CA2139431A1 - Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht6), acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisations - Google Patents

Abstract

2139431 9401556 PCTABS00165 La présente invention concerne de nouveaux polypeptides désignés 5HT6 ayant une activité de récepteur sérotoninergique, le matériel génétique permettant leur expression, toute cellule recombinante exprimant ces polypeptides, et leur utilisation.

Description

-` W O 94/01~6 213~3431. PCT/F~93/00651 POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR SEROTONINERGIQUE (5HT6) AC~DES NUCLEIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATIONS

. _ La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et le matériel 5 génétique permettant leur expression. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique.
La sérotonine est un neuromodulateur capable d'induire et de moduler une grande varihé de comportements tels que le sommeil, l'appetit, la locomotion, l'activité sexuelle ou encore la contMction vasculaire. Il est adrnis que l'activité de la 10 sérotonine est médiée par son intcraction avec des récepteurs, désignés récepteurs sérotoninergiques ou récepteurs 5-HT (pour S-hydroxytr,vptamine). Des études de biologie moléculaire ainsi que des études pharmacologiques ont révélé qu'il existait un grand nombre de sous-types de récepteurs 5-HT. Les récepteurs 5-HT qui ont été
décrits jusqu`à aujourd'hui appartiennent soit à la famille des récepteurs liés à des 1~ canaux ioniques (récepteurs S-HT33, soit à la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G et qui possèdent sept domaines transrnembranaires. Par ailleurs, l'analyse des séquences d'acides aminés a montre que les récepteurs S-HT
interagissant avec des protéines G peuvent être sous-divisés en deux groupes distincts: Les récepteurs 5HT1, comprenant les sous-types mammifères 5HT1A, 20 5HT1B et SHTlD ainsi que trois récepteurs 5HT de drosophile; et les récepteurs SHT2 comprenant les sous-types 5HT2 et 5HTlC.

Ces récepteurs ne sont sans doute pas les seuls récepteurs 5HT existant, dans la mesure où des études pharmacologiques ont revéié d'autres sous-types tels que les recepteurs 5HT4 ainsi que certains récepteurs apparentés au sous-type 5HT1 25 (récepteurs "5HT1 l~ce"?. De plus, des études supplémentaires de biologie moléculaire ont également révélé des hétérogénéités au sein des sous-types 5HTlBtlD.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveawc - polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Bien qu'appartenant à
30 la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G, ces nouveaux polypeptides diffèrent des récepteurs sérotoninergiques déjà décrits (5HT1, SHT2, 5HT3 et 5HT4) du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique.
P!us particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caractérisation de ces WO 94/015~6 X~;~9431 PCI/FR93/00651 ~ ~ ~

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nouveaux polypeptides, désignés 5HT6, ainsi que du matériel génétique perrnettant leur expr2~ssion ou leur identification.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypep~ides comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 1 ou d'un dérivé de 5 celle-ci.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ II) n 1. Par modification de nature génétique et/ou chimique, onpeut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un 10 ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharrnacocinétiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés 1~ résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimèrescomportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêrnité. Le termedérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide SEQ ID n 1, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une acti~ité de même type. De tels polypeptides 20 homologues peuvent être obtenus par des expériences d'hybridation comme décrit dans les exemples (Cf SEQ ID n 4).

Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont des polypeptides possédant la capacité de lier la sérotonine. Encore plus préférentiellement, il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Toujours selon un25 mode préféré, les polypeptides de l'invention sont susceptibles d'être reconnus par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique complète SEQ ID n 1.
Un mode de réalisation pa~ticulier de l'invention est représenté par le - polypeptide 5HT6 comprenant toute la séquence peptidique SEQ ID n 1. Comme indiqué dans les exemples, ce ~olypeptide peut être exprimé dans différents types 30 cellulaires pour former un récepteur sérotoninergique fonctionnel.

Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par syn~èse WO 9~/01556 ;~'39~31 pcr/FR93/oo6sl i chimique, sur la base des séquences SEQ ID n 1 ou 4 en utilisant les techniquesconnues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont désignés par polypeptides 5HT6.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide SHT6. Plus préférent;ellement, il s'agit d'une sé~uence . . . ~
cholsle parml:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SE~Q ID n 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et, (c) les séquences dérivees des séquences (a) et (b) en raison de la dégénércscence du code génétique.

Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s`agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d`ADN ~banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie molé~ulaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des phosphoramidites, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.

2~ Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour la production des polypeptides SHT6 tels que définis précédemment. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux pennettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A
30 cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hote choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être WO 94/01556 ~ 31. PCI/FR93/00651 préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides 5HT6 de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer lescellules COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer pluslo particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.

Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences , antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes permettant là détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de récepteurs sérotoninergiques dans des échantillons biologiques et la mise en évidence d'anomalies génétiques (polymorphisme, mutations) ou d'expressions aberrantes.
: ~ L'inhibition de l'expression de certains gènes par des oligonucléotides -~ 20 antisens s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les oligonucléotides- antisens sont des oliogonucléotides de petite taille, - complémentaire du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider ; spécifiquement avec l'AR~m~transcrit, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les oligonucléotides antisens capables d'inhiber au moins 2~ partiellement la production de polypeptides 5HT6 tels que définis precédemment. De tels oligonucléotides peuvent être constitués par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de sequences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides de l'invention.
De tels oligonucléotides peuvent être obtenus à partir de la séquence SEQ ID n 1 ou 4, par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique.

Comme indiqué ci-dessus, I'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides 5HT6 de O 94/01556 pcr/FR93/oo6sl X~g~
.

I'invention, ou avec les ARNm correspondant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comrne outil de diagnostic, pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT6, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques(mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Compte tenu des , 5 activités multiples de la sérotonine, les sondes de l'invention peuvent ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT6. Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT6 tels que définis précédemment, à partir d'autres sources 0 cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent comporter jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n 1 ou 4 ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples.

Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées capables d'exprimer à leur surface un polypeptide SHT6 tel que défini ci-avant. Ces cellules peuvent être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture desdites cellules dans des conditions d'expression de ladite séquence.
Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma 30 ssp. Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivsntes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour mesurer la capacité de différentes molécules à se comporter comme ligand ou comme rnodulateur de l'activité des polypeptides de l'invention. Plus particulièrement, elles peuvent ainsi être utilisées dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de WO 94/015~6 2~L39431. PCl/FR93/00651 ligands ou de modulateur de l'activité des polypeptides de l'invention, et, pluspréférentiellement, d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine.
IJn autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence etJou d'isolement de ligands des polypeptides 5HT6 de l'invention, selon lequel on s réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellen ent non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite ~o molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine pour les polypeptides 5HI'6 i Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou - d'isolement de modulateurs des polypeptides 5HT6 de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une rnolécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non^identifiées, avec une cellule recombinée telle que' 20 décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de I'invention et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
sur ledit polypeptide de l'invention.

2~ Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels li~gands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs SHT6.

L'invention concerne également tout médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide 5HT6 de l'in~ention. Préférentiellement la molé^ule est un li~and ou un modulateur identifié
et/ou isolé selon le procédé décrit précédemment.

- ` WO 9~/0l~56 ; . PCr/FR93/006~1 ` ~i3~ 3~

D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures SEO_ID n 1: Séquences nucléotidique et peptidique du récepteur 5HT6 murin.
L'ADNc de 1558 pb a été séquencé sur les 2 brins depuis le site EcoRI jusqu'au site XhoI. Les 92 premiers nucléotides ne sont pas représentés.
Fi~ure 2: Pourcentages d'homologie de séquence peptidique entre le récepteur 5HT6 présenté SEQ ID n 1 et d'autres récepteurs de la famille des récepteurs couplés à des protéines G. Les homologies ont été calculées sur les séquences conservées: le domaine transmembranaire et ses boucles de connection.
Figure 3: Courbe de saturation du ~l25I]-LSD aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT6. Les membranes ont été incubées avec des concentrations de ligand allant de 50 pM à 1,25 nM, avec ou sans 10 ~ de 5HT. Laliaison spécifique est représentée. L'encart représente l'analyse en Scatchard des résultats.
Figure 4: Mise en évidence de séquences homologues par PCR sur des ARN totaux -(1 ilg) de différents tissus.
Table 1: Profil pharmacologique du récepteur 5HT6. Les résultats correspondent àdes expériences de compétition pour la liaison du [125I]-LSD aux membranes des . 20 cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT6 de manière transitoire. Les valeurs d'IC50 (correspondant à la concentration en ligand nécessaire pour déplacer 50 ~o du [125I]-LSD lié) ont été calculées expérimentalement et converties en Ki selon l'équation suivante: Ki = IC50/(1 + ClKd) dans laquelle C est la concentration en ~125I~-LSD (150 pM) et Kd est la constante de dissociation du ~125I]-LSD (980 pM).
2s Les nombres entre parenthèses correspondent au nombre d'expériences indépendantes réalisées, chaque point étant réalisé en triple.

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wO 94/015~6 21394:~1. pcr/FR93/oo65l Techniques généra~es de clona~e Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de ch]orure de césium, l`électropho~èse sur gels d`agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborato~, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction dès extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proeminentes est effectuée par un - traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides syn~hétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science ~Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.

. , W O 94/01556 2~39~ PC~r/FR93/00651 La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence normales sont généralement les suivantes: hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à
65C; lavage: 0,5 x SSC à 65C.
1. IsQ!~ment du récepteur ~HT6 Les comparaisons de séquences entre les différents récepteurs sérotoninergiques conrlus font apparaître une certaine conservation, particulièrement dans certaines régions transmembranaires potentielles telles que les domaines IIl et IV. Dans le but de mettre en évidence et d'isoler un nouYeau récepteur, les inYenteurs de la présente demande ont utilisé une sonde correspondant à un fragment génomique du récepteur 5HTlB~i [Maroteaux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 3020]
pour cribler une banque d'~DN de cerveau de rat. Plus particulièrement, la sonde1~ utilisée correspond au fragment SacI-BglII de 2,3 kb du récepteur 5HT1BB, préalablement marqué par "random priming" lFeinberg et Vogelstein, Analytical Biochemistry ~ (1984) 6]. Cette sonde a été utilisée pour cribler une banque d'ADNc de cerveau de rat construite dans le phage UniZap (Stratagène), dans des conditio~s de stringence faible (formamide 30 %, 5 x SSC, 42C). Parmi les phages positifs obtenus, l'un d'entre-eux, hybridant faiblement à la sonde a été isolé. Ce phage, dénommé ASR et porté par le plasmide pSR, contenait un insert de 1,6 kb ,' environ qui a ensuite été introduit dans le plasmide Bluescript. La sequence de ce - fragment a été dé~erminée sur les 2 brins en utilisant la technique des dideoxynucléotides au moyen d'oligonucléotides synthétiques.
- 2s La séquence ainsi obtenue est présentée sur la SEQ ID n 1. Elle montre que l'ADNc isolé porte une phase de lecture ouverte de 367 acides aminés. Par ailleurs, l'analyse d'hydrophobicité montre que cette protéine porte sept domaines hydrophobes, une particularité rencontrée chez les membres de la famille des récepteurs couplés à des protéines G. L'extrémité N-terminale contient par ailleurs ~
sites de N-glycosylation, et le domaine cytoplasmique présumé contient les sitesconsensus de phosphorylation par les protéines kinases C et A.

WO 94/01~6 PCr/FR93/00651 , Z1394;~,~

2. Etude d'homolo~ies de séquence La séquence du récepteur 5HT6 isolé ci-dessus a été comparée avec les séquences des récepteurs couplés à des protéines G suivants: S31, 5HT1BB, 5HTlDa, 5HTlA, 5HT-dro2A, 5HT-drol, 5HTlC et 5HT2. Ces expériences ont 5 révélé une certaine homologie dans le domaine transmembranaire potentiel et dans les boucles de connection, mais pas dans les régions terminales ni dans là troisième boucle cytoplasmique. La figure 2 donne les ~o d'homologie au niveau des régionsconservées.
Comme il ressort de cette figure, l'homolgie, au niveau des régions 10 conservées, avec les récepteurs connus est faible, le meilleur résultat étant obtenu avec les récepteurs sérotoninergiques 5HTlBJ3 et SHTlDa (54 % d'homologie), et avec le récepteur S31 qui n'est pas encore caractérisé.

3. Expression transitoire du récepteur 5HT6 dans les c~llules Cos-7 et caractérisation pharmacologique ~ Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 1 a été inséré dans un vecteur d'expression eucaryote, qui a été utilisé pour transfecter des cellules Cos-7. Les membranes des cellules transfectées obtenues ont ensuite été preparées et testées pour . ~ leur capacité à lier certains ligands sérotoninergiques marqués.
L'ADNc de 1,6 kb codant pour le récepteur 5HT6 a été isolé à partir du plasmide pSR~ sous forrne d'un fragrnent EcoRI-XhoI, puis inséré aux sites correspondants du vecteur p513. Le vecteur pS13 dérive du vecteur pSG5 [Green etal., Nucl. Acids Res. 1 (1988) 369] par addition d'un multisite de clonage. Le vecteur recombinant ainsi obtenu désigné p513SR a ensuite été utilisé (20 ~g parplaque de 10 cm) pour transfecter les cellules Cos-7 en présence de phosphate decalcium.
48 heures après la transfection, les cellules recombinantes sont récoltées et les membranes sont préparées selon la technique decrite par Amlaiky et Caron [J. Biol. Chem. ~Q (1985) 1983]. Des expériences de liaison à saturation et de compétition ont ensuite été réalisées sur ces membranes en présence des ligands radiomarqués suivants: [125I]-LSD; [l25I]-cyanopindolol; [3H~-8-oH-DPAT et [3H]-spiperone. Pour cela, les échantillons de membrane (10-20 ~g de protéines) ont été
incubés 10 minutes à 37C en présence du ligand dans un volume final de 250 ul de - WO 94/01556 PCr/FR93/00651 2~3~31 tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4~. La réaction est ensuite stopée par filtration sous vide sur filtres en fibre de verre Whatman GF/C, et rinçage 4 fois avec 4 ml de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4). La liaison non-spécifique a été déterminée en présence de 10 IlM de 5HT. La radioactivité a été mesurée avec un compteur y.

Les résultats obtenus montrent que, bien que le [125I]-cyanopindolol; le ~3HJ-8-oH-DPAT et le 13H]-spiperone ne lient pas les membranes préparées, le ~125I~-LSD présente un site de liaison saturable avec un Kd = 980 pM et un Bmax =
2,2 pmoVmg de protéines membranaires (figure 3). Dans une exprérience contrôle, il a par ailleurs été montré que le [125I]-LSD ne liait pas les cellules Cos-7 transfectées lo par le plasmide p513.
Pour déterminer le profil pharmacologique de ce récepteur, le [l2~I]-LSD lié
aux membranes a été déplacé en présence de différentes drogues sérotoninergiques(table 1). Ces différentes drogues montrent l'ordre d'efficacité de déplacement suivant: méthylsergide > bufotenine > surnatriptan > 5HT (table 1). La kétansérine, le ~) cyanopindolol et le 5-CT possèdent une faible affinité, tant dis que la i norépinéphrine est inactive.

4. ~:xpression du ~écepteur 5HT6 dans lçs cellules l~IH-3T3 et étude pharrnacolo~ique L'ADNc cloné dans l'exemple 1 a également été exprimé dans les cellules NIH-3T3, qui n'expriment aucun récepteur sérotoninergique de manière endogène.
Pour cela, le vecteur d'expression recombinant décrit en 3. ci-dessus a été utilisé. Il a été introduit (20 ~g par plaque de 10 cm) dans les cellules NIH-3T3 par transfection en présence de phosphate de calcium, en même temps que le vecteur pRSVnéo [Gorman et al., Science 221 (1983) 551], portant le gène de résistance au G418 (1 ~g par plaque de 10 cm). Les clones transformants ont été sélectionnés en présence de 0,5 mg de G418. Les clones isolés ont ensuite été amplifiés et les RNA totaux de ces clones ont été préparés et analysés en Northern Blot pour l'expression d'ARNm du- 5HT6. Un clones a ainsi été sélectionné, SR4, exprimant des niveaux élevés d'ARNm du 5HT6.

Les membranes des cellules de ce clone ont ensuite ,~té préparées et testées dans les conditions décrites ci-dessus pour leur capacité à lier certains ligands W0 94/0l-~ZS6 . ! i ~ PCr/FR93/00651 2~3943i.

sérotoninergiques marqués, témoignan~ de la présence de récepteurs 5HT6 fonctionnels à leur surface.

5. Recherche de séquences homologues dans d'autres tissus La séquence nucléotidique SEQ ID n 1 a ensuite été utilisée pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus. Pour cela, deux technique~
ont été utilisées:
- la PCR
- l'hybridation in situ.

Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homologues sont les 0 suivants d'origine murine: cerveau, cervelet, rein, foie, moelle épinière, rate, poumon, intestin et coeur.

5.1. Recherche par PCR
Pour la recherche par PCR, les sondes suivantes ont été utilisées:
Sonde (i): SEQ ID n 2 1~ Sonde (ii): SEQ ID n 3 La sonde (i) correspond à la position 1174 sur la SEQ ID n 1 et la sonde (ii) à la position 1394.
Les AR~ totaux ~nt été préparés à partir des différents tissus étudiés, en utilisant la technique décrite par Cathala et al. (DNA 2(4~ (lg83)). 1 ~g de ces ARN a été soumis à une transcription inverse en présence de 200 unités de transcriptase inverse MMLV et de 300 ng de la sonde (i~, pendant 1 heure à 37C. La moitié du " produit de cette réaction a ensuite été amplifiée (20 cycles) en présence de 5 unités de la polymérase Taq (Cetus) et de 500 ng des sondes (i) et ~ii). Les produits a nsi obtenus ont ensuite été transférés sur filtres de nitro-cellulose et hybridés dans les conditions de stringence élevée suivantes: 42C, dans un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6,5) contenant 50 ~o de formamide, 5 x SSC, 1 x Denhardt's, 0,1% de SDS et 100 ~g/ml d'ARNt. Les lavages ont été effectués à 60C dans un tampon 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.

wO 94/01~6PCr/FR93/0065 1 2~3943~

Cette étude a permis de mettre en évidence des fragments d'ADN specifiques homologues dans la moelle epinière et le cerveau (figure 4).
5.2. Recherche par hybridation in si~u Les experiences d'hybridation in sin~ ont été réalisées sur des sections 5 cryostatees de cerveau de rat adulte ~S semaines environ) selon la technique decrite par Hafen et al. [EMBO J. 2 (1983) 617]. La sonde utilisée pour ces experiences est un ARN simple brin obtenu par transcription en présence de polymérase T7, de ~35S]-CTP en utilisant le plasmide PSR comme matnce.
Cette étude a permis de mettre en évidence des séquences homologues selon 10 I'invention dans les couches CA1, CA2 et CA3 de l'hippocarnpe. Une experiencecontrole réalisée dans les mêmes conditions avec différentes sondes d'ARN de même longueur mais non specifique des récepteurs de l'invention n'a révélé aucun signal positif.

6. Isolement du~ce~teur humain 1~Selon la méthodologie décrite en 5. ci-dessus, le récepteur 6HT6 humain a été cloné.
Pour cela, une banque d'ADN génomique humain a été préparée à partir de placenta, par digestion partielle par l'enzyme Mbol, séparation sur gradients de sels, et sous clonage dans le vecteur Lamda GEM 12 linéarise par BarnHI (bacterie hôte:TAP
90)-La banque ainsi obtenue a ensuite été criblée en utilisant comme sonde le fragment EcoRI-XhoI de 1,6 kb décrit dans l'exemple 3., marque selon la technique de random priming. Les fragments de DNA qui hybrident avec cette sonde ont été isolés, sous clonés dans un plasmide Bluescript, amplifiés, puis séquencés dans les deux sens selon la technique dideoxynucleotide. L'arnplification a été réalisée par la technique PCR: 20 cycles en présence de Thermus aquaticus polymerase(2,5 unités; Cetus) etd'oligonucléotides I (SEQ ID n 5) et 2 (SEQ ID n 6). Le fragment obtenu a été
digeré par les enzymes BamHl et XhoI, puis sous clones dans un vecteur d'expression P513.
La séquence obtenue est présentée sur la séquence SEQ ID n 4.

WO94/01556 PCr/FR93/006~1 , .~ ., . ;
Z~39~

Il est entendu que les même expériences peuvent être répétées en utilisant dtautres tissus et notamment des tissus d'origine humaine, et d'autres sondes. Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidene~e lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et/ou amplifiées par les techniques classiques de S biologiemoléculaire.

.
i . W 0 9~/01~6 PCT/FR93/00651 21394~

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: France ¦ (F) CODE POSTAL: 75654 ~(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveaux polypeptides ayant une activite ¦de recepteur serotoniner~ique, acides nucleiques codant pour ces ,15 polypeptides et utilisations.
!( iii, NOMBRE DE SEQUENCES: 6 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1557 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc .3~
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Souris (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 310.. 1410 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Gene recepteur 5HT6 - souris"
'. .
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Asp Phe Leu Asn Ala Ser Asp Gln Asn Leu Thr Ser WO 94/01~56 , X~39431. PCr/FR93/00651 ! .

Glu Glu Leu Leu Asn Arg Met Pro Ser Lys Ile Leu Val Ser Leu Thr CTG TCT GGG CTG GCA TTG ATG ACA ACC ACC ATC AAC TCC CTC GTG ATC 4~4 Leu Ser Gly Leu Ala Leu Met Thr Thr Thr Ile Asn Ser Leu Val Ile Ala Ala Ile Ile Val Thr Arg Lys Leu His His Pro Ala Asn Tyr Leu 50 . 55 60 j 15 ATT TGT TCC TTG GCA GTT ACA GAT TTT CTT GTA GCT GTC CTG GTG ATG 540 Ile Cys Ser Leu Ala Val Thr Asp Phe.Leu Val Ala Val Leu Val Met ' 65 70 75 i CCC TTC AGT ATT GTG TAC ATT GTG AGA GAG AGC TGG ATT ATG GGA CAA 588 i 20 Pro Phe Ser Ile Val Tyr Ile Val Arg Glu Ser Trp Ile Met Gly Gln Val Leu Cys Asp Ile Trp Leu Ser Val Asp Ile Ile Cys Cys Thr Cys Ser Ile Leu His Leu Ser Ala Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Ile Thr Asp Ala Val Glu Tyr Ala Arg Lys Arg Thr Pro Arg His Ala Gly 130 135 , 140 3~ ATC ATG ATC ACG ATC GTG TGG GTT ATA TCT GTG TTC ATC TCT ATG CCT 780 Ile Met Ile Thr Ile Val Trp Val Ile Ser Val Phe Ile Ser Met Pro : 40 Pro Leu Phe Trp Arg His Gln Gly Thr Ser Arg Asp Asp Glu Cys Val j ATC AAA CAT GAC CAC ATT GTT TCC ACA ATT ~AC TCC ACG TTT GGA GCT 876 Ile Lys His Asp His Ile Val Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Phe Gly Ala 175 . 180 185 , TTC TAC ATC CCG CTT GTA TTG ATA TTG ATC CTC TAC TAC AAA ATA TAC 924 ~;
! Phe Tyr Ile Pro Leu Val Leu Ile Leu Ile Leu Tyr Tyr Lys Ile Tyr 1gO 195 200 205 , ` AGA GCA GCA AGG ACA CTG TAC CAC AAG AGA CAA GCG AGT CGG ATG ATA 972 Arg Ala Ala Arg Thr Leu Tyr His Lys Arg Gln Ala Ser Arg Met Ile Lys Glu Glu Leu Asn Gly Gln Val Phe Leu Glu Ser Gly Glu Lys Ser 60 Ile Lys Leu Val Ser Thr Ser Tyr Met Leu Glu Lys Ser Leu Ser Asp ~ WO 94/015~6 2139~3~. PCT/FR93tO06~ 1 I

1 ~
I

Pro Ser Thr Asp Phe Asp Arg Ile His Ser Thr Val Lys Ser Pro Arg 25s 260 265 . TCG GAA CTG AAG CAT GAG AAA TCT TGG AGA AGA CAG AAA ATC TCA GGC 1164 5 Ser Glu Leu Lys His Glu Lys Ser Trp Arg Arg Gln Lys Ile Ser Gly Thr Arg Glu Arg Lys Ala Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ile Leu Gly Ala Phe Val Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Lys Glu Leu Val Val Asn GTC TGT GAA AAA TGT AAA AT~ TCT GAA GAA ATG TCA AAC TTT TTG GCA 1308 Val Cvs Glu Lys Cys Lys Ile Ser Glu Glu Met Ser Asn Phe Leu Ala 2~ TGG CTT GGT TAC CTG AAT TCC CTT ATA AAT CCA CTG ATT TAT ACC ATC 1356 . Trp Leu Gly Tyr Leu Asn Ser Leu Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Ile ~ 335 340 345 ; TTT AAT GAA GAC TTC AAG AAA GCT TTC CAA AAA CTT GTA CGA TGC CGA 1404 25 Phe Asn Glu Asp Phe Lys Lys Ala Phe Gln Lys Leu Val Arg Cys Arg Tyr T~FORMATIoN POUR LA SEO ID_NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE::acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ! ( i i, TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
,45 (A) ORGANISME: Sonde (i) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION POUR LA SEO Ip NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: acide nuclélque W O 94/01~56 2~ 394-31 PCT/FR93~0065l ~ !

¦ (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (v~) ORIGINE:
S (A) ORGANISME: Sonde (ii) ~xij DESCRIPTION DE 1A SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
; (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
, (A) LONGUEUR: 1101 paires de bases B) TYPE: acide nucléique ' ~C) NOMBRE DE BRINS: double ¦ ~D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
¦ ~iii) ANTI-SENS: NON
! ~ 25 (vi) ORIGINE: -~ tA) ORGANISME: Homo sapiens ¦ (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1.. 1101 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: Jproduct= "Gene recepteur 5HT6 humain"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
¦ ATG GAT TTC TTA AAT TCA TCT GAT CAA AAC TTG ACC TCA GAG GAA CTG 48 Met Asp Phe Leu Asn Ser Ser Asp Gln Asn Leu Thr Ser Glu Glu Leu Leu Asn Arg Met Pro Ser Lys Ile Leu Val Ser Leu Thr Leu Ser Gly Leu Ala Leu Met Thr Thr Thr Ile Asn Ser Leu Val Ile Ala Ala Ile 50 Ile Val Thr Arg Lys Leu His His Pro Ala Asn Tyr Leu Ile Cys Ser CTT GCA GTC ACA GAT TTT CTT GTG GCT GTC CTG GTG ATG CCC TTC AGC 24 b Leu Ala Val Thr Asp Phe Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Phe Ser 6~ 70 75 80 Ile Val Tyr lle Val Arg Glu Ser Trp Ile Met Gly Gln Val Val Cys ~'0 94/01556 PCT/FR~3/00651 Z~3~

¦ Asp Ile Trp Leu Ser Val Asp Ile Thr Cys Cys Thr Cys Ser Ile Leu 5 CAT CT. TCA GCT ATA GCT TTG GAT CGG TAT CGA GCA ATC ACA GAT GCT 384 His Leu Ser Ala Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Ile Thr Asp Ala 10 Val Glu Tyr Ala Arg Lys Arg Thr Pro Lys His Ala Gly Ile Met Ile Thr Ile Val Trp Ile Ile Ser Val Phe Ile Ser Met Pro Pro Leu Phe 1~ 145 150 155 160 Trp Arg His Gln Gly Thr Ser Arg Asp Asp Glu Cys Ile Ile Lys His Asp His Ile Val Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Phe Gly Ala Phe Tyr Ile Pro Leu Ala Leu Ile Leu Ile Leu Tyr Tyr Lys Ile Tyr Arg Ala Ala 30 Lys Thr Leu Tyr His Lys Arg Gln Ala Ser Arg Ile Ala Lys Glu Glu :GTG AAT:GGC CAA GTC CTT TTG GAG AGT GGT GAG AAA AGC ACT AAA TCA 720 Val Asn:Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Gly Glu Lys Ser Thr Lys Ser 3~ 225 230 235 240 Val Ser Thr Ser Tyr Val Leu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Pro Ser Thr 245 ` 250 255 Asp Phe Asp Lys Ile His Ser Thr Val Arg Ser Leu Arg Ser Glu Phe Lys His Glu Lys Ser Trp Arg Arg Gln Lys Ile Ser Gly Thr Arg Glu 50 Arg Lys Ala Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ile Leu Gly Ala Phe Val Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Val Lys Glu Leu Val Val Asn Val Cys Asp Lys Cys Lys Ile Ser Glu Glu Met Ser Asn Phe Leu Ala Trp Leu Gly 325 ~ 330 335 Tyr Leu Asn Ser Leu Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Ile Phe Asn Glu WO 94/01556 PCl /FR93/0065 1 -2~;~g4~

GAC TTC AAG AAA GCA TTC CAA AAG CT~ GTG CGA TG~ CGA TGT TA 1101 . Asp Phe Lys Lys Ala Phe Gln Lys Leu Val Arg Cys Arg Cys 2) INFORM~TION POUR LA SEO ID NO: ~:
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Oligonucléotide 1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: -~ .
~2~ EORMATION POUR LA SEO ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases ~B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:.simple (D) CONFIGURATION: linéaire ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A~ ORGANISME: Oligonucléotide 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

WO 94/01~56 PCl/FR93/006~1 (cellules Cos-7)(cortex humain)(Calf caudate) 5-HT 6.9 (2) 8.5 8.4 5-C T 5.5 (4) 6.0 8.6 R U24969 6.8 (2) _ 7.3 TF M P P 6.1 (2) _ 6.2 6.2 8-O H-D P AT 5.8 (2) 6.1 5.9 Sumatriptan 7.1 (2) _ 7.5 Bu~otenine 7.5 (2) 8.1 Methvsergide 8.2 (2) 7.2 8.4 Ergotamine 7.3 (2) 6.8 7.6 Yohim blne 7.2 (2) 7.1 (+) Cyanopindolol 5.4 (2) 6.9 Ketanserin 5 5 (2) < 5 _ 5.7 Mianserin 7.0 (2) ~ 6.4 Spiperone 6.0 (2) 5.3 Dopamine 3.8 (2) (-)Norepinephrine 3.3 (2) .

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID
n° 1 ou d'un dérivé de celle-ci.

2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier la sérotonine.

3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur sérotoninergique.

4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique complète SEQ ID n° 1.

5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique SEQ ID n° 1.

6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

7. Séquence selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.

8. Séquence selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques.

9. Séquence selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.

10. Oligonucléotide antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

11. Oligonucléotide selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est constitué par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 7.

12. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 6 ou avec l'ARNm correspondant.

13 Sonde selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases.

14. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire.

15. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID n° 2 et 3.

16. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 12 à 15 pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT6; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT6, ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT6.

17. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

18. Cellule selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes.

19. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.

20. Procédé selon la revendication 19 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes de la sérotonine.

21. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
sur ledit polypeptide.

22 Ligand ou modulateur d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon les procédés des revendications 19 à 21.

23. Utilisation d'un ligand ou modulateur identifié et/ou obtenu selon les procédé des revendications 19 à 21 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs 5HT6.

24. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

25. Médicament selon la revendication 24 caractérisé en ce que la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 19 à 21.