ES2664409T3 - Anticuerpos humanizados específicos de la forma protofibrilar del péptido beta-amiloide - Google Patents

Abstract

Anticuerpo humanizado específico de la forma protofibrilar del péptido A-β, caracterizado por que: - dicho anticuerpo tiene unas funciones efectoras disminuidas, - la parte variable de su cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos 90% de identidad con la secuencia SEC ID NO: 6 o SEC ID NO: 28; - la parte variable de su cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos 90% de identidad con la secuencia SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 24; - dicho anticuerpo tiene una afinidad por la forma protofibrilar del péptido Aβ al menos 100 veces superior a su afinidad por las otras formas de este péptido, siendo la afinidad la EC50 medida por ELISA; y 15 - dicho anticuerpo se une a los péptidos A-β agregados en placas seniles y no a los depósitos difusos de péptidos A-β.

Description

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Breve descripción de las figuras:

Figura 1A: Mapa del plásmido pXL4973 que permite la expresión de la cadena ligera LC1 del anticuerpo antiAbeta 13C3-VH1VL1.

Figura 1B: Mapa del plásmido pXL4979 que permite la expresión de la cadena pesada HC1 del anticuerpo antiAbeta 13C3-VH1VL1.

Figuras 2A y 2B: separación de las protobibrillas y de los oligómeros de baja masa molecular por gel filtración sobre Superdex 75 (respectivamente a t=0 y a t=16h).

Figura 3: Determinación de la masa molecular de las protofibrillas.

Figuras 4A, 4B y 4C: Determinación de las afinidades de los anticuerpos humanizados (respectivamente anticuerpos LP09027 (4A), LP09026 (4B) y LP09028 (4C)) para la fotofibrillas (media de 3 experimentos ± sem).

Figura 5: Especificidad del anticuerpo humanizado LP09027 frente a unas fibrillas de A.

Figuras 6A y 6B: Especificidad del anticuerpo humanizado (LP09027) para las placas maduras seniles, respectivamente de la corteza frontal (6A) y del hipocampo (6B) de un ratón. Las flechas indican las placas seniles.

Ejemplos

Ejemplo 1: Obtención de los anticuerpos humanizados

Se humanizó un anticuerpo murino 13C3.

Este ejemplo describe la secuencia y la obtención del anticuerpo humanizado anti-péptido A VH1VL1 (LP09027) por producción en expresión transitoria en la línea mamífero HEK293 denominada FreeStyle 293-F.

Los ADNc que codifican para las cadenas variables humanizadas VL1 y VH1 se fusionan a los ADNc que codifican para las regiones constantes humanas Ckappa e IgG4 respectivamente. La secuencia de la región constante IgG4 es la de la variante que tiene las sustituciones S241P y L248E en la nomenclatura de Kabat, a fin de disminuir significativamente la producción de semi-moléculas (Angla et al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) y las funciones efectoras (WO 97/09351).

Las secuencias nucleicas que codifican para CH1 (SEC ID NO: 1) y CL1 (SEC ID NO: 3) se clonaron independientemente en el vector de expresión para generar respectivamente los plásmidos pXL4973 (Fig 1A) y pXL4979 (Fig 1 B).

Un lote del anticuerpo está producido por producción en expresión transitoria en la línea FreeStyle 293-F (Invitrogen) después de la cotransfección de los plásmidos pXL4973 y pXL4979 según el protocolo descrito por Invitrogen (referencia de catálogo K9000-01). Este lote (LP09027) se purifica después por cromatografía de afinidad sobre una columna de gel MabSelect (Amersham) según las recomendaciones del proveedor y después se formula en el tampón PBS (referencia Dulbecco 14190-094) y filtrado estérilmente (0,2 µm). A partir de 1 l de cultivo, se obtienen 33 mg de anticuerpos con una pureza del 97% por SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y por cromatografía de exclusión estérica. La masa obtenida por SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y por LC/MS está de acuerdo con la secuencia primaria en aminoácidos y la presencia de un N-glucano sobre el dominio Fc, es decir una masa de 23969 Da para la LC1 y 49650 Da para la HC1, teniendo en cuenta el N-glucano en forma G0F. La masa obtenida por SDS-PAGE en condiciones no desnaturalizantes y por cromatografía de exclusión de tamaño está de acuerdo con la estructura heterotetramérica del anticuerpo 150 kDa.(Fig 4A).

Según el mismo procedimiento, los lotes de anticuerpo humanizados LP09026 y LP09028 se produjeron a partir de secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 21 para LP09026 (Fig 4B), y SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 21 para LP09028 (Fig 4C).

Ejemplo 2: Preparación de las protofibrillas a partir del péptido A (1-42)

Las protofibrillas se prepararon a partir del péptido sintético A (1-42) según el método descrito por Johansson et al. (FEBS, 2006, 2618-2630). El péptido liofilizado (Anaspec referencia 24224) se pone en solución en 10mM de NaOH a la concentración de 100µM, después se agita durante 1 minuto y se incuba sobre hielo durante 10 minutos. La solución de péptido se diluye después en el tampón 100mM fosfato de sodio, 200mM de NaCl pH=7,4 a una concentración de 50 µM, y después se agita durante 1 minuto. La preparación se incuba durante una noche a 37°C para obtener la formación de fotofibrillas y después se centrifuga a 17900g durante 15 minutos a 16°C para eliminar los agregados insolubles. Para separar las protofibrillas de las formas oligoméricas de A de baja masa molecular, el

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