CA2087950A1 - Support pour milieux de culture compartimente et milieux de culture electifs complementaires - Google Patents
Support pour milieux de culture compartimente et milieux de culture electifs complementairesInfo
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Abstract
2087950 9221748 PCTABS00160 Support multicompartimenté pour milieux de culture, rempli ou non de milieux de culture (micro)biologiques complémentaires. Il est prévu le doublement des cloisons qui séparent les secteurs portant les milieux de culture, comme il est prévu la division du support en des compartiments de dimensions différentes, de manière à ce qu'il comporte au moins un compartiment plus petit que les autres, destiné à être rempli d'un milieu sélectif et au moins un compartiment plus grand que les autres, destiné à être rempli d'un milieu électif, un milieu de culture électif nouveau étant mis au point à cette fin, contenant notamment un indicateur d'acidité et du saccharose et/ou du lactose, ou du mannitol et rendu électif à l'égard des bactéries à gram négatifs par l'adjonction de clindamycine ou de lincomycine et, pour certaines applications, d'un macrolide et/ou d'une substance inhibant la croissance d'entérocoques et/ou de germes levuriformes et de champignons.
Description
~092121748 PCT/CH92/000~
SUPPORT POUR MILIEUX DE CULTURE CO~PARTIME.~TF
ET 2~795~
MILIEUX DE C~'LTURE ELECT~FS Co~PLE.~E~TA~REc Bon nombre d'analYses de microbiologie, notamment de micro-biologie clinique, sont compliquees par la présence de ger-mes d'especes differentes, souvent en grands nombres. Quand les différentes colonies qui apparaissent alors dans la culture, ont un aspect assez identique, ou quand la crois-sance est très dense, la reconnaissance et l'isolement du ou des germe(s) en cause deviennent difficiles et prennent beaucoup de temps. Par conséquent, dans certains cas le(s) germe<s~ en cause sont manqub~s?, tandis que dans d'autres cas le diagnostic et l'antibiogramme sont obtenus trop tard pour avoir encore une utilite.
Afin d'obtenir un meilleur discernement des germes recher-ches et d'ameliorer ainsi l'efficacite des analyses micro-biologiques, nous avons entrepris des recherches qui ont abouti dans l'élaboration d'un nouveau milieu de culture, dont les diverses variantes peuvent etre utilisees seules, ou dans des combinaisons de milieux qui, par blectivite, permettent de seParer les germes Prbsents dans l'inoculum en catégories distinctes et du fait que chacun des milieux présente alors un nombre limltb de colonies microblennes qui, de plus, appartlennent a une cate~orie determlnee, de reconnaltre et d'Isoler directement les ~ermes lmportants.
Afin de faciliter l'examen de la culture nous avons encore conçu des boltes dans le genre de la bolte dlte de petri, dlvlsees en plusleurs compartiments afin de pouvoir conte-nlr plusieurs milieux blectifs complbmentalres. Puis, nos recherches ont dbmontré que certalns substances sont en mesure de diffuser a travers le plastic, polystyrene par exemple, et d'influencer le milieu contenu dans le comPar-timent avoisant. Pour les combinaisons de milieux ou une W092/21748 2 0 8 7 9 5 0 2 - PCT/CH92/000~
telle diffusion de substances pourrait g~ner nous avons mis au point ~es boltes ~ plusieurs compartiments, ayant des cloisons intérieures doublees, séparées par une fente. Les fentes sont fermées soit en bas au niveau du fond de la bolte (figure 1 ), soit en haut (figure 2 >. Nous pré-ferons la derni~re solution pour la raison qu'elle permet l'orientation de la bolte dans un appareil de remplissage automatique par l'enfilement de plaquettes tatrices orien-tables.
Parmi les milieux électifs il Y en a qui sont convenablement appeles selectifs pour la raison qu'ils inhibent la crois-sance de presque toutes les especes de sermes en faveur de quelques especes bien determinées. Pour l'isolement de ces dernières il suffit de ce fait d'une surface très réduite.
Pour les combinaisons qui comportent un ou plusieurs de ces milieux nous avons invente des boItes qui ont des comparti-ment de dimensions différentes. Les figures 3 , 4 , 5 et 6 montrent de manière non limitative quatre exemples. La bolte de la fig. 3 est de forme ronde et contient un com-partiment qui occupe environ un quart de la surface. A par-tir de l'endroit o~ les deux cloisons qui la délimitent se jointent, part une cloison qui divise la partie restante de la bolte en deux parties de surfaces é~ales. Les compar-timent~ peuvent etre séparés par des cloisons simples, ou doublés conformement aux figures 1 ou 2_. La conception de la bolte de la fig. 4 est identique à cette différence pres que la bolte est de forme carrée avec le petit compar-timent situé dans un des quatre coins. La bolte de la figure g est une bolte ronde divlsée par une cloison de bord en bord situee dans l'axe et Une clolson perpendlculairement la p'remiere. La bolte comporte ainsl un ~rand compartl-ment occuPant envlron la moitie de la surface, et deux pe-tites comPartiments occupant chacun environ un quart de la surface. ]ci aussi, les cloisons peuvent etre simples, ou doublees conformement aux fisures 1 ou 2 . La figure 6 montre une bolte basee sur la m~me conception a cette difference pres qu'elle est de forme carree. Dans le cas d'une bo~te carree il est evident que les cloisons peuvent aussi etre situees dans les diagonales. Dans tous les exem-WO92/21748 _ 3 _ 2 0 8 ~ 9 ~ O PCT/CH92/0005~
ples les cloisons ont une ~auteur qui est pr~férablement decinq millimètres, dePassant ainsi d'un millimètre le niveau de la surface des milieux de culture contenus dans les com-partiments, qui ont de pr~ference ~ne épaiss~ur de quatre millimètres.
Les exemples suivants decrivent de manière non limitative comment il est possible de séparer les germes presents dans l'inoculum en plusieures categories distinctes par une com-binaison judicieusement choisie de milieux de culture élec-tifs:
premier exemple: dans les cultur~s oto-rhino-laryngolo-yiques, synecologiques, urologiques et de certains pus, notamment d'origine chirurgicale, on a avant:age, compte tenu de la mu]tiplicite de sermes pr~sents dans l'inocu-lum, dc pouvoir s~l~arer dès le d~but les germes a gram positifs des germes a gram n~gatifs et d'obt~nir isol~-ment les Neisseria et levures pat.hog~nes, vu leur intéret particulier. Certains des germes présents dans ces pré-lèvements ont besoirl de serum sanguin pour pouvoir former des colonias, t.andis ~ue pour ]a mise en évidence de la formation d'llémolYsine par certains germes à gram posi-tifs la I)r~sence de san~ complet. est de rigueur. Nos re-cherches nous ont alor~ mell~ a composer un jeu de trois milieux ~lectifs contenus dan~ une bolte ~ trois colnpar-timents:
le premier compartiment contient une gélose au sang, pré-parée a part:ir du milieu dit Colwnbia agar base, et en-richie avec 4 a 6 pour cent de sang défibrine. Pour la rendre élective nous ajoutons de la nYst~tine ~ ralson de
SUPPORT POUR MILIEUX DE CULTURE CO~PARTIME.~TF
ET 2~795~
MILIEUX DE C~'LTURE ELECT~FS Co~PLE.~E~TA~REc Bon nombre d'analYses de microbiologie, notamment de micro-biologie clinique, sont compliquees par la présence de ger-mes d'especes differentes, souvent en grands nombres. Quand les différentes colonies qui apparaissent alors dans la culture, ont un aspect assez identique, ou quand la crois-sance est très dense, la reconnaissance et l'isolement du ou des germe(s) en cause deviennent difficiles et prennent beaucoup de temps. Par conséquent, dans certains cas le(s) germe<s~ en cause sont manqub~s?, tandis que dans d'autres cas le diagnostic et l'antibiogramme sont obtenus trop tard pour avoir encore une utilite.
Afin d'obtenir un meilleur discernement des germes recher-ches et d'ameliorer ainsi l'efficacite des analyses micro-biologiques, nous avons entrepris des recherches qui ont abouti dans l'élaboration d'un nouveau milieu de culture, dont les diverses variantes peuvent etre utilisees seules, ou dans des combinaisons de milieux qui, par blectivite, permettent de seParer les germes Prbsents dans l'inoculum en catégories distinctes et du fait que chacun des milieux présente alors un nombre limltb de colonies microblennes qui, de plus, appartlennent a une cate~orie determlnee, de reconnaltre et d'Isoler directement les ~ermes lmportants.
Afin de faciliter l'examen de la culture nous avons encore conçu des boltes dans le genre de la bolte dlte de petri, dlvlsees en plusleurs compartiments afin de pouvoir conte-nlr plusieurs milieux blectifs complbmentalres. Puis, nos recherches ont dbmontré que certalns substances sont en mesure de diffuser a travers le plastic, polystyrene par exemple, et d'influencer le milieu contenu dans le comPar-timent avoisant. Pour les combinaisons de milieux ou une W092/21748 2 0 8 7 9 5 0 2 - PCT/CH92/000~
telle diffusion de substances pourrait g~ner nous avons mis au point ~es boltes ~ plusieurs compartiments, ayant des cloisons intérieures doublees, séparées par une fente. Les fentes sont fermées soit en bas au niveau du fond de la bolte (figure 1 ), soit en haut (figure 2 >. Nous pré-ferons la derni~re solution pour la raison qu'elle permet l'orientation de la bolte dans un appareil de remplissage automatique par l'enfilement de plaquettes tatrices orien-tables.
Parmi les milieux électifs il Y en a qui sont convenablement appeles selectifs pour la raison qu'ils inhibent la crois-sance de presque toutes les especes de sermes en faveur de quelques especes bien determinées. Pour l'isolement de ces dernières il suffit de ce fait d'une surface très réduite.
Pour les combinaisons qui comportent un ou plusieurs de ces milieux nous avons invente des boItes qui ont des comparti-ment de dimensions différentes. Les figures 3 , 4 , 5 et 6 montrent de manière non limitative quatre exemples. La bolte de la fig. 3 est de forme ronde et contient un com-partiment qui occupe environ un quart de la surface. A par-tir de l'endroit o~ les deux cloisons qui la délimitent se jointent, part une cloison qui divise la partie restante de la bolte en deux parties de surfaces é~ales. Les compar-timent~ peuvent etre séparés par des cloisons simples, ou doublés conformement aux figures 1 ou 2_. La conception de la bolte de la fig. 4 est identique à cette différence pres que la bolte est de forme carrée avec le petit compar-timent situé dans un des quatre coins. La bolte de la figure g est une bolte ronde divlsée par une cloison de bord en bord situee dans l'axe et Une clolson perpendlculairement la p'remiere. La bolte comporte ainsl un ~rand compartl-ment occuPant envlron la moitie de la surface, et deux pe-tites comPartiments occupant chacun environ un quart de la surface. ]ci aussi, les cloisons peuvent etre simples, ou doublees conformement aux fisures 1 ou 2 . La figure 6 montre une bolte basee sur la m~me conception a cette difference pres qu'elle est de forme carree. Dans le cas d'une bo~te carree il est evident que les cloisons peuvent aussi etre situees dans les diagonales. Dans tous les exem-WO92/21748 _ 3 _ 2 0 8 ~ 9 ~ O PCT/CH92/0005~
ples les cloisons ont une ~auteur qui est pr~férablement decinq millimètres, dePassant ainsi d'un millimètre le niveau de la surface des milieux de culture contenus dans les com-partiments, qui ont de pr~ference ~ne épaiss~ur de quatre millimètres.
Les exemples suivants decrivent de manière non limitative comment il est possible de séparer les germes presents dans l'inoculum en plusieures categories distinctes par une com-binaison judicieusement choisie de milieux de culture élec-tifs:
premier exemple: dans les cultur~s oto-rhino-laryngolo-yiques, synecologiques, urologiques et de certains pus, notamment d'origine chirurgicale, on a avant:age, compte tenu de la mu]tiplicite de sermes pr~sents dans l'inocu-lum, dc pouvoir s~l~arer dès le d~but les germes a gram positifs des germes a gram n~gatifs et d'obt~nir isol~-ment les Neisseria et levures pat.hog~nes, vu leur intéret particulier. Certains des germes présents dans ces pré-lèvements ont besoirl de serum sanguin pour pouvoir former des colonias, t.andis ~ue pour ]a mise en évidence de la formation d'llémolYsine par certains germes à gram posi-tifs la I)r~sence de san~ complet. est de rigueur. Nos re-cherches nous ont alor~ mell~ a composer un jeu de trois milieux ~lectifs contenus dan~ une bolte ~ trois colnpar-timents:
le premier compartiment contient une gélose au sang, pré-parée a part:ir du milieu dit Colwnbia agar base, et en-richie avec 4 a 6 pour cent de sang défibrine. Pour la rendre élective nous ajoutons de la nYst~tine ~ ralson de
2 u~ s par Inillllitre pour elnpecher 1~ croissance de le-vures, et de la colimyclne en ~orme de colistlne meth~ne sulfonate ~ raison de 20 unités internationales, solt 1,7 microgramme par millilitre. A cetLe concentratlon de la colimYcine il n'Y a que les selmes a gram positifs qui poussent, ~ l'excePtion dc~ l~ro~cus species, reconnais-sables aux grandes colonies dont l'essaimage est inhibe, ainsi que de Nei~seria mening~ dis et Neisseria gonor-rhoeae, qui se distinguent nettement par leurs colonies translucides.
W092/21748 2 ~ ~ 7 9 ~ O PCT/CH92/OOOSX
Le deuxième comPartiment est destiné à recevoir un milieu qui favorise non seulement électivement la croissance de germes à gram negatifs, mais qui Permet en Plus d'identi-fier les Haemophilus species et Neisseria species patho-gènes. Puisqu'il n'existe pas de milieu qui répond ~ ces exigences, nous avons inventé un milieu ad hoc, qui con-tient approximativement pour un litre lz gram de gelose, 4 gram de chlor1lre de sodium, 10 gram de peptone, 2 gram d'extrait de viande, 2 gram d'extrait de levure, 10 gram de saccharose, 2 unités internationales de nystatine et 15 ml d'une solution de rouge neutre à 0,25 Pour cent.
Après sterilisation on y ajoute encore 10 ml d'Isovitalex, melange enrichissant contenant les facteurs v et X, 40 ml de sérum stérile de cheval, et de la clindamycine en forme de clindamycinePhosPhate a raison de 8 milligramme par litre. En plus du saccharose on peut encore l'addition-ner de 10 gram de lactose par litre. A la concentration donnee de la clindamycine il n'y a que les germes a gram negatif qùi poussent sur ce milleu, a l'exception de cer-i tains Proprionibacterium species, qui Y developpent des colonies tYpiquement plates et petites, et d'enterocoques, immédiatement reconnaissables a leurs colonies petites, bombées et rouge fonce. Parmi les germes à gram négatifs, les espèces barlales de Neisseria et d'Haemophilus forment des colonies rouges à cause de la transformation en acide du saccharose et, eventuellement du lactose. N'ayant pas la faculte de s'attaquer a l'un ou l'autre des ces deux sucres, les Neisseria pathogènes développent des colonies incolores, translucldes et ~albées, tandis que les dif-ferents biotypes de Haemophllus Influenzae forment des colonies lncolores, translucides et plates. En poussant plus raPidement, les enterobacterles et les batonnets a gram negatifs, oxYdase positifs, developpent des colonies nettement plus grandes et o~aques et qui sont blanches ou rouges suivant la formation ou non d'aclde.
Quand on désire empècher la croissance de ~)roprionibac-terium species et d'entérocoques, on Peut remplacer la clindamycine ~ar du cristal-violet à raison de 1 milli-litre d'une solution a 0,1 pour cent par litre de milieu ~092/21748 - 5 - 2 0 ~ 7 9 5 ~ PCT/CH92/0005X
on peut encore incorporer un ~el ferrique dans ce miiieu au cas où il est souhaitable de mettre en ~idence une eventuelle formation de hydroxyde de soufre.
Le troisieme compartiment contient un milieu genéralement appelé "gélose chocolat", prepare a partir du milieu de base s~los~ se]on Thayer-Martin ~ raison de 40 gram pour un litre. ~pr~s stérilisation on y ajoute du sang d~fibri-né Iys~ à raison de ~ ~ 6 pour cent, puis le milieu est rechauffe à 80C Pendant 30 minutes en agitant regulière-ment la bouteille. Par la sui~e on y ajoute encore une quantite adequate d'un melange enrichissant, lo ml de VITOX
par exemPle, et 10 milligramme de vancomycine, 2'500 unit~s internationales de polymyxine-B, ainsi que 5 milligramme de trimethoprim par litre. Ainsi comPosé ce milieu ne permet la croissance que de Neis~eria méningitidis, Neisseria Go-norrhoeae, Candida et Saccharomyces species, Campylobacter sPecies et Bacillus species, notamment Bacillus fusiformis, suivant la composition de l'atmosphere de la culture lors de l'irlcubation. Ainsi, il ne Peut y avoir croissance que de Neisseria patllosèrles, de Candida et Saccharomyces spe-cies et de certaines souches de Bacillus fusiformis quand I'incubation a lieu dans l'air enrichi de 5 a 7 pour cent de dioxyde de carbone, tandis que l'on n'obtient la crois-sance que de levures et de bacilles anaerobies, y compris Campylobacter sPecies, quand la culture est incubée en atmosphere anaérobie.
Ces trois milieux, contenus dans une meme boite, permettent d'identifier directement dans les cultures oto-rhino-larYn-gologiques sur la gelose au san~ a la collmycine strePt coccus pYogenes~ colonies ~rises beta-hbmolytiques, strePt coccus pneumonlae~ colonies translucides alpha-henlolytlques, Neisserla meningitidis et Nelsseria ~onorrhoeae, colonles galbees, dbpolies, et les Corynebacterie species patho~enes, colonies blanchatres, generalement plus ou molns nettement beta-hemolytique~, alnsi que les StaPhylococcus species, en Particulier Staphylococcus aureus, assez grandes colonies beta-hemolytiques plates et grises, ou galbées et jaun~tres;
-sur le milieu au serum a la clindamycine on reconnait Neis-seria meningitidis et Neisseria ~onorrhoeae, colonies gal-'2~79~
bees, tran~ d~s'~t incolores, Haemophilus influenzae, colonies plates, transParantes et incolores, ainsi que Hae-mophilus para-influenzae, colonies plates, transparantes et rouges, tandis que les Neisseria banals se présentent sous forme de colonies galbées, translucides et rouges;
-sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies de Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, transpa-rantes, de levures, blanches et échancrees, ainsi que de ~acillus fusiformis, opaques et brunatres.
Inoculés avec des prél~vement gynecologiques ou urologiques on peut directement identifier sur la sélose au sang a la colimycine Streptococcus agalacteae. colonies blanchatres, beta-hemolytiques, Streptococcus faecalis, colonies galbees, grises, non hémolYtiques~ Gardnerella vaginalis, petites co-lonies plates, translucides, hémolytiques ou non, suivant l'origine humain ou ovin du sang incorPoré dans le milieu, les CorYnebacterium species, y compris Listeria monocyto-genes, colonies blanches ou grisatres, séneralement plus ou moins nettement hémolytiques quand il s'agit d'especes patho-genes, les Neisseria pathogènes, colonies galbees, trans-lucides, et les StaPhYlococcus species, notamment Staphy--lococcus aureus, assez grandes colonies bbta-hemolytiques, plates et grises, ou galbées et jaunatres, tandis que les Lactobacillus sPecies et Proprionibacterium species se pre-sentent 'sous forme de petltes colonies géneralement alpha-hémolytiques, et les Proteus species, rarement présentes, de grandes colonies blanches-grisatres;
-sur le milieu au serum à la cllndamycine on reconnalt les colonies des batonnets a ~ram ne~atifs, 9randes, ~albees, et rouge lor8qu'11s gont capableg de former de l'acide a partlr du 8accharoge et/ou du lactose quand ce dernier sucre a ete lncorporé dans le milleu, ou blanchatres en absence de formation d'acide, des Neisseria species patho-oenes, galbees, incolores et translucides, de Streptoc,oc-cus faecalls, petites, bombees et rouge fonce et bien que peu fréquemment, de Proprionibacterium specles, petltes, plates et rouge ou blanchatres et translucides.
-sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies des Neisseria species pathogènes, Neisseria gonorrhoeae :' ' ;
, :
W092/21i48 7 ~ 0 87 ~/cH92/oO~
en particulier, galbees et transparantes, ainsi que de levures, notamment Candida albicans, blanches et échan-crées.
Les germes recherchés sont ainsi répartis sur les trois milieu.~ en catégories distinctes et, de par les aspects que presentent leurs colonies sur le milieu particulier, y sont directement identifiables.
Sans modifier l'electivité des milieux on peut remplacer dans la gelose au sang la colimycine par de la PolymYxine B a raison de 2'500 unites internationales par lltre, dans la gélose au sérum la clindamycine par de la lincomycine ~ raison de 1 milligramme par litre, ou par un millilitre par litre d'une solution a 0,1 pour cent de crystal-violet, et dans le milieu chocolat-VCT le triméthoprim par de la neomycine a raison de 2 mg par litre.
Exceptionnellement certaines Pseudomonas species r~sis-tantes a la colimycine peuvent se dievelopper sur la gélose à la colimYctne. Toutefois, elles produisent de l'oxydase, ce qui permet de les diffbrentier des Proteus species, qui sont oxydase negatives, en etalant un peu d'une colonie sur un morceau de paPier imbibé du reactif ad hoc.
Si l'on desire empecher les membres colimycine-résistants de ces deux familles de se develoPper sur ce milieu, il suffit d'ajouter en plus de la colimycine de l'acide nali-dixique a raison dei5 mg par litre. On n'obtiendra alors que la croissance de germes a gram posltlfs dans ce com-partiment.
~Deuxleme exemple: les sermes ~eneralement responsables d'lnfectlons urlnaires sont les Enterobacterlaceae, les Pseudomonas species, les differentes especes de staPh coque et les enterocoques. Dans des cas partlcullers on cherche, outre les germes cites, le Neisseria gonorrhoeae, les Candida species et les levures pathogenes. Il existe plusieurs milieux pour l'isolement des Enterobacteriaceae et des Pseudomonas species. Toutefois, nos recherches ont montré que le milieu a la clindamYCine de l'exemple pre-W092/21748 2 ~ ~ 7 9 5 0 PCT/CH92/ooo~
cedent, avec ou sans serum, convient particulierement bienceci d'autant plus qu'on peut lui additionner d'un sel ferrique pour la mise en ~vidence de formation de hydr-oxyde de soufre, ce qui permet d'identifier directement Proteus vulgaris et Proteus mirabilis.
Puisque l'acidification ou non des colonies par la degra-dation du seul lactose, mise en ~vidence par le virement de l'indicateur, est un critere généralement admis, il suffit d'incorPorer uniquement du lactose à raison de 10 gram par litre et de faire abstention du saccharose. Pour la mise en evidence d'une éventuelle formation de hydr-oxyde de soufre on peut ajouter 1 gram de citrate de fer ainsi que 6 gram de thiosulPhate de sodium par litre, et ajuster le pH ia 7,2. La nystatine n'est supprimée et le sérum n'est ajoute que si le milieu devra également ser-vir a la mise en evidence des levures et Candida species, et de Neisseria gonorrhoeae, respectivement. L'avantage de la clindamYcine Par rapport au methylviolet est que la premiere ne gene en rien la croissance desdits germes. Ce milieu est alors coulé dans le grand compartiment d'une bolte comportant un grand et deux petits compartiments.
L'un des deux petits compartiments reSoit soit le milieu dit mannitol-salt a~ar destiné a mettre en evidence les Staphylococcus species, soit la gelose au san~ a la coli-mycine du premier exemPle~ avec de l'acide nalidixique et de la nYstatine ou de l'amphotericine-B, afin de mettre en évidence non seulement les Staphylococcus species, mais aussi les Streptococcus species, Y compris les beta-hémoly-tiques et les enterocoques, ainsi que les Neisseria patho-genes. Quand ce compartlment est munl du manitol-salt aSar, ~e deuxleme compartiment resolt le milleu selon Slanètz et ~artley, qui permet de mettre selectivement en evldence les enterocoques. Par contre, si le premier Petit comPar-tlment resolt la gelose au sang cltee, le deuxleme petlt compartiment est rempli d'un milieu pour l'isolement de levures et de Candlda species, le milieu de Sabouraud par exemple, ou le milleu chocolat-VCT du premier exemple.
On a ainsi dans la meme bolte trois milieux qui permettent d'isoler separément solt les batonnets à gram negatifs et W092/21748 - 9 - 2 0 8 7~ ~ ~PCT/CH92/00058 les levures et Candida species, les Staphylococcus species, et les entérocoques, respectivement, soit les b~tonnets à gram negatifs, les Neisseria pathogenes et les cocci ~
~ram positifs. v compris les entérocoques et les strepto-coques beta-hémolYtiques~ et les levures et Candida spe-cies, respectivement.
Les deux combinaisons preferées sont:
1- dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comprennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH. rouge de phenol Par exemple, avec ou sans sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu selon Slanetz et Bartley, et le mannitol-salt agar, respectivement;
2- dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comPrennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH, rouge de phenol par exemple, et sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu dit chocolat-VCT a la vancomycine, colimycine et trimethoprim, additionne de nystatine, et la gélose au sang a la coli-; mycine et l'acide nalidixique, egalement additionnee de nystatine, respectivement. Cette derniere combinaison peut egalement servir aux cultures urologiques et gyne-cologiques.
.
Les germes responsables de troubles de la voie digestive se comptent parmi les batonnets à gram négatifs, oxydase négatifs, soit les salmonelles, shi~elles, Yersinla ente-rocolitica! Yersinia pseudotuberculo9is, et les souches enterotoxiques et enteroPathooenes d'Escherlchla coll, les batonnets a 9ram ne3atlfs, oxydase Positlfs~ solt Aeromonas hydroPhila~ Plelsiomonas shi9elloldes, Pseudo-monas aeruginosa, Vlbrio cholera et Vibrio parahaemoly-ticus, plusieures Candida species, notamment Candida al-bicans, plusieures especes de moisissures, ainsi que les especes de staphylocoques productrices d'alpha-toxine.
Parce qu'aucun des batonnets à gram negatifs cites n'est en mesure de former de l'acide à partir du lactose Pen-.
' ~ ' W092/21748 2 0 8 7 9 5 0 - 1 o - PCT/CH92/OOQ.-.~
dant les premieres 24 heures d'incubation, ledit ~ucre est géneralement incorporé dans les milieux destinés à
isoler les bâtonnets à gram négatifs cites. Afin d'em-pecher la croissance de germes a gram positifs, on les additionne de sels biliaires et de methyl-violet (violet de gentiane). Toutefois, certains des batonnets a gram négatifs, notamment les shigelles, y sont egalement sen-sibles. Or, ces derniers se développent aussi bien que les autres germes à gram negatifs sur le milieu que nous avons invente.
Dans l'exemple précedent l'eventuelle croissance de l'en-terocoque sur notre milieu a la clyndamycine constitue un avantage: l'apect typique de ses colonies permet d'iden-tifier immédiatement ce pathogene des voies urinaires.
Par contre, sa mise en évidence dans les cultures de sel-les n'a aucun intéret du fait qu'il appartient à la flore physiologique de l'intestin. Nous avons alors teste dif-ferents antibiotiques et chimiothérapeutiques suscepti-bles d'en empecher electivement la croissance, pour con-stater qu'il suffit d'additionner le milieu d'un macro-Iide, de l'erYthromycine à raison de 4 milligrammes par litre par exemple. Adapte aux cultures de selles, notre milieu contient donc, outre la clindamycine ou la linco-mycine, du lactose, de l'erYthromycine ou de la rovamy-cine, et un sel ferrique, ce dernier pour que les colo-nies de salmonelles se font remarquer par leur noircis-sement d~ a l'interaction entre le fer et le hydroxyde de soufre formé par la majorite des especes de salmonel-les. Ce milieu est coule dans le ~rand compartlment de la bolte de petrl dlvlse en un ~rand et deux petits com-partiments. Les deux petits recoivent respectivement le mannitol-salt agar, pour la mise en evidence de staphylo-coques mannitol positifs, et le milieu selon Sabouraud, ce dernier rendu electif a l'egard des mycoses, Candida compris, par l'adjonction d'un ou plusieures prodults ~
action antibacterienne. on a ainsi un ensemble de milieux qui permet d'isoler et d'identifier les germes responsa-bles de troubles de la voie digestive.
x u ~ u w092/21748 11 PCT/CH~2/00058 Comme deja dit, les exemples donnes ne sont pas limitatifs:
les éléments qui constituent cette invention se pretent a des var-iants, comme le nombre de secteurs grands et petits des supports pcur milieux de culture, qui peut etre plus grand que mentionne, par exemple suivant les figures / et 8 , la forme des boites de petri, qui peut etre rectangu-laire, plutot que carrée ou ronde, la conception du double-ment des cloisons, qui est applicable a tous les supports pour milieux de culture ayant au moins deux secteurs, les combinaisons de milieux electifs et sélectifs, qui peuvent etre choisies differemment en fonction de la nature de l'in-oculum, ainsi que le volume et la concentration de leurs constltuants, qui peuvent varies suivant l'origine des pro-duits, le degre d'électivité et l'intensite de réaction que l'on desire obtenir. Ainsi, le bleu de chine convient mieux aux daltoniens comme indicateur d'acidite.
~ ~7 .
W092/21748 2 ~ ~ 7 9 ~ O PCT/CH92/OOOSX
Le deuxième comPartiment est destiné à recevoir un milieu qui favorise non seulement électivement la croissance de germes à gram negatifs, mais qui Permet en Plus d'identi-fier les Haemophilus species et Neisseria species patho-gènes. Puisqu'il n'existe pas de milieu qui répond ~ ces exigences, nous avons inventé un milieu ad hoc, qui con-tient approximativement pour un litre lz gram de gelose, 4 gram de chlor1lre de sodium, 10 gram de peptone, 2 gram d'extrait de viande, 2 gram d'extrait de levure, 10 gram de saccharose, 2 unités internationales de nystatine et 15 ml d'une solution de rouge neutre à 0,25 Pour cent.
Après sterilisation on y ajoute encore 10 ml d'Isovitalex, melange enrichissant contenant les facteurs v et X, 40 ml de sérum stérile de cheval, et de la clindamycine en forme de clindamycinePhosPhate a raison de 8 milligramme par litre. En plus du saccharose on peut encore l'addition-ner de 10 gram de lactose par litre. A la concentration donnee de la clindamycine il n'y a que les germes a gram negatif qùi poussent sur ce milleu, a l'exception de cer-i tains Proprionibacterium species, qui Y developpent des colonies tYpiquement plates et petites, et d'enterocoques, immédiatement reconnaissables a leurs colonies petites, bombées et rouge fonce. Parmi les germes à gram négatifs, les espèces barlales de Neisseria et d'Haemophilus forment des colonies rouges à cause de la transformation en acide du saccharose et, eventuellement du lactose. N'ayant pas la faculte de s'attaquer a l'un ou l'autre des ces deux sucres, les Neisseria pathogènes développent des colonies incolores, translucldes et ~albées, tandis que les dif-ferents biotypes de Haemophllus Influenzae forment des colonies lncolores, translucides et plates. En poussant plus raPidement, les enterobacterles et les batonnets a gram negatifs, oxYdase positifs, developpent des colonies nettement plus grandes et o~aques et qui sont blanches ou rouges suivant la formation ou non d'aclde.
Quand on désire empècher la croissance de ~)roprionibac-terium species et d'entérocoques, on Peut remplacer la clindamycine ~ar du cristal-violet à raison de 1 milli-litre d'une solution a 0,1 pour cent par litre de milieu ~092/21748 - 5 - 2 0 ~ 7 9 5 ~ PCT/CH92/0005X
on peut encore incorporer un ~el ferrique dans ce miiieu au cas où il est souhaitable de mettre en ~idence une eventuelle formation de hydroxyde de soufre.
Le troisieme compartiment contient un milieu genéralement appelé "gélose chocolat", prepare a partir du milieu de base s~los~ se]on Thayer-Martin ~ raison de 40 gram pour un litre. ~pr~s stérilisation on y ajoute du sang d~fibri-né Iys~ à raison de ~ ~ 6 pour cent, puis le milieu est rechauffe à 80C Pendant 30 minutes en agitant regulière-ment la bouteille. Par la sui~e on y ajoute encore une quantite adequate d'un melange enrichissant, lo ml de VITOX
par exemPle, et 10 milligramme de vancomycine, 2'500 unit~s internationales de polymyxine-B, ainsi que 5 milligramme de trimethoprim par litre. Ainsi comPosé ce milieu ne permet la croissance que de Neis~eria méningitidis, Neisseria Go-norrhoeae, Candida et Saccharomyces species, Campylobacter sPecies et Bacillus species, notamment Bacillus fusiformis, suivant la composition de l'atmosphere de la culture lors de l'irlcubation. Ainsi, il ne Peut y avoir croissance que de Neisseria patllosèrles, de Candida et Saccharomyces spe-cies et de certaines souches de Bacillus fusiformis quand I'incubation a lieu dans l'air enrichi de 5 a 7 pour cent de dioxyde de carbone, tandis que l'on n'obtient la crois-sance que de levures et de bacilles anaerobies, y compris Campylobacter sPecies, quand la culture est incubée en atmosphere anaérobie.
Ces trois milieux, contenus dans une meme boite, permettent d'identifier directement dans les cultures oto-rhino-larYn-gologiques sur la gelose au san~ a la collmycine strePt coccus pYogenes~ colonies ~rises beta-hbmolytiques, strePt coccus pneumonlae~ colonies translucides alpha-henlolytlques, Neisserla meningitidis et Nelsseria ~onorrhoeae, colonles galbees, dbpolies, et les Corynebacterie species patho~enes, colonies blanchatres, generalement plus ou molns nettement beta-hemolytique~, alnsi que les StaPhylococcus species, en Particulier Staphylococcus aureus, assez grandes colonies beta-hemolytiques plates et grises, ou galbées et jaun~tres;
-sur le milieu au serum a la clindamycine on reconnait Neis-seria meningitidis et Neisseria ~onorrhoeae, colonies gal-'2~79~
bees, tran~ d~s'~t incolores, Haemophilus influenzae, colonies plates, transParantes et incolores, ainsi que Hae-mophilus para-influenzae, colonies plates, transparantes et rouges, tandis que les Neisseria banals se présentent sous forme de colonies galbées, translucides et rouges;
-sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies de Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, transpa-rantes, de levures, blanches et échancrees, ainsi que de ~acillus fusiformis, opaques et brunatres.
Inoculés avec des prél~vement gynecologiques ou urologiques on peut directement identifier sur la sélose au sang a la colimycine Streptococcus agalacteae. colonies blanchatres, beta-hemolytiques, Streptococcus faecalis, colonies galbees, grises, non hémolYtiques~ Gardnerella vaginalis, petites co-lonies plates, translucides, hémolytiques ou non, suivant l'origine humain ou ovin du sang incorPoré dans le milieu, les CorYnebacterium species, y compris Listeria monocyto-genes, colonies blanches ou grisatres, séneralement plus ou moins nettement hémolytiques quand il s'agit d'especes patho-genes, les Neisseria pathogènes, colonies galbees, trans-lucides, et les StaPhYlococcus species, notamment Staphy--lococcus aureus, assez grandes colonies bbta-hemolytiques, plates et grises, ou galbées et jaunatres, tandis que les Lactobacillus sPecies et Proprionibacterium species se pre-sentent 'sous forme de petltes colonies géneralement alpha-hémolytiques, et les Proteus species, rarement présentes, de grandes colonies blanches-grisatres;
-sur le milieu au serum à la cllndamycine on reconnalt les colonies des batonnets a ~ram ne~atifs, 9randes, ~albees, et rouge lor8qu'11s gont capableg de former de l'acide a partlr du 8accharoge et/ou du lactose quand ce dernier sucre a ete lncorporé dans le milleu, ou blanchatres en absence de formation d'acide, des Neisseria species patho-oenes, galbees, incolores et translucides, de Streptoc,oc-cus faecalls, petites, bombees et rouge fonce et bien que peu fréquemment, de Proprionibacterium specles, petltes, plates et rouge ou blanchatres et translucides.
-sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies des Neisseria species pathogènes, Neisseria gonorrhoeae :' ' ;
, :
W092/21i48 7 ~ 0 87 ~/cH92/oO~
en particulier, galbees et transparantes, ainsi que de levures, notamment Candida albicans, blanches et échan-crées.
Les germes recherchés sont ainsi répartis sur les trois milieu.~ en catégories distinctes et, de par les aspects que presentent leurs colonies sur le milieu particulier, y sont directement identifiables.
Sans modifier l'electivité des milieux on peut remplacer dans la gelose au sang la colimycine par de la PolymYxine B a raison de 2'500 unites internationales par lltre, dans la gélose au sérum la clindamycine par de la lincomycine ~ raison de 1 milligramme par litre, ou par un millilitre par litre d'une solution a 0,1 pour cent de crystal-violet, et dans le milieu chocolat-VCT le triméthoprim par de la neomycine a raison de 2 mg par litre.
Exceptionnellement certaines Pseudomonas species r~sis-tantes a la colimycine peuvent se dievelopper sur la gélose à la colimYctne. Toutefois, elles produisent de l'oxydase, ce qui permet de les diffbrentier des Proteus species, qui sont oxydase negatives, en etalant un peu d'une colonie sur un morceau de paPier imbibé du reactif ad hoc.
Si l'on desire empecher les membres colimycine-résistants de ces deux familles de se develoPper sur ce milieu, il suffit d'ajouter en plus de la colimycine de l'acide nali-dixique a raison dei5 mg par litre. On n'obtiendra alors que la croissance de germes a gram posltlfs dans ce com-partiment.
~Deuxleme exemple: les sermes ~eneralement responsables d'lnfectlons urlnaires sont les Enterobacterlaceae, les Pseudomonas species, les differentes especes de staPh coque et les enterocoques. Dans des cas partlcullers on cherche, outre les germes cites, le Neisseria gonorrhoeae, les Candida species et les levures pathogenes. Il existe plusieurs milieux pour l'isolement des Enterobacteriaceae et des Pseudomonas species. Toutefois, nos recherches ont montré que le milieu a la clindamYCine de l'exemple pre-W092/21748 2 ~ ~ 7 9 5 0 PCT/CH92/ooo~
cedent, avec ou sans serum, convient particulierement bienceci d'autant plus qu'on peut lui additionner d'un sel ferrique pour la mise en ~vidence de formation de hydr-oxyde de soufre, ce qui permet d'identifier directement Proteus vulgaris et Proteus mirabilis.
Puisque l'acidification ou non des colonies par la degra-dation du seul lactose, mise en ~vidence par le virement de l'indicateur, est un critere généralement admis, il suffit d'incorPorer uniquement du lactose à raison de 10 gram par litre et de faire abstention du saccharose. Pour la mise en evidence d'une éventuelle formation de hydr-oxyde de soufre on peut ajouter 1 gram de citrate de fer ainsi que 6 gram de thiosulPhate de sodium par litre, et ajuster le pH ia 7,2. La nystatine n'est supprimée et le sérum n'est ajoute que si le milieu devra également ser-vir a la mise en evidence des levures et Candida species, et de Neisseria gonorrhoeae, respectivement. L'avantage de la clindamYcine Par rapport au methylviolet est que la premiere ne gene en rien la croissance desdits germes. Ce milieu est alors coulé dans le grand compartiment d'une bolte comportant un grand et deux petits compartiments.
L'un des deux petits compartiments reSoit soit le milieu dit mannitol-salt a~ar destiné a mettre en evidence les Staphylococcus species, soit la gelose au san~ a la coli-mycine du premier exemPle~ avec de l'acide nalidixique et de la nYstatine ou de l'amphotericine-B, afin de mettre en évidence non seulement les Staphylococcus species, mais aussi les Streptococcus species, Y compris les beta-hémoly-tiques et les enterocoques, ainsi que les Neisseria patho-genes. Quand ce compartlment est munl du manitol-salt aSar, ~e deuxleme compartiment resolt le milleu selon Slanètz et ~artley, qui permet de mettre selectivement en evldence les enterocoques. Par contre, si le premier Petit comPar-tlment resolt la gelose au sang cltee, le deuxleme petlt compartiment est rempli d'un milieu pour l'isolement de levures et de Candlda species, le milieu de Sabouraud par exemple, ou le milleu chocolat-VCT du premier exemple.
On a ainsi dans la meme bolte trois milieux qui permettent d'isoler separément solt les batonnets à gram negatifs et W092/21748 - 9 - 2 0 8 7~ ~ ~PCT/CH92/00058 les levures et Candida species, les Staphylococcus species, et les entérocoques, respectivement, soit les b~tonnets à gram negatifs, les Neisseria pathogenes et les cocci ~
~ram positifs. v compris les entérocoques et les strepto-coques beta-hémolYtiques~ et les levures et Candida spe-cies, respectivement.
Les deux combinaisons preferées sont:
1- dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comprennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH. rouge de phenol Par exemple, avec ou sans sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu selon Slanetz et Bartley, et le mannitol-salt agar, respectivement;
2- dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comPrennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH, rouge de phenol par exemple, et sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu dit chocolat-VCT a la vancomycine, colimycine et trimethoprim, additionne de nystatine, et la gélose au sang a la coli-; mycine et l'acide nalidixique, egalement additionnee de nystatine, respectivement. Cette derniere combinaison peut egalement servir aux cultures urologiques et gyne-cologiques.
.
Les germes responsables de troubles de la voie digestive se comptent parmi les batonnets à gram négatifs, oxydase négatifs, soit les salmonelles, shi~elles, Yersinla ente-rocolitica! Yersinia pseudotuberculo9is, et les souches enterotoxiques et enteroPathooenes d'Escherlchla coll, les batonnets a 9ram ne3atlfs, oxydase Positlfs~ solt Aeromonas hydroPhila~ Plelsiomonas shi9elloldes, Pseudo-monas aeruginosa, Vlbrio cholera et Vibrio parahaemoly-ticus, plusieures Candida species, notamment Candida al-bicans, plusieures especes de moisissures, ainsi que les especes de staphylocoques productrices d'alpha-toxine.
Parce qu'aucun des batonnets à gram negatifs cites n'est en mesure de former de l'acide à partir du lactose Pen-.
' ~ ' W092/21748 2 0 8 7 9 5 0 - 1 o - PCT/CH92/OOQ.-.~
dant les premieres 24 heures d'incubation, ledit ~ucre est géneralement incorporé dans les milieux destinés à
isoler les bâtonnets à gram négatifs cites. Afin d'em-pecher la croissance de germes a gram positifs, on les additionne de sels biliaires et de methyl-violet (violet de gentiane). Toutefois, certains des batonnets a gram négatifs, notamment les shigelles, y sont egalement sen-sibles. Or, ces derniers se développent aussi bien que les autres germes à gram negatifs sur le milieu que nous avons invente.
Dans l'exemple précedent l'eventuelle croissance de l'en-terocoque sur notre milieu a la clyndamycine constitue un avantage: l'apect typique de ses colonies permet d'iden-tifier immédiatement ce pathogene des voies urinaires.
Par contre, sa mise en évidence dans les cultures de sel-les n'a aucun intéret du fait qu'il appartient à la flore physiologique de l'intestin. Nous avons alors teste dif-ferents antibiotiques et chimiothérapeutiques suscepti-bles d'en empecher electivement la croissance, pour con-stater qu'il suffit d'additionner le milieu d'un macro-Iide, de l'erYthromycine à raison de 4 milligrammes par litre par exemple. Adapte aux cultures de selles, notre milieu contient donc, outre la clindamycine ou la linco-mycine, du lactose, de l'erYthromycine ou de la rovamy-cine, et un sel ferrique, ce dernier pour que les colo-nies de salmonelles se font remarquer par leur noircis-sement d~ a l'interaction entre le fer et le hydroxyde de soufre formé par la majorite des especes de salmonel-les. Ce milieu est coule dans le ~rand compartlment de la bolte de petrl dlvlse en un ~rand et deux petits com-partiments. Les deux petits recoivent respectivement le mannitol-salt agar, pour la mise en evidence de staphylo-coques mannitol positifs, et le milieu selon Sabouraud, ce dernier rendu electif a l'egard des mycoses, Candida compris, par l'adjonction d'un ou plusieures prodults ~
action antibacterienne. on a ainsi un ensemble de milieux qui permet d'isoler et d'identifier les germes responsa-bles de troubles de la voie digestive.
x u ~ u w092/21748 11 PCT/CH~2/00058 Comme deja dit, les exemples donnes ne sont pas limitatifs:
les éléments qui constituent cette invention se pretent a des var-iants, comme le nombre de secteurs grands et petits des supports pcur milieux de culture, qui peut etre plus grand que mentionne, par exemple suivant les figures / et 8 , la forme des boites de petri, qui peut etre rectangu-laire, plutot que carrée ou ronde, la conception du double-ment des cloisons, qui est applicable a tous les supports pour milieux de culture ayant au moins deux secteurs, les combinaisons de milieux electifs et sélectifs, qui peuvent etre choisies differemment en fonction de la nature de l'in-oculum, ainsi que le volume et la concentration de leurs constltuants, qui peuvent varies suivant l'origine des pro-duits, le degre d'électivité et l'intensite de réaction que l'on desire obtenir. Ainsi, le bleu de chine convient mieux aux daltoniens comme indicateur d'acidite.
~ ~7 .
Claims (10)
1: support pour milieux de culture, divisé en au moins deux secteurs délimités par des cloisons, caractérisé en ce que les cloisons adjointes sont séparées par une fente.
2: support pour milieu de culture, caractérisé en ce qu'il consiste du fond d'une bolte à couvercle divisé en au moins trois secteurs adjoints, qui n'ont pas tous les mêmes di-mensions.
3: support pour milieux de culture selon les revendications 1 et/ou 2 , caractérisé en ce que les secteurs sont sé-parés les uns des autres par des cloisons doubles dont les faces intérieures opposées sont pontées de façon à ce que la fente qui les sépare est close sur toute sa longueur.
4: support pour milieux de culture selon une ou plusieures des revendications précédentes, caractérisé en ce que les secteurs sont munis de milieux de culture microbiologiques électifs et/ou sélectifs.
5: support pour milieux de culture selon la revendication 4 , caractérisé en ce qu'il est muni d'une combinaison de milieux de culture comprennant un milieu électif à l'égard des bactéries à gram négatifs, ainsi qu'un milieu électif à l'égard de plusieurs germes à gram positifs, permettant la croissance des staphylocoques, des streptocoques et de Listeria monocytogenes en particulier, et un milieu sélec-tif à l'égard des espaces pathogenes de Neisseriaceae et/ou des germes levuriformes.
6: support pour milieux de culture selon la revendication 4 , caractérisé en ce qu'il est muni d'une combinaison de milieux de culture comprennant un milieu électif à l'égard des bactéries à gram négatifs, ainsi qu'un milieu électif à l'égard des staphylocoques, et électif ou non à l'égard des streptocoques et/ou des Neisseriaceae species, et/ou des germes levuriformes, et un milieu sélectif à l'égard des entérocoques.
7: support pour milieux de culture selon la revendication 4 , caractérisé en ce qu'il est muni d'une combinaison de milieux de culture comprennant un milieu électif à l'égard des bactéries à gram négatifs, ainsi qu'un milieu électif à l'égard des staphylocoques et électif ou non à l'égard des streptocoques et/ou de Listeria monocytogenes, et un milieu sélectif à l'égard des mycoses, y compris les Can-dida et Saccharomyces species.
8: support pour milieux de culture selon une des revendi-cations 4 à 7 comprennant un grand secteur muni d'un milieu de culture enrichi ou non de sérum sanguin et/ou d'autres facteurs promoteurs de croissance bactérienne, caractérise en ce qu'il est rendu électif à l'égard des bactéries à gram négatifs par l'adjonction de clindamycine ou de lincomycine et/ou un ou plusieurs autre(s) antibio-tiques et/ou chimiothérapeutiques.
9: support pour milieux de culture selon une des revendi-cations 4 à 7 comprennant un grand secteur muni d'un milieu de culture électif à l'égard des bactéries à gram négatifs, enrichi ou non de sérum sanguin et/ou d'autres facteurs promoteurs de croissance bactérienne, et/ou une ou plusieures substances inhibant la croissance d'entéro-coques et/ou de mycoses, y compris les champignons et les Candida et Saccharomyces species, caractérisé en ce qu'il contient en plus de la clindamycine ou de la lincomycine, et/ou un macrolide, du saccharose et/ou du lactose, ou du mannitol et un colorant indicateur d'acidité.
10: support pour milieux de culture selon une des revendi cations 4 à 7 comprennant un grand secteur muni d'un milieu de culture enrichi ou non de sérum sanguin et/ou d'autres facteurs promoteurs de croissance bactérienne et/ou une ou plusieures substances inhibant la croissance de mycoses, y compris les Candida et Saccharomyces spe-cies et/ou de la L-lysine, caractérisé en ce qu'il con-tient en plus un produit sulfuré et un sel ferrique, con-venables pour la mise en évidence d'une éventuelle forma-tion d'hydroxyde de soufre, un colorant indicateur de pH, du lactose et/ou du saccharose, ou du mannitol et qu'il est rendu électif à l'égard des bactéries a gram négatifs par l'adjonction de clindamycine ou de lincomycine et/ou d'une ou plusieures autres antibiotiques, ou du cristal-violet.
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