ES2274619T3 - Microorganismos transformaciones con propiedades mejoradas. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la modificación genética de microorganismos de producción utilizados en biotecnología para mejorar sus propiedades de manera que produzcan productos útiles de forma más eficiente. Los microorganismos expresan al menos una enzima que provoca el acoplamiento funcional de la oxidación y reducción de substratos mediante dos reacciones de deshidrogenasa de unión de piridina-nucleótido con diferentes especificidades para las parejas de coenzimas NAD/NADH y NADP/NADPH y de esta forma se facilita la transferencia de electrones entre las dos pareja de coenzimas a partir de dichos substratos. En particular la invención se refiere al incremento de la producción de productos tales como etano o aminoácidos a partir de fuentes de carbono y nitrógeno tales como biomasa que comprenda hexosas, pentosas o sus polímeros.

Description

Microorganismos transformados con propiedades mejoradas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modificación por ingeniería genética de microorganismos de producción utilizada en biotecnología para mejorar sus propiedades de modo que produzcan productos útiles más eficientemente. En particular, la invención se refiere a aumentar las productividades de los procesos biotecnológicos y los rendimientos de sus productos tales como etanol o aminoácidos a partir de fuentes de carbono y nitrógeno tales como biomasa que comprende hexosas, pentosas o sus polímeros.

Antecedentes de la invención

La eficiencia de muchos procesos biotecnológicos está limitada por la necesidad de que los organismos de producción equilibren sus reacciones rédox metabólicas. En particular, para cada una de las parejas de nucleótidos de piridina (NAD/NADH y NADP/NADPH), el índice total de oxidación debe ser igual al índice total de reducción: de otro modo, la pareja se convertirá completamente en una forma (por ejemplo, todo en la forma NAD o todo en la forma NADH), y las reacciones que requieren la otra forma se harán infinitamente lentas, causando que la red metabólica entera de reacciones se distorsione de modo indeseado (concretamente, no proporcionando ya el producto deseado).

Por ejemplo, aunque las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe son muy eficientes para convertir hexosas en etanol y tienen muchas ventajas para este proceso (tales como tolerancia de altas concentraciones de etanol y otros estreses), son incapaces de fermentar xilosa a etanol. La xilosa es un componente importante de las plantas, y la incapacidad de convertirlo en etanol reduce la eficiencia con la que puede utilizarse la biomasa renovable tal como desechos agrícolas. Sin embargo, estas levaduras pueden utilizar xilulosa. Algunas levaduras (por ejemplo, Pichia stipitis) pueden convertir xilosa en etanol, aunque no muy eficientemente, y contienen las enzimas xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH). Estas enzimas catalizan la reducción secuencial de xilosa a xilitol y la oxidación de xilitol a xilulosa. Se han construido cepas de S. cerevisiae transformadas que contienen XR y XDH heterólogas, que poseen así una ruta para convertir xilosa en la xilulosa fermentable (Kötter y Ciriacy [1993]; Tantirungkij et al. [1994]; Walfridsson et al. [1995]). Aunque estas cepas podían utilizar xilosa para el crecimiento y la formación de xilitol, no producían mucho etanol. Todas las enzimas XDH conocidas son específicas de NAD, mientras que todas las enzimas XR conocidas son específicas de NADPH o tienen preferencia por NADPH. Se cree (Bruinenberg et al. [1983]; Bruinenberg [1986]) que la conversión de xilosa en xilulosa mediante esta ruta da como resultado por lo tanto que el conjunto celular de NADPH se esté convirtiendo en NADP y que el de NAD se esté convirtiendo en NADH, después de lo cual se impide en gran medida un metabolismo adicional de xilosa. El NADH puede reoxidarse en condiciones aeróbicas, pero esto requiere un control crítico de los niveles de oxígeno para mantener el metabolismo fermentativo y la producción de etanol. En contraposición, las bacterias que fermentan xilosa a etanol eficientemente contienen xilosa isomerasa y convierten directamente xilosa en xilulosa sin reacciones de oxidación-reducción. Los intentos de crear levaduras que puedan convertir eficientemente xilosa en etanol se han centrado en descubrir o modificar por ingeniería genética las enzimas XR o XDH con especificidad de coenzima alterada (Metzger y Hollenberg [1995]) o en expresar el gen xilosa isomerasa en levadura. Sin embargo, han fracasado todos los intentos reseñados (véanse, por ejemplo, Amore et al. [1989]; Ho et al. [1983]; Sarthy et al. [1987]; Walfridsson et al. [1996]) de construir buenas cepas fermentadoras de xilosa expresando genes de xilosa isomerasa bacterianos en levaduras.

Como segundo ejemplo, es un proceso biotecnológico importante la fermentación de azúcares de hexosa a etanol por levadura. La ruta glicolítica desde glucosa a etanol es rédox neutra, concretamente, la cantidad de NAD reducida en la formación de una cierta cantidad de piruvato a partir de glucosa es exactamente la misma que la cantidad de NADH oxidada en la formación de etanol a partir de la misma cantidad de piruvato, y el NADP(H) no está directamente implicado en el proceso. Sin embargo, el crecimiento de levadura no es un proceso rédox neutro; la formación de 100 g de materia de levadura seca a partir de glucosa y amoniaco está acompañada por la producción neta de 1,3 mol de NADH y 0,9 mol de NADP (Oura [1972]). Este NADH en exceso se produce principalmente mediante el metabolismo productor de energía, mientras que el NADP en exceso se produce principalmente mediante rutas biosintéticas (véase Oura [1972]). Como otros organismos, la levadura tiene distintos sistemas de nucleótidos de piridina (NAD(H) y NADP(H)) que han evolucionado para facilitar estos dos aspectos del metabolismo. El NADH en exceso producido por la fermentación de levadura se reoxida a NAD principalmente por la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, dando como resultado la producción de glicerol. En la fermentación por destilación, esto representa una desviación inútil de un 3-5% de la fuente de carbono (Oura [1977]). Los intentos de reducir la proporción de glicerol a etanol producida durante las fermentaciones han encontrado poco o ningún éxito. Por ejemplo, Björkqvist et al. (1977) eliminaron cada uno y ambos genes que codifican la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Sin embargo, las levaduras que carecen de esta enzima no sólo eran incapaces de crecer en condiciones anaeróbicas, sino que también dejaban de producir etanol.

Es un tercer ejemplo la producción biotecnológica de aminoácidos. Los aminoácidos tienen extensas aplicaciones en las industrias de alimentos, de alimentación animal, médica y química. Se han desarrollado procesos de fermentación para producir la mayoría de los aminoácidos que aparecen en las proteínas. Las rutas metabólicas hasta aminoácidos convierten en primer lugar una fuente de carbono tal como glucosa en intermedios tales como 3-fosfoglicerato, piruvato, oxaloacetato o 2-oxoglutarato, que están más oxidados que la glucosa. Su formación produce NADH. La mayoría de los aminoácidos están más reducidos que los intermedios, pero las reacciones que conducen a ellos a partir de los intermedios casi invariablemente producen NADP. Aparte de la ruta de la histidina, que es una productora de NADPH neta, y las rutas de glutamina, glutamato, tirosina y fenilalanina, que ni consumen ni producen NADPH, la biosíntesis de todos los demás 15 aminoácidos a partir de glucosa produce entre 1 y 8 mol de NADP por mol de aminoácido y produce simultáneamente NADH (Neidhardt et al. [1990]). Entonces, son necesarias otras reacciones para oxidar el NADH y reducir el NADP para conseguir el equilibrio metabólico. Esto se convierte en un factor importante con organismos de producción tales como Corynebacteria modificadas y/o seleccionadas para producir enormes cantidades de aminoácidos a escala comercial. Para eliminar el NADH en exceso, las fermentaciones de aminoácido se operan en condiciones aeróbicas, y se consume oxígeno en grandes cantidades. Para asegurar una formación máxima de producto, es esencial suministrar continuamente cantidades adecuadas de oxígeno, típicamente en forma de aire enriquecido con oxígeno (Hirose [1986]). Las deficiencias de oxígeno, por ejemplo, en fermentaciones de alta densidad celular o en casos en los que el suministro de oxígeno es antieconómico, dan típicamente como resultado menores rendimientos y productividades de producto, ya que parte de la fuente de carbono se convierte en compuestos tales como succinato, lactato o ambos para librarse del NADH en exceso.

Otros ejemplos incluyen la biosíntesis potenciada de nucleótidos, lípidos y metabolitos secundarios mediante microorganismos modificados seleccionados o modificados por ingeniería genética para producir estos compuestos a escala industrial. Durante estos procesos, los microorganismos producen generalmente NADH y un intermedio metabólico crucial (tal como piruvato) que está más oxidado que la fuente de carbono y reduce este intermedio al producto deseado utilizando NADPH. De nuevo, los microorganismos tienen que oxidar el NADH en exceso y reducir el NADP en exceso, y los rendimientos de la fuente de carbono se reducen por las transformaciones metabólicas adicionales de la fuente de carbono necesarias para conseguir el equilibro rédox.

En todos estos ejemplos, el NADH en exceso se reoxida mediante respiración, que requiere una aireación eficiente, o mediante la formación de subproductos indeseados tales como glicerol. La aireación a gran escala industrial es cara, y difícil de controlar exactamente. En algunos procesos tales como la fermentación de xilosa a etanol, la reducción del NADP en exceso causa también problemas. Son reacciones bioquímicas importantes que regeneran NADPH la rama oxidativa de la ruta de fosfato de pentosa (PPP), concretamente, las sucesivas reacciones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfolgluconato deshidrogenasa e isocitrato deshidrogenasa ligada a NADP. Ambas reacciones producen CO_{2}. En operaciones a escala industrial, esto representa tanto una pérdida directa de fuente de carbono como una contaminación ambiental. Además, el CO_{2} acidifica también los medios de cultivo, requiriendo el uso de mayores cantidades de agentes neutralizantes para controlar el pH de la fermentación, y tiene un impacto significativo sobre la fisiología celular en general y la producción de aminoácidos en particular. Por ejemplo, el CO_{2} inhibe enzimas de la biosíntesis de metionina y purina y se ha reseñado que inhibe la formación de producto en varios procesos de fermentación, incluyendo la producción de isoleucina, inosina, fumarato, penicilina y otros antibióticos y biomasa de levadura (Hirose [1986]).

Sería muy beneficioso un método general para aliviar estos problemas sin utilizar aireación, que es cara y difícil de controlar a niveles óptimos. Los beneficios potenciales incluyen rendimientos aumentados de la fuente de carbono, consumo de energía reducido, reducciones significativas de la producción de CO_{2} y productividad específica aumentada, que es particularmente importante en procesos que utilizan microorganismos inmovilizados.

En las rutas importantes del metabolismo de carbono y nitrógeno, es una norma general que la mayoría de las rutas catabólicas utilizan la pareja de coenzimas NAD/NADH en las etapas de oxidación-reducción, mientras que las reacciones anabólicas sintéticas utilizan más frecuentemente la pareja NADP/NADPH. Aunque los potenciales rédox (E) de estas dos parejas son ambos cercanos a -0,32 (Kaplan [1960]), las relaciones de formas reducida y oxidada de las dos parejas se mantienen a niveles muy diferentes en las células vivas. Por ejemplo, en S. cerevisiae aeróbica, NADH/NADH= 0,9 y NADPH/NADP= 3,2 (Sáez y Lagunas [1976]).

La mayoría de las nucleótido de piridina deshidrogenasas tienen una especificidad marcada, a menudo casi absoluta, por uno u otro nucleótido de piridina. Algunas deshidrogenasas con el mismo sustrato aparecen como enzimas específicas tanto de NAD como de NADP. Habitualmente, sólo una de las enzimas está presente en ciertas condiciones, o las enzimas se expresan en diferentes compartimentos celulares. Son buenos ejemplos las glutamato deshidrogenasas, que están sujetas a complicados mecanismos de control que habitualmente dan como resultado que sólo una de las enzimas sea dominante en cualquier condición de crecimiento (por ejemplo, Courchesne y Magasanik [1988]; Coschigano et al. [1991]; Miller y Magasanik [1991]; ter Schure et al. [1995]; Dang et al. [1996]; Avendano et al. [1997]). S. cerevisiae contiene isocitrato deshidrogenasas ligadas a NAD y NADP: el citosol (que se considera como un solo compartimento) contiene sólo enzima ligada a NADP y hay otra enzima ligada a NADP en los peroxisomas, mientras que las mitocondrias (donde la matriz, crestas y espacio intermembranoso forman tres subcompartimentos) contienen tanto enzimas ligadas a NAD como a NADP (Minard et al., [1998]). Por lo tanto, las células son capaces de mantener relaciones de NADH/NAD mucho menores que las relaciones de NADPH/NADP, porque las reacciones que transfieren equivalentes de reducción entre los dos sistemas (y así tenderían a equilibrarlos) están limitadas. Algunas células bacterianas y animales contienen NAD(P) transhidrogenasas (ED 1.6.1.1 y 1.6.1.2). Las transhidrogenasas son a menudo enzimas unidas a membrana con varias subunidades que están ligadas a la producción de energía en lugar de al equilibrado de los sistemas nucleótido de piridina. Con los fines de esta solicitud de patente, el término "deshidrogenasas" no incluye las transhidrogenasas EC 1.6.1.1 y 1.6.1.2. Muchos organismos de producción utilizados en biotecnología tales como S. cerevisiae y Corynebacteria no contienen NAD(P) transhidrogenasas, y así parecen ser incapaces de convertir NADH más NADP directamente en NAD más NADPH, y viceversa.

La existencia de dos sistemas de nucleótido de piridina y la ausencia de procesos no regulados que los equilibrarían sugiere que el crecimiento y reproducción eficientes de los organismos vivos actualmente evolucionados requieren dos sistemas distintos. La razón puede ser porque es necesaria una alta relación de NADPH/NADP para impulsar las reacciones biosintéticas, mientras que una relación de NADH/NAD menor es más adecuada para la generación de energía mediante rutas tales como glicólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Metzler [1977]).

Boles et al. (1993) estudiaron una S. cerevisiae mutante que carecía de fosfoglucoisomerasa, la enzima que interconvierte glucosa-6-fosfato (Glc6P) y fructosa-6-fosfato (Fru6P). Esta cepa (un mutante de deleción de pgi1) es incapaz de crecer en ninguna hexosa ni pentosa, aunque puede crecer en ciertas mezclas de fructosa y glucosa (por ejemplo, 2% de fructosa más 0,1% de glucosa). Los autores encontraron que la transformación del mutante con una biblioteca genómica preparada a partir del mutante mismo daba como resultado que ciertos transformantes fueran capaces de crecer en glucosa sola, aunque 3 a 4 veces más lento que el tipo salvaje, y contuvieran plásmidos que comprendían el gen GDH2. Este gen codifica una glutamato deshidrogenasa ligada a NAD. Los autores argumentaron que la presencia simultánea de actividades sustanciales de ambas glutamato deshidrogenasas ligadas a NADP y NAD posibilitaba que el mutante de deleción de pgi1 creciera en glucosa, metabolizándola mediante el PPP, y convirtiendo el NADPH resultante en NADH, que podía reoxidarse después por mitocondrias funcionales. Por tanto, se propuso que estos mutantes convierten NAD más NADPH en NADH más NADP, que es la transformación opuesta a la necesaria en los microorganismos de producción industrial (véase anteriormente). Además, su capacidad de sobrevivir en glucosa dependía estrictamente de la presencia de mitocondrias funcionales y oxígeno, y eran incapaces de fermentar azúcares a etanol (Boles et al. [1993]).

Sumario de la invención

Según la presente invención, se transforma un microorganismo tal como un hongo o bacteria con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica o causa de otro modo la expresión de al menos una enzima que causa el acoplamiento funcional de la oxidación y la reducción de sustratos por dos reacciones de deshidrogenasa ligada a nucleótido de piridina con diferentes especificidades por las parejas de coenzimas NAD/NADH y NADP/NADPH, y facilita así la transferencia de electrones entre las dos parejas de coenzimas mediante dichos sustratos. La enzima o enzimas pueden ser por tanto uno o más miembros de un par de deshidrogenasas ligadas a nucleótido de piridina que tienen al menos un sustrato en común, pero diferentes especificidades de nucleótido de piridina. Los procesos biotecnológicos en los que ocurre una oxidación neta de una pareja de coenzimas de nucleótido de piridina junto con una reducción neta de la otra se llevan a cabo más eficientemente por el microorganismo transformado según la invención que por el correspondiente organismo no transformado, y la aireación de dichos procesos puede reducirse y hacerse más flexible. Estos procesos incluyen la fermentación de carbohidrato a etanol mediante el crecimiento de microorganismos, la fermentación de xilosa a productos útiles y la producción comercial de aminoácidos, nucleótidos, lípidos y metabolitos secundarios por microorganismos.

Los microorganismos preferibles con los fines de esta invención son levaduras, hongos filamentosos y bacterias. Las levaduras preferidas pertenecen al género Saccharomyces, y son especialmente cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae; el género Schizosaccharomyces, y son especialmente cepas de la especie Schizosaccharomyces pombe; y el género Pichia, y son especialmente cepas de la especie Pichia stipitis, así como Candida spp. o Pachysolen spp. Los hongos filamentosos útiles incluyen, por ejemplo, Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Paecilomyces y Penicillium. Los géneros bacterianos particularmente adecuados incluyen Corynebacteria, especialmente las cepas Corynebacterium glutamicum, así como Brevibacteria tales como Brevibacterium flavum y B. lactofermentum.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Mapa genético de pAOS66 con los genes, módulos de expresión y sitios de restricción relevantes indicados.

Figura 2. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida a partir de una secuencia parcial del gen que codifica la enzima málica de Aspergillus nidulans con algunas enzimas málicas conocidas. Los números de la base de datos (SwissProt) para las enzimas málicas conocidas son: P23368 (enzima málica humana), P40375 (enzima málica de S. pombe), PR36013 (enzima málica de S. cerevisiae). La secuencia parcial del gen que codifica la enzima málica de Trichoderma reesei se obtuvo en VTT Biotechnology y Food Research. Los aminoácidos idénticos al menos en tres de las secuencias están sombreados en gris.

Figura 3. Fermentaciones de xilosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa GDH2 (H1803, símbolos oscuros) y cepa control (H1805, símbolos claros): comparación de crecimiento y índices de utilización de xilosa.

Figura 4. Fermentaciones de xilosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa GDH2 (H1803, símbolos oscuros) y cepa control (H1805, símbolos claros): comparación de índices de utilización de etanol y xilitol.

Figura 5. Fermentaciones de xilosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa GDH2 (H1803, línea continua) y cepa control (H1805, línea de puntos): comparación de índices de desprendimiento de dióxido de carbono.

Figura 6. Actividades enzimáticas específicas de glutamato deshidrogenasa-NADP (NADP-GDH) y glutamato deshidrogenasa-NAD (NAD-GDH) para cepas H1805 (control) y H1803 en puntos temporales de 26 y 96 horas.

Figura 7. Fermentaciones de glucosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa GDH2 (H1791, línea continua) y cepa control (H1793, línea de puntos): comparación de los índices de desprendimiento de dióxido de carbono.

Figura 8. Perfiles de biomasa para fermentaciones en lote de xilosa de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2195) y cepa control (H2191).

Figura 9. Índices metabólicos específicos globales (mmol C/g-célula.h) de fermentaciones en lotes de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2195) y cepa control (H2191).

Figura 10. Perfiles temporales de producción de etanol a partir de xilosa en fermentaciones en lotes de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2222) y cepa control (H2221). Las concentraciones de etanol se normalizan con los correspondientes niveles de biomasa.

Figura 11. Índices metabólicos específicos globales (mmol C/g-célula.h) de fermentaciones en lotes de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2222) y cepa control (H2221).

Figura 12. Perfiles temporales de biomasa para fermentaciones en lotes de xilosa de cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2222) y cepa control (H2221).

Figura 13. Perfiles de biomasa para fermentaciones en lotes de xilosa de cepa recombinante de Schizosaccharomyces pombe H2369 que expresa enzima málica y cepa control H2370.

Figura 14. Perfiles temporales para producción volumétrica de etanol a partir de xilosa en cepa recombinante de Schizosaccharomyes pombe H2369 que expresa enzima málica y cepa control H2370.

Figura 15. Separación de los productos de digestión con BamHI de los vectores de transformantes de Corynebacterium descritos en el ejemplo 21. Carril 1: digestión del vector del transformante ATCC 21253. Carril 2: no relevante para este experimento. Carril 3: digestión del vector del transformante ATCC 21799 (VTT E-992103).

Descripción detallada de la invención

La enseñanza crucial de la presente invención es un método para potenciar los procesos biotecnológicos mediante la transformación de microorganismos de producción con genes de enzimas que tienden a equilibrar los dos sistemas de nucleótido de piridina que coexisten en las células vivas. Sorprendentemente, aunque en las células han evolucionado dos sistemas de nucleótido de piridina distintos que se mantienen a distintos potenciales rédox, y dichas reacciones de equilibrado están aparentemente prohibidas en células evolucionadas naturalmente, se da a conocer ahora que estas reacciones promueven las rutas metabólicas deseadas para la formación de producto mediante microorganismos modificados por ingeniería genética o seleccionados utilizados en muchos procesos biotecnológicos, y se benefician así estos procesos.

En su primera realización, la presente invención proporciona un microorganismo que está transformado con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica o causa de otro modo la expresión de al menos una de un par de deshidrogenasas con especificidades de coenzima opuestas para NAD/NADH y NADP/NADPH, pero al menos un sustrato común (S en las ecuaciones (1) y (2)), de tal modo que ambos miembros del par se expresan simultáneamente en el mismo compartimento subcelular, preferiblemente el citosol. Esto da como resultado un acoplamiento funcional de las reacciones catalizadoras de deshidrogenasas (1) y (2). No es una parte necesaria de la invención, pero tampoco está excluida, que las dos deshidrogenasas deban asociarse físicamente dentro de la célula transformada. El acoplamiento funcional permite que ocurran las siguientes reacciones, que tienden a equilibrar las parejas de coenzimas NAD/NADH y NADP/NADPH:

(1)

NADP + SH_{2} \Leftrightarrow S + NADPH

(2)

S + NADH \Leftrightarrow SH_{2} + NAD

Podría esperarse que la operación simultánea de las reacciones (1) y (2) procediera hasta que las relaciones de NAD/NADH y NADP/NADPH fueran casi idénticas, debido a que los potenciales rédox de las dos parejas son muy similares. Sin embargo, los inventores muestran en la presente memoria que cuando los microorganismos de producción se transforman de este modo, aumentan sustancialmente la eficiencia con la que se convierte el material bruto en productos útiles y los rendimientos de productos de biomasa.

Ha de observarse que la tendencia a equilibrar las dos parejas de nucleótidos de piridina causada por las reacciones (1) y (2) (y también por las reacciones (3) a (5), (6) a (8) y (11) a (12) siguientes) está causada por la transferencia de electrones a través de los sustratos de deshidrogenasas ligadas de nucleótido de piridina (SH_{2} en las reacciones (1) y (2) y las reacciones (3) a (5), malato en las reacciones (6) a (8) y glutamato en las reacciones (11) y 12)). Esto distingue la presente invención de sistemas en los que los electrones se transfieren desde NAD(P)H a NAD(P) mediante las denominadas transhidrogenasas (por ejemplo, EC 1.6.1.1 y 1.6.1.2). Kojima et al. (1996: documento EP 0733712 A1) han descrito un sistema en el que la transhidrogenasa puede utilizarse en ciertas bacterias como medio para convertir el NADH generado por el ciclo de TCA en NADPH.

Son conocidos varios pares de deshidrogenasas que comparten sustratos comunes pero tienen diferentes especificidades de nucleótido de piridina. Por ejemplo, hay tanto formas ligadas a NAD como a NADP de glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2 y 1.4.1.4), isocitrato deshidrogenasa (EC 1.1.1.41 y 1.1.1.42), aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3 y 1.2.1.4), alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 y 1.1.1.2), malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37 y 1.1.1.82), glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8 y 1.1.1.94), xilosa-1-deshidrogenasa (EC 1.1.1.175 y 1.1.1.179), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.2.1.12 y 1.2.1.13), orotato reductasa (EC 1.3.1.14 y 1.3.1.15) y ferredoxina reductasa (EC 1.18.1.2 y 1.18.1.3), pero puede utilizarse cualquier par apropiado de deshidrogenasas. Se conocen muchas deshidrogenasas (véase, por ejemplo "Enzyme Nomenclature" 1992, Academic Press Inc.) y pueden encontrarse sus propiedades en la bibliografía o determinarse mediante ensayos espectrofotométricos sencillos (véase, por ejemplo, Bergmeyer [1974]). Además de enzimas de origen natural con las especificidades de nucleótido de piridina deseadas, la invención incluye también el uso de enzimas modificadas por ingeniería genética con especificidades de nucleótido de piridina alteradas. Como ejemplo de cambios de especificidad de cofactor véanse, por ejemplo, Chen et al. (1994) y Chen et al. (1997).

Las actividades catalíticas responsables de las reacciones (1) y (2) pueden ocurrir en la misma proteína polimérica o incluso en una cadena polipeptídica individual o estar combinadas en dicha proteína polimérica o cadena polipeptídica individual, por ejemplo, mediante ingeniería genética. La invención puede realizarse también sobreexpresando una deshidrogenasa que opere efectivamente con ambos sistemas de nucleótido de piridina. Son conocidas deshidrogenasas que aceptan ambos nucleótidos de piridina e incluyen isozimas de glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.3), aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.5) y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.71). Se sabe poco acerca de cómo sus actividades se regulan in vivo de modo que no alteren las concentraciones de nucleótidos de piridina.

En su segunda realización, la invención proporciona un microorganismo que está transformado con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica o causa de otro modo la expresión de al menos una enzima que cataliza al menos una etapa de una serie cíclica de reacciones en las que el NADP se reduce a NADPH y el NADH se oxida a NAD, o viceversa. Las reacciones (3) a (5) muestran uno de dichos ciclos:

(3)

NADP + SH_{2} \Leftrightarrow S + NADH

(4)

S + X \Leftrightarrow Z + Y

(5)

NADH + Z \Leftrightarrow SH_{2} + NAD

En la dirección escrita, las reacciones (3) a (5) convierten NADP más NADH en NADPH más NAD, y en la dirección contraria, llevan a cabo la transformación opuesta. Las enzimas que catalizan las reacciones (3) y (5) son de nuevo un par de deshidrogenasas con un sustrato común (SH_{2}) pero especificidades de coenzima opuestas, como en la primera realización de la invención, pero ahora los productos de reacción (S y Z) son diferentes. Con los fines de esta invención, la reacción (4) puede ser una serie de etapas en lugar de una etapa individual, a condición sólo de que S se convierta en Z sin un cambio neto de NAD o NADP. Por tanto, esta serie de reacciones tiende también a equilibrar las parejas NAD/NADH y NADP/NADPH del mismo modo que las reacciones (1) y (2), excepto porque ésta está ahora acoplada a la transformación de X \Leftrightarrow Y. Por tanto, en el equilibrio, no es necesariamente el caso que las relaciones de NAD/NADH y NADP/NADPH sean casi iguales: en lugar de ello, dependerán también del equilibrio entre X e Y. Se proporciona un ejemplo de esta realización de la invención mediante enzima málica, piruvato carboxilasa y malato deshidrogenasa, que catalizan las siguientes reacciones:

(6)

enzima málica: malato + NADP \Leftrightarrow piruvato + CO_{2} + NADPH

(7)

piruvato carboxilasa: piruvato + CO_{2} + ATP \Leftrightarrow oxaloacetato + ADP + Pi

(8)

malato deshidrogenasa: oxaloacetato + NADH \Leftrightarrow malato + NAD

En las reacciones (6) a (8), piruvato + CO_{2} corresponden a S en las reacciones (3) a (5), oxaloacetato corresponde a Z y ATP y ADP + Pi, respectivamente, corresponden a X e Y.

En las reacciones (3) a (5), el sustrato reducido SH_{2} es común a las dos deshidrogenasas. La invención puede practicarse también transformando un microorganismo con una o más enzimas para crear una serie cíclica de reacciones (3') a (5') en la que la forma oxidada del sustrato es común a las dos deshidrogenasas:

(3')

NADH + S \Leftrightarrow SH_{2} + NAD

(4')

SH_{2} + X' \Leftrightarrow ZH_{2} + Y'

(5')

NADP + ZH_{2} \Leftrightarrow S + NADPH

De nuevo, para los fines de esta invención, la reacción (4') puede ser una serie de etapas en lugar de una etapa individual, a condición sólo de que SH_{2} se convierta en ZH_{2} sin un cambio neto de NAD ni NADP.

Adicionalmente, es ahora una extensión obvia de la invención combinar los esquemas cíclicos (3) a (5) y (3') a (5') de modo que ni las formas oxidada ni reducida de los sustratos sean comunes a las dos deshidrogenasas, sino que las formas oxidadas de los sustratos de las deshidrogenasas puedan interconvertirse mediante reacciones sin cambio rédox neto y lo mismo las formas reducidas:

(3'')

NADP + SH_{2} \Leftrightarrow S + NADPH

(4'')

ZH_{2} + Y' \Leftrightarrow X' + SH_{2} \hskip2cm S + X \Leftrightarrow Y + Z

(5'')

NADH + Z \Leftrightarrow ZH_{2} + NAD

Por tanto, en su forma más general, la invención consiste en transformar un microorganismo con un gen causante de la expresión de al menos una enzima que cataliza una de las reacciones (3'') a (5''), de modo que todas estas reacciones puedan ocurrir en el mismo compartimento celular. Cuando las reacciones ocurren de izquierda a derecha como se escribe anteriormente, los equivalentes de reducción se transfieren desde NADH a través de ZH_{2} y SH_{2} hasta NADP, reduciéndolo a NADPH. Cuando las reacciones ocurren de derecha a izquierda, se forma NADH a expensas de NADPH.

También en esta realización de la invención, se prevé que pueda utilizarse una enzima modificada por ingeniería genética con especificidades de coenzima cambiadas.

En el primer aspecto específico de la invención, el microorganismo hospedador porta una enzima XR que usa preferiblemente NADPH y una enzima XDH que usa preferiblemente NAD. El microorganismo hospedador puede convertir la xilosa en xilulosa mediante estas enzimas pero, como se describe anteriormente, este proceso es ineficiente y los rendimientos de etanol desde xilosa son bajos o nulos. Se proporciona un ejemplo de este aspecto de la invención en el ejemplo 8. Se transforma una cepa modificada por ingeniería genética de S. cerevisiae que porta los genes XR y XDH y xiluloquinasa (XK) con un plásmido de múltiples copias que porta el gen GDH2 que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD de S. cerevisiae, y un gen marcador. Se seleccionan los transformantes mediante el gen marcador. Los transformantes fermentan xilosa a etanol más eficientemente que la levadura hospedadora no transformada, en particular con un rendimiento mayor de etanol desde xilosa, o menos producción de CO_{2} o ambos. Dependiendo de las condiciones de proceso elegidas, la eficiencia mejorada puede verificarse también de otros modos tales como una productividad en volumen aumentada o un índice específico potenciado. El índice específico potenciado es especialmente significativo en procesos que utilizan microorganismos inmovilizados, en los que hay un límite superior a la cantidad de biomasa que puede mantenerse por el material vehículo. La eficiencia aumentada puede explicarse mediante la siguiente secuencia de reacciones:

(9)

xilosa + NADPH \rightarrow xilitol + NADP

(10)

xilitol + NAD \rightarrow xilulosa + NADH

(11)

NADH + 2-oxoglutarato + NH_{3} \rightarrow glutamato +NAD

(12)

\underline{NADP + glutamato \rightarrow 2-oxoglutarato + NH_{3} + NADPH}

SUMA:

xilosa => xilulosa

Por tanto, se evita el desequilibrio rédox, y puede tener lugar una conversión suave de xilosa en xilulosa. El flujo mediante reacciones de descarboxilación tales como G6PDH e isocitrato deshidrogenasa para regenerar NADPH se reduce, con producción reducida de CO_{2}, y la fermentación ocurre eficientemente y sin aireación. Bastante sorprendentemente, la producción de xilitol aumentó también en aproximadamente un 25% en la cepa transformada según la invención con GDH2 en comparación con la cepa control. Este aumento de xilitol se discute a continuación.

En este ejemplo, el microorganismo hospedador se había transformado ya con genes que codifican XR, XDH y XK. No es un requisito de la invención que el organismo hospedador sea por sí mismo un transformante. Es destacable que la invención causa un aumento sustancial de los rendimientos de etanol con el microorganismo hospedador del ejemplo 8, porque la XR en este hospedador es la enzima de P. stipitis, que es capaz de trabajar con NAD(H) aunque tiene preferencia por NADP(H) (Verduyn et al. [1985]). Por tanto, este aspecto de la invención se verifica incluso con una XR que puede utilizar NADH. Puede ocurrir un efecto más sustancial cuando el organismo hospedador contiene una XR con mayor especificidad por NADP(H), tal como cuando se expresa en gran medida el marco de lectura abierto de S. cerevisiae XHR 104w que codifica la actividad XR. Además, se ha reivindicado que la transformación de levaduras con un gen que codifica XK mejora la eficiencia con la que fermentan xilosa a etanol (Ho y Tsao, documento WO 95/13362). Es notable que la presente invención cause una fermentación mejorada de xiloxa a etanol incluso cuando el organismo hospedador contiene niveles elevados de XK. Sin embargo, la invención proporciona una fermentación mejorada de xilosa a etanol también en organismos hospedadores que no se han transformado con un gen que codifica XK. Es ahora conocido que las levaduras tales como S. cerevisiae y Schiz. pombe contienen genes homólogos que codifican XDH, XK y XR (S. cerevisiae). La capacidad de una levadura hospedadora que no contiene ningún gen heterólogo de XR, XDH o XK de fermentar xilosa a etanol puede potenciarse también útilmente mediante transformación según la presente invención.

Son conocidas diversas enzimas, incluyendo isomerasas y epimerasas, que interconvierten los diferentes azúcares de pentosa y diferentes fosfatos de pentosa. Se entenderá por un experto en la técnica que la presente invención proporciona un método general para mejorar la eficiencia de la producción de etanol, no sólo a partir de xilosa, sino también de otras pentosas.

Se entenderá por un experto en la técnica que pueden obtenerse efectos beneficiosos similares utilizando otros pares de deshidrogenasas según la primera realización de la invención descrita anteriormente. Por ejemplo, en lugar de transformar S. cerevisiae con GDH2, de modo que se expresen adecuadamente tanto glutamato deshidrogenasas ligadas a NAD como a NADP en el citosol, puede conseguirse el mismo efecto transformando la levadura con uno o ambos miembros de otro par de deshidrogenasas que compartan los mismos sustratos, pero utilicen diferentes nucleótidos de piridina, a condición de que ambas enzimas sean reversibles, o al menos de que catalicen las reacciones en las direcciones mostradas en las ecuaciones (11) y (12). Por ejemplo, la mayoría de isocitrato deshidrogenasas ligadas a NAD son enzimas alostéricas que no pueden catalizar la carboxilación reductiva de 2-oxoglutarato (correspondiente a la reacción (11)), sino sólo la descarboxilación oxidativa de isocitrato, y por lo tanto serían inadecuadas para este aspecto de la presente invención. Sin embargo, pueden utilizarse algunos otros pares de deshidrogenasas, incluyendo alcohol y aldehído deshidrogenasas. Puede obtenerse información apropiada en la bibliografía o determinarse fácilmente ensayando con ensayos espectrofotométricos simples. Las actividades deshidrogenasa pueden medirse fácilmente en ambas direcciones, a condición de que sean reversibles, siguiendo la aparición o desaparición de NAD(P)H en presencia de los sustratos apropiados para determinar si las enzimas candidatas catalizan las reacciones necesarias para aliviar el desequilibrio coenzimático.

Según la segunda realización de la presente invención, pueden obtenerse efectos beneficiosos similares transformando S. cerevisiae con una molécula de ADN recombinante que codifica una enzima málica de S. cerevisiae ligada a NAD(P) que ya contiene piruvato carboxilasa y malato deshidrogenasa. La levadura puede catalizar ahora las reacciones (6) a (8) como se muestra anteriormente, dando como resultado la conversión de NADP más NADH en NADPH más NAD. El ejemplo 14 ilustra los efectos beneficiosos de esta transformación. Comparada con la cepa control, la cepa que sobreexpresa el gen de enzima málica exhibía un índice específico de utilización de xilosa un 55% mayor y índices específicos de formación de etanol y xilitol un 20% y un 25% mayores.

Los índices de formación de xilitol aumentados observados en los ejemplos 8 y 14 por las cepas construidas según las primera y segunda realizaciones de la invención fueron inesperadas, porque estas cepas particulares contenían también XDH y XK heterólogas. XDH y XK son conocidas por ayudar a la conversión de xilosa en etanol, de modo que estas cepas eran un buen ensayo para mostrar que la presente invención puede mejorar adicionalmente la fermentación de xilosa a etanol en condiciones realistas. Se espera que XDH y XK faciliten la conversión de xilitol derivado de xilosa a xilulosa-5-fosfato, de modo que es significativo que incluso en presencia de estas dos enzimas la transformación según la presente invención aumentara la captación de xilosa en más de lo que aumentaba la producción de etanol, apareciendo la diferencia como un aumento de la producción de xilitol. El xilitol es un producto atractivo, por sí mismo o junto con etanol. La transformación según la invención de cepas que no contienen XDH y XK heterólogas se espera que proporcione al menos mejoras tan buenas de la producción de xilitol como las conseguidas en los ejemplos 8 y 14.

Las levaduras y otros microorganismos producen otros pentitoles, en particular, arabitol y ribitol, así como xilitol. Estos pueden producirse a partir de otras pentosas naturales (por ejemplo, arabinosa) que aparecen en materiales brutos, o mediante interconversiones metabólicas de pentitoles que a menudo proceden mediante reacciones de deshidrogenasa con especificidad de coenzima diferente (véase, por ejemplo, Chiang y Knight [1960]). En cualquier caso, aparecen problemas de equilibrio rédox similares a los descritos anteriormente, y pueden obtenerse productividades y rendimientos mejorados mediante la práctica de la presente invención.

Se entenderá por un experto familiarizado con la técnica que, debido a que explota principios bioquímicos fundamentales, la presente invención tiene una aplicación muy amplia y puede practicarse en otros microorganismos así como en S. cerevisiae. El ejemplo 18 ilustra que la transformación de Schiz. pombe con el gen que codifica la enzima málica según la invención mejora la eficiencia de la fermentación de xilosa a etanol. Las productividades volumétrica y específica se potenciaron también significativamente con este microorganismo, y de forma importante, era capaz de mantener su biomasa y capacidad metabólica en las condiciones del proceso, mientras que la biomasa de la cepa control se reducía relativamente rápido.

En otro aspecto específico de la invención, el microorganismo hospedador fermenta azúcares de hexosa a etanol. Debido a que los microorganismos crecen durante la fermentación, produce excesos tanto de NADH como de NADP (Oura, [1972]). Con el microorganismo no transformado, la producción de etanol está acompañada por la producción de glicerol, que es necesario para reoxidar el exceso de NADH, y por la producción de más de un mol de CO_{2} por mol de etanol, que es necesario para reducir el NADP en exceso. Estas reacciones reducen el rendimiento de etanol desde carbohidrato fermentable. Con el microorganismo transformado, aumenta el rendimiento de etanol desde carbohidrato fermentable comparado con el del microorganismo no transformado. Se proporcionan ilustraciones de este aspecto de la invención en los ejemplos 9 y 13.

En el ejemplo 9, se transforma la levadura S. cerevisiae con un plásmido de múltiples copias que comprende el gen GDH2 que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD de S. cerevisiae y un gen marcador. Los transformantes se seleccionan mediante el gen marcador. Los transformantes fermentan glucosa a etanol con eficiencia mejorada, en particular, un rendimiento mejorado de etanol desde carbohidratos fermentables y con una producción reducida de algunos subproductos indeseados, incluyendo CO_{2}. Dependiendo de las condiciones de proceso elegidas, la eficiencia mejorada puede verificarse también de otros modos tales como un volumen de productividad aumentado o un índice específico aumentado. Esto puede explicarse mediante la siguiente secuencia de reacciones, que convierte partes sustanciales de los NADH y NADP en exceso en NAD y NADPH sin consumo indeseado de azúcares fermentables:

NADH + 2-oxoglutarato + NH_{3} \rightarrow glutamato + NAD

NADP + glutamato \rightarrow 2-oxoglutarato + NH_{3} + NADPH

En el ejemplo 13, se transforma S. cerevisiae con un gen que modifica la enzima málica según la segunda realización de la invención. Se consiguen ventajas significativas, incluyendo de nuevo producción reducida de biomasa (indeseada) y índice específico aumentado de producción de etanol.

Se entenderá por un experto en la técnica que pueden obtenerse efectos beneficiosos similares sobre la fermentación de hexosa a etanol utilizando otros pares de deshidrogenasas según la primera realización de la invención dada a conocer anteriormente, o utilizando otras enzimas apropiadas según la segunda realización de la invención, y que la invención puede practicarse con otros microorganismos así como S. cerevisiae.

Es una parte significativa de la invención que la misma transformación que aumenta la eficiencia de la fermentación de xilosa a etanol (ejemplos 8, 14 y 18), aumenta también la eficiencia de la fermentación de hexosa a etanol (ejemplos 9 y 13). Por tanto, la invención proporciona simultáneamente la utilización tanto de glucosa como de xilosa, que son azúcares importantes derivados de muchas biomasas renovables tales como materiales agrícolas y forestales y desechos urbanos.

Para la producción industrial de etanol, la presente invención se practica preferiblemente utilizando una cepa industrial, por ejemplo, una levadura de destilación o de cervecería, o una levadura de vino o una cepa de Schiz. pombe utilizada para la producción de ron. Son bien conocidos los métodos para transformar levaduras industriales, que a menudo son poliploides y carecen de marcadores auxotróficos. Se ha hecho una revisión temprana de dichos métodos por Knowles y Tubb (1987). La cepa industrial transformada según la invención se utiliza después, por ejemplo, en el mismo proceso de fermentación industrial que la cepa no transformada, y proporciona las ventajas dadas a conocer anteriormente tales como rendimiento aumentado, productividad aumentada y subproductos indeseables reducidos. Comparada con la cepa no transformada, la cepa transformada puede utilizarse también ventajosamente para la fermentación económica de un intervalo más amplio de materiales brutos tales como materiales brutos con altos niveles de pentosas, polímeros de pentosa o ambos.

En un tercer aspecto específico de la invención, se transforma un microorganismo que sobreproduce un aminoácido tal como alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, triptófano, cisteína, metionina o prolina con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica al menos un par de deshidrogenasas con especificidades de nucleótido de piridina opuestas (concretamente, según la primera realización de la invención) o con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica al menos una enzima que cataliza al menos una etapa de una serie cíclica de reacciones en la que el NADP se reduce a NADPH y el NADH se oxida a NAD según las reacciones (3) a (5), (3') a (5') o (3'') a (5'') (concretamente, según la segunda realización de la invención). El microorganismo transformado puede producir el aminoácido deseado con eficiencia mejorada, en particular, con un rendimiento aumentado de la fuente de carbono, con una productividad aumentada, con un requisito reducido de aireación, con una producción reducida de dióxido de carbono o con varios de estos beneficios.

Por ejemplo, la lisina se produce actualmente mediante procesos de fermentación microbiana que están basados principalmente en diversas Corynebacteria tales como Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum. Las técnicas genéticas para estas bacterias están bien desarrolladas (véanse, por ejemplo, Follettie et al. [1991]; Follettie y Sinskey [1986]; Jetten et al. [1994]; Jetten y Sinskey [1995]) y están disponibles vectores de ADN para la transformación eficiente de estos organismos de producción mediante plásmidos de múltiples copias o integración cromosómica. Por ejemplo, los vectores disponibles incluyen pAJ655, pAJ1844 y pCG11 para uso con C. glutamicum, Brevibacterium spp. y Escherichia coli o el vector de plásmido pAJ440 para uso en Bacillus subtilis, Brevibacterium spp. y C. glutamicum, o el vector plásmido pMS2 para uso en Rhodococcus spp., Corynebacterium spp. y E. coli. Los efectos de la transformación de cepas productoras de lisina según la presente invención pueden verificarse en cepas tales como ATCC 31269, ATCC 21253, ATCC 21800, ATCC 21801 o ATCC 21086, o en otras cepas que sobreproducen lisina u otros aminoácidos y se utilizan industrialmente.

Se ilustra este aspecto de la invención en los ejemplos 19 a 23. Se transformó Corynebacterium glutamicum con un gen de Peptostreptococcus asaccharolyticus que codifica una glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD. La Corynebaterium glutamicum transformada muestra actividad glutamato deshidrogenasa ligada a NAD, y este organismo posee naturalmente actividad glutamato deshidrogenasa ligada a NADP. Por lo tanto, el organismo transformado posee un par de deshidrogenasas según la primera realización de la invención que puede convertir NADP más NADH en NAD más NADPH. Al contrario que algunas bacterias, Corynebacterium glutamicum no contiene transhidrogenasa NADP/NADH, de modo que la operación secuencial de las dos glutamato deshidrogenasas proporciona a la bacteria el nuevo medio para equilibrar las parejas de coenzimas NAD/NADH y NADP/NADPH. Es bien conocido que la síntesis de lisina (y la mayoría de los otros aminoácidos) produce NADP y que, cuando se sobreproduce lisina en grandes cantidades, el requisito de reducción de NADP a NADPH puede limitar la producción de aminoácido. Es también conocido que en las condiciones de cultivo utilizadas en el ejemplo 23, la producción de lisina no empieza mientras sigue presente treonina en el medio, y que los rendimientos son relativamente bajos hasta que las bacterias dejan de crecer (Vallino, J.J. [1991]; véanse especialmente las páginas 207 a 213). Sorprendentemente, Corynebacterium glutamicum transformada según la invención producía ya grandes cantidades de lisina mientras la treonina seguía presente, y antes de que la bacteria hubiera alcanzado siquiera un 25% del rendimiento de biomasa esperado. Estos ejemplos dan a conocer que la presente invención puede practicarse con ventaja también en bacterias así como hongos, y para mejorar la producción de aminoácidos así como compuestos no nitrogenados tales como etanol y xilitol.

Para la producción industrial de aminoácidos, se transforma una cepa bacteriana que sobreproduce uno o más aminoácidos según la invención. La cepa transformada puede utilizarse en los mismos procesos industriales que la cepa original no transformada. Por ejemplo, pueden utilizarse materiales brutos que comprenden cualquiera de una variedad de azúcares o ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, succínico o fumárico como fuente de carbono y amoniaco, sales de amonio o hidrolizados de proteína baratos como fuente de nitrógeno. Pueden añadirse materiales en trazas orgánicos (por ejemplo, tiamina) e inorgánicos (por ejemplo, sales de hierro y manganeso) del mismo modo que para el proceso original con la cepa original no transformada. Comparada con la cepa no transformada, la cepa transformada según la presente invención proporciona las ventajas dadas a conocer anteriormente tales como un rendimiento aumentado, una productividad aumentada, y un requisito reducido de oxígeno.

Puede introducirse también una glutamato deshidrogenasa ligada a NAD en Corynebacterium glutamicum (y otras Corynebacteria spp.) mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, el gen de Peptostreptococcus asaccharolyticus se ha transferido a C. glutamicum bajo un promotor Tac por Marx et al. (1999). Significativamente, estos trabajadores utilizaron una cepa de Corynebacterium glutamicum de la que se eliminó en primer lugar el gen que codifica la glutamato deshidrogenasa ligada a NADP, mientras que la presente invención enseña la presencia simultánea de glutamato deshidrogenasas ligada a NADP y ligada a NAD. La invención puede practicarse también transformando cepas bacterianas que sobreproducen otros aminoácidos distintos de lisina con éste u otro gen que codifica glutamato deshidrogenasa ligada a NAD, o con el gen de alguna otra enzima que cause el acoplamiento funcional de dos deshidrogenasas con diferentes especificidades por las parejas de nucleótidos de piridina.

Se producen comercialmente polihidroxialcanoatos (PHA) para preparar plásticos biodegradables, pero los precios son demasiado altos para un uso extendido excepto cuando éste está reforzado por la legislación (por ejemplo, en Alemania). Por lo tanto, es deseable mejorar la eficiencia de los procesos microbianos que producen PHA. En la biosíntesis de PHA, se metaboliza la glucosa a acetil-CoA, produciendo 2 moléculas de NADH/molécula de acetil-CoA, y después se condensa la acetil-CoA a acetoacetil-CoA, que se reduce por NADPH a 3-hidroxibutiril-CoA. Por lo tanto, la síntesis de cada molécula de 3-hidroxibutiril-CoA produce 4 moléculas de NADH y requiere 1 molécula de NADPH. Se polimeriza después la 3-hidroxibutiril-CoA a polihidroxibutirato (PHB) o se copolimeriza con otras acil-CoA tales como propionil-CoA, formando PHA mixtos. El requisito de una molécula de NADPH y la producción de 4 moléculas de NADH por unidad monomérica significa que los microorganismos que sintetizan PHA necesitan derivar parte de su flujo de carbono mediante reacciones tales como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o isocitrato deshidrogenasa para generar NADPH, con la consiguiente producción en exceso de CO_{2} y gasto de fuente de carbono, como se explica anteriormente. Al mismo tiempo, el NADH debe reoxidarse, causando pérdidas de carbono adicionales o una demanda de oxígeno aumentada o ambos. Este gasto puede reducirse transformando el microorganismo de producción según la presente invención, proporcionando así un nuevo mecanismo que convierte parte del NADH en exceso producido
en el NADPH requerido (para revisiones, véanse, por ejemplo, Anderson y Dawes [1990]; Poirier et al. [1995]).

En este aspecto de la invención, se transforma un microorganismo que produce uno o más PHA según la primera o segunda realizaciones, y se utiliza el microorganismo transformado para fermentar glucosa en presencia o ausencia de ácidos orgánicos tales como ácidos propiónico o valérico. Comparado con el organismo original no transformado, el organismo transformado según la invención proporciona las ventajas dadas a conocer anteriormente tales como producir rendimientos aumentados de PHA desde glucosa, productividades aumentadas y una formación reducida de subproductos indeseados tales como CO_{2}. El ejemplo 24 ilustra cómo puede hacerse esto. En este ejemplo, el microorganismo de producción es una cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae transformada con genes de PHB sintasa y reductasa de Alcaligenes eutrophus. Sin embargo, no es necesario utilizar una levadura recombinante. Puede utilizarse cualquier microorganismo productor de PHA, por ejemplo, Alcaligenes eutrophus o Pseudomonas oleovarans, o cepas bacterianas modificadas por ingeniería genética que sobreproducen PHA. Se utiliza después el microorganismo transformado según la presente invención para fermentar glucosa con o sin ácidos orgánicos esencialmente en las mismas condiciones de proceso que las utilizadas para el organismo original no transformado.

En otro aspecto de la invención, se transforma un microorganismo de producción según la invención y, en las condiciones de un proceso biotecnológico, el microorganismo transformado mantiene un mayor nivel de la capacidad metabólica necesaria para dicho proceso que el correspondiente microorganismo no transformado. El ejemplo 14 ilustra este aspecto. Se utiliza S. cerevisiae transformada según la invención con un gen que expresa enzima málica para fermentar xilosa a etanol en condiciones anaeróbicas, que son ventajosas porque evitan una reducción en el rendimiento de etanol causada por procesos oxidativos. En estas condiciones de proceso, la biomasa de la cepa control se reduce con el tiempo durante la operación del proceso, con una correspondiente pérdida de su capacidad metabólica de convertir sustrato (xilosa) en producto (etanol). En la práctica, esto conduciría a requisitos de proceso inconvenientes y costosos tales como adición repetida de más organismo de producción. Sin embargo, el organismo transformado según la invención es capaz de mantener su biomasa y la capacidad metabólica requerida por el proceso (Fig. 8). Presuntamente, esto es debido a que el organismo transformado es capaz de obtener suficiente energía de la biotransformación del proceso (en el caso del ejemplo 14, la conversión de xilosa en etanol) para mantener su propia integridad y capacidad metabólica, mientras que el organismo no transformado no puede. En las condiciones del ejemplo 14, con un microorganismo de producción unicelular y un medio líquido homogéneo, era fácil demostrar la reducción de biomasa del microorganismo control y el mantenimiento de biomasa del organismo transformado según la invención.

Sin embargo, resulta evidente para un experto familiarizado con la técnica, en primer lugar, que en muchos procesos, por ejemplo, aquellos que emplean medios heterogéneos u hongos filamentosos o ambos, puede ser muy difícil demostrar el mantenimiento de biomasa, y en segundo lugar, el parámetro significativo no es la biomasa misma, sino su capacidad metabólica de convertir el sustrato del proceso en el producto. A este respecto, capacidad metabólica significa la capacidad total del organismo de producción presente en un proceso (por ejemplo, por unidad de volumen de un fermentador) de realizar un conjunto particular de biotransformaciones, a saber, aquellas requeridas por el proceso biotecnológico particular, y puede medirse midiendo el índice de conversión del sustrato de proceso en producto de proceso en condiciones estándar.

Otros aspectos de la invención incluyen la transformación de microorganismos de producción que se han desarrollado para sobreproducir nucleótidos, lípidos o metabolitos secundarios de diversos tipos a escala industrial. Después de la transformación según las realizaciones anteriormente descritas de esta invención, estos microorganismos proporcionarán rendimientos aumentados de los productos comerciales deseados, o índices de producción específica aumentados, formación reducida de subproductos indeseables (tales como CO_{2} o biomasa en exceso) o varias de estas ventajas simultáneamente.

Estos ejemplos dan a conocer cómo puede mejorarse la eficiencia de los procesos biotecnológicos transformando microorganismos de producción con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica enzimas que facilitan reacciones de oxidación-reducción entre los sistemas de coenzimas NAD(H) y NADP(H). La invención puede realizarse transformando el hospedador con un gen individual (por ejemplo, GDH2 en el ejemplo 3; MAE1 en el ejemplo 12) y utilizando enzimas que se expresan naturalmente en el hospedador en las condiciones de producción específicas para completar los esquemas de reacción (concretamente, reacciones (1) + (2) o (3) + (4) + (5) anteriormente). Sin embargo, la invención puede realizarse también transformando el hospedador con más de una molécula de ADN, de modo que se realizan ambas reacciones (1) y (2) o dos o más de las reacciones (3), (4) y (5) (o (3'), (4') y (5'), o (3''), (4'') y (5'')) por enzimas expresadas por genes transformados.

Además de GDH2 y un gen que codifica la enzima málica, pueden ser ventajosos genes que codifican otras enzimas. Las enzimas adecuadas (se dan ejemplos anteriormente) son conocidas y sus genes se han clonado y pueden encontrarse en bancos de datos y obtenerse mediante métodos de PCR bien conocidos en la técnica (los ejemplos 6 y 7 y 10 confirman lo fácilmente que puede hacerse esto para genes tanto de levadura como de hongos filamentosos). Un experto en las técnicas de fisiología y metabolismo microbianos puede planear un esquema metabólico correspondiente a las reacciones (1) y (2), o (3) a (5), (3') a (5'), o (3'') a (5''). Muchos de dichos esquemas requieren enzimas bien conocidas. En los bancos de datos (por ejemplo, Swissprot) puede buscarse también para encontrar la enzima o enzima necesarias. Por tanto, por ejemplo, los siguientes números de acceso proporcionan secuencias de aminoácidos o nucleótidos correspondientes a deshidrogenasas ligadas a NADP: P00369, P31026, P00370, P50216, P08200, P14941, P75214, P27800, Q58820, P15719, P46919, P28861, L05667, U26463, YPL061w, P18819, M88600, X75327 y P55804. Estas secuencias pueden utilizarse para clonar los correspondientes genes, por ejemplo, mediante PCR con cebadores específicos de secuencia.

Pueden encontrarse otras actividades enzimáticas adecuadas llevando a cabo ensayos enzimáticos apropiados (véase, por ejemplo, Bergmeyer [1974], pero pueden diseñarse fácilmente otros sistemas de ensayo adecuados por un experto en la técnica) sobre extractos preparados a partir de organismos adecuados, incluyendo bacterias, hongos y plantas y animales superiores. La proteína responsable puede purificarse después mediante métodos estándar, y prepararse anticuerpos contra ella o contra datos de secuencia de aminoácidos obtenidos a partir de ella. El gen que codifica la proteína puede clonarse después mediante métodos estándar tales como utilizar anticuerpos para examinar bibliotecas de expresión u oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias de aminoácidos para actuar como cebadores en clonación por PCR o sondas de hibridación para examinar bancos de genes.

Pueden encontrarse también nuevas actividades enzimáticas adecuadas y sus genes explotando información de bancos de datos de otros modos que son familiares y rutinarios para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el alineamiento de varias secuencias que codifican enzimas málicas revela la denominada "firma de enzima málica", que permite la preparación de mezclas de oligonucleótidos que pueden utilizarse, por ejemplo, en clonación por PCR de genes que codifican enzimas málicas en otros organismos, como se describe en el ejemplo 7 para la enzima málica de Aspergillus nidulans.

Es bien conocido por un experto en la técnica que, durante la clonación de genes por PCR, pueden ocurrir mutaciones puntuales y pueden perpetuarse mediante la técnica de amplificación. Pueden ocurrir también naturalmente pequeñas diferencias de secuencia entre los mismos genes en diferentes cepas del mismo organismo. Muchos de estos cambios no tienen un efecto significativo sobre la función de la proteína codificada, y por lo tanto se denominan mutaciones neutras. Por ejemplo, se observaron dos mutaciones puntuales en el gen que codifica la enzima málica en el ejemplo 10, pero no afectaban significativamente la actividad de la enzima málica codificada. Dichas mutaciones neutras pueden introducirse también deliberadamente. Esta invención abarca el uso de dichas variantes neutras de genes, así como de los genes naturales.

Según la presente invención, se transforma el organismo hospedador de tal manera que las reacciones (1) y (2) en la primera realización de la invención, o las reacciones (3) a (5) (o (3') a (5') o (3'') a (5'')) en la segunda realización ocurran simultáneamente, preferiblemente en el mismo compartimento subcelular, preferiblemente el citosol. La restricción de que las reacciones ocurran en el mismo compartimento no es absoluta, porque las reacciones (4'') pueden incluir reacciones de transporte o lanzadera que muevan intermedios metabólicos entre compartimentos subcelulares. La invención enseña que el gen transformante puede modificarse si es necesario para causar la expresión en el compartimento apropiado y en las condiciones fisiológicas reinantes durante el proceso de producción deseado. Las denominadas secuencias "señal" o "diana" son conocidas porque habitualmente codifican secuencias de aminoácido N-terminales o C-terminales relativamente cortas que dirigen las proteínas a compartimentos específicos tales como mitocondrias, peroxisomas o espacio periplásmico (McAlister-Henn et al. [1995]). Estas secuencias pueden retirarse o añadirse fácilmente a genes mediante técnicas estándar de ingeniería genética, causando que las enzimas deseadas se expresen en el compartimento deseado. La enzima málica expresada por el gen MAE1 completo (como en los ejemplos 13, 14 y 18) es un ejemplo de una enzima con una secuencia diana mitocondrial (Boles et al. [1998]), de modo que se espera que al menos algo de su actividad esté localizada dentro de mitocondrias. Cuando el gen se expresa fuertemente, como en los ejemplos 13 y 14, es probable que una parte de la enzima permanezca en el citosol, donde se encuentran también malato deshidrogenasa y piruvato carboxilasa de levadura. Si se desea expresar la enzima málica (o alguna otra enzima con una secuencia diana mitocondrial) sólo en el citosol, entonces puede retirarse la secuencia diana mediante truncamiento apropiado del gen. Además, las enzimas sujetas a inactivación catabólica pueden modificarse para retardar o prevenir este circuito regulatorio (Minard y McAlister-Henn [1992]).

La presente invención puede practicarse también transformando un microorganismo con una molécula de ADN recombinante de modo que el promotor natural de un gen hospedador que codifica una enzima adecuada que cataliza una de las reacciones (3'') a (4'') se reemplace por otro promotor que puede causar una expresión más fuerte o expresión en condiciones fisiológicas diferentes que dicho promotor natural. No es necesario que la molécula de ADN transformante contenga una secuencia de nucleótidos que codifique una enzima funcional completa. Por ejemplo, puede obtenerse un efecto beneficioso transformando el hospedador S. cerevisiae con una molécula de ADN que reemplaza sólo mediante recombinación in vivo el promotor natural GDH2 del hospedador por un promotor tal como PGK o ADH, de modo que se expresa constitutivamente la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD del hospedador. Cuando el hospedador se transforma con un gen de otro organismo, es deseable utilizar un promotor derivado del hospedador.

Para muchos hongos y bacterias de producción son conocidos promotores adecuados. Los ejemplos incluyen el promotor de S. cerevisiae PGK, ACT, ENO1, GAPDH, genes MET tales como MET25 y promotores ADH, y versiones modificadas de los mismos (por ejemplo, Ruohonen et al., [1995]; Beier y Young [1982]). Se prevé en la invención que, en el caso de S. cerevisiae, por ejemplo, el uso de estos promotores pueda ser ventajoso incluso cuando el gen o genes transformados se obtienen a partir de levadura. Pueden ser especialmente ventajosos cuando los genes han de integrarse en el genoma del hospedador, porque estos promotores son conocidos por causar una expresión adecuada en un intervalo de condiciones fisiológicas. Por ejemplo, el denominado promotor de longitud media ADH1 causa una expresión eficiente en S. cerevisiae en condiciones de crecimiento tanto fermentativas como gluconeogénicas. Sin embargo, la expresión adecuada del gen o genes transformados puede obtenerse también con los promotores naturales de los genes, por ejemplo, mediante transformación con un plásmido de múltiples copias, como se da a conocer en los ejemplos 3 a 5. La expresión eficiente en condiciones fisiológicas deseadas puede obtenerse también mediante modificaciones del promotor en cuestión o mediante modificaciones de los mecanismos reguladores de transacción (negativos o positivos) implicados en la expresión del gen particular.

Cuando se transforman genes extraños en un organismo, es deseable transformar con una secuencia de ADN sin intrones, obtenida por ejemplo a partir de ADNc o mediante síntesis artificial.

Cualquier método conocido en la técnica para introducir o transformar genes en el hospedador es adecuado para esta invención, y pueden utilizarse diversos tipos de vectores, incluyendo vectores plásmidos de replicación autónoma o cromosomas artificiales. Los métodos descritos en la técnica para integrar copias individuales o múltiples de genes transformantes en cromosomas en formas funcionales expresables son también adecuados para esta invención. Se han descrito ejemplos de dichos métodos para levadura, hongos filamentosos y Corynebacteria, y otros microorganismos. Puede incluirse un gen marcador apropiado en el vector transformante, de modo que los transformantes puedan seleccionarse fácilmente. También puede utilizarse cotransformación con un segundo vector que contiene un gen marcador detectable. Es conocido un amplio intervalo de genes marcadores. Los transformantes pueden seleccionarse también mediante la expresión de un fenotipo deseado, tal como la capacidad potenciada de crecer en xilosa en condiciones anaeróbicas (véase el ejemplo 8).

Se prevé en la invención que pueda ser ventajoso en algunos casos causar la expresión de los genes transformados sólo en condiciones de cultivo específicas. Por ejemplo, puede ser útil en primer lugar hacer crecer el organismo hasta cierta densidad celular, y después causar la expresión del gen transformante. Se conocen promotores que pueden inducirse mediante cambios en la temperatura o el pH, por fuentes de carbono o nitrógeno particulares, o por la presencia o ausencia en el medio de ciertas sustancias orgánicas o inorgánicas tales como fosfato o cobre. Los ejemplos de promotores de levadura que se han utilizado para dicha expresión inducible incluyen GAL1, GAL10, CUP1 y PH05.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que describen la construcción de las cepas de producción de la invención, así como su uso en los aspectos específicos anteriormente indicados de la invención. Si no se indica otra cosa, todos los procedimientos biotecnológicos se llevan a cabo utilizando métodos convencionales en la técnica.

Ejemplo 1 Construcción de la cepa integrante con los genes XYL1 y XYL2 de Pichia stipitis que codifican xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa

Se digirió el vector de expresión de levadura pAOS66 (Figura 1) basado en pMA91 (Mellor et al. [1983]) que contiene XYL1 bajo el promotor PGK1 y XYL2 bajo el promotor ADH1 modificado (Ruohonen et al., [1995]) con HindIII, aislando el módulo de expresión de 2,8 kb que porta el gen XYL1 entre el promotor y el terminador PGK1 y con BamHI, aislando el módulo de expresión de 2,2 kb que porta el gen XYL2 entre el promotor ADH1 modificado y el terminador ADH1. Se utilizó el plásmido B955 (Toikkanen et al. [1998]) para construir el módulo de integración. B955 es el vector de clonación bacteriano Bluescript SK (Stratagene) que porta dos fragmentos del gen URA3 (que codifica orotidin-5'-P-descarboxilasa, Rose et al. [1984]); los pares de bases 71-450 y 781-1135 de la región de codificación del gen en los sitios SacI-XbaI y los sitios XhoI-Asp718, respectivamente, de la región del poliengarce. Se utilizaron los sitios HindIII y BamHI de poliengarce restantes en el vector de clonación para introducir los módulos de expresión XYL1 y XYL2 entre los dos fragmentos URA3 mediante ligamientos de extremo cohesivo. La construcción resultante (5' URA3 71-450 pb- módulo de expresión XYL2 3'-5'- módulo de expresión XYL1 5'-3'- URA3 781-1135 3'), se liberó de Bluescript SK por digestión con SacI-NsiI y se aisló a partir de un gel de agarosa. Se utilizó 1 \mug del fragmento para transformar la cepa de levadura CEN.PK2 (VW-1B) (MAT\alpha leu2-3.112 ura 3- 52 trp1 -289 his3- \Delta1 MAL2 - 8^{c} SUC2) (Boles et al., [1996]) mediante el procedimiento de transformación de LiAc (Hill et al. [1991], Gietz et al. [1992]). La cepa CEN.PK2 (VW-1B) se denomina "cepa H1346" por los inventores, y tiene un número de colección de cepas VTT VTT C-98304.

La estrategia de integración está basada en la toxicidad de 5-FOA (ácido 5-fluoroorótico) en las células de levadura (Boeke et al. [1984]). Las células de tipo silvestre convierten 5-FOA en 5-FUMP (monofosfato de 5-fluorouridina), un potente inhibidor de la timidilato sintetasa. Por tanto, sólo los mutantes ura3 (y ura5) pueden crecer en presencia de 5-FOA, a condición de que se proporcione uracilo para la cepa mutante. La integración del fragmento anteriormente descrito en el locus URA3 desestabiliza el gen de tipo salvaje y la cepa se vuelve auxotrófica de uracilo, permitiendo que crezca en placas 5-FOA.

Se verificó la integración funcional correcta mediante transferencia Southern, midiendo las actividades XR y XDH en los extractos celulares y mostrando que la cepa de integración crecía sólo en xilosa en cultivos de matraz agitado, en contraposición con la cepa CEN.PK2 (VW-1B) no transformada. La cepa integrante se denominó H1469.

Ejemplo 2 Clonación del gen de xiluloquinasa de Saccharomyces cerevisiae (Nº SGF YGR 194C)

Se amplificó el gen de xiluloquinasa (XK) a partir de ADN total de cepa de levadura de tipo silvestre mediante PCR, utilizando el cebador de codificación 5' CCA GTG ATA TCG AGG ATG AGA TTA GTA C 3' y el cebador inverso 5' CCA GTG ATA TCT GTA CTT GTC AGG GCA T 3'. Ambos cebadores contienen un sitio de restricción EcoRV en el extremo 5'. Las condiciones de reacción PCR fueron: 94ºC 3 min inicio caliente, 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 2 min, 30 ciclos, 72ºC 10 min extensión final. Se digirió el producto de PCR con EcoRV y se purificó a partir de un gel de agarosa. Se ligó el fragmento XK en el vector B609 (Bluescribe M13, Stratagene, con el promotor ADH1 modificado y el terminador ADH1) que se había tratado con la enzima Klenow para hacer los extremos romos. Se comprobó la orientación del fragmento con las enzimas BglII y EcoRI. Se digirió un clon con la orientación correcta con BamHI y se purificó el fragmento a partir de un gel de agarosa. Se clonó el fragmento de BamHI en el sitio BamHI del vector de expresión de levadura YEplac195 (Gietz y Sugino, [1988]).

Ejemplo 3 Contransformación de la cepa integrante H1469 con los genes que codifican la xiluloquinasa (XK) y glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD (NAD-GDH) en dos vectores de expresión separados de múltiples copias

Se cotransformaron dos vectores de expresión de levadura, el YEplac195 anteriormente descrito que porta el gen que codifica la xiluloquinasa, y el YEplac181 que porta el gen GDH2 que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD (Boles et al. [1993]), en la cepa integrante H1469. Se seleccionó el vector YEplac195 omitiendo uracilo y YEplac181 omitiendo leucina de los medios de cultivo. La recuperación del plásmido a partir de los transformantes de levadura verificó la integridad de los dos plásmidos de expresión. La cepa que porta ambos genes que codifican XK y NAD-GDH se denominó H1803 (VTT C-98302). Una cepa control que porta el gen que codifica XK y el plásmido control YEplac181 sin GDH2 se denominó H1805 (VTT C-98303).

Ejemplo 4 Transformación de la cepa integrante H1469 con el gen que codifica glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD en un vector de expresión de múltiples copias

Se transformó el plásmido YEplac181 anteriormente descrito que porta el gen GDH2 que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD en la cepa integrante H1469. La selección de los transformantes fue como se cita anteriormente. La recuperación del plásmido a partir de los transformantes de levadura verificó la integridad del plásmido de expresión. La cepa portadora del gen que codifica NAD-GDH se denominó H1795 (VTT C-98300). Una cepa control que porta el plásmido control YEplac181 se denominó H1797 (VT C-98301).

Ejemplo 5 Transformación de la cepa de levadura H1346 (CEN.PK2 (VW-1B)) con el gen que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD en un vector de expresión de múltiples copias

Se transformó el plásmido de expresión anteriormente descrito YEplac181 que porta el gen GDH2 que codifica la glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD en la cepa CEN.PK2 (VW-1B) (=H1346). La selección de los transformantes fue como se cita anteriormente. La recuperación del plásmido a partir de los transformantes de levadura verificó la integridad del plásmido de expresión. La cepa que porta el gen que codifica NAD-GDH se denominó H1791 (VTT C-98298). Una cepa control que porta el plásmido control YEplac181 se denominó H1793 (VTT C-98299).

Ejemplo 6 Clonación del marco abierto de lectura YKL029C que codifica el homólogo de enzima málica de Saccharomyces cerevisiae

La enzima málica se ha caracterizado a partir de S. cerevisiae (Fuck et al. [1973]). El análisis del genoma de levadura reveló un marco abierto de lectura (ORF YKL029C) con homología con el gen que codifica enzima málica de Schizosaccharomyces pombe (Viljoen et al. [1994]). Se amplificó el ORF YKL029C de S. cerevisiae a partir del ADN cromosómico de levadura mediante PCR utilizando el cebador de codificación 5' CAT GCT AAG CTT CTA GAA TGC TTA GAA CCA GAC TA 3' y el cebador inverso 5' GAT GCT AAG CTT CTA GAT GGT TAT GCT TCG TCT AC 3'. Ambos cebadores contienen sitios de restricción HindIII y BglII en el extremo 5'. Las condiciones de la reacción PCR fueron: 94ºC 3 min inicio caliente, 94ºC 1 min, 40ºC 1 min, 72ºC 2 min, 30 ciclos, 72ºC 10 min extensión final. El fragmento de ADN obtenido era del tamaño esperado. Se digirió el fragmento de PCR con la enzima de restricción apropiada (BglII), permitiendo su clonación entre el promotor y el terminador PGK1 en el vector de expresión de levadura pMA91.

Ejemplo 7 Clonación del gen que codifica la enzima málica a partir del hongo filamentoso Aspergillus nidulans

Hasta ahora, todos los genes que codifican las enzimas málicas clonadas a partir de diferentes organismos contienen una secuencia de ADN que codifica la "firma de enzima málica". Es una secuencia de aminoácidos única altamente conservada (FNDDIQGTGAVVMASLI) de esta proteína particular (Prosite: PDOC00294). La firma permite planear cebadores degenerados específicos para clonación de cualquier gen particular que codifique una enzima málica.

Se diseñaron cebadores degenerados utilizando la firma de enzima málica (región D) para el cebador del extremo 3' y una segunda región homóloga de la proteína, la región C, para el cebador del extremo 5' (Viljoen et al. [1994]). El cebador de codificación era 5' GA(T/C) GTI GGI ACI AA(T/C) AA 3' y el cebador inverso era 5' GTI CC(T/C) TG(A/G/T) AT(A/G) TC(A/G) TC(A/G) TT(A/G) AA 3'. Las condiciones de la reacción PCR fueron: 94ºC 3 min inicio caliente, 94ºC 1 min, 37ºC 1 min, 72ºC 2 min, 7 ciclos, 94ºC 1 min, 40ºC 1 min, 72ºC 2 min, 25 ciclos, 72ºC 10 min extensión final. Se utilizó el ADN cromosómico de Aspergillus nidulans como molde en la reacción de PCR. Se obtuvo un fragmento del tamaño esperado (0,24 kb) y la Figura 2 muestra el alineamiento del producto de PCR con algunas enzimas málicas conocidas. Se da una secuencia parcial de aminoácidos de enzima málica de A. nidulans en la secuencia nº 1. La secuencia parcial obtenida permite el diseño de cebadores adicionales, y puede utilizarse por sí misma para sondear mediante hibridación Southern para clonar la enzima málica completa a partir de cualquier banco de ADN (por ejemplo, ADNc, cromosómico, lambda). Puede clonarse también el gen que codifica la enzima málica de Trichoderma reesei, otro hongo filamentoso. Se incluye una secuencia parcial de aminoácidos del mismo en la Figura 2, y se da también en la secuencia nº 2).

Ejemplo 8 Producción de etanol a partir de xilosa

Parte 1

Cultivos en matraz agitado

Se cultivaron las cepas H1803 y H1805 (véase el ejemplo 3) en el medio de crecimiento que se modificó con SC-URA-LEU (medio completo sintético, uracilo y leucina omitidos, Sherman et al., [1983]) y base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (Difco) y las fuentes de carbono D-glucosa (20 g/l) o D-xilosa (20 g/l). Se precultivaron las células en matraces agitados en un medio que contenía glucosa como fuente de carbono. Se recogieron las células mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen de 100 ml de medio que contenía xilosa como fuente de carbono. Se mantuvieron las células a 30ºC en matraces Erlenmeyer de 100 ml agitados suavemente con una barra magnética. Se consiguió la anaerobiosis utilizando una esclusa de aire.

Después de dos días de incubación con xilosa, la cepa con niveles elevados de NAD-GDH había producido 2,35 g de etanol/g de peso seco, y la cepa control produjo 1,47 g de etanol/g de peso seco. Se midió enzimáticamente la cantidad de etanol con la ayuda de un analizador automático (Cobas-Mira).

Se midió la actividad glutamato deshidrogenasa en un extracto de célula de levadura bruto, que se obtuvo agitando con vórtex 500 mg de células recientes en 500 \mul de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, y 1 g de perlas de vidrio (diámetro 0,4 mm) durante 15 minutos. Se centrifugó después la mezcla en una centrífuga de sobremesa y se ensayó el sobrenadante. Se mezclaron 200 \mul de un tampón que contenía NAD(P)H 200 \muM y fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4, con 10 \mul del extracto de levadura bruto diluido 20 veces. Para iniciar la reacción, se añadieron \alpha-cetoglutarato (concentración final 10 mM) y cloruro de amonio (concentración final 20 mM). Se midió el índice de absorbancia reducida a 340 nm y se calculó la actividad a partir de éste. Está relacionada con el contenido de proteína del extracto de levadura medido mediante un ensayo de proteína BIORAD. Se midió la actividad NADP-GDH utilizando NADPH como sustrato, y se midió la actividad NAD-GDH con NADH como sustrato. Se estimó la actividad NAD-GDH como 4-5 ncat/mg en la cepa de sobreexpresión, y 0,04 ncat/mg en el control sin GDH2 sobreexpresado. La actividad NADP-GDH fue de aproximadamente 2 ncat/mg. Todos los ensayos se realizaron en un analizador automatizado
Cobas-Mira.

Parte 2

Cultivos en fermentador

Se realizó la fermentación anaeróbica de xilosa a etanol en un fermentador Chemap CMF de 1,8 litros (Suiza) mediante cepas modificadas por ingeniería genética de Saccharomyces cerevisiae designadas como H1803 y H1805. Ambas cepas derivan de S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) (Boles et al. [1996]) y expresan xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) mediante integración cromosómica de los correspondientes genes de Pichia stipitis. Además, ambas cepas sobreexpresan la xiluloquinasa nativa (XK) a partir de un plásmido de múltiples copias (YEplac195 + XK). La cepa H1803 contiene un plásmido adicional que expresa la glutamato deshidrogenasa-NAD (NAD-GDH) a partir de S. cerevisiae (YEplac181 + GDH2), mientras que la cepa H1805 contiene sólo el vector de clonación (YEplac181) y sirve como cepa control. Omitir el uracilo (URA) de los medios de crecimiento puede minimizar la segregación de plásmido por el vector YEplac195, y la leucina (LEU) la de YEplac181.

Los cultivos de siembra de las cepas H1803 y H1805 se mantuvieron rutinariamente sobre placas que se renovaron cada 2-3 semanas. Se preparó el pre-inóculo transfiriendo una colonia individual a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio completo sintético modificado sin uracilo ni leucina (SC-URA-LEU) + glucosa 20 g/l (Sherman et al. [1983]). Para cada cepa, se prepararon tres matraces idénticos. Se hicieron crecer las células durante una noche en un agitador rotativo a 150 rpm y 30ºC, y se transfirió después el contenido de cada matraz a un matraz con deflectores de 3 l que contenía 500 ml de SC-URA-LEU más glucosa 50 g/l, y se hicieron crecer aeróbicamente a 150 rpm y 30ºC hasta que se agotó la glucosa (DO_{600}: 20-25).

Se recogieron células del cultivo anterior (seis matraces) mediante una centrifugación de 10 minutos a 4.500 rpm y 4ºC, se lavaron con un tampón de PO_{4}^{2-} 0,1 M (pH= 5,5) y se resuspendieron en el mismo tampón a un volumen final respectivo de 30 ml, y posteriormente se transfirieron al fermentador. El medio de fermentación contenía SC-URA-LEU + xilosa al 10%. Se mantuvo la temperatura del fermentador a 30ºC, se controló el pH a 5,5 mediante la adición de NaOH 2 M, y la agitación fue constante a 300 rpm. Se llevó a cabo el cultivo en condiciones anaeróbicas vaporizando el espacio de cabeza del fermentador con nitrógeno a un caudal constante de 0,2 vvm. Se conectó el gas de escape mediante una válvula de múltiples puertos a un espectrómetro de masas cuadripolar Balzers (Suecia) para análisis en línea. Se extrajeron muestras líquidas del fermentador a intervalos de tiempo para medir crecimiento, consumo de sustrato y formación de productos extracelulares. Para muestras seleccionadas, se midieron también las actividades de las glutamato deshidrogenasas-NADP y NAD mediante técnicas enzimáticas estándar. Se monitorizó el crecimiento midiendo tanto la absorbancia a 600 nm como el peso de célula seca (DCW) mediante filtración y posterior secado hasta peso constante. Se separaron xilosa, etanol, xilitol, glicerol y acetato presentes en el caldo del fermentador en una columna HPX-87H (55ºC) con H_{2}SO_{4} 5 mM como eluyente (0,6 ml/min), y se cuantificaron mediante detección del índice de refracción (IR). Se verificaron independientemente las cantidades de etanol, glicerol, xilitol y acetato mediante ensayos enzimáticos apropiados con la ayuda de un analizador automatizado (Cobas-Mira).

Se resumen el crecimiento y consumo de xilosa de las cepas H1803 y H1805 durante las primeras 30 horas de cultivo en la Figura 3. Ambas cepas pueden consumir xilosa eficazmente a índices comparables, sin embargo, la cepa que sobreexpresa NAD-GDH (H1803) acumula aproximadamente un 6% menos de biomasa (7,13 frente a 6,72 g/l). La diferencia más notable entre las dos cepas es la producción de etanol. Como se ilustra en la Figura 4, al final del periodo de tiempo de 30 horas, la cepa GDH2 acumula aproximadamente 1,02 g de etanol por g de DCW, comparada con 0,73 para la cepa control. Esto representa una potenciación de la producción específica de etanol de aproximadamente un 40% para la cepa GDH2 (0,58 frente a 0,83 mmol/g-célula.h). La productividad volumétrica es también mayor para la cepa GDH2 en aproximadamente un 30% (3,94 frente a 5,20 mmol/l.h). Los correspondientes rendimientos de etanol desde xilosa son 0,21 y 0,29 (mol/mol) para las cepas control y GDH2, respectivamente. Inesperadamente, la producción de xilitol era también elevada para la cepa GDH2 en aproximadamente un 25%, como se muestra de nuevo en la Figura 4.

Se representa aún otra extraordinaria divergencia entre las dos cepas recombinantes en la Figura 5. Estos datos de dióxido de carbono provienen de las medidas de espectrómetro de masas del gas efluente. Como se muestra en la Figura 5, la sobreexpresión de GDH2 atenúa significativamente el desprendimiento de dióxido de carbono. Los valores integrados para la producción de CO_{2} de 0 a 30 horas son 100,4 y 80,7 mol/l para la cepa control y GDH2, respectivamente, concretamente, la cepa GDH2 gasta aproximadamente un 20% menos de fuente de carbono en la producción de dióxido de carbono.

Se realizaron ensayos enzimáticos para NADP-GDH y NAD-GDH en muestras elegidas, y se muestran los resultados de dos de dichos conjuntos en la Figura 6. La mezcla de ensayo contenía tampón fosfato de sodio 100 mM a pH= 7,0, 200 \muM de cualquiera de NADPH (ensayo NADP-GDH) o NADH (ensayo NAD-GDH), y lisado celular a una concentración final de aproximadamente 0,5 mg/ml. Se inició la reacción mediante la adición de \alpha-cetoglutarato 20 mM más NH_{4}Cl 40 mM, y se monitorizó espectrofotométricamente el consumo de NAD(P)H a 340 nm. Ambas cepas tienen notables actividades NADP-GDH, como se esperaba, aunque H1803 parece tener una sorprendentemente mayor actividad específica por esta enzima (aproximadamente un 40% o así). Por otro lado, la actividad NAD-GDH es esencialmente cercana al límite de detección del ensayo para la cepa control, mientras que H1803 tiene una actividad específica bastante alta para esta enzima de NAD.

Estos resultados muestran que la cepa recombinante H1803 que sobreexpresa la glutamato deshidrogenasa-NAD tiene capacidades significativamente potenciadas para la producción de etanol (y xilitol), tanto en términos de mayores productividades específicas como de mayores rendimientos de producto desde sustrato de carbono. La cepa recombinante produce también significativamente menos masa celular (indeseada) y muy sustancialmente menos dióxido de carbono (indeseado), no sólo aumentando así los rendimientos de los productos deseados, sino reduciendo también los desechos y cargas contaminantes.

Ejemplo 9 Producción de etanol a partir de glucosa

Se realizó la fermentación de glucosa a etanol en un fermentador Chemap CMF de 1,8 l (Suiza) mediante cepas modificadas por ingeniería genética de Saccharomyces cerevisiae designadas como H1793 y H1791, ambas derivadas de S. cerevisiae CEN.PK2 (VW-1B) (Boles et al. [1996]). La cepa H1791 se transforma con un plásmido que expresa la glutamato deshidrogenasa-NAD (NAD-GDH) de S. cerevisiae (YEplac181 + GDH2), mientras que la cepa H1793 contiene sólo el vector de clonación (YEplac181) y sirve como cepa control. La segregación de plásmido puede minimizarse omitiendo la leucina (LEU) de los medios de crecimiento.

Se preparó el inóculo transfiriendo una colonia individual a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio completo sintético modificado sin leucina (SC-LEU) + glucosa 20 g/l. Se hicieron crecer las células durante una noche en un agitador rotativo a 150 rpm y 30ºC (DO_{600}: 10-15). Se recogieron las células del cultivo anterior mediante una centrifugación de 10 minutos a 4.500 rpm y 4ºC, se lavaron con tampón PO_{4}^{2-} 0,1 M (pH= 5,5) y se resuspendieron en el mismo tampón a un volumen final respectivo de 25 ml, y posteriormente se transfirieron al fermentador. El medio de fermentación contenía (por litro): base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos y sin amoniaco) 3,4 g, uracilo 0,044 g, triptófano 0,164 g, histidina 0,116 g, KNO_{3} 5,055 g, glucosa 40 g. Se mantuvo la temperatura del fermentador a 30ºC, se controló el pH a 5,5 mediante la adición de NaOH 2 M y la agitación fue constante a 300 rpm. Se llevó a cabo el cultivo en condiciones anaeróbicas vaporizando el espacio de cabeza del fermentador con nitrógeno a un caudal constante de 0,2 vvm. Se conectó el gas de escape mediante una válvula de múltiples puertos a un espectrómetro de masas cuadripolar Balzers (Suecia) para análisis en línea. Se extrajeron muestras líquidas del fermentador a intervalos de tiempo para medir crecimiento, consumo de sustrato y formación de productos extracelulares. Se midieron biomasa, glucosa, etanol, glicerol y acetato como en el ejemplo anterior.

La Tabla 1 resume los datos de fermentación primarios para estas dos fermentaciones. La cepa que sobreexpresa NAD-GDH (H1791) acumula de promedio aproximadamente un 12% menos de biomasa (0,52 frente a 0,46 g/l) durante el periodo de tiempo de 21 horas. Los índices de consumo de glucosa específico son comparables para las dos cepas (dentro de un 5%). Sin embargo, la cepa GDH2 tiene un índice de producción volumétrica mayor (11%) y una producción específica de etanol mayor (25%). Se representa en la Figura 7 aún otra divergencia extraordinaria entre las dos cepas recombinantes. Estos datos de dióxido de carbono provienen de las medidas de espectrómetro de masas del gas efluente. Como se muestra en la Figura 7, la sobreexpresión de NAD-GDH atenúa significativamente el desprendimiento de dióxido de carbono. Los valores integrados para la producción de CO_{2} de 0 a 21 horas son 93,7 y 70,6 mmol/l para las cepas control y GDH2, respectivamente, concretamente la cepa GDH2 gasta aproximadamente un 25% menos de fuente de carbono en dióxido de carbono. El índice específico de producción de CO_{2} para la cepa GDH2 está también atenuado en aproximadamente un 15%. Además, se estima que el rendimiento de etanol desde glucosa (mol/mol) es de aproximadamente un 19% mayor para la cepa GDH2 frente a la cepa control.

Estos resultados muestran que la cepa recombinante H1791 que sobreexpresa la glutamato deshidrogenasa-NAD (NAD-GDH) tiene capacidades significativamente potenciadas para la producción de etanol a partir de glucosa, tanto en términos de mayores especificidades específicas como de mayores rendimientos de producto desde el sustrato de carbono. La cepa recombinante produce también significativamente menos masa celular (indeseada) y menos dióxido de carbono (indeseado), no sólo aumentando así los rendimientos de productos deseados, sino reduciendo también los desechos y cargas contaminantes.

TABLA 1 Fermentaciones de glucosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae) que sobreexpresa NAD-GDH (H1791) y cepa control (H1793): comparación de índices de crecimiento, consumo de glucosa, producción de etanol y desprendimiento de dióxido de carbono. Las dos últimas filas muestran los flujos medios calculados expresados en términos volumétricos (Jv, mmol/l.h) o específicos (Js, mmol/g-célula.h). Las concentraciones de glucosa y etanol representan los valores medios de cuatro medidas: dos con HPLC y dos con ensayos enzimáticos

1

Ejemplo 10 Una estrategia de clonación alternativa del marco abierto de lectura YKL029C que codifica el homólogo de enzima málica de Saccharomyces cerevisiae

Si se utiliza la enzima de restricción BglII para la clonación del homólogo de enzima málica entre el promotor y el terminador PGK1 en el vector de expresión de levadura pMA91, ha de hacerse una digestión enzimática parcial, ya que hay un sitio BglII interno en +227 pb de la región de codificación de la enzima málica. Una estrategia de clonación alternativa fue la siguiente:

Se digirió el fragmento de PCR con la enzima de restricción HindIII y se trató con enzima Klenow para hacer los extremos romos. Se digirió el vector de expresión pMA91 (Mellor et al. [1983]) con la enzima de restricción HindIII y se aisló el fragmento de 1,8 kb que contenía el promotor y terminador PGK1 a partir de un gel de agarosa. Se ligó el módulo promotor-terminador al vector YEplac195 (Gietz y Sugino [1988]), que se había linealizado en su sitio de clonación múltiple con HindIII. La orientación del fragmento promotor-terminador en el vector de expresión es HindIII-promotor PGK1-terminador PGK1-EcoRI. Se digirió este vector de expresión con BglII y se trató con enzima Klenow, obteniéndose extremos romos para la clonación del homólogo de enzima málica entre el promotor y el terminador PGK1.

Se secuenció completamente el ORF YKL029C clonado por PCR. Se observaron dos mutaciones puntuales, creadas durante la amplificación por PCR, que alteran dos aminoácidos en la enzima: leucina 341 a valina y glutamina 620 a leucina. Estas mutaciones puntuales no estaban en regiones de aminoácidos conservadas de enzimas málicas (Viljoen et al. [1994]) ni alteraban significativamente los valores de Km aparente de la enzima amplificada por PCR, comparada con la enzima nativa (actividad de enzima nativa medida a partir de la cepa H1346; véanse la Tabla 2 y Fuck et al. [1973]), y por tanto se consideraron neutras. La invención puede practicarse con esta variante génica, o con un gen nativo que codifica enzima málica o con cualquier otra variante neutra.

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TABLA 2 Los valores de Km aparente de malato, NAD^{+} y NADP^{+} de la enzima málica nativa y amplificada por PCR a partir de S. cerevisiae

2

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Se transformaron el vector control YEplac195 y el mismo vector con homólogo de enzima málica de S. cerevisiae bajo el promotor y el terminador PGK1 en la cepa de levadura CEN.PK2 (VW-1B, H1346), obteniéndose las cepas H2189 (VTT C-99316) y H2193 (VTT C-99317), respectivamente.

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Ejemplo 11 Integración del gen xiluloquinasa (YGR194C) en la cepa integrante H1469

Se construyó un módulo para la integración del gen xiluloquinasa con regiones flanqueantes de HIS3 y el gen de resistencia a kanamicina KMX2 para selección.

Se digirió el vector lanzadera de levadura pRS423 (Christianson et al. [1992]) con DrdI, obteniéndose un fragmento de 1,5 kb que contenía el gen HIS3 que codifica imidazolglicerol-P hidratasa (Fink [1964]). Se aisló el fragmento a partir de un gel de agarosa, se hicieron romos los extremos con polimerasa T4 y se ligó al sitio EcoRV del vector de clonación bacteriana Bluescript SK (Stratagene).

Se digirió el plásmido pFA6-kanMX2 (Wach et al. [1994]) con PvuII y SpeI, aislándose el módulo de resistencia a kanamicina de 1,4 kb. Se aisló el fragmento KMX2 a partir de un gel de agarosa y se hicieron los extremos romos con enzima Klenow. Se digirió el Bluescript SK que porta el fragmento HIS3 DrdI con NheI y BclI dentro del gen HIS3 (retirando 50 pb de esta región de codificación), se hicieron romos los extremos con enzima Klenow y se trataron con fosfatasa alcalina de camarón, antes de ligamiento con el fragmento de KMX2 aislado.

Se aisló el gen xiluloquinasa bajo el promotor ADH1 modificado y el terminador ADH1 en YEplac195 (véase el ejemplo 2) después de una digestión con BamHI a partir de un gel de agarosa. Se digirió con BglII el Bluescript SK que porta el fragmento HIS3 DrdI con el módulo KMX2 dentro del gen HIS3 (dos sitios BglII adyacentes retiran 60 pb de su región de codificación) y se trató con fosfatasa alcalina de camarón, antes de ligamiento con el fragmento de xiluloquinasa aislado con promotor y terminador ADH1.

El módulo de integración final así construido contenía 900 pb de secuencia HIS3, el gen xiluloquinasa (terminador ADH1, gen XK, promotor ADH1 modificado), 50 pb de región de codificación de HIS3, el módulo KMX2 (promotor, gen, terminador) y 550 pb de secuencia HIS3. Se separó esta construcción de Bluescript SK mediante digestión con BstBI y BssHI, dejando aproximadamente 400 pb de secuencia HIS3 en cualquier lado para integración
dirigida.

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Se utilizó 1 \mug del módulo de integración aislado a partir de un gel de agarosa para transformar la cepa H1469, obteniéndose la cepa H2217 (VTT C-99318). El examen de transformantes integrantes fue en placas YPD con G418 200 \mug/ml. Se verificó la correcta integración del módulo XK en el locus HIS3 mediante hibridación Southern, mediante PCR, y mediante crecimiento potenciado en xilulosa comparado con el tipo silvestre.

Ejemplo 12 Transformación de las cepas integrantes H1469 y H2217 con el gen que codifica la enzima málica en un vector de expresión de múltiples copias

Se transformaron el plásmido YEplac195 descrito anteriormente que porta el gen MAE1 que codifica la enzima málica bajo el promotor y el terminador PGK1 (véase el ejemplo 6 ó 10) y el plásmido control YEplac195 en las cepas integrantes H1469 y H2217. Se seleccionaron los plásmidos omitiendo uracilo de los medios de crecimiento. La recuperación de plásmido a partir de los transformantes de levadura verificó la integridad de los plásmidos de control y expresión. Las cepas obtenidas se denominaron del modo siguiente: H1469 con el plásmido control como H2191 (VTT C-99319), H1469 con el plásmido de enzima málica como H2195 (VTT C-99320), H2217 con el plásmido control como H2221 (VTT C-99321) y H2217 con el plásmido de enzima málica como H2222 (VTT C-99322).

Ejemplo 13 Efecto de la enzima málica: producción de etanol a partir de glucosa

Se realizó la fermentación de glucosa a etanol en un fermentador Chemap CMF de 1,8 l (Suiza) mediante cepas modificadas por ingeniería genética de Saccharomyces cerevisiae derivadas de S. cerevisiae CEN.PK2/VW-1b (Boles et al.,[1996]) designadas a continuación como H1346. Más específicamente, las dos cepas utilizadas en este ejemplo son como sigue: (i) H2193: H1346 transformada con un plásmido que expresa la enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL029c) o, (ii) H2189: H1346 transformada con el vector de clonación (YEplac195) y sirve como cepa de control. Omitir el uracilo (URA) de los medios de crecimiento minimiza la segregación de plásmido.

Se preparó el inóculo transfiriendo una colonia individual a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio completo sintético sin uracilo (SC-URA) + glucosa 20 g/l. Se hicieron crecer las células durante una noche en un agitador rotativo a 150 rpm y 30ºC (DO_{600}: 10-15). Se recogieron las células del cultivo anterior mediante una centrifugación de 10 minutos a 4.500 rpm y 4ºC, se lavaron con tampón fosfato 0,1 M (pH= 5,5) y se resuspendieron en el mismo tampón a un volumen final respectivo de 25 ml, y posteriormente se transfirieron al fermentador. El medio de fermentación contenía (por litro): base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos), suplementos de aminoácidos, 30 g de glucosa. Se mantuvo la temperatura del fermentador a 30ºC, se controló el pH a 5,5 mediante la adición de NaOH 2 M y la agitación fue constante a 300 rpm. Se llevó a cabo el cultivo en condiciones anaeróbicas purgando el caldo con nitrógeno a un caudal constante de 0,1 vvm. Se extrajeron muestras líquidas del fermentador a intervalos de tiempo para medir crecimiento, consumo de sustrato y formación de productos extracelulares. Se midieron biomasa, glucosa, etanol, glicerol y acetato como en el ejemplo anterior.

La Tabla 3 resume los resultados de fermentación para estas dos fermentaciones. La cepa que sobreexpresa MAE1 (H2193) utiliza aproximadamente un 20% menos carbono para la síntesis de biomasa (3,27 frente a 2,60 mol C/g-célula.h), dando como resultado densidades de biomasa finales que son significativamente menores comparadas con el control (1,33 frente a 2,20 g/l). El índice de consumo específico de glucosa es aproximadamente un 20% mayor para la cepa MAE1. De forma más importante, la MAE1 tiene un índice de producción específica de etanol mayor de aproximadamente un 25% (18,85 frente a 23,64 mmol C/g- célula.h). Los índices de producción de etanol específicos mayores son ventajosas en procesos que están limitados físicamente por la cantidad de biocatalizador que puede utilizarse, por ejemplo, sistemas de fermentación de célula inmovilizada. Además, el rendimiento de etanol desde glucosa para la cepa que sobreexpresa MAE1 es aproximadamente un 4% mayor comparado con el control (0,478 frente a 0,499 mol C/mol C).

Estos resultados dan a conocer que la cepa recombinante H2193 de S. cerevisiae que sobreexpresa la enzima málica endógena (MAE1) tiene capacidades significativamente potenciadas de producción de etanol a partir de glucosa como sustrato de carbono. La cepa recombinante produce también significativamente menos masa celular (indeseada), no sólo aumentando así los rendimientos de productos deseados, sino reduciendo también las cargas de desecho.

TABLA 3 Fermentaciones de glucosa con cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expresa MAE1 (H2193) y cepa control (H2189): flujos medios expresados en términos volumétrico (Jv, mmol C/l.h) o específico (Js, mmol C/g célula.h) (intervalo de tiempo: 3,3 a 29 horas). Las concentraciones de glucosa y etanol representan valores medios de cuatro medidas: dos con HPLC y dos con ensayos enzimáticos

3

Se repitió el experimento descrito anteriormente con las siguientes modificaciones:

(1) se aumentó el tamaño de inóculo del biorreactor de aprox. 0,1 g/l a aprox. 2 g/l, y

(2) además de utilizar un inóculo grande (aprox. 2 g/l), posteriormente al agotamiento de glucosa (24 horas), se añadió una solución concentrada de glucosa al fermentador, proporcionando una concentración final de glucosa de aproximadamente 45 g/l, y se dejó proceder la fermentación durante 24 horas adicionales (lote repetido). Los resultados primarios fueron como sigue para los dos casos: (1) la sobreexpresión de la enzima málica da como resultado índices específicos de producción de etanol (+9%) y de consumo de glucosa (+20%) mayores, con menos glucosa derivando a biomasa (-16%); (2) la sobreexpresión de la enzima málica potenciaba los índices específicos de producción de etanol en un 6 y un 8% para la primera y segunda fases, respectivamente, mientras que los correspondientes índices de captación de glucosa son también mayores en un 16 y un 17% en las dos fases. La concentración de biomasa inicial de 2 g/l para ambas cepas aumentó a 5,73 y 6,36 g/l para la cepa sobreproductora de enzima málica y control, respectivamente, durante la primera fase (concretamente, un 10% menos para MAE1). Los valores correspondientes para la segunda fase fueron 7,66 frente a 8,15 g/l (concretamente, un 6% menos para MAE1).

Resumiendo, estos tres experimentos dan a conocer que la cepa recombinante de S. cerevisiae H2193 que sobreexpresa la enzima málica nativa (MAE1) tiene capacidades significativamente potenciadas de producción de etanol a partir de glucosa como sustrato de carbono (índices específicos aumentados en hasta un 25%, rendimientos aumentados en un 4%). La cepa recombinante produce también significativamente menos masa celular (indeseada), no sólo aumentando así los rendimientos de los productos deseados, sino reduciendo también las cargas de desechos.

Ejemplo 14 Efecto de la enzima málica: producción de etanol a partir de xilosa

Se realizó la fermentación de xilosa a etanol en un fermentador Chemap CMF de 1,8 l (Suiza) mediante cepas modificadas por ingeniería genética de Saccharomyces cerevisiae derivadas de S. cerevisiae CEN.PK2/VW-1b (Boles et al. [1996]) designadas a continuación como H1346. Más específicamente, las cuatro cepas utilizadas en este ejemplo son las siguientes: (i) H2195: H1346 que porta integraciones cromosómicas de genes que codifican xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) (cepa H1469) transformada con un plásmido que expresa la enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL029c). (ii) H2191: H1469 transformada con el vector de clonación (YEplac195) y que sirve como control para la cepa H2195. (iii) H2222: H1346 que porta integraciones cromosómicas de genes que codifican xilosa reductasa (XR), xilitol deshidrogenasa (XDH) y xiluloquinasa (XK) (cepa H2217) transformada con un plásmido que expresa la enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL209c). (iv) H2221: H2217 transformada con el vector de clonación (YEplac195) y que sirve como control para la cepa H2222. Omitir el uracilo (URA) de los medios de crecimiento minimiza la segregación de plásmido.

Se preparó el inóculo transfiriendo una colonia individual a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio completo sintético sin uracilo (SC-URA) + fosfato 0,1 M + glucosa 20 g/l. Se hicieron crecer las células durante una noche en un agitador rotativo a 150 rpm, 30ºC, y después se transfirió todo el caldo a un matraz de 2 l que contenía 500 ml de SC-URA + fosfato 0,1 M + glucosa 50 g/l. Se hizo crecer de nuevo el cultivo durante una noche como anteriormente y se recogieron después las células mediante una centrifugación de 10 minutos a 4.500 rpm y 4ºC. Se lavaron después las células con tampón fosfato 0,1 M (pH= 5,5) y se resuspendieron en el mismo tampón a un volumen final respectivo de 100 ml, y posteriormente se transfirieron al fermentador.

El medio de fermentación contenía (por litro): base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos), suplementos de aminoácidos, 50 g de xilosa. Se mantuvo la temperatura del fermentador a 30ºC, se controló el pH a 5,5 mediante la adición de NaOH 2 y la agitación fue constante a 300 rpm. Se llevó a cabo el cultivo en condiciones anaeróbicas purgando el caldo con nitrógeno a un caudal constante de 0,1 vvm. Se extrajeron muestras líquidas del fermentador a intervalos de tiempo para medir crecimiento, consumo de sustrato y formación de productos extracelulares. Se midieron biomasa, glucosa, etanol, glicerol y acetato como en el ejemplo anterior.

a) Fermentaciones anaeróbicas de xilosa con las cepas H2195 y H2191

La Figura 8 muestra los perfiles temporales para biomasa y turbidez para la cepa que sobreexpresa MAE1 (H2195) y la cepa control (H2191). Obsérvese que las Saccharomyces cerevisiae que expresa genes que codifican XR y XDH pueden utilizar en general xilosa, sin embargo, son incapaces de crecer anaeróbicamente en xilosa. Como se ilustra por la Figura 8, la sobreexpresión de la enzima málica nativa tiene un efecto realmente positivo sobre la viabilidad celular en estas condiciones. La cepa H2195 exhibe un crecimiento inicial en xilosa incluso en condiciones anaeróbicas, que es seguido por una reducción de la biomasa hasta un nivel después de 32 horas que corresponde al del inóculo. Por el contrario, la biomasa del control se reduce monótonamente durante el mismo periodo de tiempo desde un valor inicial de 2,11 hasta 1,47 g/l, concretamente una caída de biomasa de aprox. un 30%.

La Figura 9 resume los índices metabólicos específicos globales (mmol C/g célula.h) para estas dos fermentaciones en lotes. Evidentemente, además de evitar la degradación celular, la sobreexpresión de la enzima málica tiene también un efecto positivo sobre la utilización de xilosa y sobre la producción tanto de etanol como de xilitol. La utilización de xilosa está potenciada en más de un 55% y las productividades de etanol y xilitol aumentan en aproximadamente un 20% y 25%, respectivamente.

Estos resultados dan a conocer que la cepa recombinante de S. cerevisiae H2195 que sobreexpresa la enzima málica nativa (MAE1) tiene capacidades significativamente potenciadas de utilización de xilosa, así como de producción de etanol y xilitol a partir de xilosa. La cepa recombinante puede mantener también su viabilidad durante periodos de tiempo prolongados.

b) Fermentaciones anaeróbicas de xilosa con las cepas H2222 y H2221

Se llevó a cabo este experimento como se describe en la parte (a), excepto porque las cepas H2195 y H2191 se sustituyeron por las cepas H2222 y H2221, que además de los genes que codifican XR y XDH portan también una integración cromosómica de un gen que codifica la XK nativa. La cepa H2222 sobreexpresa la enzima málica nativa.

Es evidente a partir de la Figura 10 que la sobreexpresión de la enzima málica tiene un efecto potenciador significativo sobre la producción de etanol a partir de xilosa, y también que éste puede mantenerse durante varios días seguidos.

Como se indica en la Figura 11, el potenciamiento del índice de producción específico de etanol es cercano a un 30%, comparado con el control, y la utilización de xilosa específica es de hasta aproximadamente un 5%. Además, como se indica en la Figura 12, la cepa control acumula una cantidad significativamente mayor de biomasa durante este periodo de 144 h (2,03 frente a 1,47 g/l, concretamente, aproximadamente +40%). Este comportamiento parece ser diferente en comparación con las cepas H2195 y H2191 descritas en la parte (a) anterior. Una causa plausible para esta diferencia puede encontrarse en que XK puede desempeñar un papel significativo en la utilización de xilosa (obsérvese que H2222 y H2221 portan integraciones cromosómicas de XK nativa). Sin embargo, la reducción de biomasa observada en la parte (b) está bien de acuerdo con la observada en el ejemplo 13 que trata los efectos de MAE1 sobre la conversión de glucosa en etanol. Además, el rendimiento molar de etanol desde xilosa era aproximadamente un 25% mayor para la cepa que sobreexpresa la enzima málica: 0,114 frente a 0,091 mol de C de etanol por mol de C de xilosa.

En resumen, estos experimentos dan a conocer que las cepas recombinantes de S. cerevisiae H2195 y H2222 que sobreexpresan la enzima málica nativa (MAE1) en contextos genéticos sin y con XK, respectivamente, tienen capacidades significativamente potenciadas de utilización de xilosa y producción de etanol a partir de xilosa como sustrato de carbono (hasta un 30%). Además, la cepa H2222 produce menos acetato (indeseado) (-30%). En el contexto que carece de XK, sólo el microorganismo transformado según la invención (H2195) es capaz de sobrevivir en las condiciones del proceso. Por otro lado, en el contexto con XK, donde el microorganismo no transformado puede sobrevivir, el microorganismo transformado según la invención (H2222) produce significativamente menos masa celular (indeseada) (hasta un 40%), no sólo aumentando así los rendimientos de los productos deseados, sino reduciendo también las cargas de desechos.

Ejemplo 15 Construcción de un vector de integración para la expresión del gen que codifica la enzima málica de S. cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe

Se digirió el vector YEplac195 con la enzima málica que incluye el promotor y el terminador PGK del ejemplo 10 con HindIII, y se aisló el fragmento de 3,7 kpb a partir de un gel de agarosa. Se trató este fragmento con enzima Klenow para hacer romos los extremos. Se ligó después este fragmento al sitio SmaI del vector pJK210 (ATCC86957). Se digirió el vector con AvrII para integración mediante recombinación homóloga en el gen URA4.

Ejemplo 16 Construcción de un vector de múltiples copias para la expresión de los genes que codifican xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa de P. stipitis en Schizosaccharomyces pombe

Se aisló el fragmento SacI y NsiI del ejemplo 1, que contiene el gen de xilosa reductasa bajo el promotor y el terminador PGK, y el gen de xilitol deshidrogenasa bajo el promotor y el terminador ADH1, a partir de un gel de agarosa. Se ligó después al vector pSP1 (ATCC77497), que contiene el gen LEU2, que se linealizó digiriendo con PstI y SacI.

Ejemplo 17 Transformación de Schizosaccharomyces pombe

Se transformó el vector linealizado del ejemplo 15 mediante electroporación (http://www.bio.uva.nl/pombe/
handbook) a la cepa de S. pombe ATCC201400. Se hizo una cepa control de modo similar integrando el vector vacío pJK210. Se seleccionaron los transformantes para auxotrofia de URA. Se transformó el vector de múltiples copias del ejemplo 16 del mismo modo. Se seleccionaron transformantes para auxotrofia LEU adicional. La cepa resultante se denomina H2369 (VTT C-99323) y la cepa control sin actividad de enzima málica H2370 (VTT C-99324).

Ejemplo 18 Efecto de la enzima málica: producción de etanol a partir de xilosa con Schizosaccharomyces pombe

Se realizó la fermentación de xilosa a etanol en un fermentador Chemap CMF de 1,8 l (Suiza) mediante cepas modificadas por ingeniería genética de Schizosaccharomyces pombe derivadas de S. pombe cepa H2153 (ATCC 201400). Más específicamente, las dos cepas utilizadas en este ejemplo son como sigue: (i) H2369: H2153 que porta una integración cromosómica del gen de S. cerevisiae que codifica enzima málica y transformado con un plásmido de múltiples copias que expresa los genes que codifican xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis. (ii) H2370: H2153 que porta una integración cromosómica del vector de clonación pJK210 y transformado con un plásmido de múltiples copias que expresa genes que codifican xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) de Pichia stipitis. Omitir uracilo (URA) y leucina (LEU) de los medios de crecimiento minimiza la segregación de plásmido.

Se preparó el inóculo transfiriendo una colonia individual a un matraz Erlenmeryer de 250 ml de que contenía 20 ml de medio mínimo de Edimburgo (http://www.bio.uva.nl/pombe/handbook/section1/section1-8.html) con 225 mg/l de adenina, histidina y clorhidrato de lisina añadidos (EMM2 + ADE + HIS + LYS) + glucosa 20 g/l. Se hicieron crecer las células durante aproximadamente 50 horas en un agitador rotativo a 200 rpm, 30ºC, y después se transfirió todo el caldo a otro matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml del mismo medio. Se hicieron crecer las células durante aproximadamente 24 horas en un agitador rotativo a 200 rpm, 30ºC, y después se transfirió todo el caldo a un matraz de 2 l que contenía 700 ml de EMM2 + ADE + HIS + LYS + glucosa 50 g/l. Se hizo crecer el cultivo durante aproximadamente 40 horas como anteriormente, y después se recogieron las células mediante una centrifugación de 10 minutos a 4.000 rpm y 4ºC. Se lavaron después las células con tampón fosfato 0,1 M (pH= 5,5) y se resuspendieron en el mismo tampón a un volumen final respectivo de 100 ml, se ajustó la DO600 de ambas cepas al mismo valor con tampón y posteriormente se transfirió al fermentador. El medio de fermentación contenía EMM2 + ADE (225 mg/l) + HIS (450 mg/l) + LYS (450 mg/l) + xilosa 50 g/l.

Se mantuvo la temperatura del fermentador a 30ºC, se controló el pH a 5,5 mediante la adición de KOH 1 M, y la agitación fue constante a 300 rpm. Se llevó a cabo el cultivo en condiciones microaeróbicas purgando el caldo a un caudal constante de 0,5 SLPM con mezcla de nitrógeno y aire (7:1), siendo por tanto la fracción de oxígeno a la entrada de un 2,5%. Se extrajeron muestras líquidas del fermentador a intervalos de tiempo para medir crecimiento, consumo de sustrato y formación de productos extracelulares. Se midió la biomasa según la DO600 y midiendo el peso seco de las muestras. Se midieron xilosa, etanol, xilitol, glicerol y acetato con HPLC. Se midió también el etanol mediante ensayo enzimático con Cobas-Mira.

La Figura 13 muestra los perfiles temporales para la biomasa y la turbidez de la cepa H2369 y la cepa control H2370. Como se ilustra en la Figura 13, la expresión de la enzima málica tiene realmente un efecto positivo sobre la viabilidad celular en estas condiciones. La reducción de biomasa es de 2,6 a 1,9 g/l con H2369 y de 2,43 a 1,2 g/l con la cepa control H2370. Partiendo de niveles de biomasa muy similares, el control se reduce en más de un 50% y la cepa transformada según la invención en menos de un 30%. Por tanto, éste es otro ejemplo que da a conocer que en condiciones en que las cepas control tienen una pobre capacidad de sobrevivir y mantener su capacidad de biomasa y metabólica, las cepas transformadas según la invención tienen una capacidad mejorada de mantener su biomasa, y en consecuencia, su capacidad metabólica. Las medias logarítmicas de las biomasas durante la fermentación son 2,23 g/l para H2369 y 1,74 g/l para H2370.

La Figura 14 muestra los índices volumétricos de producción de etanol con la cepa H2369 y la cepa control H2370. Como se ilustra en la Figura 14, la producción volumétrica de etanol con H2369 es significativamente mayor comparada con la cepa control H2370 (+62%). El índice específico de producción de etanol es mayor en un 26% (0,386 frente a 0,305 mmol C/g célula.h). Evidentemente, además de evitar la degradación celular, la expresión de la enzima málica tiene también un efecto positivo sobre la producción de etanol. La utilización volumétrica de xilosa se potencia en un 47% (9,7 g/l frente a 6,6 g/l). También se potencia el índice específico (en aproximadamente un 15%, 1,45 frente a 1,26 mmol C/g célula.h, resultados no mostrados en la presente memoria), mostrando que la capacidad metabólica de la biomasa extra mantenida por la cepa transformada era incluso mayor que la de la cepa control.

Estos resultados dan a conocer que la cepa recombinante de S. pombe H2369 que expresa la enzima málica de S. cerevisiae tiene capacidades significativamente potenciadas de utilización de xilosa, así como de producción de etanol a partir de xilosa. La cepa recombinante puede también mantener su viabilidad durante periodos de tiempo prolongados. Además, la cepa H2369 produce menos acetato (indeseado) (-43%). Estos resultados son comparables con las fermentaciones con S. cerevisiae que sobreexpresan enzima málica nativa. Con S. cerevisiae, se potenció la utilización de xilosa en un 55% y la producción de etanol en un 20%.

Ejemplo 19 Clonación del gen de glutamato deshidrogenasa ligado a NAD a partir de Peptostreptococcus asaccharolyticus

Se hizo crecer anaeróbicamente Peptostreptococcus asaccharolyticus (ATCC 14963) y se aisló el ADN genómico. Se clonó después el gen que codifica glutamato deshidrogenasa ligada a NAD según la secuencia publicada por Snedcor et al. (1991) mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5'- GAG GAT CCA TAG GAG CGC ATG TTG GAC C-3' y 5'-CAG GAT CCT CTG TTA GGG ATT TAC TCC-3'. Se utilizó la polimerasa DyNAzyme EXT (Finnzymes), se ligó el producto de PCR de 2,4 kpb resultante al vector pCR 2.1 TOPO (Invitrogen) y se transformó en células E. coli TOP10F' (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 20 Construcción de un vector lanzadera de E. coli-Corynebacterium glutamicum que contiene el gen que codifica la glutamato deshidrogenasa ligada a NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus

Se aisló el plásmido pAJ655, un vector lanzadera de E. coli-Corynebacterium glutamicum, a partir de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 3913 y se digirió con BamHI. Se purificó el vector en un gel de agarosa y se desfosforilaron los extremos con fosfatasa alcalina de camarón.

Se digirió el vector pCR2.1 TOPO con el gen que codifica la glutamato deshidrogenasa ligada a NAD de Peptostrepcoccus asaccharolyticus del ejemplo 19 con BamHI, y se aisló el fragmento de 2,4 kpb a partir de un gel de agarosa. Se ligó después el fragmento de 2,4 kpb al vector lanzadera linealizado y se transformó en células DH5\alpha de E. coli.

Ejemplo 21 Transformación del vector lanzadera en una cepa de Corynebacterium glutamicum

Se transformaron las cepas de Corynebacterium glutamicum ATCC 21799 (E-991193) y ATCC 21253 (E-991992) con el vector lanzadera obtenido en el ejemplo 20 mediante electroporación (Follettie [1989]). Se eligieron estas cepas porque se han desarrollado para sobreproducir lisina.

Se recuperó el plásmido a partir de las cepas transformadas, se digirió con BamHI y se separaron los productos de digestión en un gel de agarosa como se muestra en la Figura 15. En el carril 1, está el vector digerido a partir de un transformante de ATCC 21253, y en el carril 3 está el vector digerido a partir de un transformante de ATCC 21799 que se denomina VTT E-991203. La figura muestra el vector de 10 kpb y el inserto de 2,5 kbp. Un segundo aislamiento de ATCC 21799 transformada se denominó VTT E-991204, y el plásmido recuperado a partir de este aislamiento se comportaba del mismo modo mostrado por VTT E-991203 en la Fig. 15.

Ejemplo 22 Medición de la actividad glutamato deshidrogenasa ligada a NAD en extractos celulares de Corynebacterium glutamicum

Se prepararon extractos celulares de Corynebacterium glutamicum agitando con vórtex 500 mg de peso húmedo de células, 500 \mul de tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, y 500 \mul de perlas de vidrio durante 20 minutos a 4ºC en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Se centrifugaron los tubos a 4ºC y 13.000 rpm en una centrífuga de sobremesa y se analizó el sobrenadante. El tampón para el ensayo de actividad contenía fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, cloruro de amonio 20 mM y NADH 200 \muM. Se inició la reacción añadiendo \alpha-cetoglutarato a una concentración final 2 mM. Se calculó la actividad a partir del cambio de absorbancia de NADH a 340 nm. Se realizaron los ensayos enzimáticos a 30ºC. Se midió la cantidad de proteína extraída con el ensayo de proteína BioRad utilizando IgG como patrón. Se encontraron actividades enzimáticas entre 0,1-0,2 ncat/mg para un transformante de la cepa ATCC 21253 y 0,1-0,2 ncat/mg para transformantes de la cepa ATCC 21799, que se denominan VTT E-991203 y VTT E-991204.

Ejemplo 23 Producción de lisina por Corynebacterium glutamicum transformada

Fermentación en matraces agitados: Se analizaron las cepas VTT E-991203 y VTT E-991204 en fermentaciones de matraz agitado como se describe por Kiss (1991), excepto porque el antibiótico utilizado fue cloranfenicol 10 mg/l en lugar de kanamicina. Como control, se hizo crecer la cepa original ATCC 21799 en ausencia de antibiótico. Se diluyó 1 ml de precultivo, crecido en LB, en 50 ml de medio CGM1 (Kiss [1991]) y se hizo crecer a 30ºC en matraces Erlenmeyer con deflectores de 250 ml en un agitador a 250 rpm. Se analizaron los aminoácidos en los sobrenadantes mediante HPLC y la glucosa con un ensayo enzimático. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Producción de lisina por una cepa control (ATCC 21799) y dos transformantes según la invención de Corynebacterium glutamicum

4

Las dos cepas transformadas VTT E-991203 y VTT E-992104 crecieron más lentamente que el control debido a que (al contrario que el control) contienen vectores lanzadera y se cultivaron en presencia de cloranfenicol. Cuando se midió la producción de lisina, los transformantes seguían en la fase I de la fermentación, concretamente, la treonina seguía presente, mientras que el control estaba cerca de o en fase estacionaria y había consumido casi toda la treonina. En Corynebacteria, la sobreproducción de L-lisina empieza sólo en la fase II, después de utilizar la treonina (Vallino [1991]). Sin embargo, notablemente, los transformantes ya producían lisina durante la fase I, y las cantidades de lisina producidas por gramo de biomasa eran sólo un 16% y un 12% menores que las producidas por el control en la etapa sobreproductora de lisina normal (fase II). Además, los rendimientos de lisina desde glucosa utilizados obtenidos con los transformantes aumentaron notablemente a medida que los transformantes crecían a lo largo de la fase I (desde 0,105 g/g cuando se había consumido un 49% de la treonina a 0,15 g/g cuando se había consumido un 63% de la treonina). Para cepas sobreproductoras de lisina convencionales de Corynebacterium glutamicum, los rendimientos de lisina desde glucosa utilizada esperados en esta etapa de la fermentación son cercanos a cero (Vallino 1991]). Resulta evidente que cuando los transformantes emergen de la fase I a la etapa de sobreproducción de lisina normal (cuando el crecimiento se completa y ya no se deriva glucosa a la producción de biomasa), los índices y rendimientos de producción de lisina superarán los del control. Está claro para los expertos en la técnica que el lento crecimiento de los transformantes puede acelerarse integrando el gen de glutamato deshidrogenasa ligado a NAD en los genomas de los transformantes, evitando así el inconveniente de mantener un plásmido y eliminando la necesidad de cloranfenicol en el medio de crecimiento.

Este ejemplo da a conocer que la transformación de una cepa sobreproductora de lisina de Corynebacterium glutamicum con un gen de glutamato deshidrogenasa ligado a NAD según la invención potencia la producción de lisina por el transformante, al menos durante las etapas tempranas de crecimiento. Se espera que se obtendrá una sustancial potenciación de los rendimientos de lisina desde glucosa cuando las fermentaciones con transformantes continúen en la fase II.

Ejemplo 24 Coexpresión de los genes de Alcaligenes eutrophus que codifican polihidroxibutirato reductasa (PHB) y PHB sintasa con el gen que codifica glutamato deshidrogenasa dependiente de NAD o el gen que codifica enzima málica de S. cerevisiae

Se digirió el plásmido pRS303 (Sikorski y Hieter [1989]) con SacI y XbaI y se aisló a partir de un gel de agarosa al 0,7%. Se ligó el fragmento GDH2 de 4,8 kpb (que contiene el gen con su propio promotor) en un módulo SacI/XbaI (Boles et al. [1993]) en el vector pRS303, creando el plásmido pGDH2-303. Se cortó el origen de replicación de 2 micrómetros del plásmido pLGSD5 (Guarente et al. [1982]) con EcoRI y se volvieron romos los extremos con polimerasa de fragmento largo de Klenow. Se digirió el plásmido pRS303 con XhoI y se volvieron romos los extremos con polimerasa de fragmento largo de Klenow. Se ligó después el origen de replicación a pRS303, creando el plásmido pTL92.

Se digirió el plásmido pGDH2-303 con SmaI y se aisló una banda doble de 4,8 kpb que contenía tanto el fragmento GDH2 (4,8 kpb) como el vector estructural (4,5 kpb) a partir de un gel de agarosa. Se digirieron después los fragmentos recuperados con KpnI. Esta digestión escinde el vector estructural (pRS303) en dos fragmentos, permitiendo así el aislamiento de la banda de 4,8 kpb que contiene el fragmento GDH2. Se linealizó el plásmido pTL92 con SmaI y se aisló a partir de un gel de agarosa. Se desfosforiló el vector linealizado con CIAP (fosfatasa alcalina intestinal de ternero) a 37ºC durante 1 hora, y después se purificó en un gel de agarosa. Se ligaron el fragmento GDH2 romo y el vector pTL92 romo, creando p2-GDH2.

El plásmido p2-GDH2 puede transformarse en la cepa de S. cerevisiae D603 (MAT\alpha/MAT\alpha, ura3-52, lys2-801, met, his3, ade2-101, reg1-501; Srienc et al. [1986]) que expresa los genes heterólogos de Alcaligenes eutrophus que codifican PHB reductasa y PHB sintasa en un plásmido p2DPT de múltiples copias con un promotor bidireccional inducible por galactosa (Carlson [1999]). Los cultivos en matraz agitado y biorreactor con controles apropiados pueden realizarse en medio SD enriquecido (DaSilva [1988]) que contiene 10 g/l de cada una de glucosa y galactosa. El contenido de PHB de las células control y células transformadas según la invención se determina mediante análisis de CG de extractos de dicloroetano de material celular secado sometido a propanólisis (Riis y Mai [1988], Leaf et al. [1996]). Se miden el consumo de azúcar y los intercambios de gas mediante métodos estándar. De este modo, pueden demostrarse las ventajas esperadas por la invención, tales como un rendimiento aumentado de PHB desde glucosa, una productividad aumentada, una producción de CO_{2} reducida y un requisito de oxígeno reducido.

Está claro que el fragmento de 3,8 kpb con el gen MAE1 entre el promotor y el terminador PGK1 (véase el ejemplo 10) puede clonarse y expresarse en la levadura D603 con una estrategia similar a la utilizada para el gen GDH2.

Pueden utilizarse estrategias similares para introducir genes de deshidrogenasas según la invención en otros microorganismos productores de PHB y otros PHA, incluyendo bacterias ya utilizadas en la producción industrial de PHA tales como Alcaligenes eutrophus. Las enzimas ventajosas incluyen la glutamato deshidrogenasa ligada a NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus utilizada en el ejemplo 21 para transformar otra bacteria, Corynebacterim glutamicum.

Microorganismos depositados

Se depositaron los siguientes microorganismos según las normas del Tratado de Budapest en la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania.

Microorganismo	Número de acceso	Fecha de depósito
Saccharomyces cerevisiae
H1791 (VTT C-98298)	DSM 12213	4 de junio de 1998
H1795 (VTT C-98300)	DSM 12214	4 de junio de 1998
H1803 (VTT C-98302)	DSM 12215	4 de junio de 1998
H2193 (VTT C-99317)	DSM 12722	5 de marzo de 1999
H2195 (VTT C-99320)	DSM 12723	5 de marzo de 1999
H2222 (VTT C-99322)	DSM 12724	5 de marzo de 1999
Schizosaccharomyces pombe
H2369 (VTT C-99323)	DSM 12725	5 de marzo de 1999
H2370 (VTT C-99324)	DSM 12726	5 de marzo de 1999
Corynebacterium
VTT E-991203	DSM 12728	11 de marzo de 1999
VTT E-991204	DSM 12729	11 de marzo de 1999

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<110> Valtion teknillinen tutkimuskeskus

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<120> Microorganismos transformados con propiedades mejoradas

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<160> 2

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<210> 1

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<211> 71

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<212> PRT

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<213> Aspergillus nidulans

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<223> Fragmento interno de enzima málica de A. nidulans

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<400> 1

5

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<210> 2

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<211> 156

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<212> PRT

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<213> Trichoderma reesei

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<223> Fragmento interno de enzima málica de T. reseei

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<400> 2

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6

Claims (36)

1. Un microorganismo transformado con al menos una molécula de ADN recombinante que codifica o causa de otro modo la expresión de al menos una enzima seleccionada del grupo consistente en enzima málica, glutamato deshidrogenasa, aldehído deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, xilosa-1-deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, orotato reductasa y ferredoxina reductasa, que causa el acoplamiento funcional de la oxidación y reducción de sustratos mediante dos reacciones de deshidrogenasas ligadas a nucleótido de piridina que comparten un sustrato común y tienen diferentes especificidades por las parejas de coenzimas NAD/NADH y NADP/NADPH, y facilita así la transferencia de electrones entre las dos parejas de coenzimas mediante dichos sustratos, produciendo así dicho microorganismo transformado productos útiles más eficientemente que el correspondiente organismo no transformado.

2. El microorganismo de la reivindicación 1, produciendo dicho microorganismo más producto por unidad de material bruto que el correspondiente microorganismo no transformado.

3. El microorganismo de la reivindicación 1, produciendo dicho microorganismo un producto más rápidamente que el correspondiente microorganismo no transformado.

4. El microorganismo de la reivindicación 1, produciendo dicho microorganismo menos CO_{2} por unidad de producto producido que el correspondiente microorganismo no transformado.

5. El microorganismo de la reivindicación 1, teniendo dicho microorganismo un requisito de oxígeno más reducido por unidad de producto producido que el correspondiente microorganismo no transformado.

6. El microorganismo de la reivindicación 1 que, en las condiciones de un proceso biotecnológico, mantiene un mayor nivel de la capacidad metabólica necesaria para dicho proceso que el correspondiente microorganismo no transformado.

7. El microorganismo de la reivindicación 6, en el que la capacidad metabólica necesaria del correspondiente microorganismo no transformado se reduce con el tiempo en las condiciones de dicho proceso biotecnológico.

8. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el producto es etanol.

9. El microorganismo de la reivindicación 8, en el que el etanol deriva de una pentosa.

10. El microorganismo de la reivindicación 8, en el que el etanol deriva de una hexosa.

11. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el producto es uno o más aminoácidos.

12. El microorganismo de la reivindicación 11, en el que el aminoácido es lisina.

13. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el producto es polihidroxialcanoato.

14. El microorganismo de la reivindicación 13, en el que el polihidroxialcanoato es polihidroxibutirato.

15. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el producto es un pentitol.

16. El microorganismo de la reivindicación 15, en el que el pentitol es xilitol.

17. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, siendo dicho microorganismo una levadura.

18. El microorganismo de la reivindicación 17, siendo dicho microorganismo una cepa de Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp. o Pichia spp.

19. Un microorganismo de la reivindicación 9, que es una cepa de Saccharomyces spp. o Schizosaccharomyces spp. que expresa genes que codifican xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y que se transforma con la al menos una molécula de ADN recombinante que codifica o causa de otro modo la expresión de una enzima que es una deshidrogenasa ligada a nucleótido de piridina.

20. El microorganismo de la reivindicación 19, que expresa adicionalmente un gen que codifica xiluloquinasa.

21. El microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, siendo dicho microorganismo una bacteria.

22. El microorganismo de la reivindicación 21, siendo dicho microorganismo una cepa de Corynebacteria o Brevibacteria.

23. Cepas de Saccharomyces cerevisiae seleccionadas del grupo consistente en H1791 (VTT C-98298, DSM 12213), H1795 (VTT C-98300, DSM 12214), H1803 (VTT C-98302, DSM 12215), H2193 (VTT C-99317, DSM 12722), H2195 (VTT C-99320, DSM 12723) y H2222 (VTT C-99322, DSM 12724).

24. Cepas de Schizosaccharomyces pombe seleccionadas del grupo consistente en H2369 (VTT C-99323, DSM 12725) y H2370 (VTT C-99324, DSM 12726).

25. Cepas de Corynebacteria seleccionadas del grupo consistente en VTT E-991203 (DSM 12728) y VTT E-991204 (DSM 12729).

26. Un método de producción de productos útiles a partir de materiales brutos, que comprende la etapa de fermentar dichos materiales con un microorganismo de la reivindicación 1.

27. El método de la reivindicación 26, en el que los materiales brutos comprenden pentosas, polímeros de pentosa o mezclas de los mismos.

28. El método de la reivindicación 26, en el que los materiales brutos comprenden hexosas, polímeros de hexosa o mezclas de los mismos.

29. El método de la reivindicación 27, en el que se produce un pentitol.

30. El método de la reivindicación 29, en el que el pentitol es xilitol.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que se produce etanol.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que se producen uno o más aminoácidos.

33. El método de la reivindicación 32, en el que el aminoácido es lisina.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que se producen uno o más polihidroxialcanoatos.

35. El método de la reivindicación 34, en el que el polihidroxialcanoato es polihidroxibutirato.

36. Un método de producción de etanol a partir de materiales brutos que comprenden pentosas, polímeros de pentosa o mezclas de los mismos, que comprende la etapa de fermentar dichos materiales con un microorganismo de una cualquiera de las reivindicaciones 17, 19 y 20.