotor GPD1) foi verificada por um procedimento PCR usando o primer para frente específico para o promotor e o reverso específico para NSSB2.
[0035] Um gene apirase apy da cepa E. coli HN280 foi amplificado a partir do plasmídeo de virulência pinv (acesso ao genbank no. AJ315184) (Fig. 3A) omitindo o primeiro 70 bp que codifica a sequência objetivando o periplasma N-terminal endógeno com os primers Ko390 (CGCGGATCCATGCTGAAGGCAGAAGGTTTTCTC) e Ko391 (TTTGCGGCCGCTTATGGGGTCAGTTCATTGGTAGGAGTATTTAATTC) (Fig. 3B). O gene NSSB1, por sua vez, foi amplificado com os primers V3f (CGCGGATCCATGGCTGAAGGTGTTTTCCAAGGTG) e Ko389 (TTTGCGGCCGCTCAACCTTGCATACCAACAC) usando pusgpdp como gabarito.
[0036] Os fragmentos sintetizados foram duplamente digeridos com bamhi/noti e ligados com os plasmídeos digeridos bamhi/noti pyes2 (contém o gene URA3 como um marcador seletivo e o promotor GALI para expressão) (Invitrogen). Os plasmídeos resultantes foram denominados pyes2-apy (Fig. IC) e pyes2- NSSB (Fig. 1D).
[0037] Os transformantes S. cerevisiae foram estabilizados por cultivo alternado em meio não seletivo e seletivo. Os transformantes que preservaram seus fenótipos (resistência à zeocina) e forneceram o marcador dominante ZeoR após esse cultivo foram considerados como estáveis. A presença da construção desejada (NSSB2 sob o promotor GPD1) no genoma de transformantes estáveis foi confirmada por PCR. A verificação dos transformantes de levedura contendo plasmídeos replicativos foi feita via resgate de plasmídeo pela transformação do E. coli com subsequente análise de restrição.
[0038] As cepas foram cultivadas por uma noite em meio YPD, lavadas com água estéril e quantidades iguais de cada cultura foram inoculadas no meio de teste. Para as cepas S. cerevisiae BY4742 pUSgpdp-zeo+, foi usado YPD suplementado por 2 ou 4% de glicose. Para o crescimento aeróbico, foi usado o sistema GENbox (bioMerieux, Marcy l'Etoile, França). As cepas foram cultivadas no agitador rotativo Inkubator 1000 Heidolph (Schwabach, Alemanha) a 28°C e amostras foram colhidas a cada 24 horas no caso de condições aeróbicas e imediatamente após a inoculação e após 5 dias de crescimento no caso de crescimento anaeróbico. Para a fermentação da galactose, foram cultivadas por uma noite cepas recombinantes em meio SD. Uma concentração inicial de biomassa para a fermentação da galactose foi de 15 μg L-1. A eficiência da fermentação da galactose dos transformantes obtidos com o plasmídeo pYES2-apy, pYES2-NSSB e o plasmídeo de controle pYES2 foi avaliada em meio SD suplementado por uma mistura de 1% ou 5% de glicose e 10% de galactose. A fermentação foi realizada em condição semi-anaeróbica (120 revoluções/min) durante 1-3 dias. A biomassa foi medida por densidade ótica com um espectrofotômetro a 600 nm e a densidade celular foi calculada. As concentrações de etanol e glicose foram medidas pelos protocolos descritos anteriormente (Gonchar et al., 2001, Gonchar, 1998).
[0039] O ensaio do ATP nas células de levedura foi feito por um método desenvolvido no laboratório do inventor como um dos vários métodos adequados disponíveis para as pessoas com conhecimento comum no assunto. O método usa uma preparação de riboflavina quinase obtida a partir da cepa recombinante Candida famata que superexpressa o gene FMN1 que codifica a quinase. O ATP foi extraída das células testadas de levedura com 5% de ácido tricloroacético (5 mg de células, 30 min). A mistura de reação conteve (1 ml de volume total): 75 mM tampão fosfato, pH 8,0; 1 mM MgS04 x 7H20; 1 mM riboflavina; 0,25 mg riboflavina quinase (30 mU/mg de proteína) e a amostra do extrato ATP. A reação prosseguiu por 30 min a 37°C sendo então interrompida por fervura de 5 min. O mononucleotídeo flavina (FMN) resultante foi ensaiado por análise fluorométrica com fluorômetro Turner Quantech FM 109510-33 após a separação cromatográfica de FMN em 5% Na2HPO4. Foi medido um branco contendo somente o meio de ensaio para cada reação. Foi usada uma curva de calibração padrão paro ATP para calcular o ATP formada.
[0040] A atividade ATPase foi medida como descrita anteriormente (Tashima, 1975) com pequenas modificações. A mistura de reação conteve 50 mM Tris/HCI (pH 7,5), 70 mM KCI, 35 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 70 μM CaCI2 e 3 mM ATP. A concentração da proteína adicionada foi de 0,05 mg ml-1. Após a incubação a 37 °C por 15 min a reação foi interrompida com ácido tricloroacético e o fosfato liberado do ATP foi determinado por procedimentos estabelecidos (Fiske and Subbarow, 1925).
[0041] Como mencionado na presente anteriormente, podem ser usadas diferentes estratégias para o controle do nível intracelular ATP. Uma primeira abordagem se baseia na geração de ciclos fúteis que estejam gastando a energia da hidrólise ATP para reações metabólicas reversas. Um dos ciclos fúteis mais estudados é a conversão da frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifosfato por fosfofrutoquinase com o uso de ATP e sua contraparte catalisada por frutose-1,6-bisfosfatase. Apesar de essa estratégia ser realmente uma realização alternativa da presente invenção, nota-se que a reação de reações fúteis também sempre envolve alguma alteração dos caminhos bioquímicos que levam ao acúmulo de etanol, de forma a influenciar o nível final da produção. Um técnico no assunto pode prontamente obter a sequência que codifica a frutose- 1,6-bisfosfatase S. cerevisiae e modificá-la sob controle operável do promotor GPD de forma análoga como a apresentada aqui, ou usar qualquer outro promotor S. cerevisiae para gerar uma realização exemplar desta prática.
[0042] Uma segunda abordagem mais completamente exemplificada na presente se baseia na superexpressão regulada das enzimas hidrolisantes ATP: as ATPases. A maioria das ATPases são componentes de hétero-oligômeros e se localizam ou estão associadas às membranas celulares. Essa característica desta classe de enzimas torna difíceis suas sobre-expressões no citosol devido aos potenciais efeitos tóxicos que podem ser causados pelo acúmulo de proteínas insolúveis no compartimento citoplásmico. Para encontrar uma candidata ATPase mais adequada, os inventores realizaram uma busca do genoma S. cerevisiae dos genes que codificam as ATPases solúveis. Foram escolhidos dois genes como candidatos para a superexpressão. SAP1 codifica uma grande proteína citosólica com função desconhecida, mas que desempenha funções características das enzimas hidrolisantes ATP. É previsto que SAP1 codifique uma proteína da família AAA (ATPase Associada com diferentes Atividades celulares). A SAP1 foi anteriormente identificada pela interação com a proteína cromatina Sin1p S. cerevisiae (Liberzon et al., 1996). Apesar de não exemplificada na presente, a superexpressão da proteína SAP1 é outra candidata adequada para a redução do ATP na levedura.
[0043] O candidato exemplificado é o domínio ATPase do gene SSB2 que codifica a chaperona molecular associada ao ribossomo (Fig. 2). A proteína SSB2 (SSB2p) é responsável pela correta dobradura da cadeia polipeptídica nascente durante sua liberação do ribossomo. A energia da hidrólise ATP é usada para estabilizar o complexo SSB2p com a proteína nascente. O SSB2p consiste de três domínios distintos. Um deles, localizado na região do N-terminal 44 kDa da proteína possui uma atividade ATPase que é reprimida por dois outros domínios C-terminais. O domínio ATPase isolado 44 kDa demonstrou possuir maior afinidade com o ATP e maior velocidade de reação quando comparado com a proteína de comprimento total (Pfund et al., 2001). O domínio N-terminal da proteína SSB2p foi, portanto escolhido para exemplificar os métodos da presente invenção.
[0044] Uma terceira abordagem também exemplificada na presente que pode ser a expressão das ATP- difosfohidrolases, ou apirases, são enzimas que hidrolisam tanto os fosfatos y- e β do ATP e ADP. São distintas das demais fosfohidrolases com relação à atividade específica, à especificidade do substrato de nucleotídio, aos requisitos de cátions divalentes e sensibilidade a inibidores (Plesner, 1995; Handa and Guidotti, 1996). As apirases são amplamente expressas em eucariotas como também foram encontrados alguns procariotas, indicando um papel geral para essas enzimas em todas as espécies. A apirase bacteriana apy da coli foi usada para reduzir o nível ATP intracelular da levedura nas presentes realizações exemplares, mas outras apirases funcionam tão bem ou melhor que a enzima E. coli.
[0045] É mostrado o fragmento 1,233 bp da ORF SSB2 que codifica os resíduos aminoácidos 411 N-terminal da proteína SSB2p (denominada na presente NSSB2) na Fig. 2B, que, juntamente com o códon de partida anterior 12 bp de ORF foram amplificados usando o procedimento PCR. Os primers foram indicados de forma a gerar um códon de parada TGA no lugar do GAC que codifica o resíduo aspartato. Assim, a síntese protéica é finalizada após 411 códons que levam à produção da proteína truncada com um peso molecular 44 kDa, que corresponde ao domínio ATPase previamente descrito de SSB2p. O fragmento DNA obtido foi clonado em pUC57 pela clonagem T/A e subclonado no cassete de expressão pGPD1P, como ilustrado na Fig. 1A sob o controle do promotor do gene GPD1. É sabido que este promoter é constitutivamente ativo em levedura sendo regulado para cima em condições de stress osmótico (Albertyn et al., 1994). O gene de resistência zeocina foi clonado no sítio HindIII do plasmídeo resultante para produzir pUSgpdp- zeo como mostrado na Fig. 1B. O plasmídeo foi introduzido na cepa BY4742 S. cerevisiae. Os transformantes estáveis resistentes à zeocina foram selecionados para outros estudos. Foi verificada a presença do gene ZeoR e NSSB2 sob o promotor GPD1 nas cepas recombinantes por PCR com o uso de dois conjuntos de primers correspondentes. Finalmente, foram selecionadas três cepas recombinantes para outros testes.
[0046] As cepas abrigando NSSB2 sob o controle do promotor GPD1 foram testadas quanto à capacidade de crescer e de produzir etanol. Devido ao fato que o promotor selecionado não exige fatores ou indutores adicionais para o funcionamento básico, foram feitos testes em meio YPD rico suplementado por 2 ou 4% glicose.
[0047] Após 5 dias de crescimento sob condições anaeróbicas no meio suplementado por 2% glicose, as cepas S. cerevisiae que expressam o NSSB2 direcionado pelo promotor GPD1 não indicou nenhuma diferença na produção de etanol quando comparadas com a cepa do tipo selvagem. O crescimento dos recombinantes foi levemente reduzido 3-5%; (ver Fig. 3). Entretanto, quando o meio foi suplementado com 4% glicose, as mesmas cepas mostraram redução de acúmulo da biomassa (até 20%) quando comparadas com o tipo selvagem. Além disso, nessas condições, observamos um elevado acúmulo de etanol pelas cepas recombinantes. Assim, a taxa final etanol para biomassa foi significativamente maior para pUSgpdp-zeo +S. cerevisiae quando comparada à cepa parental (ver Fig. 4).
[0048] Os mesmos experimentos foram feitos em condições aeróbicas. As amostras foram colhidas a cada 24 horas, sendo medidas as concentrações de biomassa e etanol. No caso da cepa do tipo selvagem, foi observado um nível máximo de produção de etanol após 24-30 horas de crescimento e obteve 14-15 g por litro (ver Fig. 5). Durante esse tempo, quase toda a glicose foi fermentada pelas cepas testadas. Após isso, as células entraram em uma fase oxidativa de crescimento e começaram a reutilizar o etanol do meio. Assim, após 5 dias de crescimento no caso da cepa do tipo selvagem, a concentração final de etanol foi reduzida para 0,6-1,2 g por litro (ver Fig. 6). No caso das cepas recombinantes que expressam NSSB2 sob o promotor GPD1, o máximo de acúmulo de etanol foi observado entre 24 e 48 horas de crescimento, o que coincide com a fermentação ativa da glicose e o aumento de biomassa. Entretanto, contrariamente à cepa do tipo selvagem, os recombinantes não puderam reutilizar efetivamente o etanol do meio (ver Fig. 5).
[0049] Assim, mesmo após 5 dias de cultivo das cepas recombinantes, a concentração de etanol no meio foi de até 8 12 g por litro, o que foi 10 a 12 vezes maior em comparação com a cepa parental BY4742 S. cerevisiae. Notavelmente, as cepas recombinantes também se caracterizaram pelo crescimento reduzido. Após 48 horas de incubação, a taxa de crescimento das cepas recombinantes foi deprimida e após 5 dias de incubação alcançou 1-1,2x 107células por ml, que foi duas vezes menor que a da BY4742.
[0050] O ATP foi ensaiado em uma das cepas recombinantes estudadas. Aí demonstrou que as células da cepa recombinante #18 após 5 dias de incubação em condições aeróbicas em 4% glicose suplementadas no meio YPD que conteve 2,5 vezes uma menor quantidade de ATP em comparação com a cepa parental BY4742 como mostrado na Tabela 1. Tabela 1. Ensaio de ATP na cepa recombinante #18 que expressa o NSSB2 direcionado com o promotor GPDI após 5 dias de crescimento em condições aeróbicas em meio YPD suplementado com 4% glicose.
[0051] Demonstrou-se que tanto a taxa de crescimento reduzido como o teor reduzido de ATP nas cepas recombinantes são provocadas pela expressão da parte 5' do gene SSB2. Sabe- se que a parte N-terminal de SSB2p tem forte atividade ATPase (Pfund et al., 2001). As cepas recombinantes que superexpressam o NSSB2p cultivado em condições aeróbicas e anaeróbicas indicaram reduzida produção de etanol. O crescimento da levedura consiste de dois períodos. Durante as primeiras horas de incubação, a glicose é efetivamente fermentada em etanol com a rápida produção de ATP e acúmulo de etanol. Este ATP é gasto no aumento da biomassa e também usada para iniciar as reações catabólicas que levam ao reuso do etanol previamente produzido. A expressão do domínio ATPase de SSB2 causa, portanto uma redução no nível ATP intracelular que leva à redução do crescimento, assim como à inibição da reutilização secundária do etanol acumulado, resultando na maior produção de etanol por célula.
[0052] Um gene apirase apy de E. coli que não possui a sequência objetivando o periplasma N-terminal foi amplificado como fragmento 675 bp e em paralelo com o gene NSSB1 de S. cerevisiae foi clonado sob o controle do promotor GALI induzível por galactose no quadro do plasmídeo replicativo pYES2. Os plasmídeos resultantes pYES2-apy e pYES2-NSSB foram transformados na cepa recipiente BY4742 de S. cerevisiae. Os transformantes foram selecionados em meio mineral que não possui uracil e verificado pelo resgate do plasmídeo pela transformação de E. coli. A cinética de crescimento, a síntese do etanol, a atividade ATPase das cepas recombinantes obtidas foram analisadas sob condições de ativação transcripcional dos genes alvo.
[0053] A cinética do crescimento dos transformantes S. cerevisiae com os plasmídeos pYES2-apy e pYES2-NSSB foi analisada no meio contendo galactose (1% glicose + 10% galactose e 5% glicose + 10% galactose) em frascos Erlenmeyer de 50 ml em 20 ml do meio definido. A concentração inicial de biomassa foi de 15 mg L-1. Os transformantes foram caracterizados por um pequeno retardo de crescimento durante o cultivo em meio contendo 1% glicose + 10% galactose (Fig. 7A), entretanto, não se revelou nenhuma diferença significativa no crescimento durante o cultivo em meio contendo 5% glicose + 10% galactose (Fig. 7B). Aparentemente, uma maior concentração de glicose no meio reprime a expressão dos genes alvo.
[0054] A eficiência da fermentação da galactose dos transformantes obtidos com o plasmídeo pYES2-apy, pYES2-NSSB e o plasmídeo de controle pYES2 foi avaliado nessas condições. Apesar da baixa quantidade total de etanol sintetizado, o aumento na fermentação alcoólica e na produção de etanol dos transformantes selecionados ficou demonstrada no meio contendo 1% glicose + 10% galactose (Fig. 8A, 9A). O acúmulo de etanol e a produção do transformante com pYES2-NSSB no terceiro dia de fermentação foi maior, sendo um aumento de 22% e 39% nessa ordem, quando comparado à cepa parental (Tabela 2).
[0055] O transformante com pYES2-apy mostrou 17% e 28% de aumento de acúmulo e produção de etanol quando comparado com a cepa de controle (Tabela 2). A eficiência da fermentação alcoólica da galactose também foi medida no meio contendo a mistura de açúcares 5% glicose + 10% galactose. O aumento do acúmulo e da produção de etanol foi somente alcançado para os transformantes abrigando pYES2-NSSB enquanto o transformante com pYES2-apy sintetiza o etanol como a cepa de controle (Fig. 8B, 9B). O transformante abrigando pYES2-NSSB indicou um aumento de 37% e 17% de acúmulo e produção de etanol quando comparado com a cepa de controle (Tabela 2), enquanto a atividade específica da ATPase foi somente maior no transformante com pYES2-NSSB (transformante com o maior nível de produção de etanol) (Tabela 2). . Tabela 2. Síntese do etanol, produção e atividade específica do ATPase de transformantes de S. cerevisiae e cepa de controle no terceiro dia de fermentação.
[0056] Assim, as construções com o promotor GALI confirmaram a prova obtida anteriormente do conceito, isto é, que a indução da ATPase que codifica SSB1, mesmo sob este promotor induzido pela galactose levou a um aumento substancial na produção de etanol. Infelizmente, este promoter não é muito conveniente por ser fortemente reprimido pela glicose.
[0057] O presente pedido cita várias referências, sumarizadas abaixo. Cada citação serve como auxílio àqueles de conhecimento comum na técnica para a melhor compreensão da presente invenção e para encontrarem fontes de sequências, técnicas recombinantes, testes e outras informações de rotina que habilitaria aqueles de conhecimento comum na prática de todas as numerosas realizações da presente invenção. Assim, cada referência citada é incorporada à presente em sua totalidade por referência, exceto por aquelas partes em que essas referências que contiverem informações que estiverem em conflito com as informações mencionadas na presente, caso em que a presente revelação será julgada como controlando over a referência incorporada. REFERÊNCIAS Albertyn J., Hohmann S., Thevelein J.M., Prior B.A. (1994) GPD1, which encodes glycerol-3-phosphate dehydrogenase, is essential for growth under osmotic stress in Saccharomyces cerevisiae, and its expression is regulated by the highosmolarity glycerol response pathway. Mol Cell Biol. 14:4135-4144. Bai F.W., Anderson W.A., Moo-Young M. (2008) Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances 26:89-105. Fiske C.H., and Subbarow Y. (1925). The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem. 66:375-400. Giaever G., Chu A. M., Ni L., Connelly C., Riles L., Veronneau S., Dow S., Lucau-Danila A., Anderson K., Andre B., Arkin A. P., Astromoff A., El-Bakkoury M., Bangham R., Benito R., Brachat S., Campanaro S., Curtiss M., Davis K., Deutschbauer A., Entian K. D., Flaherty P., Foury F., Garfinkel D. J., Gerstein M., Gone D., Guldener U., Hegemann J. H., Hempel S., Herman Z., Jaramillo D. F., Kelly D. E., Kelly S. L., Kotter P., LaBonte D., Lamb D. C., Lan N., Liang H., Liao H., Liu L., Luo C., Lussier M., Mao R., Menard P., Doi S. L., Revuelta J. L., Roberts C. J., Rose M., Ross- Macdonald P., Scherens B., Schimmack G., Shafer B., Shoemaker D. D., Sookhai-Mahadeo S., Storms R. K., Strathern J. N., Valle G., Voet M., Volckaert G., Wang C. Y., Ward T. R., Wilhelmy J., Winzeler E. A., Yang Y., Yen G., Youngman E., Yu K., Bussey H., Boeke J. D., Snyder M., Philippsen P., Davis R. W., Johnston M. (2002) Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 418: 387-391. Gonchar M.V. (1998) Sensitive method for quantitative determination of hydrogen peroxide and oxidase substrates in biological samples. Ukr. Biokhim. Zh. 70:157-163. Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. (2001) A 30 new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages. Food Technol. Biotechnol. 39:37-42. Hahn-Hagerdal B., Karhumaa K.,Jeppsson M., Gorwa- Grauslund M.F.(2007) Metabolic Engineering for Pentose Utilization in Saccharomyces cerevisiae. Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 108:147-177. Handa M., Guidotti G. (1996) Purification and cloning of a soluble ATPdiphosphohydrolase (apyrase) from potato tubers (Solanum tuberosum). Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 916-923. Ingledew W.M. Alcohol production by Saccharomyces cerevisiae: a yeast primer, in the alcohol textbook. 3rd ed. UK: Nottingham University Press; 1999. Jeffries T.W. (2005) Ethanol fermentation on the move. Nature 23:40-41. Jeffries T.W., Jin Y.-S. (2004) Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 495-509. Lancashire W.E., Dickinson J.R., Malloch R.A. (1998) DNA encoding enzymes of the glycolic pathway for use in alcohol producing yeast. US Patent 5,786,186. Leskovac, V., Trivic S., PericD. (2002) The three zinc-containing alcohol dehydrogenases from baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res., 2:481-494. Liberzon A., Shpungin S., Bangio H., Yona E. Katcoff D.J. (1996) 20 Association of yeast SAP 1, a novel member of the 'AAA' ATPase family of proteins, with the chromatin protein SIN1. FEBS Left. 388:5-10. Panesar P.S., Marwaha S.S., Kennedy J.F. (2006) Zymomonas mobilis: an alternative ethanol producer. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81:623-635. Pfund C, Huang P, Lopez-Hoyo N, Craig E.A. 2001. Divergent functional properties of the ribosome-associated molecular chaperone Ssb compared with other Hsp70s. Mol. Biol. Cell. 12, 3773-3782. Plesner L. (1995) Ecto-ATPases: identities and functions. Int. Rev. Cytol. 158: 141-214. Sambrook J. and Russell D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Schubert C. (2006) Can biofuels finally take center stage? Nature Biotechnol., 24:777-784. Sprenger G.A. (1996) Carbohydrate metabolism in Zymomonas mobilis: a catabolic highway with some scenic routes. FEMS Microbiol. Lett. 145:301-5 307. Tashima Y. (1975) Removal of protein interference in Fiske-Subbarow method by sodium dodecyl sulphate Anal Biochem 69:410-414.
Claims (10)
1. CEPA DE LEVEDURA, caracterizada por compreender um ácido nucléico recombinante que inclui um promotor ligado operativamente para superexpressar um ácido nucléico que codifica uma apirase solúvel em citosol, em que o ácido nucléico é definido pela SEQ ID NO: 5 em que a apirase é uma apirase de E. coli definida pela SEQ ID NO: 6.
2. CEPA DE LEVEDURA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por adicionalmente incluir um ácido nucléico recombinante que inclui um promotor ligado operativamente para superexpressar um ácido nucléico que codifica uma ATPase solúvel em citosol, em que o ácido nucléico que codifica a ATPase solúvel em citosol codifica a porção N-terminal solúvel em citosol de uma proteína S. cerevisiae.SSB2, em que o ácido nucleico é definido pela SEQ ID NO: 2.
3. CEPA DE LEVEDURA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada em pela porção N-terminal solúvel em citosol da proteína S. cerevisiae.SSB2 estar de acordo com a SEQ ID NO: 3.
4. CEPA DE LEVEDURA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo ácido nucléico que codifica a ATPase solúvel em citosol codificar uma porção N-terminal solúvel em citosol de uma proteína S. cerevisiae.SSB2 e o ácido nucléico que codifica a apirase codificar uma apirase de E. coli.
5. CEPA DE LEVEDURA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo ácido nucléico que codifica a porção N- terminal solúvel em citosol de uma proteína S. cerevisiae.SSB2 estar de acordo com a SEQ ID NO: 2 e o ácido nucléico que codifica a apirase de E. coli estar de acordo com a SEQ ID NO: 5.
6. CEPA DE LEVEDURA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela cepa de levedura ser S. cerevisiae.
7. USO DA CEPA DE LEVEDURA, conforme definida nas reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para a aplicação em um método para a ampliação da produção de etanol por fermentação de levedura que compreende o cultivo da cepa de levedura recombinante em uma fonte de carboidrato em condições onde a fonte de carboidrato é fermentada para a produção de etanol, em que uma quantidade de etanol produzida pela cepa de levedura recombinante nas condições de cultivo é maior que a quantidade de etanol feita em uma parente da cepa de levedura recombinante que não possui o ácido nucléico recombinante que superexpressa a apirase.
8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo método para a ampliação da produção do etanol incluir o cultivo da levedura em condições aeróbicas.
9. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo método para a ampliação da produção do etanol incluir o cultivo da levedura em condições anaeróbicas.
10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo método para a ampliação da produção do etanol incluir o cultivo da levedura em condições aeróbicas por um primeiro período de tempo e então o cultivo da levedura em condições anaeróbicas por um segundo período de tempo e em que a produção ampliada de etanol ocorre em crescimento anaeróbico.
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