BRPI1013484B1

BRPI1013484B1 - protease, dna, vetor de expressão, célula transformada, e, método para produzir uma protease

Info

Publication number: BRPI1013484B1
Application number: BRPI1013484A
Authority: BR
Inventors: Tsunoda Akira; Kobayashi Hiroyuki; Yamaguchi Hiroyuki; Harada Kazunori; Kato Shigeaki; Suga Taro
Original assignee: Meito Sangyo Kk
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2019-08-27
Also published as: AU2010229341A1; RU2011142793A; BRPI1013484A2; DK2411512T3; RU2495931C2; US8609389B2; AU2010229341B2; NZ595078A; MX2011009586A; AU2010229341B9; EP2411512A1; WO2010110464A1; CA2756752A1; JP5643766B2; CN102361975A; US20120040436A1; CA2756752C; JP2012521188A; BRPI1013484A8; ES2445710T3

Abstract

protease, dna, vetor de expressão, célula transformada, e, método para produzir uma protease a presente invenção fornece uma protease tipo melhorada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75 % idêntica à seq id no: 3, a dita protease tipo melhorada tem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste de: (a) substituição da glutamina que corresponde à glutamina na posição 265 na seq id no: 3 com um aminoácido ácido, e (b) substituição da glutamina na posição 266 na seq id no: 3 com um aminoácido ácido, e em que a dita protease tipo melhorada tem atividade de coagulação do leite.

Description

“PROTEASE, DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA TRANSFORMADA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEASE”

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção diz respeito a uma protease tendo atividade de coagulação do leite melhorada derivada de um microorganismo. A protease é preferivelmente usada para a produção de queijo.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [0002] A quimosina de bezerro tem sido usada como uma enzima de coagulação do leite para a produção de queijo por muitos anos. Uma atividade de coagulação do leite da quimosina de bezerro é principalmente atribuída à quimosina, que é uma protease ácida e tem atividade de protease específica de sítio para a caseína do leite com atividade não específica de sítio baixa (digere especificamente a ligação peptídica entre a fenilalanina na posição 105 e a metionina na posição 106 na sequência de aminoácido da κ-caseína). A atividade de protease não específica é considerada levar à redução no rendimento da produção de queijo e à geração de um peptídeo de sabor amargo durante a maturação. Por esta razão, a quimosina é uma excelente enzima de coagulação do leite.

[0003] Entretanto, diminuições no abate de bezerros e aumentos da demanda de queijo tem tornado difícil fornecer a quimosina de bezerro. Hoje em dia, uma enzima de coagulação do leite derivada de microorganismos tais como Rhizomucor miehei e Rhizomucor pusillus, e uma quimosina recombinante produzida pela introdução do gene da quimosina de bezerro em fungos ou levedura são amplamente usadas como uma enzima de coagulação do leite.

[0004] A enzima de coagulação do leite mencionada acima derivada de um microorganismo, quando comparada com a quimosina de bezerro ou quimosina recombinante, tem uma atividade de protease não específica mais alta. É um problema que a razão C/P (razão da atividade de coagulação do leite para atividade de protease), que é importante como características da enzima de coagulação do leite, é baixa. De modo a resolver uma tal desvantagem, em Rhizomucor pusillus, um gene variante da enzima de coagulação do leite obtido pela mutagênese loco

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2/34 dirigida com engenheiramento genético foi expressado e avaliado. Na variante, a razão C/P foi melhorada para ser melhor do que um tipo selvagem pela substituição do ácido glutâmico na posição 19 com alanina na sequência de aminoácido da enzima de coagulação do leite (Documento que não de patente 1).

[0005] Entretanto, visto que a atividade de coagulação do leite da enzima de coagulação do leite variante diminui em cerca de 40 por cento com a substituição de aminoácido, tem sido difícil colocar uma tal enzima em uma aplicação prática. Assim, uma enzima de coagulação do leite derivada de um microorganismo em que a razão C/P é alta e a atividade de coagulação do leite é mantida ou melhorada foi desejada. [0006] Além disso, a acilação da enzima de coagulação do leite derivada de microorganismos tais como Rhizomucor pusillus e Rhizomucor miehei com anidrido dicarboxílico de modo a melhorar a razão C/P tem sido tentada (Documento de patente 1). Com este método, alguma melhora foi obtida, entretanto, estas não são ainda satisfatórias.

[0007] [Documento de patente 1] Patente Japonesa No. 2-18834B [0008] [Documento que não de patente 1] J. Biochem. 129, 791-794, 2001 SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma protease adequada para a coagulação do leite em que uma atividade (a seguir também aludida como uma “atividade de protease não específica”) para digerir uma ligação de peptídeo outra que não a ligação entre a fenilalanina na posição 105 e a metionina na posição 106 na sequência de aminoácido da κ-caseína é baixa e uma atividade de coagulação do leite é mantida ou melhorada.

[0010] Foi estudada na presente invenção intensivamente, para superar o problema descrito acima, e foi isolada, entre cepas mutantes de microorganismos que produzem uma enzima de coagulação do leite, uma cepa mutante que produz uma enzima de coagulação do leite cuja razão C/P é melhorada por causa da redução na atividade de protease não específica, isolaram um gene da enzima de coagulação do leite do tipo melhorada, determinaram a sua sequência de nucleotídeo, expressaram o gene, e mediram a atividade de coagulação do leite e a

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3/34 razão C/P da enzima de coagulação do leite tipo melhorada, deste modo completaram a presente invenção.

[0011] Consequentemente, a presente invenção fornece uma protease derivada do microorganismo tendo a atividade de coagulação do leite, cuja atividade de coagulação do leite é mantida ou aumentada e a razão C/P é aumentada, também fornece um DNA que codifica esta protease, um vetor contendo o DNA e uma célula transformada na qual o vetor foi introduzido.

[0012] Um aspecto da presente invenção é fornecer uma protease tipo melhorada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75 % idêntica à SEQ ID NO: 3, a dita protease tipo melhorada tem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste de:

[0013] substituição da glutamina que corresponde à glutamina na posição 265 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e [0014] substituição de glutamina na posição 266 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e em que a dita protease tipo melhorada tem atividade de coagulação do leite.

[0015] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer a protease tipo melhorada como descrita acima, que é selecionada do grupo que consiste de: [0016] uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 é(são) substituído(s) com um aminoácido ácido, [0017] uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 é(são) substituído(s) com um aminoácido ácido e não mais do que 10 aminoácidos (preferivelmente, não mais do que 5 aminoácidos, mais preferivelmente não mais do que 3 aminoácidos, além disso preferivelmente não mais do que 2 aminoácidos) em posições outras que não 265 e 266 são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e em que a dita protease tipo melhorada tem atividade de coagulação do leite.

[0018] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer a protease tipo

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4/34 melhorada como descrita acima, em que o dito aminoácido ácido é o ácido glutâmico ou o ácido aspártico.

[0019] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer a protease tipo melhorada como descrita acima, em que o ácido glutâmico na posição 19 é substituído com valina, alanina, isoleucina ou leucina.

[0020] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer a protease tipo melhorada como descrita acima, em que a treonina na posição 81 é substituída com glutamina ou ácido aspártico.

[0021] Ainda um outro aspecto da presente invenção é fornecer um DNA que codifica a protease tipo melhorada como descrita acima.

[0022] Ainda um outro aspecto adicional da presente invenção é fornecer um vetor de expressão que compreende o DNA como descrito acima.

[0023] Ainda um outro aspecto adicional da presente invenção é fornecer uma célula transformada dentro da qual o vetor de expressão como descrito acima é introduzido.

[0024] Ainda um outro aspecto adicional da presente invenção é fornecer a célula transformada como descrita acima, a dita célula transformada sendo Saccharomyces cerevisiae.

[0025] Ainda um outro aspecto adicional da presente invenção é fornecer um método para produzir uma protease tipo melhorada tendo atividade de coagulação do leite, que compreende as etapas de cultivar a célula transformada como descrito acima em um meio de cultura e coletar a protease tipo melhorada no meio de cultura.

[0026] Visto que atividade de coagulação do leite é mantida ou melhorada e a razão C/P é alta, rendimento mais alto de produção de queijo com a enzima tipo melhorada da presente invenção é esperado. Além disso, a razão C/P mais alta no geral implica que o desenvolvimento de sabor amargo no queijo durante a maturação é reduzido, isto é, queijo de alta qualidade pode ser fabricado com a enzima melhorada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

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5/34 [0027] A Figura 1 mostra a estrutura de um vetor de expressão JS4.

[0028] A Figura 2 mostra o alinhamento de sequência da protease de Rhizomucor pusillus (RMPP) e a protease de Rhizomucor miehei (RMMP). DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO [0029] A presente invenção será ilustrada em detalhes abaixo.

[0030] A protease tipo melhorada (enzima de coagulação do leite) da presente invenção [0031] A protease tipo melhorada da presente invenção compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75 % idêntica à SEQ ID NO: 3, e tem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste de:

[0032] substituição da glutamina que corresponde à glutamina na posição 265 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e [0033] substituição da glutamina na posição 266 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e tem atividade de coagulação do leite.

[0034] Os exemplos do aminoácido ácido mencionado acima incluem ácido glutâmico e ácido aspártico.

[0035] A protease tipo melhorada da presente invenção preferivelmente tem identidade de sequência não menor do que 90 %, mais preferivelmente não menor do que 95 % da sequência de aminoácido inteira da SEQ ID NO: 3.

[0036] Em uma forma de realização, a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser obtida pela introdução da(s) mutação(ões) em uma protease tipo selvagem derivada de Rhizomucor miehei (SEQ ID NO: 3). Nesta forma de realização, a protease tipo melhorada da presente invenção é selecionada do grupo que consiste de:

[0037] uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 é(são) substituída(s) com um aminoácido ácido, [0038] uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 é(são) substituída(s) com um aminoácido ácido e não mais do que 10 aminoácidos

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6/34 em posições outras que não 265 e 266 são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e tem atividade de coagulação do leite.

[0039] A Fig. 2 mostra o alinhamento de sequência da protease de Rhizomucor pusillus e a protease de Rhizomucor miehei. Em ambas as sequências, os aminoácidos nas posições 265 e 266 são conservados, assim a protease tipo melhorada da presente invenção também pode ser obtida pela introdução da(s) mutação(ões) em uma protease tipo selvagem de Rhizomucor pusillus (SEQ ID NO: 43). Isto é, em uma outra forma de realização, a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 43 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 é(são) substituída(s) com um aminoácido ácido. Além disso, esta protease tipo melhorada pode ter uma outra mutação (substituições, deleções, inserções, ou adições de não mais do que 10 aminoácidos) outra que não a(s) substituição(ões) na glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição 266 contanto que a mesma tenha atividade de coagulação do leite.

[0040] Na protease tipo melhorada da presente invenção, o ácido glutâmico na posição 19 e a treonina na posição 81 na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43 podem ser substituídas com outros aminoácidos. O ácido glutâmico na posição 19 é preferivelmente substituído com valina, alanina, isoleucina ou leucina, ao passo que a treonina na posição 81 é preferivelmente substituída com glutamina ou ácido aspártico.

[0041] Na presente invenção, “posição 265”, “posição 266”, “posição 19” e “posição 81” não necessariamente indicam uma posição absoluta a partir do terminal N da protease mas indica uma posição relativa comparada com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43. Por exemplo, na protease tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43, quando a deleção de um aminoácido acontece em uma posição do lado do terminal N a partir da posição 265, a posição 265 mencionada acima é então para ser a posição 264. Mesmo em um tal caso, o aminoácido na posição 264 contado a partir do resíduo de terminal N é o aminoácido da “posição 265” na presente invenção. A posição absoluta do aminoácido é

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7/34 determinada pelo alinhamento da sequência de aminoácido de uma protease de interesse com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43. O aminoácido indicado pelo termo “que corresponde a” também significa um aminoácido em uma posição relativa comparado com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43.

[0042] A SEQ ID NO: 3 e a SEQ ID NO: 43 são sequências de aminoácido da protease tipo madura. A protease tipo melhorada da presente invenção pode incluir a sequência de aminoácido de um peptídeo de sinal, propeptídeo e outros.

[0043] Com o método como descrito nos Exemplos desta descrição, pelo cruzamento de uma cepa mutante que produz uma protease tipo melhorada com alta razão C/P a partir de um microorganismo que produz uma protease tipo selvagem tendo a atividade de coagulação do leite com razão C/P comparativamente baixa e cultivar a cepa mutante em um meio, a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser obtida a partir da célula da cepa mutante ou a partir do meio. Os exemplos do microorganismo que produz a protease tipo selvagem com a razão C/P comparativamente baixa incluem uma cepa do tipo selvagem de Rhizomucor miehei (ATCC16457), Rhizomucor pusillus (ATCC16458), e cepas derivadas destas. Estas cepas podem ser adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 USA). A protease tipo melhorada da presente invenção também pode ser obtida isolando-se um DNA que codifica a protease tipo melhorada da cepa mutante mencionada acima e expressar o DNA.

[0044] Além disso, a protease tipo melhorada da presente invenção também pode ser obtida isolando-se um DNA que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43 da cepa do tipo selvagem de Rhizomucor miehei (ATCC16457), Rhizomucor pusillus (ATCC16458), ou cepas derivadas destas e modificar o DNA com mutagênese loco-dirigida de modo a codificar a protease tipo melhorada da presente invenção, seguido pela expressão do DNA modificado.

[0045] A expressão do DNA mencionado acima pode ser realizada pela construção de um vetor de expressão contendo o DNA mencionado acima e introduzindo-o em uma célula hospedeira. Embora a célula hospedeira possa ser

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8/34 uma célula procariótica ou célula eucariótica, uma célula eucariótica é preferível. Os exemplos da célula eucariótica incluem célula de levedura, uma célula fúngica, e uma célula vegetal. A célula de levedura é preferível e a célula de Saccharomyces cerevisiae sendo particularmente preferida.

[0046] Além disso, a expressão do DNA mencionado acima também pode ser realizada em um sistema isento de célula.

[0047] A razão C/P da protease tipo melhorada da presente invenção é maior do que a razão C/P de uma protease do tipo selvagem correspondente (SEQ ID NO: 3 ou 43). A razão C/P da protease tipo melhorada da presente invenção é preferivelmente não menor do que 1,2 vezes, mais preferivelmente não menor do que 1,5 vezes, ainda mais preferivelmente não menor do que 2,0 vezes tão alta quanto a razão C/P da protease tipo selvagem (SEQ ID NO: 3 ou 43).

[0048] A razão C/P aqui indica [atividade de coagulação do leite (MCA)]/[atividade da protease (PA)]. A medição de PA e MCA pode ser realizada com os seguintes métodos. Como para a medição de MCA, embora exista o Método Padrão Internacional (descrito na ISO15174, IDF176, primeira edição 2002-09-01, Self-imposed Specifications for Food Additives), um valor de MCA na presente descrição é calculada pelo seguinte método (aqui, aludido como método Meito). [0049] [1] Medição de PA [0050] A caseína fabricada a partir do leite (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) é dissolvida em uma solução de hidrogeno fosfato de dissódio 0,05 M e ajustada ao pH 6,0 com 1 mol/l de solução de teste de ácido clorídrico, para preparar uma solução de substrato de caseína a 0,6 %. Uma amostra de teste (0,2 ml), que é diluída apropriadamente, é adicionada a 1 ml desta solução de substrato. A mistura é deixada reagir a 37°C por 10 a 30 minutos e depois a reação é terminada pela adição de 1 ml de uma solução de parada de reação (uma solução mista de ácido tricloroacético 0,11 mol/l, acetato de sódio anidro 0,21 mol/l, e ácido acético 0,33 mol/l). O sobrenadante é obtido pela centrifugação, e 1 ml de 0,55 mol/l de carbonato de sódio anidro é adicionado a 0,4 ml do sobrenadante, e depois 0,2 ml de um reagente de fenol fabricado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

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9/34 (reagente de Folin-Ciocalteu) diluído duas vezes é adicionado. A mistura é deixada reagir a 37°C por 30 minutos e depois a absorbância (comprimento do caminho ótico: 1 cm) é medido a 660 nm. Separadamente, 1 ml da solução de parada de reação é adicionado a 1 ml da solução de substrato, seguido pela adição de 0,2 ml de uma amostra de teste. Em seguida, a mistura é preparada nos mesmos procedimentos e o resultante é usado como um branco. Um valor obtido pela subtração da absorbância do branco da absorbância da amostra de teste é convertido na quantidade de tirosina livre para calcular um valor de PA. A unidade de PA é Unidade/ml. Este 1 Unidade refere-se à quantidade de enzima que realiza um aumento na substância de coloração de reagente de fenol equivalente a 1 pmol de tirosina em 1 minuto no método mencionado acima. Também, a equação de correlação da tirosina e substância de coloração de reagente de fenol é obtida preparando-se uma curva de calibração de tirosina como descrito abaixo.

[0051] Curva de calibração de tirosina [0052] Uma tirosina padrão (peso molecular 181,2, fabricada pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) é secada a 105°C por 3 horas. Depois 0,050 g do padrão é precisamente pesado e dissolvido em 0,2 mol/l de solução de teste de ácido clorídrico para atingir exatamente um volume final de 50 ml. 1, 2, 3 e 4 ml desta solução são precisamente medidos e 0,2 mol/l de solução de teste de ácido clorídrico é adicionado a cada um para atingir exatamente um volume de 100 ml. Dois ml de cada solução é precisamente medido. Depois, 5 ml de solução de teste de carbonato de sódio a 0,55 mol/l e 1 ml do reagente de fenol diluído duas vezes são adicionados. Imediatamente depois disto, a mistura é misturada com agitação e deixada repousar a 37 ± 0,5°C por 30 minutos. A partir da solução obtida, exatamente 2 ml da solução obtida é tomada e as absorbâncias A1, A2, A3, e A4 no comprimento de onda de 660 nm são medidas junto com uma solução de controle preparada em uma maneira similar. Tomando-se as absorbâncias A1, A2, A3 e A4 ao longo de um eixo vertical e a quantidade de tirosina (pmol) em 2 ml de cada solução ao longo de um eixo horizontal, a curva de calibração é preparada para determinar a quantidade de tirosina (pmol) para uma diferença de absorbância de 1.

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10/34 [0053] [2] Método de ensaio para MCA (método de Meito) [0054] Leite em pó desnatado, preferivelmente fabricado pela [0055] CHR.HANSEN, é dissolvido (10 %) em cloreto de cálcio 0,01 M (pH 6,0) para ser usado como um substrato. Uma amostra da solução de teste (0,5 ml) preparada a um concentração na qual fragmentos de coalho são formados por 2 a 5 minutos, preferivelmente e 2 minutos e 30 segundos, é adicionados a 5 ml deste substrato, e a mistura é mantida a 35°C. Enquanto agitando a mistura com uma vareta de vidro, a formação de fragmento de coalho é observada para medir o tempo para a formação. Comparado com um valor do padrão cujo MCA é conhecido, este valor é medido similarmente, o MCA é determinado calculando-se quanto (vezes) mais quantidade de substrato uma quantidade unitária da amostra de teste pode coagular o substrato em um tempo unitário. A equação de cálculo é como segue:

MCA (Mu/ml) = Sx(TsxWs)/(TxW) [0056] S: atividade específica da enzima de coagulação do leite do padrão (Mu/g) [0057] Ts: tempo para a coagulação do leite da solução padrão (segundos) [0058] W_s: quantidade do padrão em 1 ml da solução padrão (g) [0059] T: tempo para a coagulação do leite da solução de amostra de teste (segundos) [0060] W: quantidade da amostra de teste em 1 ml da amostra de solução de teste (ml) [0061] Além disso, MCA também pode ser calculado por quantidade de proteína unitária quantificando-se a quantidade total de proteínas contidas na amostra de teste. No Exemplo 13 descrito mais tarde, MCA é calculado por 1 mg de proteína (Mu/mg de proteína).

[0062] O valor de MCA calculado pelo método mencionado acima tem correlação com o valor de MCA calculado pelo Padrão Internacional (descrito na ISO15174, IDF176, primeira edição 01-09-2002, Self-imposed Specifications for Food Additives). A correlação pode ser mostrada pela seguinte fórmula.

[0063] 1 unidade de padrão internacional (IMCU/ml) « 1 unidade do método

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Meito (Mu/ml)/100 [0064] A MCA da protease da presente invenção é de modo preferivelmente substancial igual a ou maior do que a MCA da protease tipo selvagem. Quando a protease da presente invenção e a protease tipo selvagem (SEQ ID NO: 3 ou 43) são preparadas sob a condição idêntica para comparar MCA, a MCA da protease tipo melhorada da presente invenção preferivelmente não é menor do que 0,8 vezes, mais preferivelmente não menor do que 0,9 vezes, ainda mais preferivelmente não menos do que 1,0 vez tão alta como MCA da protease do tipo selvagem.

[0065] Um exemplo de preparação da protease tipo melhorada da presente invenção e a protease tipo selvagem sob a condição idêntica inclui incorporar DNA que codifica para cada protease em um vetor idêntico para a expressão de gene, introduzindo cada um deste vetor de expressão em uma célula de uma cepa idêntica em uma condição idêntica, e cultivar a célula sob uma condição de cultura idêntica para obter uma cultura como uma solução de protease. A cultura obtida pode ser condensada em uma maneira idêntica ou purificada em uma maneira idêntica para o uso.

[0066] 2. DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção [0067] O DNA da presente invenção é DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção. Os exemplos específicos do DNA da presente invenção incluem um DNA que compreende nucleotídeos de 208 a 1290 na SEQ ID NO: 1 e um DNA que compreende uma sequência que hibridiza com a sequência de nucleotídeo complementar aos nucleotídeos de 208 a 1290 na SEQ ID NO: 1 sob condições severas, e que codifica a protease tipo melhorada tendo as propriedades descritas acima. Os exemplos específicos do DNA da presente invenção também incluem um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 42 e um DNA que compreende uma sequência que hibridiza com a sequência de nucleotídeo complementar à sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 42 sob condições severas, e que codifica a protease tipo melhorada tendo as propriedades descritas acima. Condições severas significam condições em que um chamado híbrido específico é formado enquanto que um híbrido não específico não é formado.

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Embora as condições variem dependendo da sequência de nucleotídeo ou seu comprimento, os seus exemplos incluem condições em que o DNA com alta homologia, por exemplo, DNAs tendo uma homologia de não menos do que 75 %, preferivelmente não menos do que 90 %, mais preferivelmente não menos do que 95 %, mutualmente hibridizam, e DNAs tendo uma homologia com mais baixo do que estas não hibridizam, ou condições de hibridização, isto é uma condição usual para lavagem na hibridização de Southern, a 60°C e 1 χ SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente 0,1 χ SSC e uma concentração salina equivalente a 0,1 % de SDS.

[0068] O DNA que codifica a protease da presente invenção pode ser isolado da cepa mutante tendo a protease tipo melhorada mencionada acima pelo método de clonagem de gene convencional. Por exemplo, o mesmo pode ser isolado pela seleção do DNA de uma biblioteca de gene da cepa mutante mencionada acima pela hibridização com uma sonda de oligonucleotídeo sintética com base na sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou 42.

[0069] Também, o DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser obtido planejando-se iniciadores com base na sequência de nucleotídeo de DNA genômico conhecida ou cDNA do gene da protease do tipo selvagem, e amplificando o DNA do DNA genômico e biblioteca de cDNA da cepa mutante mencionada acima usando os iniciadores.

[0070] O DNA obtido pela introdução de uma mutação loco-dirigida em um DNA tipo selvagem também é incluído no DNA que codifica a protease da presente invenção.

[0071] Por exemplo, um DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser facilmente obtido isolando-se um DNA que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 da cepa do tipo selvagem de Rhizomucor miehei (ATCC16457) ou sua cepa derivada, e introduzir a mutação loco-dirigida dentro dela. Um DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser também obtida isolando-se um DNA que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 43 da cepa do tipo selvagem de Rhizomucor pusillus (ATCC16458) ou sua cepa derivada, e introduzir a mutação loco-dirigida dentro dela.

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13/34 [0072] A introdução da mutação loco-dirigida pode ser realizada por um método conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as mutações podem ser introduzidas sintetizando-se iniciadores tendo um sítio de clivagem da enzima de restrição em uma extremidade e contendo o sítio de mutação na outra extremidade, e substituindo uma porção correspondente em um gene não mutado com a porção mutada (método de mutação de cassete).

[0073] Como o método para introduzir a mutação loco-dirigida, por exemplo, Método duplex aberto e método de kunkel são conhecidos. O método de kunkel está fundamentado em um princípio em que o gene não mutado é clonado em um fago de filamento único, e um filamento complementar é sintetizado usando DNA sintético contendo um desemparelhamento em um ponto mutado como um iniciador, e depois um novo fago e DNA replicado são fabricados apenas com o filamento complementar obtido contendo a mutação como um padrão. A mutagênese locodirigida pode ser realizada usando um kit comercialmente disponível.

[0074] 3. Vetor de expressão da presente invenção [0075] O vetor de expressão da presente invenção é usado para expressar a protease tipo melhorada da presente invenção. O mesmo pode ter uma estrutura em que uma sequência promotora que controla a expressão do DNA é ligado a jusante do DNA que codifica a protease tipo melhorada da [0076] presente invenção. Além disso, um terminador também pode ser ligado a jusante do DNA.

[0077] Como o promotor mencionado acima, quando um hospedeiro é E. coli, trp, lac, taq, ÀPl ou seus semelhantes podem ser usados. Quando um hospedeiro é levedura, um promotor de GAL7, ADH, TPI ou PHO5 ou seus semelhantes é preferido, e entre estes, GAL7 é preferida porque o mesmo fortemente promove a expressão de gene (Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11,8555-8568 (1983)).

[0078] Os exemplos do terminador incluem TPI, GAPDH, e GAL10. Pela ligação do promotor acima mencionado, o DNA que codifica a protease tipo melhorada da presente invenção, o terminador mencionado acima na ordem de 5' a jusante para 3' a jusante e inserindo o resultante em um vetor, o vetor de expressão da presente

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14/34 invenção pode ser construído.

[0079] Como um vetor capaz de replicar na levedura, qualquer tipo do plasmídeo dos chamados YIp, YRp, YEp e YCp pode ser usado. A partir do ponto de vista do número de cópia e estabilidade, o tipo YEp é preferido. Visto que estes plasmídeos no geral contêm uma sequência desnecessária, em consideração da estabilidade do plasmídeo, ou de modo a facilitar a modificação do plasmídeo, é preferido deletar a sequência desnecessária.

[0080] Um gene marcador de seleção para selecionar um gene recombinante ou um repórter para checar a expressão do gene introduzido também pode ser inserido no vetor de expressão da presente invenção. Os exemplos do gene marcador de seleção incluem genes de resistência à higromicina, genes resistentes à canamicina, e genes de resistência à ampicilina. Os exemplos do gene repórter incluem os genes da beta-glicuronidase (GUS), os genes da cloranfenicol acetiltransferase (CAT), os genes da luciferase (LUC) e os genes GFP. Além disso, de modo a expressar a protease tipo melhorada da presente invenção como um tipo secretor ou para facilitar a purificação da protease expressada, uma sequência adicional pode ser incluída no vetor de expressão da presente invenção. Neste caso, a protease da presente invenção é expressada como uma proteína de fusão com uma proteína ou peptídeo codificados pela sequência adicional. Os exemplos da sequência adicional incluem uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal ou propeptídeo e sequência de nucleotídeo que codifica um rótulo His, ou rótulo GST.

[0081] 4. Célula transformada da presente invenção [0082] Uma célula transformada da presente invenção é uma célula dentro da qual o vetor de expressão da presente invenção foi introduzido, a célula sendo capaz de produzir a protease tipo melhorada da presente invenção. Embora a célula possa ser uma célula procariótica ou possa ser uma célula eucariótica, é preferido ser a célula eucariótica.

[0083] Os exemplos da célula eucariótica incluem célula de levedura, célula fúngica e, célula vegetal. A célula de levedura é preferida e Saccharomyces cerevisiae sendo particularmente preferida.

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15/34 [0084] Os exemplos de Saccharomyces cerevisiae incluem cepas de SHY3, D13-1A e MC16.

[0085] Um método para introduzir o vetor de expressão dentro da célula hospedeira pode ser apropriadamente selecionado dependendo dos tipos de célula hospedeira. Tais métodos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um transformante de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, pode ser obtido pelo seguinte método.

[0086] Saccharomyces cerevisiae cultivado em meio de cultura YPD (1 % de extrato de levedura (fabricado pela Difco), 2 % de Bactopeptona (fabricado pela Difco) e 2 % de glicose) durante a noite é inoculada a um volume final de 10 % em um meio de cultura YPD fresco, e cultivada a 30°C por 4 horas. A cultura obtida (1,5 ml) é submetida à centrifugação leve com uma centrífuga de bancada para colher as células. As células são enxaguadas com 0,2 M de LiSCN (fabricada pela Kanto Chemical Co., Inc.) e colocadas em suspensão em 0,02 ml de LiSCN 1 M.

[0087] Subsequentemente, 0,01 ml de uma solução contendo o vetor de expressão (cerca de 1 a 10 pg) e 0,03 ml de 70 % de PEG4000 são misturados, e a mistura foi mantida a 30°C por 1 hora. Esta mistura foi diluída pela adição de 0,14 ml de água esterilizada e depois plaqueado em duas placas SDah (0,67 % de base nitrogenada de Bacto-levedura sem aminoácido, 2 % de glicose, 0,002 % de sulfato de adenina, 0,002 % de L-histidina-HCl, 2 % de ágar). Depois de incubados a 30°C por 2 a 3 dias, o transformante pode ser obtido.

[0088] 5. Método para produzir a protease tipo melhorada tendo a atividade de coagulação do leite da presente invenção [0089] Cultivando-se a célula transformada da presente invenção, a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser produzida, e expressando-se a protease tipo melhorada da presente invenção como uma proteína de fusão com um peptídeo de sinal para a secreção, a protease tipo melhorada da presente invenção pode ser acumulada em um meio. Quando um promotor indutível é usado, a indução é preferivelmente realizada durante a cultura. Embora um método para cultivar a célula transformada varie dependendo dos tipos de célula, métodos convencionais podem

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16/34 ser utilizados.

[0090] Um exemplo do método para cultivar o transformante de Saccharomyces cerevisiae será descrito abaixo.

[0091] O transformante é cultivado com agitação a 30°C por dois dias nos 50 ml de meio de cultura YPD em um frasco de Sakaguchi de 500 ml para proliferar células de levedura. O meio de cultura é centrifugado a 1000xg por 5 minutos para coletar as células. As células são mais uma vez colocadas em suspensão em 100 ml de meio de cultura YPGal (1 % de extrato de levedura, 2 % de Bactopeptona, 4 % de galactose (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), e cultivadas com agitação em um frasco de Sakaguchi de 500 ml a 30°C por três dias.

[0092] A protease tendo a atividade de coagulação do leite, protease esta que é secretada no meio, pode ser usada como tal no estado de existir em sobrenadante de cultura e também pode ser usada pela condensação do sobrenadante de cultura. A protease tendo a atividade de coagulação do leite, protease esta que é secretada no meio, pode ser purificada ou parcialmente purificada. Usando um método geral para purificar uma proteína, a purificação ou purificação parcial podem ser realizadas. Por exemplo, uma técnica incluindo cromatografia tal como troca de íon ou filtração em gel, coagulação com sulfato de amônio ou sedimentação com um solvente orgânico pode ser usada.

[0093] A enzima purificada também pode ser condensada pela liofilização, membrana de ultrafiltração, sedimentação com o solvente orgânico ou seus semelhantes.

EXEMPLOS [0094] A seguir, a presente invenção será agora descrita concretamente por via dos Exemplos mas o escopo técnico da presente invenção não é restrito a estas ilustrações exemplificadas. Também, todas as manipulações de gene podem ser realizadas como descrito em Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

[Exemplo 1] [0095] Aquisição da cepa mutante de Rhizomucor miehei que produz uma

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17/34 protease com razão C/P melhorada [0096] Uma cepa precursora de Rhizomucor miehei (CBS182-67 (uma cepa derivada da ATCC16457)) que produz uma protease foi submetida a um tratamento de mutagênese, deste modo uma cepa mutante que secreta uma protease com razão C/P melhorada foi obtida. Os detalhes são ilustrados abaixo.

[0097] Tratamento de mutagênese [0098] A cepa precursora de Rhizomucor miehei foi cultivada em uma placa de malte (2 % de extrato de malte, 2 % de glicose, 0,1 % de peptona, 2 % de ágar), e mantida por 3 dias a 1 semana a 37°C para permitir a formação de esporo. Estes esporos foram colocados em suspensão em água esterilizada usando uma espátula de vidro.

[0099] Nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, fabricado pela SIGMA CHEMICAL CO.) foi adicionada a esta suspensão de esporo a uma concentração final de 200 pg/ml. A mistura foi tratada na temperatura ambiente por 5 a 20 minutos tal que a taxa de mortalidade é de 90 %. Uma quantidade apropriada desta mistura foi plaqueada na placa de malte, e a placa resultante foi mantida a 37°C. No dia seguinte, cada grupo de hifas fúngicas pequenas obtidas foi inoculado em 8 ml de meio de cultura YPD (1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona, 2 % de glicose), e o sobrenadante de cultura depois cultivado a 37°C por 4 dias foi usado como uma amostra para medir a atividade de protease (PA) e a atividade de coagulação do leite (MCA). As células foram armazenadas a -80°C.

[0100] (2) Pesquisa quanto à protease tipo melhorada [0101] Como um resultado de medir MCA e PA pelo método descrito acima, uma protease tipo melhorada cujo PA foi muito menor do que aquele da cepa precursora e cuja razão C/P (MCA/PA) foi enormemente aumentada em 4,6 vezes quando comparada com a cepa precursora foi obtida.

[Exemplo 2] [0102] Isolamento de um gene de protease da cepa mutante [0103] Aquisição do DNA cromossômico da cepa mutante e a cepa precursora [0104] A cepa mutante obtida no Exemplo 1 e a cepa precursora foram

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18/34 cultivadas na placa de malte, e mantidas a 37°C por três dias a uma semana para permitir a formação de esporo. Estes esporos foram colocados em suspensão em água esterilizada usando uma espátula de vidro. Esta suspensão de esporo foi semeada em 200 ml de meio YPD líquido em um frasco de Sakaguchi de 500 ml tal que cerca de 1 x 10⁸ esporos foram contidos em cada frasco, e cultivados por dois dias a 37°C. No momento quando as células formaram uma pelota com um tamanho de cerca de 0,5 a 2 mm, o meio foi filtrado para remover a umidade excessiva e assim um peso úmido de cerca de 5 g das células foi obtido.

[0105] Depois de congeladas com nitrogênio líquido, as células foram transferidas a um almofariz pré-esfriado e 3 g de areia do mar (850 a 1400 pm) foram adicionados. A mistura foi triturada finamente até pó com um pistilo sob esfriamento com nitrogênio líquido. Isto foi colocado em suspensão em 15 ml de uma solução contendo 0,05 M de EDTA pH 8,5 e 0,2 % de SDS, solução esta que foi pré aquecida a 68°C, e o resultante foi mantido a 68°C por 15 minutos. Depois, a mesma foi deixada repousar e deixada esfriar até a temperatura ambiente, e o sobrenadante turvo foi coletado pela centrifugação. Depois de adicionar 1/10 volume de acetato de sódio 3 M à solução coletada, a mistura foi suavemente agitada e o sobrenadante foi coletado pela centrifugação. Em seguida, quando 15 ml de isopropanol foram adicionados ao sobrenadante coletado e calmamente misturados, um pedaço do DNA genômico e proteínas apareceu. Depois o precipitado gerado foi enxaguado com etanol a 70 %, o resultante foi secado sob pressão reduzida, dissolvido em 400 pl de TE, e 10 pl de solução de RNase (10 mg/ml). A mistura foi mantida a 37°C por 1 hora. Depois do final do tratamento com RNase, um tratamento com fenol/clorofórmio e tratamento com clorofórmio foram realizados, seguidos pela precipitação com etanol, deste modo o DNA genômico foi obtido.

[0106] (2) Isolamento do gene da protease a partir do DNA cromossômico da cepa mutante e cepa precursora [0107] O gene da protease foi isolado pela PCR usando o DNA cromossômico derivado da cepa mutante obtida acima e da cepa precursora como um padrão. Com base na sequência da protease de Rhizomucor miehei registrada no banco de gene

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19/34 (DDBJ acesso número: E01264), iniciadores da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 foram preparados. A condição de PCR foi (A) a 94°C por 2 minutos, (b) 28 ciclos de 94°C por 30 segundos - 55°C por 30 segundos - 72°C por 3 minutos, e (c) 72°C por 5 minutos. Como uma polimerase, TaKaRa Ex Taq (fabricado pela Takara Bio Inc.) foi usada. Como um ciclador térmico, TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient (fabricado pela Takara Bio Inc.) foi usado. Como um resultado de determinar a sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA obtido pela PCR, foi revelado que a sequência de aminoácido codificada pelo DNA amplificado com o DNA cromossômico da cepa precursora como o padrão conteve a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácido codificada pelo DNA amplificado com o DNA cromossômico da cepa mutante como o padrão conteve a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 deste modo o aminoácido na posição 19 foi substituído com valina e o aminoácido na posição 266 foi substituído com ácido glutâmico.

[0108] Daqui em diante, a protease derivada da cepa precursora de Rhizomucor miehei é chamada de RMMP tipo selvagem, e a protease tipo melhorada é chamada de “RMMP melhorada” e um gene que codifica a protease tipo melhorada é chamada de “gene RMMP melhorado”.

[Exemplo 3] [0109] A construção de um vetor plasmídico JS4 para expressar uma proteína estranha usando levedura em germinação (Saccharomyces cerevisiae) MC16 como um hospedeiro.

[0110] JS5 (descrito na Patente Japonesa N^o 3012377 [0109]) foi usado como um material de partida para construir o vetor plasmídico JS4.

[0111] Primeiro, a PCR foi realizada usando o DNA iniciador das SEQ ID NOs: 7 e 8 com JS5 como um padrão, deste modo o produto da PCR de 0,55 kbp contendo uma região promotora GAL7 foi obtido. A condição de PCR foi em (A) 94°C por 2 minutos, (b) 30 ciclos de 98°C por 10 segundos - 52°C por 30 segundos - 72°C por 1 minuto, e (c) 72°C por 5 minutos. Como uma polimerase, TaKaRa Ex Taq (fabricado pela Takara Bio Inc.) foi usada. Como um ciclador térmico, TaKaRa PCR Thermal

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Cycler Dice Gradient (fabricado pela Takara Bio Inc.) foi usado.

[0112] Em seguida, o produto de PCR obtido foi digerido com enzimas de restrição EcoR I e BamH I e inseridos em pUC18 que foi também digerido com EcoR I e BamH I. O plasmídeo obtido foi introduzido dentro da DH5a da E. coli, e as células foram espalhadas em um aplaca de LB ágar contendo 100 pg/ml de ampicilina, 0,1 mM de IPTG e 0,04 mg/ml de X-GAL, e incubados a 37°C por 16 horas. A colônia branca que apareceu foi cultivada com agitação em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina a 37°C por 14 a 16 horas. A partir dos transformantes coletados pela centrifugação, o plasmídeo foi extraído usando o kit QIAprep Miniprep (QIAGEN, daqui em diante todas as extrações de plasmídeo foram realizadas usando este kit). Para o fragmento inserido, o sequenciamento foi realizado para confirmar que as mutações não desejadas não foram introduzidas.

[0113] Subsequentemente, o plasmídeo contendo o fragmento de inserto foi digerido com EcoR I e BamH I para se obter um fragmento de DNA de 0,55 kbp, e depois este fragmento de DNA e o fragmento de DNA de cerca de 6 kbp obtido pela digestão de JS5 com BamH I seguido pela digestão parcial com EcoR I foram ligados. O plasmídeo resultante foi introduzido dentro da DH5a da E. coli e a E. coli transformada foi cultivada em meio LB ágar contendo 100 pg/ml de ampicilina a 37°C por 16 horas. A colônia que apareceu foi cultivada com agitação no mesmo meio líquido a 37°C por 14 a 16 horas e depois, do transformante coletado pela centrifugação, o plasmídeo foi extraído. Este plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição EcoR I, BamH I, e Pst I, para confirmar um padrão de migração pela análise de eletroforese em gel de agarose. Deste modo, o vetor de expressão JS4 foi preparado.

[0114] Como um material de partida para construir este vetor plasmídico, além do JS5, por exemplo, JS52 (número de acesso FERM BP-3898) descrito no parágrafo 0112 da Patente Japonesa N^o 3012377, também pode ser usado. [Exemplo 4] [0115] Construção do vetor plasmídico para expressar o gene RMMP do tipo selvagem e o gene RMMP melhorado

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21/34 [0116] Usando iniciadores (SEQ ID NOs: 9 e 10) planejados de modo a ter um sítio BamH I em ambos os terminais da sequência de nucleotídeo contendo DNA que codifica RMMP do tipo selvagem ou RMMP melhorado tendo as mutações Glu19Val/Gln266Glu, que foram obtidos no Exemplo 2, a PCR foi realizada. O produto de PCR obtido foi digerido com BamH I, inseridos em JS4 que foi similarmente digerido com BamH I e desfosforilado, e o vetor obtido foi introduzido dentro da DH5a da E. coli.

[0117] Usando um iniciador direto que pode recozer ao promotor GAL7 e um iniciador inverso que pode recozer ao terminal 3' do gene RMMP (SEQ ID NOs: 11 e 10), a PCR direcionada à colônia foi realizada. Um transformante de E. coli tendo o vetor plasmídico que foi confirmado que uma direção do gene inserido foi correta foi submetido à cultura líquida como descrito acima. O plasmídeo foi extraído e submetido ao sequenciamento para confirmar que erros não desejados não foram introduzidos, deste modo os vetores plasmídicos para expressar o gene RMMP tipo selvagem e gene RMMP melhorado foram obtidos.

[Exemplo 5] [0118] Construção do vetor de expressão dos genes RMMP melhorados em que a mutação loco dirigida é introduzida (I) [0119] O produto de PCR do gene RMMP do tipo selvagem obtido pelo método descrito no Exemplo 4, que contém uma sequência prepro e os sítios BamH I em cada terminal, foi digerida com BamH I e inseridos em pUC18 que foi similarmente digerido com BamH I e desfosforilado. O plasmídeo resultante foi introduzido dentro da DH5a da E. coli e depois o plasmídeo foi extraído a partir do transformante obtido e a sua sequência de nucleotídeo foi confirmada e deste modo pRMMP-wt foi obtido. [0120] Em seguida, realizando-se a PCR usando pRMMP-wt como um padrão, pares de iniciadores das SEQ ID NOs: 12 e 13, SEQ ID NOs: 14 e 15, SEQ ID NOs: 16 e 17, SEQ ID NOs: 18 e 19, SEQ ID NOs: 20 e 21, SEQ ID NO: 22 e 23, ou SEQ ID NOs: 24 e 25 e o Kit PrimeSTAR Mutagenesis Basal (Takara Bio Inc., a seguir aludido como um “kit” como uma abreviação), as mutações foram introduzidas tal que um resíduo de ácido glutâmico na posição 19 ou glutamina na posição 266 na

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SEQ ID NO: 3 foram substituídos com um outro aminoácido. O planejamento de iniciadores para introduzir a mutação e PCR foram realizadas referindo-se ao manual anexo a este kit. Os experimentos de mutagênese foram realizados de acordo com o manual.

[0121] Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli, e as células foram espalhadas sobre uma placa de LB ágar contendo 100 pg/ml de ampicilina, e incubados a 37°C por 16 horas, deste modo os transformantes foram obtidos. A partir destes transformantes, os plasmídeos foram extraídos pelo mesmo método como descrito acima e submetido ao sequenciamento para confirmar que as mutações não desejadas não foram introduzidas.

[0122] Por tais procedimentos, os genes que codificam as RMMPs melhoradas tendo mutação de Glu19Val, Glu19Ala, Glu19Ile, Glu19Leu, Glu19Phe, Gln266Glu ou Gln266Asp foram preparados. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhorada foram chamados respectivamente como, pRMMP-E19V, pRMMPE19A, pRMMP-E19I, pRMMP-E19L, pRMMP-E19F, pRMMP-Q266E e pRMMPQ266D.

[0123] Além disso, usando pRMMP-Q266E ou pRMMP-Q266D como um padrão, pares de iniciadores das SEQ ID NOs: 12 e 13, SEQ ID NOs: 14 e 15, SEQ ID NOs: 16 e 17 ou SEQ ID NOs: 18 e 19 assim como o kit mencionado acima, a PCR foi realizada. Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli e depois os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos da mesma maneira como descrito acima e sequenciado, deste modo os genes que codificam a RMMP melhorada tendo mutações de Glu19Val/Gln266Asp, Glu19Ala/Gln266Glu, Glu19Ala/Gln266Asp, Glu19Ile/Gln266Glu, Glu19Ile/Gln266Asp, ou Glu19Leu/Gln266Glu foram obtidos. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhorada foram respectivamente chamados de pRMMP-E19VQ266D, pRMMP-E19AQ266E, pRMMP-E19AQ266D, pRMMP-E19IQ266E, pRMMPE19IQ266D, e pRMMP-E19LQ266E.

[0124] Os vetores plasmídicos assim obtidos foram digeridos com BamH I, os fragmentos obtidos foram inseridos no JS4 pelo método descrito acima, deste modo

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23/34 os vetores de expressão para cada um dos genes de RMMP melhorada mencionados acima foram obtidos.

[Exemplo 6] [0125] Construção do vetor de expressão dos genes da RMMP melhorada em que a mutação loco dirigida é introduzida (II) [0126] Além disso, usando pRMMP-wt como um padrão, usando pares de iniciador das SEQ ID NOs: 26 e 27, SEQ ID NOs: 28 e 29, SEQ ID NOs: 30 e 31, SEQ ID NOs: 32 e 33, SEQ ID NOs: 34 e 35 ou SEQ ID NOs: 36 e 37 assim como o kit mencionado acima, a PCR foi realizada. Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli e depois os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos da mesma maneira como descrito acima e sequenciado, deste modo os genes que codificam RMMP melhorada tendo mutações de Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu ou Gln265Asp/ Gln266Asp foram obtidos. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhorada foram respectivamente chamados de pRMMP-Q265E, pRMMP-Q265D, pRMMP-Q265EQ266E, pRMMPQ265EQ266D, pRMMP-Q265DQ266E e pRMMP-Q265DQ266D.

[0127] Os genes da RMMP melhorada foram obtidos pela digestão do vetor plasmídico assim obtido com BamH I e inseridos dentro do JS4 pelo método descrito acima, deste modo o vetores de expressão dos genes de RMMP melhorada mencionados acima foram obtidos.

[Exemplo 7] [0128] Construção dos vetores de expressão dos genes da RMMP melhorada em que a mutação loco dirigida é introduzida (III) [0129] Usando pRMMP-E19V, pRMMP-E19A ou pRMMP-E19I como um padrão, pares de iniciador das SEQ ID NOs: 30 e 31, SEQ ID NOs: 32 e 33, SEQ ID NOs: 34 e 35, ou SEQ ID NOs: 36 e 37 assim como o kit mencionado acima, a PCR foi realizada. Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli e depois os plasmídeos foram extraídos de cada um dos transformantes obtidos da mesma maneira como descrito acima e sequenciado, deste modo os genes que

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24/34 codificam a RMMP melhorada tendo mutações de Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Glu,

Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp,

Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Asp,

Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu,

Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Glu,

Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Glu,

Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Glu,

Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Glu ou

Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Asp foram obtidos. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhoradas foram respectivamente chamados de pRMMPE19VQ265EQ266E, pRMMP-E19VQ265EQ266D, pRMMP-E19VQ265DQ266E, pRMMP-E19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E, pRMMPE19AQ265EQ266D, pRMMP-E19AQ265DQ266E, pRMMP-E19AQ265DQ266D, pRMMP-E19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMPE19IQ265DQ266E e pRMMP-E19IQ265DQ266D.

[0130] Os genes da RMMP melhorada foram obtidos pela digestão dos vetores plasmídicos assim obtidos com BamH I e inseridos dentro do JS4 pelo método descrito acima, deste modo os vetores de expressão dos genes de RMMP melhorada mencionados acima foram obtidos.

[Exemplo 8] [0131] Transformação de levedura MC16 em germinação com o vetor de expressão contendo gene de RMMP tipo selvagem ou melhorada [0132] Os vetores de expressão produzidos como descrito acima foram introduzidos na levedura MC16 em germinação (MATa, leu2, his4, ade2) pelo método de Gietz e Schiestl (1995), e as células foram espalhadas em uma placa SDah, e incubadas a 30°C por 3 dias, deste modo os transformantes foram obtidos. [Exemplo 9] [0133] Expressão secretora da RMMP tipo selvagem e melhorada [0134] Os transformantes obtidos pelo método descrito acima foram cultivados com agitação a 200 rpm em 100 ml de meio YPD líquido, que foi preliminarmente preparada em um frasco de Erlenmeyer de 500 ml com defletores, a 30°C por 24 horas. As células de levedura coletadas pela centrifugação foram recolocadas em

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25/34 suspensão em uma quantidade dupla de meio YPGal líquido, transferidas a um frasco Erlenmeyer com defletores esterilizado, e cultivadas ainda com agitação da mesma maneira por 72 a 96 horas para a expressão secretora. Depois da cultura, o meio de cultura foi centrifugado, deste modo o sobrenadante de cultura contendo a RMMP mencionada acima foi obtido.

[Exemplo 10] [0135] Medição de MCA e PA e avaliação da razão C/P [0136] Como para o sobrenadante de cultura contendo a RMMP, MCA e PA foram medidos para calcular a razão C/P. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[Tabela 1]

N^o	Mutações	Razão C/P relativa (A razão C/P do tipo selvagem é considerada como 1.)
Tipo selvagem	RMMP tipo selvagem	1,0
Tipo melhorada	Glu19Val/Gln266Glu	3,8
1.	Glu19Val	1,9
2.	Glu19Ala	2,2
3	Glu19Ile	1,7
4.	Glu19Leu	0,9
5.	Glu19Phe	N.D.
6.	Gln266Glu	1,4
7.	Gln266Asp	1,7
8.	Glu19Ala/Gln266Glu	2,9
9.	Glu19Ile/Gln266Glu	2,6
10.	Glu19Leu/Gln266Glu	1,7
11.	Glu19Val/Gln266Asp	3,7
12.	Glu19Ala/Gln266Asp	2,7
13.	Glu19Ile/Gln266Asp	3,0
14.	Gln265Glu	1,3
15.	Gln265Asp	1,5
16.	Glu265Glu/Gln266Glu	2,2
17.	Gln265Glu/Gln266Asp	2,8
18.	Gln265Asp/Gln266Glu	2,7
19.	Gln265Asp/Gln266Asp	3,0
20.	Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Glu	4,9
21.	Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp	5,1
22.	Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu	4,0
23.	Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp	4,7
24.	Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Glu	3,5
25.	Glu19Ala/Gln265Glu/Gln266Asp	3,3
26.	Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Glu	3,2
27.	Glu19Ala/Gln265Asp/Gln266Asp	3,3

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26/34

28.	Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Glu	3,5
29.	Glu19Ile/Gln265Glu/Gln266Asp	3,6
30.	Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Glu	3,5
31.	Glu19Ile/Gln265Asp/Gln266Asp	3,5

[0137] N.D.: não detectado (A atividade de coagulação do leite e atividade de protease não puderam ser detectadas).

[0138] A razão C/P da RMMP tendo a mutação de Glu19Val/Gln266Glu derivada de Rhizomucor miehei (cepa mutante) foi 3,8 vezes tão grande quanto aquela do tipo selvagem.

[0139] A RMMP tendo a mutação de Glu19Val, Glu19Ala, e Glu19Ile exibiram uma razão C/P mais alta. Em Rhizomucor pusillus, a mutação de Glu19Ala já foi conhecida (J. Biochem. 129, 791-794, 2001).

[0140] Na RMMP do tipo selvagem, como mostrado na SEQ ID NO: 3, os aminoácidos nas posições 265 e 266 são ambos glutamina. Foi confirmado que a razão C/P de RMMP tendo a única substituição de glutamina na posição 265 com um aminoácido ácido, Gln265Glu e Gln265Asp (os tipos melhorados 14 e 15 na Tabela 1) foram ambas mais altas, comparadas com aquela do tipo selvagem. Similarmente, a razão C/P de RMMP tendo a única substituição de glutamina na posição 266 com o aminoácido ácido, Gln266Glu e Gln266Asp (os tipos melhorados 6 e 7 na Tabela 1) foram ambas mais altas, comparadas com aquela do tipo selvagem.

[0141] A presente invenção revelou pela primeira vez que a razão C/P aumenta pela substituição de glutamina nas posições 265 ou 266.

[0142] Além disso, foi confirmado que quando a substituição de glutamina na posição 266 com o aminoácido ácido e substituição de ácido glutâmico na posição 19 foram combinados (os tipos melhorados 8 a 13 na Tabela 1), a razão C/P tornouse maior do que aquela no caso onde apenas glutamina na posição 266 foi substituída.

[0143] Além disso, a razão C/P de RMMP tendo a mutação de

Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu e

Gln265Asp/Gln266Asp, em que os aminoácidos nas posições 265 e 266 foram

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27/34 simultaneamente substituídos com aminoácido ácidos (o tipo 16 a 19 melhorados na Tabela 1), foi significantemente maior do que aquela da RMMP tendo a mutação em que apenas a glutamina na posição 265 ou apenas a glutamina na posição 266 foram substituídas com aminoácidos ácidos.

[0144] Além disso, a razão C/P das RMMPs tendo a mutação de Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Glu, Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Glu e Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp, em que os aminoácidos nas posições 265, 266 e 19 foram simultaneamente substituídos com aminoácidos ácidos (os tipos melhorados de 20 a 23 na Tabela 1), foi significantemente mais alto (até cerca de cinco vezes), comparada com a RMMP tipo selvagem. Foi confirmado que as proteases tipo melhorada foram extremamente excelentes como uma enzima de coagulação do leite.

[Exemplo 11] [0145] Construção do vetor de expressão dos genes da RMMP melhorada em que a mutação loco dirigida é introduzida (IV) [0146] Subsequentemente, um vetor de expressão do gene da RMMP tendo a mutação em que treonina na posição 81 na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 foi substituída com glutamina ou ácido aspártico foi preparado.

[0147] Usando pRMMP-wt ou pRMMP-Q265EQ266E como um padrão, iniciadores da SEQ ID NOs: 38 e 39, assim como o kit mencionado acima, a PCR foi realizada. Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli e depois os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos da mesma maneira como descrito acima e sequenciado, deste modo os genes que codificam RMMPs melhoradas tendo mutações de Thr81Gln e Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu foram obtidos. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhorada foram respectivamente chamados de pRMMP-T81Q e pRMMP-T81QQ265EQ266E.

[0148] Subsequentemente, usando pRMMP-Q265EQ266D como um padrão,

DNAs iniciadores da SEQ ID NOs: 40 e 41, assim como o kit mencionado acima, a

PCR foi realizada. O produto da PCR obtido foi introduzido dentro da DH5a da E.

coli e depois o plasmídeo foi extraído do transformante obtido da mesma maneira

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28/34 como descrito acima e sequenciado, deste modo o gene que codifica RMMP melhorada tendo mutações de Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp foi obtido. O vetor plasmídico contendo os genes da RMMP melhorada foi chamado de pRMMPT81DQ265EQ266D.

[0149] Além disso, usando pRMMP-E19VQ265EQ266E, pRMMPE19VQ265EQ266D, pRMMP-E19VQ265DQ266E, pRMMP-E19VQ265DQ266D, pRMMP-E19AQ265EQ266E, pRMMP-E19AQ265EQ266D, pRMMPE19IQ265EQ266E, pRMMP-E19IQ265EQ266D, pRMMP-E19IQ265DQ266E ou pRMMP-E19IQ265DQ266D como um padrão, iniciadores da SEQ ID NOs: 38 e 39, assim como o kit mencionado acima, a PCR foi realizada. Os produtos de PCR obtidos foram introduzidos dentro da DH5a da E. coli e depois os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos da mesma maneira como descrito acima e sequenciados, deste modo os genes que codificam RMMPs melhoradas tendo mutações de Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu,

Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu, Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp,

Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu,

Glu19Ala/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu, Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Asp,

Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu, ou

Glu19Ile/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Asp foram obtidos. Estes vetores plasmídicos contendo os genes da RMMP melhorada foram respectivamente chamados de pRMMP-E19VT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265EQ266D, pRMMPE19VT81QQ265DQ266E,

E19AT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19VT81QQ265DQ266D, pRMMP-E19AT81QQ265EQ266D, pRMMPpRMMPE19IT81QQ265EQ266E, pRMMP-E19IT81QQ265EQ266D, pRMMPE19IT81QQ265DQ266E e pRMMP-E19IT81QQ265DQ266D.

[0150] Os genes da RMMP melhorada foram obtidos pela digestão dos vetores plasmídicos assim obtidos com BamH I e inseridos dentro do JS4 pelo método

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29/34 descrito acima, deste modo os vetores de expressão dos genes de RMMP melhorada mencionados acima foram obtidos.

[Exemplo 12] [0151] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 8 a 10, os vetores de expressão preparados no Exemplo 11 foram introduzidos na levedura MC16 em germinação e os transformantes foram submetidos à cultura líquida, deste modo o sobrenadante de cultura contendo a RMMP melhorada foi obtido. Como para o sobrenadante de cultura contendo a RMMP, MCA e PA foram medidos para calcular a razão C/P. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

[Tabela 2]

N^o	Mutações	Razão C/P relativa (A razão C/P do tipo selvagem é considerada como 1).
Tipo selvagem	RMMP tipo selvagem	1,0
Tipo melhorada	Glu19Val/Gln266Glu	3,8
32.	Thr81Gln	1,1
33.	Thr81Gln/Gln265Glu/Gln266Glu	2,6
34.	Thr81 Asp/Gln265Glu/Gln266Asp	4,4
35.	Glu19Val/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln26	4,3
36.	6Glu	3,8
37.	Glu19Val/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln26	4,8
38.	6Asp Glu19Val/Thr81 Gln/Gln265Asp/Gln26 6Glu Glu19Val/Thr81 Gln/Gln265Asp/Gln26 6Asp	2,9
39.	Glu19Ala/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln26	3,2
40.	6Glu Glu19Ala/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln26 6Asp	3,0
41.	Glu19Ile/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln266	3,0
42.	Glu	2,8
43.	Glu19Ile/Thr81 Gln/Gln265Glu/Gln266	2,7
44.	Asp Glu19Ile/Thr81 Gln/Gln265Asp/Gln266 Glu Glu19Ile/Thr81 Gln/Gln265Asp/Gln266 Asp	3,0

[0152] Como mostrado na Tabela 2, foi confirmado que a RMMP tendo as

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30/34 substituições de treonina na posição 81 com glutamina ou ácido aspártico e glutaminas nas posições 265 e 266 com aminoácidos ácidos (os tipos melhorados 33 e 34 na Tabela 2) exibiram a razão C/P mais alta do que a RMMP do tipo selvagem. Em particular, a razão C/P da RMMP tendo as mutações de Thr81Asp/Gln265Glu/Gln266Asp aumentaram tanto quanto 4,4 vezes, comparadas com aquela da RMMP do tipo selvagem.

[0153] Nos casos onde a substituição de ácido glutâmico na posição 19 foi combinada com as substituições acima, a razão C/P foi maior do que a RMMP do tipo selvagem (os tipos melhorados 35 a 44 na Tabela 2)). Em particular, a razão C/P da RMMP tendo a mutação de Glu19Val/Thr81Gln/Gln265Asp/Gln266Glu aumentou tanto quanto 4,8 vezes, comparada com aquela do tipo selvagem RMMP. [0154] Os resultados mostrados na Tabela 1 e Tabela 2 indicam que quando as glutaminas nas posições 265 e/ou 266 na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 são substituídas com o aminoácido ácido, a razão C/P aumenta, comparado com a RMMP do tipo selvagem, e combinando-se a(s) substituição(ões) de aminoácidos nas posições 19 e/ou 81, a razão C/P aumenta ainda mais.

[Exemplo 13] [0155] Purificação das RMMPs do tipo selvagem e melhoradas e avaliação de enzima purificada [0156] A levedura MC16 em germinação que abriga o vetor de expressão contendo o gene RMMP do tipo selvagem ou gene da RMMP melhorada tendo as mutações de Glu19Val/Gln266Glu, Glu19Val, Glu19Ala, Gln266Glu, Gln266Asp, Glu19Ala/Gln266Glu, Gln265Glu, Gln265Asp, Gln265Glu/Gln266Glu, Gln265Glu/Gln266Asp, Gln265Asp/Gln266Glu, Gln265Asp/Gln266Asp, Glu19Val/Gln265Glu/ Gln266Asp ou Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp foi cultivada no método descrito acima para permitir a expressão secretora da RMMP. O sobrenadante de cultura coletado pela centrifugação foi aplicado a uma coluna enchida com HiTrap Q HP (fabricado pela GE Healthcare), que foi equilibrada com um tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 5,5, de antemão, para absorver a proteína de RMMP. Depois de lavar a coluna com o mesmo tampão, a proteína foi

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31/34 eluída com tampão de NaCl 0,3 M. Dois μΙ da fração foram colocados em um aplaca de leite desnatado (1 % de leite desnatado (fabricado pela Difco), 100 mM de tampão de ácido acético pH 5,2, e 1 % de ágar) e incubados a 37°C por 10 minutos, a fração ativa foi detectada com o aparecimento de halo turvo.

[0157] A fração ativa obtida foi concentrada com uma membrana de ultrafiltração e depois purificada pela cromatografia líquida de alto desempenho usando a coluna de filtração em gel Super SW3000 (fabricado pela Tosoh Corporation). Quando a fração purificada foi analisada pela SDS-PAGE, uma única faixa foi observada.

[0158] Os resultados da medição de MCA para a RMMP purificada assim obtida são mostrados na Tabela 3. A quantificação de proteínas foi realizada com Reagente de Ensaio de Proteína BCA (fabricado pela Pierce).

[Tabela 3]

Mutações	MCA (χ 10³ Mu/mg-proteína)
RMMP tipo selvagem	3,89
Glu19Val/Gln266Glu	4,15
Glu19Val	2,19
Glu19Ala	2,43
Gln266Glu	4,24
Gln266Asp	4,01
Glu19Ala/Gln266Glu	4,23
Gln265Glu	4,22
Gln265Asp	4,03
Gln265Glu/Gln266Glu	3,91
Gln265Glu/Gln266Asp	3,74
Gln265Asp/Gln266Glu	3,90
Gln265Asp/Gln266Asp	3,92
Glu19Val/Gln265Glu/Gln266Asp	4,52
Glu19Val/Gln265Asp/Gln266Asp	4,27

[0159] A partir destes resultados, a MCA diminuiu com a substituição apenas de ácido glutâmico na posição 19, ao passo que a MCA aumentou com a substituição de glutamina nas posições 265 ou 266. A MCA também aumentou com as substituições nas posições 19 e 266 e as substituições nas posições 19, 265 e 266 [Exemplo 14] [0160] Medição do peso de matéria seca no soro do leite [0161] A produção de queijo é uma das características importantes no uso

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32/34 comercial de uma enzima de coagulação do leite. A medição do peso da matéria seca no soro do leite é um índice útil para avaliar a produção de queijo. Um peso mais baixo de matéria seca no soro de leite indica um rendimento mais alto de queijo.

[0162] Depois, a medição do peso de matéria seca no soro de leite usando a RMMP do tipo selvagem e RMMP E19V/Q266E, ambas as quais são expressadas em levedura, será descrita.

[0163] A levedura MC16 em germinação que abriga o vetor de expressão contendo o gene RMMP do tipo selvagem ou o gene da RMMP melhorada tendo as mutações de Glu19Val/Gln266Glu foi cultivadas pelo método descrito acima para permitir a expressão secretora da RMMP. O sobrenadante de cultura coletado pela centrifugação foi concentrado por uma membrana de ultrafiltração e o resultante foi usado como a enzima de coagulação do leite.

[0164] Operação de coagulação do leite [0165] O leite de vaca não homogeneizado pasteurizado comercialmente disponível (Takanashi milk products Co. Ltd.) (500 g) é colocado em um béquer e aquecido a 32°C. No ponto quando a temperatura do leite de vaca atinge 32°C, 0,4 g de D-(+) glicono-1,5-lactona (ácido D-glicônico δ-lactona, fabricado pela Wako Pure Chemical) é adicionado e agitados e depois cloreto de cálcio (fabricado pela Wako Pure Chemical) é gradualmente adicionado a uma concentração final de 1 mM e agitado. Depois da adição dos reagentes, a enzima de coagulação do leite (2.000 Mu) é adicionada, agitados por 1 minuto, e mantidos a 32°C. Trinta minutos depois a enzima de coagulação do leite é adicionada é ajustada como tempo de quimosina. Os coalhos são cortados em quadrados de 1 a 1,5 cm quadrados, e deixados repousar por 10 minutos. Depois que eles são deixados repousar, os coalhos são suavemente quebrados. Os coalhos são mantidos a 32°C por 20 minutos, enquanto ocasionalmente são calmamente agitados. Depois, o béquer é transferido a um incubador a 37°C e a temperatura interna é aumentada para 37°C (a 0,5°C por 1 minuto). No ponto quando os coalhos atingem 37°C, eles são deixados repousar por mais 30 minutos, enquanto ocasionalmente são calmamente agitados. Depois que os

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33/34 coalhos são deixados repousar, os coalhos e o soro são separados com gaze. Os coalhos coletados são enrolados na gaze, e colocado em um molde exclusivamente para a produção de queijo. Pela aplicação de pressão (5 MPa por 90 minutos), o soro é ainda fluido e coletado. Todo o soro de leite coletado é misturado e filtrado com papel de filtro qualitativo N^o 1 (ADVANTEC). O resultante é usado como soro do leite total.

[0166] (2) Medição do peso de matéria seca no soro do leite [0167] Um béquer é preliminarmente seco a 105°C com um forno de secagem. Não menos do que 30 minutos mais tarde, o béquer retirado do forno de secagem é colocado em um dessecador, e o peso é medido. Cerca de 25 g de soro de leite obtidos acima são colocados no béquer, e secados no forno de secagem a 105°C por 12 a 15 horas ou mais. Depois de secado, o béquer é colocado no dessecador. Não menos do que 30 minutos mais tarde, o peso é medido. Um valor obtido pela subtração do peso do béquer preliminarmente medido é ajustado como o peso da matéria seca.

[0168] De acordo com o método descrito acima, o teor de matéria seca de 15 lotes do soro do leite e o peso de matéria seca total foram medidos em duplicata, e os resultados são mostrados na Tabela 4 [Tabela 4]

Teor de matéria seca no soro do leite (% p/p)
Lote N^o	RMMP tipo selvagem	RMMP Glu19Val/ Gln266Glu
1	7,257	7,141
2	7,248	7,183
3	7,190	7,168
4	7,177	7,058
5	7,128	7,025
6	7,133	7,032
7	7,054	6,977
8	7,153	6,966
9	7,270	7,087
10	7,129	7,086
11	7,167	7,019
12	7,135	7,010
13	7,037	6,976

Matéria seca total no soro de leite (g)

Lote N^o	RMMP tipo selvagem	RMMP Glu19Val/ Gln266Glu
1	28,648	28,238
2	28,605	28,468
3	28,891	28,218
4	28,651	28,219
5	28,621	27,890
6	28,502	28,300
7	28,397	27,985
8	28,514	28,104
9	29,053	28,526
10	28,637	28,423
11	28,789	28,142
12	28,231	27,521
13	27,656	27,577

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34/34

14	7,098	7,189
15	7,181	7,080
Média	7,157	7,066
SD	0,065	0,071

14	27,696	27,792
15	28,323	27,364
Média	28,481	28,051
SD	0,203	0,214

[0169] A matéria seca total no soro de leite da RMMP do tipo selvagem e RMMP Glu19Val/Gln266Glu foi de 28,4810 g e 28,0511 g, respectivamente. A presença de uma diferença significante foi confirmada usando o teste t de Student (teste de dois lados). Uma diferença significante foi encontrada entre estas (P < 0,01). Isto é, foi descoberto que a RMMP Glu19Val/Gln266Glu pode atingir rendimento mais alto de queijo do que a RMMP do tipo selvagem, a saber, pode produzir cerca de 1,51 % mais queijo do que a RMMP do tipo selvagem. Isto é equivalente a 85,97 kg no caso de produzir queijo usando 100 toneladas (1016,05 kg) de leite.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Protease, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, incluindo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste de:

(A) substituição de glutamina que corresponde à glutamina na posição

265 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e (B) substituição da glutamina na posição 266 na SEQ ID NO: 3 com um aminoácido ácido, e em que a dita protease tem atividade de coagulação do leite.
2. Protease, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste de:

uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou 43 exceto que a glutamina na posição 265 e/ou a glutamina na posição

266 é(são) substituída(s) com um aminoácido ácido,
3. Protease, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito aminoácido ácido é o ácido glutâmico ou o ácido aspártico.
4. Protease, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o ácido glutâmico na posição 19 é substituído com valina, alanina, isoleucina ou leucina.
5. Protease, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a treonina na posição 81 é substituída com glutamina ou ácido aspártico.
6. DNA, caracterizado pelo fato de que codifica a protease como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA como definido na reivindicação 6.
8. Célula transformada que é selecionada do grupo consistindo de célula procariótica, célula de levedura, e célula fúngica, caracterizada pelo fato de que dentro da mesma o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 7 é introduzido.
9. Célula transformada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada

Petição 870180126740, de 05/09/2018, pág. 42/44

2/2 pelo fato de que dita célula transformada é Saccharomyces cerevisiae.
10. Método para produzir uma protease tendo atividade de coagulação do leite, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar a célula transformada como definida na reivindicação 8 ou 9 em um meio de cultura e coletar a protease no meio de cultura.