BRPI1106308A2 - composição imunogênica de leishmania (leishmania), método, kit imunodiagnóstico e vacina para leishmaniose - Google Patents

Abstract

composição imunogênica de leishmania (leishmania), método, kit imunodiagnóstico e vacina para leishmaniose. a presente invenção descreve uma composição que compreende proteínas isoladas do parasita leishmania (leishmania) chagasi syn. l. (l.) infantum para aplicação no diagnóstico sorológico dos casos de leishmaniose visceral canina (lvc) assintomática e / ou sintomática, além de sua aplicação como antígenos vacinais contra as leishmanioses. estas proteínas foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral (lv) assintomática e / ou sintomática, indicando que as mesmas são expressas pelo parasita durante a infecção ativa. sua identificação foi realizada através de técnica de eletroforese bidimensional realizada com os dois estágios do parasita (promastigota e amastigota) causador da lv no brasil, l. chagasi, seguido de experimentos de western-blot empregando amostras de soros de cães com lv assintomática e / ou sintomática.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA DE Leishmania (Leishmania), MÉTODO, KIT IMUNODIAGNÓSTICO E VACINA PARA LEISHMANIOSE” A presente invenção descreve uma composição que compreende proteínas identificadas no parasita Leishmania (Leishmania) chagasi syn. L. (L.) infantum para aplicação no diagnóstico sorológico dos casos de leishmaniose visceral canina (LVC) assintomática e sintomática, além de sua aplicação como antígenos vacinais contra as leishmanioses. Estas proteínas foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral (LV) assintomática e/ou sintomática, indicando que as mesmas são expressas pelo parasita durante a infecção ativa. Suas identificações foram realizadas através de técnica de eletroforese bidimensional com os dois estágios do parasita (promastigota e amastigota) causador da LV no Brasil, L. chagasi, seguido de experimentos de western-blot empregando amostras de soros de cães com LV assintomática e/ou sintomática.

As leishmanioses são doenças presentes em cerca de 88 países localizados em regiões tropicais e subtropicais do mundo (http://www.who.int). São causadas pela infecção por parasitas protozoários do gênero Leishmania. Muitas regiões do mundo são endêmicas para as diferentes espécies do parasita [E. Handman, Leishmaniasis: current status of vaccine development, Clin Microbiol Rev 14 (2001) 229-243]. Este é o caso da América do Sul, onde co-existem pelo menos oito diferentes espécies do parasita e que são capazes de causar diferentes tipos clínicos da doença no hospedeiro mamífero [A. Barrai, D. Pedral-Sampaio, G. Grimaldi Junior, H. Momen, D. McMahon-Pratt, A. Ribeiro de Jesus, R. Almeida, R. Badaro, M. Barral-Netto, E.M. Carvalho, Leishmaniasis in Bahia, Brazil: evidence that Leishmania amazonensis produces a wide spectrum of clinicai disease, Am J Trop Med Hyg 44 (1991) 536-546]. Nas Américas, as leishmanioses são classificadas em duas grandes categorias clínicas: a LV e a leishmaniose tegumentar (LT). Essa engloba as seguintes manifestações clínicas: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose muco-cutânea (LMC) e leishmaniose cutâneodifusa (LCD). A LV é a forma mais grave da doença, fatal se não tratada e é causada, principalmente, pela espécie L. chagasi. A LC e LMC são causadas, principalmente, pela espécie L. braziliensis. Deve-se, entretanto, destacar a infecção causada por L. amazonensis que pode causar as formas clínicas de LC, LCD ou LV [M. Barrai e cols, 1991; G. Grimaldi, Jr., R.B. Tesh, Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research, Clin Microbiol Rev 6 (1993) 230-250]. No Velho Mundo, a LC é causada por L. major, enquanto a LV é causada por L. infantum, nos países litorâneos do Mediterrâneo e por L. donovani em países asiáticos. Cabe ressaltar que, atualmente, as espécies L. infantum e L. chagasi são consideradas idênticas [I.L. Maurício, J.R. Stothard, M.A. Miles, The strange case of Leishmania chagasi, Parasitol Today 16 (2000) 188-189], O resultado da infecção por Leishmania é determinado, principalmente, pelas interações estabelecidas entre a cepa infectante do parasita e o sistema imune do hospedeiro. Em geral, uma imunidade protetora é associada com o desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo Th1, capaz de estimular macrófagos para destruir os parasitas fagocitados, uma vez que tais células são consideradas as principais células hospedeiras de Leishmania. Tal resposta pode ser detectada no homem pela reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH), a qual é baseada na inoculação intradérmica de extrato do parasita, seguido de reação inflamatória local. A suscetibilidade à doença, por sua vez, parece ser associada com a geração de uma resposta imune celular do tipo Th2 e, em muitos casos, pela indução de uma resposta humoral elevada frente ao parasita [L. Gradoni, An update on antileishmanial vaccine candidates and prospects for a canine Leishmania vaccine, Vet Parasitol 100 (2001) 87-103; D. McMahon-Pratt, J. Alexander, Does the Leishmania major paradigm of pathogenesis and protection hold for New World cutaneous leishmaniases or the visceral disease?, Immunol Rev 201 (2004) 206-224.]. A presença de anticorpos específicos ao parasita Leishmania, produzidos após o reconhecimento de proteínas do parasita, tem sido associada com a manifestação clínica da doença [S.A. Miles, S.M. Conrad, R.G. Alves, S.M. Jeronimo, D.M. Mosser, A role for IgG immune complexes during infection with the intracellular pathogen Leishmania, J Exp Med 201 (2005) 747-754]. Pacientes humanos, quando assintomáticos, desenvolvem uma resposta de DTH positiva associada a uma sorologia negativa frente aos antígenos parasitários, invertendo-se os parâmetros nos casos de pacientes com sintomatologia clínica evidente [J.A. Crescente, F.T. Silveira, R. Lainson, C.M. Gomes, M.D. Laurenti, C.E. Corbett, A cross-sectional study on the clinicai and immunological spectrum of human L. (L.) infantum chagasi infection in the Brazilian Amazon region, Trans Royal Soc Trop Med Hyg 103 (2009) 1250-1256]. Existem pacientes com valores intermediários de tais parâmetros, que tendem a apresentar sintomatologia intermediária da doença, sendo assim chamados de oligossintomáticos [Crescente e cols, 2009].

Para completar o complexo espectro de manifestações clínicas das leishmanioses, deve-se ressaltar que a variedade de formas da doença no hospedeiro vertebrado não se limita apenas ao homem. Nas áreas urbana e peri-urbana das médias e grandes cidades do Brasil, cães domésticos podem estar infectados por espécies viscerotrópicas, como por L. chagasi, sendo sensíveis ao desenvolvimento da LV, que ainda pode estar acompanhada de lesões cutâneas, denominando-se tal forma como de leishmaniose víscero-cutânea canina (LVC). A LVC pode ser classificada como sintomática quando há três ou mais dos seguintes sintomas clínicos são encontrados: perda de peso e pelo, adenopatia, onicogrifose, hepatomegalia, conjuntivite, dermatite espoliativa no nariz, na cauda e nas pontas da orelha; e são considerados como assintomáticos quando nenhuma manifestação clínica é evidente no animal. Cabe ainda ressaltar que essa manifestação clínica é responsável por cerca de 60 a 80% dos casos de LVC no Brasil [L. Solano-Gallego, A. Koutinas, G. Miro, L. Cardoso, M.G. Pennisi, L. Ferrer, P. Bourdeau, G. Oliva, G. Baneth. Directions for the diagnosis, clinicai staging, treatment and prevention of canine leishmaniasis, Vet Parasitol (2009)]. A doença é considerada um sério problema de saúde veterinária e humana, já que cães infectados, independentemente se sintomáticos ou assintomáticos, comportam-se como reservatórios do parasita e podem infectar seres humanos por meio dos vetores flebotomíneos transmissores [C.L. Barbiéri, Immunology of canine leishmaniasis, Parasite Immunol 28 (2006) 329-337; R. Molina, C. Ameia, J. Nieto, M. San-Andres, F. Gonzalez, J.A. Castillo, J. Lucientes, J. Alvar, Infectivity of dogs naturally infected with Leishmania infantum to colonized Phlebotomus perniciosus, Trans Royal Soc Trop Med Hyg 88 (1994) 491-493].

Neste contexto, o desenvolvimento de sistemas de diagnóstico e vacinas eficientes baseados em proteínas do parasita que sejam antigênicas e/ou imunogênicas, respectivamente, contra as diferentes formas clínicas de leishmanioses, torna-se uma tarefa complexa, porém, importante. A existência de títulos elevados de anticorpos específicos às proteínas do parasita é uma característica importante da LV humana (LVH) e da LVC, e a geração de uma elevada resposta humoral tem sido relacionada com o desenvolvimento da doença. Na LT, títulos elevados de anticorpos são encontrados nos casos sintomáticos da doença, porém, os mesmos não se apresentam homogêneos aos casos das infecções viscerotrópicas. Mesmo na ausência de correlação entre a imunidade protetora e uma produção elevada de anticorpos, a detecção de tais anticorpos torna possível o desenvolvimento de ferramentas voltadas para o diagnóstico sorológico da doença. As técnicas empregadas no sorodiagnóstico da LVH apresentam-se bem desenvolvidas, entretanto, o mesmo não se aplica para os casos de LVC. O diagnóstico clínico e laboratorial das leishmanioses apresenta-se bastante dificultado. O diagnóstico das formas sintomáticas é utilizado para confirmar a doença, enquanto o diagnóstico das formas assintomáticas é importante para o controle da doença e a redução das taxas de infecção. Adicionalmente, um diagnóstico precoce pode melhorar a eficácia do tratamento, pois o mesmo pode ser realizado no início da doença. Tradicionalmente, para um diagnóstico definitivo da doença, há a necessidade do encontro do parasita nas lesões e/ou em aspirados realizados em órgãos internos, como amostras obtidas de punções no baço, na medula óssea e nos linfonodos [B.L. Herwaldt, Leishmaniasis, Lancet 354 (1999) 1191-1199]. Os métodos tradicionais baseiam-se no uso de colorações hematológicas das amostras, por cultivos in vitro realizados em fragmentos de tecidos infectados e pela amplificação do DNA do parasita pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) [G. Spanakos, E.T. Piperaki, P.G. Menounos, N. Tegos, A. Flemetakis, N.C. Vakalis, Detection and species Identification of Old World Leishmania in clinicai samples using a PCR-based method, Trans Royal Soc Trop Med Hyg 102 (2008) 46-53; G. Miro, L. Cardoso, M.G. Pennisi, G. Oliva, G. Baneth, Canine leishmanioses—new concepts and insights on an expanding zoonosis: part two, Trends Parasitol 24 (2008) 371-377]. A coleta de amostras para a realização de tais técnicas, porém, é invasiva. Como nos casos sintomáticos há uma produção elevada de anticorpos específicos específicos a determinadas proteínas do parasita, o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem o sorodiagnóstico da doença apresenta-se como uma alternativa atraente [Barbieri e cols, 2006, K. Kar, Serodiagnosis of leishmaniasis, Crit Rev Microbiol 21 (1995) 123-152; L. Cardoso, H.D. Schallig, F. Neto, N. Kroon, M. Rodrigues, Serological survey of Leishmania infection in dogs from the municipality of Peso da Regua (Alto Douro, Portugal) using the direct agglutination test (DAT) and fast agglutination screening test (FAST), Acta Tropica 91 (2004) 95-100; A.B. Reis, A. Teixeira-Carvalho, A.M. Vale, M.J. Marques, R.C. Giunchetti, W. Mayrink, L.L. Guerra, R.A. Andrade, R. Correa-Oliveira, O.A. Martins-Filho, Isotype patterns of immunoglobulins: hallmarks for clinicai status and tissue parasite density in Brazilian dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi, Vet Immunol Immunopathol 112 (2006) 102-116]. A coleta de amostras de soro para os testes sorológicos é considerada menos invasiva em relação à realizada para a realização dos métodos parasitológicos tradicionais e pode ser facilmente realizada em áreas endêmicas. Entretanto, tais testes dependem da utilização de antígenos específicos e da forma clínica da leishmaniose que se deseja diagnosticar. O uso de proteínas do parasita na forma de extratos brutos ou semipurificados permite obter valores elevados de sensibilidade, principalmente, nas formas viscerais sintomáticas. Entretanto, nas formas cutâneas e muco-cutâneas e, principalmente, na forma assintomática de LVC e LVH, a sensibilidade dos testes com os extratos é variável [Herwaldt e cols, 1999; I.A. Maalej, M. Chenik, H. Louzir, A. Ben Salah, C. Bahloul, F. Amri, K. Dellagi, Comparative evaluation of ELISAs based on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis, Am J Trop Med Hyg 68 (2003) 312-320; A.J. Caldas, J. Costa, D.

Aquino, A.A. Silva, M. Barral-Netto, A. Barrai, Are there differences in clinicai and laboratory parameters between children and adults with American visceral leishmaniasis?, Acta Tropica 97 (2006) 252-258; S.A. Grevelink, E.A. Lerner, Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol 34 (1996) 257-272]. Outro problema importante é a especificidade dos testes, uma vez que há a ocorrência de reação cruzada frequente dos anticorpos anti-Leishmania com proteínas também encontradas em outros patógenos, tais como em tripanossomatídeos, no Schistosoma, além da ocorrência de um número elevado de resultados falso-positivos em animais que residem em áreas endêmicas da doença, mas não estão infectados por Leishmania [Kar e cols, 1995; C. Ferreira Ede, M. de Lana, M. Carneiro, A.B. Reis, D.V. Paes, E.S. da Silva, H. Schallig, C.M. Gontijo, Comparison of serological assays for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in animais presenting different clinicai manifestations, Vet Parasitol 146 (2007) 235-241; R. Porrozzi, M.V. Santos da Costa, A. Teva, A. Falqueto, A.L. Ferreira, C.D. dos Santos, A.P. Fernandes, R.T. Gazzinelli, A. Campos-Neto, G. Grimaldi, Jr., Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs, Clin Vaccine Immunol 14 (2007) 544-548; S.G. Reed, W.G. Shreffler, J.M. Burns, Jr., J.M. Scott, G. Orge Mda, H.W. Ghalib, M. Siddig, R. Badaro, An improved serodiagnostic procedure for visceral leishmaniasis, Am J Trop Med Hyg 43 (1990) 632-639]. As técnicas empregadas no diagnóstico sorológico da LVC utilizando extratos do parasita têm ainda limitações no sentido de que nos estágios iniciais da doença, animais infectados podem se apresentar soro-negativos e outros, clinicamente curados, podem permanecer sorologicamente reativos por muitos anos [L. Ferrer, M.J. Aisa, X. Roura, M. Portus. Serological diagnosis and treatment of canine leishmaniasis, Vet Rec 136 (1995) 514-516], Devido à baixa especificidade dos testes sorológicos empregados, atualmente, pelos Órgãos de Saúde competentes, muitos cães que apresentam resultados positivos nas triagens sorológicas, porém, ausência de sintomatologia clínica evidente, são sacrificados na maioria das vezes sem a necessidade de tal medida, porém, como mais uma medida de controle da doença.

Por todos os motivos citados, é considerado urgente o desenvolvimento de um diagnóstico sorológico para a LVC que apresente sensibilidade e especificidade elevadas e que permita, principalmente, o diagnóstico dos animais que se encontrem na fase assintomática da doença.

Em relação ao sorodiagnóstico da LVH, atualmente, o uso de uma proteína recombinante que contêm a porção carboxiterminal da proteína kinesina (rK39) de L. chagasi constitui a base para o teste de sorodiagnóstico comercial e apresenta sensibilidade e especificidade elevadas [R. Badaro, D. Benson, M.C. Eulalio, M. Freire, S. Cunha, E.M. Netto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J.M. Burns, R.L. Houghton, J.R. David, S.G. Reed, rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis, J infect Dis 173 (1996) 758-761; S. Singh, V. Kumari, N. Singh, Predicting kala-azar disease manifestations in asymptomatic patients with latent Leishmania donovani infection by detection of antibody against recombinant K39 antigen, Clin Diagn Lab Immunol 9 (2002) 568-572; E.E. Zijlstra, Y. Nur, P. Desjeux, E.A. Khalil, A.M. El-Hassan, J. Groen, Diagnosing visceral leishmaniasis with the recombinant K39 strip test. experience from the Sudan, Trop Med Int Health 6 (2001) 108-113; J.M. Burns, Jr., W.G. Shreffler, D.R. Benson, H.W. Ghalib, R. Badaro, S.G. Reed, Molecular characterization of a kinesin-related antigen of Leishmania chagasi that detects specific antibody in African and American visceral leishmaniasis, Proc Natl Acad Sei USA 90 (1993) 775-779]. Entretanto, o sorodiagnóstico das formas assintomáticas da LVH e LVC, assim como o sorodiagnóstico da LC e LMC no homem, também apresenta problemas de sensibilidade e/ou especificidade, como a reatividade cruzada com soros de pacientes com doenças auto-imunes [P. Salotra, R. Singh, Rapid and reliable diagnostic tests for visceral leishmaniasis, Indian J Med Res 122 (2005) 464-467], Em relação ao desenvolvimento de vacinas contra as leishmanioses, atualmente, as pesquisas têm objetivado a identificação de proteínas das quais a imunização seja capaz de induzir uma resposta imunológica protetora [Handman e cols, 2001; R.N. Coler, S.G. Reed, Second-generation vaccines against leishmaniasis, Trends Parasitol 21 (2005) 244-249]. A princípio, uma proteína é considerada candidata a compor uma classe de vacinas quando _a mesma é capaz de induzir a geração de uma resposta imune celular do tipo Th1 frente à infecção pelo parasita [Handman e cols, 2001]. Diversos antígenos parasitários, testados sob a forma de extratos purificados, semipurificados, proteínas recombinantes e vacinas de DNA têm sido avaliados em diversos modelos experimentais (revisado em [J. Kubar, K. Fragaki, Recombinant DNA-derived Leishmania proteins: from the laboratory to the field, Lancet Infect Dis 5 (2005) 107-114; M. Soto, L. Ramírez, M. Pineda, V. González, P. Entringer, C. Indiani de Oliveira, I. Nascimento, A. Souza, L. Corvo, C. Alonso, P. Bonay, C. Brodskyn, A. Barrai, M. Barral-Netto, S. Iborra, Searching genes encoding Leishmania antigens for diagnosis and protection, Scholarly Research Exchange 2009 (2009)]). A proteção induzida pelos antígenos vacinais depende, em grande parte, da administração conjunta dos mesmos com adjuvantes de resposta imune. Entre esses, destaca-se o uso de oligodesoxirribonucleotídeos com motivos CpG não-metilados (CpG ODN) e saponinas ou, alternativamente, o uso de vacinas de DNA baseadas em plasmideos de expressão em eucariotos contendo genes codificadores dos antígenos de interesse [S. Gurunathan, D.M. Klinman, R.A. Seder, DNA vaccines: immunology, application, and optimization, Annual Rev Immunol 18 (2000) 927-974; E. Dumonteil, DNA Vaccines against protozoan parasites, advances and challenges, J Biomed Biotechnol 2007 (2007) 905-920; J. Champsi, D. McMahon-Pratt, Membrane glycoprotein M-2 protects against Leishmania amazonensis infection, Infect Immun 56 (1988) 3272-3279; W.R. Santos, V.M. de Lima, E.P. de Souza, R.R. Bernardo, M. Palatnik, C.B. Palatnik de Sousa, Saponins, IL-12 and BCG adjuvant in the FML-vaccine formulation against murine visceral leishmaniasis, Vaccine 21 (2002) 30-43; E. Oliveira-Freitas, C.P. Casas, G.P. Borja-Cabrera, F.N. Santos, D. Nico, L.O. Souza, L.W. Tinoco, B.P. da Silva, M. Palatnik, J.P. Parente, C.B. Palatnik-de-Sousa, Acylated and deacylated saponins of Quiliaja saponaria mixture as adjuvants for the FML-vaccine against visceral leishmaniasis, Vaccine 24 (2006) 3909- 3920; R.C. Giunchetti, R. Correa-Oliveira, O.A. Martins-Filho, A. Teixeira-Carvalho, B.M. Roatt, R.D. de Oliveira Aguiar-Soares, W. Coura-Vital, R.T. de Abreu, L.C. Malaquias, N.F. Gontijo, C. Brodskyn, C.l. de Oliveira, DJ. Costa, M. de Lana, A.B. Reis, A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs, Vaccine 26 (2008) 623-638; A.P. Fernandes, M.M. Costa, E.A. Coelho, M.S. Michalick, E. Freitas, M.N. Melo, W.L. Tafuri, M. Resende, V. Hermont, C.F. Abrantes, R.T. Gazzinelli, Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein, Vaccine 26 (2008) 5888-5895; Gurunathan e cols, 2000]. As formulações vacinais têm sido empregadas, principalmente, em modelos murinos experimentais os quais, mesmo não sendo considerados similares à leishmaniose humana e canina, são tomados em consideração inicial para predizer o sucesso ou não destes nos hospedeiros mamíferos. O êxito dos candidatos à vacina tem sido associado à geração de respostas imunes específicas frente aos antígenos vacinais, como descrito anteriormente, mediada pela produção de citocinas como IFN-gama, IL-12 e TNF-alfa, e no controle das respostas mediadas por citocinas descritas como associadas com a suscetibilidade à doença, do tipo Th2, tais como IL-4, IL-10 e TGF-beta [M. Barral-Netto, A. Barrai, C.E. Brownell, Y.A. Skeiky, L.R. Ellingsworth, D.R. Twardzik, S.G. Reed, Transforming growth factor-beta in leishmanial infection: a parasite escape mechanism, Science 257 (1992) 545-548; A. Gumy, J.A. Louis, P. Launois, The murine model of infection with L. major and its importance for the deciphering of mechanisms underlying differences in Th cell differentiation in mice from different genetic backgrounds, Int J Parasitol 34 (2004) 433-444; N. Noben-Trauth, Susceptibility to L. major infection in the absence of IL-4, Immunol Lett 75 (2000) 41-44; D. Sacks, N. Noben-Trauth, The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice, Nat Rev Immunol 2 (2002) 845-858], Existem diversas limitações voltadas para a aplicação dos diferentes candidatos à vacina contra as leishmanioses dos experimentos realizados em laboratórios de pesquisa para o emprego na população canina e/ou humana.

Formulações administradas com êxito em modelos murinos podem não induzir proteção em cães e no homem, além disso, muitas das moléculas candidatas têm sido testadas contra um número restrito de espécies do parasita, normalmente frente a uma espécie, tornando-as específicas apenas para esta determinada cepa de Leishmania (revisado em [C.B. Palatnik-de-Sousa, Vaccines for leishmaniasis in the fore coming 25 years, Vaccine 26 (2008) 1709-1724]). A presente invenção descreve a identificação de 59 (cinquenta e nove) proteínas isoladas do parasita Leishmania (Leishmania) chagasi syn. L. (L.) infantum para aplicação no diagnóstico sorológico dos casos de leishmaniose visceral canina (LVC) assintomática e sintomática, além de sua aplicação como antígenos vacinais contra as leishmanioses. Destas proteínas, trinta e uma (31) são proteínas consideradas hipotéticas no parasita e foram selecionadas nos estágios promastigota (15) e like-amastigota (16) de L. chagasi. As demais proteínas (28) não já haviam sido descritas anteriormente para Leishmania, mas ainda não apresentavam emprego para imunodiganóstico ou vacina contra as leishmanioses. A composição imunogênica contendo as proteínas e/ou seus epítopos (peptídeos) específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+, permitem o desenvolvimento de um diagnóstico sorológico sensível e específico para a identificação de cães portadores da LV sintomática e assintomática. Estas proteínas e/ou peptídeos constituem também antígenos para vacinas contra as leishmanioses, permitindo o desenvolvimento de uma vacina multigênica efetiva contra diferentes cepas do parasita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Eletroforese bidimensional (2DE) dos extratos protéicos totais das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento e like-amastigotas de Leishmania chagasi. Os géis 2DE foram obtidos após a separação dos extratos das formas promastigotas (em A), e like-amastigotas (em B) (150 pg de cada extrato), com a primeira dimensão em IEF pH 4-7 e a segunda dimensão em SDS-PAGE 12%, seguido da coloração com Coomassie Brilliant Blue G-250 colloidal. As figuras são representativas de três géis independentes, que apresentaram resultados similares.

Figura 2. Análise imunoproteômica do extrato protéico total das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de Leishmania chagasi. Os géis 2DE (em A) foram obtidos como mostrado na legenda da Figura 1. Os immunoblots foram identificados após a incubação da membrana de celulose com pools de amostras de soro de cães com LV assintomática (em B) ou sintomática (em C). Os anticorpos aderidos à membrana foram detectados com o conjugado de cabra anti-lgG de cão, na diluição de 1:5000. O eixo x representa o ponto isoelétrico (pf) das proteínas e o eixo y representa o peso molecular aproximado (kDa) das mesmas, determinado pelo uso de um padrão de proteínas comercial para géis 2DE. Os spots mais reativos das proteínas hipotéticas ou já descritas foram numerados e suas identidades foram determinadas e são mostradas nas Tabelas 1 e 2. As figuras são representativas de três experimentos independentes, que apresentaram resultados similares.

Figura 3. Análise imunoproteômica do extrato protéico total das formas like-amastigotas de Leishmania chagasi. Os géis 2DE (em A) foram obtidos como mostrado na legenda da Figura 1. Os immunoblots foram identificados após a incubação da membrana de celulose com pools de amostras de soro de cães com LV assintomática (em B) ou sintomática (em C). Os anticorpos aderidos à membrana foram detectados com o conjugado de cabra anti-lgG de cão, na diluição de 1:5000. O eixo x representa o ponto isoelétrico {pf) das proteínas e o eixo y representa o peso molecular aproximado (kDa) das mesmas, determinado pelo uso de um padrão de proteínas comercial para géis 2DE. Os spots mais reativos das proteínas hipotéticas ou já descritas foram numerados e suas identidades foram determinadas e são mostradas nas Tabelas 3 e 4. As figuras são representativas de três experimentos independentes, que apresentaram resultados similares.

Figura 4. Comparação do perfil de expressão das proteínas das formas promastigota e like-amastigota de Leishmania chagasi que foram reconhecidas pelos soros de cães com LV sintomática e/ou assintomática. Os diagramas mostram o número de spots reconhecidos em cada estágio do parasita, individualmente, ou em ambos. Em (A), o número total de proteínas reconhecidas pelos soros de cães assintomáticos (19 - 18%), sintomáticos (64 -62%) e o total (21 - 20%). (B) Proteínas expressas na forma promastigota do parasita que foram reconhecidas pelos soros de cães assintomáticos (10 -20%), sintomáticos (25 - 49%) e o total (16 - 31%). C) Proteínas expressas na forma like-amastigota do parasita que foram reconhecidas pelos soros de cães assintomáticos (9 - 17%), sintomáticos (39 - 74%) e o total (5 - 9%).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

As proteínas descritas na presente invenção foram isoladas da cepa MHOM/BR/1970/BH46 de Leishmania chagasi. Os parasitas na forma promastigota em fase estacionária de crescimento foram preparados após incubação in vitro a 24°C em meio Schneider's (Sigma) completo, o qual foi composto pela adição de soro fetal bovino inativado a 20% (FBS, Sigma), 20 mM de L-glutamina, 200 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e 50 pg/ml de gentamicina, em pH 7.2 [Coelho EAF. Avaliação dos níveis de proteção e da resposta imune induzida pela imunização com os antígenos A2 e LACK na infecção experimental com Leishmania (Leishmania) major e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Doctoral Thesis. Department of Biochemistry and Immunology, ICB, UFMG. 2004], Parasitas no estágio like-amastigota foram obtidos pela conversão das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento (1010 parasitas), que foram incubadas a 34°C, com 5% C02, por 48 h, em pH 5.0, conforme descrito [Doyle PS, Engel JC, Pimenta PFP, Silva PP, Dwyer DM. Leishmania donovani: long-term culture of axenic amastigotes at 37°C. Exp Parasitol 1991;73:326-34]. A preparação dos extratos, a extração das proteínas das formas promastigotas e like-amastigotas de L. chagasi e a confecção dos géis bidimensionais (2DE) foram realizadas de acordo com protocolo descrito por Lewis e col. (2000), com modificações [Lewis TS, Hunt JB, Aveline LD, Jonscher KR, Louie DF, Yeh JM, Nahreini TS, Resing KA, Ahn NG.

Identification of novel MAP kinase pathway signalling targets by functional proteomics and mass spectrometry. Mol Cell. 2000;6:1343-54], Brevemente, as células (1010 parasitas) foram lavadas 3 vezes em 40 mM Tris-HCI, pH 7.5, centrifugadas a 5000 x g por 10 min e a 4°C. O precipitado foi ressuspendido em tampão de lise [7 M de uréia, 2 M de thiouréia, 4% de chol-amidopropyl dimethylammonio-1-propanesulfonate (CHAPS), 40 mM de dithiothreitol (DTT), 2% de IPG (pH 4-7) e 40mM de Tris base], adicionando-se um coquetel de inibidor de proteases (GE Healthcare, Upsala, Sweden). As amostras foram incubadas por 1 h na temperatura ambiente, sob agitação constante. A purificação das proteínas foi realizada por precipitação das mesmas pelo kit “2D Clean Up Kit” (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Os extratos foram quantificados com o kit “2-D Quant-Kit” (GE Healthcare). Alíquotas foram mantidas a -80°C, até o uso.

Para a primeira dimensão da eletroforese, 150 pg das proteínas foram dissolvidas em um volume de 250 μΙ com solução de rehidratação [7 M de uréia, 2 M de thiourea, 2% de CHAPS, 40 mM de DTT, 2% immobilized pH gradient (IPG-buffer, pH 4-7, trace bromophenol blue)]. Em seguida, as amostras foram aplicadas em tiras de IPG (13 cm, pH 4-7; GE Healthcare) para rehidratação passiva, overníght, na temperatura ambiente. Após a rehidratação do gel, a focalização isoelétrica foi realizada com corrida a 500 V por 1 h, 1.000 V por 1 h, e 8.000 V por 8 h, usando os equipamentos Multiphor II electrophoresis unit e EPS 3500 XL power supply (Amersham, Piscataway, NJ, USA).

Após a focalização isoelétrica (IEF), cada tira foi incubada por 15 min em 10 ml de solução de 50 mM tampão Tris-HCI em pH 8.8, 6 M urea, 30% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS, 0.002% de azul de bromofenol e 125 mM DTT, seguido por um segundo passo de incubação na mesma solução tampão, sem DTT, que foi substituído por 125 mM de iodacetamida. As tiras de IPG foram transferidas para um gel de poliacrilamida a 12% e seladas com solução de agarose (agarose e azul de bromofenol em tampão cátodo Tris-glicina). Utilizou-se o padrão protéico da Invitrogen (BenchMark™ Protein Ladder). A corrida eletroforética foi realizada em sistema de “Mini-Protean II system (BioRad)” conectado ao MultiTemp II cooling bath (Amersham Biosciences). A eletroforese foi realizada a 200 V por 2 h em tampão Tris/glicina/SDS.

Os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue G-250 eolloidal, de acordo com Neuhoff et al. (1988) [Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W. Improved staining of proteins in polyacrilamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis 1988;9:255-62]. As imagens foram documentadas com o scanner Typhoon (GE Healthcare) e as análises foram realizadas com o software PDQuest™ (BioRad). A comparação dos mapas de géis 2DE derivados de três preparações independentes. Uma preparação representativa de cada estágio do parasita foi utilizada. O pi teórico das proteínas foi identificado por sequenciamento de novo e calculado pelo programa “ScanSite pl/Mw’ (http://scansite.mit.edu/calc_mw_pl.html).

Aproximadamente 350 spots de proteínas foram visualizados nas formas promastigotas (Figura 1A) e 200 spots nas formas like-amastigotas (Figura 1B) de Leishmania chagasi. A maioria dos spots nas formas promastigotas concentrou-se entre 15 e 50 kDa, enquanto que nas formas like-amastigotas os mesmos concentraram-se entre 25 e 70 kDa.

As proteínas foram transferidas do gel 2DE para membranas de celulose, pela técnica de western-blot, e a detecção das proteínas antigênicas foi realizada utilizando-se 60 amostras dos soros de cães infectados com L. chagasi (40 com a doença sintomática e 20 assintomáticos). Nos exemplos que se seguem foi utilizado o teste de western blot. Porém, outras técnicas poderão também ser empregadas para o desenvolvimento de um diagnóstico laboratorial da LVC, tais como: ELISA, dot-blot, radioimunodifusão e imunocromatografia. A presente invenção poderá ser mais bem compreendida, de forma não limitante, através dos exemplos que se seguem: Exemplo 1- Detecção das proteínas antigênicas A detecção das proteínas antigênicas foi realizada utilizando-se amostras dos soros de 60 cães infectados com L. chagasi (40 sintomáticos e 20 assintomáticos), obtidos na região metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. Os animais foram considerados sintomáticos quando três ou mais dos seguintes sintomas estavam presentes: perda de peso e/ou pelo, adenopatia, onicogrifose, hepatomegalia, eonjuntivite, dermatite espoliativa no nariz, na cauda ou nas pontas da orelha. Os animais assintomáticos não apresentavam sinais e sintomas clínicos. Todas as amostras de soros dos cães sintomáticos e assintomáticos foram positivas quando testadas por imunofluorescência indireta (RIFI) e a presença das formas amastigotas de Leishmania foi confirmada pela observação microscópica e cultura in vitro de aspirados dos linfonodos poplíteo e/ou pré-escapular, da medula óssea e/ou de fragmentos de tecidos. Amostras de soros de 20 cães que residem em áreas não-endêmicas de LV, sem sinais ou suspeita clínica de LV e negativos nos testes sorológicos e parasitológicos constituíram o grupo controle.

Os extratos totais das formas promastigota e like-amastigota foram separados eletroforeticamente, como descrito anteriormente, e transferidos para membranas de celulose pela técnica de western-blot (Schleicher & Schull, Dassel, Germany) por 2 h e a 400 mA. As membranas foram bloqueadas em 5% (p/v) de leite em pó desnatado em PBS 1x (pH 7.4) e 0.05% Tween 20 por 2 h, à temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram lavadas 6 vezes (10 min cada) com solução de bloqueio e pré-incubadas com os pools de soro de cães com LV sintomática e assintomática (diluídos 1:200 cada) por 2 h, na temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com o anticorpo secundário de cabra anti-lgG de cão, conjugado com peroxidase (diluição 1:5000) por 2 h. Após 3 lavagens com PBS 1x e 0.5% Tween 20, os imunoblots foram revelados pela adição de uma solução composta por cloronafitol (12.5 mg), diaminobenzidina (25 mg) e H2O2 30 vol. (20 pL).

Na análise da imunoreatividade dos anticorpos frente às proteínas expressas na forma promastigota dos parasitas (Figura 2), e baseado na comparação com o gel 2DE obtido anteriormente (Figura 2A), observou-se que os anticorpos presentes nos soros de cães assintomáticos reconheceram, aproximadamente, 40 spots de proteínas no extrato das formas promastigotas, (Figura 2B), enquanto que os soros de cães sintomáticos reconheceram, aproximadamente, 80 proteínas (Figura 2C).

Na análise da imunoreatividade dos anticorpos frente às proteínas expressas na forma like-amastigota dos parasitas (Figura 3), e baseado na comparação com o gel 2DE obtido anteriormente (Figura 3A),-observou-se que os anticorpos presentes nos soros de cães assintomáticos reconheceram, aproximadamente, 30 spots de proteínas (Figura 3B), enquanto que os soros de cães sintomáticos reconheceram, aproximadamente, 70 proteínas (Figura 3C).

Como controle, extratos totais de proteínas dos estágios promastigota e like-amastigota de L. chagasi foram submetidos à eletroforese bidimensional, transferidos para membranas de nitrocelulose e incubados com amostras de soros de cães do grupo controle, e não foi constatado reconhecimento de qualquer proteína do parasita Leishmania (dados não mostrados).

Na análise comparativa das proteínas identificadas nas formas promastigota e like-amastigota de L. chagasi com os soros de cães sintomáticos e assintomáticos, observou-se que a maioria das proteínas de ambos os estágios foram reconhecidas por anticorpos de cães que apresentavam a doença sintomática (Figura 4).

Exemplo 2- Identificação das proteínas antigênicas A identificação de proteínas a partir de anticorpos nos soros de cães assintomáticos possui relevância clínica, visto que um número elevado de cães infectados não é detectado nas análises sorológicas de rotina. Além disto, as proteínas reconhecidas nos soros sintomáticos e assintomáticos e em ambos os estágios do parasita, tornam-se ferramentas atrativas para o diagnóstico sorológico sensível da doença, que é capaz de detectar isoladamente ou em associação a patologia nas diversos estágios clínicos que a mesma se apresenta.

Com o objetivo de estabelecer um mapa de referência de proteínas nas formas promastigotas de L. chagasi que foram reconhecidas nos western-blots com soros de cães assintomáticos e sintomáticos, 51 spots bem definidos (25, 10 e 16 reconhecidos por soros sintomáticos, assintomáticos e por ambos, respectivamente) foram selecionados e extraídos dos géis 2DE. Para as proteínas expressas nas formas like-amastigotas, foram selecionados 53 spots (39, 9 e 5 reconhecidos por soros sintomáticos, assintomáticos e por ambos, respectivamente) que foram selecionados e extraídos dos géis 2DE. A extração de proteínas dos géis 2DE foi realizada como descrito: os spots foram lavados com 25 mM de bicarbonato de amônio e 50% de acetonitrila, até completa descoloração do corante utilizado. Após a secagem, os fragmentos de gel foram colocados em banho de gelo com 50 μΙ da solução de protease e 20 ng/ml de “sequence grade-modified trypsin” (Promega), em 25 mM bicarbonato de amônio (Promega Biosciences, CA), por 30 min. O excesso da solução de protease foi removido e substituído por 25 mM de bicarbonato de amônio. A digestão foi realizada por 18 h a 37°C. A extração dos peptídeos foi realizada 2 vezes por 15 min com 30 μΙ de 50% de acetonitrila e 5% de ácido fórmico. O produto da digestão pela tripsina foi concentrado em speed-vac (Savant, USA) para, aproximadamente, 10 μΙ e dessalinizado em coluna de Zip-Tip (C18 resin; P10, Millipore Corporation, Bedford, MA). As amostras foram misturadas em uma matriz (5 mg/ml recrystallized a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) em um volume final de 1 ml (na proporção 1:1) e submetidas à análise.

Análises de MS e MS tandem foram realizadas utilizando-se o programa MALDI-TOF-TOF AutoFIex III™ no modo “positive-reflector” controlado pelo software FlexControl™, para análise e identificação das proteínas. Utilizou-se um padrão de calibração de peptídeos II (Bruker Daltonics) como referência para a calibração do aparelho e o ácido a-cyano-4-hidroxicinâmico como matriz. As amostras foram colocadas em alvos MTP AnchorChip™ 600/384 (Bruker Daltonics) usando o protocolo padrão para o método de gotas secas. Cada espectro foi produzido por acumulação de dados de 200 tiros de laser consecutivos. O espectro de massas foi calibrado usando uma mistura padrão de peptídeos para calibração (Bruker Daltonics), consistindo de angiotensina I & II, substância P, bombesina, ACTH clip 1—17, ACTH clip 18-39 e somatostatina 28 como padrão interno, e as massas dos peptídeos foram determinadas como massas mono-isotópicas. O espectro resultante foi processado pelo software de análise Flex (Bruker Daltonics).

Os peptídeos obtidos do espectro MS/MS foram avaliados manualmente. Os peptídeos sequenciados foram pesquisados no banco de dados (http://blast.ncbi.nlm7nih.gov) pesquisando em (organisma Leishmania -taxid:5658). Os espectros MS/MS de baixa qualidade não foram considerados para sequenciamento ou para seleção em banco de dados de sequência de proteínas. As sequências dos peptídeos sequenciados foi extendida para o ponto de divagem tríptica mais próximo e a coincidência entre a massa molecular experimental e a teórica, juntamente com a qualidade do alinhamento, foi considerada como critério de identificação das proteínas.

Entre as proteínas identificadas, algumas proteínas encontram-se já descritas e foram empregadas anteriormente para diagnóstico, vacina e/ou no tratamento das leishmanioses.

Proteínas hipotéticas que ainda não apresentavam função definida em Leishmania são apresentadas na Tabela 1. Proteínas já conhecidas em Leishmania, mas que ainda não apresentam emprego no diagnóstico e vacinas nas leishmanioses são apresentadas na Tabela 2. Em ambos os casos, as proteínas foram identificadas no estágio promastigota de L. chagasi.

No caso das proteínas reconhecidas no estágio like-amastigota de L. chagasi, proteínas hipotéticas que ainda não apresentavam função definida em Leishmania são apresentadas na Tabela 3. Proteínas já conhecidas em Leishmania, mas que ainda não apresentam emprego no diagnóstico e vacinas nas leishmanioses são apresentadas na Tabela 4.

Assim, tais grupos de proteínas apresentam potencial para compor um diagnóstico sorológico aitamente específico para as leishmanioses e podem ser utilizadas como vacinas contra as leishmanioses.

Tabela 1. Listagem das quinze (15) proteínas hipotéticas de formas promastigotas de Leishmania e que foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral assintomática e/ou sintomática causada por Leishmania chagasi, após identificação por imunoproteômica.

Tabela 2. Listagem das nove (9) proteínas já descritas em formas promastigotas de Leishmania e que foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral assintomática e/ou sintomática causada por Leishmania chagasi, após identificação por imunoproteômica.

Tabela 3- Listagem das dezesseis (16) proteínas hipotéticas de formas like-amastigotas de Leishmania e que foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral assintomática e/ou sintomática causada por Leishmania chagasi, após identificação por imunoproteômica.

Tabela 4- Listagem das dezenove (19) proteínas já descritas em formas like-amastigotas de Leishmania e que foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com leishmaniose visceral assintomática e/ou sintomática causada por Leishmania chagasi, após identificação por imunoproteômica.

REIVINDICAÇÕES

Claims (21)

1- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA DE Leishmania, caracterizada por compreender ao menos uma proteína selecionada do grupo consistindo das sequências SEQ ID N°1 a 59 ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+ e excipientes farmacologicamente aceitáveis.

2- COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA DE Leishmania, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender preferencialmente ao menos uma das proteínas específicas de Leishmania selecionadas do grupo consistindo das sequências SEQ ID N°1 a 11, ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+ e excipientes farmacologicamente aceitáveis.

3- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE caracterizado por compreender: a) ligação de anticorpos específicos de Leishmania de uma amostra ao menos a uma proteína selecionada do grupo descrito consistindo das sequências SEQ ID N°1 a 59 e/ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8\ ligada a um suporte sólido ou a um carreador; b) contactar os anticorpos do passo (a) com um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se ligam aos anticorpos do passo (a); c) detectar os anticorpos específicos de Leishmania na amostra supracitada pela detecção do anticorpo secundário ou à proteína especificamente ligados ao dito anticorpo artà-Leishmania.

4- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelas amostras serem selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e outro fluído corporal.

5- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado de um grupo de materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno ou outro utilizado com a mesma finalidade dos demais descritos.

6- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo carreador ser uma partícula de ouro.

7- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado de um grupo consistindo de IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses deles.

8- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína do passo (b) ser selecionada de um grupo consistindo de Proteína A e/ou Proteína G.

9- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo consistindo de peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.

10- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

11- MÉTODO PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo passo de detecção de anticorpo específico à Leishmania ser selecionado do grupo consistindo de detecção de fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou de radioisótopos.

12- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, caracterizado por compreender: - pelo menos uma das proteínas seleconadas do grupo consistindo das sequências SEQ ID Nos 1 a 59; ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+; - um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário ou a proteína está conjugado a uma enzima ou a um marcador, e um reagente para detectar a enzima ou marcador utilizados;

13- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelas proteínas ou os epítopos estarem ligados a um suporte sólido ou carreador.

14- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de material consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e polistireno.

15- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo carreador consistir de partículas de ouro.

16- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado do grupo consistindo de IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses.

17- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela proteína conjugada a uma enzima ou marcador ser selecionada do grupo, consistindo de proteína A e/ou proteína G.

18- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dito marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, redioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

19- KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, uréase, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.

20- VACINA PARA LEISHMANIOSE, caracterizada por compreender ao menos uma proteína selecionada de um grupo que consiste das sequências SEQ ID N°1 a 59 ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+ e excipientes farmacologicamente aceitáveis.

21- VACINA PARA LEISHMANIOSE, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender preferencialmente ao menos uma das proteínas específicas de Leishmania selecionadas de um grupo consistindo das sequências SEQ ID N° 1 a 11, ou seus epítopos (peptídeos) correspondentes mais específicos para linfócitos B (LB) e linfócitos T CD8+ e excipientes farmacologicamente aceitáveis.