BRPI1012853B1 - Anticorpo humanizado específico para a forma protofibrilar do peptídeo beta-amiloide e seu processo de produção, composição farmacêutica, polinucleotídeo e vetor recombinante - Google Patents

Anticorpo humanizado específico para a forma protofibrilar do peptídeo beta-amiloide e seu processo de produção, composição farmacêutica, polinucleotídeo e vetor recombinante Download PDF

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Abstract

anticorpos humanizados específicos da forma protofibrilar do peptídeo beta-amiloide. a presente invenção refere-se aos anticorpos humanizados específicos da forma protofibrilar do peptídeo beta-amiloide, assim como a utilização desses anticorpos no domínio do mal de alzheimer.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanizados específicos da forma protofibrilar do peptídeo β-amiloide. A presente invenção tem também por objeto a utilização terapêutica, diagnóstica e/ou preventiva desses anticorpos, em particular associada ao acionamento e à progressão de distúrbios neurodegenerativos e/ou às doenças ligadas ao depósito de placas amiloides, e notadamente do Mal de Alzheimer.
[0002] O Mal de Alzheimer (AD) é um mal neurodegenerativo progressivo que afeta uma ampla proporção da população idosa. Esse mal é caracterizado no plano químico por uma perda da memória e um declínio das funções cognitivas, no plano neuropatológico pela presença no cérebro de depósitos neurofibrilares intracelulares e de depósitos extracelulares do peptídeo β-amiloide (A-β) que forma as placas amiloides (Yanker et al. Nature Med. Vol. 2 No 8 (1996)). A esses sinais se acrescenta um número considerável de outras mudanças anormais, incluindo uma alteração dos sistemas imunitários e inflamatórios, assim como uma alteração da função mitocondrial que pode levar a um aumento do estresse oxidativo, uma ativação dos mecanismos da apoptose e por último uma morte celular.
[0003] As placas amiloides são majoritariamente compostas dos peptídeos A-β a 40 ou 42 resíduos que são gerados, quando do processo proteolítico da proteína precursor do peptídeo β-amiloide (APP). Os depósitos extracelulares de peptídeos A-β representam a característica precoce e invariável de todas as formas do AD, incluindo as formas familiares (FAD). As FAD aparecem, de maneira relativamente precoce (entre 40 e 60 anos) e são devido a mutações no gene da APP em 5% dos casos de FAD (> 20 famílias) com seis mutações falsos-sentidos simples ou duplos; no gene da presenilina 1 (PS 1) em 50 a 70% dos casos de FAD (> a 200 famílias) com mais de 80 mutações diferentes identificadas até então; e no gene da presenilina 2 (PS 2) em menos casos de FAD com 2 mutações falso-sentido descritas em 8 famílias. Mutações nesses três genes foram demonstradas como induzindo mudanças na proteólise da APP, que levam a uma superprodução de A-β e ao aparecimento precoce da patologia e dos sintomas que são similares àqueles das formas esporádicas da AD.
[0004] A toxicidade neuronal das placas amiloides poderia residir nas fibrilas de peso molecular importante que são formados por agregação de peptídeos A-β solúveis em formas fibrilares inicialmente solúveis (dita também forma protofibrilar) que são em seguida convertidas em formas insolúveis incorporadas nas placas amiloides. Com efeito, in vitro, foi mostrado que o peptídeo A-β solúvel se agregava progressivamente em uma forma fibrilar (c-a-d que pode ser marcado pelos agentes, tais como o vermelho congo ou a tioflavina S que reconhecem as estruturas terciárias em folha beta dos peptídeos/proteínas), de elevado peso molecular (> 200 kDa), mas ainda solúvel. Porque essa forma é solúvel, ela é frequentemente denominada forma protofibrilar, enquanto que as fibrilas resultam de uma agregação ainda mais importante levando à perda de solubilidade. As formas protofibrilares de transição são geralmente consideradas como os precursores das fibras amiloides e poderiam ser responsáveis pelo disfuncionamento celular e pela perda neuronal no Mal de Alzheimer e em outras doenças ligadas à agregação de proteínas.
[0005] Foi mostrado que as placas amiloides estéreis (isto é, agregadas, são denominadas também placas maduras) são correlacionadas com o estatuto cognitivo dos pacientes com Alzheimer contrariamente aos depósitos difusos de peptídeo A-β que estão também amplamente presentes nos pacientes não atingidos (Duyckaerts et Al, Neurobiol. Aging 1997; 18: 33-42 e Jellinger et Al. 1998; 54:77-95). Alvejar, em particular, essas placas amiloides senis permite, portanto, tratar a patologia Alzheimer, de maneira mais específica e eficaz.
[0006] Numerosos tratamentos foram tentados, a fim de prevenir a formação dos peptídeos A-β, como, por exemplo, inibidores do processo proteolítico da APP.
[0007] Estratégias de imunoterapia como a administração de anticorpos anti-A-β (para diminuir os depósitos amiloides) ou a imunização com os antígenos dos peptídeos A-β (para promover uma resposta humoral) foram testadas, a fim de reduzir o tamanho e a densidade das placas.
[0008] Por exemplo, foi descrito (US 7 179 463) um método de tratamento contra o Mal de Alzheimer que consiste em administrar um anticorpo dirigido contra uma protofibrila que apresenta uma mutação Arclic no interior da região codificando para o peptídeo A-β.
[0009] Nenhum exemplo de anticorpo é realmente descrito. Além disso, nenhuma comparação da afinidade dos anticorpos para os peptídeos em função do peso molecular desses peptídeos foi feita. Outras patentes (US 6 761 888 e US 6 750 324) evocaram anticorpos reconhecendo diversos epitopos ao longo da sequência em ácidos aminados do peptídeo A-β42. Um pedido internacional (WO2007/108756) foi depositado com referência aos anticorpos específicos de protofibrilas, mas os anticorpos descritos reconhecem, ao mesmo tempo, os peptídeos A-β de elevado peso molecular e os oligômeros de peso médio. Além disso, a afinidade dos anticorpos para as placas maduras em relação à sua afinidade para as placas difusas não é evocada.
[00010] Apesar da evolução atual dos conhecimentos a propósitos do Mal de Alzheimer, existe sempre uma necessidade para composições e métodos de tratamento e/ou de prevenção dessa patologia, limitando ao máximo os efeitos secundários. Anticorpos, tais como descritos no presente pedido, humanizados e específicos da forma protofibrilar dos peptídeos A-β têm por finalidade resolver esse problema. Permitindo o reconhecimento das placas amiloides senis e não das placas difusas, os anticorpos objeto da invenção reconhecem as placas patológicas, de forma muito mais eficaz do que anticorpos que reconhecem todas as formas de Abeta, que serão, em grande parte, fixadas sobre os depósitos difusos ou fixadas sobre as formas solúveis de peptídeo A-β monomérico ou de baixo peso molecular.
[00011] Além disso, o fato de reconhecer unicamente as formas próton fibrilares dos peptídeos A-β e não as formas protofibrilares de outras proteínas não ligadas ao Mal de Alzheimer evita ligações inúteis capazes de diminuir a concentração de anticorpos eficazes sobre a doença.
[00012] O anticorpo murin que se humanizou levará o nome de anticorpo 13C3 em todo o presente pedido.
[00013] As sequências que podem codificar para ou constituir os anticorpos humanizados, objetos da invenção, figuram na Tabela 2.
[00014] A presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado que se liga especificamente à forma protofibrilar do peptídeo A-β, seja um peptídeo de elevado peso molecular.
[00015] Em um modo mais vantajoso, o anticorpo se liga ao peptídeo A-β que tem um peso molecular superior a 200, 300, 400 ou 500 kDa.
[00016] De acordo com um modo de aplicação, o anticorpo, objeto da invenção, se liga aos peptídeos A-β agregados em placas senis e não aos depósitos difusos de peptídeos A-β.
[00017] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo, objeto da invenção, se liga especificamente às formas protofibrilares do peptídeo A-β, mas não às outras proteínas de estrutura amiloides (como, por exemplo, os IAPP Islet Amyloid Polypeptide).
[00018] A presente invenção refere-se também a um anticorpo humanizado que tem funções afetivas diminuídas, o que permite uma limitação dos efeitos adversos, tais como o aparecimento de micro hemorragias e edemas vasogênicos.
[00019] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo, objeto da invenção, não possui mais funções efetivas.
[00020] Em um modo de realização ainda mais vantajoso, o anticorpo é uma imunoglobulina G 4, cujo domínio Fc sofreu mutações, diminuindo a produção de semimoléculas.
[00021] Em um modo de realização ainda mais vantajoso, o anticorpo é uma imunoglobulina G 4, cujo domínio Fc sofreu mutações, diminuindo a atividade efetiva.
[00022] A presente invenção tem por objeto um anticorpo humanizado, compreendendo pelo menos um CDR codificado por uma sequência nucleotídica que apresenta uma sequência idêntica a uma das sequências SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 e 19, ou por sequências que diferem respectivamente por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos dessas sequências.
[00023] A presente invenção tem por objeto um anticorpo humanizado, compreendendo pelo menos um CDR que apresenta uma sequência a uma das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 e 20.
[00024] Em um outro modo de realização, o anticorpo objeto da invenção compreende pelo menos um CDR, cuja sequência difere de 1 a 2 ácidos aminados em relação a uma das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 32, contanto que o anticorpo mantenha sua especificidade de ligação.
[00025] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo compreende os CDR codificados pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 e 19 ou por sequências que diferem respectivamente por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos dessas sequências.
[00026] Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo compreende os CDR de sequência SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 e 20.
[00027] O anticorpo, objeto da invenção, pode também compreender os CDR codificados pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 13, 31, 17 e 19 ou por sequências que diferem respectivamente por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos dessas sequências.
[00028] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende os CDR de sequência SEQ ID NO: 10, 12, 14, 32, 18 e 20.
[00029] Um objeto da invenção é o anticorpo humanizado compreendendo os CDR codificados pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 29, 31, 17 e 19 ou por sequência que diferem respectivamente por 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos dessas sequências.
[00030] É também um objeto da invenção um anticorpo humanizado, compreendendo os CDR de sequência SEQ ID NO: 10, 12, 30, 32, 18 e 20.
[00031] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma parte variável de sua cadeia pesada (VH) codificada por uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95 ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 5 ou a sequência SEQ ID NO: 27.
[00032] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma parte variável de sua cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 6 ou a sequência SEQ ID NO: 28.
[00033] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma parte variável dessa cadeia leve (VL) codificada por uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 7 ou a sequência SEQ ID NO: 23.
[00034] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma parte variável de sua cadeia leve (VL), compreendendo uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 8 ou a sequência SEQ ID NO: 24.
[00035] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma cadeia pesada, que compreende uma parte variável (VH) codificada por uma das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 27.
[00036] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma cadeia pesada que compreende uma parte variável (VH) de sequência polipeptídica SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 28.
[00037] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma cadeia leve que compreende uma parte variável (VL) codificada por uma das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23.
[00038] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende uma cadeia leve que compreende uma parte variável (VL) de sequência polipeptídica SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 24.
[00039] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 5 e 7.
[00040] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 6 e 8.
[00041] Em um modo outro de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 5 e 23.
[00042] Em um modo outro de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 6 e 24.
[00043] Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 27 e 23.
[00044] Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo objeto da invenção compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 28 e 24.
[00045] A presente invenção tem também por objeto um anticorpo que compreende uma cadeia pesada codificada por uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 25.
[00046] A presente invenção tem também por objeto um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência polipeptídica SEQ ID NO: 2 ou com a sequência polipeptídica SEQ ID NO: 26.
[00047] Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo compreende uma cadeia leve codificada por uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 21.
[00048] Em um modo de realização, o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 22.
[00049] Um objeto da invenção é um anticorpo que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 e 3.
[00050] Um outro objeto da invenção é um anticorpo, do qual a sequência compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 2 e 4.
[00051] Um objeto da invenção é um anticorpo que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 e 21.
[00052] Um outro objeto da invenção é um anticorpo, cuja sequência compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 2 e 22.
[00053] Um objeto da invenção é um anticorpo que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 25 e 21.
[00054] Um outro objeto da invenção é um anticorpo cuja sequência compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 26 e 22.
[00055] Um outro objeto da invenção é um anticorpo humanizado antipeptídeo Aβ que tem uma afinidade pela forma protofibrilar do peptídeo Aβ pelo menos 100 vezes superior à sua afinidade para as outras formas desse peptídeo.
[00056] Um outro objeto da invenção é um anticorpo, caracterizado pelo fato de induzir uma diminuição das placas amieloides.
[00057] Um outro objeto da invenção é a utilização de um anticorpo humanizado antipeptídeo Aβ no tratamento das doenças associadas aos distúrbios neurodegenerativos, e em particular no tratamento do Mal de Alzheimer.
[00058] Um outro objeto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado antipeptídeo Aβ e excipiente.
[00059] Um outro objeto da invenção é um método de tratamento do Mal de Alzheimer, compreendendo a administração no paciente de um anticorpo humanizado antipeptideo-Aβ.
[00060] Um outro objeto da invenção é uma célula ou células que produz(em) um anticorpo humanizado antipeptídeo -A β , assim como o processo de produção desse anticorpo, compreendendo a colocação dessas células em cultura. Essas células são vantajosamente oriundas de uma linhagem celular.
[00061] Um objeto da invenção é um medicamento que compreende um anticorpo humanizado antipeptideo-Aβ.
[00062] Um objeto da invenção é um polinucleotídeo codificando para um polipeptídeo que apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das sequências SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 22, 24, 26 ou 28.
[00063] Um outro objeto da invenção é um polinucleotídeo que tem uma sequência, tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das sequência SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 ou 27.
[00064] Um outro objeto da invenção é um vetor recombinante que compreende um ácido nucléico que tem uma das sequências SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 ou 27, assim como uma célula hospedeira, que compreende esse vetor.
Definições
[00065] Uma ligação específica é entendida de uma diferença de um fator de pelo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 entre a intensidade da ligação a um receptor em relação a um outro, no caso entre a ligação à forma protofibrilar do peptídeo A-β e a ligação às outras formas do peptídeo.
[00066] Por "epitopo" se entende o local do antígeno ao qual se liga o anticorpo. Se o antígeno é um polímero, tal como uma proteína ou um poli-sacarídeo, o epitopo pode ser formado por resíduos contíguos ou não-contíguos. No caso, o epitopo é conformacional, isto é, ligado à estrutura tri-dimensional do peptídeo A-β protofibrilar.
[00067] Por "forma protofibrilar" entende-se uma forma oligomérica de peptídeos A-β, solúvel in vitro e podendo ser isolada como uma entidade de peso molecular superior a 200 kDa, 300 Kda, 400 Kda ou 500 Kda e que pode fixar agentes tais como a tioflavina-S ou o vermelho Congo.
[00068] Por "placa senil" entende-se uma placa composta de um núcleo amiloide (fixando a tioflavina S ou o vermelho Congo) envolvidos de neuritos distróficos e de uma reação de células gliais. As placas senis são encontradas em particular nos pacientes atingidos pelo Mal de Alzheimer contrariamente aos depósitos amiloides difusos (não fixando a tioflavina S ou o vermelho Congo) que são muito mais numerosa, mas não são associados à doença.
[00069] Um anticorpo, também denominado imunoglobulina, é composto de duas cadeias pesadas idênticas, ("CH") e de duas cadeias leves idênticas ("CL") que são ligadas por uma ponte dissulfeto. Cada cadeia contém uma região constante e uma região variável. Cada região variável compreende três segmentos denominados "regiões que determinam a complementaridade" ("CDRs") ou "regiões hipervariáveis", que são principalmente responsáveis pela ligação ao epitopo de um antígeno.
[00070] O termo "VH" faz referência às regiões variáveis de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo as cadeias pesadas de um fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' ou F(ab)'.
[00071] O termo "VL" faz referência às regiões variáveis de uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo as cadeias leves de um fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' ou F(ab)'.
[00072] Por "anticorpo", entende-se também qualquer fragmento funcional de anticorpo: Fab (Fragment antigen binding), Fv, scFv (single chain Fv), Fc ((Fragment cristalisable). De preferência, esses fragmentos funcionais serão fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fv, dos diabodies, anticorpos multi-específicos (notadamente bi-específicos), polipeptídeos sintéticos contendo as sequências de um ou de CDRs, que possuem geralmente a mesma especificidade de fixação que o anticorpo humanizado, dos quais são oriundos. Segundo a presente invenção, fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos humanizados por métodos, tais como a digestão por enzimas, como a pepsina ou a papaína e/ou por clivagem das pontes dissulfetos por redução química.
[00073] Os nanobodies entram também nessa definição.
[00074] Por "regiões CDR ou CDRs", entendem-se designar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas como definidas por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5t" Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). Existem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é utilizado no caso para designar segundo os casos uma dessas regiões ou várias, até mesmo o conjunto dessas regiões que contêm a maioria dos resíduos ácidos aminados, responsáveis pela ligação afim do anticorpo para o antígeno ou o epitopo que ele reconhece. As regiões as mais conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões ou sequências FR para "framework" ou regiões "vigas".
[00075] A presente invenção refere-se aos anticorpos humanizados.
[00076] Por "anticorpo humanizado", entende-se um anticorpo que contém principalmente sequências imunoglobulinas humanas. Esse termo faz geralmente referência a uma imunoglobulina não humana que foi modificada por incorporação de sequências humanas ou de resíduos encontrados em sequências humanas.
[00077] Em geral, os anticorpos humanizados compreendem um ou tipicamente dois domínios variáveis, nos quais o total ou parte das regiões CDR correspondem a parte oriundas da sequência parente não humana e nos quais o total ou parte das regiões FR é oriunda de uma sequência imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado por então compreender pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), em particular aquela da imunoglobulina humana de referência escolhida.
[00078] Procura-se assim obter um anticorpo que seja imunogênico com um mínimo em um humano. Assim, é possível que um ou dois ácidos aminados de um ou vários CDRs seja(m) modificado(s) por um ácido aminado, menos imunogênico para o hospedeiro humano, isto, sem reduzir substancialmente a especificidade de ligação do anticorpo ao peptídeo A-β de elevado peso molecular. Da mesma forma, os resíduos das regiões vigas podem não ser humanos e é possível que não sejam modificados, por não contribuem ao potencial imunogênico do anticorpo.
[00079] Existem vários métodos de humanização conhecidas do técnico para modificar um anticorpo parente não humano em um anticorpo menos imunogênico para o humano. Uma identidade global das sequências com um anticorpo humano não é forçosamente necessária. Com efeito, a identidade global de sequência não é necessariamente um indicador predictivo de uma imunogenicidade reduzida e a modificação de um grande número limitado de resíduo pode levar a anticorpos humanizados que apresentam um potencial imunogênico muito atenuado no homem (Molecular Immunology (2007) 44, 1986-1998).
[00080] Diversos métodos são, por exemplo, a inclusão de CDRs (grafting) (EPO 0 239 400; WO 91/09967; e U.S. Pat. Nos. 5 530 101 e 5 585 089), a re-surfaçagem (EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padian, 1991, Molec Imm 28(4/5); 489-498; Studnicka et al. 1994, Prot Eng 7(6): 805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) ou ainda a mistura das cadeias (U.S. Pat. No. 5 565 332).
[00081] A presente invenção refere-se em particular aos anticorpos humanizados, cujas partes variáveis são modificadas, segundo a tecnologia explicitada no pedido de patente internacional WO 2009/032661.
[00082] Essa técnica aplica notadamente uma simulação de dinâmica molecular a partir de modelos a partir de modelos tridimensionais de anticorpos, esses modelos sendo construídos por homologia.
[00083] A presente invenção refere-se também a toda forma de anticorpos tendo funções efetivas diminuídas, como imunoglobulinas, portando mutações do domínio Fc, reduzindo sua afinidade pelos receptores do sistema imunitário ou como nanobodies.
[00084] Por "funções efetivas", entende-se qualquer fixação do domínio Fc do anticorpo em receptores ou proteínas induzindo respostas imunitárias. A diminuição dessas funções efetivas permite diminuir efeitos adversos, tais como o acionamento de micro- hemorrogias (Racke et al. J Neurosci 2005, 25:629).
[00085] A afinidade pode ser medida por qualquer técnica conhecida do técnico. Ela é vantajosamente medida, segundo a técnica Biostat Speed desenvolvida a partir dos algoritmos descritos por Ratkovsk DA et Reedy TJ (Biometrics, 1986, 42, 575-82).
[00086] A fim de permitir a expressão de cadeias pesadas e/ou cadeias leves do anticorpo, objeto da invenção, os polinucleotídeos codificando para essas cadeias são inseridos em vetores de expressão. Esses vetores de expressão podem ser plasmídeos, YACs, cosmídeos, retro-vírus, epissomas derivados de EBV, e todos os vetores que o técnico pode julgar apropriados à expressão dessas cadeias.
[00087] Esses vetores podem ser utilizados para transformar células vantajosamente oriundas de uma linhagem celular. Essa linhagem celular é ainda mais vantajosamente oriunda de um mamífero.
[00088] Ela é vantajosamente a linhagem CHO ou uma linhagem derivada dessa linhagem, ou ainda a linhagem HEK293 ou uma linhagem derivada dessa linhagem.
[00089] A transformação das células pode ser efetuada por qualquer método conhecido do técnico para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Esse método pode ser a transformação com o auxílio de dextrano, a precipitação por fosfato de cálcio, a transfecção com o auxílio de polibreno, a fusão de protoplastos, a eletroporação, o encapsulamento dos polinucleotídeos em lipossomas, a injeção biolística e a micro-injeção direta do DNA no núcleo.
[00090] Os anticorpos, objeto da invenção, podem estar compreendidos em composições farmacêuticas, visando uma administração por via tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutânea, intraocular, etc. Preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm veículos farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação injetáveis. Pode tratar-se em particular de soluções salinas (fosfato mono-sódico, di-sódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, etc..., ou misturas desses sais), estéreis, isotônicas, ou de composições secas, notadamente liofilizadas, que, por adição segundo o caso de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de solutos injetáveis.
[00091] A título de exemplo uma composição farmacêutica compreende (1) um tampão fosfato Dulbecco (pH ~ 7.4), contendo eventualmente 1 mg/ml a 25 mg/ml de soro albumina humana, (2) 0,9% w/v de cloreto de sódio (NaCL)), e (3) 5% (w/v) de dextrose. Ela pode também compreender um antioxidante, tal como triptamina e um agente estabilizante, tal como o Tween 20.
[00092] As patologias visadas podem ser todas as doenças ligadas ao depósito de placas amiloides. Em particular, a patologia visada é o
Mal de Alzheimer.
[00093] As doses dependem do efeito desejado, da duração do tratamento e da via de administração utilizada; elas estão geralmente compreendidas entre 5 mg e 1000 mg de anticorpos por dia para um adulto. De maneira geral, o médico determinará a dosagem apropriada em função do estágio da doença, da idade do paciente, de seu peso ou de qualquer outro fator a considerar, em função do paciente.
[00094] A presente invenção é ilustrada, sem para tanto ser limitada, pelos exemplos que se seguem.
Breve descrição das figuras
[00095] Figura 1A: Mapa do plasmídeo pXL4973 permitindo a expressão da cadeia leve LC1 do anticorpo antiAbeta 13C3-VH1VL1.
[00096] Figura 1B: Mapa do plasmídeo pXL4979 permitindo a expressão da cadeia pesada HC1 do anticorpo antiAbeta 13C3- VH1VL1.
[00097] Figura 2A e 2B: Separação das protofibrilas e dos oligômeros de fraca massa molecular por gel de filtragem sobre Superdex 75 (respectivamente a t=0 e t=16h).
[00098] Figura 3: Determinação da massa molecular das protofibrilas.
[00099] Figura 4A, 4B e 4C: Determinação das afinidades dos anticorpos humanizados (respectivamente anticorpos LP09027 (4A), LP09026 (4B) e LP09028 (4C)) para as protofibrilas (média de 3 experiências + sem).
[000100] Figura 5: Especificidade do anticorpo humanizado LP09027 face às fibrilas de Aβ.
[000101] Figura 6A e 6B: Especificidade do anticorpo humanizado (LP09027) para as placas maduras senis, respectivamente do córtex frontal (6A) e de hipocampe (6B) de um rato. As setas indicam as placas senis.
EXEMPLOS Exemplo 1: Obtenção dos anticorpos humanizados Um anticorpo murin 13C3 foi humanizado.
[000102] Esse exemplo descreve a sequência e a obtenção de anticorpo humanizado antipeptídeo Aβ VH1VL1 (LP09027) por produção em expressão transitória na linhagem mamífera KEK293 nomeada Freestyle 293-F.
[000103] Os cDNA codificando para as cadeias variáveis humanizadas VL1 e VH1 são fundidas aos cDNA codificando para as regiões constantes humanas Ckappa e IgG4 respectivamente. A sequência da região constante IgG4 é aquela da variante que tem as substituições S241P e L248E na nomenclatura de Kabat, a fim de diminuir significativamente a produção de semi-moléculas (Angla at al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) e as funções efetivas (WO 97/09351).
[000104] As sequências nucléicas codificando para CH1 (SEQ ID NO: 1) e para CL1 (SEQ ID NO: 3) foram clonadas independentemente no vetor de expressão para gerar respectivamente os plasmídeos pXL4973 (figura 1A) e pXL4979 (figura 1B).
[000105] Um lote do anticorpo é produzido por produção em expressão transitória na linhagem Freestyle 293-F (Invitrogen), após co- transfecção dos plasmídeos pXL4973 e pXL4979, segundo o protocolo descrito por invitrogen (referência catálogo K9000-01). Esse lote (LP09027) é em seguida purificado por cromatografia de afinidade sobre uma coluna de gel MabSelect (Amersham), segundo as recomendações do fornecedor, depois formulado no tampão PBS (referência Dulbecco 14190-094) e filtrado esterilmente (0,2 μm). A partir de 1 L de cultura, 33 mg de anticorpos são obtidos com uma pureza de 97% por SDS- PAGE em condições desnaturantes e por cromatografia de exclusão estérica. A massa obtida por SDS-PAGE em condições desnaturantes e por LC/MS está em acordo com a sequência primária em ácido aminado e a presença de um N-glican sobre o domínio Fc, seja uma massa de 23969 Da para a CL1 e 49650 Da para a HC1, considerando- se o N-glican sob a forma G0F. A massa obtida por SDS-PAGE em condições não desnaturantes e por cromatografia de exclusão de tamanho está em acordo com a estrutura hetero-tetramérica de anticorpos 150 kDa (figura 4A).
[000106] De acordo com um mesmo processo, os lotes de anticorpos humanizados LP09026 e LP09028 foram produzidos a partir das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 21 para LP09026 (figura 4B), e SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 21 para LP09028 (figura 4C).
Exemplo 2: Preparo das protofibrilas a partir do peptídeo Aβ (1-42)
[000107] As protofibrilas foram preparadas a partir do peptídeo sintético Aβ (1-42), segundo o método descrito por Johansson et al. (FEBS, 2006, 2618-2630). P peptídeo liofilizado (Anaspec référence 24224) é colocado em solução em 10mM NaOH à concentração de 100μM, depois agitado durante 1 mn e incubado sobre o gelo durante 10 mn. A solução de peptídeo é em seguida diluída no tampão 100 mM fosfato de sódio, 200 mM NaCl pH=7,4 a uma concentração de 50 μM, depois agitado durante 1 mn. O preparo é incubado durante uma noite a 37 °C para se obter a formação de protofibrilas, depois centrifugado a 17900 g durante 15 minutos a 16 °C, para eliminar os agregados insolúveis. Para separar os protofibrilas das formas oligoméricas de Aβ de baixa massa molecular, o que flutua é carregado sobre uma coluna de gel filtragem Superdex 75 equilibrada no tampão 50 mM acetato de amônio pH=8.5. As frações correspondentes às fotofibrilas e aos oligômeros de baixa massa molecular são coletadas e estocadas a 4 °C. A figura mostra um perfil tipo de separação das protofibrilas. A massa molecular das protofibrilas é determinada pelo gel filtragem Superdex200, utilizando como marcadores de massa de molecular o quite de calibragem Biorad (referência 150-1901). A figura 3 mostra que a massa molecular das protofibrilas é superior a 200 KDa.
Exemplo 3: Especificidade e afinidade dos anticorpos humanizados face às protofibrilas.
[000108] 50 μl de protofibrilas e oligômeros de baixa massa molecular à concentração de 1 μg/ml em PBS (Gibco, referência 70011) são colocados nos poços de uma ELISA (Nunc, referência 442404) e incubados a 4 °C durante uma noite. Após eliminação do excesso do antígeno, 200 μl de tampão PBS + 5% leite em pó (peso/volume) são depositados em cada poço para eliminar as adsorções não específicas e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. Os poços são em seguida lavados quatro vezes com 300 μl de tampão PBS tween 0,2%. 50 μl de uma solução de anticorpo primário (diluição de 3 em 3 em PBS Tween a partir de uma concentração de 100 μg/ml para os oligômeros e a partir de 25 μg/ml para as protofibrilas) são acrescentados a cada poço e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Os poços são lavados 4 vezes com 300 μl de tampão PBS Tween. O anticorpo secundário anti-Fc humano acoplado à peroxidase (Goat Anti Humano IgG (Fc) peroxidase conjugated, Pierce, referência 31413) diluído a 1/10000 em tampão PBS Tween é acrescentado a cada poço e incubado durante uma hora à temperatura ambiente. Após quatro lavagens com 300 μl de PBS Tween, 100 μl de TMB (Interchim, referência UP664782) são acrescentados a cada poço e incubados durante aproximadamente 10 mn, depois a reação é parada com uma solução de HCl 1M (Interchim, referência UPS29590) e as placas são lidas a uma medida no comprimento de onda de 450 nm. As EC50 são determinadas por BioStat Speed. Os resultados obtidos são indicados na tabela 1, assim como na figura 4 e mostram a maior especificidade do anticorpo pelas protofibrilas em relação os oligômeros de baixa massa molecular (fator 184). Tabela 1
Figure img0001
[000109] O peptídeo Aβ 1-42 liofilizado (Anaspec referência 24224) é dissolvido, segundo a recomendação do fornecedor: 40 μl de NH4OH 1% são acrescentados a 500 μg de Aβ 1-42. Após completa dissolução, 460 μl de PBS são acrescentados para se obter uma concentração de 1 mg/ml. Alíquotas de 10 μl são preparadas e estocadas a -80 °C.
[000110] 50 μl de uma solução de peptídeo Aβ 1-42 à combinação de 1 μg/ml no tampão carbonato (NAHCO3 0.025 M (Acros Organics, referência 217120010), Na2CO3 0.035 M (Acros Organics, referência 207810010), pH 9.7 é depositada nos poços de uma placa ELISA e incubada durante a noite à temperatura ambiente. Conforme anteriormente, os poços são lavados com o tampão PBS Tween, incubadas em presença de tampão PBS + 5% leite em pó (peso/volume) e lavados com tampão PBS tween. O anticorpo humanizado à concentração de 0,02 μg/ml é incubado durante uma hora à temperatura ambiente com uma faixa de concentração (a partir de 1 mg/ml) de peptídeos Aβ 1-28 (Bachem, referência H7865), Aβ 1-16 ((Anaspec, referência 24225), Aβ 25-35 ((Anaspec, referência 24227), oligômeros de baixa massa molecular ou protofibrilas preparados conforme descritos anteriormente. A mistura anticorpo/antígeno é em seguida depositada em cada poço e a placa de microtitulação incubada durante uma hora à temperatura ambiente. O anticorpo livre não complexado é determinado segundo o mesmo protocolo ELISA que descrito anteriormente. Essas experiências de competição mostram que só as protofibrilas com uma afinidade muito maior do que os oligômeros de baixa massa molecular são capazes de neutralizar o anticorpo humanizado, impedindo de interagir com o peptídeo Aβ 1-42, nenhum dos peptídeos é capaz de neutralizar o anticorpo.
Exemplo 4: Especificidade do anticorpo humanizado LP09027 face às fibrilas de Aβ 1-42.
[000111] O peptídeo Aβ 1-42 (Anaspec, 20276) é dissolvido em 200 μl de NaOH 10 mM a uma concentração de 5 mg/ml. O peptídeo IAPP (Anaspec, 60804) é diluído em 200 μl de DMSO 50% a uma concentração de 5 mg/ml. 100 μl de cada preparado são diluídos em 400 μl de PBS 1.25X. A concentração final dos peptídeos é de 1 mg/ml em 500 μl. As amostras são incubadas durante 72 horas a 37 °C. Após incubação, as amostras são centrifugadas a 17900 g durante 30 minutos a 4 °C. O que flutua é eliminado e o resíduo é lavado três vezes com PBS 1X. Após a última lavagem, o resíduo de fibrilas é retomado em 150 μl de PBS. Para controlar a presença de fibrilas de tipo amiloide, um teste de fluorescência da tioflavina T (Anaspec, 88306) é realizado. 20 μl de tioflavina T (20 μM final), 10 μl da amostra e 70 μl de PBS 1X (volume final 100 μl) são misturados em um poço de uma placa negra (Corning, 3792). A tioflavina T é excitada a 450 nm e, em presença de estrutura de tipo amiloide, emite uma fluorescência a 482 nm. 50 μl de fibrilas de Aβ 1-42 a 1 μg/ml e IAPP a 0,5 μg/ml são depositados em cada poço de uma placa de microtitulação. O protocolo ELISA é aplicado, utilizando-se diluições em série do anticorpo humanizado a partir de 10 μg/ml. A figura 5 mostra que o anticorpo humanizado LP09027 reconhece especificamente as fibrilas de Aβ 1-42 mas não aquelas de IAPP.
Exemplo 5: Especificidade de anticorpo humanizado LP09027 para as placas senis maduras e para as placas difusas.
[000112] O anticorpo humanizado (LP09027) conjugado com a digoxigenina (digoxigenin-3-O-metil carbonil -ε- ácido amino capróico -N-hidróxi succinimida éster: Roche 11333054001; 11418165001) foi utilizado em imuno-histoquímica (Robot Ventana) sobre cortes de cérebros de ratos APP PS1 (modelo Alzheimer descrito por Schmitz C. et al., Am. J. Pathol, 2004, 164, 1495-1502)) assim como cortes de cérebros humanos (córtex cerebral) proveniente de pacientes atingidos pelo Mal de Alzheimer. As amostras foram previamente fixadas no formol e incluídas em parafina.
[000113] Os resultados obtidos no rato (figuras 6A e 6B) mostram claramente que o anticorpo humanizado reconhece exclusivamente as placas senis maduras e densas, mas não os depósitos difusos do peptídeo Aβ.
[000114] Esses dados estão em correlação com as propriedades desse anticorpo que é específico da forma Abeta protofibrilar e não reconhece, portanto, as formas solúvel, mono ou oligoméricas desse peptídeo. Tabela 2
Figure img0002

Claims (29)

1. Anticorpo humanizado específico da forma protofibrilar do peptídeo A-β, caracterizado pelo fato de que compreende as CDRs das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 e 20, as CDRs das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 14, 32, 18 e 20 ou as CDRs das sequências SEQ ID NO: 10, 12, 30, 32, 18 e 20.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se ligar aos peptídeos A-β agregados em placas senis e não aos depósitos difusos de peptídeos A-β.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende as CDRs codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 e 19.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende as CDRs codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 13, 31, 17 e 19.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende as CDRs codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 9, 11, 29, 31, 17 e 19.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que compreende uma parte variável codificada por uma das sequências nucleotídicas SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 27.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada que compreende uma parte variável de sequência polipeptídica SEQ ID NO: 6 ou sequência SEQ ID NO: 28.
8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve que compreende uma parte variável codificada por uma das sequências nucleotídicas da SEQ ID NO: 7 e da sequência SEQ ID NO: 23.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve que compreende uma parte variável de sequência polipeptídica SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 24.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas das SEQ ID NO: 5 e 7.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que sua sequência compreende as sequências polipeptídicas das SEQ ID NO: 6 e 8.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada codificada pela sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 25.
13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada da sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 26.
14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve codificada pela sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 21.
15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve com uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO: 22.
16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas de SEQ ID NO: 1 e 3.
17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID NO: 2 e 4.
18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 12 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas de SEQ ID NO: 5 e 23.
19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 12 a 15 ou 18, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 6 e 24.
20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 12 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas de SEQ ID NO: 27 e 23.
21. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 28 e 24.
22. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de induzir uma redução das placas amiloides.
23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que sua afinidade pela forma protofibrilar do peptídeo Aβ é pelo menos 100 vezes superior à sua afinidade pelas outras formas desse peptídeo.
24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento das doenças associadas aos distúrbios neurodegenerativos.
25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento do Mal de Alzheimer.
26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 e excipientes.
27. Processo de produção de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de células que produzem o referido anticorpo.
28. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que é adequado para a expressão da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, em que apresenta (i) uma sequência selecionada do grupo que consiste nas sequências SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 e 27 ou (ii) uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos.
29. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 28.
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