BRPI1011856A2 - polipeptídeos e composições de imunização contendo polipeptídeos gram-positivos e métodos de uso - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE INFECÇÃO, DE SINTOMA OU DIMINUIÇÃO DA COLONIZAÇÃO POR STAPHYLOCOCCUS SPP., CONTENDO POLIPEPTÍDEOS GRAM-POSITIVOS, KIT PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A TAIS POLIPEPTÍDEOS, BEM COMO USO DOS MESMOS. A presente invenção provê polipeptídeos isolados isoláveis de uma Staphylococcus spp. São também providas pela presente invenção composições que incluem um ou mais dos polipeptídeos e métodos para fabricação e métodos para uso dos polipeptídeos.

Description

Tr Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES PARA TRATAMENTO DE INFECÇÃO, DE SINTOMA OU DIMINUI- ÇÃO DA COLONIZAÇÃO POR STAPHYLOCOCCUS SPP., CONTENDO ” POLIPEPTÍDEOS GRAM-POSITIVOS, KIT PARA DETECÇÃO DE ANTI- CORPOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A TAIS POLIPEPTÍDEOS, Ê BEM COMO USO DOS MESMOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Pro- visório U.S. No. de Série 61/210.772 depositado em 23 de março de 2009.

ANTECEDENTES Bactérias gram-positivas são um grupo notadamente diverso de organismos que causam uma variedade de doenças em ambos humanos e animais. Alguns dos patógenos reconhecidos como importantes em saúde hu- mana e/ou animal incluem bactérias pertencentes às famílias Corynebacteria- ceae, Enterococcacae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e Peptococcaceae, que incluem espécies bacterianas tais como Actinomyces spp., Bifidobacterium spp., Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Erysipe- lothrix spp., Eubacterium spp., Kytococcus spp., Lactobacillus spp., Micrococ- cus spp., Mobiluncus spp., Mycobacteria Spp., Peptostreptococcus spp., Propi- — onibacterium spp. e Staphylococcus spp. Esses patógenos causam uma gran- de variedade de manifestações clínicas em muitas espécies animais diferentes. O tratamento para tais infestações tem sido historicamente antibióticos que ata- cam as estruturas e funções comuns dos organismos gram-positivos. No entan- to, muitos dos organismos gram-positivos ubíquos desenvolveram resistência a — várias classes de antibióticos, tornando o tratamento de infecções difícil. O uso disseminado de antibióticos no tratamento de doenças bacterianas em ambos humanos e animais de produção de alimento é provavelmente um grande fator de contribuição na proliferação de linhagens resistentes a antibiótico de muitas espécies de organismos gram-positivos. Desta maneira, há uma grande neces- sidade em encontrar tratamentos diferentes que previnam ou eliminem infec- ções por organismos gram-positivos em animais bem como humanos. Infecções Staphylococcais em animais de agricultura Na indústria agricultural várias doenças importantes são causa

- das por organismos gram-positivos.

Exemplos de condições clínicas causa- das por infecções bacterianas gram-positivas incluem mastite, septicemia, pneumonia, osteomielite, meningoencefalite, linfangite, dermatite, infecções do trato genital, metrite, doença perinatal, abcessos da pituitária, artrite, bur- site, orquite, cistite e pielonefrite, linfadenite caseosa, tuberculose, linfangite ulcerativa, erisipela, laminite, doença de tyzzer, tétano, botulismo, enterite, edema maligno, abraxia, hemoglobinúria baciliar, enterotoxemia.

Staphylo- coccus spp., em particular, são capazes de infectar muitas espécies diferen- tes de animais agriculturais e podem causar grandes perdas econômicas.

Por exemplo, a indústria de laticínio Norte-americana é estimada perder a- proximadamente $185 por vaca anualmente devido à mastite, uma doença : frequentemente causada por Staphylococcus aureus.

Uma vez que há 9,5 : milhões de cabeças de vacas leiteiras nos Estados Unidos, o custo anual de o mastite é aproximadamente $1,8 bilhão.

Isto é aproximadamente 10% do valor total das vendas de leite das fazendas e cerca de dois-terços desta perda são devido à produção de leite reduzida em vacas subclinicamente infectadas.

Outras perdas são devido a leite anormal descartado e leite reti- rado de vacas tratadas com antibiótico, custos de substituição precoce de vacas afetadas, valor de venda reduzido de vacas selecionadas, custos de fármacos e serviços veterinários e custos de trabalho aumentados.

Em adi- ção à sua prevalência dentro da indústria de laticínio bovino, a mastite cau- sada por cocci gram-positivo é também comum entre cabras e ovelha.

Do- enças animais adicionais causadas por S. aureus incluem botriomicose em cavalos, sinovite purulenta e osteomielite em aves, obstruções nasais em coelhos, abortos em suíno e piemia por carrapato em cordeiros.

Outras es- pécies de staphylococci são patógenos de pele principais de canino (S. in- termedius) e suíno (S. hycius). Em espécies de aves, patógenos staphylo- coccal causam endocardite e septicemia.

Infecções staphylococcal em seres humanos Staphylococcus spp. são também patógenos humanos que cau- sam uma ampla variedade de infecções.

A espécie Staphylococcus aureus, um colonizador comum de mucosa e pele humanas, é um patógeno oportu- )

< nístico que pode causar infecções humanas diversas.

Por exemplo, S. au- reus é o agente causador de várias infecções de pele, incluindo impetigo, furunculose, celulite e síndrome da pele escaldada, bem como infecções de ferida pós-cirúrgica potencialmente fatais.

Ainda, a exposição de indivíduos —imunocomprometidos à S. aureus em ambientes hospitalares resultou em infecções de órgão tais como pneumonia, infecções do trato urinário, osteo- mielite, artrite, bacteremia e endocardite.

S. aureus é também o agente cau- sador de toxinoses, mais notadamente síndrome do choque tóxico e enve- nenamento de comida.

Envenenamento de comida causado pela enterotoxi- na staphylococcal B é a causa mais comum de doença de origem em comi- da, ultrapassando até mesmo a salmonelose, a campilobacteriose e a listeri- : ose.

Outras espécies de staphylococci também causam doença humana; S. : epidermis, S. haemolyticus e S. hominis geralmente infectam dispositivos o médicos implantados e S. saprophyticus está associada com infecções do trato urinário em mulheres.

Mecanismos de virulência de staphylococci Staphylococci infectam uma variedade de tecidos hospedeiros e evadem o sistema imune através da produção de vários tipos de proteínas secretadas, fatores de virulência expressos na superfície e sistemas metabó- licos planejados para sobrevivência no meio dos recursos limitados e defe- sas ativas associadas com o ambiente hospedeiro.

Colonização é a primeira etapa necessária no estabelecimento de infecção; vários fatores incluindo cápsula, ácido lipoteicoico e ácido teicoico são componentes estruturais co- muns que contribuem para a colonização.

Ainda, proteínas de superfície tais como proteína de ligação à fibronectina staphylococcal e proteínas de liga- ção à sialoproteína óssea se ligam especificamente a componentes do teci- do hospedeiro.

Toxinas são geralmente produzidas dentre os patógenos staphylococcais e são altamente prejudiciais; várias doenças humanas, in- cluindo envenenamento de alimento, síndrome do choque tóxico e condições de pele esfoliativa, são o resultado direto de proteínas de toxina secretada extracelular.

Um único isolato pode codificar genes para 20-30 toxinas secre- tadas diferentes.

Alguns dos produtos de proteína secretada são superantí- )

: genos que se ligam não-especificamente à molécula de Classe 1! da MHC de uma célula apresentando antígeno e, simultaneamente, ao receptor de célu- la T de uma célula T.

A ligação induz sinalização de célula T e leva à libera- ção de níveis altos de fatores pró-inflamatórios, por fim induzindo dano ao — hospedeiro devido à resposta imune devastadora.

Outra classe de fatores de virulência expressos na superfície oculta as bactérias do sistema imune hos- pedeiro, Por exemplo, a Proteína A expressa na superfície de S. aureus ini-

be a opsonização e a fagocitose através da ligação do componente Fc de anticorpo hospedeiro.

Várias proteases, hemolisinas (alfa, beta, gama e del-

ta), nucleases, lipases, hialuronidases e colagenase também auxiliam as bactérias na extração de nutrientes de células circundantes e proteção delas

: contra defesas do hospedeiro.

Resistência a antibiótico dentre staphylococeci

O A CDC estima que a cada ano quase 2 milhões de pessoas nos Estados Unidos adquiram uma infecção nosocomial, resultando em 90.000 mortes anualmente.

Dessas infecções fatais, 70% são causadas por bacté-

rias resistentes a antibióticos.

O aumento em resistência a antibiótico dentre as espécies microbianas é particularmente pronunciado em colonizadores de pele e mucosais tal como S. aureus.

Por exemplo, a maioria de S. aureus isolada de ambientes hospitalares é resistente à penicilina e 50% são tam-

bém resistentes às penicilinas semissintéticas, tais como metcilina, nafcilina e oxacilina.

Esses isolados, referidos como MRSA (S. aureus resistente à meticina) (methicillin resistant S. aureus), foram primeiro vistos nos anos 70 e agora firmemente estabelecidos em ambientes hospitalares.

Recentemen-

te houve vários casos de infecções por MRSA na comunidade, onde os indi- víduos infectados não tiveram nenhuma exposição prévia a hospitais e pro-

fissionais de cuidado de saúde.

Esta tendência alarmante é intensificada pelo isolamento de isolatos de MRSA que são menos suscetíveis à vanco-

micina, um glicopeptídeo usado para tratar MRSA.

Pouquíssimas linhagens foram mostradas ser verdadeiramente resistentes à vancomicina de acordo com a definição do CDC de resistência à vancomicina, mas várias linhagens de MRSA foram caracterizadas como consistindo em subpopulações com

' )

. susceptibilidade reduzida à vancomícina, ou VISA (S. aureus intermediária à vancomicina) (Vancomycin Intermediate S. aureus). Uma vez que o isola- mento de linhagens resistentes à vancomicina e intermediárias à vancomici- na é um desenvolvimento relativamente novo, há poucos dados com relação àsua prevalência em hospitais e/ou na comunidade. Ocasionalmente, VRSA (S. aureus resistente à vancomicina) (Vancomycin Resistant S. aureus) com resistência integral à vancomicina e carregando um plasmídeo de resistência provavelmente adquirido de Enterococcus spp. foi também recuperada de humanos. Estratégias para prevenção e tratamento de infecções por Staphylococcus A emergência de vários patógenos gram-positivos que são resis- : tentes a antibióticos múltiplos tem alimentado os esforços de pesquisa com o : objetivo de desenvolver vacinas preventivas para proteger contra doenças. As vacinas são projetadas para serem administradas a pacientes a fim de elicitaruma resposta de memoria a longo prazo do sistema imune, de manei- ra que se o patógeno for encontrado no futuro, o sistema imune pode mais rapidamente e eficientemente eliminar o patógeno. Até agora, uma vacina amplamente protetora contra patógenos gram-positivos associados com vá- rias doenças humanas, particularmente aquelas doenças associadas com infecções staphylococcaís, não está disponível. Abordagens de desenvolvi- mento de vacina para a prevenção de infecções staphylococcais incluem aquelas relatando o uso de componentes de superfície microbiana reconhe- cendo moléculas de matriz de adesão [MSCRAMMS Nilsson e outros, 1998. J. Clin. Invest. 101:2640-9; Menzies e outros, 2002. J. Infect. Dis. 185:937- 43; Fattom e outros, 2004. Vacecine 22:880-7], polissacarídeos de superfície (McKenney e outros, 2000; McKenney e outros, 1999. Science 284:1523-7; Maira-Litran e outros, 2002. Infect Immun. 70:4433-40; Maira-Litran e outros,

2004. Vaccine 22:872-9; Maira-Litran e outros, 2005. Infect. Immun. 73 : 6752-62) e exoproteinas mutadas (Lowell e outros, 1996. /nfect. Immun. 64 :4686-93; Stiles e outros, 2001. Infect. Immun. 69:2031-6; Gampfer e outros,

2002. Vaccine 20:3675- 84), como antígenos em composições de vacina de subunidade, bem como uma linhagem avirulenta viva (Reinoso e outros,

. 2002. Can. J. Vet. Res. 66:285-8) e várias abordagens de vacina de DNA (Ohwada e outros, 1999. J. Antimicrob. Chemother. 44:767-74); Brouillette e outros, 2002. Vaccine 20:2348-57; Senna e outros, 2003. Vaccine 21:2661- 6). Embora muitas dessas composições tenham mostrado algum grau de — proteção, elas obtiveram pouca proteção cruzada contra linhagens staphylo- coccais diversas e falharam ainda em elicitar respostas imunes substanciais em pacientes imunocomprometidos, uma população sob risco importante para infecções nosocomiíais.

As doenças staphylococcais mais severas são aquelas media- das pelas exotoxinas pirogênicas superantigênicas (SPEs) (Supernantigenic pyrogenic —exotoxins) mencionadas acima que estimulam não- i especificamente células T independentes de apresentação de antígeno. Tais : doenças incluem síndrome do choque tóxico, doença de pele esfoliativa e possivelmente síndrome de Kawasaki. Para essas doenças mediadas por SPE, agentes imunoterapêuticos que reforçam o sistema imune durante uma infecção ativa são frequentemente mais eficazes do que vacinas, que são tipicamente administradas antes da infecção. A natureza devastadora da resposta imune à SPE necessita de redução rápida em atividade de toxina como o primeiro objetivo em terapia. Até agora, neutralização de toxina em doença mediada por S. aureus foi acompanhada com mais eficácia através da administração de imunoglobulina humana intravenosa (IVIG) (Intravenous Immunoglobulin), uma preparação de anticorpo humano concentrada, purifi- cada, de milhares de doadores humanos (Takei e outros, 1993, J. Clin. In- vest. 91:602-7; Stohl e Elliot. 1996. Clin. Immunol. Immunopathol. 79:122- 33). A distribuição disseminada de S. aureus, que coloniza aproximadamen- te 30% de adultos humanos saudáveis, coincide com taxas de exposição altas para a maioria da população, então o nível de anticorpos antitoxina an- ti-staphylococcal em IVIG é frequentemente suficiente para neutralizar toxina o tempo suficiente para estabilizar a resposta imune até que a carga de bac- téria seja reduzida com antibióticos (Schlievert, 2001. J. Allergy Clin. Immu- nol. 108(4 Supl.):S8107-110). Preparações de IVIG de fabricantes múltiplos foram mostradas neutralizar toxina em ensaios de proliferação com células

+ mononucleares de sangue periférico humano, inibir diferenciação de célula B direcionada por célula T humana induzida por toxina in vitro (Stohl e Elliot.

1996. Clin. Immunol. Immunopatho!l. 79:122-33; Stohl e Elliott, 1995. J. Im- munol 155:1838-50; Stohl e outros, 1994, J. Immunol. 153:117-27) e reduzir secreção de lL+4 ell-2 em PBMCs estimuladas com enterotoxina B staph- ylococcal (Takei e outros, 1993, J. Clin. Invest. 91:602-7; Darenberg e ou- tros, 2004. Clin, Infect. Dis. 38:836-42). Terapia com IVIG, com sua habilida- de comprovada em neutralizar SPE, é agora uma terapia recomendada para síndrome de Kawasaki e está ganhando preferência como um método de tratamento para síndrome do choque tóxico staphylococcal (Schlievert, 2001. J, Allergy Clin. Immunol. 108 (4 Supl.):S8107-110). Uso de IVIG como uma lavagem imunoprotetora durante cirurgia foi também investigado em camun- . dongos (Poelstra e outros, 2000. Tissue Eng. 6(4):401-411). Embora IVIG padrão tenha utilidade para limitação do avanço de alguma doença mediada por SPE staphylococcal, a segurança, a eficácia e a consistência de prepa- rações de IVIG humanas geradas a partir de milhares de doadores humanos não-selecionados permanecem controversas (Baker e outros, 1992. N. Engl.

J. Med. 327:213-9; Miller e outros, 2001, J. Alleray Clin. Immunol. 108:891-4, Sacher, 2001. J. Allergy Clin, Immunol. 108:8139-46; Darenberg e outros,

2004. Clin. Infect. Dis. 38:836-42). Ainda, o benefício de IVIG na prevenção de infecções staphylococcais é duvidável (Baker e outros, 1992. N. Engl. J.

Med. 327:213-9; Hill, H.R. 2000. J. Pediatr. 137:595-7; Darenberg e outros,

2004. Clin. Infect. Dis. 38:836-42). A fim de aumentar a eficácia de IVIG no tratamento de infecções staphylococcais em certas populações sob risco, uma lgG humana anti-staphylococcal policlonal, selecionada de doador, de- rivada de plasma, com títulos altos de anticorpo direcionado ao fator A de coagulação MSCRAMMS staphylococcal (CIfA) e proteina G de ligação a fibrinogênio (SdrG) foi criada e testada com sucesso em bebês com peso de nascimento muito baixo para prevenir sepse staphylococcal (Vernachio e outros, 2003. Antimicrob. Agents Chemother. 47:3400-6; Bloom e outros,

2005. Pediatr. Infec. Dise. J. 24:858-866; Cappareli e outros, 2005. Antimi- crob. Agents Chemother. 49:4121-7). Um anticorpo monoclonal humanizado

. específico com relação ao fator A de coagulação MSCRAMM de S. aureus está também sendo desenvolvido. O anticorpo foi selecionado de um grupo de milhares de anticorpos anti-CIfA de murino quanto à sua habilidade em se ligar a CIfA de uma maneira que anula ligação de S. aureus à fibronectina humana e foi subsequentemente humanizado através de mutação de resí- duos direcionados específicos para imitar o anticorpo do subgrupo de linha germinativa humana homólogo (Hall e outros, 2003. I/nfect. Immun. 71:6864- 70; Domanski e outros, 2005, Infec. Immun. 73:5229-32). O anticorpo espe- cífico está sendo projetado para uso em conjunto com antibióticos para o tratamento de várias infecções por S. aureus ameaçadoras à vida severas, embora estudos em animal também demonstrem um efeito protetor profiláti- Ú co.

SUMÁRIO Em um aspecto, a presente invenção provê composições inclu- indo dois ou mais polipeptídeos isolados. Um polipeptídeo isolado na com- posição tem um peso molecular conforme determinado através de eletrofo- rese em um gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa. Por exemplo, uma composição pode incluir proteínas isoladas de 88 kDa e 55 kDa. Em alguns aspectos a composição pode incluir polipeptídeos isolados tendo pesos mo- leculares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa. Os polipeptídeos podem ser isoláveis de uma Staphylococcus aureus quando incubados em meios incluindo um quelante de ferro e não-isoláveis quando cultivados no meio sem o quelante de ferro. A composição protege um ani- mal, tal como um camundongo ou vaca ou ser humano, contra provocação com uma linhagem de S. aureus tal como, por exemplo, a linhagem ATCC

19636. A composição pode incluir ainda um veículo farmaceuticamente acei- tável e pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos isolados tendo um peso molecular de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43KkDa,41kDa ou40 kDa e isolado de uma S. aureus quando cultivado no meio sem o quelante de ferro. Em alguns aspectos os polipeptídeos da com- posição podem ser isolados de S. aureus linhagem ATCC 19636.

. Em algumas modalidades cada polipeptídeo da composição tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo do polipeptídeo do mesmo peso molecular expresso por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636, onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios compreendendo um quelante de ferro e não- isolável quando cultivado no meio sem o quelante de ferro, Por exemplo, o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 88 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 88 kDa expresso por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e o polipeptídeo isolado com um peso mole- : cular de 55 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de . similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 55 kDa expresso por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636. Em outro aspecto, a presente invenção provê composições que incluem um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO:408 e SEQ ID NO:397. A composição pode incluir ainda pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Sta- —phylococcus aureus quando incubada em meios compreendendo um quelan- te de ferro e não-isolável quando cultivada nos meios sem o quelante de fer- ro.

Em alguns casos, o segundo polipeptídeo pode incluir uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:364, SEQIDNO:375, SEQ ID NO:386 e SEQ ID NO:149. Em outros casos, o se- gundo polipeptídeo pode ter um peso molecular conforme determinado atra- vés de eletroforese em um gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa.

A composi- ção pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos isolados isoláveis de uma S aureus quando cultivado em meios sem o quelante de ferro e tem um pe- so molecular de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa ou 40 kDa |

- A presente invenção também provê métodos para uso das com- posições. Em um aspecto, o método é para tratamento de infecção em um indivíduo e inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composi- ção da presente invenção a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma in- S fecção causada por Staphylococcus spp. Em outro aspecto, o método é para tratamento de um sintoma em um indivíduo e inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção a um indivíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus spp. O indivíduo pode ser um mamífero tal como um ser humano, cavalo ou vaca. A Staphylococcus spp.podeserS. aureus. A presente invenção provê ainda métodos para uso de anticor- ' po, por exemplo, anticorpo policlonal, que se liga especificamente a polipep- . tídeos da presente invenção. Em um aspecto, o método é para tratamento de uma infecção em um indivíduo e inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma in- fecção causada por Staphylococcus Spp., onde a composição ínclui anticor- po que se liga especificamente a pelo menos um e, em alguns casos, mais de um, polipeptídeo isolado da presente invenção. Em outro aspecto, o mé- todo é para tratamento de um sintoma em um indívíduo e inclui administra- ção de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus spp., onde a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um e, em alguns casos, mais de um, polipeptídeo isolado da presente invenção. O indivíduo pode ser um mamífero, tal como um ser humano, cavalo ou vaca. A Staphylococcus spp.podeserS. aureus.

São também providos pela presente invenção métodos para di- minuição da colonização em um indivíduo. Em um aspecto, o método inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção a um indivíduo colonizado por uma Staphylococcus spp. Em outro aspecto, o método inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo colonizado por Staphylococcus spp., onde a composição inclui anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um e,

- em alguns casos, mais de um, polipeptídeo isolado da presente invenção.

A presente invenção provê um kit para detecção de anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo. O kit inclui, em recipientes separados, um polipeptídeo isolado da presente invenção e um reagente —quedetectaum anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. O perfil eletroforético das proteínas de linhagens dife- rentes de Staphylococcus aureus derivadas de espécies diferentes cultiva- das com e sem ferro (faixas marcadas Fe“* e DP, respectivamente).

Figura 2, A diferença em mortalidade entre camundongos vaci- nados e não-vacinados após provocações homóloga e heteróloga com Sta- : Phylococcus aureus. Figura 3. Curva de sobrevivência Kaplan-Meier mostram a so- brevivência percentual após vacinação e provocação homóloga com S. au- reusATCC 19636.

Figura 4. Curva de sobrevivência Kaplan-Meier mostrando a so- brevivência percentual após vacinação e provocação heteróloga com S. au- reus ATCC 19636.

Figura 5. Curva de sobrevivência Kaplan-Meier mostrando so- brevivência percentual após imunização passiva e provocação homóloga com S. aureus ATCC 19636.

Figura 6. Curva de sobrevivência Kaplan-Meier mostrando so- brevivência percentual após imunização passiva e provocação heteróloga com S. aureus linhagem 1477.

Figura 7. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regula- do por metal obtido a partir de S. aureus ATCC 19636, (SEQ ID NO:353).

Figura 8. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regula- do por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:354).

Figura 9. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regula- do por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:355).

Figura 10. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:356).

. Figura 11. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:357). Figura 12. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:358), Figura 13. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:359). Figura 14. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:360). Figura 15. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopor metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:361). Figura 16. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ' lado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:362). . Figura 17. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:363). Figura 18. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:364). Figura 19, A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:365). Figura 20. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopor metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:366). Figura 21. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:367). Figura 22. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:368). Figura 23. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:369). Figura 24. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:370). Figura 25. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado pormetal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:371). Figura 26. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:372).

ESSAS NEAR.

AAA ESA 13/187 . Figura 27. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NOCTC8325. (SEQ ID NO:373). Figura 28. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSAA476. (SEQ ID NO:374). Figura 29. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:375). Figura 30. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:376). Figura 31. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:377). Figura 32. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- : lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:378). Figura 33. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ' lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:379). Figura 34. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:380). Figura 35. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:381). Figura 36. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopor metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:382). Figura 37. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido à partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:383). Figura 38. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:384). Figura 39. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSAA476. (SEQ ID NO:385). Figura 40. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:386). Figura 41. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:387). Figura 42. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MuS50. (SEQ ID NO:388).

. Figura 43. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:389). Figura 44. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:390). Figura 45. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:391). Figura 46. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:392). Figura 47. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:393). Figura 48. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- | lado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:394). : Figura 49. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:395). Figura 50. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:396). Figura 51. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:397). Figura 52. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopor metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:398). Figura 53. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:399). Figura 54. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:400). Figura 55. A sequência de aminoácido de um polipeptideo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:401). Figura 56. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:402). Figura 57. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopor metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:403). Figura 58. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:404). |

ENA EEE SAAE AAA ESSE 15/187 - Figura 59. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:405). Figura 60. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:406). Figura 61. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:407). Figura 62. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:408). Figura 63. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:409). Figura 64. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ' lado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:410). Figura 65. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ' lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSAZ52. (SEQ ID NO:411). Figura 66. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:412). Figura 67. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:413). Figura 68. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- ladopormetal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:414). Figura 69. A sequência de aminoácido de um polipeptideo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:415). Figura 70. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:416). Figura 71. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NOTC8325. (SEQ ID NO:417). Figura 72. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:418). Figura 73. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus ATOC19636. (SEQ ID NO:419). Figura 74. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:420).

. Figura 75. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:421). Figura 76. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:422). Figura 77. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:423). Figura 78. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:424). Figura 79. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:425). Figura 80. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- Ú lado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:426). : Figura 81. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- i lado por metal obtido a partir de S. aureus COL, (SEQ iD NO:427). Figura 82, A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:428). Figura 83. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo regu- lado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:429). Figura 84. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC 19636. (SEQ ID NO:430). Figura 85. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:431). Figura 86. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:432). Figura 87. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ IDNO:433). Figura 88. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID

, NO:434). Figura 89. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:435).

Figura 90. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:436).

Figura 91. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO437). Figura 92. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- ] lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ |D , NO:438). Figura 93. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptíideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NOCTC8325. (SEQ ID NO:439). Figura 94. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:440). Figura 95. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATOC19636. (SEQ ID NO:441). Figura 96. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO442). Figura 97. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MuS50. (SEQ ID NO:443). Figura 98. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:444). Figura 99. Uma sequência de ácido nucleico codificando um po-

- lipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:445). Figura 100. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ 1IDNO:446). Figura 101. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:447). Figura 102. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ 1D NO:448). : Figura 103. Uma sequência de ácido nucleico codificando um . polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:449). Figura 104. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NOCTC8325. (SEQ ID NO:450). Figura 105. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ IDNO451). Figura 106. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:452). Figura 107. Uma sequência de ácido nucleico codificando um —polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:453). Figura 108. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:454). Figura 109. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:455).

TERESA E AESA TEASER 19/187 . Figura 110. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:456). Figura 111. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:457). Figura 112. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:458). Figura 113. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ i 1D NO:459). . Figura 114. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO460). Figura 115. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:461). Figura 116. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ 1D NO:462). Figura 117. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:463), Figura 118. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:464). Figura 119. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MuSO. (SEQ ID NO:465). Figura 120. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ

ERRATAS AAA AAA SEE 20/187 - ID NO:466). Figura 121. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2, (SEQ ID NO:467). Figura 122. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:468). Figura 123. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:469). Figura 124. Uma sequência de ácido nucleico codificando um : polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ . ID NO:470). Figura 125. Uma sequência de ácido nucleico codificando um —polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:471). Figura 126. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:472). Figura 127. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:473). Figura 128. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQIDNO: 474). Figura 129. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:475). Figura 130. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:476). Figura 131. Uma sequência de ácido nucleico codificando um

RANA AAA CEARA SEEN 21/187 : polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:477). Figura 132. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO478). Figura 133. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:479). Figura 134. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:480). i Figura 135. Uma sequência de ácido nucleico codificando um . polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA3S00. (SEQ ID NO:481). Figura 136. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:482). Figura 137. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQIDNO:483). Figura 138. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:484). Figura 139. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:485). Figura 140. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:486). Figura 141. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:487). |

* Figura 142. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:488). Figura 143. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:489). Figura 144. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:490). Figura 145. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID : NO:491). : Figura 146. Uma sequência de ácido nucleico codificando um | polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ IDNO492). Figura 147, Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:493). Figura 148. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:494). Figura 149. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:495). Figura 150. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus ATCC19636. (SEQ ID NO:496). Figura 151. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO497). Figura 152. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID

FERRARA ARNAEAREAANEAAEAA RSA SACAS EA 23/187 : NO:498).

Figura 153. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:499).

Figura 154. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:500).

Figura 155. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ 1IDNO:501). Figura 156. Uma sequência de ácido nucleico codificando um Ú polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID . NO:502).

i Figura 157. Uma sequência de ácido nucleico codificando um —polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA3S00. (SEQ ID NO:503).

Figura 158. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:504).

Figura 159. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:505).

Figura 160. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptideo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ IDNO:506).

Figura 161. Curvas de sobrevivência Kaplan-Meier mostrando sobrevivência percentual após imunização passiva e provocação homóloga com S. aureus ATCC 25904. A, provocação intravenosa após vacinação com rMntC; B, provocação intraperitoneal após vacinação 2x com extrato de SIRP, vacinação 2x com rSIRP7 ou vacinação 3x com rSIRP7; C, provoca- ção intravenosa após vacinação com rSIRP7.

Figura 162. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- |

. gulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:543). Figura 163. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus MuSO, (SEQ ID NO:544). Figura 164. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- —guladopor metal obtido a partir de S. aureus MRSAZ52. (SEQ ID NO:545). Figura 165. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:546). Figura 166. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:547). Figura 167. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:548). i Figura 168. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- : gulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:549). i Figura 169. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- —gulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:550). Figura 170. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:551). Figura 171. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:552). Figura 172. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:553). Figura 173. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:554). Figura 174. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- —gulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA2Z252. (SEQ ID NO:555). Figura 175. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:556). Figura 176. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:557). Figura 177. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:558). Figura 178. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re-

ERRA AREAS EA aa aaa Aa aa 25/187 gulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:559). Figura 179. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:560). Figura 180. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- —guladopormetal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:561). Figura 181. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo re- gulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:562). Figura 182. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:563). Figura 183. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID . NO:564). Figura 184. Uma sequência de ácido nucleico codificando um —polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ ID NO:565). Figura 185, Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:566). Figura 186. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ ID NO:567). Figura 187. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:568). Figura 188. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:569). Figura 189. Uma sequência de ácido nucleico codificando um — polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:570). Figura 190. Uma sequência de ácido nucleico codificando um

. polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NOTC8325. (SEQ ID NO:571). Figura 191. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ 1IDNO:572). Figura 192. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus RF122. (SEQ ID NO:573). Figura 193. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Mu50. (SEQ ID NO:574). : Figura 194. Uma sequência de ácido nucleico codificando um : polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MRSA252. (SEQ | ID NO:575). Figura 195. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MW2. (SEQ ID NO:576). Figura 196. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus Newman. (SEQ 1IDNO:577). Figura 197. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus JH9. (SEQ ID NO:578). Figura 198. Uma sequência de ácido nucleico codificando um —polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus USA300. (SEQ ID NO:579). Figura 199. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus COL. (SEQ ID NO:580). Figura 200. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus NCTC8325. (SEQ ID NO:581).

TERES ASA ta ara SAS 27/187 : Figura 201. Uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo regulado por metal obtido a partir de S. aureus MSSA476. (SEQ ID NO:582).

Figura 202. Western blot mostrando ligação de soros convales- centesde camundongo a polipeptídeos regulados por metal produzidos re- combinantemente.

Figura 203. Um Westem blot mostrando ligação de soros de humanos saudáveis a polipeptídeos regulados por metal recombinantemente produzidos.

Figura 204. Um Westem blot mostrando ligação de soros de humanos convalescentes a polipeptídeos regulados por metal produzidos recombinantemente. . Figura 205. Dados de citometria de fluxo mostrando expressão na superfície de S. aureus DUS875 de polipeptídeos regulados por metal. Figura 206. Indução de citocina seguindo vacinação com rSIRP7 e reestimulação ou com extrato de SIRP ou rSIRP7. DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES PREFERIDAS DA INVEN-

ÇÃO A presente invenção provê polipeptídeos e composições incluin- do polipeptídeos. Conforme aqui usado, "polipeptídeo" refere-se a um polí- mero de aminoácidos ligado por ligações de peptídeo. Desta maneira, por exemplo, os termos peptídeo, oligopeptídeo, proteína e enzima são incluídos na definição de polipeptídeo. Este termo também inclui modificações pós- expressão do polipeptídeo, tais como glicosilações, acetilações, fosforilações esimilar. O termo polipeptídeo não conota um comprimento específico de um polímero de aminoácido. Um polipeptídeo pode ser isolável diretamente de uma fonte natural ou pode ser preparado com o auxílio de técnicas re- combinantes, enzimáticas ou químicas. No caso de um polipeptídeo que é de ocorrência natural, tal polipeptídeo é tipicamente isolado. Um polipeptídeo "isolado" é um que foi removido de seu ambien- te natural. Por exemplo, um polipeptídeo isolado é um polipeptídeo que foi removido do citoplasma ou da membrana de uma célula, e muitos dos poli-

* peptídeos, ácidos nucleicos e outro material celular de seu ambiente natural não estão mais presentes.

Um polipeptídeo caracterizado como "isolável" de uma fonte par- ticular é um polipeptídeo que, sob condições apropriadas, é produzido a par- tir da fonte identificada, embora o polipeptídeo possa ser obtido de fontes alternativas usando, por exemplo, técnicas recombinantes, químicas ou en- zimáticas bem conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica.

Desta maneira, caracterização de um polipeptídeo como "isolável" a partir de uma fonte particular não implica qualquer fonte específica a partir da qual o poli- peptídeo deve ser obtido ou quaisquer condições ou processos particulares sob os quais o polipeptídeo deve ser obtido.

Um polipeptídeo "purificado" é um que é pelo menos 60% livre, preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente pelo menos 90% livre, de outros componentes com os quais eles estão naturalmente associados.

Os polipeptídeos que são produzidos fora do organismo onde eles ocorrem naturalmente, por exemplo, através de meios químicos ou re- combinantes, são considerados ser isolados e purificados por definição, uma vez que eles nunca se apresentam em um ambiente natural.

Conforme aqui usado, um "fragmento de polipeptídeo" refere-se a uma porção de um polipeptídeo que resulta da digestão de um polipepti- deo com uma protease, A menos que de outra maneira especificado, "um", "uma", "o, a" e "pelo menos um, uma" são usados intercomutavelmente e significam um ou mais de um.

O termo "compreende" e suas variações não têm um signifi- cadolimitante onde esses termos aparecem no relatório e reivindicações.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser caracterizado por peso molecular, impressão digital de massa, sequência de aminoácido, ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, atividade imunológica ou combi- nações de duas ou mais de tais características.

O peso molecular de um polipeptídeo, tipicamente expresso em kilodáltons (kDa), pode ser determi- nado usando métodos de rotina incluindo, por exemplo, filtragem em gel, eletroforese em gel incluindo eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

TERRAS ERON SEA ELES SCE 29/187 . com dodecil sulfato de sódio (SDS), eletroforese capilar, espectrometria de massa, cromatografia líquida (incluindo HPLC) e cálculo do peso molecular de uma sequência de aminoácido observada ou prevista. A menos que de outro modo indicado, peso molecular refere-se a peso molecular conforme determinado através da separação de um polipeptídeo usando um gel de poliacrilamida SDS tendo um gel de empilhamento de cerca de 4% e um gel de separação de cerca de 10% sob condições de redução e desnaturação.

Conforme aqui usado, uma "impressão digital de massa" refere- se a uma população de fragmentos de polipeptídeo obtidos de um polipeptíi- deo após digestão com uma protease. Tipicamente, os fragmentos de poli- peptídeo resultantes de uma digestão são analisados usando um método espectrométrico de massa. Cada fragmento de polipeptídeo é caracterizado . por uma massa, ou por uma razão de massa (m) para carga (z), que é refe- i rida como uma "razão m/z" ou um "valor m/z". Métodos para geração de umaimpressão digital de massa de um polipeptídeo são rotina. Um exemplo de tal método é revelado no Exemplo 13.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo regulado por metal. Conforme aqui usado, um "polipeptídeo regulado por metal" é um polipeptídeo que é expresso por um micróbio em um nível maior do que quando o micróbio é cultivado em condições com pouco metal com- parado com o cultivo do mesmo micróbio em condições com alto teor de me- tal. Condições de baixo teor de metal e alto teor de metal são descritas aqui. Por exemplo, uma classe de polipeptídeo regulado por metal produzido por Staphylococcus Spp. não é expressa em níveis detectáveis durante o cultivo domicróbio em condições com alto teor de metal, mas é expressa em níveis detectáveis durante o cultivo em condições com baixo teor de metal.

Exemplos de polipeptídeos regulados por metal isoláveis de S. aureus após cultivo em condições com baixo teor de ferro têm pesos mole- culares de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa e 33 kDa. E- xemplos de polipeptídeos regulados por metal isoláveis de S. aureus após cultivo em condições com baixo teor de cobre ou baixo teor de zinco têm pesos moleculares de 115 kDa, 88 kDa, 80 kDa, 71 kDa, 69 kDa, 35 kDa, 30 )

' kDa, 29 kDa e 27 kDa.

Exemplos adicionais de polipeptídeos regulados por metal inclu- em versões recombinantemente produzidas de polipeptídeos descritos aqui. Um polipeptídeo recombinantemente produzido pode incluir a sequência de aminoácido inteira traduzível a partir de um transcrito de MRNA. Alternati- vamente, um polipeptídeo regulado por metal produzido recombinantemente pode incluir um fragmento ou porção de toda a sequência de aminoácido traduzível. Por exemplo, um polipeptídeo regulado por metal produzido re- combinantemente pode não ter uma sequência clivável em nenhum terminal do polipeptídeo, por exemplo, uma sequência de sinal clivável no terminal amino do polipeptídeo. Desta maneira, um polipeptídeo regulado por metal pode ser um : polipeptídeo que incluí a sequência de aminoácido mostrada nas, por exem- plo, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:386, SEQIDNO:397, SEQ ID NO:408 e SEQ ID NO:419.

A presente invenção também inclui polipeptídeos que não são regulados por metal. Tais polipeptídeos são expressos na presença de um íon de metal tal como, por exemplo, na presença de cloreto férrico, e tam- bém expressos quando cultivados em condições com baixo teor de ferro.

Exemplos de tais polipeptídeos isoláveis de S. aureus têm pesos molecula- res de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa e 40 kDa. Se um polipeptídeo é um polipeptídeo regulado por metal ou não pode ser determinado através de métodos úteis para comparação da pre- sença de polipeptídeos, incluindo, por exemplo, filtragem em gel, eletrofore- se em gel incluindo eletroforese em gel de poliacrilamída com dodecilsulfato de sódio (PAGE-SDS), eletroforese capilar, espectrometria de massa e cro- matografia líquida incluindo HPLC. Culturas separadas de um micróbio são cultivadas sob condições de alto teor de metal e sob condições de baixo teor demetal, os polipeptídeos da presente invenção são isolados conforme des- crito aqui e os polipeptídeos presentes em cada cultura são separados e comparados. Tipicamente, uma quantidade igual de polipeptídeos de cada |

' cultura é usada. Preferivelmente, os polipeptídeos são separados usando um gel de poliacrilamida SDS tendo um gel de empilhamento de cerca de 4% e um gel de separação de cerca de 10% sob condições de redução e desnaturação. Por exemplo, 30 microgramas (ug) de polipeptídeo total de cada culturapodem ser usados e carregados em cavidades de um gel. Após ativação do gel e tingimento dos polipeptídeos com Coomasie Brilliant Blue, as duas faixas podem ser comparadas. Quando determinando se um poli- peptídeo é ou não expresso em um nível detectável, 30 ug de polipeptídeo total de uma cultura são separados em um Gel de PAGE-SDS e tingido com Coomasie Brilliant Blue usando métodos conhecidos na técnica. Um polipep- tídeo que pode ser visualizado pelo olho é considerado ser expresso em um Ú nível detectável, enquanto um polipeptideo que não pode ser visualizado : pelo olho é considerado não ser expresso em um nível detectável.

Alternativamente, se um polipeptídeo é regulado por metal ou não pode ser determinado usando análise de expressão de gene baseada em microdisposição. Culturas separadas de um micróbio são cultivadas sob condições de alto teor de metal e sob condições de baixo teor de metal, RNA é extraído das células de cada cultura e diferenças em expressão de RNA em células cultivadas em condições de alto teor de metal versus expressão deRNA em células cultivadas em condições de baixo teor de metal são de- tectadas e comparadas. Por exemplo, cDNA marcado pode ser preparado a partir de 8-10 ug de RNA bacteriano usando protocolos estabelecidos. O cCDNA marcado pode ser aplicado a uma microdisposição do genoma de S. aureus. Tais microdisposições estão comercialmente disponíveis e expres- sãode gene usando tais disposições é rotina.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ter atividade imu- nológica. "Atividade imunológica" refere-se à habilidade de um polipeptídeo em elicitar uma resposta imunológica em um animal. Uma resposta imunoló- gica para um polipeptídeo é o desenvolvimento em um animal de uma res- posta imune mediada por célula e/ou anticorpo para o polipeptídeo. Geral- mente, uma resposta imunológica inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos efeitos que seguem: a produção de anticorpos, células B, células T )

FERA a EANES ESMERALDAS 32/187 ' auxiliares, células T supressoras e /ou células T citotóxicas direcionadas a um epítopo ou epítopos do polipeptídeo. "Epítopo" refere-se ao sítio em um antígeno ao qual células B e/ou células T específicas respondem de maneira que anticorpo é produzido. A atividade imunológica pode ser protetora. "Ati- —vidade imunológica protetora" refere-se à habilidade de um polipeptídeo em elicitar uma resposta imunológica em um animal que previne ou inibe infec- ção por Staphylococcus spp., por exemplo, S. aureus. Se um polipeptídeo tem atividade imunológica protetora pode ser determinado através de méto- dos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, métodos descritos no Exemplo 5,9 ou 12. Por exemplo, um polipeptídeo da presente invenção, ou combinação de polipeptídeos da presente invenção, protege um roedor tal : como um camundongo contra provocação com Staphylococcus spp. Um po- . lipeptídeo da presente invenção pode ter atividade soroativa. "Atividade so- roativa" refere-se à habilidade de um polipeptídeo candidato em reagir com anticorpo presente em soro convalescente de um animal infectado com um Staphylococcus spp., por exemplo, S. aureus. Em alguns aspectos, o soro convalescente pode ser de um animal infectado com o isolato ATCC 19636, linhagem SAAV1, linhagem 2176 ou linhagem 1477. Os polipeptídeos da presente invenção podem ter atividade imunorreguladora. "Atividade imunor- reguladora" refere-se à habilidade de um polipeptídeo em agir de uma ma- neira não-específica para aumentar uma resposta imune a um antígeno par- ticular. Métodos para determinação de se um polipeptídeo tem atividade i- munorreguladora são conhecidos na técnica.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ter as característi- casde um polipeptídeo expresso por um micróbio de referência, isto é, um polipeptídeo de referência. As características podem incluir, por exemplo, peso molecular, impressão digital da massa, sequência de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos. O micróbio de referência pode ser um gram-positivo, preferivelmente um membro da família Micrococcaceae, pre- ferivelmente Staphylococcus spp., mais preferivelmente Staphylococcus au- reus. Exemplos preferidos de linhagens são detalhados na Tabela 1.

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FERRARI AREAS SEA Ca ts REA Sa aaa Catia a aa a a AE 33/187 Tabela 1. Linhagens bacterianas Quando o micróbio de referência é S. aureus isolato ATCC 19636, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa e tiver uma impressão digital de : massa que seja similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo re- gulado por metal expresso por um micróbio de referência e tendo um peso , molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa, respectivamente. Preferivelmente, tais polipeptídeos são regulados por me- tal. Por exemplo, um polipeptídeo candidato pode ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa e tiver uma im- pressão digital de massa similar à impressão digital de massa de um poli- peptídeo regulado por metal de 88 kDa produzido pela linhagem de referên- ciaS aureusisolato ATCC 19636.

Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus isolato ATCC 19636, um polipeptídeo candidato pode ser considerado um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que seja estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:408 ou SEQ ID NO:419.

Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus RF 122, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipepti- deoda presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:409 ou SEQ ID NO:420.

FEEL baia Eee 34/187 . Alternativamente, quando o micróbio de referência é S, aureus Mu50, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estru- turalmente simílar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:410 ou SEQ ID NO:421. Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus MRSAZ252, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipep- tídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:411 ou SEQ ID NO:422.

Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus MW?2, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estru- turalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:412 ou SEQ ID NO:423. Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus Newman, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipepti- deo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:413 ou SEQ ID NO:424.

Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus JH9, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estru- turalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:403, SEQ BD NO:414 ou SEQ ID NO:425. Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus US A300, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipepti- |

ERA EEE SONS E EA ECA CLS ESSE 35/187 ' deo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:415 ou SEQ ID NO:426.

Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus COL, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estru- turalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:416 ou SEQ ID NO:427. Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus NCTC 8325, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um poli- . peptídeo da presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à se- —quência de aminoácido da SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:406, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:428. Alternativamente, quando o micróbio de referência é S. aureus MSSAA476, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipep- tideoda presente invenção se ele tiver uma sequência de aminoácido que é estruturalmente similar, conforme descrito em detalhes abaixo, à sequência de aminoácido da SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:418 ou SEQ ID NO:429. Quando o micróbio de referência é isolato de S. aureus SAAV1, um polipeptídeo candidato pode ser considerado um polipeptídeo da presen- te invenção se ele tíver um peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa, e tem uma impressão digital de massa que é similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo expresso por um micróbio de referência e tendo peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa,36kDa,35kDa ou 33 kDa, respectivamente. Preferivelmente, tais polipeptídeos são regulados por metal. Por exemplo, um polipeptídeo candi- dato pode ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver um peso

ENE AEREAS ROSES SACA SE ASA SM Ea aa ADE 36/187 ' molecular de 88 kDa e tiver uma impressão digital de massa similar à im- pressão digital de massa de um polipeptideo regulado por metal de 99 kDa produzido pela linhagem de referência S. aureus isolato SAAV1. Quando o micróbio de referência é S. aureus linhagem 2176, um —polipeptíideo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presen- te invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa ou 32 kDa e tiver uma impressão digi- tal de massa que é similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo expresso por um micróbio de referência e tendo um peso molecular de 88 kDa,80 kDa,65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa ou 32 kDa, respectivamente.

Preferivelmente, tais polipeptídeos são regulados por me- tal.

Por exemplo, um polipeptídeo candidato pode ser um polipeptídeo da . presente invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa e tiver uma im- pressão digital de massa similar à impressão digital de massa de um poli- peptídeo regulado por metal de 88 kDa produzido pela linhagem de referên- cia S. aureus isolato 2176. Quando o micróbio de referência é S. aureus linhagem 1477, um polipeptídeo candidato pode ser considerado ser um polipeptídeo da presen- te invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa,37kDa,36kDa, 35 kDa, 33 kDa ou 32 kDa e tiver uma impressão digi- tal de massa que é similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo expresso por um micróbio de referência e tendo um peso molecular de 88 kDa, 80 kDa, 65 kDa, 55 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa, 33 kDa ou 32 kDa, respectivamente.

Preferivelmente, tais polipeptídeos são regulados por me- tal.

Por exemplo, um polipeptídeo candidato pode ser um polipeptídeo da presente invenção se ele tiver um peso molecular de 88 kDa e tiver uma im- pressão digital de massa similar à impressão digital de massa de um poli- peptídeo regulado por metal de 88 kDa produzido pela linhagem de referên- cia S. aureus isolato 1477. Conforme aqui usado, um polipeptídeo pode ser "estruturalmen- te similar" a um polipeptídeo de referência se a sequência de aminoácido do polipeptídeo possuir uma quantidade especificada de similaridade de se-

" quência e/ou identidade de sequência comparado com o polipeptídeo de referência. Um polipeptídeo pode ser também "estruturalmente similar" a um polipeptídeo de referência se o polipeptídeo exibir uma impressão digital de massa possuindo uma quantidade especificada de identidade comparado com uma impressão digital de massa comparável do polipeptídeo de refe- rência. Desta maneira, um polipeptídeo pode ser "estruturalmente similar" a um polipeptídeo de referência se, comparado com o polipeptídeo de referên- cia, ele possuir um nível suficiente de identidade de sequência de aminoáci- do, similaridade de sequência de aminoácido, similaridade de impressão di- gitaldemassa ou combinação dos mesmos. Similaridade de sequência de polipeptídeo e identidade de sequência de po- lipeptídeo 2 Similaridade estrutural de dois polipeptídeos pode ser determi- nada através do alinhamento dos resíduos dos dois polipeptídeos (por e- xemplo, um polipeptídeo candidato e qualquer polipeptídeo de referência apropriado descrito aqui) para otimizar o número de aminoácidos idênticos ao longo dos comprimentos de suas sequências; lacunas em uma ou ambas as sequências são permitidas na formação do alinhamento a fim de otimizar o número de aminoácidos idênticos, embora os aminoácidos em cada se- —quêncianão devam permanecer em sua ordem apropriada. Um polipeptídeo de referência pode ser um polipeptídeo descrito aqui ou qualquer polipepti- deo regulado por metal conhecido, conforme apropriado. Um polipeptídeo candidato é o polipeptídeo sendo comparado com o polipeptídeo de referên- cia. Um polipeptídeo candidato pode ser isolado, por exemplo, de um micró- bio, ou pode ser produzido usando técnicas recombinantes ou quimicamente ou enzimaticamente sintetizado.

A menos que modificado como de outra maneira descrito aqui, uma análise de comparação em par de sequências de aminoácido pode ser realizada usando o algoritmo BESTFIT no pacote GCG (versão 10.2, Madi- son WI) Alternativamente, os polipeptídeos podem ser comparados usando o programa Blastp do algoritmo de pesquisa BLAST 2, conforme descrito por Tatiana e outros (FEMS Microbio! Lett., 174, 247-250 (1999)), e disponível

SERES ESEC 38/187 no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os va- lores de default para todos os parâmetros de pesquisa BLAST 2 podem ser usados, incluindo matriz = BLOSUMG62; penalidade de lacuna aberta = 11, penalidade de lacuna de extensão = 1, lacuna x dropoff = 50, esperado =

10,tamanho da palavra = 3 e filtragem.

Na comparação de duas sequências de aminoácido, similaridade estrutural pode ser referida como "identidade percentual" ou pode ser referi- da como "similaridade" percentual. "Identidade" refere-se à presença de a- minoácidos idênticos. "Similaridade" refere-se à presença de não apenas aminoácidos idênticos, mas também a presença de substituições conservati- vas.

Uma substituição conservativa para um aminoácido em um polipeptídeo i da invenção pode ser selecionada de outros membros da classe à qual o : aminoácido pertence.

Por exemplo, é bem conhecido na técnica de bioquíi- mica de proteina que um aminoácido pertencente a um agrupamento de a- minoácidos tendo um tamanho ou característica particular (tal como carga, hidrofobicidade e hidrofilicidade) pode ser substituído por outro aminoácido sem alterar à atividade de uma proteína, particularmente em regiões da pro- teina que não estão diretamente associadas com atividade biológica.

Por exemplo, aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e tirosina.

Aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagi- na e glutamina.

Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina.

Os aminoácidos negativamente carregados (áci- dos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Substituições conservativas incluem, por exemplo, Arg por Lys e vice versa para manter uma carga posí- tiva; Asp por Glu e vice versa para manter uma carga negativa; Thr por Ser de maneira que um —OH livre seja mantido; e Asn por Glh para manter um NH> livre.

Da mesma maneira, análogos biologicamente ativos de um poli- peptídeo contendo deleções ou adições de um ou mais aminoácidos contí- — guos ou não-contíguos que não eliminam uma atividade funcional — tal co- mo, por exemplo, atividade imunológica — do polipeptídeo são também com-

preendidos. |

E a ASS EESC SEA SEADE ESC AAA 39/187 ' Desta maneira, conforme aqui usado, referência a um polipeptí- deo da presente invenção e/ou referência à sequência de aminoácido de uma ou mais SEQ ID NOs. pode incluir um polipeptídeo com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de similaridade de sequência de aminoácido com a se- quênciade aminoácido de referência. Alternativamente, conforme aqui usado, referência a um polipep- Ú tídeo da presente invenção e/ou referência à sequência de aminoácido de . uma ou mais SEQ ID NOs. pode incluir um polipeptíideo com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 28% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de amino- ácidode referência.

Consequentemente, um polipeptídeo da presente invenção pode incluir certas variantes incluindo, por exemplo, polipeptídeos homólogos que se originam — biologicamente e/ou recombinantemente — de espécies ou li- nhagens microbianas outras que não a espécie ou linhagem microbiana a —partirda qual o polipeptídeo foi originalmente isolado e/ou identificado.

Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um poli- peptídeo geralmente conhecido como formato acetiltransferase (PfIB). Uma modalidade deste polipeptídeo é refletida na SEQ ID NO:353. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 e SEQ ID NO:363.

Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir |

' um polipeptídeo geralmente conhecido como oligopeptídeo permeasse, pro- teina de ligação a peptídeo (Opp1A). Uma modalidade deste polipeptídeo é refletida na SEQ ID NO:364. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID —NO:369, SEQIDNO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:373 e SEQ ID NO:374.

Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo geralmente conhecido como proteína de ligação a transpor- tador ABC de composto sideróforo (SirA). Uma modalidade deste polipepti- deoé refletidanaSEQ ID NO:375. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID i NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384 . e SEQ ID NO:385.

Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo algumas vezes referido aqui como SYN2. Uma modalidade deste polipeptídeo é refletida na SEQ ID NO:386. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395 e SEQ ID NO:396.

Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo geralmente conhecido como lipoproteína de ligação a hidro- xamato férrico (FhuD). Uma modalidade deste polipeptídeo é refletida na SEQ ID NO:397. Modalidades variants são refletidas nas SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 e SEQ ID NO:407.

Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo algumas vezes referido aqui como SYN1. Uma modalidade deste polipeptídeo é refletida na SEQ ID NO:408. Modalidades variants são refletidas nas SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 e SEQ ID NO:418.

ESEC SRA o ECOS Sa CA SAAE MEDA EE CASSA Saias 41/187 | ' Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo geralmente conhecido como proteína de membrana de sis- tema de transporte de manganês (MntC). Uma modalidade deste polipepti- deo é refletida na SEQ ID NO:419. Modalidades variantes são refletidas nas —SEQIDNO:420,SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 e SEQ ID NO:429. Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo geralmente conhecido como lipoproteína transportadora ABC de ferricromo (SstD). Modalidades deste polipeptídeo são refletidas nas SEQ ID NO:543, SEQ ID NO:544, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:546, SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:549, SEQ ID NO:550, SEQ ID NO:551 . e SEQ ID NO:552. Como outro exemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir um polipeptídeo geralmente conhecido como transportador ABC de compos- to de ferro (FhuD2). Modalidades deste polipeptídeo são refletidas nas SEQ ID NO:553, SEQ ID NO:554, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:556, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:561 e SEQ ID NO:562. Um polipeptídeo da presente invenção pode ser também proje- tado para prover uma ou mais sequências adicionais tal como, por exemplo, a adição de sequências de codificação a aminoácidos C-terminais e/ou N- terminais adicionados que podem facilitar a purificação através de aprisio- namento em colunas ou uso de anticorpos.

Tais tags incluem, por exemplo, tagsricas em histidina que permitem a purificação de polipeptídeos em colu- nas de níquel.

Tais técnicas de modificação de gene e sequências adicionais adequadas são bem conhecidas na técnica de biologia molecular, Um polipeptídeo da presente invenção pode ser também proje- tado de maneira que certos aminoácidos no C-terminal e/ou N-terminal se- jam deletados.

Por exemplo, uma diferença entre as sequências de aminoá- cido de SEQ ID NO:364 e SEQ ID NO:365 é que a SEQ ID NO:365 possui uma adição de aminoácido 29 N-terminal que não está presente na sequên- |

AREA ENA SAAE EESC CCC ECA Ada 42/187 ' cia de aminoácido do polipeptídeo de referência da SEQ ID NO:364. Adições N-terminais exemplares similares, tipicamente variando de a partir de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, são aparentes quando uma pessoa compara, por exemplo, a sequência de aminoácido do peptídeo de referência da SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:408 ou SEQ ID NO:419 com certas modalidades variantes do respectivo polipeptídeo de referência. Outras adi- ções e/ou deleções de aminoácido, ou no N-terminal ou no C-terminal, são possíveis.

Uma "modificação" de um polipeptídeo da presente invenção in- clui polipeptídeos (ou análogos dos mesmos tais como, por exemplo, seus fragmentos) que são quimicamente ou enzimaticamente derivatizados em : um ou mais aminoácido constituinte. Tais modificações podem incluir, por exemplo, modificações de cadeia lateral, modificações de estrutura principal emodificações N- e C-terminais tais como, por exemplo, acetilação, hidroxi- lação, metilação, amidação, e a ligação de porções carboidrato ou lipídeo, co-fatores, e similar, e suas combinações. Os polipeptídeos modificados da invenção podem reter a atividade biológica — tal como, por exemplo, ativida- de imunológica — do polipeptídeo não-modifícado ou pode exibir uma ativi- dade biológica reduzida ou aumentada. Os polipeptídeos da presente invenção (incluindo seus análogos biologicamente ativos e suas modificações) incluem polipeptídeos nativos (de ocorrência natural), recombinantes e quimicamente ou enzimaticamente sintetizados. Por exemplo, um polipeptídeo da presente invenção pode ser preparado através do isolamento do polipeptídeo a partir de uma fonte natu- ral ou pode ser preparado recombinantemente através de métodos bem co- nhecidos incluindo, por exemplo, preparação como proteínas de fusão em bactérias ou outras células hospedeiro. Os polipeptídeos expressos por um micróbio de referência po- dem ser obtidos através do cultivo dos micróbios de referência sob condi- ções com baixo teor de metal e o subsequente isolamento de um polipeptí- deo através dos processos revelados aqui. Alternativamente, os polipepti- |

TARA ADS AAAENA AA SEO ESSA a aa a aa aa ala aaa Saia aa as ia ca aa Ea A: EE 43/187 " deos expressos por um micróbio de referência podem ser obtidos através da identificação de genes expressos em níveis maiores quando o micróbio é cultivado em condições com baixo teor de metal — isto é, genes regulados por metal. Os genes regulados por metal podem ser clonados e expressos e os polipeptídeos regulados por metal expressos podem ser identificados a- través dos processos descritos aqui. Um polipeptídeo candidato pode ser isolado de um micróbio ou identificado a partir de um micróbio, preferivel- mente um micróbio gram-positivo, mais preferivelmente um membro da famí- lia Micrococcaceae, preferivelmente Staphylococcus spp., mais preferivel- mente Staphylococcus aureus.

Outros micróbios gram-positivos a partir dos quais polipeptídeos podem ser isolados e/ou identificados incluem Corynebacterium spp., Ente- . rococcus spp., Erysipelothrix spp., Kytococeus spp. e Micrococeus spp., My- cobacterium spp. e Erysipelothrix spp. Um polipeptídeo candidato pode ser também produzido usando técnicas enzimáticas ou químicas. Similaridade de impressão digital de massa Um polipeptídeo candidato pode ser avaliado através de análise de especirometria de massa para determinar se o polipeptídeo candidato tem uma impressão digital de massa similar a um dos polipeptídeos expres- sos por um micróbio de referência e referido acima pelo peso molecular. Ti- picamente, o polipeptídeo candidato pode ser isolado, por exemplo, através de separação do polipeptídeo candidato através de eletroforese em gel e excisão da porção do gel contendo o polipeptídeo candidato. Qualquer mé- todo de eletroforese em gel que separe polipeptídeos com base em caracte- rísticas diferentes pode ser usado, incluindo eletroforese em gel 1 dimensio- nal ou 2 dimensional, bem como separação cromatográfica líquida com base em, por exemplo, hidrofobicidade, pl ou tamanho. O polipeptídeo candidato pode ser fragmentado, por exemplo, através de digestão com uma protease. Preferivelmente, a protease pode clivar a ligação de peptídeo no lado carbó- xiterminal do aminoácido lisina e do aminoácido arginina, exceto quando o aminoácido seguindo a lisina ou a arginina é uma prolina. Um exemplo de tal protease é tripsina. Métodos para digestão de um polipeptídeo com tripsina |

E ENE AAA SES SECA SACA A Seas - 44/187 ' são rotina e conhecidos na técnica.

Um exemplo de tal método é revelado no Exemplo 13. Métodos para análise espectrométrica de massa de polipeptí- deos são rotina e conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, espectroscopia de massa por tempo de voo com dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI-TOF MS). Tipicamente, uma mistura con- tendo os fragmentos de polipeptídeo obtidos de um polipeptídeo candidato é misturada com uma matriz que funciona para transformar a energia de /aser para a amostra e produzir fragmentos de polipeptídeo ionizados, preferivel- mente monoisotópicos.

Exemplos de matrizes que podem ser usadas inclu- em, por exemplo, ácido sinapínico ou ácido ciano-4-hidroxicinâmico.

Um e- xemplo de um método para a análise de polipeptídeos através de MALDI- . TOF MS é descrito no Exemplo 13. Os fragmentos de polipeptídeo ionizados são separados de acordo com sua razão m/z e detectados para dar um es- —pectro de razão m/z versus intensidade.

O espectro inclui valores m/z que representam os fragmentos de polipeptídeo derivados do polipeptídeo can- didato.

Para qualquer dado polipeptídeo, a quantidade de cada fragmento de polipeptídeo resultante de uma digestão com tripsina deve ser equimolar, No entanto, é conhecido que digestão com tripsina não é sempre 100% eficien- te, por exemplo, alguns sítios são mais eficientemente clivados.

Desta ma- neira, quando MALDI-TOF MS é usada para determinar valores m/z, a inten- sidade de cada valor m/z é tipicamente não-idêntica.

Em geral, um espectro tem um nível de base de ruído presente na maior parte do eixo x (isto é, o eixo tendo os valores das razões m/z). Este nivel de base de ruído varia de- —pendendo das condições de atividade e da máquina usada, e é facilmente identificado através de inspeção visual do espectro.

Um valor m/z é geral- mente considerado representar um fragmento de polipeptídeo quando a in- tensidade é pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior ou pelo menos 4 vezes maior do que o nível de base de ruído.

O espectro geralmen- te inclui outros valores m/z que são artefatos resultantes de, por exemplo, digestão incompleta, digestão excessiva, outros polipeptídeos que podem estar presentes na mistura ou a protease usada para digerir o polipeptídeo )

FEED SEIA AAA REA 45/187 ' incluindo valores m/z resultantes de autólise da protease. Este método de digestão de um polipeptídeo com uma protease é reconhecido na técnica como resultando em uma impressão digital de massa de maior especificida- de que pode ser usada para caracterizar precisamente o polipeptídeo e dis- tinguilode outros polipeptídeos.

Neste aspecto da invenção, quando um polipeptídeo candidato é analisado através de espectroscopia de massa, preferivelmente ambos o polipeptídeo candidato e o polipeptídeo do micróbio de referência são prepa- rados e analisados juntos, desta maneira diminuindo quaisquer artefatos po- tenciais resultantes de diferenças em manuseamento de amostra e condi- ções de atividade. Preferivelmente, todos os reagentes usados para preparar a analisar os dois polipeptídeos são iguais. Por exemplo, o polipeptídeo do . micróbio de referência e o polipeptídeo candidato são isolados sob substan- cialmente as mesmas condições, fragmentados sob substancialmente as mesmas condições e analisados através de MALDI-TOF MS na mesma má- quina sob substancialmente as mesmas condições. Um polipeptídeo candi- dato pode ser considerado ser "estruturalmente similar" a um polipeptídeo de referência se ele exibir uma impressão digital de massa possuindo pelo me- nos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou substancialmente todos dos —valoresm/z presentes no espectro do polipeptídeo do micróbio de referência e acima do nível de ruído de base estiverem também presentes no espectro do polipeptídeo candidato. (Vide, por exemplo, Publicação do Pedido de Pa- tente Norte-Americano No. 2006/0233824 A1). Em outro aspecto, um polipeptídeo pode ser considerado ser um —polipeptídeo da presente invenção se ele tiver um peso molecuiar de um po- lipeptídeo de referência descrito na Tabela 2, 3, 4 ou 5 e tiver uma impres- são digital de massa que ínclua uma subpopulação incluindo pelo menos uma porcentagem especificada dos fragmentos de polipeptídeo do polipepti- deo de referência conforme listado na Tabela 2, 3, 4 ou 5. Por exemplo, um —polipeptídeo da presente invenção inclui um polipeptideo de 88 kDa e uma impressão digital de massa que inclui uma porcentagem especificada de fragmentos de polipeptídeo tendo massas de HVDVR (SEQ ID NO: 1), YS- |

SEEN aa MESA Ms CC nana 46/187 ' YER (SEQ ID NO: 2), IIGDYRR (SEQ ID NO: 3), IFTDYRK (SEQ ID NO: 4), ELKELGOK (SEQ ID NO: 5), YAQVKPIR (SEQ ID NO: 6), QMQFFGAR (SEQ ID NO: 7), SMQPFGGIR (SEQ ID NO: 8), VSGYAVNFIK (SEQ ID NO: 9), NHATAWQGFK (SEQ ID NO: 10), LWEQVMQLSK (SEQ ID NO: 11), SLGKEPEDONR (SEQ ID NO: 12), DGISNTFSIVPK (SEQ ID NO: 13), AG- VITGLPDAYGR (SEQ ID NO: 14), TSTFLDIYAER (SEQ ID NO: 15), SMQPFGGIRMAK (SEQ ID NO: 16), THNOGVFDAYSR (SEQ ID NO: 17), KAGVITGLPDAYGR (SEQ ID NO: 18), TLLYAINGGKDEK (SEQ ID NO: 19), IEMALHDTEIVR (SEQ ID NO: 20), AGEPFAPGANPMHGR (SEQ ID NO: 21), VALYGVDFLMEEK (SEQ ID NO: 22), KTHNQGVFDAYSR (SEQ ID NO: 23), YGFDLSRPAENFK (SEQ ID NO: 24), TSSIQYENDDIMR (SEQ ID NO: 25), KAGEPFAPGANPMHGR (SEQ ID NO: 26), RVALYGVDFLMEEK (SEQ . ID NO: 27), LIWVEQVMQLSKEER (SEQ ID NO: 28), MLETNKNHATAWQGFK (SEQ ID NO: 29), MHDFNTMSTEMSEDVIR (SEQ ID NO: 30), YGNND- DRVDDIAVDLVER (SEQ ID NO: 31), ETLIDAMEHPEEYPQLTIR (SEQ ID NO: 32), YAQVKPIRNEEGLVVDFEIEGDFPK (SEQ ID NO: 33).

A impressão digital de massa de um polipeptídeo candidato po- de ser determinada através de um método espectrométrico de massa, por exemplo, através de MALDI-TOF MS. A impressão digital de massa de um polipeptídeo candidato terá geralmente fragmentos de polipeptídeo adicio- nais e, então, pode ter valores m/z adicionais outros que não aquelas lista- dos para um polipeptídeo na Tabela 2, 3, 4 ou 5. Quando o polipeptídeo candidato está sendo comparado com um polipeptídeo na Tabela 2, 3, 4 ou 5, o polipeptídeo candidato pode ser isolável de um micróbio, preferivelmen- te um micróbio gram-positivo, mais preferivelmente um membro da família Micrococcaceae, preferivelmente Staphylococcus spp., mais preferivelmente Staphylococcus aureus. Outros micróbios gram-posiítivos incluem Coryne- bacterium spp., Enterococcus spp., Erysipelothrix spp., Kyfococcus spp., Lis- teria spp., Micrococeus Spp., and Mycobacterium spp. e Erysipelothrix spp.

Um polipeptídeo candidato pode ser obtido através do cultivo de um micróbio sob condições de baixo teor de metal e o isolamento subse- quente de um polipeptídeo através dos processos descritos aqui. Alternati-

' vamente, um polipeptídeo candidato pode ser obtido através de expressão recombinante de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo candidato.

É bem conhecido na técnica que modificações de aminoácido podem ser acidentalmente introduzidas durante o manuseamento da amos- tra, tal como oxidação, e formação de derivados de carbamidometila.

Ainda, esses tipos de modificações alteram o valor m/z de um fragmento de poli- peptídeo.

Por exemplo, se um fragmento de polipeptídeo contiver uma meti- onina que é oxidada, o valor m/z será aumentado em 16 com relação ao mesmo fragmento que não contém a metionina oxidada.

Desta maneira, a- queles fragmentos de polipeptídeo na Tabela 2, 3, 4 ou 5 tendo a notação "oxidação (M)" têm um valor m/z que é aumentado em 16 com relação ao mesmo fragmento que não contém a metionina oxidada.

É compreendido . que os fragmentos de polipeptídeo da Tabela 2, 3, 4 ou 5 pode ser modifica- do durante o manuseamento da amostra.

Similaridade de sequência de polinucleotídeo e identidade de sequência de polinucleotideo Os polipeptídeos da invenção podem ser também identificados em termos dos polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo.

Desta manei- ra, a invenção inclui polinucleotíideos que codificam um polipeptídeo da in- venção ou hibridizam, sob condições de hibridização padrão, para um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, e os complementos de tais sequências de polinucleotídeo.

Conforme aqui usado, referência a um polinucleotídeo da pre- sente invenção e/ou referência à sequência de ácido nucleico de uma ou maisSEQID NOs. podem incluir polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de polinucleotideo de referência identificada.

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FAESA aaa aa 75/187 Neste contexto, "identidade de sequência" refere-se à identidade entre duas sequências de polinucleotídeo. Identidade de sequência é geral- mente determinada pelo alinhamento das bases dos dois polinucleotídeos (por exemplo, alinhamento da sequência de nucleotídeo da sequência can- didatae uma sequência de nucleotídeo que inclui, por exemplo, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:474 ou SEQ ID NO:485) para otimizar o nú- mero de nucleotídeos idênticos ao longo dos comprimentos de suas sequên- cias; lacunas em uma ou ambas as sequências são permitidas na realização do alinhamento a fim de otimizar o número de nucleotídeos compartilhados, embora o nucieotíideo em cada sequência deva permanecer em sua ordem própria. Uma sequência candidata é a sequência sendo comparada com uma sequência conhecida — por exemplo, uma sequência de nucleotídeo . que inclui a sequência de nucleotídeo da, por exemplo, SEQ ID NO:474 ou SEQ ID NO:485. Por exemplo, duas sequências de nucleotídeo podem ser comparadas usando o programa Blastn do algoritmo de pesquisa BLAST 2, conforme descrito por Tatiana e outros, FEMS Microbio! Lett., 1999; 174: 247-250 e disponível na world wide web em ncbi.nim.nih.gov/BLAST. Os valores default para todos os parâmetros de pesquisa BLAST 2 podem ser usados, incluindo recompensa para compatibilidade = 1, penalidade para faltade compatibilidade = -2, penalidade de lacuna aberta = 5, penalidade de lacuna de extensão = 2, lacuna x. dropoíf = 50, esperado = 10, tamanho da palavra = 11 e filtrar.

Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como formato acetiltransferase (PfIB). Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:430. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO:434, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:436, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:439 e SEQ ID NO:440.

Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como oligonucleotídeo permease, proteína de ligação de peptide (Opp1A).

|

Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:441. Moda- lidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:442, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:444, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:450 e SEQ ID NO:451.

Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como proteína de ligação a transportador ABC de composto sideróforo (Si- rA). Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:452. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:454, SEQIDNO:455, SEQ ID NO:456, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:461 e SEQ ID NO:462.

Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- . cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo referido aqui como SYN2. Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:463.

Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:465, | SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:472 e SEQ ID NO:473.

Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptíideo geralmente conhecido como FhuD. Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:474. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:476, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:479, SEQ |D NO:480, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:482, SEQ ID NO:483e SEQ ID NO:484, Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo referido aqui como SYN1. Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:485. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:486, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:489, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:491, SEQ ID —NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:4894 e SEQ ID NO:495.

Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como MntC. Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:496. Uma modalidade de tal polinucleotídeo é refletida na SEQ ID NO:496. Modalidades variantes são refletidas nas SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ |D NO:502, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:504, SEQ ID NO:505 e SEQ ID NO:506.

Como outro exemplo, um polinucleotideo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como lipoproteína transportadora ABC de ferricromo (SstD). Modalidades de tal polinucleotídeo são refletidas como SEQ ID NO:563, SEQ ID NO:564, SEQ ID NO:565, SEQ ID NO:566, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID i NO:569, SEQ ID NO:570, SEQ ID NO:571 e SEQ ID NO:572. . Como outro exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode in- cluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geralmente conhecido como transportador ABC de composto de ferro (FhuD2). Modalidades de tal polinucleotídeo são refletidas nas SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:578, SEQ |ID NO:579, SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:581 e SEQ ID NO:582. São também providas pela presente invenção preparações de célula integral de um micróbio, onde o micróbio expressa um ou mais dos polipeptídeos da presente invenção. As células presentes em uma prepara- ção de célula integral são preferivelmente inativadas de maneira que as cé- lulas não possam replicar, mas a atividade imunológica dos polipeptídeos da presente invenção expressa pelo micróbio é mantida. Tipicamente, as célu- lassão mortas através de exposição a agentes tal como glutaraldeído, for- malina ou formaldeído. Composições Uma composição da presente invenção pode incluir pelo menos um polipeptídeo isolado descrito aqui ou vários polipeptídeos que é um intei- ro maior do que um (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro). Por exemplo, uma composição pode incluir um polipeptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408 e/ou um polipeptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397. A menos que um nível específico de similaridade e/ou identidade de sequência seja expressamente identificado aqui (por exemplo, pelo menos 80% de similaridade de sequência, pelo menos 90% de identidade de se- quência, etc), referência à sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO. identificada inclui variantes tendo os níveis de similaridade de sequência e/ou os níveis de identidade de sequência descritos aqui na seção intitulada "Símilaridade de sequência de polipeptídeo e identidade de sequência de polipeptídeo”.

Em algumas modalidades, a composição pode incluir um ou mais polipeptídeos isolados adicionais. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo ou polipeptídeos isolados adicionais podem incluir um ou mais polipep- . tídeos regulados por metal. Desta maneira, uma composição pode incluir pelo menos um polipeptideo regulado por metal isolado que inclui uma se- quência de aminoácido mostrada em uma ou mais de SEQ ID NO:353 até SEQ ID NO:429 e/ou uma ou mais de SEQ ID NO:543 até SEQ ID NO:562, Adicionalmente ou alternativamente, uma composição pode incluir pelo me- nos um polipeptídeo regulado por metal isolado tendo um peso molecular de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa. Adicionalmente ou alternativamente, uma composição pode incluir pelo menos um polipepti- deo isolado regulado por metal que inclui uma sequência de aminoácido co- dificada por um polinucleotídeo que inclui uma sequência de nucleotídeo mostrada em uma ou mais de SEQ ID NO:;430 até a SEQ ID NO:506 e/ou uma ou mais de SEQ ID NO:563 até a SEQ ID NO:582.

Em uma modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:397 (ou uma va- riante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ |D NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID —NO:404,SEQIDNO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407).

Em outro modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:408 (ou uma variante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418).

Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:419 (ou uma va- riante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426,SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 ou SEQ ID NO:429).

Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:375 (ou uma va- . riante da mesma, tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ |D NO378 SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384 ou SEQ ID NO:385).

- Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:386 (ou uma va- riante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ |ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392, SEQ |D NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395 ou SEQ ID NO:3986).

Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:364 (ou uma va- riante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ |D NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:373 ou SEQ ID NO:374).

Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que incluiasequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:353 (ou uma va- riante da mesma tal como, por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ |D

NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 ou SEQ ID NO:363), Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido, ou uma variante da mesma, de qualquer umadas sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:543, SEQ ID NO:544, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:546, SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:549, SEQ ID NO:550, SEQ ID NO:551 ou até SEQ ID NO:552. Em outra modalidade, a composição inclui um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido, ou variante da mesma, de qualquer uma das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO:553, SEQ ID i NO:554, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:556, SEQ ID NO:557, SEQ |ID . NO:558, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:561 ou SEQ ID NO:562.

Em algumas modalidades, a composição pode incluir uma com- | binação de dois ou mais polipeptídeos selecionados do que segue: um poli- , peptídeo SNY, um polipeptídeo MntC, um polipeptídeo FhuD, um polipepti- deo SYN2, um polipeptídeo SirA, um polipeptídeo Opp1A e um polipeptídeo Pflb.

Desta maneira, a composição pode incluir pelo menos um ou uma combinação que inclui pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou todos os sete de: um polipep- tídeo SYN1, um polipeptídeo MntC, um polipeptídeo FhuD, um polipeptídeo SYN2, um polipeptídeo SirA, um polipeptídeo Opp1A e um polipeptídeo Pflb.

Composições exemplares que incluem combinações de polipeptídeos são identificadas na Tabela 6.

[ Composição | sYN1 | MntC | FhuD | syn2 | Sia | Oppia | Pre | [2 pPeptigens O OA a nn Ke

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| Composição | SYN1 | Mntc | EhuD | SYN2 | sia | Opp1a | Pro | a a a Au a a ae as La o as as a az a a as aa | se x x x Ls xx x | | se px Ls XxX XxX x | : Il sa [fd jo px | x | za ss [x | ' Ls x [x [x [a peptídeos | X | x [x x | o DD x 1 ss x o se x o a sex a e

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| Composição | SYN1 | MntC | FhuD | SYN2 | Sra | Oppta | Pro | za NX | za x O zo RR x | sa O x | zo x a a oz x x La a a 8 x XxX] x x |) Lo x x x | aa a x | 88 | | x | | x [x | x | | aa O Las a x | as a x | Lg | Px x x | x |) : 88 Dx x xXx x) aa O ' o xXx DX XxX Dx) La x XxX x PR A ço 2 | x x x x

LB q x x Dx x a a as x o a a a La x x x as x XxX x x x es x XxX x o dx x x x x ar a O x | e dx | px | x | x | x | Re eo o a O Les RR XxX)

[composição | sYyn1 | wmC T FnuD | vz | Sra | Oopia TPM] aos XX | x | Lo a e es x x X px x XX XxX | ca Do o Par Do o oo ar RX XX Dx [SpPeptaeoss| | | y ago x x x x x E E a Es x x TA Deo DD Fe E mo x Dx x Tx] ' * pPeptídeos = polipeptideos "X" identifica polipeptídeos incluídos em uma composição particular.

Em todo o relatório, um polipeptídeo SYN1 pode ser caracteriza- do por uma ou mais do que segue: uma sequência de aminoácido que inclui a sequênciade aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418, sendo codificada por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:485, SEQIDNO:486, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:489, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:491, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495, e/ou um peso molecular calculado de cerca de 33,1 kDa.

Em todo o relatório, um polipeptídeo MntC pode ser caracteriza- doporum ou mais do que segue: possuir um peso molecular conforme de- terminado através de SDS-PAGE de 33 kDa, uma impressão digital de mas- sa de pelo menos 80% similar à impressão digital de massa de um polipepti- deo regulado por metal de 33 kDa produzido pela linhagem de referência S.

aureus isolato ATCC 19636, uma sequência de aminoácido que inclui a se- quência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ |ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 ouSEQID NO:429, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:496, SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:504, SEQ ID NO:505 ou SEQ ID NO:506, e/ou peso molecular calculado de cerca de 34,6 kKDa.

Em todo o relatório, um polipeptídeo FhuD pode ser caracteriza- do por um ou mais do que segue: uma sequência de aminoácido que inclui a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:397, . SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:474, - SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:476, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:479, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:482, SEQ ID NO:483 ou SEQ ID NO:484, e/ou peso molecular calculado de cerca de 35,4 kDa.

Em todo o relatório, um polipeptídeo SYN2 pode ser caracteriza- do por um ou mais do que segue: um peso molecular conforme determinado através de SDS-PAGE de 36 kDa, uma impressão digital de massa de pelo menos 80% similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo regula- do por metal de 36 kDa produzido pela linhagem de referência S. aureus isolato ATCC 19636, uma sequência de aminoácido que inclui a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395 ou SEQ ID NO:396, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:472 |

Ea as E aaa to pro EEE EEE SEASON SESC SEEN CENAS 86/187 ou SEQ ID NO:473, e/ou peso molecular calculado de cerca de 36,5 kDa. Em todo o relatório, um polipeptídeo SirA pode ser caracterizado por um ou mais do que segue: um peso molecular conforme determinado por SDS-PAGE de 37 kDa, uma impressão digital de massa de 80% similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo regulado por metal de 37 kDa produzido pela linhagem de referência S. aureus isolato ATCC 19636, uma sequência de aminoácido que inclui a sequência de aminoácido mos- trada em qualquer uma de SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ |D NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384 ou SEQ ID NO:385, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:452, SEQ ID . NO:453, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO455, SEQ ID NO:456, SEQ |ID NO:457, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:461 ou SEQ ID NO:462, e/ou um peso molecular calculado de cerca de 36,6 i kDa.

é Em todo o relatório, um polipeptídeo Opp1A pode ser caracteri- zado por um ou mais do que segue: um peso molecular conforme determi- nado através de SDS-PAGE de 55 kDa, uma impressão digital de massa de pelomenos 80% similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo regulado por metal de 55 kDa produzido pela linhagem de referência S. au- reus isolato ATCC 19636, uma sequência de aminoácido que incluí a se- quência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID —NO:369, SEQIDNO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:373 ou SEQ ID NO:374, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:442, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:444, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:450 ouSEQ ID NO451, e/ou um peso molecular calculado de cerca de 59,9 kDa.

Em todo o relatório, um polipeptídeo PfIB pode ser caracterizado por um ou mais do que segue: um peso molecular conforme determinado através de SDS-PAGE de 88 kDa, uma impressão digital de massa de 80% similar à impressão digital de massa de um polipeptídeo regulado por metal de 88 kDa produzido pela linhagem de referência S. aureus isolato ATCC 19636, uma sequência de aminoácido que inclui a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ |D NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 ou SEQ ID NO:363, sendo codificado por um polinucleotídeo que inclui a sequência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO:434, SEQ ID | NO:435, SEQ ID NO:436, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:439 . ou SEQ ID NO:440, e/ou um peso molecular calculado de cerca de 84,7 kDa. : 15 Em outra modalidade particular, a composição pode incluir uma combinação de polipeptídeos tais como, por exemplo, um polipeptídeo MntC, - um polipeptídeo FhuD, um polipeptídeo SirA e um polipeptídeo SYN2 (Com- posição 77 da Tabela 6), cada polipeptíideo sendo caracterizado conforme descrito imediatamente acima.

Em algumas modalidades, uma composição pode incluir um ou mais polipeptídeos que são produzidos recombinantemente. Por exemplo, uma composição pode incluir um polipeptídeo Pflb recombinantemente pro- duzido tal como, por exemplo, um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:353, embora um polipeptídeo Pflb re- combinantemente produzido possa ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo Pflb pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinantemente produzido. Tal composição pode incluir um ou mais polipeptídeos recombinantemente produzidos, um ou mais poli- peptídeos isolados de S. aureus ou qualquer combinação dos mesmos.

Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- tídeo Opp1A recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um poli- peptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID

NO:364, embora um polipeptídeo Opp1A recombinantemente produzido possa ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo Opp1A pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombi- nantemente produzido. Tal composição pode incluír ainda um ou mais poli- peptídeos recombinantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isola- dos de S. aureus ou qualquer combinação dos mesmos.

Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- tídeo SirA recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um polipep- tídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:375, embora um polipeptídeo SirA recombinantemente produzido possa ser ca- racterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo SirA pode ser carac- terizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinantemente pro- - duzido. Tal composição pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos recom- binantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isolados de S. aureus : 15 ou qualquer combinação dos mesmos. Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- . tideo SYN2 recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um poli- peptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:386, embora um polipeptídeo SYN2 recombinantemente produzido pos- sa ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo SYN2 pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinante- mente produzido. Tal composição pode incluir ainda um ou mais polipepti- deos recombinantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isolados de S. aureus ou qualquer combinação dos mesmos.

Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- tídeo FhuD recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um poli- peptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ |D NO:397, embora um polipeptídeo FhuD recombinantemente produzido possa ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo FhuD pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinantemente produzido. Tal composição pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos re- combinantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isolados de S. au-

reus ou qualquer combinação dos mesmos.

Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- tídeo SYN1 recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um poli- peptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID —NO:408, embora um polipeptideo SYN1 recombinantemente produzido pos- sa ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptídeo SYN1 pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinante- mente produzido. Tal composição pode incluir ainda um ou mais polipepti- deos recombinantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isolados de S aureus ou qualquer combinação dos mesmos.

Como outro exemplo, uma composição pode incluir um polipep- tídeo MntC recombinantemente produzido tal como, por exemplo, um poli- . peptídeo que inclui a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:419, embora um polipeptídeo MntC recombinantemente produzido possa : 15 ser caracterizado de qualquer maneira onde um polipeptíideo MntC pode ser caracterizado, conforme descrito acima, em adição a ser recombinantemente - produzido. Tal composição pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos re- combinantemente produzidos, um ou mais polipeptídeos isolados de S. au- reus ou qualquer combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinantemente produzido pode representar um fragmento imunologicamente ativo da versão nativa do polipeptídeo. Um fragmento imunologicamente ativo pode incluir adições de aminoácido ao terminal amino e/ou terminal carbóxi do núcleo (por exemplo, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 364, SEQIDNO: 375, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 408 ou SEQ ID NO: 419) do fragmento imunologicamente ativo, Em certas moda- lidades, qualquer adição ao terminal amino do núcleo do fragmento imunolo- gicamente ativo pode incluir uma ou mais adições, deleções, substituições de aminoácido (coletivamente "modificações") ou qualquer combinação de modificação comparado com versão mais longa — por exemplo, tipo selva- gem ou outra forma nativa — do polipeptídeo. Desta maneira, por exemplo, em modalidades onde o fragmento imunologicamente ativo inclui SEQ ID

SB BRA NANA CAROS 290/187 NO:397, uma adição ao terminal amino da SEQ ID NO:397 pode incluir pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelomenos 16, pelomenos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo me- nos 25 ou pelo menos 26 modificações na adição do terminal amino, por e- xemplo, aminoácidos 1-26 da SEQ ID NO:399. Como outro exemplo, em modalidades onde o fragmento imunologicamente ativo inclui SEQ ID NO:408, uma adição ao terminal amino da SEQ ID NO:408 pode incluir pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 modi- ficações na adição do terminal amino comparado com, por exemplo, os ami- . noácidos 1-26 da SEQ ID NO:415. ' Quando comparando a similaridade de sequência de aminoácido : 15 e/ou identidade de sequência de aminoácido de um polipeptídeo de referên- cia e um polipeptídeo candidato de um comprimento diferente (por exemplo . um fragmento imunologicamente ativo do polipeptídeo de referência) a simi- laridade e/ou identidade pode ser computada em um comprimento integral do polipeptídeo mais longo, contando cada resíduo de aminoácido de com- primento maior no polipeptídeo mais longo contribuindo como uma divergên- cia.

Em algumas modalidades, desta maneira, um polipeptídeo iso- lado da invenção pode incluir um polipeptídeo tendo pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos97%, pelomenos 98% ou pelo menos 99% de similaridade e/ou identi- dade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 397, contanto que se o polipeptídeo isolado incluir um ou mais aminoácidos adi- cionais no terminal amino, o um ou mais aminoácidos adicionais incluem pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoácidos 1-26 da SEQ ID NO:399, Em outras modalidades, um polipeptídeo isolado da invenção pode incluir um polipeptídeo tendo pelo menos 98% ou pelo menos 99% de stntiala cadeia saharaui A calada E adoro MARA 91/187 similaridade e/ou identidade de sequência com a sequência de aminoácido a SEQ ID NO:408, contanto que se o polipeptídeo isolado incluir um ou mais aminoácidos adicionais no terminal amino, o um ou mais aminoácidos adi- cionais incluem pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoácidos 1-5 da SEQ ID NO:415.

Conforme acima mencionado na seção intitulada Similaridade de sequência de polipeptídeo e identidade de sequência de polipeptídeo, um polipeptídeo identificado pela referência à sequência de aminoácido de uma SEQID NO: particular pode incluir um polipeptídeo com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo BR menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo me- . nos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos ' 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos : 15 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido (por e- xemplo, a sequência de aminoácido provida em uma SEQ ID NO.) e/ou um polipeptídeo com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de referência (por exemplo, a sequência de ami- —noácido provida em uma SEQ ID NO. especificada).

Um polipeptídeo recombinantemente produzido pode ser ex- presso a partir de um vetor que permite expressão do polipeptídeo quando o vetor é introduzido em uma célula hospedeiro apropriada. Uma célula hos- pedeiro pode ser construída para produzir um ou mais polipeptídeos recom- binantemente produzidos da invenção e, então, pode incluir um ou mais ve- tores que incluem pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipepti- deo da invenção. Desta maneira, cada vetor pode incluir um ou mais polinu-

Tiamat dali ENA 92/187 cleotídeos da invenção — isto é, um polinucleotídeo que codifica um polipep- tídeo da invenção.

Certas composições tais como, por exemplo, aquelas incluindo polipeptídeos recombinantemente produzidos, podem incluir um número má- ximode polipeptídeos. Em algumas modalidades, o número máximo de poli- peptídeos pode referir-se ao número total máximo de polipeptídeos. Certas composições podem incluir, por exemplo, não mais do que 50 polipeptídeos tais como, por exemplo, não mais do que 40 polipeptídeos, não mais do que 30 polipeptídeos, não mais do que 25 polipeptídeos, não mais do que 20 polipeptíideos, não mais do que 15 polipeptídeos, não mais do que 10 poli- peptídeos, não mais do que oito polipeptídeos, não mais do que sete poli- . peptídeos, não mais do que seis polipeptídeos, não mais do que cinco poli- . peptídeos, não mais do que quatro polipeptídeos, não mais do que três poli- peptídeos, não mais do que dois polipeptideos ou não mais do que um poli- : 15 peptídeo. Em outras modalidades, um número máximo de polipeptídeos re- combinantemente produzidos pode ser especificado de uma maneira similar. . Em ainda outras modalidades, um número máximo de polipeptídeos não- recombinantemente produzidos pode ser especificado de uma maneira simi- lar.

Uma composição pode incluir polipeptídeos isoláveis de um mi- cróbio ou podem ser isoláveis de uma combinação de dois ou mais micró- bios. Por exemplo, uma composição pode incluir polipeptídeos isoláveis de duas ou mais Staphylococcus spp. ou de uma Staphylococcus spp e um mi- cróbio diferente que não é um membro do gênero Staphylococcus. A presen- teinvenção também provê composições incluindo uma preparação de célula integral, onde a célula integral expressa um ou mais dos polipeptídeos da presente invenção. Por exemplo, a célula integral pode ser uma Staphylo- coccus spp. Em alguns aspectos, uma composição pode incluir preparações integrais de duas, três, quatro, cinco ou seis linhagens.

Opcionalmente, um polipeptídeo da presente invenção pode ser covalentemente ligado ou conjugado a um polipeptídeo veículo para melho- rar as propriedades imunológicas do polipeptídeo. Polipeptídeos carreadores

TERRA RARAS CAN RCE SAS ES Ra dra gnu a Siad SAAE 93/187 úteis são conhecidos na técnica.

O acoplamento químico dos polipeptídeos da presente invenção pode ser realizado usando métodos conhecidos e de rotina.

Por exemplo, vários reagentes de reticulação homobifuncionais e/ou heterobifuncionais tais como bis(sulfossuccinimidil)suberato, —bis(diazobenzídina), adipimidato de dimetila, pimelimidato de dimetila, supe- rimidato de dimetila, suberato de dissuccinimidila, glutaraldeído, m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, sulfo-m-maleimidobenzoil-N- hidroxissuccinimida, 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de sulfos- succinimidila, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de sulfossuccinimídila e (1-etil-3- (dimetil-aminopropil)carbodiimida podem ser usados (vide, por exemplo, Har- low e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, em geral e Capítulo 5, Cold

. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, NY (1988)). . As composições da presente invenção incluem opcionalmente ' ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. "Farmaceuticamente aceitá- : 15 vel" refere-se a um diluente, veículo, excipiente, sal, etc, que é compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudiciais ao seu recipi- - ente.

Tipicamente, a composição inclui um veículo farmmaceuticamente acei- tável quando a composição é usada conforme aqui descrito.

As composições da presente invenção podem ser formuladas em preparações farmacêuticas em uma variedade de formas adaptadas para a via de administração esco- lhida, incluíndo vidas adequadas para estimulação de uma resposta imune a um antígeno.

Desta maneira, uma composição da presente invenção pode ser administrada através de vias conhecidas incluindo, por exemplo, oral; parenteral, incluindo intradermal, transcutânea e subcutânea; intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc, e topicamente tal como intranasal, intrapul- monar, intramamária, intravaginal, intrauterina, intradermal, transcutânea e retalmente, etc.

É previsto que uma composição pode ser administrada a uma superfície mucosal, tal como através da administração à mucosa nasal ou respiratória (por exemplo, através de um spray ou aerossol), a fim de es- timular imunidade mucosal, tal como produção de anticorpos IgA secretores,

no corpo do animal.

Uma composição da presente invenção pode ser também admi- | nistrada através de um implante de liberação sustentada ou retardada. Im- plantes adequados para uso de acordo com à invenção são conhecidos e incluem, por exemplo, aqueles revelados em Emery e Straub (WO 01/37810 (2001)) e Emery e outros (WO 96/01620 (1996)). Implantes podem ser pro- duzidosem tamanhos pequenos o suficiente para serem administrados atra- vés de aerossol ou spray. Implantes podem também incluir nanoesferas e microesferas .

Uma composição da presente invenção pode ser administrada em uma quantidade suficiente para tratar certas condições conforme aqui descrito. A quantidade de polipeptídeos ou células integrais presentes em uma composição da presente invenção pode variar. Por exemplo, a dosa- : - gem de polipeptídeos pode estar entre 0,01 microgramas (ug) e 300 mg, ti- í picamente entre 0,1 mg e 10 mg. Quando a composição é uma preparação . de célula integral, as células podem estar presentes em uma concentração : 15 de, por exemplo, 10º bactérias/ml, 10º bactérias/ml, 10º bactérias/ml, 10º bactérias/ml, 10º bactérias/ml, 10 bactérias/ml, 10º bactérias/m! ou 10º bac- - térias/ml. Para uma composição injetável (por exemplo, subcutânea, intra- muscular, etc) os polipeptídeos podem estar presentes na composição em quantidades de maneira que o volume total da composição administrada se- ja0O5mla5,0 ml, tipicamente 1,0 a 2,0 ml. Quando à composição é uma preparação de célula integral, as células estão preferivelmente presentes na composição em uma quantidade que o volume total da composição adminis- trada é de 0,5 ml! a 5,0 ml, tipicamente 1,0 a 2,0 ml. A quantidade adminis- trada vai variar dependendo de vários fatores incluindo, mas não limitado a, os polipeptídeos específicos escolhidos, o peso, condição física e idade do animal e a via de administração. Desta maneira, o peso absoluto do polipep- tídeo incluído em uma dada forma de dosagem unitária pode variar ampla- mente e depende de fatores tais como a espécie, idade, peso e condição física do animal, bem como o método de administração. Tais fatores podem ser determinados por um versado comum na técnica. Outros exemplos de dosagens adequadas para a invenção são revelados em Emery e outros (Patente U.S. 6.027.736).

As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas através de métodos bem conhecidos na técnica de Farmácia. Métodos de preparação de uma composição com um veículo farmaceuticamente aceitável incluem a etapa detrazero composto ativo (por exemplo, um polipeptídeo ou célula integral da presente invenção) em associação com um veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas tra- zendo em associação uniformamente e intimamente o composto ativo com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e então, se necessário, moldagem do produto nas formulações desejadas.

Uma composição incluindo um veículo farmaceuticamente acei- tável pode também incluir um adjuvante. Um adjuvante refere-se a um agen- - 1 te que pode agir de uma maneira não-específica para aumentar uma respos- Í ta imune a um antígeno particular, então reduzindo potencialmente a quanti- : 15 dade de antígeno necessária em qualquer dada composição de imunização e/ou a frequência de injeção necessária a fim de gerar uma resposta imune - adequada ao antígeno de interesse. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, IL-1, I1L-2, emulsificantes, dipeptídeos muramila, brometo de dimetil diocta- decil amônio (DDA), aviridina, hidróxido de alumínio, óleos, saponinas, alfa- tocoferol, polissacarídeos, parafinas emulsificadas (incluindo, por exemplo, aquelas disponíveis sob a marca registrada EMULSIGEN da MVP Laborato- ries, Ralston, Nebraska), ISA-70, RIBI e outras substâncias conhecidas na técnica. É esperado que os polipeptídeos da invenção tenham atividade i- munorreguladora e que tais polipeptídeos possam ser usados como adjuvan- tes que agem diretamente como ativadores de célula T e/ou B ou agem em tipos específicos que aumentam a síntese de várias citocinas ou ativam cur- sos de sinalização intracelular. Tais polipeptídeos são esperados aumentar a resposta imune para aumentar o índice de proteção da composição existen- te.

Em outra modalidade, uma composição da invenção incluindo um veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir um modificador de res- posta biológica e outras citocinas que afetam as células imunes. Uma com- |

CR NENE NARRA ETA 96/187 posição de imunização pode também incluir outros componentes conhecidos na técnica tais como um antibiótico, um preservativo, um antioxidante ou um agente de quelação.

Métodos de Fabricação A presente invenção também provê métodos para obtenção de polipeptídeos descritos aqui.

Os polipeptideos e as células integrais da pre- sente invenção podem ser isoláveis de um membro da família Micrococca- ceae, preferivelmente Staphylococcus spp., mais preferivelmente Staphylo- coccus aureus.

Outros micróbios gram-positivos a partir dos quais polipeptí- deos podem ser isolados incluem Corynebacterium spp., Erysipelothrix spp., Mycobacterium spp. e Erysipelothrix spp.

Micróbios úteis para obtenção dos ' polipeptídeos da presente invenção e fabricação de preparações de célula : integral estão comercialmente disponíveis de um depositório tal como a A- ' merican Type Culture Collection (ATCC). Ainda, tais micróbios são pronta- : 15 mente disponíveis através de técnicas de rotina e conhecidos na técnica.

Os micróbios podem ser derivados de um animal infectado como um isolato de - campo e usados para obter polipeptídeos e/ou preparações de célula inte- gral da presente invenção, ou armazenados para uso futuro, por exemplo, em um repositório congelado a -20º C até 95º C, ou 40º C a -50º C, em meios bacteriológicos contendo 20% glicerol, e outros meios conhecidos.

Quando um polipeptídeo da presente invenção tiver que se obti- do a partir de um micróbio, o micróbio pode ser incluído sob condições de baixo teor de metal.

Conforme aqui usado, a expressão "condições de baixo teor de metal" refere-se a um ambiente, tipicamente meios bacteriológicos, que contém quantidades de metal livre que fazem com que um micróbio ex- presse polipeptídeos regulados por metal em um nível detectável.

Conforme aqui usado, a expressão "condições com alto teor de metal" refere-se a um ambiente que contém quantidades de metal livre que fazem com que um micróbio ou não expresse um ou mais polipeptídeos regulados por metal descritos aqui em um nível detectável ou expresse tal polipeptideo em um nivel menor comparado com expressão do polipeptídeo regulado por metal sob condições com baixo teor de metal.

Em alguns casos, "condições com )

alto teor de metal" podem incluir um ambiente natural rico em metal e/ou cul- tura em um meio rico em metal sem um quelante de metal.

Em contraste, em alguns casos, "condições com baixo teor de metal" podem incluir cultura em um meio que inclui um quelante de metal, conforme descrito em mais deta- lhes abaixo.

Metais são aqueles presentes na Tabela Periódica sob os Gru- pos 1 a 17 (notação IUPAC; também referidos como Grupos |-A, II-A, III-B, IV-B, V-B, VI-B, VII-B, VIII, 1-B, 1I-B, III-A, IV-A, V-A, VI-A e VII-A, respecti- vamente, sob a notação CAS). Preferivelmente, os metais são aqueles nos Grupos 2 a 12, mais preferivelmente Grupos 3-12. Mais preferivelmente ain- da, ometalé ferro, cobre, magnésio, níquel, cobalto, manganês, molibdênio ou selênio, mais preferivelmente ferro. | - Condições com baixo teor metal são geralmente o resultado da - adição de um composto quelante de metal a um meio bacteriológico, o uso ' de um meio bacteriológico que contém quantidades baixas de um metal ou a : 15 combinação dos mesmos.

Condições com alto teor de metal estão geral- mente expressas quando um quelante não está presente no meio, um metal . é adicionado ao meio ou a combinação dos mesmos.

Exemplos de quelan- tes de metal incluem compostos naturais e sintéticos.

Exemplos de compos- tos naturais incluem compostos fenólicos de planta, tais como flavonoides.

Exemplos de flavonoides incluem os quelantes de cobre catequina e narin- genina, e os quelantes de ferro miricetina e quercetina.

Exemplos de quelan- tes de cobre sintéticos incluem, por exemplo, tetratiomolibdato e exemplos de quelantes de zinco sintéticos incluem, por exemplo, N,N,N' N'-Tetracis(2- piridilmetiN)etileno diamina.

Exemplos de quelantes de ferro sintéticos inclu- em 2,2-dipiridla (também referido na técnica como a,a'-bipiridila), 8- hidroxiquinolina, ácido etilenodiamino-di-O-hidroxifenilacético (EDDHA), des- ferrioxamina metanossulfonato (desferol), transferrina, lactoferrina, ovotrans- ferrrina, sideróforos biológicos, tais como catecolatos e hidroxamatos, e ci- trato.

Um exemplo de um quelante de cátion divalente geral é resina CHE- LEX Preferivelmente, 2,2'-dipiridila é usada para a quelação de ferro.

Tipi- camente, 2,2'-dipiridila é adicionada ao meio em uma concentração de pelo menos 300 microgramas/mililitro (pg/ml), pelo menos 600 pg/ml ou pelo me-

)

nos 900 upg/m. Níveis altos de 2,2'-dipiridinila podem ser 1200 pg/ml, 1500 pg/ml ou 1800 po/ml. O genoma de S. aureus codifica três homólogos Fur: Fur, PerR e Zur. Embora as proteínas Zur e PerR pareçam estar principalmente envolvi- —dasnaregulagem de homeostase de zinco e genes de estresse de peróxido, respectivamente, a proteína Fur foi demonstrada regular vários sistemas de absorção sideróforo-ferro em resposta à limitação de ferro. A proteina Fur também desempenha um papel em resistência a estresse oxidativo e viru- lência. É esperado que um organismo gram-positivo, preferivelmente uma S. aureus, com uma mutação em um gene fur vá resultar na expressão consti- tutiva de muitos, se não todos, os polipeptídeos regulados por metal da pre- . sente invenção. A produção de uma mutação fur em uma S. aureus, preferi- . velmente gram-positiva, pode ser realizada usando métodos de rotina inclu- ' indo, por exemplo, mutagênese por transposon, química ou direcionada a . 15 sítio útil para geração de mutações de inativação de gene em bactérias gram-positivas.

. O meio usado para incubar o micróbio e o volume de meio usa- do para incubar o micróbio podem variar. Quando um micróbio está sendo avaliado quanto à habilidade em produzir um ou mais dos polipeptídeos des- critos aqui, o micróbio pode ser cultivado em um volume adequado, por e- xemplo, 10 mililitros a 1 litro de meio. Quando um micróbio está sendo culti- vado para obter polipeptídeos para uso em, por exemplo, administração a animais, o micróbio pode ser cultivado em um fermentador para permitir o isolamento de quantidades maiores de polipeptídeos. Métodos para cultivo de micróbios em um fermentador são rotina e conhecidos na técnica. As condições usadas para cultivo de um micróbio preferivelmente incluem um quelante de metal, mais preferivelmente um quelante de ferro, por exemplo, 2,2'-dipiridila, um pH entre 6,5 e 7,5, preferivelmente entre 6,9 e 7,1 e uma temperatura de 37º C.

Em alguns aspectos da invenção, um micróbio pode ser coletado após cultivo. A coleta inclui concentração do micróbio em um volume menor e suspensão em um meio diferente do meio de crescimento. Métodos para

Ftesatas aan Ra a ATENA 99/187 concentração de um micróbio são rotina e conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, filtragem e concentração.

Tipicamente, o micróbio concentrado é suspenso em um tampão apropriado.

Um exemplo de um tampão que po- de ser usado contém base Tris (7,3 gramas/litro) em um pH de 8,5. Opcio- nalmente,o tampão final também minimiza degradação proteolítica.

Isto po- de ser realizado ao ter o tampão final em um pH maior do que 8,0, preferi- velmente pelo menos 8,5 e/ou incluindo um ou mais inibidores de proteinase (por exemplo, fluoreto de fenilmetanossulfonila). Opcionalmente e preferi- velmente o micróbio concentrado é congelado a -20º C ou abaixo até rom-

per Quando o micróbio tiver que ser usado como uma preparação de 5 célula integral, as células coletadas podem ser processadas usando méto- dos de rotina e conhecidos para inativar as células.

Alternativamente, quan- do um micróbio tiver que ser usado para preparar polipeptídeos da presente . 15 invenção, o micróbio pode ser rompido usando métodos químicos, físicos ou mecânicos rotina e conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, fervura, - prensa francesa, sonificação, digestão de peptidoglicano (por exemplo, atra- vês de digestão com lisozima) ou homogeneização.

Um exemplo de um dis- positivo adequado útil para homogeneização é um homogeneizador AVES- TIN modelo C500-B, (Avestin Inc., Ottawa, Canadá). Conforme aqui usado, "rompimento" refere-se à quebra da célula.

Rompimento de um micróbio po- de ser medido através de métodos que são rotina e conhecidos da técnica incluindo, por exemplo, mudanças em densidade óptica.

Tipicamente, um micróbio é submetido a rompimento até a transmitância percentual ser au- —mentada em 20% quando uma diluição 1:100 é medida.

Quando métodos físicos ou químicos são usados, a temperatura durante rompimento é tipica- mente mantida baixa, preferivelmente a 4º C, para minimizar mais a degra- dação proteolítica.

Quando métodos químicos são usados a temperatura pode ser aumentada para otimizar o rompimento celular.

Uma combinação de métodos químicos, físicos e mecânicos pode ser também usada para so- lubilizar a parede celular do micróbio, Conforme aqui usado, o termo "solubi- lizar" refere-se à dissolução de materiais celulares (por exemplo, polipepti-

)

deos, ácidos nucleicos, carboidratos) na fase aquosa do tampão onde o mi- cróbio foi rompido e a formação de agregados de materiais celulares insolú- veis. Sem pretender ser limitado pela teoria, as condições para solubilização são acreditadas resultar na agregação de polipeptídeos da presente inven- çãoem agregados solúveis que são grandes o suficiente para permitir iso- lamento fácil através de, por exemplo, centrifugação.

Os agregados insolúveis que incluem um ou mais dos polipepti- deos da presente invenção podem ser isolados através de métodos que são rotina e conhecidos na técnica. Preferivelmente, os agregados insolúveis são isolados através de centrifugação. Tipicamente, centrifugação de polipepti- deos, tais como polipeptídeos de membrana, pode ser realizada por forças centrífugas de 100.000 x g. O uso de tais forças centrífugas requer o uso de - ultracentríifuga e aumento para volumes de processo grandes de amostra é : frequentemente difícil e não econômico com esses tipos de centrífuga. Os . 15 métodos descritos aqui proveem a produção de agregados insolúveis gran- des o suficiente para permitir o uso de centrifugas de fluxo contínuo, por e- - xemplo, T-1 Sharples (Alfa Laval Separations, Warminster, PA), que pode ser usada com uma taxa de fluxo de 250 miímin a 117,210 Kpa (17 psi) em uma força centrífuga de 46.000 x g a 60.000 x g. Outras centríifugas de grande escala podem ser usadas, tais como configurações de tigela, câmara e disco tubulares. Tais centrifugas são rotineiramente usadas e conhecidas na técnica e estão comercialmente disponíveis de fabricantes tais como Pennwalt, Westfalia e alpha-Laval.

As proteínas coletadas finais são lavadas e/ou dialisadas contra —umtampão apropriado usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, diafiltragem, precipitação, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de troca de fon ou cromatografia por afinidade, ou ultrafitragem e lavagem dos poli- peptídeos, por exemplo, em álcool, através de diafiltragem. Após isolamento, os polipeptídeos são suspensos em tampão e armazenados em temperatura baixa,por exemplo, -20º C ou abaixo.

Naqueles aspectos da presente invenção onde uma preparação de célula integral deve ser feita, após crescimento um micróbio pode ser morto com a adição de um agente tal como glutaraldeído, formalina ou for- maldeído em uma concentração suficiente para inativar as células na cultura. Por exemplo, formalina pode ser adicionada em uma concentração de 0,3% (vol:vol). Após um período de tempo suficiente para inativar as células, as células podem ser coletadas através de, por exemplo, diafiltragem e/ou cen- trifugação e lavadas.

Em outros aspectos, um polipeptídeo isolado da invenção pode ser preparado recombinantemente. Quando preparado recombinantemente, um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser identificado e clona- doem um hospedeiro de expressão apropriado conforme descrito abaixo no Exemplo 14. O hospedeiro de expressão recombinante pode ser cultivado i : em um meio apropriado, rompido e os polipeptídeos isolados conforme aci- : ma descrito.

' Métodos de Uso . 15 Um aspecto da presente invenção refere-se ainda a métodos de uso das composições da presente invenção. Os métodos incluem adminis- tração a um animal de uma quantidade eficaz de uma composição da pre- sente invenção. O animal pode ser, por exemplo, ave (incluindo, por exem- plo, galinhas ou perus), bovino (incluindo, por exemplo, gado), caprino (inclu- indo, por exemplo, cabras), ovino (incluindo, por exemplo, ovelha), porco (incluindo, por exemplo, suíno), bison (incluindo, por exemplo, búfalo), equi- no (incluindo, por exemplo, cavalos), um animal de companhia (incluindo, por exemplo, cachorros ou gatos), membros da família Cervidae (incluindo, por exemplo, cervo, alce, veado, alce caribou e rena) ou ser humano.

Em alguns aspectos, os métodos podem incluir ainda adminis- trações adicionais (por exemplo, uma ou mais administrações de reforço) da composição ao animal para aumentar ou estimular uma resposta imune se- cundária. Um reforço pode ser administrado em um momento após a primei- ra administração, por exemplo, uma a oito semanas, preferivelmente duas a ' 30 quatro semanas, após a administração da composição. Reforços subse- quentes podem ser administrados uma, duas, três, quatro ou mais vezes anualmente. Sem ser limitado pela teoria, é esperado que em alguns aspec-

tos da presente invenção reforços anuais não sejam necessários, como um animal será provocado no campo por exposição a micróbios expressando polipeptídeos presentes nas composições tendo epítopos que são idênticos a ou estruturalmente relacionados a epítopos presentes nos polipeptídeos da composição administrada ao animal.

Em um aspecto, a invenção refere-se a métodos para fabricação de anticorpos, por exemplo, através da indução da produção de anticorpo em um animal ou através de técnicas recombinantes. O anticorpo produzido inclui anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um polipeptídeo presente na composição. Neste aspecto da invenção, uma "quantidade efi- caz" é uma quantidade eficaz para resultar na produção de anticorpo no a- . nimal. Métodos para determinação de se um animal produziu anticorpos que . se ligam especificamente a polipeptídeos presentes em uma composição da ' presente invenção podem ser determinados conforme descrito aqui. A pre- . 15 sente invenção inclui ainda anticorpo que se liga especificamente a um poli- peptídeo da presente invenção e composições incluindo tais anticorpos.

- O método pode ser usado para produzir anticorpo que se liga especificamente a polipeptídeos expressos por um micróbio outro que não o micróbio a partir do qual os polipeptídeos da composição foram isolados.

Conforme aqui usado, um anticorpo que pode "se ligar especificamente" a um polipeptídeo é um anticorpo que interage com o epítopo do antígeno que induziu a síntese do anticorpo ou interage com um epítopo estruturalmente relacionado. Pelo menos alguns dos polipeptídeos presentes nas composi- ções da presente invenção tipicamente incluem epítopos que são conserva- dos nos polipeptídeos de espécies diferentes e gêneros diferentes de micró- bios. Desta maneira, anticorpo produzido usando uma composição derivada de um micróbio é esperado se ligar a polipeptídeos expressos por outros micróbios e provê proteção de amplo espectro contra organismos gram- positivos. Exemplos de micróbios gram-positivos aos quais o anticorpo pode se ligar especificamente são Micrococcaceae, preferivelmente, Staphylococ- cus spp., mais preferivelmente, Staphylococcus aureus; membros da família Streptococcaceae, preferivelmente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi, ou Streptococcus dysgalactiae; e Bacillus Spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Erysipelothrix Spp., Listeria spp., Micrococeus spp. e Mycobacterium spp., Kytococeus spp. e Erysipelothricz spp.

Desta maneira, o anticorpo produzido usando uma composição de polipeptídeos da invenção pode ser usado para identificar e caracterizar polipeptídeos da invenção independentes da origem, fonte e/ou maneira de obtenção do polipeptídeo.

A presente invenção refere-se também ao uso de tal anticorpo para se direcionar a um micróbio expressando um polipeptídeo da presente invenção ou um polipeptídeo tendo um epítopo estruturalmente relacionado . com um epítopo presente em um polipeptídeo da presente invenção.

Um R composto pode ser covalentemente ligado a um anticorpo onde o anticorpo pode ser, por exemplo, uma toxina.

Da mesma maneira, tais compostos po- : 15 dem ser covalentemente ligados a um sideróforo bacteriano para se direcio- nar ao micróbio.

O acoplamento químico ou conjugação de um anticorpo da presente invenção, ou uma porção do mesmo (tal como um fragmento Fab), pode ser realizado usando métodos conhecidos e de rotina.

Em um aspecto a invenção refere-se também a tratamento de uma infecçãoem um animal, incluindo um ser humano, causada por um mi- cróbio gram-positivo, preferivelmente por um membro da família Micrococeca- ceae, preferivelmente, Staphylococcus spp., mais preferivelmente, S. au- reus; membros da família Streptococcaceae, preferivelmente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Strepto- coccus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi, ou Streptococcus dysgalactiae; Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Entero- coccus spp., Erysipelothrix spp., Kytococeus spp., Listeria spp., Micrococeus Spp., Mycobacterium spp. e Erysipelothrix spp.

Conforme aqui usado, o ter- mo "infecção" refere-se à presença de um micróbio gram-positivo no corpo de um animal, que pode ou não ser clinicamente aparente.

Um animal com uma infecção por um membro do gênero Staphylococcus que não é clinica- mente aparente é frequentemente referido como veículo assintomático. |

RSRS Sead 104/187 Tratamento de uma infecção pode ser profilático ou, alternativa- mente, pode ser iniciado após o animal ser infectado pelo micróbio.

Trata- mento que é profilático, por exemplo, iniciado antes de um indivíduo ser in- fectado por um micróbio ou enquanto qualquer infecção permanece subclini- ca-éreferido aqui como tratamento de um indivíduo que está "sob risco" de infecção.

Conforme aqui usado, o termo "sob risco" refere-se a um animal que pode ou não realmente possuir o risco descrito.

Desta maneira, tipica- mente, um animal "sob risco" de infecção por um míicróbio é um animal pre- sente em uma área onde animais foram identificados como infectados pelo micróbio e/ou prováveis de serem expostos ao micróbio mesmo se o animal não tiver ainda manifestado qualquer indicação detectável de infecção pelo - micróbio e sem importar se o animal pode carregar uma quantidade subclíni- : ca do micróbio.

Desta maneira, administração de uma composição pode ser : realizada antes, durante ou após o animal ter primeiro contato com o micró- . 15 bio.

Tratamento iniciado após o primeiro contato do animal com o micróbio pode resultar em diminuição da severidade de sintomas e/ou sinais clínicos : de infecção pelo micróbio, remoção completa do micróbio e/ou diminuição da probabilidade de ter uma infecção clinicamente evidente comparado com um animal ao qual a composição não é administrada.

O método inclui adminis- tração de uma quantidade eficaz da composição da presente invenção a um animal tendo, ou sob risco de ter, uma infecção causada por um micróbio gram-positivo, e determinação de se o número de micróbios causando a in- fecção diminuiu.

Neste aspecto da invenção, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para reduzir o número dos micróbios especificados em um animal ou reduzir a probabilidade de que o animal tenha uma infecção clini- camente evidente comparado com um animal ao qual a composição não é administrada.

Métodos para determinação de se uma infecção é causada por um micróbio gram-positivo são rotina e conhecidos na técnica e são mé- todos para determinar se a infecção diminuiu.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a métodos para tratamento de um ou mais sintomas ou sinais clínicos de certas condições em um animal que podem ser causados por infecção por um micróbio gram-

105/187 | positivo, preferivelmente por um membro da família Micrococcaceae, preferi- velmente, Staphylococcus spp., mais preferivelmente, S. aureus; membros da família Streptoococcaceae, preferivelmente, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi ou Streptococcus dysgalactiae; Ba- cillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Enterococcus spp, Ery- sipelothrix spp., Kytococeus spp., Listeria spp., Micrococcus spp., Mycobac- terium spp. e Erysipelothrix spp. O método inclui a administração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção a um animal tendo ou sob risco de ter uma condição, ou exibindo sintomas e/ou sinais clínicos de uma condição, e determinação de se pelo menos um sintoma ' elou sinal clínico da condição é mudado, preferivelmente, reduzido. Exem- plos de condições e/ou sinais clínicos causados por infecções microbianas ' incluem, por exemplo, mastite, septicemia, pneumonia, meningoencetfalite, . 15 limfangite, dermatite, infecções do trato urinário, estrangulamentos, metrite, doença perinatal, abcessos da pituitária, artrite, bursite, orquite, cistite e pie- . lonefrite, linfadenite caseous, tuberculose, linfangite ulcerativa, listeriose, erisipelas, laminite, antrax, doença de tyzzer, tétano, botulismo, enterite, e- dema maligno, abraxia, hemoglobinúria baciliar, enterotoxemia, lesões da pele necróticas e infecções nosocomiais. Exemplos de condições causadas por S. aureus também incluem, por exemplo, botriomicose em cavalos, sino- vite purulenta e osteomielite em ave, abortos em suíno e piemia pelo carra- pato em cordeiros. Exemplos de condições causadas por Streptococcus spp. também incluem, por exemplo, dor de garganta, febre escarlate, impetigo, —endocardite ulcerativa, febre reumática e glomerulonefrite pós-streptococcal, cerviícite em seres humanos, cervicite em equino e suíno e meniginte e ab- cessos da papada em suíno.

Tratamento de sintomas e/ou sinais clínicos associados com es- sas condições pode ser profilático ou, alternativamente, pode ser iniciado após o desenvolvimento de uma condição descrita aqui. Conforme aqui usa- do, o termo "sintomas" refere-se a uma evidência subjetiva de doença ou condição sofrida pelo paciente e causada por infecção por um micróbio. )

Conforme aqui usado, o termo "sinal clínico" ou simplesmente "sinal" refere- se à evidência objetiva de doença ou condição causada por infecção por um micróbio.

Sintomas e/ou sinais clínicos associados com condições referidas aqui e as avaliações de tais sintomas são rotina e conhecidos na técnica.

Tratamento que é profilático, por exemplo, iniciado antes de um indivíduo manifestar sintomas ou sinais de uma condição causada por um micróbio, é referido aqui como tratamento de um indivíduo que “está sob risco" de de- senvolver a condição.

Desta maneira, tipicamente um animal "sob risco" de desenvolver uma condição é um animal presente em uma área onde animais tendo a condição foram diagnosticados e/ou é provável de ser exposto a um micróbio causador da condição mesmo se o animal ainda não manifestou - sintomas ou sinais de qualquer condição causada pelo micróbio.

Desta ma- . neira, administração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após a ocorrência das condições descritas aqui.

Tratamento iniciado após . 15 o desenvolvimento de uma condição pode resultar em diminuição da severi- dade dos sintomas de uma das condições ou remoção completa dos sinto- : mas.

Neste aspecto da invenção uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para prevenir a manifestação de sintomas de uma doença, diminuír a severidade dos sintomas de uma doença e/ou remover completamente os sintomas.

O tratamento bem sucedido de uma infecção microbiana gram- positiva em um animal é revelado no Exemplo 5, que demonstra a proteção contra doença causada por S. aureus em modelos de camundongo através da administração de uma composição da presente invenção.

Esses modelos de camundongo são um modelo geralmente aceito para o estudo de doença — humana causada por esses micróbios.

O tratamento bem sucedido de uma infecção microbiana gram-posítiva em um animal é também revelado nos Exemplos 10 a 12, que demonstram que administração de uma composição da presente invenção provê proteção contra doença causada por S. aureus em vacas.

A presente invenção também provê métodos para diminuição da colonização por micróbios gram-positivos, por exemplo, bloqueio dos sítios de ligação de micróbio gram-positivo, incluindo tecidos do sistema esqueleta!

: | 107/187 (por exemplo, ossos, cartilagem, tendões e ligamentos), sistema muscular (por exemplo, músculos esqueletal e liso), sistema circulatório (por exemplo, coração, vasos sanguíneos, capilares e sangue), sistema nervoso (por e- xemplo, cérebro, cordão espinhal e nervos periféricos), sistema respiratório (por exemplo, nariz, traqueia, pulmões, brônquios, bronquiocelos, alvéolos), sistema digestivo (por exemplo, boca, glândulas salivares, esôfago, fígado, estômago, intestinos grosso e delgado), sistema excretor (por exemplo, rins, uréteres, bexiga e uretra), sistema endócrino (por exemplo, hipotálamo, pitui- tária, tireoide, pâncreas e glândulas adrenais), sistema reprodutor (por e- xemplo, ovários, ovidutos, útero, vagina, glândulas mamárias, testículos e vesículas seminais), sistemas linfático/imune (por exemplo, linfo, nós linfáti- : cos e vasos, células sanguíneas mononucleares ou brancas, tais como ma- - crófagos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e linfócitos, incluindo Ú células T e células B) e linhagens de célula específicas (por exemplo, células . 15 —precursoras, células epiteliais, células-tronco) e similar. Preferivelmente, o micróbio gram-positivo é um membro da família Micrococcaceae, preferivel- mente, Staphylococcus spp., mais preferivelmente, S. aureus; um membro da família Streptooccaceae, preferivelmente, Streptococcus pyogenes, S- treptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococeus uberis, Streptococcus bovis, Streptococcus equi ou Streptococcus dysgalactiae; Ba- cillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Enterococus spp. Erysi- pelothrix spp., Kytococeus spp., Listeria spp., Micrococcus Spp., Mycobacte- rium spp. e Erysipelothrix spp.

Diminuição da colonização em um animal pode ser realizada profilaticamente ou, alternativamente, pode ser iniciada após o animal ser colonizado pelo micróbio. Tratamento que é profilático — por exemplo, inicia- do antes de um indivíduo ser colonizado por um micróbio ou enquanto qual- quer colonização permaneça não-detectada — é referido aqui como trata- mento de um indivíduo que está "sob risco" de colonização pelo micróbio.

Desta maneira, tipicamente, um animal "sob risco" de colonização por um micróbio é um animal presente em uma área onde os animais foram identifi- cados como colonizados pelo micróbio e/ou é provável que sejam expostos )

ao micróbio mesmo se o animal não tiver ainda manifestado qualquer indica- ção detectável de colonização pelo micróbio e sem importar se o animal po- de carregar um número de subcolonização do micróbio.

Desta maneira, ad- ministração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após ouanimaltero primeiro contato com o micróbio.

Tratamento iniciado após o primeiro contato do animal com o micróbio pode resultar em diminuição do grau de colonização pelo micróbio, remoção completa do micróbio e/ou di- minuição da probabilidade que o animal seja colonizado pelo micróbio com- parado com um animal ao qual a composição não é administrada.

Desta maneira, o método inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção a um animal colonizado por, ou sob risco : de ser colonizado por, um micróbio gram-positivo.

Neste aspecto da inven- - ção, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para diminuir a ' colonização do animal pelo micróbio, onde colonização menor refere-se a . 15 um ou mais de: diminuição do grau de colonização pelo míicróbio, remoção completa do micróbio e/ou diminuição da probabilidade que o animal seja colonizado pelo micróbio comparado com um animal ao qual a composição não é administrada.

Métodos para varredura da colonização de um animal por um micróbio são rotina e conhecidos na técnica.

Por exemplo, coloniza- ção do trato intestinal de um animal por um micróbio pode ser determinada através da medição da presença do micróbio nas fezes do animal.

É espera- do que diminuição da colonização de um animal por um micróbio vá reduzir a transmissão do micróbio para seres humanos.

Uma composição da invenção pode ser usada para prover imu- —nização ativa ou passiva contra infecção bacteriana.

Em geral, a composição pode ser administrada a um animal para prover imunização ativa.

No entan- to, a composição pode ser também usada para induzir produção de produtos imunes, tais como anticorpos, que podem ser coletados do animal produtor e administrados a outro animal para prover imunidade passiva.

Componentes imunes, tais como anticorpos, podem ser coletados para preparar composi- ções (preferivelmente contendo anticorpo) a partir de soro, plasma, sangue, colostro, etc, para terapias de imunização passiva.

Composições de anticor-

)

ada ssSEES aaa iam SENA POR O O A 109/187 po incluindo anticorpos monoclonais e/ou antiidiotipos podem ser também preparadas usando métodos conhecidos.

Anticorpos quiméricos incluem re- giões constantes derivadas de humano de ambas as cadeias pesada e leve e regiões variáveis derivadas de murino que são antígeno-específicas (Mor- risone outros, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 1984, 81(21):6851-5; LoBuglio e outros, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 1989, 86(11):4220-4; Boulianne e outros, Nature, 1984, 312(5995):643-6.). Anticorpos humanizados substituem as regiões constante e de estrutura principal de murino (FR) (da região variável) com as contraparttes humanas (Jones e outros, Nature, 1986, 321(6069):522-5; Riechmann e outros, Nature, 1988, 332(6162):323-7, Ve- rhoeyen e outros, Science, 1988, 239(4847):1534-6; Queen e outros, Proc. . Natl.

Acad.

Sci.

USA, 1989, 86(24):10029-33; Daugherty e outros, Nucleic Acids Res., 1991, 19(9): 2471-6.). Alternativamente, certas linhagens de ca- mundongo podem ser usadas, as quais foram geneticamente engenheiradas . 15 para produzir anticorpos que são quase que completamente de origem hu- mana; seguindo imunização as células B desses camundongos são coleta- : das e imortalizadas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Bruggeman e Taussig, Curr.

Opin.

Biotechnol., 1997, 8(4):455-8, Lonberg e Huszar, Int.

Rev.

Immunol., 1995;13(1):65-93; Lonberg e outros, Nature, 1994, 368:856-9; Taylor e outros, Nucleic Acids Res., 1992, 20:6287-95.). Composições de anticorpo passivo e fragmentos do mesmo, por exemplo, scFv, Fab, F(ab')z ou Fv ou outras formas modificadas do mesmo, podem ser administrados a um recipiente na forma de soro, plasma, sangue, colos- tro e similar.

No entanto, os anticorpos podem ser também isolados de soro, plasma, sangue, colostro e similar usando métodos conhecidos para uso posterior em uma forma concentrada ou reconstituída tal como, por exemplo, soluções de lavagem, revestimento impregnado e/ou agentes tópicos e simi- lar.

Preparações de imunização passiva podem ser particularmente vantajo- sas para o tratamento de doença sistêmica aguda ou imunização passiva de animais jovens que falharam em receber níveis adequados de imunidade passiva através do colostro materno.

Anticorpos úteis para imunização pas- siva podem ser também úteis para conjugar a vários fármacos ou antibióti-

RS ENS NAAEAEEAEASAEASAAAA Ad | 110/187 | cos que poderiam ser diretamente direcionados a bactérias expressando durante uma infecção sistêmica ou localizada um polipeptídeo da presente invenção ou um polipeptídeo tendo um epítopo estruturalmente relacionado a um epítopo presente em um polipeptídeo da presente invenção.

Modelos animais, em particular modelos de camundongo, estão disponíveis para varredura experimental das composições da presente in- venção. Esses modelos de camundongo são geralmente modelos aceitos para o estudo de doença humana causada por membros do gênero Staph- ylococcus e S. aureus em particular. Naqueles casos onde um membro do gênero Staphylococcus causa doença em um animal, por exemplo, uma va- ca, o hospedeiro natural pode ser usado para avaliar experimentalmente as ' composições da presente invenção. - No entanto, proteção em um modelo de camundongo não é a- ' penas a única maneira de avaliar se uma composição pode conferir proteção . 15 aum animal contra infecção por um Staphylococcus spp. A resposta imune adaptativa consiste em duas divisões principais: a resposta humoral (anti- . corpo) e a resposta celular (célula 1). Seguindo infecção por um patógeno bacteriano, células dendríticas no sítio de infecção encontram antígenos mi- crobjanos e produzem moléculas de sinalização tais como, por exemplo, re- ceptores de superfície e citocinas em resposta a padrões moleculares con- servados associados com a bactéria específica. Esses sinais são modelados pela natureza do patógeno e levam idealmente às respostas de anticorpo e célula T apropriadas que protegem o hospedeiro da doença. Embora algu- mas doenças bacterianas sejam controladas principalmente através de fun- ções do anticorpo, outras requerem respostas de célula T ou ambas as res- postas de anticorpo e célula T para proteção. O objetivo de biologia de vaci- na é identificar as respostas imunes que proveem proteção e então projeto de uma vacina para reproduzir uma ou mais dessas respostas em seres hu- manos.

Anticorpos podem ter muitas funções diferentes em conferir pro- teção contra infecção tais como, por exemplo, fixação de complemento, op- sonização, neutralização e/ou aglutinação. Além disso, algumas subclasses )

de anticorpos são melhores do que outras em funções específicas; por e- xemplo, para fixação de complemento a hierarquia que segue existe para subclasses de IgG humana: IgG3>IgG1>IgG2>19G4). Funções imunológicas de anticorpo podem ser estudadas de uma variedade de maneiras.

Por exemplo, Westem blots são usados para identificar ligação específica de antígeno com base em tamanho de proteí- nas separadas, enquanto o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima padrão (ELISA) é usado para produzir informação quantitativa sobre títulos de anti- corpo dentro do soro.

Estudos de ligação de superfície de anticorpo são u- sados para determinar se anticorpos em soro são capazes reconhecer antí- genos na superfície de bactérias intactas, um indicador importante de se os - anticorpos têm o potencial em ter atividade in vivo.

Desta maneira, um ver- sado na técnica reconhece que ensaios de ligação de anticorpo tais como Ú um Western blot, ELISA (por exemplo, usando antissoro) e/ou de ligação de . 15 superfície se relacionam positivamente com os antígenos se ligando especi- ficamente provendo atividade imunológica contra infecção por Staphylococ- cus spp. (Vytvytska e outros 2002, Proteomics 2:580-590; Kuklin e outros 2006, Infect.

Immun. 74(4):2215-2223; Dryla e outros 2005, Clin.

Diag.

Lab.

Immunol. 12(3):387-398). No entanto, um versado na técnica reconhece ain- daque uma falta de ligação de anticorpo em um ensaio tal como, por exem- plo, um Western blot, ELISA ou ensaio de ligação de superfície não significa que o antígeno ensaiado falha em prover atividade imunológica contra infec- ção por Staphylococcus spp. (Kim HK e outros. "IsdA e IsdB antibodies pro- tect mice against Staphylococcus aureus abcess formation and lethal chal- lenge". Vaccine (2010), doi:10.1016/.vaccine.2010.02.097). A Figura 202 mostra que soro de camundongo convalescente se liga a pelo menos MntC recombinantemente produzida (SEQ ID NO:419), SYN2 recombinantemente produzida (SEQ ID NO:386), SirA recombinante- mente produzida (SEQ ID NO:375) e Opp1A recombinantemente produzida (SEQ ID NO:364), indicando que cada um dos polipeptídeos recombinante- mente produzidos ligados pode induzir atividade imunológica contra infecção por Staphylococcus spp. |

| | 112/187 A Figura 204 mostra que soro humano convalescente se liga à PfIB recombinantemente produzida (SEQ ID NO:353), Opp1A recombinan- temente produzida (SEQ ID NO:364), SirA recombinantemente produzida (SEQ ID NO:375), SYN2 recombinantemente produzida (SEQ ID NO:386), FhuD recombinantemente produzida (SEQ ID NO:397), SYN1 recombinan- temente produzida (SEQ ID NO:408) e MntC recombinantemente produzida (SEQ ID NO:419), indicando que cada um dos polipeptídeos recombinante- mente produzidos pode induzir atividade imunológica contra infecção por Staphylococcus spp. A Figura 205 mostra que anticorpo criado contra FhuD recombi- nantemente produzida (SEQ ID NO:397), Opp1A recombinantemente produ- . zida (SEQ ID NO:364) e PfIB recombinantemente produzida (SEQ ID NO:353) se liga à superficie de células de Staphylococcus SPp., indicando Ú que cada um dos alvos de polipeptídeo do anticorpo de ligação à célula pode . 15 induzir atividade imunológica contra infecção por Staphylococcus spp. Técnicas tais como ensaios de opsonofagocitose (OPA), onde bactérias ligadas a anticorpo e complemento são combinadas com fagócitos humanos ou de camundongo para determinar os níveis de morte bacteriana, são úteis para estudo de função de anticorpo. Resultados de OPA positivos serelacionam com proteção induzida por vacina em um modelo de camun- dongo (Stranger-Jones e outros 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. 103(45): 16942- 16947). Um ensaio de queima oxidativa similar pode ser usado para avaliar o nível de espécies oxigênio reativas (ROS) por neutrófilos humanos ou de camundongo frescos seguindo interação com bactérias ligadas a anticorpo e complemento.

Em alguns casos, uma pessoa pode determinar que um polipep- tídeo candidato possui atividade imunológica mediada por célula e, então, o polipeptídeo candidato pode exibir atividade imunológica na ausência de in- dução da produção de anticorpos. (Spellberg e outros 2008, Infect. Immun. 76(10):4575-4580). Células T citotóxicas ou CD8 matam principalmente célu- las infectadas diretamente através de vários mecanismos efetores, enquanto células T CD4 auxiliares funcionam para prover sinalização importante na maneira de citocinas. Essas classes de célula T podem ser subdivididas mais com base nas citocinas que elas produzem, e subclasses diferentes são eficazes contra patógenos bacterianos diferentes. Células T são fre- quentemente estudadas através da varredura de seus fenótipos com citome- tria de fluxo, onde os anticorpos são usados para visualizar os níveis de marcadores de superfície específicos que permitem classificação das células T como, por exemplo, uma célula T CD4+ recentemente ativada, uma célula T CD8+ de memória, etc. Ainda, citocinas e outros produtos de células T podem ser estudados através do isolamento das células T do tecido linfoide ereestimulação delas com antígeno cognato. Seguindo estimulação de antí- geno as células T produzem citocinas que podem ser visualizadas através - de, por exemplo, tingimento com citocina intracelular acoplado com citome- tria de fluxo ou coleta dos sobrenadantes celulares e uso de tecnologia de Ú conta Luminex para medir 15-25 citocinas simultaneamente. : 15 A Figura 206 mostra que uma composição (rSIRP7) que inclui PfIB recombinantemente produzida (SEQ ID NO:353), Opp1A recombinan- : temente produzida (SEQ ID NO:364), SirA recombinantemente produzida (SEQ ID NO:375), SYN2 recombinantemente produzida (SEQ ID NO:386), FhuD recombinantemente produzida (SEQ ID NO:397), SYN1 recombinan- temente produzida (SEQ ID NO:408) e MntC recombinantemente produzida (SEQ ID NO:419) induz um perfil de citocina similar ao perfil de citocina in- duzido pelo extrato de SIRP demonstrado prover atividade imunológica con- tra infecção por Staphylococcus spp. A composição de rSIRP7 induziu a produção de, por exemplo, IL-2, IL-6, IL-17, IFN-y, MIP-2 e GM-CSF.

Desta maneira, em adição a modelos de camundongo, aqueles versados na técnica reconhecem que atividade imunológica comensurada com os métodos descritos aqui pode se relacionar com qualquer um ou mais do que segue: dados de Western blot mostrando que soro de animais expos- tos a Sfaphylococcus spp. contém anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo candidato, ensaios de ligação de superfície celular demons- trando que anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo candida- to se liga especificamente a Staphylococcus spp., dados de opsonofagocito-

Festa Saara ENE TATTOO AESA: 114/187 se e indução de citocina.

Outro aspecto da presente invenção provê métodos para detec- ção de anticorpo que se liga especificamente a polipeptídeos da presente invenção. Esses métodos são úteis na, por exemplo, detecção de se um a- nimaltem anticorpo que se liga especificamente a polipeptídeos da presente invenção e diagnóstico de se um animal pode ter uma condição causada por um micróbio expressando polipeptídeos descritos aqui ou expressando poli- peptídeos que compartilham epítopos com os polipeptídeos descritos aqui. Tais sistemas de diagnóstico podem estar em forma de kit. O método inclui contato de um anticorpo com uma preparação que incluí um polipeptídeo da presente invenção para resultar em uma mistura. O anticorpo pode estar - presente em uma amostra biológica, por exemplo, sangue, leite ou colostro, O método inclui ainda incubação da mistura sob condições para permitir que o anticorpo se ligue especificamente ao polipeptídeo para formar um com- : 15 plexo polipeptídeo:anticorpo. Conforme aqui usado, o termo "complexo poli- peptídeo:anticorpo" refere-se ao complexo que resulta quando um anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo. A preparação que inclui os poli- peptídeos da presente invenção pode também incluir reagentes, por exem- plo, um tampão, que proveem condições apropriadas para a formação do complexo polipeptideo:anticorpo. O complexo polipeptídeo:anticorpo é então detectado. A detecção de anticorpo é conhecida na técnica e pode incluir, por exemplo, imunofluorescência ou peroxidase, Os métodos para detecção da presença de anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos da presente invenção podem ser usados em vários formatos que foram usados para detectar anticorpo, incluindo radioimunoensaio e ensaio imunoabsor- vente ligado à enzima.

A presente invenção também provê um kit para detecção de an- ticorpo que se liga especificamente a polipeptídeos da presente invenção. O anticorpo detectado pode ser obtido de um animal suspeito de ter uma infec- ção causada por um micróbio gram-positivo, mais preferivelmente, um mem- bro da família Micrococcaceae, preferivelmente, Staphylococcus spp., mais preferivelmente, S. aureus; Streptococcus spp., Bacillus spp., Clostridium

ERAASRGEE AA SOR aa EE Sands o TEENS AESA MASSA AA 115/187 spp., Corynebacterium spp., Enterococus spp., Erysipelothrix spp., Kytococ- cus spp., Listeria spp., Micrococcus spp., Mycobacterium spp., e Erysipelot-

hrix spp.

O kit inclui pelo menos um dos polipeptídeos da presente inven- —ção(por exemplo, um, pelo menos dois, pelo menos três, etc) em um mate- rial de embalagem adequado em uma quantidade suficiente para pelo me- nos um ensaio.

Opcionalmente, outros reagentes tais como tampões e solu- ções necessários para prática da invenção podem ser também incluídos.

Por exemplo, um kit pode também incluir um reagente para permitir detecção de um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo da presente in- venção, tal como um anticorpo secundário detectavelmente marcado proje- - tado para se ligar especificamente a um anticorpo obtido de um animal.

Ins- truções para uso dos polipeptídeos embalados são também tipicamente in- cluídas.

Conforme aqui usado, a expressão "material de embalagem" refere- seauma ou mais estruturas físicas usadas para alojar os teores do kit.

O material de embalagem é construído através de métodos bem conhecidos, ' em geral para prover um ambiente livre de contaminante, estéril.

O material de embalagem pode ter um rótulo que indica que os polipeptídeos podem ser usados para detecção de anticorpo que se liga especificamente a poli- peptídeos da presente invenção.

Ainda, o material de embalagem contém instruções indicando como os materiais dentro do kit são empregados para detectar o anticorpo.

Conforme aqui usado, o termo "embalagem" refere-se a um recipiente tal como vidro, plástico, papel, folha, e similar, capaz de conter dentro de limites fixados os polipeptídeos, e outros reagentes, por exemplo, um anticorpo secundário.

Desta maneira, por exemplo, uma embalagem po- de ter uma cavidade de placa de microtitulação à qual quantidades em mi- crograma de polipeptídeos foram afixadas.

Uma embalagem pode também conter um anticorpo secundário. "Instruções para uso" tipicamente incluem uma expressão tangível descrevendo a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro de método de ensaio tais como as quantidades relati- vas de reagente e amostra a serem misturadas, períodos de tempo de ma- nutenção para misturas de reagente/amostra, temperatura, condições de tampão e similar. A presente invenção é ilustrada pelos exemplos que seguem. Deve ser também compreendido que os exemplos, materiais, quantidades e procedimentos particulares devem ser interpretados amplamente de acordo comoescopo eco espírito da invenção conforme aqui descrito.

EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de proteínas reguladas por ferro Escala de Laboratório Composições derivadas de linhagens diferentes de Staphylococ- cus aureus incluindo proteínas novas expressas sob restrição de ferro e/ou - outros graus de quelação com íon de metal foram avaliadas quanto à eficá- cia contra uma provocação virulenta em camundongos. A eficácia da com- posição foi avaliada através da coleta de dados nos parâmetros que seguem . 15 (1) aeficácia de cada composição para prover proteções homóloga e heteró- loga contra uma provocação virulenta viva em camundongos, (2) a eficácia i de cada composição em reduzir as lesões de pele necróticas e (3) a eficácia de composições derivadas de Staphylococcus cultivada em condições com e sem ferro em prover proteção.

As linhagens de Staphylococcus aureus avaliadas neste estudo tiveram origem de três espécies animais: ave, humano e bovino. O isolato de ave SAAV1 era um isolato de campo tendo origem em um bando de perus doentes tendo grau alto de osteomielite e sinovite. Os isolatos bovinos (li nhagem 1477 e linhagem 2176) foram isolados de dois rebanhos leiteiros comerciais tendo uma alta incidência de mastite clínica. O isolato humano foi obtido da ATCC (linhagem 19636) e originado de um paciente tendo osteo- mielite clínica.

Estoques de semente máster de cada isolato foram preparados através da inoculação do isolato apropriado em 200 mi! de Caldo de Soja Tríptico (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI) contendo 300 pM de 2,2- dipiridilta (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). A cultura foi cultivada enquanto agi- tando a 200 rpm por 6 horas a 37º C e coletada através de centrifugação a

10.000 x g. O pélete bacteriano foi ressuspenso em 100 ml de caldo TBS contendo glicerol 20% e esterilmente disperso em frascos criogênicos de 2 ml (1 ml por frasco) e armazenado a -90º C até o uso. Cada estoque de semente máster foi expandido em uma semen- te de trabalho. Um frasco de cada isolato de semente máster foi inoculado em 200 ml de Caldo de Soja Tríptico (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI) contendo 1000 ul de 2,2-dipiridila (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). A cultura foi cultivada enquanto agitando a 200 rpm por 6 horas a 37º C e coletada atra- vés de centrifugação a 10.000 x g. O pélete bacteriano foi ressuspenso em 100 mlde caldo TBS contendo glicerol 20% e aplicado esterilmente em fras- cos criogênicos de 2 ml (1 ml! por frasco) e armazenado a -90º C até uso. À ' semente de trabalho foi usada para a produção de composições enriqueci- das com proteínas de membrana reguladas por ferro, incluindo proteinas de ' membrana reguladas por ferro.

' 15 Todas as linhagens foram adaptadas para crescerem em meios altamente depletados de ferro (isto é, meios contendo níveis muito baixos de ferro livre). Isto foi realizado através de subcultura das bactérias em TSB contendo concentrações altas de 2,2-dipiridila (de 300 a 1600 UM).

As proteínas foram preparadas a partir de bactérias como segue.

As bactérias foram cultivadas a partir de estoques de semente de trabalho congelados através de subcultura em 25 ml de meios isentos de ferro (con- tendo 1000 uM de 2,2'-dipiridila) e meios com ferro, então incubadas a 37º C enquanto agitando a 400 rpm. Seguindo 12 horas de incubação, 5 ml de ca- da cultura foram transferidos para 500 ml de meios isentos de ferro ou com ferro pré-incubados a 37º C. As culturas foram incubadas por 8 horas a 37º C enquanto agitando a 100 rpm, então as células foram peletizada através de centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos. Os péletes bacterianos foram ressuspensos em 100 ml! de solução salina fisiológica estéril e centrifugados a 10.000 x g por 10 minutos. Os péletes foram então ressuspensos em 45 ml! de solução salina tamponada com Tris, pH 7,2 (TBS; Tris 25 mM, NaCl 150 mM) e as suspensões bacterianas resultantes foram despejadas como alí- quotas de 9 ml! em 5 tubos individuais. Um mililitro de TBS contendo 50 uni-

Vistas Sadat Sasrinastanidadadsas RAS anti ata dia LA rasaliaabicaias hackear 118/187 dades de lisostafina (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado a cada tubo para dar um volume final de 5 unidades/ml. Seguindo incubação a 37º C por 30 minutos enquanto agitando a 200 rpm, 1 ml de TBS contendo 0,1 mg de |li- sozima (Sigma) foi adicionado a cada tubo. As suspensões bacterianas fo- ram então incubadas por mais 45 minutos enquanto agitando a 200 rpm. Em seguida, as suspensões foram centrifugadas a 3050 x g por 12 minutos a 4º C para peletizar restos celulares grandes. Os sobrenadantes foram coleta- dos através de aspiração sem perturbar o pélete. O sobrenadante foi então centrifugado a 39.000 x g por 2,5 horas. Os péletes resultantes contendo as proteínas foram ressuspensos em 200 uL de tampão Tris, pH 7,2, sem solu- ção salina. A solução de proteína para cada isolado foi combinada para um . volume total de 1 ml e armazenada a -90º C. Os extratos enriquecidos em proteína derivados de S. aureus fo- ' ram fracionados em tamanho em géis SDS-PAGE usando um gel de empi- ' 15 lhamento 4% e gel de separação 10%. Amostras para eletroforese foram preparadas combinando 10 ul de amostra com 30 ul de tampão de amostra de redução SDS (Tris-HCI 62,5 mM, pH 6,8, glicerol 20%, SDS 2%, B- mercaptoetanol 5%) e fervidas por 4 minutos. As amostras sofreram eletrofo- rese em corrente constante de 18 mA por 5 horas a 4º C usando um forne- cimento de energia de célula xi Protein Il (BioRad Laboratories, Richmond, CA, modelo 1000/500). O peso molecular de cada proteína individual con- forme visualmente visto no gel de SDS-PAGE foi estimado usando um densi- tômetro (BioRad) usando um marcador de peso molecular de faixa ampla como um padrão de referêcia (BioRad).

Os padrões de SDS-PAGE das proteínas de cada isolato quan- do cultivadas na presença de 1600 uM de dipiridila mostraram um padrão de expressão de proteína muito diferente comparado com a mesma linhagem quando cultivada na presença de 300 uM de dipiridila. Por exemplo, quando cultivada em 300 uM de isolato de dipiridila SAAV1 resultou em proteínas reguladas por metal de 90 kDa, 84 kDa, 72 kDa, 66 kDa, 36 kDa, 32 kDa e 22 kDa, enquanto cultivada em 1600 UM de dipiridila resultou em proteínas reguladas por metal de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa e 33,0 kDa.

Da mesma maneira, quando cultivado em 300 UM de isolato de dipiridila 19636 resultou em proteínas de 42 kDa e 36 kDa, enquanto cultivo em 1600 UM de dipiridila resultou em proteínas reguladas por metal de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 KkDae33,0kDa.

Todas as condições, incluindo cultivo em meios com ferro, resultaram na expressão das proteínas que seguem que eram presumivel- mente não-reguladas por metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa e 40 kDa.

Ainda, cultivo de linhagens diferentes de S. aureus em 1600 uM de dipiridila resultou em padrões de expressão de proteína similares.

As composições enriquecidas em proteinas de membrana reguladas por ferro . de isolato de ave (SAAV1) incluíam proteinas com pesos moleculares de 87,73 kDa, 54,54 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa e 33,0 kDa.

Os pesos moleculares das proteínas do isolato ATCC 19636 foram es- : 15 sencialmente idênticos àqueles do isolato de ave.

Ambos os isolatos de bo- vino, quando cultivados com 1600 UM de 2,2-dipirídila, expressaram perfis de formação de faixa similares aos isolatos de ave e ATCC para a maioria das proteinas (87,73 kDa, 54,53 kDa, 37,7 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa e 33,0 kDa). No entanto, nenhum dos isolatos bovinos produziu a proteína de 38,42 kDavistacom cos isolatos de ave e ATCC e os isolatos bovinos expressaram três proteínas (80,46 kDa, 65,08 kDa e 31,83 kDa) não observadas com as linhagens de ave e ATCC (vide Figura 1 e Tabela 7). Todas as condições resultaram na expressão das proteínas que seguem que não eram reguladas por metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa,41KkDae40kDa.

Tabela 7. Pesos moleculares de polipeptídeos regulados por metal obtidos de isolatos de Staphylococcus aureus.

SAAV1 19636 1477 2176 LEE EE seas TT 046 [EE essas TT eso |

SAAV1 19636 1477 2176 [se [Og [OT EE ans [as Interessantemente, não houve nenhuma diferença em perfis de proteina conforme examinado através de SDS-PAGE entre o sobrenadante clarificado e o pélete bacteriano após tratamento das bactérias com lisostafi- nailisozima.

Ambos o pélete bacteriano e o sobrenadante extraídos tinham ' 5 exatamente os mesmos perfis de proteina conforme examinado através de SDS-PAGE.

Esta mesma observação foi vista também quando rompendo as células bacterianas usando um homogeneizador AVESTIN a 206,84Mpa (30.000 psi). O pélete bacteriano resultante, após centrifugação em veloci- dade lenta, era idêntico em seu perfil de proteina comparado com o sobre- ' 10 —nadante clarificado após centrifugação em alta velocidade a 30.000 x g por 2,0 horas a 4º C.

Exemplo 2 Preparação das composições de imunização derivadas de Staphylococcus aureus As proteínas do isolato humano ATCC 19636 e do isolato bovino 1477, cultivadas em condições isentas de ferro e preparadas conforme des- crito no Exemplo 1, foram usadas para formular duas composições de vaci- na.

As proteínas do isolato ATCC tinham pesos moleculares de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa e 33,0 kDa, en- quanto o isolato bovino expressou proteínas tendo pesos moleculares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,7 kDa, 35,70 kDa, 34,91 KkDa, 33,0 kDa e 31,83 kDa.

Cada composição também continha as proteí- nas que seguem que eram não-reguladas por metal: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kda, 41 kDa e 40 kDa.

Vacinasde estoque foram preparadas a partir das duas linhagens através de | emulsificação de cada suspensão de proteína aquosa (500 uM de proteína total/ml!) em um adjuvante comercial (EMULSIGEN, MVP Laboratories, Rals- ton, Nebraska) usando um recipiente de homogeneização IKA Ultra Turrax T-50 (IKA, Cincinnati, OH) para dar uma dose final de 50 ug de proteína total emum volume injetável de 0,1 ml com uma concentração de adjuvante de 22,5% volívol.

Como vacinação controle, uma composição de proteina foi preparada a partir do isolato bovino 1477 cultivado sob condições com ferro (TSB suplementado com 300 UM de cloreto férrico) conforme descrito no Exemplo 1. Uma vacina de placebo foi preparada substituindo a suspensão de proteína aquosa por solução salina fisiológica no protocolo acima.

Exemplo 3 Vacinação de camundongo Setenta (N=70) camundongos fêmeas CF-1 obtidos do Harlan Ú Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas foram i- ' 15 gualmente distribuídos em 7 grupos (10 camundongos/grupo). Os camun- dongos foram alojados em gaiolas para camundongo de policarbonato (An- ' core Corporation, Bellmore, NY). Uma gaiola única foi usada para cada gru- po de tratamento e comida e água foram fornecidas ad libitium a todos os camundongos.

Todos os camundongos foram vacinados intraperitonealmen- tecomb0O,1mlda composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Vacinado com placebo Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 19636 expressas sob restrição de ferro Grupo 3: Vacinado com placebo Grupo 4: Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro.

Grupo 5: Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro.

Grupo 6: Vacinado com proteínas 19636 ATCC expressas sob restrição de ferro.

Grupo 7: Vacinado com FeCl3; 1477 Bovina, onde "FeCl3 1477 |

TORNA ERES SAS CANNA: 122/187 Bovina" refere-se a proteínas obtidas de 1477 Bovina cultivada em TSB su- plementado com 300 uM de cloreto férrico.

Exemplo 4 Preparação de organismo de provocação As linhagens de Staphylococcus previamente descritas ATCC 19636 e a linhagem 1477 foram usadas como organismos de provocação.

Em suma, os isolatos de estoques congelados (previamente descritos) foram riscados em placas de ágar de sangue e incubados a 37º C por 18 horas.

Uma única colônia de cada isolato foi subculturada em 50 ml de Caldo de Soja Tríptico (Difco) contendo 1600 ul de 2,2'-dipíridila.

As culturas foram incubadas a 37º C por 6 horas enquanto girando a 200 rpm, então centrifu- - gadas a 10.000 x g por 10 minutos a 4º C para peletizar as bactérias.

Os péletes bacterianos foram lavados duas vezes através de centrifugação em TBS a 4º C.

Os péletes finais foram ressuspensos em TBS para uma densi- dade óptica de 42% de Transmitância (T) a 562 nm em um volume de apro- ximadamente 25 ml de TBS e usados para provocação.

Um pouco antes da ' provocação, 1 ml! dessas suspensões bacterianas foi serialmente diluído e plaqueado em ágar para enumerar o número de unidades de formação de colônia (CFU) por dose de camundongo.

Exemplo5 Provocação Quatorze dias após a segunda vacinação, os camundongos em todos os grupos (1-7) foram subcutaneamente provocados na parte de trás do pescoço com 0,1 ml do organismo apropriado.

Os sete grupos de camun- —dongos foram provocados como segue: Grupo-1 (Vacinado com Placebo): Provocado com ATCC 19636 Grupo-2 (Vacinado com proteína ATCC 19636 expressa sob res- trição de ferro): Provocado com ATCC 19636 Grupo-3 (Vacinado com Placebo): Provocado com 1477 Bovina Grupo-4 (Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro): Provocado com 1477 Bovina Grupo-5 (Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro): Provocado com ATCC 19636 Grupo-6 (Vacinado com proteínas ATCC 19636 expressas sob restrição de ferro): Provocado com 1477 Bovina Grupo-7 (Vacinado com FeCI3 1477 Bovina): Provocado com 1477 Bovina Conforme determinado através do protocolo de enumeração descrito no Exemplo 4, a concentração de S. aureus 19636 usada para pro- vocação foi 1,35 x 10º CFU por dose de camundongo e a concentração de S. aureus 1477 usada para provocação foi 1,65 x 10º CFU de colônia por dose de camundongo. Morbidez, mortalidade e patologia foram registradas diariamente por 7 dias após a provocação.

. Quando comparando os camundongos provocados com isolato ATCC 19636, 70% dos camundongos do Grupo 1 vacinados com placebo morreram dentro de 7 dias de provocação (Tabela 8 e Figura 2). Isto de- . 15 —monstrou que a linhagem 19636 causou uma taxa de mortalidade alta em camundongos no nível de dose administrado. Em contraste com os camun- dongos no Grupo 1, apenas 10% dos camundongos no Grupo 2 morreram dentro de 7 dias pós-provocação. Esses resultados ilustraram que os ca- mundongos provocados com a linhagem 19636 eram significantemente pro- tegidos por vacinação com à composição de 19636 (p=0,020, teste de Extra- to de Fischer). Ainda, uma análise Kaplan-Meier dos dados de tempo-para- morte indicou que a vacina forneceu proteção significante (p=0,0042, teste logrank) contra provocação homóloga (Figura 3). Ainda, apenas 20% dos camundongos no Grupo 5 morreram dentro de 7 dias de provocação, indi- cando que a composição 1477 bovina ofereceu proteção significante contra provocação com a linhagem ATCC 19636 (p = 0,015 teste logrank para mor- talidade). Quando os dados foram analisados através de uma curva de so- brevivência Kaplan-meier e teste logrank (Figura 4), a proteção contra morta- lidade foi determinada ser significante (p = 0,015 teste logrank para mortali- dade), indicando que a composição de vacina derivada da linhagem 1477 proveu proteção heteróloga contra provocação com a linhagem 19636.

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RARA AAAARAAAAEAARARAAAARANLAA 124/187 Tabela 8. Mortalidade de Camundongos Vacinados e Não-vacinados Se- guindo Provocação com Staphylococcus aureus (isolato ACC 19636 humano e isolato bovino 1477). Grupos No. de Ca- No. de Mortalidade mun-dongos Mortos percentual (%) Grupo-1* (Placebo, Prov 10 7110 70 ATCC 19636) Grupo-2* (ATCC 19636, 1/10 10 Prov Homóloga) Grupo-3* (Placebo, Prov 10 2/10 20 1477 Bovina) Grupo-4* (1477 Bovina, 10 1/10 10 , Prov Homóloga) Grupo-5* (1477 Bovina, 10 2/10 20 : Prov Heteróloga) Grupo-6* (ATCC 19636, 10 0/10 ' Prov Heteróloga) Grupo-7* (FeCl; 1477 Bo- 2/10 20 ' vina, Prov 1477 Bovina) *Grupo-1, (Vacinado com placebo/Provocado com ATCC 19636) *Grupo-2 (Vacinado com proteinas ATCC 19636 expressas sob restrição de ferro/Provocado com ATCC 19636) *Grupo-3 (Vacinado com placebo/Provocado com 1477 Bovina) *Grupo 4 (Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro/Provocado com 1477 Bovina) *Grupo-5 (Vacinado com proteínas 1477 Bovinas expressas sob restrição de ferro/Provocado com ATCC 19636) *Grupo-6 (Vacinado com proteínas ATCC 19636 expressas sob restrição de ferro/Provocado com 1477 Bovina) *Grupo-7 (Vacinado com FeCl; 1477 Bovina/Provocado com 1477 Bovina) Quando comparando os camundongos provocados com isolato de 1477 bovina, apenas 20% dos camundongos no grupo vacinado com pla- cebo (Grupo 3) morreram dentro de 7 dias de provocação.

No entanto, pro- vocação com o isolato de 1477 bovina elicitou o desenvolvimento de lesões de pele necróticas em 6 (76%) dos camundongos sobreviventes do Grupo 3. Essas lesões foram medidas e o tamanho médio das lesões nos camundon- gos sobreviventes foi 18,5 mm (Tabela 9). Em contraste, 20% dos camun- dongos do Grupo 4 morreram dentro de 7 dias de provocação, mas apenas três(38%) dos camundongos sobreviventes desenvolveram lesões (diâmetro médio, 2,7 mm). Esses resultados indicam que a composição de 1477 bovi- na ofereceu proteção homóloga significante contra desenvolvimento de le- sões nos camundongos provocados com a linhagem bovina 1477 (p=0,009, teste t de student). Ainda, vacinação com a composição de ATCC 19636 protegeu contra provocação com a linhagem 1477, uma vez que nenhum camundongo morreu no Grupo 6 e apenas três (30%) dos camundongos desenvolveram lesões de pele (diâmetro médio, 3,7 mm). Juntos, mortalida- de e/ou desenvolvimento de lesão reduzidos nos camundongos nos Grupos 5 e 6 demonstraram a natureza de proteção cruzada significante das com- . 15 posições derivadas das linhagens 19636 e 1477 (p=0,012, teste t de student com base em tamanho de lesão). Na demonstração da eficácia da composi- ' ção comparado com as proteínas não-reguladas por ferro, 20% dos camun- dongos no Grupo 7 morreram e 4 dos sobreviventes desenvolveram lesões de pele (diâmetro médio, 15,8 mm). Os camundongos do Grupo 7 demons- traram algum grau de proteção pela vacinação com as proteínas do isolato 1477 uma vez que menos camundongos desenvolveram lesões comparado com o Grupo 3 de vacina com placebo. No entanto, as lesões de pele obser- vadas nos camundongos no Grupo 7 foram mais frequentes e de um diâme- tro maior do que as lesões nos camundongos do grupo 4, indicando que, com relação a proteínas isoladas de células cultivadas sob condições com ferro, as proteínas isoladas das bactérias cultivadas sob restrição de ferro ofereceram proteção superior contra uma provocação idêntica.

A natureza de proteção cruzada das proteínas observadas no estudo de provocação de camundongo é apoiada pelos pesos moleculares similares das proteínas das linhagens de S. aureus descritas no Exemplo 1 (Figura 1). Embora tenha havido diferenças notáveis no perfil de SDS-PAGE das proteínas dos isolatos derivados de bovino, especificamente a ausência de uma proteína de 38,4 kDa e a presença de 3 proteínas adicionais, as pro-

teínas de ambas as linhagens 1477 e ATCC 19636 elicitaram proteção hete-

róloga.

Esses resultados indicam que as proteínas similares entre as linha-

gens 19636 e 1477 são provavelmente responsáveis pela proteção cruzada

— observada nos Grupos 5 e 6. Em contraste, os perfis de proteína da linha-

gem 1477 cultivada sob condições isentas de ferro e com ferro são observa-

velmente diferentes.

Essas proteínas isoladas sob condições sem ferro são mais protetoras quando comparado com as proteínas isoladas sob condi-

ções com ferro, demonstrado pela redução em desenvolvimento de lesão dentre os camundongos do Grupo 4 comparado com os camundongos do Grupo 7.

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Exemplo 6 Em mamíferos, foi mostrado que a resposta à lesão em tecido ou infecção bacteriana resulta em uma resposta inflamatória aguda. Esta resposta aumenta a permeabilidade capilar e a infiltração fagocítica resul- tando nos sinais clínicos reconhecidos como inflamação; inchaço, febre, dor e vermelhidão; se deixado sem controle, isso pode levar à morte. A ativação de fatores humorais e a liberação de citocinas fazem a mediação de eventos sistêmicos coletivamente conhecidos como a resposta de proteina de fase aguda que resulta em uma cascata de eventos fisiológicos e bioquímicos. A duração desta resposta está diretamente relacionada com a severidade da lesão e magnitude da infecção sistêmica. Foi bem documentado que durante . a sepse bacteriana, cirurgia grande, queimaduras e outros traumas corporais há uma alteração na concentração de vários íons de metal no soro tais como Ú ferro, cobre e zinco. Por exemplo, durante a fase aguda de uma infecção há uma diminuição nos níveis de ferro e zinco no plasma e um aumento em co- bre. A alteração desses íons de metal traços no soro pode afetar diretamen- ' te a severidade ou progressão de qualquer infecção bacteriana.

Neste estudo a requerente examinou a expressão de proteínas de Staphylococcus aureus sob várias condições de restrição de íon de metal afim de imitar a expressão de novas proteinas que podem ser expressas durante a invasão sistêmica. As linhagens de Staphylococcus aureus avalia- das neste estudo se originaram de amostras clínicas de três espécies dife- rentes de animal; ave (linhagem SAAV1), humano (linhagem 19636) e bovi- no (linhagens 1477 e 2176). Em suma, culturas de cada isolato foram prepa- —radas a partir de estoques de semente máster em 200 ml de Caldo de Soja Trípico (TSB). Cada cultura foi cultivada enquanto agitando a 200 rpm por 6 horas a 37º C. Dez ml de cada cultura foram transferidos para 500 ml! de TSB isento contendo um a quatro quelantes de íon de metal; 2,2-dipiridinila (Dp), 2-piridilmetil-etileno diamina (TPEN), catequina e naringeninas (todos — obtidos da Sigma, St. Louis, MO). Ainda, cada cultura foi também cultivada em meios com cátion contendo cloreto férrico, cloreto de zinco e/ou cloreto de cobre preparados em concentrações de 300 uM. Os quelantes de íon de metal foram usados na concentração que segue: 2,2-dipiridila (800 UM), ca- tequina e naringenina foram usadas a 300 UM e 2-piridilmetil-etileno diamina foi usada em uma concentração de 100 UM. As culturas foram cultivadas com cada quelante por 8 horas, ponto onde a cultura foi subculturada uma segunda vez por mais 12 horas. Cada cultura foi subculturada por três pas- sagens consecutivas em intervalos de 12 horas. No final da terceira passa- gem, cada cultura foi coletada através de centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos. Cada cultura foi lavada duas vezes através de centrifugação a

10.000 x gq e ressuspensa em 20 ml de solução salina tamponada com Tris, pH7,2a4C. Cada pélete bacteriano foi ressuspenso em 45 ml de solução sa- * lina tamponada com Tris, pH 7,2 (Tris 25 mM e NaCl 150 mM) e as suspen- sões bacterianas resultantes foram despejadas como alíquotas de 9 ml em 5 tubos individuais, vinte tubos no total. Um milímetro de TBS contendo 50 - 15 unidades de lisostafina (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado a cada tubo para dar uma concentração final de 5 unidades/ml. Seguindo incubação a 37º C por 30 minutos enquanto agitando a 200 rpm, 1 ml de TBS contendo 0,1 mg de lisozima (Sigma) foi adicionado a cada tubo. As suspensões bac- terianas foram então incubadas por mais 45 minutos enquanto agitando a 200rpm.Em seguida, as suspensões foram centrifugadas a 3050 x g por 12 minutos a 4º C para peletizar restos celulares grandes. Os sobrenadantes foram coletados através de aspiração sem perturbar o pélete. O sobrenadan- te foi então centrifugado a 39.000 x g por 2,5 horas. Os péletes resultantes, enriquecidos em proteinas de membrana reguladas por metal, foram ressus- pensos em 200 uL de tampão Tris, pH 7,2. As soluções de proteína para cada isolato foram combinadas para um volume total de 1 ml e armazenadas a-90ºC. As proteínas obtidas dos isolatos de S. aureus SAAV1, 19636, 1477 e 2176 cultivadas sob condições isentas de ferro, zinco e cobre incluí- am polipeptídeos regulados por metal. Extratos celulares, derivados de cada isolato, foram fracionados em tamanho em géis SDS-PAGE usando um gel de empilhamento 4% e gel | de separação 10%. Amostras para eletroforese foram preparadas combi- nando 10 ug de amostra com 30 ul de tampão de amostra de redução SDS (Tris-HCI 62,5 mM, pH 6,8, glicerol! 20%, SDS 2%, beta-mercaptoetano! 5%) fervidos por 4 minutos.

As amostras sofreram eletroforese em corrente cons- tantede18maA por5 horas a 4º C usando um fornecimento de energia de célula xi Protein Il (BioRad Laboratories, Richmond, CA, modelo 1000/500). Os padrões de SDS-PAGE das proteínas cultivadas sob quela- ção com zinco e/ou cobre mostraram padrões de formação de faixa únicos em todos os isolados que eram diferentes quando comparado com os mes- mos isolatos cultivados sob restrição de ferro na presença de 2,2'-dipiridila.

Por exemplo, quando o isolato 19636 foi cultivado sob restrição de ferro ou - na presença do quelante 2,2'-dipiridila, proteínas reguladas por ferro únicas foram expressas nas regiões de 87,73 kDa, 54,53 kDa, 38,42 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kKDa, 34,91 kDa e 33,0 kDa.

Essas proteínas foram subreguladas - 15 quando o isolato foi cultivado na presença de cloreto férrico.

No entanto, quando o mesmo isolato foi cultivado na presença do quelante de zinco e/ou cobre, um novo subconjunto de proteínas foi expresso com relação às prote- Ínas expressas sob restrição de ferro; as novas proteínas tendo pesos mole- culares de aproximadamente 115 kDa, 88 kDa, 80 kDa, 71 kDa, 69 kDa, 35 kDa,30 kDa,29 kDa e 27 kDa.

Ainda, uma proteina de 87,73 kDa foi ex pressa sob condições de restrição de ferro ou restrição de cobre, mas não quando as culturas eram restritas em zinco.

As proteínas expressas sob res- trição de ferro pareciam ser subreguladas quando cultivadas sob ou restrição de zinco e/ou restrição de cobre, mas não completamente inativadas con- forme visto quando o isolato foi cultivado em cloreto férrico.

Parece que há novas proteinas expressas quando o organismo é cultivado sob restrição de cobre e/ou restrição de ferro que não são ex- pressas quando o mesmo isolado é cultivado sob condições restritas em fer- ro.

Uma vez que metais de transição são usados por organismos para for- mar enzimas que catalisam várias reações bioquímicas, os íons de metal podem desempenhar um papel vital em sobrevivência microbiana durante uma infecção sistêmica.

Talvez seja por essa razão que durante sepse há

TERRE AESA Da o EANES SEARA NAAS 131/187 uma diminuição transiente na disponibilidade desses metais transicionais, tornando-os indisponíveis para cultivo do organismo.

Essas novas proteínas poderiam aumentar muito bem a eficácia de proteção da composição exis- tente cultivada sob restrição de ferro porque elas podem também ser ex- pressas pelas bactérias sob a restrição de íon de metal sofrida durante inva- são sistêmica.

Exemplo 7 As composições da presente invenção podem também ser pro- duzidas sob condições comerciais de grande escala Fermentação

Um frasco criogênico da semente de trabalho (2 ml! a 10º

CFU/MmI) conforme descrito no Exemplo 1 foi usado para inocular 500 m! de Caldo de Soja Tríptico (TSB) sem dextrose (Difco) preaquecido para 37º C i contendo 0,125 g/l de 2,2-dipirídila (Sigma), 2,7 gramas de extrato de leve- : 15 dura BiTek (Difco) e glicerol (3% vol/vol). A cultuva foi incubada a 37º C por 12 horas enquanto agitando a 200 rpm momento quando ela foi usada para

' inocular 2 litros do meio acima e deixada crescer por mais 4 horas a 37º C.

Esta cultura foi usada para inocular um fermentador de bancada VIRTIS de litros (Virtis, Gardiner, NY) carregado com 13 litros do meio descrito aci-

20 ma O pH foimantido constante entre 6,9 e 7,1 através de titulação automá-

tica com NaOH 50% e HCl 10%. A velocidade de agitação foi ajustada a 400 reviminuto e a cultura aerada com 11 litros ar/minuto a 37º C.

Espumação foi controlada automaticamente através da adição de 11 m! de desespumante

(Mazu DF 204 Chem/Serv, Mineápolis, MN). A cultura foi deixada crescer continuamente nessas condições por 4 horas momento quando foi esteril- mente bombeada em um fermentador de 150 litros (W.B.

Moore, Easton,

PA). O fermentador foi carregado com 120 litros de caldo de soja tríptico sem dextrose (3.600,0 gramas), extrato de levedura BiTek (600 gramas),

glicerol (3.600 ml), 2,2-dipiridila (3,0 gramas) e desepumante Mazu DF 204

(60ml). Os parâmetros da fermentação eram como segue: oxigênio dissolvi-

do (DO) (Dissolved Oxygen) foi mantido a 30% +/- 10% através do aumento da agitação para 220 rev/min aspergido com 60 litros de ar/minuto e 68,94

Kpa (10 libras por polegada quadrada (psi)) de pressão contrária. O pH foi mantido constante entre 6,9 e 7,1 através de titulação automática com NaOH 50% e HCl 10% e a temperatura mantida a 37º C. Na hora 4,5 (OD540 8-9) da fermentação a cultura foi transferida para um fermentador New Brunswick — Scientific de 1.500 litros IF-15000 carregado com 1200 litros de caldo de soja tríptico sem dextrose (36.000 gramas), extrato de levedura BiTek (6.000 gramas), glicerol (36.000 ml), 2,2-dipiridila (30,0 gramas) e desespumante Mazu DF 204 (600 m!). Os parâmetros da fermentação foram como segue: oxigênio dissolvido (DO) foi mantido a 60% +/- 10% com oxigênio suplemen- tar através do aumento da agitação para 300 rev/min aspergido com 300 a 1100 litros de ar/minuto e 34,473 Kpa (5 libras por polegada quadrada (psi)) : de pressão contrária. Conforme a fermentação progredia, oxigênio suple- mentar foi adicionado de 0-90 litros/minuto para auxiliar no controle de oxi- gênio dissolvido. O pH foi mantido constante entre 6,9 e 7,4 através de titu- . 15 lação automática com NaOH 50% e HCl 10% e a temperatura foi mantida a 37º C.

' Aproximadamente 5 horas pós-inoculação do fermentador gran- de, a cultura foi suplementada com nutrientes adicionais através da alimen- tação de 70 litros de meio contendo 18.000 gramas de TSB sem dextrose,

3.000 gramas de extrato de levedura, 30,0 gramas de 2,2-dipiridila e 18.000 ml de glicerol. A taxa de alimentação foi ajustada para aproximadamente 28 litros/hora enquanto aumentando a agitação. No final da alimentação a fer- mentação foi deixada continuar por mais 4 horas, ponto onde a fermentação foi terminada através da diminuição da temperatura do fermentador para 18º C(OCrs4o 35-40 em uma diluição 1:100).

Coleta A fermentação bacteriana foi concentrada e lavada usando um Pall Filtron Tangential Flow Maxiset-25 (Pall Filtron Corporation, Northboro, MA) equipado com três filtros de canal aberto Alpha 300-K de 30 pés?, No.

de catálogo ASSOOC5; (Pall Filtron) conectado a uma bomba de alimentação Waukesha Modelo U-60 (Waukesha Cherry-Burrell, Delevan, WI). O volume de cultura original de 1250 litros foi reduzido para 50 litros (2,5 litros/minuto)

usando uma pressão de entrada de filtro de 206,84 Kpa (30 psi) e uma pres- são de retentato de 34,473 - 41,368 Kpa (5-6 psi). O retentato bacteriano foi ajustado de volta para 150 litros usando Solução Salina Tamponada com Tris, pH 8,5, e então concentrado novamente para 50 litros para ajudar a — remover quaisquer proteínas exógenas contaminantes, tais como exoproteí- nas, para incluir toxinas e proteases secretadas.

O pH elevado da solução salina tamponada com tris ajuda a prevenir muito da degradação proteolítica que pode ocorrer durante armazenamento da suspensão de célula integral.

Inibidores de protease podem ser usados ao invés de, ou em adição a, um pH elevado.

O retentato foi misturado completamente enquanto no tanque de 200 litros usando um misturador magneticamente acionado de montagem : frontal.

O retentato foi esterilmente despejado (3,5 litros) em recipientes Nal- gene de 4 litros estéreis No. 2122 e posto em um freezer a -20º C para ar- ' mazenamento como um ponto de ruptura na fabricação, ou poderia ser pro- . 15 cessado mais.

A massa do pélete foi calculada através de centrifugação de amostras de 30 ml da cultura fermentada e coleta final.

Em suma, tubos cô- ' nicos Nalgene de 50 ml pré-pesados foram centrifugados a 39.000 x g por 90 minutos em uma centrífuga Beckman J2-21 usando um rotor JA-21 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). No final da atividade, o sobrenadante foijogado fora e os tubos foram pesados novamente.

A massa do pélete foi calculada para cada estágio.

O processo de fermentação rendeu uma massa de pélete úmida de aproximadamente 60 quilogramas.

Rompimento Oitenta quilogramas de pasta fluida de célula bacteriana em So- lução Salina Tamponada com Tris, pH 8,5, foram assepticamente transferi- dos para um tanque de processo revestido de 1000 litros de vapor local (Le- e, Modelo 259LU) com um misturador montado na parte superior (Eastern, Modelo TME-1/2, EMI Incorporatede, Clinton, CT) contendo 900 litros de TBS pH 8,5. A suspensão bacteriana bruta foi esfriada para 4º C com mistu- ra contínua por 18 horas a 200 rpm momento quando foi rompida através de homogeneização.

Em suma, o tanque de 1000 litros contendo a suspensão bacteriana foi conectado a um homogeneizador AVESTIN modelo C-500-B

(Avestin Inc., Ottawa, Canadá). Um segundo tanque de processo revestido de 1000 litros (vazio) foi conectado ao homogeneizador de maneira que o fluido no tanque de processo pudesse ser passado pelo homogeneizador, para o tanque vazio e de volta novamente permitindo passagens de homo- geneização múltiplas enquanto ainda mantendo um sistema fechado. A tem- peratura durante a homogeneização foi mantida a 4º C. No início da primeira passagem, fluido foi circulado a 482,63 Kpa (70 psi) através de uma bomba Waukesha modelo 10DO (Waukesha) através do homogeneizador (500 ga- lões/hora), enquanto a pressão do homogeneizador era ajustada para 206,84 Mpa (30.000 psi). Antes da primeira passagem, duas amostras de pré-homogeneização foram retiradas do homogeneizador para estabelecer uma linha de base para determinação do grau de rompimento e monitora- mento do pH. O grau de rompimento foi monitorado através de transmitância ] (%T a 540 nm em diluição 1:100) comparado com a amostra não- : 15 homogeneizada. O número de passagens pelo homogeneizador foi padroni- zado para dar uma transmitância percentual final entre 78-91%T em uma diluição 1:100 preferivelmente entre 86-91%). Após homogeneização, o tan- que foi removido do homogeneizador e posto em uma alça resfriadora a 4º C e misturado a 240 rpm.

Coletade Proteína A suspensão bacteriana rompida contendo as proteínas regula- das por ferro conforme ilustrado na Figura 1 foi coletada através de centrifu- gação usando T-1 Sharples, (Alfa Laval Seperations, Warminster, PA). Em suma, o tanque de processo revestido de 1000 litros contendo homogenato bacteriano rompido foi alimentado em 12 Sharples com uma taxa de alimen- tação de 250 mlíminuto a 117,21 Kpa (17 psi) em uma força centrífuga de

60.000 x g. O efluente foi coletado em um segundo tanque de processo re- vestido de 1000 litros através de uma alça estéril fechada permitindo passa- gens múltiplas através das centrifugas enquanto mantendo um sistema fe- —chado. A temperatura durante a centrifugação foi mantida a 4º C. O homo- genato foi passado 8 vezes através das centríifugas. Aproximadamente 50% da proteína foram coletados após a segunda passagem, ponto onde o fluido homogenato foi concentrado para 1/3 de seu volume original, o que diminuiu o tempo de processo para as próximas 6 passagens.

O tanque de homoge- nato foi assepticamente desconectado das centrífugas e conectado a uma montagem Millipore Pellicon Tangential Flow Filter (Millipore Corporation, Bedford, MA) equipada com um filtro Centrasette série Alpha 30K de canal de tela de 25 pés? (Pall Filtron) conectado a uma bomba de alimentação Waukesha Modelo U30 para concentração.

Após concentração, centrifuga- ção foi continuada até que o processo estivesse completo.

Proteína foi cole- tada após cada passagem.

A proteína foi coletada, ressuspensa e despejada em5O litros de solução salina tamponada com Tris, pH 8,5, contendo formu- lina 0,15% (Sigma) como preservativo.

Diafiltragem A suspensão de proteína foi lavada através de diafiltragem a 4º : C para remover quaisquer proteínas exógenas (proteases, toxinas, enzimas r 15 citoplásmicas e metabólicas, etc). Em suma, os 50 litros de proteína foram esterilmente transferidos para um tanque de processo de 200 litros contendo 150 litros de solução salina tamponada com Tris, pH 8,5, equipado com um misturador Dayton frontal, Modelo 27846 (Dayton Electric, Chicago, IL) gi- rando em 125 rev/minuto.

O tanque de processo foi esterilmente conectado auma montagem Milipore Pellicon Tangential Flow Filter (Millipore Corpora- tion) equipado com um filtro Centrasette série Alpha 30K de canal de tela de pés? (Pall Filtton) conectado a uma bomba de alimentação Waukesha Modelo U30. A solução de proteina de 200 litros foi concentrada através de filtragem para um volume alvo de 50 litros ponto onde 150 litros de solução 25 salina estéril foram adicionados.

A suspensão de proteína foi então concen- trada para aproximadamente 50 litros, O concentrado de proteína foi arma- zenado em um tanque de processo revestido de 50 litros equipado com um misturador montado na parte superior e armazenado a 4º C.

É interessante notar que a composição derivada do processo de larga escala usando homogeneização como um meio de rompimento gerou perfis de formação de faixa idênticos conforme examinado através de SDS- PAGE comparado com o processo em escala menor descrito no Exemplo 1.

Esses resultados mostram que lisostafina poderia ser substituída como o agente de lise bacteriana usando homogeneizador AVESTIN C500-B.

Esta constatação permite a geração em baixo custo de volumes grandes de pro- teínas reguladas por ferro de staphylococci.

Exemplo8 Hiperimunização de camundongos e preparação de anticorpo policlonal Imunização passiva com anticorpo purificado isolado de camun- dongos vacinados com proteínas derivadas de S. aureus linhagem ATCC 19636 cultivadas sob condições limitantes de ferro era protetora contra pro- vocações por S. aureus homóloga e heteróloga, Quinze camundongos adul- tos CD1 foram vacinados conforme descrito no Exemplo 3 com a composi- . ção de proteína derivada de S. aureus linhagem ATCC 19636 cultivada sob condições isentas de ferro conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os ca- mundongos foram vacinados intraperitonealmente 3 vezes em intervalos de - 15 7 diascom 50 ug de composição de proteína em cada vacinação, Sete dias após a terceira imunização, os camundongos sofreram sangria completa " através de punção cardíaca.

Soro foi agrupado e anticorpo purificado usando precipitação com sulfato de amônio padrão.

Proteínas do soro exógenas fo- ram removidas primeiro antes da precipitação do anticorpo através da adição de0,5 volume de sulfato de amônio saturado pH 7,2. A solução foi agitada a 100 rpm por 24 horas a 4º C.

A solução foi novamente centrifugada a 3000 x g por 30 minutos.

O sobrenadante foi coletado e precipitado novamente a- través da adição de sulfato de amônio saturado suficiente para trazer a con- centração final para 55% de saturação.

A solução foi agitada a 100 rpm por 24horasad4ºC.oO precipitado foi centrifugado a 3000 x g por 30 minutos.

O pélete final de cada amostra foi ressuspenso em 2 ml de PBS, pH 7,2. Os anticorpos precipitados foram então dialisados usando uma tubulação de diálise de corte molecular de 50.000 (Pierce, Rockford, IL) por 30 horas con- tra três mudanças de 1 litro de solução salina tamponada com fosfato para — remover sulfato de amônio.

As duas primeiras mudanças de litro foram pre- servadas com azida de sódio 0,02%. A mudança de tampão de 1 litro final não continha nenhum preservativo.

O dialisato foi coletado e centrifugado

REREREREE aa SSt EANADALRNEÁESEEEEESESSALAA SESA 137/187 novamente para remover quaisquer restos remanescentes a 3000 x g por 30 minutos.

A solução de anticorpo foi armazenada a 4º C por menos de 48 horas antes do uso.

Cada amostra foi plaqueada em ágar de sangue para verificar a esterilidade antes da infusão.

Exemplo9 Imunização passiva e provocação A fim de avaliar o efeito protetor de anticorpo infundido criado contra proteínas S, aureus expressas durante limitação de ferro, dois grupos de 15 camundongos foram, cada um, infundidos intraperitonealmente ou coma preparação de anticorpo purificada (Grupo 1) ou solução salina fisio- lógica (Grupo 2) em uma infusão de 200 ul.

Dois grupos adicionais de 15 camundongos foram infundidos subcutaneamente ou com preparação de anticorpo purificada (Grupo 3) ou solução salina fisiológica (Grupo 4). Após 60 minutos, os 2 grupos de 15 camundongos recebendo uma infusão intra- - 15 peritoneal foram provocados intraperitonealmente com 1,3 x 10º cfu de S. aureus linhagem 19636, Similarmente, os 2 grupos de 15 camundongos re- , cebendo uma infusão subcutânea foram provocados subcutaneamente com 1,3 x 10º cfu de S. aureus linhagem 1477 para teste quanto à proteção cru- zada contra provocação por uma linhagem de S. aureus diferente.

Mortali- dade e/ou tamanho da lesão foi registrado por 5 dias e os fígados de todos os camundongos foram removidos post-mortem, homogeneizados e plaque- ados para determinar o número de S. aureus presente como uma medida de infecção sistêmica.

As curvas de sobrevivência Kaplan-Meier (Figuras 5 e 6) mostram o efeito de proteção fornecido pela infusão de anticorpos de ca- —mundongos vacinados com as proteínas de S. aureus expressas durante restrição de ferro.

Embora a diferença entre os grupos infundidos e controle para grupos provocados com ATCC 19636 não fosse significante (p=0,076, teste log-rank), o fígado do único camundongo que morreu dentro do grupo infundido com anticorpo no Dia 1 foi culturado em ágar de sangue para de- terminar a ausência e/ou a presença do organismo de provocação (S. au- reus). A cultura derivada deste camundongo era negativa para Staphylococ- cus e não mostrou nenhum desenvolvimento na placa de ágar de sangue ou meio de cultura, Em contraste, os fígados dos camundongos que morreram dentro do grupo de placebo foram todos positivos para a presença de Staph- ylococcus, na verdade, culturas puras foram obtidas em cada placa de ágar de sangue derivada dos fígados desses camundongos.

Apesar dos dados de fígado não precludirem a possibilidade que o camundongo que morreu den- tro do grupo infundido com anticorpo morreu de infecção por S. aureus, a infecção não foi sistêmica, como foi no grupo de placebo, e o camundongo pode ter morrido por outras razões.

Verificação desta morte de camundongo infundido com anticorpo resulta em uma diferença significante entre trata- mentos infundidos com anticorpo e placebo (p=0,015, teste log-rank). Os dados para a provocação cruzada, onde os camundongos foram infundidos . com anticorpo gerado após vacinação com proteínas derivadas de ATCC 19636 e provocados por S. aureus linhagem 1477, também mostraram uma Ú tendência protetora.

Entre 7 e 14 dias pós-provocação, todos os camundon- : 15 gos nos grupos infundidos e não-infundidos começaram a desenvolver le- sões de pele necróticas.

No entanto, exame macroscópico de camundongos claramente revelou um retardo visível na formação de uma lesão observável bem como a severidade da lesão entre os grupos.

Camundongos infundidos desenvolveram lesões mais lentamente comparado com camundongos con- trole não-infundidos que desenvolveram lesão mais rápido do que os ca- mundongos infundidos e em um grau de severidade maior.

Os camundongos infundidos cicatrizaram mais rápido do que camundongos não-infundidos.

Isto era claramente evidente entre 21 e 35 dias pós-provocação.

Exame ma- croscópico de camundongos em 35 dias pós-provocação mostrou que ca- —mundongos não-infundidos foram seriamente desfigurados e revelou um grau maior de cicatrização.

Na realidade, muitos desses camundongos per- deram a postura normal, pelo fato de que eles pareciam ter aparência de- formada, em contraste com camundongos infundidos que quase não desen- volveram tecido de cicatriz extenso e/ou desfiguramento conforme ilustrado pela aparência deformada que os camundongos não-infundidos desenvolve- ram.

No geral, esses dados sugerem que infusão intraperitoneal de anticor- pos criados contra proteínas induzidas por ferro em S. aureus pode ambos proteger contra e limitar a severidade de infecção por S. aureus. Exemplo 10 Varredura de uma composição de vacina derivada de Staphylococcus au- reus em um rebanho leiteiro cronicamente infectado Um rebanho leiteiro comercial tendo uma história de contagens de célula somática cronicamente altas atribuível à Staphylococcus aureus foi escolhido para a varredura de uma composição de vacina conforme descrito no Exemplo 1. O critério para estabelecimento de eficácia da vacina deste estudo experimental foi: 1) incidência menor de mastite clínica causada por Staphylococcus aureus dentre controles vacinados comparado com não- vacinados, 2) melhora (isto é, uma diminuição) em contagem de célula so- . mática dentre vacinados comparado com controles e 3) diminuição em taxas de isolamento positivas de cultura de S. aureus entre controles vacinados e : não-vacinados. Sangue será coletado no momento da primeira vacinação - 15 (diaO)e novamente nas semanas 3 e 6 pós-imunização inicial. Reações de sítio de injeção ou reações sistêmicas seguindo vacinações foram monitora- das durante o estudo. Ainda, amostras de leite de tanque principal foram culturadas e quantitativamente enumeradas para determinar se houve uma diminuição no número de CFU de Staphylococcus aureus culturada após vacinação.

Três dos isolatos de Staphylococcus derivados de vacas leiteiras cronicamente infectadas dentro do rebanho foram cultivados sob condições de restrição de ferro e condições de não-restrição de ferro conforme descrito no Exemplo 1. Os três isolatos foram designados TTX101, TTX102 e TTX103. Amostras extraídas foram examinadas através de SDS-PAGE para comparar perfis de formação de faixa entre isolatos. Perfis de formação de faixa idênticos foram observados dentre os isolados examinados; às compo- sições feitas a partir de cada isolato incluíam proteínas tendo pesos molecu- lares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa,33,0kDae31,83kDa. Essas proteínas são dos mesmos pesos moleculares que anteriormente descrito na Tabela 7. Ainda, quando compa- rando os isolatos perfis de formação de faixa idênticos foram vistos com a-

quelas proteínas que eram expressas em todas as condições que não eram reguladas por ferro: 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58, kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa e 40 kDa.

Esses resultados estavam de acordo com as observações anteriores.

Um isolato designado TTX101 foi escolhido co- mooisolatopara fabricação de uma composição à ser usada neste estudo.

Exemplo 11 Preparação de vacina de Staphylococcus aureus (TTX101) Uma composição foi preparada conforme descrito no Exemplo 1 usando o isolato TIX101. A composição incluía proteínas expressas sob condições isentas de ferro tendo pesos moleculares de 87,73 kDa, 80,46 kDa, 65,08 kDa, 54,53 kDa, 37,37 kDa, 35,70 kDa, 34,91 kDa, 33,0 kDa e 31,83 kDa bem como proteínas não-reguladas por metal tendo pesos mole- culares de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa e 40 kDa.

A composição de imunização derivada da linhagem - 15 TTX101 foi usada para preparar a vacina experimental através da emulsifi- cação da suspensão de proteína extraída (400 ug de proteína total por milili- tro) em um adjuvante comercial (EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston NE) usando um recipiente de homogeneização T50 Ultra Turrax IKA (IKA, Cincinnati, OH) para dar uma dose final de 800 ug de proteina total em um volume injetável de 2,0 ml com uma concentração de adjuvante de 22,5% volívol.

A vacina foi administrada subcutaneamente 2 vezes em intervalos de 21 dias.

Exemplo 12 Projeto experimental e vacinação do rebanho Dezoito dias antes da primeira vacinação todas as vacas leitei- ras inscritas no estudo (N=80) foram testadas quanto à S. aureus através de métodos de cultura bacteriológica aeróbica padronizada através da cultura de amostras de leite indivíduais derivadas de cada vaca leiteira, Ainda, as Contagens de Célula Somática (SCC) foram enumeradas pela Dairy Herd Improvement Association usando métodos padrão.

Quatorze de 80 vacas foram clinicamente diagnosticadas com mastite e foram culturadas positivas para S. aureus.

As vacas restantes (N=66) testaram negativas para S. au-

reus. As oitenta vacas foram igualmente divididas em dois grupos designa- dos grupo-1, vacinado (N=40), e grupo-2, não-vacinado (N=40). As quatorze vacas positivas para Staphylococcus clinicamente diagnosticadas foram i- gualmente distribuídas entre ambos os grupos de maneira que cada grupo de estudo contivesse 7 vacas com mastite clínica, A SCC média entre gru- pos antes da primeira vacinação foi 203,219 nos controles não-vacinados comparado com 240,443 em vacinados (não estatisticamente diferentes p=0,7).

Dezoito dias após a primeira amostragem todas as vacas no grupo 1 foram vacinadas subcutaneamente na espádua superior direita com 2 ml de vacina conforme descrito no Exemplo 11. Dez dias após a primeira ' vacinação, amostras de leite foram obtidas neste período de tempo através do DHIA para a enumeração de células somáticas de cada vaca individual. Amostras de leite não foram bacteriologicamente testadas neste mesmo pe- - 15 ríodo de tempo para determinação da presença de Staphylococcus. A dife- rença na SSC entre os grupos neste período de tempo foi 125,241 (vacina- dos) comparado com 196,297 (controles). Isto era uma diferença de 36% no número de células somáticas entre os controles vacinados comparado com os não-vacinados. A diferença na SCC entre os controles e vacinados neste período de amostragem não foi estatisticamente diferente (p=0,5). A falta de diferença estatística na SCC entre os grupos em ambos os períodos de a- mostragem foi devido à grande variação em SCC individual entre as vacas. O sítio de injeção de cada vaca vacinada foi também examinado neste mesmo período de tempo. Nenhuma das vacas examinadas mostrou qual- quer reação de tecido adversa no sítio de injeção através de exame físico. Ainda, não houve nenhuma perda mensurável em produção de leite devido à vacinação. Vinte e um dias após a primeira vacinação todas as vacas no grupo-1 (vacinadas) receberam sua segunda vacinação ou reforço. Durante o período de tempo entre a primeira vacinação e a segunda vacinação, va- cas em ambos os grupos (vacinadas e controle) desenvolveram dano à teta devido a uma queda drástica na temperatura ambiental resultando na forma-

ção de lesões no final do teste, resultando no desenvolvimento de tetas in- fectadas e potencialmente aumentando o isolamento de Staphylococcus du- rante amostragem, o que foi observado no terceiro período de amostragem.

Vinte e três dias após a segunda vacinação amostras de leite foram obtidas através do DHIA para a enumeração de Células Somáticas de cada vaca individual.

Amostras de leite foram também bacteriologicamente testadas quanto à presença de Staphylococcus aureus.

Houve um aumento drástico em taxa de isolamento de S. aureus neste período de tempo nas vacas que testaram negativas no primeiro período de amostragem.

Nos controles não- vacinados, 42,9% dessas vacas agora testaram positivas para S. aureus, em contraste com as vacinadas, o que apenas mostrou um aumento de 35,5%. : Isto foi uma diferença de 7,4% entre vacinados conforme comparado com os controles não-vacinados.

É difícil dizer que a melhora na taxa de isolamento i de S. aureus no grupo vacinado foi devido ao efeito da vacina sozinha.

Uma - 15 pessoa não pode ignorar a dificuldade em obtenção de amostras de leite limpas de vacas que tinham dano à teta, o que poderia aumentar a contami- , nação potencial do leite por S. aureus quando obtendo a amostra.

Não obs- tante, havia uma diferença significante na SCC média entre vacinados com- parado com controles, A SCC média do grupo vacinado era 222.679 compa- rado com 404.278 células somáticas conforme medido no grupo controle.

Isso foi uma diferença de 44,9% entre vacinados quando comparado com os controles não-vacinados.

É interessante especular que a diferença vista na SCC entre esses grupos também coincide com a diferença na taxa de isola- mento de S. aureus entre os grupos.

No entanto, devido à grande variação emSCC entre animais individuais e o tamanho de amostra pequeno do teste experimental no número de animais a diferença não foi estatisticamente dife-

rente (p=0,28). Neste mesmo período de tempo o sítio de injeção de cada vaca vacinada foi examinado quanto a qualquer reação de tecido adversa que pudesse ter sido causada pela composição de vacina.

Nenhuma das vacas examinadas mostrou qualquer reação adversa no sítio de injeção através de exame físico.

As composições de vacina pareciam ser altamente compatí-

veis com tecido e não causaram nenhuma perda mensurável em produção de leite após cada vacinação.

Monitoramento das vacas é continuado através da medição de SSC e amostras de leite quanto à presença ou ausência de Staphylococcus aureus.

Algumas das vacas de cada grupo são vacinadas uma terceira vez em 42 dias após a segunda vacinação, Parece haver uma diferença favore- cendo o uso da composição de vacina para diminuição de contagens de cé- lula somática e controle de infecção causada por Staphylococcus aureus.

Monitoramento adicional inclui sorologia com base em títulos de anticorpo paraa composição vacinada, mudanças em produção de leite em vacas va- cinadas devido à melhora na saúde e SCC menor dos animais vacinados comparado com coortes não-vacinados.

Ainda, outros experimentos são conduzidos para investigar o índice de proteção da vacina com base em resposta de dose seguindo provocação com uma S. aureus virulenta. - 15 Exemplo13 Uma vez que pesos moleculares das proteínas dentre as linha- gens de S. aureus diferentes foram demonstrados ser similares e uma vez que proteção heteróloga foi observada no estudo de provocação de camun- dongo, a requerente procurou observar se as proteínas compartilhando pe- sos moleculares similares na Figura 1 eram proteínas similares.

A técnica escolhida para caracterizar as proteínas era espectrometria de massa por dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI-MS). Uma porção da composição foi dissolvida usando SDS-PAGE conforme descrito no E- xemplo 1 e o gel foi tingido com Coomassie Brilliant blue para visualizar as proteínas.

Materiais e Métodos Excisão e lavagem.

O gel foi lavado por 10 minutos com água duas vezes.

Cada faixa de proteína de interesse foi excisada cortando o mais próximo da faixa da proteína para reduzir a quantidade de gel presente naamostra.

Cada fatia de gel foi cortada em cubos de 1x1 mm e posta em tubo de 1,5 ml.

Os pedaços de gel foram lavados com água por 15 minutos.

Todos os volumes de solvente usados nas etapas de lavagem eram aproxi- madamente iguais a duas vezes o volume da fatia de gel. A fatia de gel foi em seguida lavada com água/acetonitrila (1:1) por 15 minutos. Quando as proteinas foram tingidas com prata, a mistura de água/acetonitrila foi remo- vida, os pedaços de gel secos em um concentrador/secador a vácuo SPE- EDVAC (ThermoSavant, Holbrook, NY) e então reduzidos e alquilados con- forme descrito abaixo. Quando os pedaços de gel não foram tingidos com prata, a mistura de água/acetonitrila foi removida e acetonitrila foi adicionada para cobrir até que os pedaços de gel ficassem um branco pegajoso, mo- mento quando a acetonitrila foi removida. Os pedaços de gel foram reidrata- dos em NH.HCO; 100 mM e após 5 minutos, um volume de acetonitrila igual a duas vezes o volume dos pedaços de gel foi adicionado. Isto foi incubado por 15 minutos, o líquido removido e o pedaços de gel secos em um SPE- EDVAC.

Redução e alquilação. Os pedaços de gel secos foram reidrata- dos em DTT 10 mM e NH,HCO;3 100 mM e incubados por 45 minutos a 56º ] C. Após permitir que os tubos esfriassem para temperatura ambiente, o li- quido foi removido e o mesmo volume de uma mistura de iodoacetamida 55 MM e NHHCO; 100 mM foi imediatamente adicionado. Isto foi incubado por 30 minutosem temperatura ambiente no escuro, O líquido foi removido, ace- tonitrila foi adicionada para cobrir até que os pedaços de gel ficassem um branco pegajoso, momento quando a acetonitrila foi removida. Os pedaços de gel foram reidratados em NH.HCO;s 100 mM e, após 5 minutos, um volu- me de acetonitrila igual a duas vezes o volume de pedaços de gel foi adicio- nado. lsto foi incubado por 5 minutos, o líquido removido e os pedaços de gel secos em um Speed vac. Se o gel fosse tingido com coomassie blue, e coomassie residual ainda permanecesse, a lavagem com NH,HCO; 100 mM /acetonitrila seria repetida. Digestão In-gel. Pedaços de gel foram completamente secos em um Speed Vac. Os pedaços foram reidratados em tampão de digestão (NHAHCO;3 50 MM, CaCl; 5 mM, 12,5 nanogramas por microlitro (ng/ul) trip- sina) a 4º C. Tampão suficiente foi adicionado para cobrir os pedaços de gel e mais foi adicionado conforme necessário. Os pedaços de gel foram incu- bados em gelo por 45 minutos e o sobrenadante removido e substituído com 5-2 pl! do mesmo tampão sem tripsina. Isto foi incubado a 37º C da noite pa- ra o dia em uma incubadora a ar. Extração de peptídeos. Um volume suficiente de NH,HCO; 25 MM foi adicionado para cobrir os pedaços de gel e incubados por 15 minutos (tipicamente em um sonificador de banho). O mesmo volume de acetonitrila foi adicionado e incubado por 15 minutos (em um sonificador de banho se possível) e o sobrenadante foi recuperado. A extração foi repetida duas ve- zes, usando ácido fórmico 5% ao invés de NH.HCO;3. Um volume suficiente de ácido fórmico 5% foi adicionado para cobrir os pedaços de gel e incubado . por 15 minutos (tipicamente em um sonificador de banho). O mesmo volume de acetonitrila foi adicionado e incubado por 15 minutos (tipicamente em um Ú sonificador de banho) e o sobrenadante foi recuperado. Os extratos foram - 15 agrupados e DTT 10 mM foi adicionado para uma concentração final de DTT 1 MM. A amostra foi seca em um concentrador/secador a vácuo SPEEDVAC ' para um volume final de aproximadamente 5 ul.

Dessalinização de peptídeos. As amostras foram dessalinizadas usando pontas de pipeta ZIPTIP (C18, Millipore, Billerica, MA) conforme su- gerido pelo fabricante. Em suma, uma amostra foi reconstituída em solução de reconstituição (5:95 acetonitrila:H2O, 0,1%-0,5% de ácido trifluoracético), centrifugadas e o pH checado para verificar que era menos do que 3. Uma ZIPTIP foi hidratada aspirando 10 ul de solução 1 (50:50 acetonitrila:H7O, ácido trifluoracético 0,1%) e descartando as alíquotas aspiradas. Isto foi se- —guidopor aspiração de 10 ul da solução 2 (ácido trifluoracético 0,1% em HO deionizada) e descarte das alíquotas aspiradas. A amostra foi carregada na ponta através de aspiração de 10 ul da amostra lentamente na ponta, expe- limento da mesma no tubo de amostra e repetição disso 5 a 6 vezes. Dez microlitros de solução 2 foram aspirados na ponta, a solução descartada a- través de expelimento e este processo foi repetido 5-7 vezes para lavar. Os peptídeos foram eluídos através de aspiração de 2,5 ul de solução gelada 3 (60:40, acetonitrila:H,O, ácido trifluoracético 0,1%), expelimento e então as-

— w sussa SEAL AS SA aire sanar esa A AESA ASSES NES 146/187 piração novamente da mesma alíquota para dentro e para fora da ponta 3 vezes, Após a solução ter sido expelida da ponta, o tubo é tampado e arma- zenado em gelo.

Mapeamento de peptídeo espectrométrico de massa. Os peptí- deos foram suspensos em 10 ui a 30 ul de ácido fórmico 5% e analisados através de MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA). O espectro de massa dos fragmentos de peptídeo foi determinado conforme sugerido pelo fabricante. Em suma, uma amostra contendo os peptídeos resultantes de uma digestão tríptica foi examinada com matriz ácido ciano-4- hidroxicinâmico, transferida para um alvo e deixada secar. A amostra seca foi posta no espectrômetro de massa, irradiada e o tempo de voo de cada íon detectado e usado para determinar uma impressão digital de massa de peptídeo para cada proteína presente na composição. Polipeptídeos conhe- cidos foram usados para padronizar a máquina.

Análise de dados. As massas experimentalmente observadas para os peptídeos em cada espectro de massa foram comparadas com as Massas esperadas de proteínas usando o método de pesquisa Peptide Mass Fingerprint da Mascot search engine (Matrix Science Ltd., Londres, RU, e www. matrixscience.com, vide Perkins e outros, Electrophoresis 20, 3551- 3567 (1999)) Os parâmetros de pesquisa incluíam: banco de dados, MSDB ou NCBlnr; taxonomia, bactérias (eubactérias) ou Firmicutes (bactérias gram-positivas); tipo de pesquisa, impressão digital de massa de peptídeo; enzima, tripsina; modificações fixas, carbamidometila (C) ou nenhum; modi- ficações variáveis, oxidação (M), carbamidometila (C), a combinação, ou nenhum; valores de massa, monoisotópico; massa de proteína, não-restrita; tolerância de massa de peptídeo, entre + 150 ppm e + 430 ppm ou + 1 Da; estado de carga de peptídeo, Mr; clivagens perdidas max, O ou 1; número de interrogações, 20.

Resultados O resultado desta pesquisa foi uma impressão digital de massa para cada proteina presente na composição como é mostrado nas Tabelas 2,3,4€5.

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E RSA SENTES: 147/187 Exemplo 14 Identificação de famílias de proteina regulada por ferro usando análise de expressão de gene com base em microdisposição de S. aureus cultivada sob condições com baixo teor de ferro Para análise de microdisposição, as bactérias foram culturadas em meios quimicamente definidos (CDM) (Chemically Defined Media) feitos a partir de soluções de estoque individuais (Tabela 10). Tabela 10: Meio quimicamente definido (CDM) para Staphylococcus aureus [Final] Composição Adicionar de estoque all Sais (20X) g/L 9/500 ml! 50 ml ' K2HPO, 7 70 KH2PO, 2 20 Citrato de Na; 147 14,7 : 15 (NH)2SO,s 1 10 Carboidrato (40X) g/L 9/500 ml! 25 ml ' Glicose 5 100 Vitaminas (1000X) mg/L mg/100 ml 1ml Tiamina 1 100 Ácido nicotínico o5 50 Biotina 0,005 diluição” Pantotenato de cálcio 0,25 25 Nucleotídeos (100X) mg/L mg/100 mi* 10 ml *Dissolver em 100 ml de HCI 2N Adenina 5 50 Guanina 5 50 Citosina 5 50 Uracila 5 50 Timina 10 200

Micronutrientes (1000X) —uM mg/100 ml! estoqueAB* 1 ml! *Fazer estoques A e B, então adicionar 1 ml de cada a 98 ml de ddH20O para fazer estoque final (A)

CaCl 0,5 735 H3BO; 0,5 309 CoCk 0,05 118 (NHa)sMOo7O>24 0,005 62

(B) CuSO, 01 125

. MnNSO, 01 169 ZnSO,. 0,05 144 : Individual MgSO,. 100 FeSO, ou outro 10-50 - Aminoácidos (200X) mg/L 9/100 ml 5 ml

*Autoclave a menos que de outro modo indicado Refrigerar

Ácido aspártico (0,1 M HCI) 90 1,8 Prolina 80 1,6 Alanina 60 1,2 Histidina 20 04 Valina 80 1,6

Arginina 50 1,0 Serina 30 0,6 Metionina 3 0,06 Isoleucina 30 0,6 Filtrado refrigerado no escuro

Triptofano 10 0,2 Tirosina (0,5 M NaOH) 50 1,0 Temperature ambiente Ácido glutâmico 100 2,0

Leucina 90 1,8 Fenilalanina 40 0,8 Glicina 50 1,0 Treonina 30 0,6 Lisina 50 1,0 Cisteina diariamente fresca 20 04 MÉTODO DE FABRICAÇÃO: ' Para fabricação de meios isentos de ferro, combinar todas as so- luções de estoque exceto cátions e micronutrientes e levar para volume a- propriado em frasco volumétrico usando água purificada MilliQ e deixando ' volume de veio suficiente para acomodar adições de cátion.

Adicionar 15 g de resina CHELEX por 1 L de meio e agitar em temperatura ambiente por pelo menos 2 horas.

Filtrar a solução em garrafa de vidro tratada com ácido - 15 sulfúrico (10%) usando filtro de garrafa superior de 2 um.

Adicionar soluções de estoque de cátion filtradas e armazenar a 4º C no escuro por até 2 sema- nas.

Linhagens RF122 (isolada de mastite bovina) e MSA553 de S. aureus (isoladas da síndrome do choque tóxico humano) foram usadas.

Am- bos os isolatos foram espalhados em ágar de caldo de soja tríptico direta- mente a partir de estoques de congelador de passagem secundária antes do uso em experimentos.

CDM continha concentrações de citrato finais aproxi- madamente análogas àquelas no leite bovino (5 mM). Para CDM isento de ferro, os componentes que seguem foram combinados (volume total de 0,998L)e adicionados a 15 g de resina CHELEX (BioRad Laboratories, Her- cules, CA), então agitados por 1,5 hora em temperatura ambiente: sal, glico- se, aminoácidos, vitamina e nucleotídeos.

O meio de base sem ferro foi en- tão filtrado usando filtros de garrafa superiores de 2 um (Nalgene Nunc In- ternational, Rochester, NY) em garrafas tratadas com ácido sulfúrico, após o que micronutrientes e MgCl; 100 UM (ambas as soluções preparadas em vidraria tratada com ácido com água MÍilliQ) foram adicionados.

CDM foi ar- mazenado a 4º C no escuro até o uso.

Uma única colônia bacteriana foi inoculada em 3 m! de CDM |- sento de ferro em um tubo de cultura de vidro tratado com ácido de 25 ml e agitada da noite para o dia a 250 rpm em uma incubadora a 37º C.

Um milili- tro da subcultura foi então usado para inocular 500 ml de CDM em um frasco Erlenmeyerde 2500 ml no dia seguinte.

As culturas foram incubadas a 37º C com agitação a 250 rpm.

Culturas de CDM isentas de ferro levaram aproxi- madamente duas vezes mais que CDM + FeSO, 50 uM para atingir uma OD de 1,0 (18 h versus 36 horas). Em fase média-log (OD=0,600), alíquotas de cultura de 4x100 ml foram distribuídas em frascos Erlenmeyer de 500 ml e deixadas agitar na incubadora por 10 minutos antes da adição de soluções de ferro experimentais.

A um frasco, 300 ul de lactoferrina bovina (50 mg/ml, Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO) foram adicionados para uma concentração final de 150 ua/ml.

A outro frasco, 50 ul de citrato férrico (100 nM) foram adi- cionados.

O dois frascos controle restantes não receberam quaisquer su- ' 15 plementos.

Em 5, 30, 60 e 120 minutos, 7,5 ml de cultura foram coletados e adicionados a 5 ml de solução de tiocianato de guanidina contendo B- : mercaptoetanol e lauril sarcosina de sódio 0,5%. As soluções foram mistura- das completamente para parar a transcrição e centrifugadas a 4.000 x g por 8 minutos a 8º C; sobrenadantes foram despejados e as células foram con- geladas em 250 ul de Trizol (Invitrogen) usando um banho de etanol/gelo seco, então armazenadas a -80º C até extração de RNA.

Para extração de RNA, os péletes de célula foram descongela- dos em gelo e 750 ul de Trizol (Invitrogen, Carisbad, CA) foram adicionados.

As células foram ressuspensas através de vórtex e a pasta fluida foi transfe- rida para um tubo de tampa de rosca de 2 ml! contendo contas de sílica- zircônio de 0,1 mm, então batidas 3 x 2 minutos em um BeadBeater (Bios- pec Products, Inc., Bartlesville, OK) com incubação em gelo entre as repeti- ções.

As pastas fluidas foram incubadas mais 20 minutos em temperatura ambiente, seguido por centrifugação para contas de pélete e componentes celulares. 400 ul de clorofórmio foram adicionados e misturados através de inversão, incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e os tubos foram centrifugados 8 minutos a 12.000 X g a 8º C.

A camada aquosa foi removida e RNA precipitado com 400 ul de isopropanol seguido por lavagem com 1 ml de etanol 70%. Péletes de RNA transparentes foram secos ao ar rapidamente e ressuspensos em 100 ul de RNase-H2O livre.

DNA foi digeri- do usando kit de DNase padrão (Qiagen, Valencia CA) seguido por limpeza de acordo com as instruções do fabricante em colunas Rneasy (Qiagen). Finalmente, um kit DNA-livre Turbo (Ambion, Austin, TX) foi usado para as- segurar eliminação de DNA da preparação.

RNA foi medido em um espec- trômetro e ativado em um Agilent Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) para verificar qualidade e quantidade antes da degeneração de cDNA para hibri-

dizaçãode microdisposição.

Análise de microdisposição foi realizada de acordo com protoco- ' los estabelecidos.

A disposição, caracterizando 3841 oligonucleotídeos de 70mer (Illumina, São Diego, CA) representando estruturas de leitura aberta : (ORFs) de nove genomas de S. aureus sequenciados incluindo RF122 e - 15 MSAS553, foi colocada em triplicata em lâminas revestidas com aminossilano Gaps || (Corning, Acton MA) usando um BioRobotics Microgrid Il Array Spot- ' ter (BioRobotics, Cambridge, RU). As lâminas foram novamente hidratadas, reticuladas com UV e armazenadas sob dissecação.

Imediatamente antes da hibridização, as lâminas foram incubadas por 1 hora a 42º C em tampão de pré-hibridização consistindo em 25 ml de formamida, 1,25 ml de SSC 20X, 12 ml! de dH20, 500 ul de SDS 10% e BSA 0,5 g.

As lâminas foram en- xaguadas com 2 L de água MIIliQ e secas através de centrifugação.

Para preparar amostras, 8-10 ug de RNA bacteriano total foram incubados com 20 ug de hexâmeros aleatórios a 70º C por 10 minutos, seguido por transcri- ção reversa com incorporação de amino-alila usando Superscript 1! (Invitro- gen) e dUTP acoplado à amino-alila (Sigma). cDNA rotulado foi neutralizado, purificado, seco e ressuspenso em corante fluorescente Cy3 ou Cy5 (Amer- sham Biosciences Corp., Piscataway, NJ); acoplamento aconteceu por 2 horas.

Amostras de cDNA fluorescentemente marcadas (12 ul cada) foram lavadas usando um kit de purificação de PCR Qiagen, combinadas e adicio- nadas a 9,8 ul de formamida, 6,8 ul de SSX 20X, 3,4 ul de DNA de esperma de salmão (10 mg/ml, Invitrogen) e 1 ul de SDS 10%. As amostras foram incubadas por 2 minutos a 99,9% em um ciclizador térmico e deixadas esfri- ar antes da aplicação à disposição.

As sondas foram então aplicadas à dis- posição, cobertas com uma tampa de vidro e incubadas da noite para o dia em um banho de água a 42º C.

As lâminas foram lavadas completamente emtampõesde SCC diluídos após 12-16 horas de incubação e varridas u- sando um Scanner Axon 4100B e Software Axon GenePix (Axon Instru- ments, Union City, CA). Dados de intensidade brutos foram exportados para GeneSpring (Agilent Technologies [Silicon Genetics] Palo Alto, CA) para normalização e filtragem.

Os spots foram globalmente normalizados, filtrados com base em valores de intensidade brutos mínimos (>1500) e as triplicatas tiveram a média tirada.

Cada experimento foi realizado duas vezes e uma " lâmina única foi ativada para cada um usando uma troca de corante entre os pontos de tempo compatíveis.

Desta maneira, pelo menos 6 pontos de da- dos de troca de corante foram gerados para cada gene em cada ponto de - 15 tempo, representando pelo menos 2 réplicas biológicas.

Os dados foram a- nalisados mais através de agrupamento hierárquico (distância Euclidiana, ligação média, UPGMA) e agrupamento por K-means (distância medida com base em correlação não-centrada) usando EPCLUST (Jaak Vilo, EBI) e SpotFire (SpotFire, Somerville, MA). Análise de significância para Microdis- posições (SAM (157)) foi usada em razões log médias-centradas usando o modelo de uma classe em todos os pontos de tempo para determinar se ex- pressão do gene diferiu significantemente de zero.

Valores delta adstringen- tes foram usados de maneira que a porcentagem de falsos positivos foi es- timada ser zero.

Um sumário de operons mostrando super- ou sub- regulagem similar através de análise SAM é mostrado na Tabela 11, apoian-

do a habilidade das disposições em detectar resposta biológicas.

Tabela 11. Agrupamentos operônicos com respostas transcripcionais coor- denadas identificados usando análise de microdisposição de expressão de gene de S. aureus No. de sondas coordenada- mente expressas ID do Ope- Função Resposta Genes não- | Funcionalmen- ron regulados te relaciona- contíguos dos, mas não contíguos Sir transporte | Suprarregu- 3 de cátion lada em teor de ferro baixo - Fhu transporte Suprarregu- 3 1 de cátion lada em teor : de ferro baixo transporte | Suprarregu- N/A ' de oligopep- | lada em teor tídeo de ferro baixo ' transporte | Suprarregu- 3 1 de cátion lada em teor de ferro baixo Pfl (Formato | fermentação Suprarre- 2 4 acetiltrans- gulada na ferase) presença de lactoferrina Para clonagem padrão de proteínas, os genes apropriados fo- ram amplificados a partir de DNA extraído de S. aureus (linhagem ATCC19636) através de reação em cadeia da polimerase padrão. Os inicia- dores foram projetados para incorporar sítios de endonuclease de restrição Stul e Kpnl e são mostrados abaixo: Tabela12. Iniciadores de Clonagem: Gene (inicia- Sequência de Iniciador SEQ ID dor) NO Pflb (5a 3) | GCAGGCCTTTAGAAACAAATAAAAATCATG Pflb(3.a5) | TATGGTACCTTACATACTTTCATGGAATG- | ss

TACG dor) NO [Opp1A (5a 3) | GCAGGCCTARAARAGAMAACAAGCARTTAA |. 509 |

GAA AGG TATT ' ATTIT ' ATGGCTCGT CATCTCT ACTA CAG GAT AGTT GAT

ATT DNA extraído de S. aureus ATCC 19636 foi usado como o mol- de. Amplicons de DNA foram verificados através de eletroforese em gel e as faixas amplificadas de DNA foram excisadas, purificadas, digeridas e ligadas em vetor pQE30-Xa de corte, transformadas em E. coli XL-1 competente e avaliadas quando à resistência à ampicilina. Clones resistentes foram avali- ados quanto a insertos de plasmídeo usando PCR de colônia.

Exemplo 15 Varredura de imunorreatividade de candidatos à proteína protetora Para avaliar a reatividade de anticorpo das proteínas identifica- das a partir da análise MALDI-TOF (Exemplo 13) e/ou microdisposição e análise genômica (Exemplo 14), uma varredura de duas partes foi usada para avaliar proteínas staphylococcais individualmente expressas. A primeira varredura rápida usou fragmentos de PCR transcripcionalmente ativos para pesquisar ligação de anticorpo a quantidades pequenas de proteína candida- ta expressa usando um lisato de E. coli livre de célula. A segunda varredura usou clonagem, expressão e purificação com base em PCR padrão de prote- inas em E. coli usando um vetor comercial (pQE30Xa, Qiagen, Valência, CA) a fim de validar candidatos positivos para a primeira varredura. A segunda varredura também gerou estoques de semente máster de células hospedeiro de E. coli contendo o vetor de expressão correspondendo a cada candidato * 15 à proteina imunorreativa para produção e purificação de proteína suficiente para vacinação e experimentação.

Ú Um método de alto rendimento para geração de antígenos SIRP individuais foi usado para testar vários genes candidatos codificando proteí- nas S. aureus envolvidas em metabolismo de metal, Este método gera um —amplicon de PCR transcripcionalmente ativo (TAP) usando uma reação de PCR de 2 etapas com iniciadores que adicionam um rótulo Hiss promotor, terminador e C-terminal. Os amplicons transcripcionalmente ativos resultan- tes foram usados como um molde para a produção de proteína em uma rea- ção de transcrição/tradução in vitro livre de célula consistindo em lisato de céluladef£. coli, aminoácidos e tampões. A reação de PCR de duas etapas requereu um primeiro conjunto de iniciadores específicos para o gene de interesse que também incluía uma sequência de ligante compatível com o segundo conjunto de iniciadores, Cada iniciador mostrado para a primeira etapa de PCR foi projetado para excluir sequências de sinal de processa- mento de membrana para prevenir integração à membrana celular e são mostrados abaixo.

ssa Ea 156/187 Tabela 13. Iniciadores TAP: dor) NO Pfib(3.a5) | TTAATGATGATGATGATGATGCATACTTT- 526

CATG CAT

GATTGTTT |

AAACTTTITT GATGCTTTTGTTCTTTITITGA AGAAGGAGGATATACCATGAATAGGAA- TATCGTTAAA ' TTAATGATGATGATGAT- GATGTTTTGCTTTITCTGCAAT TAATTGCT AATTGCATC CATGCTTCC ACTTT

CAGCTTT Uma reação de PCR de 50 ul padrão foi realizada usando (1 u- nidade de High Fidelity Taq DNA polymerase (Invitrogen), iniciadores 0,2 —uM,dNTP2mM (cada), Mg” final 2 mM e aproximadamente 5 ng de molde de DNA de partida, tamponada para TrisSO, 60 mM (pH 8,9) e sulfato de amônio 18 mM). O protocolo de ciclização de PCR incluía 1 minuto de des- naturação inicial a 94º C, seguido por 30 ciclos como segue: Desnaturar/94º C/30s; Anelar/55º C/30s; Estender/68º C, 90s. Iniciadores idênticos com uma sobreposição apropriada foram utilizados para a segunda etapa da reação de PCR e foram fornecidos pelo fabricante (Genlantis). O produto de PCR de DNA resultante foi purificado para eliminar iniciador residual, sal e fragmen- tos de DNA e usado como um molde para uma segunda reação com um conjunto padrão de iniciadores para adicionar as sequências promotoras e terminadoras usando condições similares. O molde de DNA foi então purifi- cado e adicionado a uma mistura de reação Rapid Translation System RTS ' 100 livre de célula de E. coli (Roche) contendo 12 ul de lisato de E. coli, 12 ul de aminoácidos, 10 ul de mistura de reação, 1 ul de metionina adicionada, ' 5 pl de tampão de reconstituição e 10 ul de molde de DNA purificado da rea- - 15 çãode PCR de duas etapas. Seguindo incubação por 5 horas a 30º C, um microlitro de cada amostra de proteína (aproximadamente 0,5 ug/ul de prote- ' ína total) foi aplicado à membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) após saturação com metanol. O blot foi bloqueado da noite para o dia com NFDM 5%/TTBS, incubado com soros de camundongo hiperimunizados aumenta- dos, de proteína restrita em ferro (IRPE) (Iron-restricted protein, enhanced), diluído 1:500 ou anticorpo anti-Hisg (1:500), lavado, incubado com conjugado de fosfatase alcalina (AP) (Alkaline Phosphagase) anticamundongo de cabra (1:300), lavado e desenvolvido cromogenicamente (Kkit de desenvolvimento de cor Bio-Rad AP) por 20 minutos. Os lisatos contendo polipeptídeos soror- reativos foram identificados.

Os clones produzidos conforme descrito no Exemplo 14 foram cultivados para fase média-log, induzidos com IPTG 1 mM e cultivados por quatro horas. As células foram peletizadas, lavadas e lisadas em tampão de carga de SDS-PAGE fervente. Os lisatos brutos foram separados através de SDS-PAGE e tingidos com Coomassie. Um segundo conjunto de proteínas separadas foi transferido para membrana PVDF e immunoblotted com soros de camundongo hiperimunizados com varina IRPE diluídos 1:500 em NFDM |

1%/TTBS.

O blot foi lavado, incubado com anticorpo secundário anticamun- dongo de cabra conjugado com fosfatase alcalina (AP), lavado e desenvolvi do com substrato cromogênico.

Exemplo 16 Preparação de composições de imunização a partir de polipeptídeos recom- binantemente produzidos A fim de isolar polipeptídeos de S. aureus recombinantes para formulação de uma vacina, clones de E. coli descritos no Exemplo 14 foram cultivados a 37º C (225 rpm) para fase média-log (ODso0=04-06) em 1L de Caldo de Soja Tríptico e então induzido por 4 horas com isopropil B-D-1- tiogalactopiranosídeo 1 mM (IPTG). As culturas foram peletizada por 10 mi- nutos a 4º C em uma centrífuga Sorvall (400 x 9) e congeladas a -80º C an- tes de sofrerem o procedimento de purificação.

Péletes bacterianos foram então processados através de dois métodos diferentes, dependendo da so- - 15 lubilidade do polipeptídeo de S. aureus expresso em excesso.

Para polipeptídeos solúveis (por exemplo, MntC, FhuD, SYN2, | SirA ou SYN1), péletes bacterianos foram ressuspensos em 25 ml de rea- gente BUGBUSTER (Novagen) e submetidos a 15 minutos de sonificação em gelo usando um sonificador Brandon equipado com uma míicroponta (ci- — clodútil 65%, 5 saídas). Material insolúvel foi removido por 10 minutos de centrifugação (4000 x g). O sobrenadante solúvel foi filtrado (0,2 ug) e sub- metido à cromatografia de afinidade com metal (Ni-NTA His-Bind, Novagen) de acordo com as instruções providas pelo fabricante.

Para polipeptídeos insolúveis (por exemplo, PfIB ou Opp1A), os péletes bacterianos foram ressuspensos em 25 ml de reagente BUGBUS- TER (Novagen), postos em uma plataforma oscilante por 10 minutos e então submetida à centrifugação (15.000 x g por 12 minutos). O pélete resultante foi ressuspenso em 10 ml de BUGBUSTER mais 20 ml de BUGBUSTER diluído (1:10 em PBS) e submetido à centrifugação (5000 x g por 12 minu- tos) O pélete foi então ressuspenso em 20 ml! de BUGBUSTER diluído e submetido a uma etapa final de centrifugação (15.000 x g por 12 minutos). O pélete final foi ressuspenso em 10 ml de Tampão A (NaH2PO, 0,1M, Tris-

VER ERREI RARAS E FE GAARA ir SUE NORA DAS la RSA 159/187 HC! 0,01, Ureia 8M, pH 8,0) e incubado por 10 minutos em uma plataforma oscilante em temperatura ambiente.

As amostras foram então submetidas à centrifugação (12.000 x g por 20 minutos) e o sobrenadante resultante foi separado através de cromatografia por afinidade com metal (Ni-NTA His- Bind, Novagen) de acordo com as instruções providas pelo fabricante, mas com as modificações que seguem.

Após carregamento da coluna, 10 ml de Tampão A foram usados para equilibrar a resina.

Seguindo a ligação de po- lipeptídeo, a coluna foi lavada com 15 ml de Tampão B (NaH2PO, 0,1M, Tris-HCI 0,01, Ureia 8M, pH 6,0) e eluída usando 15 ml de Tampão C (NaH2PO40,1M, Tris-HCI 0,01, Ureia 8M, pH 4,5). Polipeptídeos recombinantes isolados foram eluídos das colunas ] em um volume de 15 ml e postos em cassetes de diálise de corte de 20 kDa : (Pierce) para diálise contra 21 de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Seguindo três mudanças de tampão durante 30 horas, os polipepti- * 15 deos foram removidos, filtrados (0,2 um) e concentrados para 2-3 ml de vo- lume usando dispositivos Centricon de corte de 20 kDa (Millipore). As con- centrações dos polipeptídeos purificados foram determinadas usando o mé- todo BCA padrão (Pierce). 10 ug de cada polipeptideo foram combinados e o volume ajus- tadopara 100 ul com PBS para formar uma composição de imunização.

Exemplo 17 Vacinação de camundongo Provocação IV (Estudo A) Cinquenta camundongos BALB/C fêmeas (N=50) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianapolis, IN) pesando 16-22 gramas fo- ram distribuídos em 3 grupos (10-20 camundongos/grupo). Os camundongos foram alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água foram fornecidas ad libitum a todos os camundongos.

Todas as vacinas foram formuladas com IFA 50% como um adjuvante.

Os camundongos foram vacinados subcutaneamente com 0,1 ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (70 ug/100 ul)

FRAGA ASAE NAS MEAN sia a NA LECCE 160/187 (Placebo, 20 camundongos).

Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (70 ug/100 ul) (Extrato de SIRP, 20 camundongos).

Grupo 3: Vacinado com polipeptídeo recombinante MntC (10 ugr100 ul) (fMniC, 10 camundongos). Provocação IP (Estudo B) Quarenta camundongos BALB/C fêmeas (N=40) obtidos do Har- lan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas foram igualmente distribuídos em 4 grupos (10 camundongos/grupo). Os camun- dongos foram alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camundongos por gaiola). Alimento e água foram fornecidos ad libitum a to- ' dos os camundongos. Todas as vacinas foram formuladas com IFA 50% como um adjuvante. Os camundongos foram vacinados subcutaneamente com 0,1 ml da composição apropriada em intervalos de 14 dias usando ou . 15 duas vacinações (Grupos 1-3) ou três vacinações (Grupo 4) como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado duas vezes com ovalbumina (70 Ú ug/100 ul) (Placebo).

Grupo 2: Vacinado duas vezes com proteínas ATCC 25904 ex- pressas sob restrição de ferro (70 ug/100 ul) (Extrato SIRP).

Grupo 3: Vacinado duas vezes com polipeptídeos recombinante PfIB, Opp1A, SirA, SYN2, FhuD, SYN1 e MntC (cada um 10 ug/100 ul, prote- ina total 70 pug/100 ul) ((SIRP7 (2x)).

Grupo 4: Vacinado três vezes com polipeptídeos recombinantes PfIB, Opp1A, SirA, SYN2, FhuD, SYN1 e MntC (cada um 10 upg/100 ul, prote- ínatotal70 ug/100 ul) ('(SIRP7 (3x)). Provocação IC (Estudo C) Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianapolis, IN) pesando 16-22 gramas foram i- gualmente distribuídos em 3 grupos (10 camundongos/grupo). Os camun- —dongos foram alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camundongos por gaiola). Alimento e água foram fornecidos ad libitum a to- dos os camundongos. Os camundongos foram vacinados subcutaneamente com 0,1 ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (70 pg/100 ul) (Placebo). Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (70 ug/100 ul) (Extrato de SIRP). Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes PfIB, Opp1A, SirA, SYN2, FhuD, SYN1 e MntC (cada um 10 pg/100 ul, proteína total 70 pyg/100 ul) (rSIRP7). Exemplo18 Preparação de organismo de provocação . Provocação IV (Estudo A) Staphylococcus aureus linhagem ATCC 25904 foi usada como : um organismo de provocação. Em suma, uma alça de 1 ul de bactérias de . 15 um estoque de glicerol congelado cultivadas em TSB padrão (sem restrição de ferro) foi usada para inocular uma cultura de 20 ml de TSB e incubada a ' 37º C por 18 horas. 2,5 ml desta cultura foram passados para 500 ml de TSB fresco. A cultura foi incubada a 37º C por aproximadamente duas horas en- quanto girando a 250 rpm até uma densidade óptica (ODçsoo) de 0,4 (Absor- bância)ser atingida (fase média-log), então as células foram centrifugadas a

10.000 x g por 10 minutos a 4º C para peletizar as bactérias. O pélete bacte- riano foi lavado através de centrifugação em PBS a 4º C. O pélete final foi ressuspenso em 20 ml de PBS. A dose de provocação final foi preparada adicionando uma alíquota desta cultura bacteriana concentrada a PBS para gerar uma solução com uma ODçoo de 4,0 (A), correspondendo a aproxima- damente 6,67 x 10º CFU/ml. Um pouco antes da provocação, 1 ml dessas suspensões bacterianas foi serialmente diluído e plaqueado em ágar para enumerar o número de unidades de formação de colônia (CFU) por dose de camundongo. Provocação|P (Estudo B) Staphylococcus aureus linhagem ATCC 25904 foi usada como um organismo de provocação. Em suma, uma alça de 1 ul de bactérias de um estoque de glicerol congelado cultivado em TSB padrão (sem restrição de ferro) foi usada para inocular uma cultura de 20 ml de TSB e incubada a 37º C por 18 horas. 2,5 ml desta cultura foram passados para 500 ml de TSB fresco. A cultura foi incubada a 37º C por aproximadamente duas horas en- quanto girando a 250 rpm até uma densidade óptica (ODsoo) de 0,4 (Absor- bância) ser atingida (fase média-log), então as células foram centrifugadas a

10.000 x g por 10 minutos a 4º C para peletizar as bactérias. O pélete bacte- riano foi lavado através de centrifugação em PBS a 4º C. O pélete final foi ressuspenso em 20 ml de PBS. A dose de provocação final foi preparada adicionando uma alíquota desta cultura bacteriana concentrada a PBS para gerar uma solução com uma ODçoo de 6,0 (A), correspondendo a aproxima- ' damente 3,33 x 10º CFU/ml. Um pouco antes da provocação, 1 ml! dessas suspensões bacterianas foi serialmente diluído e plaqueado em ágar para enumerar o número de unidades de formação de colônia (CFU) por dose de - 15 camundongo.

Provocação IV (Estudo C) Staphylococcus aureus linhagem ATCC 25904 foi usada como um organismo de provocação. Em suma, uma alça de 1 ul de bactérias de um estoque de glicerol congelado cultivadas em TSB padrão (sem restrição deferro)foi usada para inocular uma cultura de 20 mi de TSB e incubada a 37º C por 18 horas. 2,5 ml desta cultura foram passados para 500 m! de TSB fresco. A cultura foi incubada a 37º C por aproximadamente duas horas en- quanto girando a 250 rpm até uma densidade óptica (ODçoo) de 0,4 (Absor- bância) ser atingida (fase médio-log), então as células foram centrifugadas a

10.000 xg por 10 minutos a 4º C para peletizar as bactérias. O pélete bacte- riano foi lavado através de centrifugação em PBS a 4º C. O pélete final foi ressuspenso em 20 mi de PBS. A dose de provocação final foi preparada adicionando uma alíquota desta cultura bacteriana concentrada a PBS para gerar uma solução com uma ODroo de 4,0 (A), correspondendo a aproxima- —damente 6,67 x 10º CFU/ml. Um pouco antes da provocação, 1 ml dessas suspensões bacterianas foi serialmente diluído e plaqueado em ágar para enumerar o número de unidades de formação de colônia (CFU) por dose de

TRANSE NENE 163/187 camundongo.

Exemplo 19 Provocação Provocação |V (Estudo A)

Quatorze dias após a segunda vacinação, os camundongos em todos os grupos (1-3) foram intravenosamente provocados na veia lateral da cauda com 0,3 ml do organismo apropriado.

Os três grupos de camundon- gos foram provocados identicamente com 2 x 10º CFU de S. aureus linha- gem ATCC 25904 por camundongo.

A mortalidade foi registrada diariamente por0Odias após provocação.

Quando comparando os camundongos provocados com o isolato - ATCC 25904, 80% dos camundongos do Grupo 1 vacinados com placebo morreram dentro de 10 dias de provocação (Tabela 14). Isto demonstrou que a linhagem ATCC 25904 causou uma taxa alta de mortalidade em camun- 5 15 dongos no nível de dose administrado.

Em contraste com os camundongos no Grupo 1, apenas 25% dos camundongos no Grupo 2 (vacinados com pro- : teínas extraídas da linhagem ATCC 25904 seguindo crescimento em condi- ções isentas de ferro, Extrato de SIRP) morreram dentro de 10 dias pós- provocação.

Esses resultados ilustraram que os camundongos provocados coma linhagem ATCC 25904 foram significantemente protegidos pela vaci- nação com a composição de proteína derivada de ATCC 25904 isenta de ferro (p=0,0006, teste log-rank para mortalidade). Ainda, apenas 50% dos camundongos no Grupo 3 (vacinados com polipeptíideos MntC recombinan- tes, rMntC) morreram dentro de 10 dias pós-provocação, indicando que pro- teinas recombinantes ofereceram proteção contra provocação com a linha- gem ATCC 25904 (p=0,100, teste log-rank para mortalidade). Provocação IP (Estudo B) Quatorze dias após a segunda vacinação, os camundongos em todos os grupos (1-4) foram intravenosamente provocados com 0,5 ml do organismo apropriado.

Os três grupos de camundongos foram provocados identicamente com 1 x 10º CFU de S. aureus linhagem ATCC 25904 por camundongo.

A mortalidade foi registrada diariamente por 10 dias após pro-

Fats Sd o RR EEE E EEE ETA: 164/187 vocação.

Quando comparando os camundongos provocados com o isolato ATCC 25904, 60% dos camundongos do Grupo 1 vacinados com placebo morreram dentro de 10 dias de provocação (Tabela 14). Isto demonstrou que alinhagem ATCC 25904 causou uma taxa moderada de mortalidade em camundongos no nível de dose administrado.

Em contraste com os camun- dongos no Grupo 1, apenas 30% dos camundongos no Grupo 2 (vacinados com proteínas extraídas da linhagem ATCC 25904 seguindo crescimento em condições isentas de ferro, Extrato de SIRP) morreram dentro de 10 dias pós-provocação.

Esses resultados ilustraram que os camundongos vacina- dos com a composição de proteína derivada de ATCC 25904 isenta de ferro 7 morreram na metade da taxa de camundongos vacinados com placebo quando provocados com a linhagem ATCC 25904 (p=0,143, teste log-rank B para mortalidade). Camundongos vacinados com a combinação de sete pro- - 15 teíinas recombinantes mostraram um nível maior de proteção com relação a placebo.

Apenas 20% dos camundongos no Grupo 3 (vacinados 2x com po- 7 lipeptídeos recombinantes, rSIRP7 2x) morreram dentro de 10 dias de pro- vocação e apenas 10% dos camundongos no Grupo 4 (vacinados 3x com polipeptídeos recombinantes, rsIRP7 3x) morreram dentro de 10 dias de provocação, indicando que três vacinações com proteínas recombinantes ofereceram proteção significante contra provocação com linhagem ATCC 25904 (p=0,040, teste log-rank para mortalidade). Provocação IV (Estudo C) Quatorze dias após a segunda vacinação, os camundongos em todos os grupos (1-3) foram intravenosamente provocados na veia lateral da cauda com 0,3 ml do organismo apropriado.

Os três grupos de camundongo foram provocados identicamente com 2 x 10º CFU de S. aureus linhagem ATCC 25904. A mortalidade foi registrada diariamente por 10 dias após pro- vocação.

Quando comparando os camundongos provocados com o isolato de ATCC 25904, 90% dos camundongos do Grupo 1 vacinados com placebo morreram dentro de 10 dias de provocação (Tabela 14). Isto demonstrou que

TESES ARS aa Mira a Sad Sola Ae prai arestas asa NS REL SGAN ON ERR A Da festa iv Rara duas naeNR) o bibi AAA 165/187 a linhagem ATCC 25904 causou uma taxa alta de mortalidade em camun- dongos no nível de dose administrado.

Em contraste com os camundongos no Grupo 1, apenas 40% dos camundongos no Grupo 2 (vacinados com pro- teínas extraídas da linhagem ATCC 25904 seguindo crescimento em condi- ções isentas de ferro, Extrato de SIRP) morreram dentro de 10 dias pós- provocação.

Esses resultados ilustraram que os camundongos provocados com a linhagem ATCC 25904 foram significantemente protegidos pela vaci- nação com a composição de proteína derivada de ATCC 25904 isenta de ferro (p=0,0164, teste log-rank para mortalidade). Ainda, apenas 40% dos camundongos no Grupo 3 (vacinados com polipeptídeos recombinantes, rSIRP7) morreram dentro de 10 dias pós-provocação, indicando que proteí- . nas recombinantes ofereceram proteção significante contra provocação com a linhagem ATCC 25904 (p=0,0255, teste log-rank para mortalidade). ' Os resultados são mostrados na Tabela 14 e na Figura 161. . 15 Tabela 14. Mortalidade de Camundongos Vacinados e Não-vacinados Se- quindo Provocação com isolato ATCC 25904 de Staphylococcus aureus mundongos mortos percentual (%) | Provocação IV (Estudo A) |U | — GrupotíPlacebo) =| 20 | 16820 | ão | [Provocação IPEstudo Bo | Grupo1(Placebo) | o | 6ão | 6&o | | Provocação IV (Estudo E) |U [eupotífiaeo | o | mo | ss Grupo 2 (Extrato de SIRP) Exemplo 20 Imunização passiva usando polipeptídeos recombinantemente preparados Uma composição de anticorpo policlonal é preparada conforme

EA A A o pra sro rate a MA Ara srs aC Ac tr aca 166/187 descrito no Exemplo 8, exceto que os camundongos são vacinados com uma composição de polipeptídeos recombinante preparada conforme descri- to no Exemplo 16. A composição de anticorpo resultante é usada para imunizar passivamente camundongos conforme descrito no Exemplo 9. Os camun- dongos imunizados são provocados conforme descrito no Exemplo 9. Os camundongos imunizados vão mostrar mortalidade menor comparado com camundongos não-vacinados e vacinados com placebo.

Exemplo 21 Fermentação e isolamento em grande escala de polipeptídeos recombinan- temente produzidos - Um estoque de semente máster da E. coli recombinante do E- xemplo 14 pode ser preparado através de cultivo do organismo em 2000 ml " de meio RM estéril (20 casaminoácidos, 60 g de Na2HPO;,, 30 g de KH2PO:, . 15 5gdeNaCl,10gde NH,CI por litro e 100 ug/ml de ampicilina) por 8 horas a 37º C.

As bactérias podem ser coletadas através de centrifugação a 10.000 " x g por 30 minutos.

A cultura pode ser lavada duas vezes através de centri- fugação (10.000 x 9) e o pélete bacteriano final ressuspenso em 500 ml meio RM estéril contendo glicerol estéril 20%. Um mililitro da cultura será transfe- ridopara um criofrasco de 2 ml e armazenado a -85º C.

Um criofrasco (1 ml) do estoque de semente máster recombinan- te pode ser usado para inocular um frasco de cultura de 100 ml contendo o meio descrito acima, com a exceção de ter 2 g de casamino ácidos e glicose 0,5% ("meio RM modificado"). A cultura pode ser incubada a 37º C por sete horas, momento quando ela pode ser inoculada em 2 litros de meio RM mo- dificado e deixada crescer por mais quatro horas a 37º C.

Esta cultura pode ser usada para inocular um fermentador de bancada BIOFLOW 4 New Brunswick de 30 litros carregado com 20 litros de meio RM modificado exce- to pelo fato que a concentração de casaminoácidos será de 20 g/litro ("meio RM de fermentação"). O pH do meio de fermentação pode ser mantido entre 6,9 e 7,2 através de titulação automática com NaOH 30% e HCl 10%. A cul- tura de fermentação pode ser agitada a 350 rev/min e a cultura pode ser ae-

rada com 11 litros/minuto a 37º C. Espumação pode ser controlada automa- ticamente através da adição de desespumante de silicone 0,4% (Antiespu- mante-B, J.T. Baker, NJ). A cultura pode ser deixada crescer continuamente nessas condições por quatro horas (ODgo0=4,0-6,0), momento quando a cul- turapodeser bombeada em um fermentador de 150 litros (W.B. Moore, Eas- ton, PN), carregada com 10 litros de meio RM de fermentação e desespu- mante 0,2%. Os parâmetros da fermentação podem ser como segue: 650 rpm, DO 60%, ar 50 slpm, pressão contrária 68,94 Kpa (10 psi), 37º C, e pH mantido a 7,2 com NaOH. Após atingir crescimento de fase exponencial final (aproximadamente seis horas, ODsoo=15,0), proteínas recombinantes podem ser induzidas através da adição de 150 ug/ml de IPTG. A fermentação pode " ser deixada crescer por mais três horas, ponto onde a fermentação pode ser terminada diminuindo a temperatura do fermentador para 18º C (ODgsoo 20-25 ' em uma diluição 1:100). - 15 Após fermentação, os polipeptídeos recombinantemente produ- zidos podem ser coletados através de meios convencionais. As células são Í rompidas (por exemplo, através de homogeneização para liberar os polipep- tídeos recombinantemente produzidos, alguns dos quais são solúveis e al- guns dos quais são insolúveis).

Polipeptídeos solúveis podem ser concentrados através de filtra- gem de fluxo tangencial, solubilizados em detergente e coletados através de cromatografia por afinidade com metal. Os polipeptídeos solúveis coletados podem ser isolados conforme descrito para o isolamento de polipeptídeos solúveis no Exemplo 16.

Proteínas insolúveis podem ser coletadas através de centrifuga- ção de alta velocidade. O pélete de polipeptídeos insolúveis pode ser coleta- do e então isolado conforme descrito para o isolamento de polipeptídeos insolúveis no Exemplo 16.

Exemplo 22 Vacinaçãode camundongo Polipeptídeos SirA, SYN2, FhuD e MntC recombinantemente produzidos são preparados e isolados conforme descrito no Exemplo 16.

:; EE Soda Su EEE ERRAR SSIS AISEE 168/187 Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- mundongos. Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1 ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (40 ug/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (70 19/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes SirA, : SYN2, FhuD e MntC (cada um 10 pg/100 ul, proteína total 40 pg/100 ul). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- : plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- . 15 —radocom camundongos no Grupo 1. Exemplo 23 " Vacinação de camundongo Polipeptídeo PfIB recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16.

Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- —mundongos. Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 ug/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteinas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 pg/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes PfIB (cada um 10 ug/100 ul).

Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem-

plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 24 Vacinação de camundongo Polipeptíideo Opp1A recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gossão alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- " mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: ' Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 ug/100 ul) . 15 Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 ug/100 ul) i Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes Opp1A (cada um 10 upg/100 ul). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- —plo19.Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 25 Vacinação de camundongo Polipeptídeo SirA recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- — dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libítum a todos os ca- mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue:

Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteinas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 ug/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes SirA (cada umioug100 yu). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 26 Vacinaçãode camundongo Polipeptíideo SYN2 recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- . 15 mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- , dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 pg/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes SYN2 (ca- da um 10 ug/100 ul). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 27 Vacinação de camundongo Polipeptídeo FhuD recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan

Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1m! da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 ug/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes FhuD (ca- da um 10 pg/100 ul). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- : rado com camundongos no Grupo 1. - 15 Exemplo28 Vacinação de camundongo " Polipeptíideo SYN1 recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml —da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 ug/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 ug/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes SYN1 (ca- daum10ug/100y)). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa-

rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 29 Vacinação de camundongo Polipeptideo MntC recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exempio 16. Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- mundongos. Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul) ' Grupo 2: Vacinado com proteínas ATCC 25904 expressas sob - 15 restrição de ferro (10 pug/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes MntC (ca- ' da um 10 ug/100 ul). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- —radocom camundongos no Grupo 1.

Exemplo 30 Vacinação de camundongo Polipeptídeo SstD recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16.

Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- gos são alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- —mundongos. Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul)

Grupo 2: Vacinado com proteinas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 pg/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptídeos recombinantes SstD (cada um 10 pg/100 ul), Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo 19. Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 31 Vacinação de camundongo Polipeptídeo FhuD2 recombinantemente produzido é preparado e isolado conforme descrito no Exemplo 16. . Trinta camundongos BALB/C fêmeas (N=30) obtidos do Harlan Breeding Laboratories (Indianápolis, IN) pesando 16-22 gramas são igual- mente distribuídos em três grupos (10 camundongos/grupo). Os camundon- - 15 gossão alojados em gaiolas de camundongo de policarbonato (N=5 camun- dongos por gaiola). Comida e água são fornecidas ad libitum a todos os ca- , mundongos.

Os camundongos são vacinados subcutaneamente com 0,1ml da composição apropriada duas vezes em intervalos de 14 dias como segue: Grupo 1: Placebo, vacinado com ovalbumina (10 pg/100 ul) Grupo 2: Vacinado com proteinas ATCC 25904 expressas sob restrição de ferro (10 ug/100 ul) Grupo 3: Vacinado com polipeptíideos recombinantes FhuD2 (cada um 10 ug/100 pl). Os camundongos são provocados conforme descrito no Exem- plo19.Os camundongos no Grupo 3 vão exibir mortalidade reduzida compa- rado com camundongos no Grupo 1. Exemplo 32 Polipeptídeos recombinantes são especificamente ligados por soros gerados por infecção por S. aureus S. aureus foram preparadas como organismos de provocação conforme descrito no Exemplo 4 e usadas para provocar camundongos con- forme descrito no Exemplo 5 ou 19. Soros foram obtidos de camundongos ou antes da provocação ou de camundongos que tinham recebido vacina de placebo que tinham sido provocados com S. aureus Newman e se recupera- ram (convalescentes). Sangue foi coletado de camundongos provocados e não-provocados e soros foram obtidos através de centrifugação. Os soros foram usados para avaliar a reatividade dos polipeptídeos recombinante- mente produzidos individuais usando um método de immunoblot descrito no Exemplo 15. Soros coletados de camundongos antes da provocação não rea- giram com qualquer um dos polipeptídeos recombinantes.

Anticorpo nos soros produzidos como um resultado de provoca- ção com S. aureus reagiram com os polipeptídeos recombinantemente pro- duzidos conforme mostrado na Figura 202. Anticorpo criado contra polipepti- deos expressos durante infecção por S. aureus reconhece variantes recom- ' binantemente produzidas dos polipeptídeos. Desta maneira, polipeptídeos , 15 recombinantes são substitutos imunológicos para — por exemplo, fragmentos imunológicos de — polipeptídeos imunológicos expressos pela S. aureus de Í provocação. Exemplo 33 Anticorpo contra polipeptídeos recombinantemente produzidos e polipeptideos de membrana regulados por ferro extraídos diretamente de reação cruzada de células de S. aureus Polipeptídeos regulados por ferro recombinantes são expressos e purificados conforme descrito no Exemplo 16. Polipeptideos de membrana regulados por ferro são extraídos diretamente de células de S. aureus culti- vadasem condições com baixo teor de ferro conforme descrito no Exemplo

1. Os polipeptídeos recombinantes são formulados em uma vacina conforme descrito no Exemplo 16 e usados para vacinar camundongos conforme des- crito no Exemplo 17. Os polipeptídeos extraídos com S. aureus são formula- dos em vacinas conforme descrito no Exemplo 2 e usados para vacinar ca- —mundongos conforme descrito no Exemplo 3. Para as vacinas de polipepti- deo recombinante, um polipeptídeo recombinante único será formulado na vacina. Antissoros de camundongos vacinados são coletados e usados para )

immunoblots conforme descrito no Exemplo 15. Os antissoros de animais vacinados com polipeptídeos regula- dos por ferro recombinantemente produzidos são usados ainda para avaliar a reatividade com polipeptídeos regulados por ferro extraídos seguindo a separação dos polipeptídeos reguiados por ferro extraídos através de SDS- PAGE.

Antissoros de animais vacinados com polipeptídeos recombinantes vão se ligar a polipeptídeos extraídos separados por SDS-PAGE apropriados onde epítopos de anticorpo são conservados entre os polipeptídeos extraí- dos e os polipeptideos recombinantemente produzidos.

Os antissoros de animais vacinados com polipeptídeos regula- dos por ferro extraídos são usados ainda para avaliar a reatividade com poli- * peptídeos regulados por ferro recombinantemente produzidos individuais seguindo a separação dos polipeptídeos recombinantemente regulados atra- ' vêés de SDS-PAGE.

Antissoros de animais vacinados com polipeptídeos ex- : 15 traídos se ligarão a polipeptídeos recombinantes separados por SDS-PAGE onde epítopos de anticorpo são conservados entre os polipeptídeos recom- : binantemente produzidos e os polipeptídeos extraídos.

Exemplo 34 Análise Western blot de proteínas de S. aureus recombinantes Proteínas de S. aureus recombinantes foram preparadas con- forme descrito no Exemplo 16, então submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio 10% e transferidas para mem- branas de nitrocelulose (BioRad, Hercules, CA) para análise Western blot.

Blots individuais foram reagidos com soro de doadores humanos saudáveis (nenhuma infecção por Staphylococcus relatada) ou convalescentes (S. au- reus Resistente à Meticílina). Como um controle para identificar cada proteina marcada com Histidina recombinante, cada blot foi co-incubado com anticorpos anti- Histidina (Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA e Qlagen Gm- bH, Hilden, Alemanha) para identificar as proteínas recombinantes usando análise de duas cores.

Todos os antissoros primários foram usados em uma diluição 1:1000 e incubados por 1 hora em um oscilador.

Seguindo várias | lavagens com TBS+Tween 0,05% para remover anticorpo não-ligado, as membranas foram subsequentemente incubadas com um anticorpo secun- dário humano conjugado a corante 800CW (Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA), anticorpo secundário de camundongo conjugado a corante 680 (Li-cor Bioscience, Lincoln, NE) ou um anticorpo secundário de coelho conjugado a corante 800CW (Li-Co Bioscience) na diluição recomen- dada pelo fabricante, por 1 hora, no escuro.

As membranas foram lavadas mais três a cinco vezes adicionais com Tween 0,005% TBS com a última lavagem em TBS apenas.

Sinais fluorescentes (680 e 800) foram detectados usando o Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosciences). Os resul- tados são mostrados na Figura 203 (saudáveis) e Figura 204 (convalescen- ' tes). Exemplo 35 Expressão na superfície de S. aureus DUS875 de polipeptídeos regulados s 15 pormetal S. aureus linhagem DU5875 (cap-, spa-) foi cultivada em condi- . ções com ferro (TSB + cloreto férrico 0,3 mM) ou sem ferro (TSB + dipirídila 1 mM) para uma ODso" de aproximadamente 0,6. Nos painéis A-C da Figura 205, S. aureus linhagem DU5875 foi — cultivadaem condições sem fero para uma ODsoo de aproximadamente 0,75 e congelada.

As bactérias foram descongeladas, lavadas em PBS e ressus- pensas em PBS + IgG de Porco 1% + BSA 1% como uma etapa de bloqueio.

Antissoro de camundongo criado contra FhuD, Opp1A ou PfIB foi usado em uma diluição de 1:100 para tingir aproximadamente 2x10º bactérias.

Soro de camundongo pré-imune foi usado como um controle negativo.

As bactérias foram então lavadas em tampão de bloqueio e incubadas com um anticorpo secundário anticamundongo de cabra conjugado AF633 e analisadas em um citômetro de fluxo.

As bactérias incubadas com soro de camundongo pré- imune, a 1:100, foram usadas como um controle negativo.

No painel D da Figura 205, S. aureus linhagem DUS5875 foi culti- vada em condições sem ferro para uma ODgçeoo de aproximadamente 2,0 e congelada.

As bactérias foram descongeladas, lavadas em PBS e ressus-

pensas em PBS+ IgG de Porco 0,2% + BSA 0,1% como uma etapa de blo- queio.

Antissoro de camundongo criado contra rSIRP7 foi usado em uma diluição de 1:50 para tingir aproximadamente 5 x 107 bactérias, com soro de camundongo pré-imune usado como um controle negativo.

As bactérias fo- ram então lavadas em tampão de bloqueio e incubadas com um anticorpo secundário anticamundongo de cabra AF633-conjugado e analisadas em um citômetro de fluxo.

Os resultados deste ensaio indicam que os anticorpos de murino criados contra as proteinas SIRP se ligam a células de S. aureus.

As células cultivadas sob condições sem ferro se ligam a mais anticorpo do que células cultivadas sob condições com ferro, provendo evidência adicional que FhuD, , Opp1A e PfIB são expressas em níveis mais altos sob condições de baixo teor de ferro e são antígenos que podem induzir atividade imunológica con- ' tra Staphylococcus spp.

O aumento em intensidade de fluorescência média - 15 (MFI) (Median Fluorescence Intensity) demonstra o aumento relativo em flu- orescência quando anticorpos anti-SIRP se ligam a células de S. aureus ' comparado com a MFI de soro de camundongo pré-imune, os resultados são mostrados na Figura 205. Exemplo 36 Um ensaio Luminex foi usado para avaliar expressão de citocina por esplenócitos de camundongos imunizados com a combinação (rSIRP7) de componentes SIRP recombinantes PfIB (SEQ ID NO:353), Opp1A (SEQ ID NO:364), SirA (SEQ ID NO:375), SYN2 (SEQ ID NO:386), FhuD (SEQ ID NO:397), SYN1 (SEQ ID NO:408 e MntC (SEQ ID NO:419) ou placebo, en- tão reestimulados com Extrato de SIRP (SIRPE) ou rSIRP7. Várias citocinas foram suprar-reguladas quando da reestimulação e os perfis de citocina in- duzida por reestimulação de SIRPE e rSIRP7 foram similares.

O perfil de citocina geral em resposta à reestimulação de rSIRP7 ou SIRPE lembrou aquele esperado de uma resposta imune tipo Th1/Th17 e demonstra que vacinação com os componentes SIRP recombinantes induz uma resposta imune celular que pode ser medida com base em expressão de citocina.

Métodos.

Os camundongos foram vacinados duas vezes, 14 di-

as de intervalo, com 70 ul de proteina total (OVA, Extrato de SIRP ou rSIRP7) formulada com IFA 50%. Células T CD** purificadas de suspensões de esplenócitos por seleção negativa usando um kit de isolamento de célula T CD4* e colunas LD (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA). Em suma, anticor- pos biotinilados foram usados para marcar todas as células exceto células T CD4*, e então contas magnéticas conjugadas com estreptavidina usadas para remover essas células da mistura com uma coluna magnética, deixan- do células T CD4* altamente purificadas. As células T CD4+ resultantes foram verificadas ser mais de 95% puras com base em expressão de CD3 e CDA4. Esplenócitos puros fo- ram tratados com Mitomicina C para gerar células apresentando antígeno ' mitoticamente inativas. 4 x 10º APC adicionadas a 5 x 10º células T CD4* mais antígeno de estimulação, seguido por 42 horas de incubação. Os so- B brenadantes foram analisados através de Luminex usando os parâmetros de - 15 ensaio padrão. Os resultados são mostrados na Figura 206. Exemplo 37 , Extratos de S. aureus de várias linhagens (Newman, Reynolds) foram preparados usando o método descrito no Exemplo 1. Células de S. aureus foram cultivadas ou em meio restrito em ferro contendo 1000 um de 2,2-dipiridila (Sigma-Aldrich St. Louis, MO) ou meios com ferro contendo 300 uM de FeCl;3 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO).

As proteínas dentro dos extratos de membrana de S. aureus de culturas com ferro e sem ferro foram identificadas e quantificadas usando espectrometrias de massa ITRAQ e LCQ. Marcação modificada com amina de extratos de membrana de linhagem Newman de Staphylococcus aureus deficiente em ferro e com ferro foi realizada com reagentes ITRAQ-8plex (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando 40,0 pg de extrato de membrana (reagentes 113 versus 115) de acordo com o protocolo 8Plex do fabricante. Cromatografia de troca de cátion foi aplicada usando uma coluna MCX (Waters Corp., Mitford, MA) e os peptídeos separados usando um sis- tema ULTIMATE 3000 NANO LC (Dionex Corp. Bannockburn, IL) acoplado a modo ESI usando um espectrômetro de massa OSTAR XL (Applied Biosys-

temss, Inc, Foster City, CA).

A razão de polipeptídeos regulados por metal produzidos por cé- lulas cultivadas em meios restritos em ferro comparado com meios com ferro foi medida. A razão é uma medida relativa de expressão de proteína e não provê dados indicando uma quantidade absoluta de proteína presente no extrato. Os resultados são mostrados na Tabela 15. Tabela 15 teor de ferro baixo [FD | Não | aodereminado | | [OR sm | naodeteminado | [Amo sm RA - Exemplo 38 Um ensaio de queima oxidativa pode ser usado para medir a produção de espécies oxigênio-reativas por neutrófilos, uma indicação de uma resposta inflamatória. Para obter neutrófilos a partir de sangue fresco, as células vermelhas de sangue humano fesco são lisadas através da adi- ção de tampão de lise (NH,CI 150 mM, KHCO;3 10 mM, EDTA dissódico 1 mM, pH 7,4) em uma diluição 1:10, incubadas por 10 minutos em temperatu- ra ambiente e centrifugadas por 10 minutos a 430 x g. O sobrenadante é removido através de inversão do tubo e os péletes são lavados duas vezes com PBS, então ressuspensos em 5 ml de RPMI-Hepes FCS 5% + Glutami- na (RPMI completo) e enumerados usando um MULTISIZER (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) após uma diluição 1/500 de suspensão celular em ISOTON (20 ul de células em 10 ml de ISOTON, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Para a preparação de bactérias, S. aureus linhagem Lowenstein é semeada em meio TSB e cultivada por 20 horas a 37º C em 50 ml de mei- o.

A partir desta cultura, 5 ml são peletizado por 10 minutos a 4000 rpm a 4º C.

O pélete é então lavado com 50 ml de PBS e novamente peletizado atra- vês de centrifugação por 10 minutos a 4000 rpm a 4º C.

A etapa de lavagem é repetidaeopélete de bactéria é ressuspenso em 5 ml de PBS.

As bacté- rias são ajustadas para uma densidade teórica de 1.10º CFU/ml e as dilui- ções celulares são plaqueadas em ágar e incubadas para enumeração exata no dia seguinte.

Para descomplementar os soros, todos os soros são incubados por30 minutos a 56º C.

Misturas de soros e células são realizadas em pla- cas DW estéreis de polipropileno em um volume final de 500 ul por cavida- . de.

Em cada cavidade, os reagentes que seguem são adicionados (confor- me mostrado na Tabela 16) na ordem: meio de cultura (RPMI-Hepes, gluta- B mina, FCS 5%), bactérias vivas na concentração apropriada, os soros na diluição apropriada, o complemento, hPMNs na concentração apropriada e, finalmente, a molécula DHR (Life Technologies, Inc., Carisbad, CA) como o ' marcador da queima oxidativa.

As placas são incubadas por 25 minutos a 37º C com agitação.

A reação é parada através da incubação das placas por cinco minutos em gelo.

Tabelai6 | Ú Conc.

De vol! Concentração Reagente Identificação cavida- | final (em 500 trabalho de ul) Bactérias TSB, 20h, 37ºC 1.25.10º r vivas 10º CFU/mI cFumi | 2POR | 5.10 CFUMI Leucócitos De 2 doadores dife Ô 2.5.10º de sangue | Siferentes após a 5 100 ul | 0,5.10º celis/m! : lise de célula san- cells/ml integral ; guinea Life Technologies, Inc.

No.

Cat.

D632 | 100 pg/ml 50 ul 10 uo/ml (10 mo/ml) Comple- " mento de | Produzido em ca- 1110 50ut | 1/100 (1%) a sa coelho bebê

Vol./ Concentração de ul) Soro de camun- Soros sozinho Para análise citométrica de fluxo, as PMNs humanas são primei- ro identificadas de acordo com seu tamanho e granularidade e então verifi- ' cadas através de expressão de superfície de marcadores específicos (CD35, : CD16, GR1, etc), então marcador de queima oxidativa.

Os dados são forne- cidosem termos de porcentagem de hPMNs ativadas capazes de induzir 7 queima oxidativa em comparação com o grupo controle negativo (Didier, 2003; Ploppa, 2008). i Exemplo 39

Ensaio Opsonofagocítico Um ensaio opsonofagocítico (OPA) foi desenvolvido para esti- mular a atividade fagocítica funcional de soro para Staphylococcus aureus através da medição da atividade opsônica dependente de complemento do soro.

O OPA é sumarizado na Tabela 17. Duas linhagens de S. aureus são usadas neste ensaio.

A linhagem DUS5875, que não produz cápsula ou prote- ínaA, é usada para controlar melhor o ensaio.

A linhagem LST4 Lowenstein, que expressa cápsula e proteína A, é usada como uma linhagem do tipo sel- vagem no ensaio.

O número de bactérias usadas no ensaio é dependente da fonte das células sanguíneas brancas efetoras e varia em concentração de a partir de 1 x 10º cfuíml a 5 x 107 cfuíml.

Células sanguíneas brancas de vo- luntários saudáveis humanos ou de uma linhagem de célula de leucemia promielocítica humana, HLUI6O, são usadas como células efetoras fagociíti- cas.

Como a Tabela 17 indica, o número de células efetoras usadas no en- saio é dependente da fonte das células.

Soro de coelho bebê é usado como uma fonte de complemento e é diluído de 1% a 10% dependendo do lote de soro a fim de maximizar a atividade de complemento funcional do soro de coelho enquanto minimizando a toxidez.

Soros sofrendo teste quanto à ativi- dade opsônica, pré- ou pós-imunização, são descomplementados a 56º C por30 minutos e são testados no ensaio em uma diluição de 1:20 a 1:2.000.000. Fagocitose é determinada através de contagens viáveis (cfu) de S. aureus.

Soro de teste que demonstra uma perda significante de cfu em combinação com complemento ativo quando comparado com soro pré- imune é considerado opsônico.

Os dados de ensaio são analisados através do Teste t de Student usando distribuição de uma variável com variância desigual. (Kim 2010; Stranger-Jones 2006; Dryla 2005). " Tabela 17 Concentração final ' Bactérias | aprox. 1 x 10º cfuml quando usando células efetoras HL-60 vivas aprox. 5 x 10º cfu/ml quando usando WBCs humanas sau- " dáveis Células efe- | Linhagem de célula humana HL-60 quimicamente induzida ' toras para diferenciar com N,N-dimetilformamida diluída para 10 x 10º/m! ou células sanguíneas brancas humanas de volundários sau- dáveis diluídas para 1 x 107/ml Comple- Soro de coelho bebê diluído de 1% a 10% de acordo com mento Lote de soro Soro de Soro obtido após a última imunização, descomplementado e Teste serialmente diluído de 1:20 a 1:2.000.000 Exemplo 40 Estudos de mecanismo imune (in vivo)

Em outro exemplo, o mecanismo imune através do qual protei- nas de vacina conferem proteção a camundongos será avaliado.

Esses ex- perimentos podem incluir dois tipos: (1) usando camundongos de inativação de gene em experimentos de provocação de vacina para determinar se componentes imunoespecíficos são necessários para proteção; e (2) expe-

rimentos de transferência adotiva, onde células imunes de camundongos doadores imunizados são transferidas para recipientes puros para provoca-

ção bacteriana a fim de testar se os componentes transferidos são suficien- tes para conferir proteção. Para exemplos envolvendo experimentos de provocação de va- cina em camundongos de inativação de gene, os camundongos podem ser comprados de vendedores comerciais e podem incluir várias linhagens bem caracterizadas tais como, por exemplo, inativações de célula B (uMT), inati- vações de célula T (TCRa), e uma variedade de inativações de citocina, tais como IFN-y, IL-1a, TNFa, IL-17, etc). Os camundongos podem ser imuniza- dos conforme descrito no Exemplo 3 e então provocados com S. aureus, conforme descrito no exemplo 5. O uso de camundongos do tipo selvagem com a mesma base genética (Balb/c) pode prover controles adequados para medir o efeito da inativação sobre proteção mediada por vacina contra S. aureus. Por exemplo, se os camundongos inativados em célula B vacinados morrerem mais rapidamente, ou em números maiores com relação aos ca- . 15 —mundongos controle vacinados em resposta à provocação bacteriana, pode ser concluído que células B (ou seus produtos) são importantes para a pro- ' teção mediada por vacina contra S. aureus. Essas estratégias são prática padrão no campo para medição de contribuições de vários componentes imunes para proteção de vacina (Spellberg, 2008; Lin, 2009).

Para exemplos envolvendo transferência adotiva de componen- tes imunes, camundongos doadores Balb/c do tipo selvagem podem ser i- munizados conforme descrito no Exemplo 3 a fim de gerar tecido para trans- ferência adotiva, Esses camundongos podem ser eutanizados 2-4 semanas após a segunda imunização e o sangue coletado através de punção cardia- caetecidolinfoide secundário (nós linfáticos e baço) coletado. Os nós linfá- ticos coletados podem incluir: axiliar, braquial, mesentérico, inguinal, superfi- cial, cervical, cervical profundo e lombar. Soro pode ser isolado do sangue usando metodologia padrão, tais como separadores de soro baseado em centrifugação, e então transferido de volta para um conjunto separado de — camundongos recipientes através de injeção intravenosa ou intraperitoneal. O uso de 1-3 camundongos doadores por recipiente é uma razão razoável para transferência de soro e pode ocorrer em volumes de até 0,5 ml. Ainda,

células T de tecido linfoide de doador podem ser purificadas usando anticor- pos e tecnologia de enriquecimento de conta magnética (Miltenyi Biotech) que é prática padrão no campo.

É típico atingir 95-99% de pureza celular usando esses métodos, conforme avaliado através de tingimento das proteí- —nasda superfície celular com anticorpos para marcadores de linhagem es- pecíficos e exame das células através de citometria de fluxo.

As populações de célula de interesse (por exemplo, células T CD4*, células T CD8*, etc) podem ser transferidas de volta para animais recipientes através de injeção intravenosa (entre 2.000.000 e 5.000.000 células T por recipiente). Camun- —dongos recipientes podem receber células T (ou subconjuntos de células T), soro imune ou ambos.

Como controle negativo, animais imunizados com placebo po- dem ser também usados para isolamento de soro e célula T seguido por B transferência de volta para recipientes puros.

Como para um controle positi- t 15 vo, um grupo de recipientes que fica imunizado com a vacina de proteção padrão pode ser incluído a fim de prover uma varredura de linha de base de ' eficácia de proteção quando da provocação bacteriana.

Uma vez os camundongos recipientes tendo recebido várias cé- lulas ou soros transferidos, eles podem ser provocados com S. aureus con- forme descrito no Exemplo 5. Com base na porcentagem de morte e na taxa de morte, a contribuição relativa de vários componentes imunes para prote- ção de vacina pode ser avaliada.

Por exemplo, se recipientes que foram ad- ministrados com células T a partir de doadores vacinados são protegidos contra provocação na mesma taxa que o controle positivo, pode ser concluí- do que células T são suficientes para proteção mediada por vacina.

Esta estratégia experimental é prática padrão no campo para varredura dos me- canismos imunológicos de vacinas (Spellberg, 2008; Lin 2009). Exemplo 41 Ensaio de inibição de absorção de ferro Para avaliação de se anticorpos direcionados contra componen- tes SIRP inibem crescimento celular através do bloqueio da absorção de ferro, um ensaio de absorção/transporte de ferro pode ser realizado usando células bacterianas que são pré-incubadas com antissoro anti-SIRP, Células de S. aureus de qualquer linhagem são cultivadas da noite para o dia em meios quelatados ou ricos em ferro.

As células são subculturadas nos mes- mos meios e cultivadas para fase log média até final, peletizadas e incuba- dascom antissoro anti-SIRP ou antissoro controle em PBS por até uma ho- ra.

As células foram então coletadas através de filtragem usando filtros de 0,45 UM, então ressuspensas em meio mínimo tratado com Chelex-100 para eliminar ferro ambiental.

As células são agitadas rapidamente.

Nesse ínte- rim, uma fonte de ferro (por exemplo, ferrichrome) é misturada com *FeCl —radiomarcado (ou outra molécula de ferro radiomarcada) com ácido nitrilotri- acético e deixada incubar por vários minutos.

Para iniciar a absorção de ferro, uma alíquota pequena (por e- xemplo 10 ul) da mistura de ferro radiomarcada foi adicionada às células (em um volume de 1 ml) em um tubo de cultura livre de Fe.

O tubo foi incu- - 15 bado com vortexação e amostragem periódicas de alíquotas filtrtadas em filtros de membrana e lavadas com LiCl.

Seguindo secagem, as membranas são contadas em fluido de cintilação para quantificar a absorção de ferro.

As células pré-incubadas com antissoro anti-SIRP devem ser mais lentas para absorver ferro do que células pré-incubadas com antissoro controle (Se- —bulsky,2000; Goel, 2001). Exemplo 42 Protocolo de purificação de proteína de alto rendimento Em alguns casos, rSIRPS recombinantes foram purificadas u- sando um método de alto rendimento.

Este método é otimizado para rendi- mentos maiores e pureza maior do polipeptídeo.

O método é realizado atra- vés de ressuspensão do pélete bacteriano contendo o polipeptídeo produzi- do recombinante em Tris 20 mM, pH 9; NaCl 300 mM complementado com lisozima (100 pg/ml final) e MgCl (1 mM final). A amostra é então incubada com oscilação leve por 15 minutos a 4º C.

Após 15 minutos, 1 U/ml de ben- —zoato é adicionado e a amostra é incubada por uma hora em temperatura ambiente.

O lisato solúvel obtido após centrifugação (20.000 x g, 20 minutos a 4º C) deve ser filtrado com um filtro de 0,45 um e adicionado a uma coluna de gravidade de 5 ml equilibrada revestida com resina de ligação de níquel- His (Novagen 696704, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ). A purificação da proteína N-His; é realizada seguindo as instruções do fabricante. A purifi- cação da proteína N-Hiss é finalizada usando uma coluna de exclusão de tamanho de grau prep Superdex 75 HiLoad 26/60 (GE Healthcare Bioscien- ces, Piscataway, NJ). A coluna é equilibrada com Tris 20 mM, pH 9; NaCl! 300 MM usando um BIoCAD FPLC (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) e 15 ml da amostra de proteína são carregados na coluna Hiload em uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min. A amostra é eluída seguindo 3,5 horas de tempo de atividade em uma taxa de fluxo de 1,8 mi/min usando Tris 20 mM, pH 9; NaCl 300 mM como a fase móvel.

' O polipeptídeo é quantificado usando uma versão modificada do procedimento BCA (Thermo Fisher Scientífic, Inc., Rockford, IL) onde dodecil ' sulfato de sódio 15% (SDS), ureia 8M e 3-([3-Colamidopropil]dimetilamonio)- 2-hidróxi-t-propanossulfonato (CHAPS) 2,5% são usados para assegurar solubilidade completa de toda a proteina dentro da amostra. O ensaio tam- " bém consiste em SDS 5% adicionado ao reagente de trabalho BCA para manter solubilidade da proteína durante a fase reativa de BCA. A leitura e a análise de BCA são realizadas de acordo com a literatura do produto.

Para análise densitométrica, 3,0 ug de antígeno de produto final foram quantificados quanto à pureza usando SDS PAGE 10%, tingidos com coomassie e imagem feita usando um scanner ODYSSEY (LiCor Bioscien- ces, Lincoln, NE). O gel tingido foi varrido e as áreas dos componentes prin- cipais foram determinadas com relação à área total. Endotoxina residual foi removida usando um kit blue one/endosafe Endotrap (Hyglos GmbH, Re- gendburg, Alemanha). A batelada final é armazenada com uma faixa de concentração de 1,0 mg/ml a 4,0 mg/ml em tampão de armazenamento de PBS em menos do que -70º C em alíquotas apropriadas.

O relatório completo de todas as patentes, pedidos de patente, e publicações, e material eletronicamente disponível (incluindo, por exemplo, submissões de sequência de nucleotídeo em, por exemplo, GenBank e Ref- Seg, e submissões de sequência de aminoácido na, por exemplo, SwissProt,

PIR, PRF, PDB e traduções de regiões de codificação anotadas em Gen- Bank e RefSegq) citados aqui são incorporados a título de referência.

No caso de qualquer inconsistência existir entre o relatório do presente pedido e o(s) relatório(s) de qualquer documento incorporado aqui a título de referência, o relatório do presente pedido deve prevalecer.

À descrição detalhada e os exemplos acima foram dados para clareza de compreensão apenas.

Quais- quer limitações desnecessárias devem ser compreendidas a partir deles.

À invenção não deve ser limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, uma vez que variações óbvias a um versado na técnica serão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

A menos que de outro modo indicado, todos os números expres- ' sando quantidades de componentes, pesos moleculares e outros usados no : relatório e nas reivindicações devem ser compreendidos como sendo modifi- Ú cados em todos os casos pelo termo "cerca de". Desta maneira, a menos . 15 que de outra maneira indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostra- dos no relatório e nas reivindicações são aproximações que podem variar ] dependendo das propriedades desejadas que pretendem ser obtidas pela presente invenção.

No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a doutri- na de equivalentes do escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser pelo menos considerado à luz do número de dígitos significantes relatados e através da aplicação de técnicas de arredondamento comuns.

Sem importar que as faixas numéricas e parâmetros mostrando o escopo amplo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos mostrados nos exemplos específicos são relatados o mais precisamente possível.

Todos os valores numéricos, no entanto, contêm inerentemente uma faixa necessariamente resultante do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.

Todos os cabeçalhos são para a conveniência do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue o cabeçalho, amenos que especificado.

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição compreendendo: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 92% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397, contanto que seo polipeptídeo isolado incluir um ou mais aminoácidos adicionais no terminal amino, o um ou mais aminoácidos adicionais incluam pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoácidos 1-26 da SEQ ID NO:399.

2. Composição compreendendo: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 98% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408, contanto que se o polipeptídeo isolado incluir um ou mais aminoácidos adicionais no terminal amino, o um ou mais aminoácidos adicionais incluam pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoácidos 1-5 da SEQ ID NO:415.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde a composição protege um animal contra provocação com uma S. aureus sele- cionada da ATCC 19636 ou ATCC 25904.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 compreendendo ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, onde o polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO397.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, onde o polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 92% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, onde o polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID

NO:397.

8. Composição de acordo com a reivindicação 2, onde o polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO397.

9. Composição de acordo com a reivindicação 2, onde o polipep- tídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408.

10. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou reivindica- ção 2 compreendendo ainda pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando in- cubado em meios compreendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, onde o se- gundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO.391, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:396 SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 ou SEQ ID NO:429.

12. Composição de acordo com a reivindicação 1 compreenden-

do ainda pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de metal, não é isolável quando cultivado nos mei- os sem o quelante de metal e compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer um de: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, onde o se- gundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

14. Composição de acordo com a reivindicação 2 compreenden- do ainda pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro, não é isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro e compreende uma sequência de aminoácido tendo pelomenos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qual- quer uma das: SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, onde o se- gundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:397: SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404; SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407.

16. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou reivindica- ção 2 compreendendo ainda: um polipeptídeo isolado é isolável de uma S. aureus quando cul-

tivado em meios sem o quelante de ferro e tem um peso molecular de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41, kDa, 40 kDa; ou uma combinação de tais polipeptídeos isolados.

17. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylo- coccus Spp., onde a composição compreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

18. Método para tratamento de um sintoma em um indivíduo, o método compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a composição compreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

19. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylo- coccus Spp., onde a composição compreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

20. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylo- —coccusspp., onde a composição compreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408.

21. Método para tratamento de um sintoma em um indivíduo, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- divíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a com- posiçãocompreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408.

22. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- divíduo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a composição compreende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 22, onde a composição compreende ainda pelo menos um segundo polipep- tídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus au- reus quando incubado em meios compreendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, onde o segundo polipeptídeo tem um peso molecular conforme determinado através de ele- troforese em um gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio de 88 kDa, 55 kDa, 38 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 22,0ondea composição compreende ainda pelo menos um segundo polipep- tídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma de: SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID

NO:373, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:396 SEQ ID NO:419, SEQ DD NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 ou SEQ ID NO:429.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 19, onde a composição compreende ainda pelo menos um segundo polipep- tídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus au- reus quando incubado em meios compreendendo um quelante de ferro, não é isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro e compreen- de uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO.415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID N0:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO416,SEQID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20- 22, onde a composição compreende ainda pelo menos um segundo polipep- tídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus au- reus quando incubado em meios compreendendo um quelante de ferro, não é isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro e compreen- de uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:397, SEQ

ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407.

29. Método de acordo com a reivindicação 29, onde o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ou SEQ ID NO:407.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 22, onde a composição compreende ainda: um polipeptídeo isolado que é isolável de uma S. aureus quando cultivado em meios sem um quelante de ferro e tem um peso molecular con- forme determinado através de eletroforese em um gel de poliacrilamida- dodecil sulfato de sódio de 150 kDa, 132 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa, 40 kDa, ou uma combinação de tais polipeptídeos isolados.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 22, onde o indivíduo é um mamífero.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o mamífero é um humano.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17- 22, onde a Staphylococcus spp. é S. aureus.

34. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylo- coccus Spp., onde a composição compreende: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

35. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo compreendendo: administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a composição compreende: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

36. Método para diminuição da colonização em um indivíduo, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- divíduo colonizado por uma Staphylococcus spp., onde a composição com- preende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:397.

37. Método para tratamento de uma infecção em um indivíduo, o método compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- dividuo tendo ou sob risco de ter uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a composição compreende: anticorpo que liga especificamente um polipeptídeo isolado ten- do pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de ami- noácido da SEQ ID NO:408.

38. Método para tratamento de um sintoma em um indivíduo compreendendo: administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- divíduo tendo uma infecção causada por Staphylococcus Spp., onde a com- posição compreende: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de —aminoácidoda SEQ ID NO:408.

39. Método para diminuição da colonização em um indivíduo, o método compreendendo:

administrar uma quantidade eficaz de uma composição a um in- divíduo colonizado por uma Staphylococcus spp., onde a composição com- preende: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequênciacom a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39, onde a composição compreende ainda anticorpo que se liga especifica- mente a pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, onde o segundo polipeptídeo tem um peso molecular conforme determinado através de ele- troforese em um gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio de 88 kDa, 55 kDa,38kDa, 37 kDa, 36 kDa, 35 kDa ou 33 kDa.

42. Método de acordo com a reivindicação 40, onde o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:386, SEQ ED NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ED NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, SEQ ED NO:394, SEQ ED NO:395, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:423, SEQ ED NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428 ou SEQ ID NO:429.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 36, onde a composição compreende ainda anticorpo que se liga especifica- mente a pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro, não é isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro e compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qual- quer uma da: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, onde o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO412, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:417 ou SEQ ID NO:418.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37- 39, onde a composição compreende ainda anticorpo que se liga especifica- mente a pelo menos um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro, não é isolável quando cultivado nos meios sem o quelante de ferro e compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qual- quer uma da: SEQ ID NO:397, SEQ ED NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ DD NO:406 ou SEQ ID NO:407.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, onde o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85% de similaridade com a sequência de aminoácido de qualquer uma da: —SEQIDNO:397, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406 ouSEQ ID NO:407.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39, onde a composição compreende ainda: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo que é isolável de uma S. aureus quando cultivado em meios sem um quelante de metaletem um peso molecular conforme determinado através de eletrofore- se em um gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio de 150 kDa, 292 kDa, 120 kDa, 75 kDa, 58 kDa, 50 kDa, 44 kDa, 43 kDa, 41 kDa, 40 kDa; ou uma combinação de tais polipeptídeos isolados.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39,ondeo indivíduo é um mamífero.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, onde o mamífero é um humano.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39, onde a Staphylococcus spp. é S. aureus.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39, onde o anticorpo é anticorpo policlonal.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39, onde o anticorpo é anticorpo policlonal.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 39,ondeo anticorpo é anticorpo monoclional.

54. Estojo para detecção de anticorpo que se liga especifica- mente a um polipeptídeo compreendendo em recipientes separados: um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 80% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:408 ou SEQ IDNO:397;e um reagente que detecta um anticorpo que se liga especifica- mente ao polipeptídeo.

55. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 41, onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 88 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 88 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro; onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 55 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de polipeptídeo de 55 kDa expresso por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636, e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado nos meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios semo quelante de ferro;

onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 38 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 38 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro;

onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 37 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 37 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro;

onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 36 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 36 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com-

preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro;

onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 35 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 35 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro; onde o polipeptídeo isolado com um peso molecular de 33 kDa tem uma impressão digital de massa de pelo menos 80% de similaridade com uma impressão digital de massa de um polipeptídeo de 33 kDa expres- so por Staphylococcus aureus linhagem ATCC 19636 e onde o polipeptídeo é isolável de uma Staphylococcus aureus quando incubado em meios com- preendendo um quelante de ferro e não-isolável quando cultivado em meios sem o quelante de ferro,

56. Composição compreendendo: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 92% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:397, contanto que se o polipeptídeo isolado inclu- ir um ou mais aminoácidos adicionais no terminal amino, os um ou mais aminoácidos adicionais incluam pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelomenos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoáci- dos 1-26 da SEQ ID NO:399.

57. Composição compreendendo: anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 98% de similaridade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:408, contanto que se o polipeptídeo isolado inclu- ir um ou mais aminoácidos adicionais no terminal amino, os um ou mais aminoácidos adicionais incluam pelo menos uma deleção de aminoácido ou pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com os aminoáci- dos 1-5 de SEQ ID NO:415.

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