BRPI1016151B1

BRPI1016151B1 - processo para produção de um tioéster de peptídeo, processos para a produção de um polipeptídeo, processo para a produção de um segundo intermediário utilizado para o processo para a produção do tioéster de peptídeo e processo para a remoção de uma marca para a purificação adicionada a um lado terminal c de uma proteína recombinante

Info

Publication number: BRPI1016151B1
Application number: BRPI1016151-1A
Authority: BR
Inventors: Yasuhiro Kajihara; Ryo Okamoto; Kazuyuki ISHII; Sakamoto Izumi
Original assignee: Glytech, Inc.
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2021-01-19
Also published as: KR101676515B1; RU2012102519A; CN102803286A; EP2450364A4; US20140249294A1; CA2766040C; EP2450364B1; TWI485156B; US9127041B2; JPWO2010150730A1; EP2450364A1; US20120178905A1; WO2010150730A1; SG176300A1; US8642725B2; AU2010263701A1; CA2766040A1; AU2010263701B2; DK2450364T3; JP5730197B2

Abstract

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE TIOÉSTER DE PEPTÍDEO. É fornecido um novo processo para a conversão química de uma cadeia peptídica em um tioéster de peptídeo. Os inventores deram atenção ao resíduo de cisteína de uma cadeia peptídica. Como resultado, o seguinte foi encontrado. Quando um grupo -C (=X)-R1 é introduzido no grupo tiol do resíduo de cisteína e, em seguida, o peptídeo resultante é reagido com um composto tendo um grupo retirante, representado pela fórmula: - NH-C(=Y)NHR3 em um solvente orgânico, o grupo -NH-C(=Y)NHR3 se Iiga através da reação de adição para o grupo carboxila da ligação peptídica lateral N-terminal do resíduo de cisteína, através da qual a ligação peptídica é clivada e o fragmento peptídico lateral C-terminal é cortada. Além disso, quando a cadeia peptídica resultante tendo o grupo -NH-C(=Y)NHR3 é reagida com um tiol em uma solução tampão, uma reação de troca de tiol ocorre, a saber, o grupo tiol do tiol liga-se ao carbono carbonílico ao qual o grupo -NH-C(=Y)NHR3 se Iigou, através do qual o grupo -NH-C(=Y)NHR3 é eliminado. Assim, a conversão em um tioéster de peptídeo é (...).

Description

DESCRIÇÃO Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de um tioéster de peptídeo.

Antecedentes

Vários métodos tais como a biossíntese, a síntese química e síntese livre de células são conhecidos pelo uso na síntese de proteínas. No método de biossíntese, uma proteína é obtida utilizando o interior de uma célula, tal como uma célula de Escherichia coli e introduzindo e expressando o DNA que codifica a proteína a ser sintetizada na célula. Na síntese química, a proteína alvo é sintetizada por ligação sequencial de aminoácidos de uma maneira organoquímica. Na síntese livre de células, a proteína é sintetizada em sistema livre de células, utilizando uma enzima, etc., presente em várias células, tais como a célula de Escherichia coli. Esses métodos são adequadamente utilizados separadamente ou em combinação, dependendo da utilização pretendida, do tamanho e da natureza a ser adicionada, da proteína.

Atualmente, a fim de sintetizar uma proteína de forma homogênea tendo uma modificação particular com uma cadeia de açúcar ou um lipídio, etc., em uma parte do meio da sua sequência de aminoácidos, os aminoácidos são modificados com a cadeia de açúcar ou o lípido, etc., antecipadamente e, em seguida, uma cadeia peptídica incluindo os ácidos aminados modificados é quimicamente sintetizada.

Uma síntese em fase sólida é utilizada principalmente como o método para sintetizar quimicamente a cadeia peptídica. No entanto, a cadeia peptídica obtida pela síntese de fase sólida é geralmente uma cadeia curta, e é composta de no máximo cerca de 50 resíduos.

Assim, as cadeias peptídicas curtas são preparadas separadamente e, em seguida, elas são ligadas, a fim de sintetizar o peptídeo de cadeia longa que possui a modificação. Várias técnicas para a ligadura das cadeias peptídicas foram relatadas, e uma técnica amplamente utilizada é o método de ligadura química nativa (método NCL). O método NCL também pode ser aplicado entre cadeias peptídicas desprotegidas, e é conhecido por sua utilidade na formação de uma ligação amida nativa (ligação peptídica) em um sítio de ligadura (por exemplo, Literatura Patentária 1). O método NCL é uma reação quimiosseletiva entre um primeiro peptídeo tendo uma porção a-carboxitioéster em seu C-terminal e um segundo peptídeo tendo um resíduo de cisteína em seu N-terminal, e um grupo tiol (grupo SH, também referido como um grupo sulfidrila) da cadeia lateral da cisteína é seletivamente reagido com o carbono carbonílico de um grupo tioéster, através do qual um intermediário inicial de ligação de tioéster é formado pela reação de troca de tiol. Esse intermediário espontaneamente realiza a transposição intramolecular a fim de proporcionar uma ligação amida nativa no sítio de ligadura ao mesmo tempo que regenera o tiol da cadeia lateral de cisteína.

Nesse método, duas cadeias peptídicas podem ser ligadas através da ligação peptídica apenas por mistura dos peptídeos desprotegidos em uma solução tampão. No método NCL, mesmo quando os compostos tais como peptídeos possuindo muitos grupos funcionais são reagidos, o terminal C de um peptídeo pode ser ligado seletivamente ao terminal N do outro peptídeo. A partir desses pontos, é importante determinar de que modo utilizar o método NCL, a fim de sintetizar quimicamente a proteína.

No entanto, um problema quando o método NCL é utilizado inclui a preparação de um tioéster de peptídeo tendo uma porção a-carboxitioésster em seu C-terminal, que é necessário como matéria-prima. Vários métodos foram relatados para a preparação do tioéster de peptídeo, e esses métodos podem ser geralmente classificados em dois tipos com base na síntese em fase sólida.

Um primeiro é o método de construção do tioéster de peptídeo em uma resina. Neste método, o tioéster de peptídeo pode ser obtido em conjunto com a clivagem da cadeia peptídica a partir da resina após a construção do peptídeo (por exemplo, síntese de Boc em fase sólida, síntese de Fmoc em fase sólida). Um segundo é o método de construção da cadeia peptídica em fase sólida através de um ligante equivalente ao tioéster (ligante de captura de Segurança, método Fujii, método Dawson, método mercapto propanol, método Kawakami, método Danishefsky, método Hojo, o Aimoto, etc.). Nesse método, o tioéster é obtido através da ativação do terminal C da cadeia peptídica construído por tratamento apropriado com o ligante, seguido por tiólise da cadeia peptídica (literatura não-patentária 1).

Além desses métodos, o método no qual um peptídeo protegido de modo que a cadeia lateral seja protegida pela síntese de fase sólida e apenas o grupo carboxila na posição C-terminal seja livre é sintetizado seguido por tioesterificação em uma condição de condensação adequada e também foi relatado(por exemplo, Literatura Patentária 2). Qualquer desses métodos foram bem estabelecidos, e utilizados para várias sínteses de proteínas. No entanto, o tamanho do tioéster de peptídeo capaz de ser sintetizado é limitado porque esses métodos estão limitados a restrições da síntese de fase sólida. Além disso, no método utilizando o ligante, um derivado de aminoácido não-nativo ou um derivado específico deve ser quimicamente separadamente sintetizado. Assim, os respectivos processos nem sempre podem ser ditos simples.

Um método de inteína resolveu a restrição da tioesterrificação através da síntese de fase sólida (Literatura não-patentária 2). Nesse método, um fragmento de polippetídeo biossintetizado a partir de uma célula pode ser obtido na forma de tioéster. No método inteína, a cadeia peptídica é tioesterificada utilizando uma função de emenda da proteína que ocorre na sequência da proteína particular, e a cadeia polipeptídica é obtida como tioéster. Uma vantagem desse método é que um tioéster de peptídeo de cadeia longa pode ser obtido. A síntese da proteína grande modificada, que havia sido considerada difícil de sintetizar até agora, tornou-se possível através da combinação desse método com o método de síntese química (literatura não-patentária 3). O método de expressar a cadeia polipeptídica e sua obtenção foi estudada extensivamente, e bem estabelecida como uma técnica básica em biologia.

No entanto, quando o método inteína é utilizado, uma sequência peptídica a ser direcionada é necessária e uma proteína complexa inteína expressada deve ser dobradas para assumir uma estrutura tridimensional inerente, não apenas porque é o polipeptídeo expresso, mas também a emenda de proteína levada a funcionar. Assim, dependendo da sequência de polipeptídeos a ser expressa, o tioéster de peptídeo nem sempre é obtido em associação com condições suficientes para a otimização e as complicações que a acompanham nos trabalhos.

Enquanto isso, o método de clivagem da cadeia peptídica em uma posição de um resíduo de cisteína por reação de um composto com o grupo SH do resíduo de cisteína no peptídeo (Literaturas não-patentárias 4 e 5), e o método de clivagem do peptídeo ligado à fase sólida utilizando o ligante (Literaturas não-patentárias 6 e 7) são conhecidos como os métodos de clivagem do peptídeo. Além disso, o método de clivagem da ligação peptídica no lado C-terminal de um resíduo de metionina utilizando brometo de cianogênio (CNBr) é conhecido. No entanto, esses não são métodos para a obtenção de um fragmento peptídico como a tioéster.

Literatura da Técnica Relacionada Literatura Patentária Literatura Patentária 1: Publicação Internacional WO 96/34878 Literatura Patentária 2: Publicação Internacional WO 2007/114454 Literatura não-Patentária Literatura não-patentária 1: Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 11369-11374, 1999. Literatura não-patentária 2: Schwartz et al., CHEM COMMUN., 2087-2090, 2003. Literatura não-Patentária 3: Muir, Annu. Rev. Biochem., 72: 249-289, 2003. Literatura não-Patentária 4:Stark GR, Methods of Enzymology, 47: 129-132, 1977. Literatura não-Patentária 5:Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 5513-5514, 1994. Literatura não-Patentária 6: Sola et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1786-1788, 1993. Literatura não-Patentária 7: Pascal et al., Tetrahedron Letters, Vol. 35, No. 34: 6291-6294, 1994.

Sumário da Invenção

Problema a ser resolvido pela invenção Na tioesterificação de peptídeo mostrada nos antecedentes da técnica acima, o peptídeo capaz de ser tioesterificado está limitado à cadeia peptídica sintetizada na fase sólida e cadeia peptídica a ser direcionada pela emenda da proteína. Isso ocorre porque qualquer um desses métodos requer um derivado de aminoácido não nativo, o ligante e a estrutura tridimensional particular, etc. Assim, é um objeto da presente invenção o fornecimento de um novo processo para a conversão química de uma cadeia peptídica em um tioéster de peptídeo.

Meios para Resolução de Problemas

Os presentes inventores consideraram que um processo para a ativação seletiva de um C-terminal peptídico direcionando um resíduo de aminoácidos nativo em uma sequência peptídica é necessário. Em tal processo, a cadeia peptídica em qualquer peptídeo obtido por qualquer método tal como a biossíntese pode ser seletivamente ativada e tioesterificada.

Assim, os presentes inventores focaram em um resíduo de cisteína que é um aminoácido contendo enxofre especial dentre os aminoácidos nativos. E os presentes inventores descobriram que conforme mostrado na figura a seguir, um grupo -C(=X)-R1 é introduzido em um grupo tiol do resíduo de cisteína, e um composto tendo um grupo retirante representado por -NH-C(=Y)NHR3 é reagido com esse em solvente orgânico a fim de adicionar o grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila de uma ligação peptídica em um lado N- terminal do resíduo de cisteína, através do qual a ligação peptídica é clivada e um fragmento de peptídeo em um lado C-terminal é cortado. Além disso, os presentes inventores descobriram que a cadeia peptídica resultante pode ser convertida em um tioéster peptídico por uma reação de troca com tiol no qual um composto tiol é reagido com a cadeia peptídica a qual o grupo -NH-C(=Y)NHR3 foi adicionado em uma solução tampão, permitindo assim que o grupo tiol do composto tiol fosse ligado ao carbono carbonílico ao qual o grupo -NH-C(=Y)NHR3 foi ligado e eliminando o grupo -NH- C(=Y)NHR3.

Como um exemplo relatado acima, especificamente, um grupo tionoformiato foi primeiramente introduzido no grupo tiol do resíduo de cisteína. E, uma cadeia peptídica em que N-acetilguanidido foi adicionado à região C-terminal foi obtida por reação de N-acetilguanidina com esse grupo tionoformiato no solvente orgânico para provocar a clivagem da cadeia peptídica no lado N-terminal do resíduo de cisteína. Além disso, essa cadeia peptídica adicionada com N-acetilguanidido foi reagida com tiol R4-SH na solução tampão a fim de converter para o tioéster de peptídeo. [0018] Os presentes inventores também descobriram que a cadeia peptídica adicionada com N-acetilguanidido e o tioéster de peptídeo obtido acima pode ser utilizado no método NCL. [Fórmula Química 1]

Ou seja, a invenção prevê especificamente os seguintes [1] a [14]. [1]

Um processo para a produção de um tioéster de peptídeo, compreendendo as seguintes etapas (a) a (c): uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína em uma cadeia de peptídeo tendo o resíduo de cisteína para a eliminação de R2: [Fórmula Química 2]

em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 3]

em que Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila; e (c) uma etapa de tioesterificação de um terminal C do segundo intermediário por reação de tiol com o segundo intermediário a fim de trocar o grupo -NH-C(=Y)NHR3 para o grupo tiol. [2] O processo de acordo com o item [1] acima, em que X é o átomo de enxofre. [3] O processo de acordo com o [1] ou [2] acima, em que grupo arila -O-C6. [4] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [3], em que R2 é um átomo de halogênio ou um grupo arila - S-C6-10 substituído ou insubstituído. [5] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [4] acima, em que Y é um grupo NH. [6] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [5] acima, em que R3 é um grupo acetila. [7] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [6], em que o tiol é tiol representado pela seguinte fórmula (III) na etapa (c): R4-SH (Fórmula III) em que R4 é qualquer grupo selecionado de um grupo benzila substituído ou insubstituído, um grupo arila substituído ou insubstituído, e um grupo alquila substituído ou insubstituído. [8] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [7], em que a cadeia peptídica é uma proteína recombinante. [9] O processo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [8], em que a cadeia peptídica é a proteína recombinante 5 compreendendo uma marca para a purificação. [10] Um processo para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma etapa de ligação do tio éster de peptídeo obtido pelo processo de acordo com qualquer um dos itens 10 [1] a [9] a uma cadeia peptídica tendo cisteína em um N- terminal através de um método de ligadura. [11] Um processo para a produção de um segundo intermediário utilizado para o processo para a produção do 15 tioéster de peptídeo de acordo com qualquer um dos itens [1] a [9], compreendendo: uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo 20 tiol de um resíduo de cisteína em uma cadeia de peptídeo tendo o resíduo de cisteína para a eliminação de R2: [Fórmula Química 4]

25 em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; ou (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 5]

em que Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila. Uma cadeia peptídica tendo um grupo -NH-C(=Y)NHR3 em um terminal C, em que Y é um átomo de oxigênio ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila. [13] Um processo para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma etapa de ligação do peptídeo tendo o grupo -NH-C(=Y)NHR3 em seu terminal C de acordo com o item [12] acima a uma cadeia peptídica tendo cisteína em seu terminal N através de um método de ligadura. [14]

Um processo para a remoção de uma marca para a purificação adicionada a um lado N-terminal de uma proteína recombinante, compreendendo as seguintes etapas de (a) a (c): uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína em uma proteína recombinante compreendendo uma marca para a purificação em seu terminal C para a eliminação de R2: [Fórmula Química 6]

em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada intermediário:

em que Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila; e (c) uma etapa de tioesterificação de um terminal C do segundo intermediário por reação de tiol com o segundo intermediário a fim de trocar o grupo -NH-C(=Y)NHR3 para o grupo tiol.

Efeitos da Invenção

De acordo com a presente invenção, um novo processo para a conversão química da cadeia polipeptídica para o tioéster de peptídeo foi fornecido.

No processo da presente invenção, a cadeia peptídica não possuindo um derivado de aminoácido não-ativo, o ligante e a estrutura tridimensional particular, etc., necessários para os métodos convencionais de tioesterificação pode ser tioesterificada. Portanto, mesmo o fragmento polipeptídico de cadeia longa obtido pela biossíntese, etc., pode ser facilmente tioesterificado.

Além disso, através da combinação do processo da presente invenção com o método convencional de síntese de peptídeos, o polipeptídeo de cadeia longa tendo parcialmente a modificação do peptídeo, que era até então difícil de ser sintetizada, pode ser produzido facilmente e simplesmente fazendo um fragmento da porção sem modificação utilizando o método pelo qual a biossíntese de cadeia longa é relativamente e facilmente sintetizada, fazendo um fragmento da porção tendo a modificação utilizando o método de síntese em fase sólida, e ligando-os.

Mais especificamente, o peptídeo de cadeia de açúcar mais longa pode ser produzido facilmente e simplesmente por síntese química de um fragmento sozinho contendo aminoácidos aos quais uma forma nativa de ligação da cadeia de açúcar foi adicionada quando a modificação foi realizada com a cadeia de açúcar, preparando outra porção por biossíntese e tioesterificação pelo processo da presente invenção, e ligando-as. O método de adição subsequente da cadeia de açúcar e similares à cadeia peptídica através do ligante é também conhecido publicamente, e esse também pode subsequentemente adicionar a cadeia de açúcar ao peptídeo de cadeia longa biossintetizada. No entanto, esse método de ligação de cadeia de açúcar através do ligante se liga à cadeia de açúcar e similares utilizando o aminoácido particular e a sua estrutura. Portanto, por exemplo, quando múltiplos sítios capazes de se ligarem à cadeia de açúcar estão presentes no peptídeo, a cadeia de açúcar pode ser adicionada mais fácil e simplesmente da maneira específica do sítio em comparação aos métodos convencionais, através do corte (retirada) de um fragmento peptídico contendo o sítio de ligação desejado sozinho de um peptídeo de cadeia longa após a obtenção do peptídeo de cadeia longa por biossintetização, adicionando a respectivo cadeia de açúcar, tioesterificando o fragmento peptídico adicionado com cadeia de açúcar utilizando o processo de tioesterificação da presente invenção, e ligando novamente à porção restante.

Além disso, na biossíntese, mesmo se a proteína de comprimento total for expressada normalmente, o seu fragmento peptídico pode ser indevidamente reconhecido, degradado ou não expressado normalmente na célula. É também possível que, após a síntese da proteína de comprimento total, o seu fragmento sozinho a ser modificado seja cortado, o tratamento necessário, tal como a modificação, é dado ao mesmo, o fragmento peptídico modificado é tioesterificado utilizando o processo da presente invenção, e o fragmento tioesterificado é novamente ligado à porção restante a fim de produzir a proteína modificada desejada.

Conforme descrito acima, o processo de tioesterificação de peptídeo da presente invenção é geralmente útil para a síntese protéica.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

As modalidades adequadas da presente invenção são descritas abaixo.

A presente invenção fornece um novo processo para a produção de um tioéster de peptídeo, compreendendo as seguintes etapas (a) a (c): uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína em uma cadeia de peptídeo tendo o resíduo de cisteína para a eliminação de R2: [Fórmula Química 8]

em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 9]

Na presente invenção, o "peptídeo" não é particularmente limitado contanto que dois ou mais aminoácidos sejam ligados por meio de ligação (ões) amida, e inclui peptídeos publicamente conhecidos, novos peptídeos e peptídeos modificados. Os vulgarmente referidos como proteína estão incluídos nos peptídeos da presente invenção. Também na presente invenção, o "polipeptídeo" está incluído nos peptídeos. A cadeia peptídica utilizada para o processo da presente invenção pode ser a proteína nativa ou a cadeia peptídica obtida por métodos tais como a biossíntese, a síntese química ou a síntese livre de células.

Na presente invenção, o "peptídeo modificado" inclui variantes naturais dos peptídeos, peptídeos modificados pós-translacionais, ou compostos artificialmente modificados. Tal modificação inclui, por exemplo, alquilação, acilação (por exemplo, acetilação), amidação (por exemplo, amidação do terminal C do peptídeo), carboxilação, formação de éster, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, fosforilação, hidroxilação, ligação de componente rotulado, etc., em um ou mais resíduos de aminoácidos no peptídeo.

Na presente invenção, o "aminoácido" é utilizado no seu contexto mais amplo, e inclui não apenas aminoácidos nativos, tais como serina (Ser), asparagina (Asn), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile) , alanina (Ala), tirosina (Tyr), glicina (Gly), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), glutamina (Gln), treonina ( Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp) e prolina (Pro), mas também aminoácidos não-nativos, tais como variantes e derivados de aminoácidos. Os técnicos no assunto entenderão que os aminoácidos na presente invenção incluem, por exemplo, L-aminoácidos; D- aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados, tais como variantes e derivados de aminoácidos; aminoácidos tais como norleucina, β-alanina e ornitina que não são materiais constitutivos para as proteínas in vivo; e os compostos sintetizados quimicamente para ter propriedades de aminoácidos conhecidas dos técnicos no assunto, etc., tendo em consideração essa definição ampla.

Na presente invenção, a cadeia peptídica a ser tioesterificada não é particularmente limitada, desde que a cadeia peptídica contenha o resíduo de cisteína. Por exemplo, uma origem, um método de síntese, um tamanho e formas semelhantes de cadeia peptídica não são particularmente limitados. A cadeia peptídica podem também ter a modificação e um grupo de proteção.

O número de resíduos de cisteína contidos na cadeia peptídica utilizada na presente invenção não é particularmente limitado, e a cadeia peptídica é clivada pela segmentação dos resíduos de cisteína. Portanto, é necessário conceber um esqueleto básico da proteína finalmente sintetizada dependendo dos sítios tendo o resíduo de cisteína, e os técnicos no assunto podem facilmente conceber tal esqueleto básico. Os resíduos de cisteína que não sejam os resíduos de cisteína desejados podem ser protegidos com grupos protetores com antecedência de modo que a tioesterificação seja realizada nas posições de apenas os resíduos de cisteína desejados e os resíduos restantes de cisteína que não são afetados pela reação na cadeia peptídica contendo os resíduos múltiplos de cisteína. Os exemplos de um tal grupo protetor incluem um grupo Acm.

A cadeia peptídica utilizada na presente invenção pode ter um grupo de proteção solúvel em gordura no lado N- terminal. Preferivelmente, os grupos de proteção podem incluir, entre outros, os grupos acila tais como um grupo acetila(Ac),grupos contendo carbonila tais como um grupo t- butiloxicarbonila (Boc), um grupo 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) e uma grupo aliloxicarbonila (Alloc), e um grupo alila e um grupo benzila.

A cadeia de péptido utilizado para o processo da presente invenção pode ser uma proteína nativa ou a cadeia de péptido obtido por métodos tais como a biossíntese, a síntese química ou a síntese livre de células, e é de preferência uma proteína recombinante expressa em uma célula bacteriana ou uma célula. A proteína recombinante pode ser aquelas que possuem a mesma sequência peptídica como na proteína nativa ou aquelas possuindo a sequência peptídica tendo a modificação, tal como uma marca para a mutação ou purificação, desde que a proteína seja expressada artificialmente na célula bacteriana ou célula.

A proteína recombinante utilizada na presente invenção pode ser preparada pelo método conhecido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, a proteína recombinante pode ser expressada através da introdução de um gene objetivo em um vector recombinante. O vetor recombinante utilizado na presente invenção pode ser aquele capaz de transformar uma célula hospedeira, e um plasmídeo para a Escherichia coli, um plasmídeo para Bacillus subtilis, um plasmídeo para leveduras, e vetores de vírus de animais tais como retrovírus, vírus vaccinia e baculovirus são utilizados. Esses preferivelmente possuem uma sequência reguladora tal como um promotor capaz de expressar a proteína de forma adequada na célula hospedeira. Além disso, a célula hospedeira pode ser aquelas capazes de expressar um gene estranho no vetor recombinante, e geralmente Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, células de insetos e células animais são utilizadas.

O método normalmente utilizado, em geral, pode ser utilizado como o método de transfecção do vector recombinante na célula hospedeira. Por exemplo, um método de cloreto de cálcio e um método de eletroporação, no caso da Escherichia coli e um método de cloreto de lítio e o método de eletroporação, no caso da levedura podem ser utilizados. A transformação da célula animal pode ser realizada utilizando um método físico, tal como o método de eletroporação, um método químico, tal como um método de lipossoma e um método de fosfato de cálcio, ou um vector viral, tal como retrovírus. Uma condição de cultura da célula hospedeira que é um transformante pode ser selecionada tendo em consideração as propriedades nutricionais e fisiológicas da célula hospedeira.

É preferível que o peptídeo utilizado na presente invenção seja purificado. O peptídeo pode ser purificado por um método de purificação comum. Por exemplo, no caso de uma proteína recombinante, uma célula bacteriana ou uma célula que expressa a proteína recombinante utilizada na presente invenção é cultivada, subsequentemente, a célula bacteriana ou a célula é colhida por um método conhecido, em seguida, suspensa em uma solução tampão apropriada , rompida por sonicação, lisozima e/ou congelamento e descongelamento, e em seguida uma solução de extrato bruto de um peptídeo é preparada por centrifugação ou filtração. Um agente de desnaturação de proteína, tal como ureia e cloridrato de guanidina, e um agente tensoativo tal como Triton X-100 TM podem estar contidos na solução tampão. O peptídeo contido na solução de extrato ou no sobrenadante da cultura obtido conforme acima pode ser purificado pelo método de purificação conhecido. Por exemplo, o peptídeo pode ser isolado e purificado por seleção adequada e combinação de cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, filtro, ultrafiltração, filtração em gel, electroforese, adição de sal, diálise, e similares.

Uma marca para a purificação pode ser incorporada no vetor de expressão, a fim de tornar a purificação da proteína recombinante fácil. Os exemplos da marca para a purificação incluem, por exemplo, uma marca (etiqueta) His, uma marca GST, uma marca Myc, uma marca FLAG, e uma proteína de ligação de maltose (MBP). Na presente invenção, o lado N-terminal da Cys disposta dentro da cadeia peptídica é tioesterificada, assim, a marca para a purificação é adicionada ao lado C-terminal do peptídeo e o peptídeo após a purificação é tioesterificado, através do qual o lado C-terminal da Cys na cadeia peptídica que inclui a marca é cortada e o tio éster de peptídeo pode ser obtido de forma eficiente. Através da disposição da Cys na posição desejada na cadeia peptídica, é também possível utilizar o processo da presente invenção para a remoção da marca (etiqueta) no lado C-terminal.

Portanto, o processo para a remoção da marca para a purificação adicionada ao C-terminal da proteína recombinante utilizando o processo para a produção do tioéster de peptídeo da presente invenção também está incluído na presente invenção.

Na presente invenção, o "tioéster de peptídeo" (doravante à vezes também descrito simplesmente como o "tioéster") refere-se ao peptídeo que possui uma porção carboxitioéster (-C=O-SR) no C-terminal. O tioéster de peptídeo utilizado na presente invenção não é particularmente limitado, desde que o tioéster possa causar a reação de troca com outros grupos tiol. O grupo R inclui, por exemplo, os grupos exemplificado em R4 abaixo.

No processo da presente invenção, em primeiro lugar (a) uma etapa de reação de um composto A com um grupo tiol de um resíduo de cisteína em uma cadeia de peptídeo possuindo o resíduo de cisteína a fim de produzir o primeiro intermediário é realizada.

Na presente invenção, o composto A é representado pela seguinte fórmula (I). [Fórmula Química 10]

Na fórmula, X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e de preferência o átomo de enxofre.

R1 e R2 não são particularmente limitados desde que eles tenham menor nucleofilicidade do que um átomo ou um grupo atômico a ser substituído e têm uma função de eliminação em uma condição de reação da etapa (a) a seguir como grupos retirantes, e é preferível que R1 e R2 sejam grupos retirantes diferentes entre si. Os exemplos de R1 e R2 incluem especificamente átomos de halogêneo, grupos -O- alquila substituídos ou insubstituídos, grupos -O-alquenila substituídos ou insubstituídos, grupos -O-alquinila substituídos ou insubstituídos, grupos -O-arila substituídos ou insubstituídos, grupos- O-heteroarila substituídos ou insubstituídos, grupos -S-alquila substituídos ou insubstituídos, grupos -S-alquenila substituídos ou insubstituídos, grupos -S-alquinila substituídos ou insubstituídos, grupos -S-arila substituídos ou insubstituídos, grupos -S-heteroarila substituídos ou insubstituídos. Mais preferivelmente, os exemplos de R1 e R2 incluem combinações de R1 que é o grupo retirante selecionado do grupo que consiste em grupos arila -O-C6-10 substituídos ou insubstituídos, grupos alquila -S- C1-8 substituídos ou insubstituídos e R2 que é o grupo retirante selecionado do grupo consistindo em átomos de halogêneo, grupos alquila -S-C1-8 substituídos ou insubstituídos e grupos arila -S-C6-10 substituídos ou insubstituídos.

Na presente invenção, o "grupo alquila" é um grupo monovalente derivado de hidrocarboneto alifático por remoção de qualquer um átomo de hidrogênio, e possui um subconjunto de hidrocarbila ou hidrocarboneto contendo átomos de hidrogênio e carbono. O grupo alquila inclui uma estrutura de cadeia linear ou de cadeia ramificada. O grupo alquila da presente invenção inclui de preferência os grupos alquila tendo 1 a 8 átomos de carbono. "Grupo alquila C1-8" indica que o grupo alquila tendo 1 a 8 átomos de carbono, e exemplos específicos desses incluem metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila e octila.

Na presente invenção, o "grupo alquenila" é um grupo monovalente tendo pelo menos uma ligação dupla. As formas geométricas das ligações duplas podem tomar configurações entgegen (E), zusammen (Z), cis ou trans, dependendo da configuração das ligações duplas e dos substituintes. O grupo alquenila inclui a forma de cadeia linear ou de cadeia ramificada. O grupo alquenila da presente invenção inclui de preferência os grupos alquenila tendo 2 a 8 átomos de carbono. "Grupo alquenila C2-8" indica o grupo alquenila tendo de 2 a 8 átomos de carbono, e exemplos específicos desse incluem grupos vinila, alila, propenila, butenila, pentenila, hexenila, heptenila e octenila.

Na presente invenção, o "grupo alcinilo" é um grupo monovalente tendo pelo menos uma ligação tripla. O grupo alquinila inclui grupos de cadeia linear ou alquinila de cadeia ramificada. O grupo alquinila da presente invenção inclui de preferência os grupos alquinila tendo 2 a 8 átomos de carbono. "Grupo alquinila C2-8" indica o grupo alquinila tendo 2 a 8 átomos de carbono, e exemplos específicos desse incluem grupos etinila, 1-propinila, 2- propinila, butinila, pentinila, hexinila, heptinila, octinila.

Na presente invenção, o "grupo arila" significa um grupo de anel aromático de hidrocarboneto. O grupo arila da presente invenção inclui de preferência os grupos arila tendo 6 a 10 átomos de carbono. "Grupo arila C6-10" indica o grupo arila tendo 6 a 10 átomos de carbono, e exemplos específicos desses incluem os grupos fenila, 1-naftila e 2- naftila.

Na presente invenção, o "grupo heteroarila" significa um grupo monovalente ou bivalente derivado de um anel heteroarila através da remoção de um ou dois átomos de hidrogênio, em qualquer posição. Na presente invenção, o "anel heteroarila" significa um anel aromático possuindo um ou vários heteroátomos nos átomos que compõem o anel, e possui de preferência anéis de 5-9 membros. O anel pode ser um grupo heteroarila monocíclico ou bicíclico obtido por fusão com um anel benzeno ou um anel heteroarila monocíclico. Os exemplos específicos desses incluem os grupos furanila, tiofenila, pirrolila, benzofuranila, benzotiofenila, indolila, piridila, quinolila. Tipos, números e as posições substituídas de substituintes que os grupos retirantes acima mencionados não são particularmente limitados, e os exemplos dos substituintes incluem os grupos alquila, alquenila, alcóxi, arila, formila, carbonila, carboxila, alquilcarbonila, alcoxicarbonila, halogêneo

O composto A da presente invenção inclui, especificamente, os seguintes.

Além disso, o composto acima descrito [Fórmula Química 15]

ou [Fórmula Química 16]

5 pode ser reagido com MPAA ((4-carboximetil)tiofenol) a fim de produzir o seguinte reagent de tionoformiato, que pode ser também utilizado: [Fórmula Química 17]

10 e [Fórmula Química 18]

O primeiro intermediário no qual o grupo -C(=X)-R1 está ligado ao grupo SH no resíduo de cisteína, conforme mostrado na figura a seguir, pode ser obtido por reação do composto A da presente invenção com o resíduo de cisteína no peptídeo. [Fórmula Química 19]

[0052] Na presente invenção, a etapa (a) é preferencialmente realizada em uma condição ácida, particularmente a um pH de 3 a 5. A reação é preferencialmente realizada em um solvente misto de solução tampão e acetonitrila de 0 a 50 °C, de preferência 15 a 25 °C durante cerca de 0,1 a 3 horas, de preferência 10 minutos a uma hora, mas sem limitação. Então, na presente invenção, a etapa (b) é realizada, na qual o fragmento de peptídeo no lado N-terminal mais próximo do lado do N-terminal do que a ligação peptídica clivada é obtido como o segundo intermediário através da reação do composto B com o primeiro intermediário no solvente orgânico para a adição do grupo -NH-C(=Y)NHR3 para ao grupo carboxila formando a ligação peptídica com o aminoácido adjacente ao lado N-terminal do resíduo de cisteína, e pela clivagem da ligação peptídica. Na presente invenção, o composto B é representado pela seguinte fórmula (II). [Fórmula Química 20]

Na fórmula, Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH, e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila, ou um grupo alcoxicarbonila.

Na presente invenção, o "grupo acila" significa um grupo obtido por remoção atômica de um grupo OH a partir de um grupo carboxila de um ácido carboxílico. O grupo acila do presente invento inclui de preferência os grupos acila tendo 1 a 4 átomos de carbono, e exemplos específicos desses incluem os grupos acetila, propionila e butiroila.

Na presente invenção, o "grupo alcóxi" significa um grupo oxi ligado ao "grupo alquila." O grupo alcóxi da presente invenção pode ser de cadeia linear ou de cadeia ramificada. O grupo alcóxi da presente invenção inclui de preferência os grupos alcóxi de cadeia linear tendo 1 a 14 átomos de carbono e os grupos alcóxi de cadeia ramificada tendo de 3 a 14 átomos de carbono. Especificamente, por exemplo, os grupos metóxi, etóxi, n-propilóxi, isopropóxi, n-butóxi, 2-metil-2-propilóxi, n-pentilóxi, n-hexilóxi podem ser incluídos.

Além disso, "grupo alcoxicarbonila C2-n" significa o grupo carbonila tendo um grupo alcóxi C1-(n-1). O grupo alcoxicarbonila da presente invenção inclui de preferência os grupos alcoxicarbonila tendo 2 a 15 átomos de carbono. Especificamente, por exemplo, os grupos metoxicarbonila, etoxicarbonila, n-propiloxicarbonila, isopropoxicarbonila, n-butoxicarbonila, 2-metil-2-propiloxicarbonila, n- pentiloxicarbonila, e n-hexiloxicarbonila podem ser incluídos. O grupo acila inclui de preferência o grupo acetila. Além disso, o grupo alcoxicarbonila preferivelmente inclui um grupo (Boc) terc-butoxicarbonila. O composto B da presente invenção inclui, mais especificamente, os seguintes. [Fórmula Química 21]

[Fórmula Química 22]

[Fórmula Química 23]

[Fórmula Química 24]

Na presente invenção, a etapa (b) é preferencialmente realizada na presença do solvente orgânico. É preferível que o solvente orgânico seja de alta solubilidade e baixa nucleofilicidade. Tal solvente orgânico pode incluir, por exemplo, DMSO, DMF e dioxano. A reação é preferencialmente realizada de 0 a 50 °C, preferivelmente de 15 a 25 °C durante cerca de 1 a 24 horas, preferivelmente de 5 a 10 horas, mas sem quaisquer limitações. A cadeia peptídica é clivada no lado N-terminal do resíduo de cisteína, conforme mostrado na figura a seguir, adicionando grupo -NH-C(=Y)NHR3 ao o grupo carboxila formando a ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e o amino ácido adjacente ao lado N-terminal do resíduo de cisteína. [Fórmula Química 25]

[0062] Quando o peptídeo possui o grupo amino na sua cadeia lateral, um grupo de proteção solúvel em gordura pode ser introduzido ao grupo amino na cadeia lateral antes de realizar a etapa (b) da presente invenção. O grupo de proteção solúvel em gordura pode incluir, entre outros, os grupos de proteção, tais como grupos contendo carbonila tais como um grupo 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), um grupo t-butiloxicarbonila (Boc) e um grupo aliloxicarbonila (Alloc), grupos acila tais como um grupo (Ac) acetila, e um grupo alila e um grupo benzila.

A fim de introduzir o grupo de proteção solúvel em gordura, por exemplo, o grupo Fmoc pode ser introduzido por adição de carbonato de 9-fluorenilmetil-N-succinimidila e hidrogenocarbonato de sódio e reação desses. A reação é preferencialmente realizada de 0 a 50 °C, preferivelmente à temperatura ambiente por cerca de 1 a 5 horas, mas sem quaisquer limitações. O fragmento peptídico no lado N-terminal mais próximo ao lado N-terminal do que o sítio clivado da cadeia peptídica clivada pode ser obtido como o segundo intermediário com a seguinte fórmula (1) na etapa (b). [Fórmula Química 26]

O processo para a produção do tio éster de peptídeo da presente invenção inclui ainda a etapa (c) de tioesterificação de um terminal C do segundo intermediário por reação de tiol com o segundo intermediário a fim de trocar o grupo -NH-C(=Y)NHR3 na posição C-terminal para o grupo tiol.

O segundo intermediário utilizado para a etapa (c) pode ser isolado ou não necessita isolamento após a etapa (b). Em modalidades preferíveis, o tiol representado pela seguinte fórmula (III): R4-SH (Fórmula III) é utilizado na etapa (c). R4 não é particularmente limitado contanto que não iniba a reação de troca de tiol e se torne o grupo retirante em uma reação de substituição em carbono carbonílico. Preferivelmente, R4 é qualquer grupo selecionado a partir de grupos benzila substituídos ou insubstituídos, grupos arila substituídos ou insubstituídos e grupos alquila substituídos ou insubstituídos. Mais preferivelmente, R4 é qualquer grupo selecionado a partir de grupos benzila substituídos ou insubstituídos, grupos arila C6-10 substituídos ou insubstituídos ou grupos alquila C1-8 substituídos ou insubstituídos. Mais especificamente, R4 pode ser selecionado a partir de grupos retirantes do tipo benzila tais como benzilmercaptano, grupos retirantes tipo arila tais como tiofenol e 4-(carboximetil)tiofenol, grupos retirantes tipo alquila tais como um grupo de ácido 2-mercaptoetanossulfônico e amida de 3-mercaptopropionato, etc . O tipo, o número e a posição dos substituintes substituídos que esses grupos retirantes possuem não são particularmente limitados. [0067] O segundo intermediário é completamente convertido no tioéster conforme a figura a seguir através da realização da etapa (c).

O tioéster de peptídeo obtido conforme o exemplo acima pode ser ligado a um peptídeo (ou um peptídeo modificado), que contém um resíduo de aminoácido tendo o grupo -SH no terminal N entre os peptídeos ou os peptídeos modificados utilizando o método de ligadura. Portanto, a presente invenção proporciona também um processo para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma etapa de ligação do tio éster de peptídeo obtido pelo processo da presente invenção na cadeia peptídica possuindo cisteína no terminal N através do método de ligadura.

Também é possível utilizar o segundo intermediário obtido na etapa (b) no lugar do tioéster de peptídeo acima para o método de ligadura.

Na presente invenção, o “método de ligadura" inclui não apenas o método de ligação química nativa (método NCL) descrito na literatura patentária 1, mas também nos casos de aplicação do método de ligadura química nativa para os peptídeos que contêm o aminoácido não nativo e derivado de aminoácido (por exemplo, derivado de treonina A, metionina protegida, aminoácidos adicionados com cadeia de açúcar, etc.). O peptídeo possuindo a ligação amida nativa (ligação peptídica) no sítio da ligadura pode ser produzido pelo método de ligadura.

A ligadura utilizando o método de ligadura pode ser realizada em todos os casos entre o peptídeo e o peptídeo, entre o peptídeo e o peptídeo modificado, e entre o peptídeo modificado e o peptídeo modificado.

Os termos aqui utilizados são utilizados para descrever aspectos particulares e não se destinam a limitar a presente invenção.

O termo "compreendendo" (também “contendo" e "incluindo") aqui utilizado pretende que os aspectos descritos (membros, etapas, elementos e números, etc.) estejam presentes, exceto os casos entendidos como obviamente diferentes em contexto, e não se excluem os aspectos (membros, etapas, elementos e números, etc.) outros que não os presentes. Salvo definição diferente, todos os termos (incluindo os termos técnicos e termos científicos) aqui utilizados têm os mesmos significados que os compreendido amplamente pelos técnicos no assunto ao qual pertence a presente invenção. Os termos aqui utilizados devem ser interpretados como tendo os significados coerentes para os significados neste relatório descritivo e o campo técnico relacionado a a menos que uma definição diferente seja de outra forma manifesta, e não devem ser interpretados em significados idealizados ou indevidamente formais. Os aspectos da presente invenção são por vezes descritos com referência à visão esquemática. Quando descrito na visão esquemática, a modalidade é, por vezes expressada de uma forma exagerada, a fim de descrevê-la claramente. Os termos, tais como primeiro e segundo são utilizados para expressar vários elementos, mas entende-se que esses elementos não devam ser limitados a esses termos. Esses termos são utilizados apenas para distinguir um elemento do outro elemento, e sem se afastar do escopo da presente invenção, é possível que o primeiro elemento seja escrito como o segundo elemento, como também o segundo elemento seja escrito como o primeiro elemento. A presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, a presente invenção pode ser incorporada por vários aspectos, e não deve ser interpretada de forma a limitar aos Exemplos aqui descritos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Introdução do grupo tionoformiato (Síntese de tionoformiato de fenila de MPAA) [Fórmula Química 28]

MPAA ((4-carboximetil)tiofenol) (98 mg, 0,583) e clorotionoformiato de fenila (103 μL, 0,76 mmol) foram dissolvidos em diclorometano (400 μL), e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. Após uma hora, a solução reacional foi diluída com 2,0 mL de clorofórmio, 1,0 mL de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio saturado foi adicionado, e a mistura foi extraída e lavada com clorofórmio. Uma camada de clorofórmio foi lavada com solução salina saturada, secada em sulfato de magnésio e, em seguida concentrada em pressão reduzida para proporcionar um resíduo amarelo claro em forma de xarope. Essa foi então utilizada como um reagente de tionoformiato (MPAA fenil tionoformiato) (MW: 305,3, MS: sem dados disponíveis). (Introdução do grupo de tionoformiato por reagente de MPAA fenil tionoformiato)

Um peptídeo (Ac-Val Try Ala Xaa Cys Gly-OH) (SEQ ID n°: 1), Xaa=Lys (SEQ ID n°: 2), Ser (SEQ ID n°: 3), Asp (SEQ ID n°: 4), Ala (SEQ ID n°: 5), Val (SEQ ID n°: 6), em bruto (mistura de Lys, Ser, Asp, Ala e Val), 6 mg) foi dissolvido em uma solução tampão a pH 5,5 (1,0 mL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e, em seguida, uma quantidade total de MPAA fenil tionoformiato (15 μL) dissolvida em acetonitrila (230 uL) foi adicionada. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC para se obter um composto de objetivo. A reação foi quantitativamente realizada como um resultado de HPLC. (Xaa=Lys, ESIMS calc [M+H]+ 818,3, encontrado [M+H]+ 818,4) (Xaa=Ser, ESIMS calc [M+H]+ 777,3, encontrado [M+H]+ 777,3) (Xaa=Asp, ESIMS calc [M+H]+ 805,3, encontrado [M+H]+ 805,3) (Xaa=Ala, ESIMS calc [M+H]+ 761,3, encontrado [M+H]+ 761,3) (Xaa=Val, ESIMS calc [M+H]+ 789,3, encontrado [M+H]+ - --) [0080] Um peptídeo (Ac-Val Try Ala Xaa Cys Gly-OH) (SEQ ID n°: 1), Xaa=Ser(SEQ ID n°: 3), Phe (SEQ ID n°: 8),

Leu (SEQ ID n°: 7), bruto (mistura de Ser, Fen e Leu), 10 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (2,0 mL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e, em seguida, MPAA fenil tionoformiato (5 μL) dissolvido em acetonitrila (700 uL) foi adicionado. Após 1,5 hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC para se obter um composto de objetivo. A reação foi quantitativa como um resultado de HPLC. (Xaa=Ser, ESIMS calc [M+H]+ 777,3, encontrado [M+H]+ 777,3) (Xaa=Leu, ESIMS calc [M+H]+ 803,4, encontrado [M+H]+ 803,3) (Xaa=Phe, ESIMS calc [M+H]+ 837,4, encontrado [M+H]+ 837,3) O grupo tioformiato foi introduzido no grupo -SH da cisteína, independentemente do tipo de aminoácido adjacente ao lado N-terminal da cisteína.

Exemplo 2. Reação de N-acetilguanidinilação [Fórmula Química 29]

(Caso de Xaa=Ala) Ac-Val Tyr Ala Ala Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 9) (0,2 mg, 0,28 μmol) foi dissolvido em 250 mM de solução de N-acetilguanidina/DMSO (260 μL). Após duas horas, um composto foi precipitado com e lavado com Et2O. O composto objeto foi purificado por HPLC a fim de obter o N- acetilguanidido objeto (Ac-Val Tyr Ala Ala-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 10) (rendimento: 80%, calculado a partir de intensidade de área de HPLC). (ESIMS calc [M+H]+ 548,3, encontrado [M+H]+ 548,4) (caso de Xaa=Leu ou Phe)

Uma mistura de Ac-Val Tyr Ala Leu Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 11) (0,1 mg, 0,12 μmol) e Ac-Val Tyr Ala Phe Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 12) (0,1 mg, 0,12 μmol) foi dissolvida em 250 mM de solução de N-acetilguanidina/DMSO (100 μL). Após 4,5 horas, compostos foram precipitados com e lavados com Et2O. Os compostos objeto foram purificados por HPLC a fim de obter o N-acetilguanidido objeto (Ac-Val Tyr Ala Leu-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 13) e Ac-Val Tyr Ala Phe-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 14) (rendimento: 80%, calculado a partir de intensidade de área de HPLC). (Xaa=Leu, ESIMS calc [M+H]+ 590,3, encontrado [M+H]+ 590,3) (Xaa=Phe, ESIMS calc [M+H]+ 624,3, encontrado [M+H]+ 624,3) (Caso de Xaa=Ser) Ac-Val Tyr Ala Ser Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 15) (0,2 mg, 0,26 μmol) foi dissolvido em 250 mM de solução de N-acetilguanidina/DMSO (100 μL). Após 3,5 horas, um composto foi precipitado com e lavado com Et2O. O composto objeto foi purificado por HPLC a fim de obter o N- acetilguanidido objeto (Ac-Val Tyr Ala Ser-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 16) (rendimento: 70%, a partir de intensidade de área de HPLC). (Caso de Xaa=Lys)

Um peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Lys Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 17) (0,1 mg) foi dissolvido em DMSO (30 μL) contendo Boc2O (0,3 mg) e trietilamina (0,14 μL). Após 1,5 hora, a solução reacional foi precipitada com e lavada com Et2O. O resíduo resultante foi dissolvido em 250 mM de 5 solução de N-acetilguanidina/DMSO (100 μL). Após 2,5 horas, O composto objeto foi purificado por HPLC a fim de obter o N-acetilguanidido objeto (Ac-Val Tyr Ala Lys(Boc)- NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 18) (rendimento: 70%, calculado a partir de intensidade de área de HPLC). 10 Identificou-se que o resíduo de cisteína ao qual o tionoformiato havia sido adicionado possuía a reatividade com guanidina para a ligação peptídica no lado N-terminal, independentemente do tipo de aminoácido adjacente ao lado N-terminal da cisteína. 15 Exemplo 3. Tioesterificação de peptídeo 24 aa [Fórmula Química 30]

Um peptídeo (H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 19), bruto (sem purificação), em 5 uma quantidade apropriada (estimada de cerca de 1 mg), foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (300 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e, em seguida, a quantidade total de MPAA fenil tionoformiato (1 μL) dissolvido em acetonitrila (100 μL) foi adicionada. Após 50 minutos, a 10 solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de se obter um composto objeto (H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 20)). Cys na posição 3 foi previamente protegida com Acm para não ser afetada com o reagente de tionoformiato. (ESIMS calc [M+2H]2+ 1553,8, [M+3H]3+ 1035,8, encontrado [M+2H]2+ 1552,9, [M+3H]3+ 1035,7) O peptídeo (H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly-OH (SEQ ID n°: 20), ca. 0,3 mg) foi dissolvido em DMSO (20 μL) contendo Boc2O (0,4 mg) e trietilamina (0,03 μL). Após 1,5 hora, a solução reacional foi precipitada com e lavada com Et2O. O resíduo resultante foi dissolvido em 250 mM de solução de N- acetilguanidina/DMSO (50 μL). Após 2,5 horas, O composto objeto foi purificado por HPLC a fim de obter o N- acetilguanidido objeto (BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 21)). (ESIMS calc [M+2H]2+ 1546,8, [M+3H]3+ 1031,5, encontrado [M+2H]2+ 1547,0, [M+3H]3+ 1031,4) O peptídeo 24 aa (BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-NHC(NH)NHAc (SEQ ID n°: 21), ca. 0,1 mg>) foi dissolvido em uma solução tampão a pH 7,05 (0,2 M de ácido fosfórico, 6 M de guanidina, 50 μL) contendo MESNa (sódio 2-sulfaniletanossulfonato) (1 mg, 2% v/v). Após 3,5 horas, o composto objeto foi purificado por HPLC a fim de obter tioéster (BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly-SCH2CH2SO3 (SEQ ID n°: 22)) (rendimento desconhecido, cerca de 70% em HPLC). (ESIMS calc [M+2H]2+ 1567,3, encontrado [M+2H]2+ 1566,8)

Exemplo 4. Introdução do grupo tionoformiato por reagente de clorotionoformiato

O peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Ala Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 5), 6 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (961 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e fenil clorotionoformiato (6,5 μL ) dissolvido em acetonitrila (320 μL ) foi adicionado. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de obter um peptídeo adicionado com tionoformiato objeto (SEQ ID n°: 9) (6,4 mg, 88%). (Xaa=Ala, ESIMS calc [M+H]+ 761,3, encontrado [M+H]+ 761,3)

O peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Leu Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 7), 3.4 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (510 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e fenil clorotionoformiato (3,5 μL ) dissolvido em acetonitrila (170 μL ) foi adicionado. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de obter um peptídeo adicionado com tionoformiato objeto (SEQ ID n°: 11) (3,8 mg, 92%). (Xaa=Leu, ESIMS calc [M+H]+ 803,4, encontrado [M+H]+ 803,3)

O peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Phe Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 8), 5,1 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (729 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e fenil clorotionoformiato (5,0 μL ) dissolvido em acetonitrila (243 μL ) foi adicionado. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de obter um peptídeo adicionado com tionoformiato objeto (SEQ ID n°: 12) (5,1 mg, 84%). (ESIMS calc [M+H]+ 837,4, encontrado [M+H]+ 837,3)

O peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Ser Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 3), 4,9 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (766 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e fenil clorotionoformiato (5,2 μL ) dissolvido em acetonitrila (265 μL) foi adicionado. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de obter um peptídeo adicionado com tionoformiato objeto (SEQ ID n°: 15) (5,5 mg, 92%). (ESIMS calc [M+H]+ 777,3, encontrado [M+H]+ 777,3)

O peptídeo (Ac-Val Tyr Ala Lys Cys Gly-OH (SEQ ID n°: 2), 5,5 mg) foi dissolvido na solução tampão a pH 5,0 (810 μL de 0,2 M de Na2HPO4 e 6 M de Gn-HCl), e fenil clorotionoformiato (5,5 μL ) dissolvido em acetonitrila (270 μL) foi adicionado. Após uma hora, a solução reacional foi lavada com Et2O. A purificação foi realizada por HPLC a fim de obter um peptídeo adicionado com tionoformiato objeto (SEQ ID n°: 17) (6,1 mg, 94%). (Xaa=Leu, ESIMS calc [M+H]+ 818,3, encontrado [M+H]+ 818,4)

Utilizando o reagente de clorotionoformiato, a cadeia peptídica adicionada com tionoformiato como o obtido no Exemplo 1 foi obtida. Assim, verificou-se que o tioéster de peptídeo pode também ser obtido a partir da cadeia peptídica na qual o grupo tionoformiato foi introduzido pelo reagente de clorotionoformiato através da realização da adição de N-acetilguanidido e em seguida a tioesterificação da mesma maneira como na cadeia peptídica na qual o grupo tionoformiato foi introduzido nos Exemplos 1 e 3 acima.

Aplicabilidade industrial

No processo da presente invenção, a tioesterificação é possível na cadeia peptídica que não possua um derivado de aminoácido não-nativo, o ligante ou a estrutura tridimensional particular, etc., necessários para o método de tioesterificação convencional, e é possível tioesterificar facilmente mesmo no fragmento polipeptídico de cadeia longa obtido pela biossíntese, etc. Portanto, o processo de tioesterificação da presente invenção pode ser geralmente utilizado para a síntese proteica.

Claims

1. Processo para a produção de um tioéster de peptídeo caracterizado por compreender as seguintes etapas (a) a (c): (a) uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína para a eliminação de R2 em uma cadeia de peptídeo tendo o resíduo de cisteína: [Fórmula Química 1]

em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 2]

em que Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila; e (c) uma etapa de tioesterificação de um terminal C do segundo intermediário por reação de tiol com o segundo intermediário a fim de trocar o grupo -NH-C(=Y)NHR3 na posição C-terminal para o grupo tiol.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é o átomo de enxofre.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R1 é um grupo arila -O-C6.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R2 é um átomo de halogênio, ou um grupo arila -S-C6-10 substituído ou insubstituído.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Y é um grupo NH.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que R3 é um grupo acetila.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o tiol na etapa (c) é tiol representado pela seguinte fórmula (III): R4-SH (Fórmula III) em que R4 é qualquer um selecionado a partir de um grupo benzila substituído ou insubstituído, um grupo arila substituído ou insubstituído, e um grupo alquila substituído ou insubstituído.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cadeia peptídica é uma proteína recombinante.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia peptídica é a proteína recombinante compreendendo uma marca para a purificação.

10. Processo para a produção de um polipeptídeo caracterizado por compreender uma etapa de ligação de um tioéster de peptídeo a uma cadeia peptídica tendo cisteína em um N-terminal através de um método de ligadura, o referido processo compreendendo como etapa inicial a produção de um tioéster de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Processo para a produção de um segundo intermediário utilizado para o processo para a produção do tioéster de peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender as seguintes etapas (a) ou (b): (a) uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína para a eliminação de R2 em uma cadeia de peptídeo tendo o resíduo de cisteína: [Fórmula Química 3]

em que X é um átomo de enxofre ou um átomo de oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; ou (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 4]

em que Y é um átomo de oxigênio, um átomo de enxofre ou um grupo NH e R3 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alcoxicarbonila.

12. Processo para a remoção de uma marca para a purificação adicionada a um lado terminal C de uma proteína recombinante, caracterizado por compreender as seguintes etapas de (a) a (c): (a) uma etapa de produção de um primeiro intermediário por reação de um composto A representado pela seguinte fórmula (I) com um grupo tiol de um resíduo de cisteína para a eliminação de R2 em uma proteína recombinante compreendendo uma marca para a purificação em seu terminal C:

oxigênio, e R1 e R2 são grupos retirantes; (b) uma etapa de reação de um composto B representado pela seguinte fórmula (II) com o referido primeiro intermediário em um solvente orgânico para adicionar um grupo -NH-C(=Y)NHR3 a um grupo carboxila formando uma ligação peptídica entre o resíduo de cisteína e um aminoácido adjacente a um lado N-terminal do referido resíduo de cisteína, e clivagem da referida ligação peptídica, obtendo-se assim um fragmento de peptídeo a partir do lado N-terminal mais próximo do lado N-terminal do que a ligação peptídica clivada como um segundo intermediário: [Fórmula Química 6]