AT410173B - Antigene zusammensetzung - Google Patents

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Description

AT 410 173 B
Ein Vakzin kann eine ganze Vielzahl verschiedener Antigene enthalten. Beispiele für Antigene sind abgetötete ganze Organismen, wie inaktivierte Viren oder Bakterien, Pilze, Protozoen oder sogar Krebszellen. Antigene können auch aus Unterfraktionen dieser Organismen/Gewebe, aus Proteinen oder in ihrer einfachsten Form, aus Peptiden bestehen. Antigene können auch vom Immunsystem in Form glykosylierter Proteine oder Peptide erkannt werden und können auch Polysaccharide oder Lipide sein oder beinhalten. Kurze Peptide können ebenfalls verwendet werden, da beispielsweise cytotoxische T-Zellen (CTL) Antigene in Form von kurzen, gewöhnlich 8-11 Aminosäuren langen Peptiden in Verbindung mit dem größeren Histokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) erkennen (Rammensee et al., 1995).
Um anhaltende, Antigen-spezifische Immunantworten zu erhalten, müssen Adjuvantien Immunkaskaden auslösen, die alle notwendigen Zellen des Immunsystems mit einbeziehen. Ohne in ihrer Wirkungsweise beschränkt zu sein, wirken Adjuvantien vor allem auf sogenannte Antigenpräsentierende Zellen (APC), von welchen Dendriten-Zellen (DC) die wirkungsvollsten sind. Diese Zellen treffen gewöhnlich zuerst auf das (die) Antigen(e), wonach prozessiertes oder nicht modifiziertes Antigen Immuneffektor-Zellen präsentiert wird. Intermediäre Zelltypen können auch eine Rolle spielen. Nur Effektor-Zellen mit geeigneter Spezifität werden bei einer produktiven Immunantwort aktiviert. Die Adjuvantien können auch Antigene und ko-injizierte andere Faktoren örtlich zurückhalten. Weiters können die Adjuvantien als Chemoattraktionsmittel für andere Immunzellen wirken oder örtlich und/oder systemisch als Stimulationsmittel für das Immunsystem wirken.
Zeilen des angeborenen Immunsystems erkennen auf ihren jeweiligen Zielen exprimierte Muster. Beispiele sind Lipopolysaccharide (LPS) im Falle gram-negativer Bakterien, mykobakterielle Glykolipide, Lipoteichonsäuren gram-positiver Bakterien, Mannane von Hefe und doppelsträngige RNAs von Viren (Hoffmann et al., 1999). Außerdem können sie Muster, wie veränderte Glykosylierungen von Proteinen auf Tumorzellen erkennen.
Es zeigte sich, dass polykationische Polymere, beispielsweise die polykationischen Aminosäure-Polymere Poly-L-arginin und Poly-L-lysin, eine sehr effiziente Beladung von APC mit Antigenen in vitro und in vivo ermöglichen (Buschle et al., 1998, Buschle et al., 1997, Schmidt et al., 1997). Man nimmt an, dass dies das Schlüsselereignis für die Auslösung von Immunkaskaden ist, die schließlich zur Induktion Antigen-spezifischer Immuneffektor-Zellen führen, die Ziele zerstören oder neutralisieren können. Es hat sich bereits früher gezeigt, dass eine Anzahl polykationischer Verbindungen Auswirkungen auf Immunzellen hat (Buschle et al., 1998, Buschle et al., 1997).
Die Koinjektion einer Mischung aus Poly-L-arginin oder Poly-L-lysin zusammen mit einem entsprechenden Antigen als Vakzin schützt Tiere in mehreren Tiermodellen vor Tumorwachstum (Buschle et al., 1998, Schmidt et al., 1997). Dieses chemisch definierte Vakzin kann eine große Anzahl Antigen-spezifischer T-Zellen induzieren. Um Antigen-spezifische T-Zellen zu induzieren, müssen Peptide von APC aufgenommen werden. Solche mit Peptid beladene APCs induzieren eine Immunkaskade, die schließlich zur Induktion Antigen-spezifischer Immuneffektor-Zellen, wie T-Zellen, führt.
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (Poly-l:C) ist als wirksames induzierendes Mittel für Interferon vom Typ I bekannt (Manetti et al., 1995). Wegen seiner Schutzwirkungen bei einer Anzahl von Tierspezies gegen ein breites Spektrum von sowohl RNA- als auch DNA-Viren (z.B. Herpes sim-plex-Virus, Rabies-Virus, Japanischer B-Enzephalitis-Virus, Vaccinia-Virus, Enzephalomyokarditis-Virus) wird Poly-l:C häufig in Virusinfektionsmodellen verwendet. Man nimmt an, dass Veränderungen, die als Antwort auf Poly-l:C auftreten, repräsentativ für Veränderungen sind, die als Reaktion auf eine Vielzahl verschiedener Viren auftreten. Es ist bekannt, dass Poly-l:C Makrophagen stimuliert, damit sie Cytokine, wie IL-1a und IL-12, erzeugen (Manetti et al., 1995), sie ist ein starker NK-Zellstimulator (Cavanaugh et al., 1996) und es ist im Allgemeinen bekannt, dass diese Verbindung Thl-spezifische Immunantworten fördert. Wegen dieser Fähigkeiten wurde Poly-l:C weit verbreitet als Immunmodulator in mehreren klinischen Versuchen verwendet und zeigte geringe oder keine Toxizität (Guggenheim et al., 1977, Simnaler et al., 1977). Es brachte jedoch für den Patienten keinen Nutzen. Es ist unklar, ob Poly-l:C alleine eine Adjuvans-Aktivität besitzt. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass Poly-l:C auch die stabile Reifung von in vitro gezüchteten DCs induziert, und dass solche DCs in vitro starke T-Zellen-Stimulatoren sind (Cella et al., 1999; Verdijk et al., 1999).
In der US-PS 3725545 werden Zusammensetzungen beschrieben, welche Nukleinsäurepoly- 2
AT 410 173 B mere und Protamin, Histone oder Lysozyme neben B-Zell-Epitopen umfassen und zur Antikörperproduktion verwendet werden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wirksames Vakzin-System vorzusehen, um eine wirksame Abgabe eines spezifischen Antigens an das immunsystem von Mensch oder Tier zu ermöglichen, um eine wirksame Immunisierung gegen ein solches Antigen zu erreichen.
Diese Aufgabe wird durch eine pharmazeutische Zusammensetzung gelöst, die ein T-Zellen aktivierendes Antigen oder Mischungen von derartigen Antigenen, ein polykationisches Peptid und eine Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin umfasst. Überraschenderweise zeigte es sich, dass, obwohl polykationische Peptide und Nukleinsäuren auf Basis von Inosin und Cytosin bereits als wirksame Adjuvans-Substanzen bekannt waren, die Kombination beider Substanzen mit einem Antigen synergistische Wirkungen bei der Immunstimulation zeigen, die ihre additiven Beiträge bei weitem übertreffen.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin ausgewählt aus Poly-l:Poly-C, Poly-IC, Poly-dC:Poly-dl und Poly-dIC. Natürlich sind auch jegliche andere Kombinationen komplementärer Doppelstrang-IC-Sequenzen ebenfalls bevorzugt, sowie chemisch modifizierte Nukleinsäuren, z.B. thioliertes Poly-IC, wie in US 6,008,334; US 3,679,654 und US 3,725,545 beschrieben.
Bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende polykationische Peptide sind beispielsweise in WO97/30721 beschrieben. Bevorzugte polykationische Peptide sind Polylysine, Polyarginine und Polypeptide, die mehr als 50% der basischen Aminosäuren, insbesondere Arginin- oder Lysin-Reste, in einem Bereich von mehr als 5, insbesondere mehr als 8 Aminosäure-Resten, oder Mischungen davon enthalten. Diese polykationischen Peptide können chemisch oder rekombinant erzeugt werden oder aus natürlichen Quellen stammen. Zu den bevorzugten polykationischen Peptiden, die aus natürlichen Quellen stammen, zählen von HlV-rev oder Hl-tat stammende kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, kationische antimikrobielle Peptide, Defensine, Chitosan (oder andere Chitin-Derivate) und andere Peptide, die von diesen Peptiden oder Proteinen durch eine biochemische rekombinante Erzeugung erhalten werden. Vorzugsweise enthalten die polykationischen Peptide zwischen 10 und 1000 Reste, insbesondere zwischen 50 und 500 Reste. Vorzugsweise enthalten diese Peptide mehr als 70%, insbesondere mehr als 85% basische Aminosäure-Reste, wie Arginin, Lysin, Ornithin usw. und auch synthetische organische Polykationen (Polypeptid-artige Substanzen), wie Polyethylenimin, Histone, Protamin, wie in der WO97/30721 geoffenbart. Natürlich können auch Mischungen verschiedener polykationischer Peptide oder Polypeptide verwendet werden.
Die bei der vorliegenden Zusammensetzung zu verwendenden T-Zellen aktivierenden Antigene sind nicht von kritischer Bedeutung. Vorzugsweise werden Peptide, die von einem viralen oder bakteriellen Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten stammen, als solche Antigene verwendet (einschließlich derivatisierter Antigene oder glykosylierter oder lipidisierter Antigene oder Polysaccharide oder Lipide). Bevorzugte (menschliche, tierische oder pflanzliche) Pathogene sind ausgewählt aus HIV, HBV, HCV, Influenza-Virus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium tubercuiosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (PI. falciparum, PI. vivax, etc.), Aspergillus sp. oder Candida albicans. Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifischen Proteins vom Pathogen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins umfassen. Auf dieselbe Weise können auch Tumor-Antigene (Krebs-Vakzine) oder Autoimmun-Antigene in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumor-Impfung oder eine Behandlung für Autoimmunerkrankungen durchgeführt werden.
Die T-Zellen aktivierenden Antigene sind vorzugsweise Peptid- oder Protein-, Kohlehydratoder Lipid-Antigene oder Mischungen davon. Antigene aus Parasiten oder Pflanzenpathogenen werden auch bevorzugt.
Vorzugsweise ist das Antigen ein Peptid bestehend aus 6 bis 20, vorzugsweise 7 bis 15, insbesondere 8 bis 11 Aminosäureresten. Antigene dieser Länge erwiesen sich als für die T-Zellen-Aktivierung besonders geeignet.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Vakzins. 3
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Die relativen Mengen der Ingredienzien der vorliegenden Zusammensetzung hängen stark von den Erfordernissen der individuellen Zusammensetzung ab, z.B. dem zu verwendenden polykationischen Peptid. Vorzugsweise werden zwischen 1 pg und 1 g T-Zellen aktivierendes Antigen, polykationisches Peptid und Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin angewendet. Im Fall von Poly-L-Arginin und Poly-L-Lysin liegen bevorzugte Mengen von Antigen/Polypeptid/Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin im Bereich von 1-10000 pg Antigen pro Impfung und 0,1 bis 1000 pg Polypeptid. Die Menge an Poly-IC kann vorzugsweise im Bereich von 1 bis 5000 pg/kg Körpergewicht (10 pg - 500 mg) liegen.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiters Hilfsstoffe, wie Puffer, Salze, Stabilisatoren, Antioxidantien usw., oder andere Wirkstoffe, wie Entzündungshemmer oder antinozizeptive Stoffe enthalten.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können einem Patienten, z.B. einem Impfkandidaten, in wirksamen Mengen, beispielsweise in wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder monatlichen Intervallen, verabreicht werden. Patienten, die mit der vorliegenden Zusammensetzung zu behandeln sind, können wiederholt oder nur einmal geimpft werden. Eine bevorzugte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die aktive Immunisierung, insbesondere von Menschen oder Tieren ohne Schutz gegen das spezifische Antigen.
Der Verabreichungsweg für die vorliegende Zusammensetzung ist nicht von kritischer Bedeutung, beispielsweise ist die subkutane, intramuskuläre, intradermale oder transdermale Injektion sowie die orale Aufnahme geeignet. Es ist auch möglich, die vorliegende Zusammensetzung separat zu verabreichen, beispielsweise indem die Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin separat von der Antigen/polykationischen Peptid-Zusammensetzung injiziert wird. Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf ein Set gerichtet, welches eine das Antigen und das polykationische Peptid enthaltende Zusammensetzung als eine Komponente, und eine die Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin enthaltende Zusammensetzung als eine zweite Komponente umfasst. Die Komponenten können zur selben Zeit oder an derselben Stelle verabreicht werden, es ist jedoch auf eine Anwendung an verschiedenen Stellen oder zu verschiedenen Zeiten oder für eine verschieden lange Zeitdauer möglich. Es ist auch möglich, die systemischen oder lokalen Anwendungen der Zusammensetzungen bzw. der Komponenten zu variieren.
Details der vorliegenden Erfindung sind durch die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, die Erfindung ist aber natürlich nicht auf diese beschränkt.
Fig. 1 zeigt die Immunreaktion auf ein von Ovalbumin stammendes Peptid aus einer kombinierten Injektion von Polyinosin-Polycytidylsäure (plC) und Poly-L-Arginin (pR); Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in die Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten-(LN) entnommen, und Lymphknotenzellen wurden entweder mit von Ova-stammendem Peptid, plC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h danach unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten ausgedrückt.
Fig. 2 zeigt die Immunreaktion gegen ein von Ovalbumin stammendes Peptid aus einer kombinierten Injektion von PlC und pR; Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in den Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten (LN) entnommen, und Lymphknotenzellen wurden entweder mit von Ova stammendem Peptid, plC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten gezeigt.
Fig. 3 zeigt die Induktion von Ovalbumin-Peptid-spezifischen T-Zellen nach der kombinierten Injektion von plC und pR; Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in den Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten (LN) entnommen, und Lymphknotenzellen wurden entweder mit von Ova stammendem Peptid, plC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten gezeigt.
Fig. 4 zeigt die Immunreaktion gegen ein von TRP-2 stammendes Peptid nach der kombinierten Injektion von plC und pR; Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in den Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten (LN) entnommen, und 4
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Lymphknotenzellen wurden entweder mit von TRP-2 stammendem Peptid, plC oder pR restimu-liert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten gezeigt.
Fig. 5 zeigt die Induktion von T-Zellen, die für ein P1A- (von einem Mastocytom stammendes) Peptid spezifisch sind, nach der kombinierten Verabreichung von plC und pR; Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in den Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten (LN) entnommen, und Lymphknotenzellen wurden entweder mit P1A-Pep-tid, plC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten gezeigt.
Fig. 6 zeigt die Induktion von T-Zellen, die für von Ova stammende Peptide spezifisch sind, nach der kombinierten Verabreichung von Oligo-dlC2 6 und pR; Mäusen wurden Mischungen, wie oben angeführt, subkutan in den Pfotenballen injiziert. Vier Tage später wurden drainierte Lymphknoten (LN) entnommen, und Lymphknotenzeilen wurden entweder mit von Ova stammendem Peptid, Oligo-dlC2 6 oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-y-produzierenden Zellen wurde 24 h später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106 LN-Zellen ± SA von Triplikaten gezeigt.
BEISPIELE
Beispiel 1
Die kombinierte Injektion von Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC) und Poly-L-Arginin (pR) führt zu einer synergistischen Verstärkung der Immunreaktion gegen ein von Ovalbumin stammendes Peptid. Mäuse Peptid C57BI/6 (Harlan Olac) OVA257_264-Peptid (SIINFEKL; p245), ein auf MHC-Klasse I (H-2Kb) eingeschränktes Epitop von Huhn-Ovalbumin (Rotzschke et a!., 1991), wurde unter Verwendung von Standard-Festphasen F-moc-Synthese synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert.
Poly-L-Arginin (pR)
Dosis: 300 pg/Maus
Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC)
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (SIGMA Chemicals, P-0913, Charge 125H4024) mit einem Molekulargewicht zwischen 220.000 bis 460.000 Dosis: 100 pg/Maus
Versuchsoruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
1. OVA257-264-Peptid + plC + pR
2. OVA257.264-Peptid + plC
3. OVA257.264-Peptid + pR
Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 pl (50 pl pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Einzelzell-Suspensionen wurden durch Zerkleinern von Lymphknoten durch ein 70 pm Zellsieb hergestellt. Danach wurden die Zellen zwei Mal mit DMEM-Medium (Life Technologies), das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden in DMEM/5%FCS auf 107Zellen/ml eingestellt. IFN-γ ELISPOT-Tests wurden im Triplipkat, wie beschrieben, durchgeführt (Miyahira et al., 1995). Diese Methode ist ein weit verbreitet in Verwendung befindliches Verfahren zur Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen. Lymphknotenzellen wurden in vitro entweder mit Ova-Peptid, Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC), Poly-L-Arginin (pR), Concanava 5
AT 410 173 B lin A (ConA) oder nur Medium (Hintergrund) re-stimuliert. Jeder Spot repräsentiert eine einzelne IFN-y-produzierende T-Zelle. Die Spots wurden unter Verwendung eines Biosys-Reader (Biosys, Deutschland) gezählt. Die Anzahl der Hintergrund-Spots wurde von allen Proben subtrahiert. Die Ergebnisse sind als Anzahl von Spots/1x10-Zellen ± SA von Triplikaten ausgedrückt. Nach der Stimulierung mit ConA konnten wir viele Spots nachweisen (Daten nicht dargestellt), was einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten anzeigte. Wie in Fig. 1 gezeigt konnten wir durch Injektion eines von Ova stammenden Peptids mit einer Kombination von plC und pR beinahe 800 Peptid-spezifische T-Zellen unter einer Million Lymphknotenzellen induzieren. Dagegen führten Injektionen von Peptid mit jeder der Substanzen alleine zu keiner Induktion von Peptid-spezifischen T-Zellen (Fig. 1).
Beispiel 2
Die kombinierte Injektion von plC und pR verstärkt die immunreaktion gegenüber von
Ovalbumin stammendem Peptid in konzentrations- (plC) -abhängiger Weise. Mäuse C57BI/6 (Harlan Olac)
Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL; p245), ein auf MHC-
Klasse I (H-2Kb) eingeschränktes Epitop von Huhn-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), wurde unter Verwendung von Standard-Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert.
Dosis: 300 pg/Maus
Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymeri sationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC) Polyinosin-Polycytidyl-Säure (SIGMA Chemicals, P- 0913, Charge 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220.000 bis 460.000 Dosis: 100, 50, 25 pg/Maus
Versuchsaruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
1. OVA257_264-Peptid + plC 100 pg + pR
2. OVA257.264-Peptid + plC 50 pg + pR
3. OVA257.264-Peptid + plC 25 pg + pR 4. OVA257.264-Peptid + plC 100 pg
5. OVA257.264-Peptid + pR
Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 pl (50 pl pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt, und IFN-y-ELISPOTs wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106-Zellen ± SA von Triplikaten ausgedrückt. Selbst eine sehr niedrige Dosis von plC (25 pg/Maus), die in einer Kombination mit pR plus Peptid injiziert wird, führt zur Induktion von Antigen-spezifischen T-Zellen (Fig. 2).
Beispiel 3
Die kombinierte Injektion von plC und pR verstärkt die Induktion von Ovalbumin-Peptidspezifischen T-Zellen in Peptid-konzentrationsabhängiger Weise. Mäuse C57BI/6 (Harlan Olac)
Peptid OVA257.264-Peptid (SIINFEKL; p245), ein auf MHC-
Klasse I (H-2Kb) eingeschränktes Epitop von Huhn-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), wurde unter Verwendung von Standard-Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. 6
AT 410 173 B
Poly-L-Arginin (pR)
Dosis: 300,100, 50 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC)
Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (SIGMA Chemicals, P-0913, Charge 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220.000 bis 460.000 Dosis: 100 pg/Maus Versuchsqruppen (4 Mäuse pro Gruppe) 2. 3. 4. 5. 1. OVA257-264-Peptid 300 μ9 + plC + pR OVA257.264-Peptid 100 pg + plC + pR OVA257.264-Peptid 50 pg + plC + pR OVA257.264-Peptid 300 pg + plC OVA257.264-Peptid 300 pg + pR Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 pl (50 pl pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt, und IFN-y-ELISPOTs wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106-Zellen ± SA von Triplika-ten ausgedrückt. Wie in Fig. 3 gezeigt, kann eine vergleichsweise starke Immunreaktion selbst dann induziert werden, wenn eine niedrigere Peptid-Dosis (100 pg anstelle von 300 pg/Maus) für die Impfung verwendet wird.
Beispiel 4
Die kombinierte Injektion von plC und pR führt zu einer synergistischen Verstärkung der Immunreaktion gegen ein von TRP-2 (Mäuse-Tyrosinase-verwandtes Protein 2) stammendes Peptid. Mäuse C57BI/6 (Harlan Olac)
Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein auf MHC-Klasse I (H-2Kb) eingeschränktes Epitop von Maus-Tyrosinase-verwandtem Protein 2 (Bloom et al., 1997), wurde unter Verwendung von Standard-Festphasen-F-moc-Syn-these synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert.
Poly-L-Arginin (pR)
Dosis: 100 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC)
Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 pg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (SIGMA Chemicals, P-0913, Charge 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220.000 bis 460.000 Dosis: 100 pg/Maus
Versuchsqruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
1. TRP-2+ plC + pR
2. TRP-2+ plC
3. TRP-2+ pR
Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 pl (50 pl pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Präparation der Lymphknoten und die Durchführung der IFN-y-ELISPOTs erfolgten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106-Zellen ± SA von Triplikaten ausgedrückt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass plC und pR auch zur Induktion von TRP-2-Peptidspezi-fischen T-Zellen eine synergistische Wirkung aufweisen (Fig. 4). 7
AT 410 173 B
Beispiel 5
Die kombinierte Verabreichung von plC und pR verstärkt die Induktion von T-Zellen, die für ein von einem Mastocytom stammendes Peptid spezifisch sind, sehr. Mäuse DBA/2 (Harlan Olac)
Peptid Von Mäuse-Mastocytom-P815 stammendes Peptid P1a (LPYLGWLVF), auf MHC Klasse I (H2-Ld) eingeschränkt (Lethe et al., 1992), mittels Standard-Fest-phasen-F-moc-Synthese synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert.
Dosis: 300 pg/Maus
Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymeri sationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
Polyinosin-Polycytidyl-Säure (plC) Polyinosin-Polycytidyl-Säure (SIGMA Chemicals, P- 0913, Charge 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220.000 bis 460.000 Dosis: 100 pg/Maus
Versuchsqruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
1. P1 A-Peptid + plC + pR
2. P1A-Peptid + plC
3. P1A-Peptid + pR
Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μ! (50 μΙ pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Präparation der Lymphknoten und die Durchführung der IFN-y-ELISPOTs erfolgten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106-Zellen + SA von Triplikaten ausgedrückt. Wie in Fig. 5 gezeigt, induziert die kombinierte Verabreichung von plC und pR auch in einem anderen Mäusestamm eine starke Antigen-spezifische Reaktion.
Beispiel 6
Die kombinierte Verabreichung von Oligo-diC2 6 und pR führt zu einer synergistischen
Verstärkung der Immunreaktion gegen ein von Ovalbumin stammendes Peptid. Mäuse C57BI/6 (Harlan Olac)
Peptid Ova257-264-Peptid (SIINFEKL; p245), ein auf MHC-
Klasse I (H-2Kb) eingeschränktes Epitop von Huhn-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), wurde unter Verwendung von Standard-Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert.
Dosis: 300 pg/Maus
Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymeri sationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 pg/Maus
Oligo-desoxy-IC, 26-mer (Oligo-dlC26) Oligo-dIC wurde mittels Standard-Phosphoamidid-
Chemie in einer Größenordnung von 4 μίτιοΙ synthetisiert und mittels HPLC (NAPS Göttingen, Deutschland) gereinigt.
Dosis: 5nMol/Maus
Versuchsqruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
1. OVA257-264-Peptid + Oligo-dlC2 6 + pR 2. OVA257-264~Poptid + Oligo-dlC26
3. ΟVA257-264~ Peptid + pR 8
AT 410 173 B
Am Tag 0 wurde den Mäusen in beide Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μΙ (50 μΙ pro Pfotenballen) injiziert, das die oben erwähnten Verbindungen enthielt. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Präparation der Lymphknoten und die Durchführung der IFN-y-ELISPOTs erfolgten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1x106-Zellen ± SA von Triplikaten ausgedrückt. Wie in Fig. 6 gezeigt, induziert die kombinierte Verabreichung von Oligo-dlC2 6 und pR eine starke Antigen-spezifische Reaktion gegen ein von Ova stammendes Peptid.
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Claims (13)

  1. AT 410 173 B PATENTANSPRÜCHE: 1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend • ein T-Zellen aktivierendes Antigen oder Mischungen von derartigen Antigenen • ein polykationisches Peptid, und • eine Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin.
  2. 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin ausgewählt ist aus Poly-l:Poly-C, Poly-IC, Poly-dC:Poly-dl und Poly-dIC.
  3. 3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das polykationische Peptid ausgewählt ist aus Polyarginin und Polylysin oder einem Polypeptid enthaltend zumindest 50% basische Aminosäure-Reste, insbesondere Arginin- oder Lysin-Reste.
  4. 4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das polykationische Peptid mehr als 5 Reste, vorzugsweise zwischen 10 und 1000, insbesondere zwischen 50 und 500 Reste enthält.
  5. 5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zellen aktivierende Antigen von einem menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Pathogen stammt.
  6. 6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zellen aktivierende Antigen von einem viralen oder bakteriellen Pathogen stammt.
  7. 7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass T-Zellen aktivierende Antigen ein Protein-, Kohlehydrat- oder Lipid-Antigen oder eine Mischung davon ist.
  8. 8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zellen aktivierende von Antigen von Parasiten- oder pflanzlichen Pathogenen stammt.
  9. 9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zellen aktivierende Antigen ein Peptid ist, das aus 6 bis 20, vorzugsweise 7 bis 15, insbesondere 8 bis 11 Aminosäureresten besteht.
  10. 10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie • 1 -10000 μg T-Zellen aktivierendes Antigen, • 0,1 -1000 μ9, polykationisches Peptid, und • 10 μg - 500 mg, Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin enthält.
  11. 11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzliche Substanzen ausgewählt aus Hilfssubstanzen und weiteren Wirksubstanzen enthält.
  12. 12. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Impfstoffs.
  13. 13. Set zur Impfung, umfassend eine Komponente, die ein T-Zellen aktivieren Antigen und ein polykationisches Peptid enthält, und eine Komponente, die eine Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin enthält. HIEZU 3 BLATT ZEICHNUNGEN 10
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