JPH07508655A - セロトニン作動性レセプター（５ｈｔ６）活性を有するポリペプチド，これらのポリペプチドをコードする核酸，およびそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セロトニン作動性レセプター（５ＨＴ６）活性を有するポリペプチド、これらの ポリペプチドをコードする核酸、およびそれらの利用本発明は、新規のポリペプ チド、およびそれらの発現を可能にする遺伝物質に関する。より具体的には本発 明は、セロトニン作動性レセプター活性を有する新規のポリペプチドに関する。

セロトニンは睡眠、食欲、歩行、性的活動、および血管収縮のような多種多様な 行動機能を誘導および調節することが可能な神経調節因子である。セロトニン活 性は化合物とレセプターとの相互作用により媒介され、そのレセプターはセロト ニン作動性レセプターもしくは５−ＨＴ　（５−ヒドロキシトリプタミンを表す ）レセプターと表示される。分子生物学的研究ならびに薬理学的研究により５− ＨＴレセプターの多数のサブタイプの存在が明らかにされている。今日までに記 載されている５−ＨＴレセプターは、イオンチャネル（５−ＨＴ３レセプター） に関連するレセプターの一族、あるいはＧ蛋白質との相互作用を行いそして７つ のトランスメンブランドメインを有するレセプターの一族のいずれかに属する。

そのうえアミノ酸配列の分析によりＧ蛋白質と相互作用を行う５−ＨＴレセプタ ーを２つの個別な群に細分することができ、それらの群は、哺乳類のサブタイプ ５ＨＴＩＡ、５ＨＴＩＢ、および５ＨＴＩＤを含んでなる５　ＨＴ　ルセプター 類、ならびにショウジヨウバエ（ｄｒ。

５ｏｐｈｉｌａ）の３つの５ＨＴレセプター類、ならびにサブタイプ５ＨＴ２お よび５ＨＴＩＣを含んでなる５ＨＴ２レセプター類である。

薬理学的研究により５ＨＴ４レセプターならびにサブタイプ５ＨＴ１に関連する 幾つかのレセプター（ｒ５）（Ｔｌ一様」レセプター類）のような他のサブタイ プが明らかにされているため、これらのレセプターのみが現存する５ｌ−ＩＴレ セプターであるということは恐らくありえない。

そのうえ追加的な分子生物学的研究によっても、サブタイプ５ＨＴＩＢ／ＩＤ内 における不均一性が明らかにされている。

本発明は、セロトニン作動性レセプター活性を有する新規のポリペプチドの証明 の成果である。Ｇ蛋白質と相互作用するレセプターの一族に属しながらもこれら の新規のポリペプチドは、構造的見地および薬理学的見地の両方から既に記載さ れているセロトニン作動性レセプター（５ＨＴＩ、５　ＨＴ　２．５ＨＴ３、お よび５ＨＴ４）とは異なっている。より具体的には本発明は、５ＨＴ６と表示さ れるこれらの新規のポリペプチドおよびそれらの発現もしくは同定を可能にする 遺伝物質の単離および特性決定の成果である。

したがうて本発明の第一主題は、配列番号１の配列の全てもしくは一部分、ある いは後者の誘導体を含んでなるポリペプチドにある。

本発明の目的のためには、誘導体という用語は、配列番号１のへブチド配列の遺 伝的および／または化学的特性の修飾により取得される分子のいずれかのものを 表す。遺伝的および／また化学的特性の修飾は、一つもしくは複数の残基の突然 変異、置換、欠損、添加、および／または修飾のいずれかのものを意味するとし て理解することができる。このような誘導体を、特にリガンド（複数も可）につ いてのペプチドの親和性の増加、その産生レベルの改善、プロテアーゼに対する 耐性の増大、その活性の増大および／または修飾、あるいは新規の薬物動態学的 および／または生物学的特性をそれに付与するというような様々な目的のために 作製することができる。添加から得られる誘導体の中では、一端に結合した追加 的異種部分を含むキメラポリペプチドを例として挙げることができる。誘導体と いう用語はまた、池の細胞源、特にヒト起源もしくは他の生物体の細胞から作製 され、そして同じ種類の活性を保持する配列番号１のポリペプチドと相同なポリ ペプチドも含む。このような相同ポリペプチドは、実施例において記載されるよ うにノ１イブ１ルノド形成実験により取得することができる（配列番号４を参照 せよ）。

本発明のポリペプチドはセロトニンと結合する能力を有するポリペプチドである ことが好ましい。これらはセロトニン作動性レセプター活性を有するポリペプチ ドであることがなおより好ましい。そのうえ好ましい態様に従うと、本発明のポ リペプチドは、配列番号１の完全なペプチド配列を認識する抗体により認識され ることが可能である。

本発明の具体的な態様は、配列番号１の全ペプチド配列を含むポリペプチド５　 ＨＴ　６により表される。実施例において示されるように、機能を有するセロト ニン作動性レセプターを形成させるために、このポリペプチドを様々な種類の細 胞において発現させることができる。

本発明のポリペプチドは、当業者に知られている技術を使用する配列番号１もし くは４の配列を基にする化学合成によるか、あるいはこれらの技術の組み合わせ により、細胞宿主内における以下に記載するようなヌクレオチド配列の発現によ り取得することができる。

今後は先に特定される本発明のポリペプチドを５ＨＴ６ポリペプチドと表示する 。

本発明の主題は、５ＨＴ６ポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配 列でもある。このような配列を、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくは それに相補的な鎖の全てもしくは一部分、 （ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成し、そして先に特定するポリペプチドをコ ードするいずれかの配列、および（Ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として配列（ ａ）および（ｂ）から得られる配列、 から選択することがより好ましい。

本発明の様々なヌクレオチド配列は人工的起源もしくはその他のものであること が可能である。これらはゲノム、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓもしくはＲＮＡ配列、雑種 配列、あるいは合成もしくは半合成配列であることが可能である。これらの配列 を例えば、配列番号１の配列を基にして作製したプローブを用いてＤＮＡライブ ラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーニング することにより取得することができる。このようなライブラリーは、当業者に知 られている分子生物学の標準的な技術により、様々な起源の細胞から調製するこ とができる。本発明のヌクレオチド配列も化学合成、特にホスホルアミダイト法 に従う化学合成により、あるいは別法ではライブラリーをスクリーニングするこ とにより得られる配列の化学的もしくは酵素的修飾を初めとする混合法により調 製することもできる。

本発明のヌクレオチド配列を、先に特定される５ＨＴ６ポリペプチドの産生のた めに使用することができる。この場合、該ポリペプチドをコードする部分は、一 般的には細胞宿主内においてその発現を可能にするシグナルの調節下に置かれる 。これらのシグナル（プロモーター類、およびターミネータ−類など）の選択は 、使用する細胞宿主に伴って変化することがある。この目的のために、本発明の ヌクレオチドはベクターの一部分を形成することができ、これらのベクターは自 律的に複製を行うベクター、もしくは組込みベクターであることができる。より 具体的には自律的に複製を行うベクターを、選択された宿主内において自律的に 複製する配列を使用して調製することができる。組込みベクターについては、こ れらを例えば宿主のゲノムの所定の領域と相同である配列を使用して調製して、 相同的組換えによるベクターの組込みを可能にさせることができる。組換え法に よる本発明の５ＨＴ６ポリペプチドの産生のために使用可能である細胞宿主は真 核生物性宿主もしくは原核生物性宿主のいずれかである。適切な真核生物性宿主 の中では、動物細胞、イーストもしくは真菌類を挙げることができる。特にイー ストに関しては、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　、クルイベ ロミセス（ＫＩｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワン ニオミセス（Ｓｈｗａｎｎ　ｉｏｍｙｃｅｓ）　、もしくはハンセヌラ（Ｈａｎ ｓｅｎｕｌａ）という属を挙げることができる。動物細胞に関しては、Ｃ０３Ｓ Ｃ１，ＩＯ，Ｃ１２７、およびＮＩＨ−３７３細胞などを挙げることができる。

真菌類の中では、アスペルギルス　ニスエスピー（Δｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓ ｓｐ、）、もしくはトリコデルマ　ニスエスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓ ｓｐ、）をより具体的に挙げることがでｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を使用するこ とが好ましい。

本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子療法という情況において使用することかで きるアンチセンス配列の産生、もしくは生物学的試料中のセロトニン作動性レセ プターの発現のハイブリッド形成実験による検出、ならびに遺伝子の異常（多形 性、突然変異）もしくは異常発現の証明を可能にするプローブの産生、のいずれ かのために製剤学的分野において使用可能でもある。

アンチセンスオリゴヌクレオチドによる所定の遺伝子の発現の阻害は、遺伝子の 活性の調節における有望な手法であることが証明されている。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、所定の遺伝子のコーディング鎖に相補的な 小サイズのオリゴヌクレオチドであり、そしてその結果として、転写されたｍＲ ＮＡと特異的にハイブリッド形成を行ってそのｍＲＮＡが蛋白質へと翻訳される のを阻害することが可能である。したがって本発明の主題は、先に特定される５ ＨＴ６ポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することが可能であるアン チセンスオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、先に特 定されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部分からなることがある。これらは 一般的に、本発明のペプチドをコードする配列に対して相補的な配列もしくはそ のような配列の断片である。このようなオリゴヌクレオチドは、フラグメント化 などにより、もしくは化学合成により、配列番号１もしくは４の配列から取得す ることができる。

先に記載したように、本発明は、本発明の５）ＩＴ６ポリペプチドをコードする 先に特定されるヌクレオチド配列もしくは対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成 することが可能である合成もしくはその他のヌクレオチドプローブを産生ずるこ とも可能にする。このようなプローブを、５ＨＴ６セロトニン作動性レセプター の発現を検出するため、もしくは別法で遺伝子異常（スプライシングの過誤、多 形性、および点突然変異など）を証明するための診断的な道具としてインビトロ において使用することができる。したがってセロトニンの多大な数の活性という 見地において、本発明のプローブは、神経的、心臓血管的、もしくは精神医学的 疾患を、５ＨＴ６レセブターに関連するものとして同定することが可能であるこ とがある。これらのプローブを、実施例において詳細に説明するように、他の細 胞源からの、および好ましくはヒト起源の細胞からの、先に特定される５ＨＴ６ ポリペプチドをコードする相同核酸配列の証明および単離に使用することもでき る。本発明のプローブは一般的に少なくとも１０塩基を含み、そしてそれらは、 配列番号１もしくは４の配列、あるいはそれらに相補的な鎖の全体までの量を含 むことが可能であ゛る。

これらのプローブは使用する前にラベル化することが好ましい。この目的のため には当業者に知られている様々な技術を利用することができる（放射活性もしく は酵素ラベルなど）。これらのプローブを使用することができるハイブリッド形 成条件は、以下に示す一般的クローニング技術ならびに実施例において記載され る。

本発明の他の主題は、それらの表面に先に特定される５ＨＴ６ポリペプチドを発 現することが可能な組換え細胞に関する。これらの細胞は、本発明のポリペプチ ドをコードする先に特定されるヌクレオチド配列を取り込ませ、そしてその後に 該細胞を該配列の発現のための条件下において培養することにより取得すること ができる。

本発明に従う組換え細胞は、真核生物性細胞もしくは原核生物性細胞のいずれか であることができる。適切な真核生物性細胞の中では、動物細胞、イースト、も しくは真菌類を挙げることができる。特にイーストに関しては、サツカロミセス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　、クルイに関しては、Ｃ０５ＳＣＨＯ，Ｃ１ ２７、およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞などを挙げることができる。真菌類の中では、 アスペルギルス　ニスニスげることかできる。原核生物性宿主については、以下 に示す、大腸菌このようにして取得される細胞を使用して、本発明のポリペプチ ドのリガンドとしてもしくは活性の調節物質として振る舞う様々な分子の能力を 測定することができる。したがってより具体的には、これらを本発明のポリペプ チドのりガントもしくは活性の調節物質、より好ましくはセロトニン作動薬およ び拮抗剤の証明および単離のための方法において使用することができる。

したがって本発明の他の主題は、本発明の５　ＨＴ　６ポリペプチドのりガント を証明および／または単離するための方法に関し、そしてこの方法に従って、以 下に示す、 −ある分子もしくは恐らく未同定である様々な分子を含む混合物を先に記載の組 換え細胞と接触させて、本発明のポリペプチドを、該本発明のポリペプチドと該 分子との間の相互作用を可能にさせる［１麦者は該ポリペプチドについての親和 性を有するべきである］という条件下においてその細胞表面に発現させる段階、 および−該本発明のポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する 段階、 を実施する。

ある具体的な態様においては、本発明のこの方法は、５ＨＴ６ポリペプチドにつ いてのセロトニン作動薬および拮抗剤を証明および／または単離するのに適して いる。

本発明の他の主題は、本発明の５ＨＴ６ポリペプチドの調節物質の証明および／ または単離のための方法に関し、そしてこの方法に従って以下に示す、 −ある分子もしくは恐らく未同定である様々な分子を含む混合物を先に記載の組 換え細胞と接触させて、本発明のポリペプチドを、５ＨＴの存在下、該本発明の ポリペプチドと５ＨＴとの間の相互作用を可能にさせる条件下において、その細 胞の表面に発現させる段階、および−該本発明のポリペプチドに関して５ＨＴの 活性を調節することが可能な分子を検出および／または単離する段階、を実施す る。

本発明の他の主題は、薬効性産物としての、先に記載される方法に従って単離お よび／または取得されるリガンドもしくは調節物質の利用に関する。このような りガントもしくは調節物質は実際に、５）ＩＴレセプターに関連する所定の神経 的、心臓血管的、もしくは精神医学的疾患を治療することが可能であることがあ る。

本発明はまた、本発明の５ＨＴ６ポリペプチドに作用する少なくとも一つの分子 を活性成分として含むいずれがの薬効性産物にも関する。その分子は先に記載の 方法に従って同定および／または単離されるリガンドもしくは調節物質であるこ とが好ましい。

本発明の他の利点は、以下に示す実施例を読む際に明らかになるであろうし、そ してそれらの実施例はさらに詳しい説明であって、制限ではないものとして解釈 すべきである。

図面の説明 配列番号１：マウスの５ＨＴ６レセプターのヌクレオチドおよびペプチド配列。

１５５８−ｂｐのｃＤＮＡはＥｃｏＲ１部位からＸｈｏ１部位までの両鏡につい てその配列を決定した。最初の９２ヌクレオチドは示されていない。

履ｌ：配列番号１として表される５ＨＴ６レセプターと、Ｇ蛋白質に結合させた この一族のレセプターの内の他のレセプターとの間のペプチド配列のパーセンテ ージ相同性。相同性は保存配列、すなわちトランスメンブランドメインおよびそ の連結ループについて算出した。

［１２’Ｉ］−ｔ、ＳＤ＋、：ツィテノ飽和曲線。コノ膜を、１０ｔｔＭｃ７） ５ＨＴを含むもしくは含まない、５０ｐＭから１．２５ｐＭまでの範囲にわたる リガンド濃度を使用してインキュベートした。特異的結合が示されている。挿入 グラフは結果のスキャチャード分析を示す。

履Ａ：様々な組織の総ＲＮＡ　（１μｇ）についてのＰＣＲによる相同配列の証 明。

ｍｌ　：　５ＨＴ６レセプターの薬理学的特性。この結果は、５ＨＴ６レセプタ ーを一時的に発現するＣｏ５−７細胞の膜に対する［＋８１］−１゜ＳＤの結合 への競合についての実験に相当する。ＩＣ，。値（結合した［”’Ｉ］　−ＬＳ Ｄの５０％を置換するのに必要なりガント濃度に相当する）を実験的に算出し、 そして以下に示す方程式：Ｋ１−４Ｃ，。／（１＋Ｃ／Ｋｄ）ｒ式中、Ｃは［” Ｉ］−ＬＳＤ濃度（１５０ｐＭ）テアリ、ｌ、てＫｄは［１２ｓＩ］−ＬＳＤ（ ７）解離係数である（９８０ｐＭ）］に従ってＫｉに変換させる。大括弧内の数 値は実施した独立の実施例番号に相当し、各得点は三重検定法において取得した 。

一般的なりローニング技術 プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム濃度勾配液中でのプラスミドＤＮ Ａの遠心処理、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によ るＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質 抽出、食塩倍地中のＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパツール沈殿、および 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）内における形質転換などのような分 子生物学において通常使用される方法が当業者により知られており、そしてこれ らは刊行物において詳細に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　ｅｔ　ａ ｌ、、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ ｎｕａｌ＋、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳＮ、Ｙ、、１　１９８２；Ａｕ５ｕ ｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、（ｅｄｓ）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏＩｏｇｙ’″、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７］。

制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＢＲＬ）　 、もしくはＡｍｅｒｓｈａｍ社より供与され、そして供給元の推奨事項に従って 使用する。

連結については、ＤＮＡ断片を、供給元の推奨事項に従って、アガロースもしく はアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしく はフェノールクロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファ ージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下においてインキュベー トする。

５°突出端の充填は、供給元の推奨事項に従って、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ 　（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のフレノウ断片を使用して実施する。

３゛突出端の破壊は、供給元の推奨事項に従って使用するファージＴ４のＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下において実施する。

５°突出端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼでの調整的処理により実施する。

合成オリゴデオキシヌクレオチドによりインビトロにおいて指令される突然変異 誘発は、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｔ、［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１３　（１９８５）８７４９−８７６４１により開発された方法に従って、Ａ ｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを使用して実施する。

いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼを触媒とする連鎖反応［Ｐｏ　ｌ　ｙｍｅｒａｓ ｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、５ａｉｋｉ　Ｒ， に、　ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　（１９８５）　１３５０−１ ３５４；Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、Ｂ、およびＦａｌｏ。

ｎａ　Ｆ、Ａ、、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、１５５（１９８７）　３３５−３５ ０１技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、製造元の推奨事項に従ってｒＤＮＡ ＤＮＡクサイクラＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒＪ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ ｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社）を使用して実施する。

ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ　［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　（１９７７）５４６３−５４６７ １により開発された方法【こより、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキット を使用して実施する。

ハイブリッド形成実験については、緊縮性の通常の条件１′ｉ一般１ｙ７１こ以 下に示すようなものであり、それは、ノ１イブ１ノ・ノド形成：６５℃下の５× デンハート溶液の存在中の３ｘＳＣＣ１洗浄：６５℃下のＱ、５ｘＳＳＣ１であ る。

１、５ＨＴ６レセブターの単離 様々な既知のセロトニン作動性レセプター間の配夕１１比較により、特にドメイ ンＩＩＩおよびＩＶのような幾つかの利用可能なトランスメンブラン領域内にお けるある程度の保存性が明ら力）Ｉこされた。新規のレセプターを証明および単 離する目的で、本出願の発明者１；ｔ５ＨＴＩＢβレセプター［Ｍａｒｏｔｅａ ｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８９　（１９９２）３０２０］のゲノム断片に 相当するプローブを使用してう・ノド脳のＤＮＡライブラ１ノーをスクリーニン グした。より具体的には、使用したプローブ：嘘、「ランダムプライミング（ｒ ａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｉｎｇ）Ｊ　［ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅ ｉｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　↓旦２　（１９８４ ）６］により予めラベルイヒされて（する５ＨＴ１師レセプターの２．３−ｋｂ のＳａｃｌ−ＢｇｌｌＩ断片に相当する。このプローブを使用して、ＵｎｉＺａ ｐファージ（Ｓ　ｔ　ｒａｔａｇｅｎｅ社）内において作製したう・ノド脳のｃ ＤＮＡライブラ１ノーを低緊縮性（３０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ，４２℃ ）の条件下でスクリーニングした。得られた陽性ファージの中で、そのプローブ と弱いハイブリッド形成を行う一つのものを単離した。λＳＲと表示され、そし てプラスミドｐＳＲにより保持されるこのファージは約１．６−ｋｂの挿入断片 を含み、そしてその後これをブルースクリプト（Ｂ　Ｉ　ｕ　ｅｓｃ’ｒｉｐｔ ）ファージ内に取り込ませた。この断片の配列を合成オリゴヌクレオチドにより ジデオキシヌクレオチド技術を用いて両鏡について決定した。

このようにした取得された配列は配列番号１中に存在する。単離されたｃＤＮＡ は３６７のアミノ酸からなる読み取り枠を保持することが示された。そのうえ疎 水性分析により、この蛋白質は７つの疎水性ドメインを保持することが示されて おり、これはＧ蛋白質に結合するレセプター−族の一員では他のものに相対する 独特な性質である。そのうえＮ−末端は２つのＮ−グリコリル化部位を含んでお り、そしてこの仮定的な細胞質ドメインはプロティンキナーゼＣおよびＡによる リン酸化の共通部位を保持している。

２、　配列の相同性の研究 先に単離される５ＨＴ６レセブターの配列を、Ｇ蛋白質に結合する以下に示すレ セプター、５３１．５ＨＴＩＢβ、５ＨＴＩＤα、５ＨＴＩＡ、５ＨＴ−ｄｒｏ ２Ａ、５ＨＴ−ｄｒｏｌ、５　ＨＴ　Ｉ　Ｃ，および５ＨＴ２の配列と比較した 。これらの実験により、利用可能なトランスメンブランドメイン内、および連結 ループ内においてはある程度の相同性が示されたが、末端領域内、もしくは第三 細胞質ループ内においては相同性は示されなかった。図２には保存領域内の％相 同性が示されている。

この図から明らかであるように、既知のレセプターとの保存領域内での相同性は 低（、最高の結果はセロトニン作動性レセプター５）ＩＴＩＢβおよび５ＨＴＩ Ｄα（５４％の相同性ロ二関して、ならびに未だζこ特性が決定されていないＳ ３ルセプターに関して得られて（為る。

実施例１において単離されるｃＤＮＡ断片を真核生物の発現ベクター内に挿入し 、これを使用してＣｏ５−７細胞のトランスフェクションを行った。その後、ト ランスフェクションを行って得られる細１ｍの膜を調製し、そして幾つかのラベ ル化セロトニン作動性リガンドζこ結合するｍｌ力についてのテストを行った。

５ＨＴ６レセブターをコードする１、６−ｋｂのｃＤＮＡをＥｃｏＲｌ−Ｘｈｏ ｌ断片の形態においてプラスミドｐＳＲ力）ら単離し、そしてその後にベクター ｐ５１３の対応する部位に挿入した。このベクターｐ５１３は、ベクターｐｓＧ ５ｒＧｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　（１９８８）３６９］力１ら多重クローニング部 位の添加により得られる。その後、ｐ５１３ＳＲと表示され、この方法により得 られる組換えベクター（１０ｃｍのディ・ノシュ当たり２０μｇ）を使用してリ ン酸カルシウムの存在下（こお（ＸてＣｏ５−７細胞のトランスフェクションを 行った。

トランスフェクションの４８時間後にこの組換え細胞を収集し、そして膜をＡｍ １ａｉｋｙおよびＣａｒｏｎ　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６０　（１９８５）１９８３］により記載される技術（こ従って調製する。そ の後、飽和結合および競合実験をこれらの膜につ０て、以下ｌこ示す放射ラベル 化リガンド、［”’Ｉ］−ＬＳＤ、［蔦１５１　］−シアノピンドロール、［” Ｈ］−８−ＯＩ（−ＤＰＡＴ、および［３Ｈ］−スピペロンの存在下において実 施する。この目的のためには膜サンプル（１０−２０μｇの蛋白質）を３７℃に おいて１０分間、最終容量が２５０μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ ｐＨ７，４）中のリガンドの存在下においてインキュベートした。その後この反 応をＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃグラスファイバーフィルター上での吸引濾過により 停止させ、そして４ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）で ４回すすいだ。非特異的結合は１０μＭ　５ＨＴの存在下において決定した。放 射活性をγ計測器で測定した。

得られる結果により　［＋！Ｊ］−シアノピンドロール、［”Ｈ］　−８−ＯＨ −ＤＰＡＴ、および［３Ｈ〕−スピペロンは調製した膜に結合しないが、［＋ｚ ｓＢ−ＬＳＤは、Ｋｄ＝９８０ｐＭおよびＢｍａｘ＝２゜２ピコモル／膜蛋白質 のｍｇ、を有する飽和可能な結合部位を保持することが示される（図３）。その うえ対照実験においては、［１！ｌ１ｌ−ＬＳＤはプラスミドｐ５１３でトラン スフェクトさせたＣｏ５−７細胞に結合しないことが示される。

このレセプターの薬理学的特性を決定するためには、膜に結合した［”！］　− ＬＳＤを様々なセロトニン作動性の薬物の存在下において置換させた（表１）。

これらの様々な薬物は以下に示す順序の置換効率を示し、それは、メチルセルシ ト（ｍｅｔｈｙｌｓｅｒｆ　１ｄｅ）＞ブフォテ＝ン（ｂｕｆｏｔｅｎｉｎｅ） ＞スマトリプタ：／　（ｓｕｍａ　ｔ　ｒｉｐ　ｔ　ａｎ）＞５ＨＴ、である（ 表１）。ケタンセリン（ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ）、（±）−シアノピンドロール 、および５−ＣＴは低い親和性を保持する一方、ノルエピネフエリンは不活性で ある。

実施例１においてクローン化させたｃＤＮＡを、いずれのセロトニン作動性レセ プターをも細胞内に発現しないＮＩＨ−３Ｔ３細胞内においても発現させた。こ の目的のためには先の３．において記載される組換え発現ベクターを使用した。

これをリン酸カルシウム、およびそれと同時にベクターとしての６４１８耐性遺 伝子を保持するｐＲ３Ｖｎｅ。

［Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１（１９８３）５５１１ 　（１０ｃｍのプッシュあたり１μｇ）の存在下におけるトランスフェクション によりＮＩＨ−３Ｔ３細胞内に取り込ませた（１０ｃｍのブツシュ当たり２０μ ｇ）。この形質転換体クローンを、０．　５ｍｇの６４１８の存在下において選 択した。その後５ＨＴ６のｍＲＮＡの実験については、単離されたクローンを増 幅させ、そしてこれらのクローンの総ＲＮＡを調製し、モしてノザンプロットに よる分析を行った。このようにして高レベルの５ＨＴ６　ｍＲＮＡを発現する一 つのクローンＳＲ４を選択した。

その後このクローンの細胞の膜を調製し、そして幾つかのラベル化セロトニン作 動性リガンドに結合する能力について先に記載した条件下においてテストを行い 、それらの表面には機能を有する５ＨＴ６レセブターが存在することを立証した 。

５、　他の組織内における相同配列についての検索その後配列番号１のヌクレオ チド配列を使用して他の組織についての相同配列を証明した。この目的のために は以下に示す２つの技術を使用したが、それらは、 ＰＣＲ −インサイチューハイグリッド形成 であった。

相同配列についての検索を行うのに使用した組織は以下に示すマウス起源のもの であり、すなわち脳、小脳、腎臓、肝臓、を髄、肺臓、肺、腸、および心臓であ る。

５．１．　ＰＣＲによる検索 ＰＣＨによる検索を行うためには以下に示すプローブを用いたが、それらは、 プローブ（ｉ）：配列番号２ プローブ（ｉｉ）：配列番号３ であった。

プローブ（ｉ）は配列番号１の配列上の位置１１７４に相当し、そしてプローブ （ｉｉ）は位置１３９４に相当する。

総ＲＮＡは、を研究を行った様々な組織からＣａｔｈａｌａ　ｅｔａ　１．　（ ＤＮＡ　２　（４）（１９８３）により記載される技術を使用して調製した。こ れらのＲＮＡの内の１μｇを、２００単位のＭＭＬＶリバーストランスクリプタ ーゼおよび３００ｎｇのプローブ（ｉ）の存在下における３７℃下１時間の逆転 写に供した。その後この反応の産物の半分を、５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｃ ｅｔｕｓ社）および５０００ｇのプローブ（ｉ）および（ｉ　ｉ）の存在下にお いて増幅させた（２０周期）。その後この方法により得られる産物をニトロセル ロースフィルターへ転移させ、そして以下に示す高緊縮性条件下、つまり５０％ のホルムアルデヒド、５ＸＳＳＣ１１ｘデンハート溶液、０．１％のＳＤＳ、お よび１００μｇ／ｍＩのｔＲＮＡを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩ｉ液（ｐ Ｈ６，５）中における４２℃下においてハイブリッド形成させた。洗浄は、Ｏ， ｌＸ５ＳＣ１０，１％のＳＤＳ緩衝液中６０℃において実施した。

この研究により相同的な特異的ＤＮＡ断片がを髄および脳内に存在することを証 明することが可能となった（図４）。

５．２．　インサイチュ−ハイブリッド形成による検索インサイチュ−ハイブリ ッド形成実験を、成体ラットの脳の低温切開切片（ｃｒｙｏｓｔａｔ　５ｅｃｔ ｉｏｎ）について、Ｈａｆｅｎｅｔ　ａ　Ｉ、［ＥＭＢＯＪ、　２　（１９８３ ）６１７］により記載される技術に従って実施した。これらの実験に使用するプ ローブは、鋳型としてプラスミドＰＳＲを用いる、Ｔ７ポリメラーゼおよびｐｓ Ｓ］　−ＣＴＰの存在下における転写によって得られる一本鎖ＲＮＡである。

この研究により、本発明に従う相同配列が、海馬のＣＡＩ、ＣＡ２、およびＣＡ ３層中において証明された。同じ長さではあるが本発明のレセプターに特異的で はない様々なＲＮＡプローブを用いる、同一条件下において実施する対照実験に よっては、陽性を示すシグナルは証明され先の５．において記載する方法に従い 、ヒトの５　ＨＴ　６レセブターをクローン化した。

この目的のためにはヒトのゲノムＤＮＡライブラリーを胎盤より、酵素ｋｉｂｏ ｌでの部分消化、塩ｉｌＫ勾配液上での分離、およびＢａｍＨＩ（宿主細菌：Ｔ ＡＰ　９０）で直線状にさせたベクターラムダ−ＧＥＭ１２内へのサブクローン 化により調製した。

その後この方法により得られるライブラリーを、実施例３において記載され、ラ ンダムプライミング技術に従ってラベル化した１、６−ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｈ ｏｌ断片をプローブとして使用してスクリーニングした。このプローブとハイブ リッド形成するＤＮＡ断片を単離し、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ）プラスミド内へサブクローン化させ、増幅化を行い、そしてその後ジデオキシ ヌクレオチド技術に従って両方向における配列決定を行った。増幅化は、ＰＣＲ 技術、つまりテルムス　アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ ）のポリメラーゼ（２，５単位ＨＣｅｔｕｓ社）、オリゴヌクレオチド１（配列 番号５）および２（配列番号６）の存在下における２０周期により実施した。得 られる断片を酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌで消化させ、そしてその後発現ベク ターＰ５１３中にサブクローン化させた。

得られる配列は配列番号４の配列中に存在している。

同じ実験を他の組織、特にヒト起源の組織、ならびに他のプローブを使用して繰 り返すことができることが理解される。そのうえこれらの実験において証明され る相同配列は、後に分子生物学の標準的な技術により単離および／または増幅す ることが可能であることは明白である。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願者： （Ａ）氏名：ＩＮＳＥＲＭ （Ｂ）街路名：１０１、ｒｕｅ　ｄｅ　Ｔｏｌｂｉａｃ（Ｃ）市：　ＰＡＲＩ　 ５ （Ｅ）国：ＦＲＡＮＣＥ （Ｆ）郵便番号：　７５６５４ （ｉ　ｉ）発明の名称：セロトニン作動性活性を有する新規のポリペプチド、こ れらのポリペプチドをコードする核酸、およびそれらの利用。

（ｉｉｉ）配列数＝６ （ｉｖ）コンピューター解読可能形態：（Ａ）メディウムの種類：テープ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）作動システム ：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒ ｅ１ｅａｓｅ　＃１゜０、Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５　（ＥＰＯ）（２）配列 番号１についての情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５５７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：マウス （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：３１０．．１４１０ （Ｃ）他の情報：／産物＝「マウス５ＨＴ６レセプター遺伝子」（ｘｉ）配列 ｋＴＣＡＡＡ（Ｊ？ｆＪｉＣＣＡｅＡｆｆＧＴテ１ｃｃＡｅＡλ〒ｉ丁ＡＣ１’ ｃｃ＾（Ｎ：？？ＴＧＧ＾ＧｅＴＢ〕６Ｘ１＊ＬＹ！ＵｓＡｓｐＭ土１ニューＶ ａｌ！ｓｒ？ｈｒＸｌ−ＴｙｒＧａｒＴｈｒＰｂａＧｌｙＡニー１フｓ＋ｓｏ＋ ａｓ ＴＴＣＴＡｅＡＩＣｅＧｅＴ↑ＩＹＡｍ入ＴＡテＩＣ入’！’ＣＣＴＣ？ＡＣ？ Ａｅ＾ＡＡＡＴＡ？Ａｅ９２４Ｆ７１１１？ｙｒ！ｌ＠Ｐｒｏ！ａｕＶａ１！４ ｕ１１＠Ｌ４％ｌＸＬ＠ＪｊｌｕＦｆｒ↑ｙｒＬｙｍＸニー！ｙτ＋ｓｏ　＋ｓ ｓ、　、　ｚｏｏ　ｘｏｓＡｃＡのり＾ｃ４Ａ（Ａαシ×に席ＡＧＡ賜ズＧ纜体 −π＾ｉ＾　９７２ｋｇ＆１ａＡ１１＾ｒ９丁ｈｒＬａｕＴｙｒＭ工ｓＬｙｍ入 ｒｑＧｉｌｌＡユ＆ｍａｒ八ｚｙＭａｔＸｉｓＡＡＧ　ｃＡｃＷ　ＣＴＧ　ＡＡ ｅ　Ｃｍ　ＣＡＡ　ＧＷ：　Ｔｒ（：　雷ＧＡＧ　Ａｅｅ　ＧＣ：ｔ　ＣＡ５　 ｋｋＧ　ＡＧＣ１０２６ＬｙｍＧ１０２６Ｌｙ＠ＩＩＡａｎＧｌｙＧｉｎＶＮＰ ｍｔａｕＧｌｕｈｒ＋ＡｙＯ１ｕＬｙｍＧｗＰｒｏ、　：ｅ、ｒ　Ｔｈｒ　Ａ″ ｐ７″Ａｓｐ愉１１′社゛８°り翫￥；孟１Ｙ″５“″″鳩Ａ？ＡＴ＾τ］″＾ ＾＾＾Ｃ？ＧＣ丁八へ＾＾丁τＡ入八へＡ＾＾Ａ入Ａ＾＾八へへ＾＾Ａ１５５フ （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｖ　ｉ）起源： （Ａ）生物名ニブローブ（ｉ） （ｘ　ｉ）配列 鳩諷笥虜荀陽ππ　２０ （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１９ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｖ　ｉ）起源： （Ａ）生物名ニブローブ（ｉ　１） （ｘｉ）配列 ？！　？ＡＡ實Ａ？ＣＣ１９ （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１１０１ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉＤハイポセティカル配列：Ｎｏ （ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）起源・ （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．、．１１０１ （Ｃ）他の情報：／産物＝「ヒト５　ＨＴ　６レセプター遺伝子」（Ｘｌ）配列 （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ；３７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名・オリゴヌクレオチド１ （ｘｉ）配列 人ＡＧＧＡＴＣＣＣＡ　ＧｃｃＡｃｃＡｆｆｌｃ　Ａ？ｒｒｃＴτＡＡＡ　ｒ　 ３フ（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名・オリゴヌクレオチド２ （ｘｉ）配列 丁ＴＣｃｍｃｘＧＣＴＡＣＡｃｃｕＣＡＡｍｃｒＣＧＡＧＧ’ｒ入ＣＣＡ＾３フ 表１ ５ＨＴ６　７つ７．　１００ Ｓコｌ　６１　１００ ５ＨＴＩＢｐ　７ウス　５３　５４　１００５Ｈ丁ユＤα　ヒ　ト　５５　５３ 　７１　１００５ＨテＩＡ　ラット　４５　４３　４９　４８　１００５Ｈ丁− ｄｒｏ２Ａ　４３　３９　４２　４１　４４　１００５１Ｔ−ｄｒｏｌ　４１　 ３８　３９　４２　４５　４２　１００５）ｉＴｌｃ　−７ツ　ト　３１　３４ 　３０　３２　２９　２９　３１　１００ＦＩＧＬ１’ｌ［４ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＦＲ９３１００６Ｓ１ フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／７１５　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ １５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：０１） ９４５５−４Ｃ （７２）発明者　アシ、ルネ フランス国６７０００ストラスプール・リュカゲネク３ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＥＮ （７２）発明者　プラサ、ジャンーリュクフランス国６７１００ストラスプール ・ルートドロピタル６２ （７２）発明者　ランポ、シルビー フランス国６７１００ストラスプール・リュデュラザレ６１ア

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．配列番号１のペプチド配列の全てもしくは一部分、あるいは後者の誘導体を 含んでなるポリペプチド。
2. ２．セロトニンに結合する能力を保持することを特徴とする、請求の範囲１に記 載のポリペプチド。
3. ３．セロトニン作動性レセプター活性を保持することを特徴とする、請求の範囲 ２に記載のポリペプチド。
4. ４．配列番号１の完全なペプチド配列を認識する抗体により認識されることが可 能であることを特徴とする、請求の範囲１−３の内の一つに記載のポリペプチド 。
5. ５．配列番号１の全配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１−４の内の一つ に記載のポリペプチド。
6. ６．請求の範囲１−５の内の一つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチ ド配列。
7. ７．以下に示す、 （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはそれに相補的な鎖の全てもしくは 一部分、 （ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成し、そして請求の範囲１−５の内の一つに 記載のポリペプチドをコードするいずれかの配列、および（ｃ）遺伝子コードの 縮重の結果として配列（ａ）および（ｂ）から得られる配列、 から選択されることを特徴とする、請求の範囲６に記載の配列。
8. ８．ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくはＲＮＡ配列、雑種配列、あるいは合成もしくは 半合成配列から選択されることを特徴とする、請求の範囲７に記載の配列。
9. ９．該ポリペプチドをコードする部分を細胞宿主内におけるその発現を可能にす るシグナルの調節下に置くことを特徴とする、請求の範囲６−８の内の一つに記 載の配列。
10. １０．請求の範囲１−５の内の一つに記載のポリペプチドの産生を少なくとも部 分的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11. １１．請求の範囲７に記載のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分からなるこ とを特徴とする、請求の範囲１０に記載のオリゴヌクレオチド。
12. １２．請求の範囲６に記載の配列と、もしくはそれに対応するｍＲＮＡとハイブ リッド形成することが可能なヌクレオチドプローブ。
13. １３．少なくとも１０塩基を含むことを特徴とする、請求の範囲１２に記載のプ ローブ。
14. １４．配列番号１の配列、もしくはそれに相補的な鎖の全てを含むことを特徴と する、請求の範囲１３に記載のプローブ。
15. １５．配列番号２および３の配列から選択されることを特徴とする、請求の範囲 １３に記載のプローブ。
16. １６．５ＨＴ６セロトニン作動性レセプターの発現を検出するため、あるいは遺 伝子異常（スプライシングの過誤、多形性、および点突然変異など）を証明する ため、あるいは５ＨＴ６レセプターに関連するものとしての神経的、心臓血管的 、もしくは精神医学的疾患を同定するため、あるいは別法として５ＨＴ６ポリペ プチドをコードする相同な核酸配列を証明および単離するための、請求の範囲１ ２−１５の内の一つに記載のプローブの利用。
17. １７．請求の範囲１−５の内の一つに記載のポリペプチドをその表面に発現する ことが可能な組換え細胞。
18. １８．真核生物性細胞もしくは原核生物性細胞から選択されることを特徴とする 、請求の範囲１７に記載の細胞。
19. １９．以下に示す、 一ある分子もしくは恐らく未同定である様々な分子を含む混合物を請求の範囲１ ７に記載の組換え細胞と接触させて、請求の範囲１−５に記載のポリペプチドを 、該ポリペプチドと該分子との間の相互作用を可能にさせる［後者は該ポリペプ チドについての親和性を有するべきである］という条件下においてその細胞表面 に発現させる段階、および一該ポリペプチドに結合した分子を検出および／また は単離する段階、を実施することを特徴とする、請求の範囲１−５において特定 されるポリペプチドのリガンドを証明及び／又は単離するための方法。
20. ２０．セロトニン作動薬および拮抗剤を証明および／または単離するための、請 求の範囲１９に記載の方法。
21. ２１．以下に示す、 一ある分子もしくは恐らく未同定である様々な分子を含む混合物を請求の範囲１ ７に記載の組換え細胞と接触させて、請求の範囲１−５に記載のポリペプチドを 、５ＨＴの存在下、該ポリペプチドと５ＨＴとの間の相互作用を可能にさせる条 件下においてその細胞の表面に発現させる段階、および 一該ポリペプチドに関して５ＨＴの活性を調節することが可能な分子を検出およ び／または単離する段階、 を実施することを特徴とする、請求の範囲１−５において特定されるポリペプチ ドの調節物質の証明および／または単離のための方法。
22. ２２．請求の範囲１９−２１の方法に従って得ることが可能な、請求の範囲１− ５において特定されるポリペプチドのリガンドもしくは調節物質。
23. ２３．５ＨＴ６レセプターに関連する神経的、心臓血管的、もしくは精神医学的 疾患の治療を意図する薬効性産物の調製のための、請求の範囲１９−２１の方法 に従って同定および／または取得されるリガンドもしくは調節物質の利用。
24. ２４．請求の範囲１−５の内の一つに記載のポリペプチドに作用する少なくとも 一つの分子を活性成分として含む薬効性産物。
25. ２５．その分子が請求の範囲１９−２１の方法に従って同定および／または単離 されるリガンドもしくは調節物質であることを特徴とする、請求の範囲２４に記 載の薬効性産物。