CH686521A5

CH686521A5 - Support pour milieux de culture compartimente et milieux de culture électifs complémentaires.

Info

Publication number: CH686521A5
Application number: CH152391A
Authority: CH
Inventors: Eduard Dr Engelbrecht
Original assignee: Eduard Dr Engelbrecht
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1991-05-23
Publication date: 1996-04-15
Also published as: WO1992021748A2; WO1992021748A3; EP0606207A1; CA2087950A1

Description

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Description

Bon nombre d'analyses de microbiologie, notamment de microbiologie clinique, sont compliquées par la présence de germes d'espèces différentes, souvent en grands nombres. Quand les différentes colonies qui apparaissent alors dans la culture, ont un aspect assez identique, ou quand la croissance est très dense, la reconnaissance et l'isolement du ou des germe(s) en cause deviennent difficiles et prennent beaucoup de temps. Par conséquent, dans certains cas le(s) germe(s) en cause sont manqué(s), tandis que dans d'autres cas le diagnostic et l'antibiogramme sont obtenus trop tard pour avoir encore une utilité.

Afin d'obtenir un meilleur discernement des germes recherchés et d'améliorer ainsi l'efficacité des analyses microbiologiques, nous avons entrepris des recherches qui ont abouti dans l'élaboration d'un nouveau milieu de culture, dont les diverses variantes peuvent être utilisées seules, ou dans des combinaisons de milieux qui, par électivité, permettent de séparer les germes présents dans l'inocu-lum en catégories distinctes et du fait que chacun des milieux présente alors un nombre limité de colonies microbiennes qui, de plus, appartiennent à une catégorie déterminée, de reconnaître et d'isoler directement les germes importants.

Afin de faciliter l'examen de la culture nous avons encore conçu des boîtes dans le genre de la boîte dite de pétri, divisées en plusieurs compartiments afin de pouvoir contenir plusieurs milieux électifs complémentaires. Puis, nos recherches ont démontré que certains substances sont en mesure de diffuser à travers le plastic, polystyrène par exemple, et d'influencer le milieu contenu dans le compartiment avoisinant. Pour les combinaisons de milieux où une telle diffusion de substances pourrait gêner nous avons mis au point des boîtes à plusieurs compartiments, ayant des cloisons intérieures doublées, séparées par une fente, qui peut être fermée soit en bas au niveau du fond de la boîte (fig. 1), soit en haut (fig. 2). Nous préférons la dernière solution pour la raison qu'elle permet l'orientation de la boîte dans un appareil de remplissage automatique par l'enfilement de plaquettes tatrices orientables.

Parmi les milieux électifs il y en a qui sont convenablement appelés sélectifs pour la raison qu'ils inhibent la croissance de presque toutes les espèces de germes en faveur de quelques espèces bien déterminées. Pour l'isolement de ces dernières il suffit de ce fait d'une surface très réduite. Pour les combinaisons qui comportent un ou plusieurs de ces milieux nous avons inventé des boîtes qui ont des compartiment de dimensions différentes. Les fig. 3, 4, 5 et 6 montrent de manière non limitative quatre exemples. La boîte de la fig. 3 est de forme ronde et contient un compartiment qui occupe environ un quart de la surface. A partir de l'endroit où les deux cloisons qui la délimitent se joignent, part une cloison qui divise la partie restante de la boîte en deux parties de surfaces égales. Les compartiments peuvent être séparés par des cloisons simples, ou doublés conformément aux fig. 1 ou 2. La conception de la boîte de la fig. 4 est identique à cette différence près que la boîte est de forme carrée avec le petit compartiment situé dans un des quatre coins. La boîte de la fig. 5 est une boîte ronde divisée par une cloison de bord en bord située dans l'axe et une cloison perpendiculairement à la première. La boîte comporte ainsi un grand compartiment occupant environ la moitié de la surface, et deux petits compartiments occupant chacun environ un quart de la surface. Ici aussi, les cloisons peuvent être simples, ou doublées conformément aux fig. 1 ou 2. La fig. 6 montre une boîte basée sur la même conception à cette différence près qu'elle est de forme carrée. Dans le cas d'une boîte carrée il est évident que les cloisons peuvent aussi être situées dans les diagonales. Dans tous les exemples les cloisons ont une hauteur qui est choisie telle que les cloisons dépassent d'un millimètre au moins le niveau de la surface des milieux de culture contenus dans les compartiments, qui ont de préférence une épaisseur de quatre millimètres.

Les exemples suivants décrivent de manière non limitative comment il est possible de séparer les germes présents dans Pinoculum en plusieures catégories distinctes par une combinaison judicieusement choisie de milieux de culture électifs:

premier exemple: dans les cultures oto-rhino-la-ryngologiques, gynécologiques, urologiques et de certains pus, notamment d'origine chirurigicale, on a avantage, compte tenue de la multiplicité de germes présents dans Pinculum, de pouvoir séparer dès le début les germes à gram positifs des germes à gram négatifs et d'obtenir isolément les Neisseria et levures pathogènes, vu leur intérêt particulier. Certains des germes présents dans ces prélèvements ont besoin de sérum sanguin pour pouvoir former des colonies, tandis que pour la mise en évidence de la formation d'hémolysine par certains germes à gram positifs la présence de sang complet est de rigueur. Nos recherches nous ont alors mené à composer un jeu de trois milieux électifs contenus dans une boîte à trois compartiments:

le premier compartiment contient une gélose au sang, préparée à partir du milieu dit Columbia agar base, et enrichie avec 4 à 6 pour cent de sang dé-fibriné. Pour la rendre élective nous ajoutons de la nystatine à raison de 2 unités par millilitre pour empêcher la croissance de levures, et de la colimycine en forme de Colistine méthane sulfonate à raison de 20 unités internationales, soit 1,7 microgramme par millilitre. A cette concentration de la colimycine il n'y a que les germes à gram positifs qui poussent, à l'exception des Proteus species, reconnais-sables aux grandes colonies dont l'essaimage est inhibé, ainsi que de Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, qui se distinguent nettement par leurs colonies translucides.

Le deuxième compartiment est destiné à recevoir un milieu qui favorise non seulement élective-ment la croissance de germes à gram négatifs, mais qui permet en plus d'identifier les Haemophilus species et Neisseria species pathogènes. Puisqu'il n'existe pas de milieu qui répond à ces exigences, nous avons inventé un milieu ad hoc, qui

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contient approxativement pour un litre 12 gram de gélose, 4 gram de chlorure de sodium, 10 gram de peptone, 2 gram d'extrait de viande, 2 gram d'extrait de levure, 10 gram de saccharose, 2 unités internationales de nystatine et 15 ml d'une solution de rouge neutre à 0,25 pour cent. Après stérilisation on y ajoute encore 10 ml d'isovitalex, mélange enrichissant contenant les facteurs V et X, 40 ml de sérum stérile de cheval, et de la clindamycine en forme de clindamycinephosphate à raison de 6 milligramme par litre. En plus du saccharose on peut encore l'additionner de 10 gram de lactose par litre. A la concentration donnée de la clindamycine il n'y a que les germes à gram négatif qui poussent sur ce milieu, à l'exception de certains Proprionibacterium species, qui y développent des colonies typiquement plates et petites, et d'entéro-coques, immédiatement reconnaissantes à leurs colonies petites, bombées et rouge foncé. Parmi les germes à gram négatifs, les espèces banales de Neisseria et d'Haemophilus forment des colonies rouges à cause de la transformation en acide du saccharose et, éventuellement du lactose. N'ayant pas la faculté de s'attaquer à l'un ou l'autre des ces deux sucres, les Neisseria partho-gènes développent des colonies incolores, translucides et galbées, tandis que les différents biotypes de Haemophilus influenzae forment des colonies incolores, translucides et plates. En poussant plus rapidement, les entérobactéries et les bâtonnets à gram négatifs, oxydase positifs, développent des colonies nettement plus grandes et opaques et qui sont blanches ou rouges suivant la formation ou non d'acide.

Quand on désire empêcher la croissance de Pro-prionibactérium species et d'entérocoques, on peut remplacer la clindamycine par du cristal-violet à raison de 1 millilitre d'une solution à 0,1 pour cent par litre de milieu. On peut encore incorporer un sel ferrique dans ce milieu au cas où il est souhaitable de mettre en évidende une éventuelle formation de hydroxyde de soufre.

Le troisième compartiment contient un milieu généralement appelé «gélose chocolat», préparé à partir du milieu de base gélosé selon Thayer-Martin à raison de 40 gram pour un litre. Après stérilisation on y ajoute du sang défibriné lysé à raison de 4 à 6 pour cent, puis le milieu est réchauffé à 80°C pendant 30 minutes en agitant régulièrement la bouteille. Par la suite on y ajoute encore une quantité adéquate d'un mélange enrichissant, 10 ml de VITOX par exemple, et 10 milligramme de van-comycine, 2500 unités internationales de polymyxi-ne B, ainsi que 5 milligramme de triméthoprim par litre. Ainsi composé ce milieu ne permet la croissance que de Neisseria méningitidis, Neisseria Go-norrhoeae, Candida et Saccharomyces species, Campylobacter species et Bacilus species, notamment Bacillus fusiformis, suivant la composition de l'atmosphère de la culture lors de l'incubation. Ainsi, il ne peut y avoir croissance que de Neisseria pathogènes, de Candida et Saccharomyces species et de certaines souches de Bacillus fusiformis quand l'incubation a lieu dans l'air enrichi de 5 à 7 pour cent de dioxyde de carbone, tandis que l'on n'obtient la croissance que de levures et de bacilles anaérobies, y compris Campylobacter species, quand la culture est incubée en atmosphère anaérobie.

Ces trois milieux, contenus dans une même boîte, permettent d'identifier directement dans les cultures oto-rhino-laryngologiques sur la gélose au sang à la colimycine Streptococcus pyogenes, colonies grises béta-hémolytiques, Streptococcus pneumoniae, colonies translucides alpha-hémolytiques, Neisseria méningitidis et Neisseria gonorrhoeae, colonies galbées, dépolies, et les Corynebacterie species pathogènes, colonies blanchâtres, généralment plus ou moins nettement béta-hémolytiques, ainsi que les Staphyloccus species, en particulier Sta-phyloccus aureus, assez grandes colonies béta-hé-molytiques plates et grises, ou galbées et jaunâtres;

- sur le milieu au sérum à la clindamycine on reconnaît Neisseria méningitidis et Neisseria gonorrhoeae, colonies galbées, translucides et incolores, Haemophilus influenzae, colonies plates, transparantes et incolores, ainsi que Haemophilus para-in-fluenzae, colonies plates, transparantes et rouges, tandis que les Neisseria banales se présentent sous forme de colonies galbées, translucides et rouges;

- sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies de Neisseria méningitidis et Neisseria gonorrhoeae, transparantes, de levures, blanches et échancrées, ainsi que de Bacillus fusiformis, opaques et brunâtres.

Inoculés avec des prélèvement gynécologiques ou urologiques on peut directement identifier sur la gélose au sang à la colimycine Streptococcus aga-lacteae, colonies blanchâtres, béta-hémolytiques, Streprococcus faecalis, colonies galbées, grises, non hémolytiques, Gardnerella vaginalis, petites colonies plates, translucides, hémolytiques ou non, suivant l'origine humain ou ovin du sang incorporé dans le milieu, les Corynebacterium species, y compris Listeria monocytogenes, colonies blanches ou grisâtres, généralement plus ou moins nettement hémolytiques quand il, s'agit d'espèces pathogènes, les Neisseria pathogènes, colonies galbées, translucides, et les Staphylococcus species, notamment Staphylococcus aureus, assez grandes colonies béta-hémolytiques, plates et grises, ou galbées et jaunâtres, tandis que les Lactobacillus species et Proprionibacterium species se présentent sous forme de petites colonies généralement alphahémolyti-ques, et les Proteus species, rarement présentes, de grandes colonies blanches grisâtres:

- sur le milieu au sérum à la clindamycine on reconnaît les colonies des bâtonnets à gram négatifs, grandes, galbées, et rouge lorsqu'ils sont capables de former de l'acide à partir du saccharose et/ou du lactose quand ce dernier sucre a été incorporé dans le milieu, ou blanchâtres en absence de formation d'acide, des Neisseria species pathogènes, galbées, incolores et translucides, de Streptococcus faecalis, petites, bombées et rouge foncé et bien que peu fréquemment, de Proprionibacterium species, petites, plates et rouge ou blanchâtres et translucides;

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- sur le milieu chocolat-VCT on peut trouver les colonies des Neisseria species pathogènes, Neisseria gonorrhoeae en particulier, galbées et transparantes, ainsi que de levures, notamment Candida albicans, blanches et échancrées.

Les germes recherchés sont ainsi répartis sur les trois milieux en catégories distinctes et, de par les aspects que présentent leurs colonies sur le milieu particulier, y sont directement identifiables.

Sans modifier l'électivité des milieux on peut remplacer dans la gélose au sang la colimycine par de la polymyxine B à raison de 2500 unités internationales par litre, dans la gélose au sérum la clindamycine par de la lincomycine à raison de 1 milligramme par litre, ou par un millilitre par litre d'une solution à 0,1 pour cent de crystal-violet, et dans le milieu chocolat-VCT le triméthoprim par de la néo-mycine à raison de 2 mg par litre.

Exceptionnellement certaines Pseudomonas species résistantes à la colimycine peuvent se développer sur la gélose la colimycine. Toutefois, elles produisent de l'oxydase, ce qui permet de les diffé-rentier des Proteus species, qui sont oxydase négatives, en étalant un peu d'une colonie sur un morceau de papier imbibé du réactif ad hoc.

Si l'on désire empêcher les membres colimycine-résistants de ces deux familles de se développer sur ce milieu, il suffit d'ajouter en plus de la colimycine de l'acide nalidixique à raison de 15 mg par litre. On n'obtiendra alors que la croissance de germes à gram positifs dans ce compartiment.

Deuxième exemple: les germes généralement responsables d'infections urinaires sont les Entero-bacteriaceae, les Pseudomonas species, les différentes espèces de staphylocoque et les entéroco-ques. Dans des cas particuliers on cherche, outre les germes cités, le Neisseria gonorrhoeae, les Candida species et les levures pathogènes. Il existe plusieurs milieux pour l'isolement des Enterobac-teriaceae et des Pseudomonas species. Toutefois, nos recherches ont montré que le milieu a la clindamycine de l'exemple précédent, avec ou sans sérum, convient particulièrement bien ceci d'autant plus qu'on peut lui additionner d'un sel ferrique pour la mise en évidence de formation de hydroxy-de de soufre, ce qui permet d'identifier directement Proteus vulgaris et Proteus mirabilis.

Puisque l'acidification ou non des colonies par la dégradation du seul lactose, mise en évidence par le virement de l'indicateur, est un critère généralement admis, il suffit d'incorporer uniquement du lactose à raison de 10 gram par litre et de faire abstention du saccharose. Pour la mise en évidence d'une éventuelle formation de hydroxyde de soufre on peut ajouter 1 gram de citrate de fer ainsi que 6 gram de thiosulphate de sodium par litre, et ajuster le pH à 7,2. La nystatine n'est supprimée et le sérum n'est ajouté que si le milieu devra également servir à la mise en évidence des levures et Candida species, et de Neisseria gonorrhoeae, respectivement. L'avantage de la clindamycine par rapport au méthylviolet est que la première ne gène en rien la croissance desdits germes. Ce milieu est alors coulé dans le grand compartiment d'une boîte comportant un grand et deux petits compartiments. L'un des deux petits compartiments reçoit soit le milieu dit mannitol-salt agar destiné à mettre en évidence les Staphylococcus species, soit la gélose au sang à la colimycine du premier exemple, avec de l'acide nalidixique et de la nystatine ou de Pamphotericine-B, afin de mettre en évidence non seulement les Staphylococcus species, mais aussi les Streptococcus species, y compris les béta-hémolytiques et les entérocoques, ainsi que les Neisseria pathogènes. Quand ce compartiment est muni du manitol-salt agar, le deuxième compartiment reçoit le milieu selon Slanetz et Bartley, qui permet de mettre sélectivement en évidence les entérocoques. Par contre, si le premier petit compartiment reçoit la gélose au sang citée, le deuxième petit compartiment est rempli d'un milieu pour l'isolement de levures et de Candida species, le milieu de Sabouraud, par exemple, ou le milieu chocolat-VCT du premier exemple.

On a ainsi dans la même boîte trois milieux qui permettent d'isoler séparément soit les bâtonnets à gram négatifs et les levures et Candida species, les Staphylococcus species, et les entérocoques, respectivement, soit les bâtonnets gram négatifs, les Neisseria pathogènes et les cocci à gram positifs, y compris les entérocoques et les streptocoques béta-hémolytiques, et les levures et Candida species, respectivement.

Les deux combinaisons préférées sont:

1. dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comprennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH, rouge de phénol par exemple, avec ou sans sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu selon Slanetz et Bartley, et le mannitol-salt agar, respectivement;

2. dans le grand compartiment le milieu à la clindamycine, comprennant lactose, sel ferrique, thiosulphate de sodium, indicateur de pH, rouge de phénol par exemple, et sérum sanguin, et dans les petits compartiments le milieu dit chocolat-VCT à la vancomycine, colimycine et triméthoprim, additionné de nystatine, et la gélose au sang à la colimycine et l'acide nalidixique, également additionnée de nystatine, respectivement. Cette dernière combinaison peut également servir aux cultures urologiques et gynécologiques.

Les germes responsables de troubles de la voie digestive se comptent parmi les bâtonnets à gram négatifs, oxydase négatifs, soit les salmonelles, shi-gelles, Yersinia entérocolitica, Yersinia pseudotu-berculosis, et les souches entérotoxiques et entéro-pathogènes d'Escherichia coli, les bâtonnets à gram nésatifs, oxydase positifs, soit Aeromonas hy-drophila, Pleisiomonas shigelloides, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio choiera et Vibrio parallaemolyti-cus, plusieures Candida species, notamment Candida albicans, plusieures espèces de moisissures, ainsi que les espèces de staphylocoques productrices d'alpha-toxine. Parce qu'aucun des bâtonnets à gram négatifs cités n'est en mesure de former de l'acide à partir du lactose pendant les premières 24 heures d'incubation, ledit sucre est généralement incorpore dans les milieux destinés à isoler les bâtonnets à gram négatifs cités. Afin d'empêcher la

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croissance de germes à gram positifs, on les additionne de sels biliaires et de méthyl-violet (violet de gentiane). Toutefois, certains des bâtonnets à gram négatifs, notamment les shigelles, y sont également sensibles. Or, ces derniers se développent aussi bien que les autres germes à gram négatifs sur le milieu que nous avons inventé.

Dans l'exemple précédent l'éventuelle croissance de l'entérocoque sur notre milieu à la clyndamycine constitue un avantage: l'apect typique de ses colonies permet d'identifier immédiatement ce pathogène des voies urinaires. Par contre, sa mise en évidence dans les cultures de selles n'a aucun intérêt du fait qu'il appartient à la flore physiologique de l'intestin. Nous avons alors testé différents antibiotiques et chimiothérapeutiques susceptibles d'en empêcher électivement la croissance, pour constater qu'il suffit d'additionner le milieu d'un macrolide, de l'érythromycine à raison de 4 milligrammes par litre par exemple. Adapté aux cultures de selles, notre milieu contient donc, outre la clindamycine ou la lin-comycine, du lactose, de l'érythromycine ou de la rovamycine, et un sel ferrique, ce dernier pour que les colonies de salmonelles se font remarquer par leur noircissement dû à l'interaction entre le fer et le hydroxyde de soufre formé par la majorité des espèces de salmonelles. Ce milieu est coulé dans le grand compartiment de la boîte de pétri divisé en un grand et deux petits compartiments. Les deux petits reçoivent respectivement le mannitol-salt agar, pour la mise en évidence de staphylocoques mannitol positifs, et le milieu selon Sabouraud, ce dernier rendu électif à l'égard des mycoses, Candida compris, par l'adjonction d'un ou plusieures produits à action antibactérienne. On a ainsi un ensemble de milieux qui permet d'isoler et d'identifier les germes responsables de troubles de la voie digestive.

Les exemples donnés ne sont pas limitatifs: les poids et les volumes mentionnés peuvent varier suivant l'origine des produits, le degré d'électivité et l'intensité de réaction que l'on désire obtenir. Ainsi, pour les daltoniens il peut être utile de choisir le bleu de chine comme indicateur d'acidité. Aussi, la conception de la doublure des cloisons est applicable à tous les supports pour milieux de culture compartimentés et les supports peuvent avoir un nombre plus grand de secteurs.

Claims

Revendications

1. Support pour milieux de culture microbiologique, caractérisé en ce que sa surface est divisée en plusieurs secteurs délimités par des bords droits et qu'il y a une fente entre les secteurs adjacents.

2. Support pour milieux de culture microbiologique, consistant d'une boîte de pétri, caractérisé en ce que sa surface est divisée en plusieurs secteurs par deux cloisons droites, s'élevant depuis le fond de la boîte sans atteindre le niveau supérieur du bord de ceci, dont l'une traverse la boîte au milieu, ou près du milieu et l'autre s'étend de la première perpendiculairement.

3. Support pour milieux de culture microbiologique, consistant d'une boîte de pétri, caractérisé en ce que sa surface est divisée en plusieurs secteurs par trois cloisons droites, s'élevant depuis le fond de la boîte sans atteindre le niveau supérieur du bord de ceci, dont deux qui s'étendent du bord de la boîte pour se rejoindre perpendiculairement au milieu de la boîte et une troisième qui s'étend entre leur jonction et le bord opposé de la boîte, de manière à diviser le reste de la surface au milieu en deux grands secteurs.

4. Support pour milieux de cultura microbiologique, consistant d'une boîte de pétri carrée, caractérisé en ce que sa surface est divisée en plusieurs secteurs par trois cloisons droites, qui s'élevent depuis le fond de la boîte sans atteindre le niveau supérieur du bord de ceci, dont l'une traverse la boîte au milieu, ou près du milieu et les deux autres s'étendent chacune perpendiculairement de la première à environ un tiers de sa longueur.

5. Support selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est muni de cloisons droites doublées, bordant des fentes entre les secteurs.

6. Support pour milieux de culture microbiologique, consistant d'une boîte de pétri, caractérisé en ce que sa surface est divisée en deux secteurs par une cloison droite doublée, bordant une fente entre les deux secteurs et qui s'élève depuis le fond de la boîte sans atteindre le niveau supérieur du bord de cette dernière.

7 Support selon une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que les faces opposées des cloisons doublées sont pontées dans le sens de la longueur, de façon à ce que la fente soit close.

8. Utilisation du support selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les secteurs sont munis de milieux de culture électifs et/ou sélectifs complémentaires, destinés à obtenir la séparation en des groupes distinctes des différentes sortes de germes éventuellement présentes dans l'inoculum.

9. Utilisation du support selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'électivité ou la sélectivité d'au moins un des milieux de culture est obtenu par l'adjonction d'une ou plusieurs antibiotique(s) et/ ou chimiothérapeutique(s) et/ou autre(s) substance^) inhibitrice(s) appropriées.

10. Utilisation du support selon la revendication 8, caractérisée en ce que le, ou un des grand(s) secteur(s) est muni d'un milieu enrichi ou non de sérum sanguin et contenant du saccharose et/ou du lactose, ainsi qu'un colorant indicateur de pH, additionné ou non de composants permettant de déceler les colonies de germes capables de produire de PH2S et qui est rendu électif à l'égard des germes à gram négatifs par l'adjonction d'une ou plusieurs antibiotique(s) et/ou chimiothérapeuti-que(s) et/ou autre(s) substance(s) inhibitrice(s) ap-propriée(s).

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