CA2141061A1 - Peptides inhibant l'activite des proteines ras, preparation et utilisation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des peptides capables d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines p21 activées, leur préparation et des compositions pharmaceutiques les contenant.

Description

WO 94/03597 . PCI/FR93/00772 ~ 2l~10~

ES INHIBANT L'ACrIVITE DES PROTEINES RAS
PREPARATION ET UTILISATION
La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur llhlicAhon ph~rmA~llh-lue. Plus particulièrement, la 5 ~r~le in~enlion ~n-~PrnP de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins parhPllPnlpnt l'activité trans~....~..le des ~r~l~;..P~ ras.
Difr~lts gènes, appelés oncogènes et gènes su~r~-~s-pl1rs/ sont impliqué~s dans le conh^ôle de la division oellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras, et leurs produits générAlpn~pnt ~ n~ ~roL~ es p21, puent un rôle clé dans le 10 contrôle de la prolifération oellulaire chez tous les organismes eu~oLes où ils ont été recherchés. No~n.~..Pnt, il a été montré que cPrtaines mo-liff~Ahons spécifiques de oes ~rol~i.les leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogénique. Ainsi, un grand nombre de tumeurs hl1mAinP~ ont été A~i~C à la présence de gènes ras modifiés. De même, une s~ ~ion de ces ~ro~ines p21 peut ~n~111ire à un dérèf~lPment de la prolif~r~tion cellulaire. La oc,ll~r~Pn~ion du rMe exact de oes ~rol~inP~ p21 dans les cellules, de leur mode de fon~iontl~mpnt et de leurs carAftPri~hques r~n~tih1~ donc un enjeu majeur pour la colll~r~hension et l'approche thérapeutique de la cancéro~nP~ç
In vivo, on ne ~nn~it pas encore la nature précise des événements respon~Ahle~ de l'activation des p~ .P~ p21, et de la hransduction du signal qu'elles portent. On sait qu'elles exercent leur fonction en os~illAnt entre deux états ~ olmaLionnels: une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. L'activité de ces ~ro~ Ps est donc contrôlée par les facteurs qui régissent l'équilibre entre ces deux formes, c'est-à-dire la hransition p21-GDP ->
p21-GTP et inversement.
Concernant l'activation des complexes p21-GDP, des travaux récents rapportent des situations physiologiques au cours desquelles la proportion de ~roL~ es ras liées au GTP al~gtnente dans la cellule. Il s'agit de l'activation des lymphocytes T et de la stimulation des fibroblastes 3T3 par des facteurs de croi.~sAn- e dont l'EGF et le PDGF. Cette augmentation de la proportion de p21-GTP peut s'expliquer au moins en par~ie par l'action d'une protéine jouant un rôle analogue à celui d'un récepteur pour les ~rotf~ Ps G de transduction. A cet WO 94/03597 PCr/FRs3/00772 égard, certaines prot~in~s capables de promouvoir l'~rh~n~e du GDP sur les ~r~)L~ es p21 ont été icl~nhfié~s, à partir de cerveau de boeuf (West et coll., FEBS L~tt. 259 (1990) 245) et de rat (Wolfm~n et Macara, Science 24~ (1990) 67).La lo~li~hon cellulaire ~lictinc~ de ces hrtPl-r.s et les c~n~litions 5 ~ nt~le~c hrès dirr~tes dans lesquelles ils ont été obtenus 1~i~.nt supposer qu'il s'agit de ~ .c dirr~-tes. Elles sont aussi actives sur les ~,rol~ c ras norln~ c que sur oelles qui cont onc~géniques. Ces activités ont été re~oupées sous le terrne de G_F: Facteur d'FrhAng~ des m~rl~ohi-les Gl l~nitli-lues.
Concernant l'inactivation des complexes p21-GTP, une protéine cytosolique ayant le pouvoir d'accélérer hrès fortPm~nt l'hydrolyse du GTP lié àla ~loL~ine p21 a ét~ m-ise en ~vidence (Trahey et Mc ~'ormi~k~ Science 8 (1987) 542). Cette ~L~ine, ~i~n~mm~e GAP, intf~rAgit avec les ~ ei.~-s p21 de mAni~re catalytique et multiplie par 100 à 200 la vitesse d'hydrolyse du GTP
5 mesurée in vi~ro pour la ~io~il~e p21 normAle. Dirr~-ts travaux ont montré
que le tlomAine catalytique de cette ~roL~ e de 1044 acides A~nin~s environ était situé dans la r~gion ~rl,o~cy-terminale (résidus 702-1044), et que cette région était res~nsable de l'intf~r~rhon de la ~ro~il~e GAP avec les pro~ Ps p21 (Cf WO91/02749).
Cep~n~1~nt, le rôle de cette ~rot~ e GAP n'a pas été jusqu'à présent clairement élucidé. En particulier, les ~ nts et les facteurs p~rmettAnt la transduction des ~sign~ d'activation des ~o~éines p21 à la cellule ne sont pas connlls. La présente invention résulte de la mise en évidence par la ~lerrl~n~leresse que la prot~ e GAP ne constihl~ pas simplement un régllAte-lr 2s ayant pour seul rôle de désactiver la p21 en la faisant r~ à l'etat inactif par suite de l'hydrolyse du GTP, rnais qu'elle con~tihlp- ~g~ ent l'~ffeetPllr des yrol~ es p21 ~l~lpn~ant la réponse cellulaire. La p~és~lte invention résulte plus particulièrement de l'itl~nhfi~hon et de la caractérisation de régions partic~ res (dites régions effectrices) de la yrol~ne GAP impliquées dans la transduction des signaux d'activation des protéines p21. La mise en évidence de 1'~Y;~t~.n-e d'une telle région et sa caractérisation permettent de préparer de nouveaux peptides lltili~hles phar~ tiquement.

WO 94/03597 . 2 i ~ Pcr/FR93/00772 .

Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides eapables d'inhiber au moins par~ m~nt l'activité transformante des protéines p21 activées. Il est entendu que le terme ~roL~ine p21 ~l~cigne tout produit d'f~ression d'un gène ras normal ou oncogénique.
Plus particulierement, l'invention a pour objet les peptides capables d'inhiber au moins parh~ m~nt l'a~Livil~ of,-~Ante des aomplexes p21- r GTP-GAP. On sait de plus que les ~lo~illes p21 sont n~p-cs~ 2s à l'f~p~ssion du pouvoir llal~r~ t d'oncogènes Agi~C~nt en Amcnt ~omme sr~, HER1, HER2, etc. De ce fait, les peptides de l'illvenlion et toute ~lll~osiLon 0 pl)h~ ti-lue les f~lllf~ .,t sont e~lfment utiles pour traiter les tlm~ellrs ~r~l.l~..t ces gènes activés.
r~é~PI~hf~llem~nt, les peptides de l'invention sont des dérivés de la ~ro~éille GAP.
Au sens de la ~ e invention, le terrne dérivé iéSign~o- toute moléc~lle obtenue par mof1ifi(Ahfn de nature génétique et/ou fhimirlue et cons~v~u~t la fi~ApA~ité d'inhibition recherchée. Par mo lifi~hon de nature ~néhque et/ou chimique, on peut ent~n~lre toute mtltAtion, subsht~lhon, hon, addition et/ou morlifi~Ahon d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent êhre générés dans des buts difr~ts, tels que no~m~-ent celui d'All~mPnt~r l'Affinit~ du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'AIl~m~nt~r sa résistance à des protéases ou d'améliorer son p~ ~ à lldV~ les membranes cellulaires, celui d'AII~ment~r son ~ffi~ité thérapeutique ou de réduire ses effets se~on~i~ires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmAro~- néhques et/ou biologiques.
En tant que peptide dérivé de la protéine GAP, on peut citer notamment tout peptide capable de lier la ~ro~ e p21, év~nh~ ment complexée au GTP, mais ~ll~lt une région ~ff~trice rendue non fonctionnelle. De tels peptides peuvent être obtenus par ~lPl~tion, mlltAtion ou disruption de cette région effectrice sur la protéine GAP.
Plus ~r~érel~ti~llem~nt, les peptides de l'invention comprennent tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 2 ou d'un dérivé de celle-ci.
Le terme dérivé a la même signification que pr~mment.

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2~ 6~ 4 Les peptides de l'invention peuvent ainsi avoir la structure du peptide de séquenoe SEQ ID n 2, d'un frAf~m~nt de c~ui~i, ou une structure dérivée de oeux-ci (par exemple un peptide incorporant le peptide SEQ ID n 2). De tels peptides peuvent être générés de dirr~f~.Les façons. En partic1llipr~ ils peuvent 5 être synthétisés par voie chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n 2, enutilisant les syntl~Pti~ rs peptidiques conr~ de l'homme du métier. Ils peuvent é~AlPrnPrlt être syr~t~hi~ par voie ~n~hque, par e~iession dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché, év~nt~PllPmPnt suivie de mo lifi~Ation~ chimiques ou enzymatiques. Dans le cas lo d'une synthèse par voie g~n~tique, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiql~mPnt en llhli~Ant un srt~ti~ellr d~ nnl~rlPotides, sur la base de la séquence peptidique llonTtée dans la ~resenLe ~lpmArl~e et du code ~Pn~tique. Laséquence nucléotidique peut é~AlPmPnt être préparée à partir de la séquence nucléotidique donnée dans la ~lte i~mAn~le (SEQ ID n 1), par coupures 15 enzymatiques, ligature, ~lonAgP., etc, selon les tel~hniques connues de l'hommP
du métier. CPS peptides peuvent ég~lPrnPnt être modifiés par l'ajout de séquenc~s leur pPrmett~nt une 1O~A1;~AhOn cellulaire précise. En particllliPr, des séquences de type CAAX où C est une cystéine, A un acide arniné Alirh~hque et X un acide aminé qllplcon~luel p~rmpttAnt de ~ié~ Pr si un peptide est ou zo non modifié post-tradllrtionnPllemPnt par une farnésyl transférase cellulaire peuvent être ajoutées (Cancer Cells vol3~9~ 1991 331).
La présente invention perrnet donc de générer des peptides dérivés de la ~ro~ine GAP et, plus particulièrement, de la séquence ~EQ ID n 2, présentant des propriétés biologiques intel~ssal~tes en vue d'une lltilisAtion 25 ph~rmA~ Plltique. L'activité biologique de ces difL~Its peptides de l'invention peut être évaluée selon différents tests décrits dans les exemples, et notammentpar un test de mahuration d'oocytes.
D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en compétition avec les peptides ci-dessus définis pour l'interaction avec leur cible 30 cellulaire. De tels peptides peuvent êhre synthPh~ notamment sur la base de la séquence du peptide considéré, et leur ~pA~ ité à entrer en compétition avec lespeptides ci-dessus définis pour l'interaction avec leur cible cellulaire peut être déterminée comme décrit dans les exemples.

WO 94/03597 . 21~ J D ~1~ pcr/FRs3/oo772 A titre d'exemples de peptides selon l'invention, on peut citer les peptides ayant la séquence d'acides Amin~c suivantes:
- peptide ayant la séquence SEQ ID n 2, - peptide PVEDRRRVRAI (positions ~15 sur la séquence SEQ ID n 2) - peptide EISF (positionc 2~29 sur la séquence SEQ ID n 2) - peptide EDGWM (positionc 42~6 sur la séquence SEQ ID n 2) - ~rotéine GAP portant une région ~rre~ ;~ rendue non fonc~ionnelle, - poly~Lides P~P9 (SEQ ID n 3 8) décrits dans l'exemple 2, - peptides compéht~llrs des peptides ci~sllc 0 L'invention fournit égAl~m~nt des c~O.. ~l~S~-C non peptidiques ou non exclusivement peptidiques lltilicAhles phArmA~lltiql-.oment Il est en effet pos~ih!e, à partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente cl~mAncle, de réA~iser des molécules inhibi~ices de la voie de sip~nAlicAtion dépenflAnte de la ~foLe l.e GAP non exclusi - ~nent peptidiques et c~n~pAhhles avec une licAtion pharmA~llhque.
La présente invention a égAl~m~nt pour objet toute séquenoe nucléotidique codant pour un peptide s~lon l'inv~ntion Il peut s'agir en particulier d'une séquence coll~pf~a~,t tout ou partie de la séquenoe SEQ ID n 1 ou d'une séquence dérivée de oelle-ci. Par séquence dérivée, on entend au sens20 de la ~esenLe invention toute s~quence hybridant avec la séquenoe SEQ ID n 1ou avec un fr-A~nent de oelle ci et codant pour un peptide selon l'invention, ainsi que les séquenoes résultant de ces i~mi~res par ~l~s~n~re-c~nce du code ~néhque. Un exemple de séquence de l'invention hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 est représenté sur la séquence SEQ ID n 3. Les séquences de 25 l'invention peuvent être lltilic~s pour la production des peptides de l'invention.
Dans ce cas, la partie cotlAnt pour ledit peptide est génér~l~rnent placée sous le controle de sig~naux perrnettant son expression dans un hôte oellulaire. Le choix de oes sig~naux (promoteurs, ter~inAt~llrs, sequence "leader" de sécrétion, etc)peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences 30 nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à
réplication autonome ou intégratif. Plus parhc~ rement, des vecteurs à
réplication autonome peuvent être pr~ares en lltilisAnt des séquences à
réplication autonome chea l'hôte choisi. S'Ag;~CAnt des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilicAnt des séquences homologues à

3~97 ~ PCr/FR93/00772 certaines régions du génome de l'hôte, perrnettant, par recombinaison homologue, l'int.ogr~hon du vecteur. Les hôtes cellulaires utili~hles pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes euc~oLes que proc~o~es. Parmi les hôtes eu~yoLes qui convienn~r t, on peut citer les cellules ~nim~ , les levures, ou les champignons.
En part~ rl s'~is~nt de levures, on peut citer les levures du genre r Sac~ha,o"iycec, ~luy7~omycec, Pichia, S~ io,tlyces, ou Hansenula. Sl:~gicc~nt decellules ~nim~ , on peut citer les oellules COS, CHO, C127, etc. Parmi les ignc-nc, on peut citer plus parti~-li~rementAcpergilluc ssp. ou Trichoderma 0 ssp. ~'~mnle hôtes proc~oLes, on ~r~2 utiliser les bactéries suivantes E.coli, oU Sl,~ .yce~.
Les séquenoes nucléotidiques de la présente invention sont égAl~.m~rlt r lltili~hles dans le ~ Aine phArm~llhque, soit dans le cadre d'une thérapie génique, soit pour la ~et~tiorl~ par des ex~ri~n~ d'hybri~iAtion, de l'e.~.~ion de gènes GAP dans des ~ lons biologiques, soit pour pr~ar~
des oligonllrl~oti~ nh~n~. Conc~ l la thérapie génique, les séquences de l'invention peuvent être insérées dans des v~llr~ tels~que des vecteurs r~Ll~,vildux ou des v~t~llrs adénoviraux, p~ ttAr~t leur admini~tr~hon in vivo (Médec ine et S~i~n~ 7 (1991) 705).
Les dirr~i~w,~es séquences nllrléotifiiques de l'invention peuvent être d'origine artifiri~lle ou non. Il peut s'agir de séquences ~nomi~lues, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synt~étiques ou semi-synth~tiques. Ces séquences peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN g~nc-mique)~ soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes incluant la mot1ifi-~Ation chimique ou ~yll~AI ;qe de séquences obtenues par criblage de banques.
Les produits de la présente invention peuvent être utilisés dans le ~lomAine thérapeutique: en particulier, les peptides de l'invention étant capables de moduler l'activité des protéines r_s, ils permettent d'intervenir dans le processus de développement des (~Arlc~rs, et not~mm~-ntl ils peuvent inhiber l'activité des oncogènes dont l'activité transro~ te passe par une int~ tion p21-GAP fonctionnelle. De nombreux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques. Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gènes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du WO 94/03597 . Pcr/FR93/00772 21~i96~

pancréas, dont 9096 ont un oncogène Ki-ras muté sur le doll7i.3mP codon (Almoguera et coll., Cell 53 (1988) 549), les adénocar~ inomP-s du colon et les cancers de la thyroïde (50%), ou les carrinompc du poumon et les lel-~mip~c myéloïdes (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682).
L'illvel~Lion a donc ~lPmPnt pour objet toute composition ph~rm~elltique co~ re~ ant ~ommP prinripe actif au moins un peptide et/ou un oli~ntlrléoh~ie ~nti~nc et/ou une séquence nllrl~ique selon la présente invention. Les o~ ositionc ph~rm~ tiques de l'ill-v~llion peuvent ê~hre formllléPc en vue d'une z~iminictr~hon par voie topique, orale, ~,a~ lP, 0 inL~ cAlP, inLlav~ Pl~cP, inhr~m~ ire~ sous~lt~P~, inhraoculaire, ek~
Pr~ tiellement, lec compositionfi phz3rm~-Pllhques cQnhennf~nt des v~hi~ll~.c pharm~llhqllemPnt accepldLles pour une formtll~h~n inje~hle. Il peut s'agir en particllliPr de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorurede sodium, ~ol~c~ m, calcium ou m~gnpsillml etc, ou des m~l~ng~ de tels sels), stériles, icotQtliquesl ou de ~om~s;l;Qnc s~hPfi, nolz.. ~ent lyophili~Ps, qui par addition selon le cas d'eau st~rili~ée ou de sérum physiologique, pPrmPtt~nt la c~?-,SI;IIltior~ de solutés i"jert~hlPs Les doses de principe actif (peptide, séquence mlrl~ique ou vecteur) lltili~Ps pour l'~-iminict~Ahon peuventêtre a~lées en fonction de dir~ ts p~r~mptresl et nol~ Pnt en fonrhon du 20 mode d'A~lmini~tr~hon utilisé, de la p~t~ologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du ~ el~Pnt recherchée. D'une manière génerale, conc~~ t les virus recombinants selon l'invention, oeux-ci sont formulés et mini~hrés sous forme de doses ~ln~ises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de ~r~f~ce 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu (nplaque f~lllung unitn) colles~ond 25 au pouvoir infertiell~ d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire a~plo~l;ée, et mesure, ~n~r~l~ment après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les terhniques de ~ hon du titre pfu d'une solution virale sont bien docllment~ dans la littérah~re.
Les compositions pharrn~relltiques sont plus partic-lli~rement destinées 30 à une lltilic~hon dans le L~ nts des cancers. Plus parti~lli~rement~ les compositions pharrn~relltiques ~c~ r~nent au moins un virus dans lequel est incorporé au moins une séquence nucléotidique telle que décrite ci-avant.

WO 94/03597 . Pcr/FR93/00772 ~ --D'autres avAntAg~oc de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être con~ifi7~rés conme illl7stratifs et non limitAhf,c, T.~p~rrl~ f~m~es 5 Figure 1: Mise en évidence de la région eLLe~11;ce de la ~rot~ e GAP.
Figure 2: Profil antigénique du peptide SEQ ID n 2 criblé en recouvrement séquentiel par l'Anticorps Ac200.
Fig7 re 3: Effet des peptides de l'invention sur la maturation des oeufs de xénope induite par p21 Ras Lysl2, l'insuline ou la ~r~,esl~ e.

T~hniques ~n~ c ~1~ clon~e Les méthodes classiql~Pm~nt utilisées en biologie nlol~llAire telles que les extrA~tionc ~ ~aLves d'ADN plAçmklique, la centrifllgAhon d'ADN
plAcmklique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d~acrylAmi~le~ la pllrifi~Ahon de frAgm~ntc d'ADN par ~lectroélution, les extrA. honc de ~lv~i.~P-c au phénol ou au phénol chloloL~ e,la ~r~i~i~Lon d'ADN en milieu salin par de l'~thAnol ou de l'isc,~ro~anol, la transÇ ~ AI ;on dans E;cheri~*ia coli, etc, sont bien ro~n~ c de l'homme de métier et sont abon~lAm~rlt rlé~ritf~s dans la li~ re [Maniatis T. et al., "Mole~lAr 20 Cloning, a LaL,olato.~ Manualn, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), ~Current Protocols in Molecular Biologyn, John Wiley & Sons, New York, 1987~.
Les enzyrnes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Beth~ctlA. Resear~, T Al~.~lo.;es (BRL) ou Amersharn et sont ll~ ée~
25 selon les reComm~n~lAhons des follrni~set1- s.
Les plasrnides de type pBR322, pUC, lgtll, pGEX 2T et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale.
Pour les ligatures, les frAgm~nt.~ d'ADN sont sép_rés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylAmi~e, extraits au phénol ou par un 30 n~ nge phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence del'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomrnandations du fournisseur.
Le remplissage des extrérnités 5' pro~min~ntes est ~ffel t- lé par le frA~m~nt de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les WO 94/03597 . PCr/FR93/00772 ~ 214106~
g sp~fi~ ~ions du fourni.~sellr. La destruction des ~ll~tés 3' proéminentes est ~ffechl~e en présenoe de l'ADN Polymérase du phage T4 lBiolabs) lltili~ee selon les læo...~--An-l~hons du fabricant. La destruction des exl~ ités 5' pro~minenP~c est ~ffectll~ par un ! .,.ilf~ P.nt m~.n:~ par la n~ ~ce S1.
La m1~t~g~.n.3ce rlirig~e in vitro par oligodéoxyn~ oti~ c synth~tiques est ~ffech~e selon la méthode développ~e par Taylor et al. [Nuc~eic Acids Res.
13 ~1985) 8749-8764] en llhli~nt le kit distribué par ~m~
L'~mplifi-~hon e,LGyll-aLque de ~Ir.~,ll~e.~t.c d'ADN par la t~rhrlique dite de PCR ~olymérase~atalyzed Çhain R~ orl~ Saiki R.K. et al., S~ n~ 230 0 (1985) 1350-1354; Mullis KB. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 ~1987) 33~350]
est ~ffectllée en l~tilisAnt un "DNA th~rmAl cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les sp~ifi~Ahons du fAhri~Ant La v~rificAhon des séquences nl~rléoti~liques est ~ffe~h~ par la méthode développée par SAn~r et al. [Proc Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467l en uhli~Ant le kit distribué par Amersham.
Pour les expPriPn~; d'hybridation, les ~r)~iihions de sh^ingen~ normAl~
sont ~rAl~n~ent les suiv~les: hybrirl~tion: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à 65C; lavage: 0,5 x SSC à 65 C.
FiY~n~ple l Mic-~ en évi-l~n~ c r~ n~ effe~1, ;ces L'existenoe de régions ~ffer~ices au sein de la ~roU~l,e GAP a été
~iémontrée par la rnise en évidenoe que des Anh~rps anti-GAP étaient capables de bloquer l'activité t~dllsÇO. ..~ t~ de ras (E.1.1.) alors que ces mêmes anticorps ne mo lifiAi~nt pas l'int~rAction GAP-ras (E.1.2.).
E.1.1. Inhibition de la fon~hon ras par des Anti~rps anti-GAP.
Les Anticorps nlon~lr~nAllx de souris dirigés contre la ~roL~i~le GAP ont été obtenus auprès de M. Thang (Inserm U245, Hopital St Antoine, Paris). Ces AnhCorpS ont été lltili~S pour mettre en évidence le role de l'interaction GAP-p21 et, plus pr~ nt, pour montrer l'influence d'une inhibition de cette interaction sur la maturation d'oeufs de xénopes induite par ras.
Des grenouilles Xenopus laevis ont été obtenues auprès du CNRS
(Monh~?ellier, France). Les grenouilles sont anesthésiées dans l'eau glacée, et des frA~n~nt~ d'ovaires sont prélevés chirur~ Al~m~nt et transférés dans un milieu W O 94/03597 , PC~r/FR93/00772 2~

Barth modifié (Hirai et al., Dev. Biol. 100 (1984) 214). Les oocytes au stade VIsont récupérés en ~git~nt les agrégats d'oocytes pendant 2 heures à température ambiante en pr~sence de 2 mg/ml de coll~n~se (Sigma). Pour l'analyæ de la maturation induite par ras, 40 nl de la ~ro~ille dans du milieu Barth modifié
s sont introduits dans le cytoplasme des oocytes par microinje( tion~ soit æuls, soit en présence des anticorps anti-GAP à difre.~les con~-p-nt~tions. Pour l'analyæ
de la maturation induite par les horm->nPs, les oocytes sont incubes en présenced'incl~line (10 ~g/ml) et de ~hlorure de zinc (10 ~M) (in~ inP pancréatique bovine, Si~m~) ou de ~,es~ol,e (1 ~M). Les oocytes sont conservés ~ 20C
o dans du milieu Barth modifié, et le 96 de rupture de vésicule ~ le (GVBD) est ~ aprèR 18 heures d'in~lh:~hon, par ~liscechon deR oocyteR
préalabl~mPnt fixés en présenoe de 5% d'acide trichloroac~tique. LPR r~Rl1lt~t~
sont e~ R par le % de GVBD sur des groupes d'oocytes.
Les résultats obtenus montrent que oertains anticorps anti-GAP sont capables d~inhihrr l'activité transformante de la ~ro~e ras. L'~nhcorps Ac200 a été utilisé dans la suite de l'étude.
E.1.2. ~hsPnce d'effet de l'anticorps Ac200 sur l'interaction GAP-p21 L'int~r~rt on entre GAP et le complexe p21-GTP est ~ié~ e selon le protocole suivant. La ~roL~ e Ha-ras p21 normale tRey et al., Mol. Cell. Biol. 9(1989) 3904) est équilibrée avec un exc~s de (y-3ZP) GTP (3000 Ci/mmol, Dupont, NEN Reseai~l Products, Boston, Mass) dans un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 100 mM (NH4)2S04, 10 mM dithiothréitol, 1 mM MgCl2 et 50 mg/ml de sérum-albumine bovine, pendant 30 minutes à 30 C. L'incubation est ~ e en appliquant la solution refroidie sur une colonne PD10 (Pharmacia) 2~ équilibrée par un ~n~n Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 10 mM dithiothréitol, 10mM MgCl2, 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyl, pour ~.limin~.r les nllrléoti~ libres. La ré~rtion GTPase est une variante de oelle décrite par Cassel et Selinger (Biochim. Biophys. Acta 452 (1976) 538). La réaction est commen~e par ajout de 10 ~1 (15 ~g) du cytosol obtenu par sonication de souches d'Ecoli e~rim~nt le GAP (Cf exemple E.2.1. ci-dessous pour la production de GAP), à 1 pmol de Ha-ras p21-(g~2P) GTP dans du tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, dithiothréitol 10 mM, MgCl2 5mM, GTP
100 ~M, BSA 50 llg/ml, pour obtenir un volume final de 50 L~1. La réaction est WO 94/03597 Pcr/FR93/00772 0 21~1~G1 réalisée pe.n-iAnt 3 minutes à 30C et arl~L~e sur la glaoe par addition de 950 ~l d'acide phosphorique 20 mM (pH 2,3) cont~n~nt 596 (w/v) de charbon activé.
Après ce~ ugation à 1800 g, la rA~iioArhvité est mesurée dans des ~chantillons de 200 ~l du stu.lA~ )t Les résultats sont ~r~tés ci-dessous.
Produit testéActivité relative GAP
Aucun 100 Ac200 100 ~275-351]GAP 100 Ac Y13-259 5 Ils monLl~lt que l'Anti~rps Ac200 ne modifie pas l'intP.rArtion GAP-p21.
Le même essai réalisé avec le frA~n~.nt 273-351 de GAP (SEQ ID n 1) démontre egAle.mP.nt que oe poly~,ep ide ne modifie pas l'illL~d~Lion fon~ tionn~ . GAP-p21.
ry~ e ~ r~ ri~tion ~ r~ n effectrice E.2.1. Mise en évidenoe d'une région de 80 aa environ par fr~f~m~ntAtion de GAP, production de ~c frA~n~nts de GAP sous forme de fusion GST, et rédCtiVité ViS-d-ViS de l'Anhcorps Ac200 neutr~ nt La séquence d'ADN ro~lAnt pour la ~rotéine GAP a été frA~m~.nt~e par tis)n ~l~ymaLique, et les fr~n~.nt.~ obtenus ont été se~dres par électroélution et mis sous forme de fr~m~nt.~ BamHI-EcoRI. Ces fr~ nt.S ont ensuite été ~l;mées dans la souche d'E.coli TG1 sous forme de protéines de fusion avec la gll~tAthion S-~ansférase (GST) selon la t~hnique décrite par Smith et John~on (Gene 67 (1988) 31). Pour cela, les différents fragments d'ADN
obtenus ont été insérés dans les sites BamHI-EcoRI du vecteur pGEX 2T
(PhArmA~ ), en 3' et en phase d'un ADNc codant pour la GST. Les vecteurs ainsi obtenus sont ensuite lltili~.s pour transformer la souche Ecoli TG1. Les - cellules ainsi transformées sont précultivées une nuit à 37C, diluées au 1/lOe dans du milieu LB, ajoutées d'IPTG pour induire l'expression (2 heures, 25C), puis cultivées 21 heures environ à 25C. Les cellules sont ensuite lysées, et les 30 ~rotei.l~s de fusions produites sont purifiées par Affinité sur colonne Agarose-GSH. Pour cela, le lysat b~t.?rien est incubé en présence du gel (préparé et =

WO 94/03597 . pcr/FR93/oo772 ? 3-4~ 2 équilibré avec le tampon de lyse) pendant 15 min à 4C. Après 3 lavages avec un tampon Tris-HCl pH 7,4, les protéines sont éluées en présence d'un tampon Tris-HCl pH 7,7 contenant un excès de GSH. Le surnageant est récolté et centrifugé.
Les fragments ainsi obtenus sont testés en fonction de leur reconn~i~n-e par l'anticorps Ac200. Les résultats obtenus sont prP~ent~ sur la figure 1. Ils m~ L que la région ~rr~ . ;oe de la ~r~L~l,e GAP est située entre les résidus 275 et 350 environ.
E.2.2. I~lPntifi~ ~tion plus précise par nEpitope S~AIIII;I~f~n La te hnique "d'epitope s~nning" est basée sur le prinfipe qu'un ~nti~orps donné peut réagir avec des peptides de 5 à 15 acides ~min~. De oe fait, l'i~lPrlhfi~hon d'épitopes séqllpntiplc peut être obtenue en ~i~alant un jeu complet de peptides recouvrants, de 5-15 acides ~min~, ~l,es~~ nt~ à la séquence complète de l'~nti~nP ron~i-lPré. Cette terhnique a été utili~e pour lélP- n~;,)Pr les épitopes fonctionnels du fr~mPnt de GAP mis en évidence à
l'PYPmple E.2.1. ci~ s l~. Pour cela, la t~tAli~é du fr~rnPnt a été explorée parrecouvrPmPnt~ séql~PntiPls, par synthèse d'un décapeptide tous les 2 acides aminés.
a) Synthèse des peptides recouvrants.
35 peptides couvrant la tot~lit~ de la séquenoe SEQ ID n 1 ont été
srtll~ti~ chimiqllPment La synthèse a été Pffe~tllPe en double, sur 2 supports indépPn~l~nt.~, par la méthode Pmoc/t-butyl sur phase solide (kit Cambridge Research Bio~ ~Pmi~
b) Mise en évidence des ~pitopes fon~tionnPl~.
Les épitopes fonctionnels ~ lc par l'anticorps Ac200 ont été révélés en test ELISA par un anticorps de lapin anti-souris couplé à la peroxydase. Le substrat chromogénique de l'enzyrne utilisé est l'amino-di-(~
ethylbenzothiazodine sulfonate) (ABTS).
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. LeS épitopes reconnus par cet anticorps sont les suivants:
- PVEDRRRVRAI (P1) W094/03597 i3 Pcr/FR93/UO772 - EISF (P2) - EDGWM (P3) Il est ~ntPn~lu que d'autres régions fonrtic)nnpll-p~s de la séquence SEQ ID
n 1 peuvent être mises en évidence en llhili~nt d'autres ~ntirorps anti-GAP.
Sur la base de ces résultats et en llhli~nt la même technique de synthèse chimique, les peptides suivants ont été synt~ s:
- APPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGD (P4) - WMWVTNLRTD (P5) - ISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTD (P6) - VTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKI (P7) - PPEPVEDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELEDGWMW
VTNLRTD (P8) - Peptide SEQ ID n 3 (P9) ..~le 3: C'~r~t~l;saL;on biolo~
E.3.1. L'activité biologique des peptides de l'invention a été étll~liee en mesurant leur effet sur la rn~hlr~tion d'oeufs de xénopes induite par p21 ras Lysl2, par l'insuline ou par la pro~e ,l~ol~e.
Le ~rotocole utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple E.1.1. ci-dessus. L'activité est mesurée par microinjection dans le cytoplasme des oocytes20 de 40 nl le la ~roL~ e p21 ras dans du milieu Barth modifié, soit seuls, soit en présence des dir~er~l,ts peptides de l'invention à des conc~ntrations variables.Les résultats sont exprimés par le % de GVBD sur des groupes d'oocytes. Les r~clllt~ts sont pr~c~nté~c sur la figure 3.
Ces résultats monll~Lt clairement que les peptides de l'invention, 25 no~ nt le peeptide SEQ ID n 1 et le peptide (P5), sont capables d'inhiber l'activité transÇ~ an~ de la ~ro~Lne ras. Un fragment de longueur identique ([768 860] PLCy) ~r~ar~ par les m~m~c techniques à partir de la phospholipase C type ~y humaine ne présente pas l'activité du peptide de l'invention.
E.3.2. Le peptide P9 a été purifié sous la forme d'une protéine de fusion à
30 la GST selon le protocole d~crit dans l'exemple E.2.1., puis séparé de la GSTaprès clivage protéolytique à la ll~ul~LLIe. Le peptide P9 ainsi obtenu a ensuite été testé sur la maturation d'oeufs de xénopes dans les conditions de l'exemple WO 94/03597 . PCI/FW3/00772 E.3.1. Les résultat, obtenus montrent que le peptide P9 bloque compl~tptnent la maturation des ovocytes.
L'activité de P9 a ~n~tli~ été évaluée dans un test de forln~tion de foyers de cellules ~al,sÇ~....~s. Les cellules cancéreuses ont en effet la propriété deformer des foyers de transformAtionr et n~tAmtnent les fibroblastes NIH 3T3 ,mant un ras oncogénique. Les aellules NIH 3T3 ont été cultivées d_ns du milieu DMEM (milieu Dulbecco modUié Eagle) c~lllr~nz~ 10 % de sérum de veau fétal, à 37 C, dans un envilo~ e~ nt hllmi~ n..ltf~ t 5 % C02. Les plAcmi~i~; pSV2~AP et pSV2-P9 ont été construits en in~rAnt les séquences 0 ml~ léotirliques codant pour GAP et pour P9 (SEQ ID n 3) dans le vecteur SV2.Les cellules NIH 3T3 ont été ~x,L~re~ées avec avec un ras oncogénique Ha-ras Vall2, les plasmides indiqués dans le tableau, et un ex~s de 10 fois du gène de r~ictsn~ à la néomycu~e, par la te~hnique de ~r~nsfe~;on aux lipides Ahoniques (Schweighoffer et al., Science 256 (1992) 825). La n~8me qll~nhite 1~ d'ADN total est transfectée pour chaque boite. 24 heures après la ~ .sre. ~ ;on, les cellules transre~es ~i~)v~ant de chaque boite de pétri (100 mm) sont divisées dans un ~ 1 à 10 et cultivees dans le me~me milieu mais en présence de G418 (Gibco/BRL) à 0,4 mg / ml de miliell Le nombre de foyels de transformation obtenu pOE L~g d'ADN ~ cr~1~ est comptabilisé après 14 purs 20 de culture. Les résultats obtenus sont pré~s~nt~s dans le tableau suivant. Ils r~r~ .)t la moyenne de quatre essais indép~n~l~nts pl~cmi~les L~ sfectésNombre de foyers par ~g d'ADN transhcté
Ha-Ras Val 12 110 Ha-Ras Val 12 + pSV2~AP 120 Ha-Ras Val 12 + pSV2-P9 35 Ces résultats montrent clairement que les peptides de l'invention 25 (notarnment le peptide P9) sont capables de diminuer très fortement le pouvoir transformant d'un gène ras oncogénique.

E.3.3. Activité antitumorale in vivo WO 94/03597 , 21~ 10 6 ~ PCr/FR93/00772 .

a) Pl~aLion d'un virus recombinant comprenant une s~quence nucléique selon l'invention.
Les virus ,~ h~ s défio~ctifc de l'invention peuvent être prepa-és par ;con~ dison homQloglIe entre un virus défectif et un pl~cm;~ie portant entre autre la séq -Pnce d'~c;des mlr~l~;q~ec telle que dé inie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La .eco.,~ aisoll homologue se produit après co-~ cr.~I;rJn desdits virus et plasmide dans une lignée cçl~ ire app-op-iée. La lignée ce~ lA ~ utilisée doit de prérélellce (i) être l,~rollllable par lesdits eIe~"~ c~ et (ii), co...po.ler Ies séq~IP-nr~,s c~pables de c~c rlen~nt~r la partie du gpnorne du virus 10 défertif, de p~f~"ence sous forme intégrée pour éviter les risques de reco~ il1aisoll. A
titre d~ 1C de lignée utilisable pour la p.~ Lion d'adénovirus lcCOllll)illan~S
dPfectife, on peut mP.ntiQnnPr la lignée de rein c.~ yol~ll~e humain 293 (Graham et al., J. Gen. ~lrol. 36 (1977) 59) qui contipnt nol;~ n~, i-.~égree dans son génome, la partie gauche du Be~ e d'un ad6no~,..us Ad5 (12 %). A titre d'PYPmple de lignée utilisable 15 pour la pr~&l~Liol1 de 16LloV l`Us lecolll~ ls defP,ctifc, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et hrlllli~n~ PNAS 85 (1988) 6460).
F.n.eIlite, les virus qui se sont ~ ;plies sont recupt;lt;s et purifiés selon les tP~hniques rl~cQ;quP~s de biologie molcc~ ire.

La séquence SEQ ID n 3 codant pour le peptide P9 a été donée dans un pl~mi~le néo sous controle du promoteur précoce de SV40. La cassette Pron~otel~r SV40-SEQ ID n 3 a ~n~1lit~ été clonee dans un vecteur rétroviral de t~pe Moloney (Palmer et al., PNAS 84 (1987) 1055). Un vecteur controle a également été construit, dans lequel le fragment a été inséré dans l'orientationantisens.
Les cellules amphotrophiques GP+envAml2 ont été transfectées avec les vecteurs l`~ll'O\~ildWC décrits ci-dessus par la technique au phosphate de calcium (Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400; Graham et al., Virology 52 (1973) 456). 48 heures après la transfection, les cellules transfectées sont repiquées dans un milieu contenant du G418 (Gibco, BRL) à la concentration de 0,4 mg/ml.
Deux semaines plus tard, les colonies résistantes au G418 sont cultivées en grande qll~ntite Les cellules transfectées présentant un titre élevé en virus sont cocultivées avec les cellules ecotropiques d'empaquetage Psi2 afin d'augmenter le titre viral (Palmer et al., PNAS 84 (1987) 1055).

wo 94/03597 . Pcr/FR93/00772 2~Q~ --Les virus recombinants ainsi produits sont isolés par les techniques classiques de biologie moléculaire.
b) Activité Anti~lmlor~le in vivo Un modèle de tunle-~- plllmonAire chez la souris a été mis au point selon la te~hnique iérrit~ par Mc Lemore et al (Canoer Res. 0 (1987) 5132). Pour cela, les souris ~,2,coivw.t en intr~trA~l 105 c~ lec H460a. Aux jours 4, 5 et 6, les souris ayant reçu la tum~l~r sont l~il~ par la mêrne voie intLaL~ ~le avec 0 0,1 ml de suspension virale obtenue ci-dessus (~Iv~l~ 5.106 cpu/ml) ~ont~n~nt 5 ~g/ml de ~olamine. 3{) jours après l'in~l~tion de la h~n~ellr~ les souris sontanalysées pour la présence de tllmPl~rs~ dont le volume est approximé selon la t~hnique décrite par Mc Lemore et al pré~i~e. Les ~nim~llY t~raités par le virusP9 ne pr~.c~ntent pas de tl~m~ll-s m~cllr~hles, ou ~ m~nt des t~m~ s de très petite taille. En revanche, les ~nim~llY traités par le même titre viral du virus P9 ~nti~nc sont in~lictin~uables des ~nim~llY controle n'ayant re,cu que la tl lmel lr.
Ces résultats montrent clairement que les séquences de l'il~v~-Lion, nnt~mm~nt sous forme de ve~t~urs viraux, peuvent ~tre l~hli.c~c in vivo pour le tr~itement des cancers.

Il est ~nt~n~lu que l'hc-mme du métier peut utiliser d'autres virus pour le hr~n.cff~rt des peptides de l'inv~nLion in vivo. NotAmmPnt, il peut s'agir d'adénovirus, de virus adéno-~co~ c, du virus de l'herpès, etc. Des vecteurs dérivés de ces virus ont été d~rits dans l'art ~nt~riel lr et la construction de virus 25 selon l'invention peut être ~ff~tl~e par ~ cmme du métier sur la base de ses ~orlnAi.~C~n~ générales (voir n~ t~mm~nt Aldi et al., Nature C~n~ti~ 3 (1993) 224; Sl~aL~ord-P~ 1et et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; WO 91/1808; EP 243204).

Z1~106I
.

LISTE ~E SEOUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:
-(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S~~.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
~E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TIIRE DE L' INVENTION: PEPTIDES INHIBANT L'ACTIVITE DES PROTEINES RAS, PREPARATION ET UTILISATION
~j (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: S
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape 20 (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C3 SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version ~1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 234 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTH~;TlQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..234 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(D) AUTRES INFORMATIONS: Fragrnent 273-351 du gène GAP

F~UILLE l`~0B~Fl ~141~6~
.

(xi) DESCRIPTION DE LA S3~QUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCA CCP CCA GAG CCP. Gmk GAA GAT AGA AGG CGT GTA CGP GCT ATT CTA
A i2 PrG P-o GiU Pro Val Giu Asp Arg Ars Arg Val Ars Aia Ile Leu CCT TAC ACA ~A GTA CCP GAC ACT G~T GAA A~A AGT TTC TTA AAA GGA 96 Pro Tyr Thr Lys Val Pro Asp Thr Asp Glu }le Ser Phe Leu Lys C-ly 10 GAT ATG TTC ATT GTT CAT AAT GAP. TTA GAA GAT GGA TGG ATG TGG GTT 1 .sp Met Phe Ile V~l His Asn Glu Leu Glu Asp Gly ~rp Met Trp Vzl ACA AAT TTA AGA ACA GAT GAA CAA GGC CTT ATT GTT GAA GAC CTA G~A 192 1~ Thr Asn Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu Ile Val Glu Asp Leu Val G.~ GAG GTG GGC CGG GAA GAA GAT CCA CAT GAA GGA AAP ATA 23 Glu Glu Val Gly Arg Glu Glu Asp Pro His Glu Gly Lys Ile (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
2~ (i) CARACTERISTIQUES DE L A SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 78 acides aminés (B) TYPE: aade aminé
(D) CONFIGUl~ATION: lineai~e (ii) TYPE DE MOLECULE: prot~ine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Ala Pro Pro Glu Pro Val Glu Asp Arg Arg Arg Val Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Thr Lys Val Pro Asp Thr Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys Gly 2G 25 ~ 30 Asp Met Phe Ile Val Hls Asn Glu Leu Glu Asp Gly ~rp Met Trp v21 35 40 ~5 mhr Asn Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu Ile Vzl Glu Asp Leu Vzl Glu Glu Val G'y Arg Glu Glu Asp Pro His Glu Gly Lys Ile ~0 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

lLLE i~OD~

2 1 ~

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1:>48 paires de bases ~B) TYPE: acide nudéique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: iin~aire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ~i;i) HYPOTHEIIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(v) I~YPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (LX) CARACTERISTIQUE ADDllIONELLE:
~A) NOM/CLE: CDS
~B) EMPLACEMENT: 1..1548 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(D) AUTRES INFORMATIONTS: Fragment 38~1~33 du gene GAP

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENOE: SEQ ID NO: 3:

25 Gly Gly Gly Phe Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Leu Pro ~ro Leu Gly Ala Gly ~eu Gly Thr Val Asp Glu Gly Asp Ser Leu Psp Gly Pro Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Val Ala Ile Pro Leu Thr Ala Pro Pro Thr Asn Gln Trp Tyr H~s Gly Lys Leu Asp Arg Thr Ile Ala Glu Glu Arg CTC AGG CAG GCA GGG AAG TCT GGC AGT TAT CTT ATA AGA GAG AGT GAT 24GLeu Arg Gln Ala Gly Lys Ser Gly Ser Tyr Leu Ile Arg Glu Ser Asp Arg Arg Pro Gly Se~ Phe Val Leu Ser Phe ~eu Ser Gln Me~ P.sn Va Val Asn His Phe Arg Ile Ile Ala Met Cys Glv Asp Tyr Tyr Ile Gly ~0 100 105 110 Gly Arg Arg Phe Ser Ser Leu Ser Asp Leu Ile Gly Tyr Tyr Ser His .

Val Ser Cys Leu Leu Lys Gly Glu Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ala Pro ~~:UI~ hO~

CCA GAG CCP GTA G~ GAT AGk AGG CGT GTA CGA GCT P.TT CTA CCT ,~Ar 48Q
?ro G'u P-o Va'~ G1u P.sp P-rG A-~ ArG V21 A g ~lc le Leu P-o Tyr 1 5 1~0 1~5 16Q
ACA AAA GTA CCA GAC ACT GPT G2A ATA AGT T'TC TTA AAA GGA GAT ATG 528 Thr Lys Val ~ro Asp Thr Asp Glu }le Ser Phe Leu Lvs Glv As~ Met TTC P TT GTT CAT AAT GAA TTA GAA GAT GGA TGG ATG TGG GTT ACA APT ;76 Phe Ile V21 ~s Psn Glu Leu Glu Psp Gly ~rp Me. Trp VG1 Thr Asn TTA AGA ACA GAT GAP. CAA GGC CTT ATT GTT G~ GAC CTA GTA GAA GAG 624 Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu Ile Vzl Glu Asp Leu V21 Glu Glu 1o,s 200 205 Val Gly Arg Glu Glu Asp Pro Xis Glu Gly Lys Ile Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Lys Gln Glu Ala Tyr Asn Leu Leu Met Thr Val Glv Gln 2~

Val Cys Ser Phe Leu Val Arg Pro Ser Asp Asn Thr Pro Gly Asp Tyr TCA CTT TAT TTC CGG ACC AAT GAA AAT ATT CAG CGA TTT AAA ATA TGT 816Ser Leu Tyr Phe Arg Thr Asn Glu Asn Ile Gln Arg Phe Lys Ile Cys 3~ Pro Thr Pro Asn Asn Gln Phe Met Met Gly Gly Arg Tyr Tyr Asn Ser Ile Gly Asp Ile Ile Psp ~is Tyr Arg Lys Glu Gln Ile Val Glu Gly TAT TAT CTT AAG GAA CCT GTA CCA ATG CAG GAT CAA GAA CAP~ GTA CTC 960 Tyr Tyr Leu Lys Glu Pro V2l Pro Met Gln Asp Gln Glu Gln Val Leu

4~
AAT GAC ACA GTG GAT GGC AAG G~ ATC TAT AAT ACC ATC CGT CGT AAA 1008 Asn Asp Thr Val Psp Gly Lys Giu Ile Tyr Asn Thr Ile Arg Arg Lys ACA AAG GPT GCC TTT TAT A~P. AAC ATT G?T AAG AAA GGT TAT CTT CTG 1056 Thr Lys Psp Ala Phe Tyr Lys Asn Ile Val Lys LYS Gly Tvr Leu Leu AAA AAG GGC AAA GGA AAA CGT TGG AAA AAT TTA TA? TTT ATC TTA GAG 1104 Lys Lys Gly Lys Gly Lys Arg T-p Lys Asn Leu TY- Phe Ile Leu Glu Gly Ser Asp Ala Gln Leu Ile Tyr Phe Glu Ser Glu Lys Arg Ala Thr AAA CCA AAA GGA TTA ATA GAT CTC AGT GTA TGT TCT GTC TAT GTC G?T 1200 Lys Pro Lys Gly Leu Ile Asp Leu Ser Val Cys Ser Val Tyr Val Val F~ E t~ FIE~

CAm GAT AC-T CTC mm~ T GGC AGC- Cr~ AAC TGT Tm ~m CAG ATA C-TA GTm CAG '248 Xls Asp Se- Leu Phe Gly A-g Pro ~.sn Cys Pne Gin Ile Val Val Gln 405 '10 ~15 CAC TTT AGT GAP GAA CAT TAC ATC TTT TAC TTT GCA GGP. GAP. ACT CCA 1296 His Phe Ser Glu Glu Hls Ty- Iie Phe Tyr Phe Aiz C~ly Glu Thr Pro 420 425 ~30 Glu Gln hla Glu Asp Trp Met L~s Gly Leu Gln Ala Phe C~s Asn Leu ~35 440 445 Arg Lys Ser Ser Pro Gly Thr Ser Asn Lys Arg Leu Arg Gln Val Ser Ser Leu Val Leu H~s Ile Glu Glu Ala His Lvs Leu Pro Val Lys His 465 ~70 475 480 Phe Thr Asn Pro Tyr Cys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Val Gln Val Ala Lys Thr His Ala Arg Glu Glv Gln Asn Pro Val Trp Ser Glu Glu Phe Val Phe Asp Asp (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 aciaes aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptiàe (iii) XYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: lnlerne (vi) ORIGINE:
(B) NOM : Peptide P4 (xi) D~SCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
~0 Ala Pro pro Glu Pro Val Glu As~ Arg Ars Arg Val Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Thr Lys Val Pro Asp Tnr Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys Glv

5~ 20 25 30 ' Asp ;
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 10 acides aminés FEUILLE ~tO~lFlE~

~ 2141~61 (B) TYPE: acide amlnC
(D) CONFIGURATION: ;-n~aire ( ~ TYBE D~ MO~ECULE: pep~ide (l_l) HYPCTH~IQUE: NON
(v) TY~E DU FRAGMENT: in.erne (vi) ORIGINE:
(3) NOM : Peptide P5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Trp Mel Trp Val Tnr Asn Leu Arg Thr ~sp 1~
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACmERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 acides aminés (B) TVPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide 2~ i) HYPOTHETIQUE: NON
~) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(B) NOM : Peptide P6 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ile Ser Phe Leu Lys Gly Asp Met Phe Ile Val Xis Asn Glu Leu Glu 3~
P.sp Gly Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 acides amines (B) TYPE: acide amin~
4~ (D) CONFIGURP.TION: 1in~1re (li) TYP~ DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGM~NT: interne ~0 (vi) ORIGINE:
(B) NOM : Peptide P7 (~.i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ~D NO: 7:
_ _ -Val Thr P.sn Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu Ile Val Glu Asp Leu 60 Val Glu Glu Val Gly Arg Glu Glu Asp Pro Hls Glu Gly Lys Ile FElJl'_LE ~DDI~lEE

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Peptide dérivé de la protéine GAP, capable d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des protéines p21 activées.

2. Peptide selon la revendication 1 capable d'inhiber au moins partiellement l'activité transformante des complexes p21-GTP-GAP.

3. Peptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il est capable de lier la protéine p21, éventuellement complexée au GTP, et en ce qu'il porte une région effectrice rendue non fonctionnelle.

4. Peptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID n°2 ou d'un dérivé de celle-ci.

5. Peptide selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les peptides P1 à P9.

6. Peptide selon l'une des revendications précédentes modifié par une séquence d'adressage à la membrane de type CAAX où C est une cystéine, A un acide aminé aliphatique et X un acide aminé quelconque.

7. Peptide capable d'entrer en compétition avec un peptide selon l'une des revendications 2 à 6 pour l'interaction avec sa cible cellulaire.

8. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de moduler l'activité transformante des protéines p21 obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 7 par des structuresnon peptidiques ou non exclusivement peptidiques.

9. Séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

10. Séquence selon la revendication 9 introduite dans un vecteur viral permettant son expression in vivo.

11. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 9.

12. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule hôte une séquence nucléotidique selon la revendication 9, on cultive cette cellule dans des conditions d'expression de ladite séquence, et on récupère le peptide produit.

13. Composition pharmaceutique ayant comme principe actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 7 ou une séquence nucléotidique selon la revendication 9.

14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un virus recombinant dans lequel est incorporée une séquence nucléotidique selon la revendication 9.

15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce que le virus est choisi parmi les rétrovirus et les adénovirus.

16. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 13 à 15 pour le traitement des cancers.

17. Virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.

18. Virus selon la revenndication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus adéno-associé ou du virus de l'herpès.