CA2190293C - Methode de traitement des cancers par regulation de la proteine p53 - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode de traitement des cancers par régulation des niveaux cellulaires de la protéine p53. Elle réside plus particulièrement l'utilisation d'un composé capable de moduler l'activité de la calpaïne.

Description

W095133060 2 t$ ~ =l PCT/FR95/00670 s METHODE DE TRAITEMENT DES CANCERS PAR REGULATION DE LA

La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de traitement des cancers par régulation des niveaux cellulaires de la protéine p53. Elle concerne également des vecteurs de thérapie génique permettant de réguler la protéine p53, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant.
Depuis une quinzaine d'années, la caractérisation moléculaire des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur a pemis de jeter un regard nouveau sur le processus de la cancérogenèse. Ainsi, la connaissance de plus en plus approfondie de la régulation de ces gènes et de la fonction des protéines correspondantes permet de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques.
Plus particulièrement, l'élucidation du catabolisme des protéines oncogéniques et anti-oncogéniques représente un enjeu majeur en terme de lutte anti-cancéreuse dans la mesure où elle laisse entrevoir, dans le cas des protéines oncogéniques, la possibilité d'accélérer leur dégradation et donc d'anihiler leur action, dans le cas des suppresseurs de tumeur, d'inhiber leur dégradation et donc d'augmenter leur effet anti-prolifératif ou anti-tumoral, dans le cas de protéines mutées, de potentialiser leur présentation antigénique par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité
et ainsi de stimuler une réponse immune spécifique des tumeurs, et, dans le cas où la forte expression de l'oncogène ou de l'anti-oncogène est capable d'induire la mort cellulaire programmée, la possibilité de stabiliser ces protéines pour déclencher le processus apoptotique.

Originellement, la protéine p53 a été classée comme un oncogène nucléaire puisqu'elle pouvait, dans des expériences de transfection, allonger la vie de cellules de rongeurs en culture ainsi que coopérer avec des oncogènes activés comme ras pour transformer des cellules en culture primaire. En fait, les gènes utilisés dans ces premières expériences étaient mutés et menaient à l'expression de protéines p53 variantes caractérisées par un gain de fonction. Sans exclure des fonctions qui resteraient à découvrir, on sait maintenant que la protéine p53, au moins sous sa forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement la croissance et la division cellulaire et qui, dans certaines situations, est capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). Ces propriétés se manifestant en a situation de stress où l'intégrité de FADN cellulaire est menacée, p53 a été
suggérée

2 être un "gardien du génome". La présence de p53 mutées dans environ 40 % des tumeurs humaines, tous types confondus, renforce cette hypothèse et souligne le rôle probablement crucial que jouent les mutations de ce gène dans le développement tumoral (pour revues, voir Montenarh, Oncogène, 7, 1673-1680, 1992 ; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992 ; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).

Là protéine -p53 sàuvàge est àsujett e à ui e régulation complexe qui fait intervenir le contrôle de sa synthèse et de son catabolisme ainsi que celui de sa localisation intracellulaire et de ses modifications post-traductionnelles (voir les revues citées plus haut). La protéine p53 sauvage est extrêmement instable avec une demi-vie de quelques minutes. Par contre, certaines protéines mutées qui s'accumulent à haut niveau dans les tumeurs ont une demi-vie significativement allongée.
Peu de choses ont clairement été établies concernant la dégradation de p53. En effet, ni les sites intracellulaires de dégradation, ni le nombre et la nature des voies cataboliques empruntées, ni les motifs peptidiques marquant p53 pour sa dégradation ne sont connus. A notre connaissance, la seule information disponible concerne l'implication de l'enzyme El du cycle de l'ubiquitine dans certaines conditions expérimentales (Ciechanover et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 139-143, 1991 ; Chowdary et al., Molec. Cell. Biol. 14, 1997-2003, 1994). Par ailleurs, il a été montré que certains produits protéolytiques dérivés de p53 peuvent être présentés de manière antigénique.
La présente invention concerne un procédé pour l'identification d'un inhibiteur de la dégradation d'une protéine p53 comprenant :
a) la mise à disposition d'un extrait cellulaire comprenant au moins une protéine p53 et au moins une calpaïne;
b) l'administration d'au moins une protéine et/ou d'au moins un polypeptide inhibiteur de l'activité calpaïne de l'extrait cellulaire; et c) la mise en évidence de la dégradation en mesurant la protéine p53 et les fragments de la protéine p53.

2a La présente invention concerne l'utilisation de la calpastatine ou d'une séquence d'acide nucléique codant la calpastatine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
La présente invention concerne aussi un vecteur viral comprenant une séquence d'acide nucléique codant une calpastatine, caractérisé en ce qui est choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés, et qu'il comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2.
La présente invention concerne également une composition telle que définie précédemment formulée en vue d'une administration intratumorale.

La présente invention résulte en partie de la mise en évidence que les protéines p53 sont des substrats pour des protéases dépendantes du calcium :
les calpaïnes. Elle résulte plus particulièrement de la démonstration que les protéines p53 sont dégradées spécifiquement par la m-calpaïne ou la p.-calpaïne. La présente invention constitue la première mise en évidence d'un mécanisme de régulation des niveaux cellulaires des protéines p53 et offre ainsi une nouvelle approche particulièrement efficace et spécifique pour moduler les niveaux de cette protéine dans des situations pathologiques telles que notamment certains cancers.

En particulier, la présente invention décrit une nouvelle approche pour le traitement des cancers, basée sur l'utilisation de composés modulateurs de l'activité
des calpaïnes sur les protéines p53, qui permettent soit d'activer la dégration de protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet=tumorigène .et/ou pour augmenter la présentation de peptides immunogènes, soit de stabiliser la protéine p53 sauvage, WO95133060 , 2 14,d! g73 PCTIFR95100670

3 pour contrebalancer l'effet tumorigène des protéines mutées exprimées dans les tumeurs et/ou pour induire l'apoptose des cellules tumorales.

Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé
capable de moduler l'activité de la calpaïne pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.

Les calpaïnes sont des enzymes ubiquitaires trouvées dans la plupart des cellules mammifères (pour revue, voir Croall et deMartino, Physiol. Rev., 71, 813-847, 1991). Elles sont essentiellement cytoplasmiques mais elles peuvent pénétrer dans le noyau à la faveur de la destruction de l'enveloppe nucléaire lors de la mitose ou à la suite de certains stimuli. Comme indiqué ci-avant, l'activité protéolytique des calpaïnes est dépendante de la présence de calcium.
Les composés capables de moduler l'activité de la calpaïne au sens de la présente invention peuvent être de plusieurs types.
Il peut s'agir de composés capables d'inhiber l'activité de la calpaïne sur les protéines p53. Ces composés sont particulièrement avantageux puisqu' ls sont utilisables pour inhiber, au moins en partie, la dégradation de la protéine p53 sauvage.
Ces composés permettent donc de stabiliser intracellulairement la protéine p53 sauvage et de contrebalancer l'effet des formes mutées. Parmi les composés inhibiteurs utilisables dans le cadre de l'invention on peut citer les inhibiteurs de protéases (leupeptine, aprotinine, PMSF, etc), les chélateurs du calcium (EGTA, EDTA, etc), ou des inhibiteurs plus spécifiques tels la calpastatine ou tout fragment ou dérivé de celle-ci. La calpastatine est un inhibiteur connu des calpaïnes. Sa séquence a été
décrite dans l'art antérieur (SEQ ID n 1). Un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention consiste à transférer dans les tumeurs un vecteur portant tout ou partie de la séquence codant pour la calpastatine. Cette approche est particulièrement adaptée au traitement des cancers présentant toujours un allèle p53 sauvage, tels que les carcinomes coliques ou bronchiques par exemple. Différents fragments ou dérivés de la calpastatine peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. De tels fragments ou dérivés peuvent être toute molécule obtenue à partir de la séquence SEQ
ID n 1 par modification(s) de nature génétique et/ou chimique, conservant la capacité
d'inhiber au moins en partie l'activité d'une calpaïne. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, délétion, substitution, addition, et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications peuvent être effectuées dans différents buts, et notamment celui de préparer des séquences adaptées

4 à l'expression dans un type particulier de vecteur ou d'hôte, celui de réduire la taille de la séquence pour faciliter leur pénétration cellulaire, celui d'augmenter l'activité
d'inhibition, ou, de manière particulièrement avantageuse, d'augmenter la sélectivité de l'inhibiteur vis-àvis de l'activité des calpaïnes sur la dégradation de la protéine p53 sauvage.
Dans un mode de la réalisation particulière de la présente invention, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'inhibiteur administré est une calpastatine.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques codant pour la calpastatine est la séquence SEQ NO: 1 ou la séquence SEQ NO: 2.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que l'extrait cellulaire provient d'une cellule cancéreuse.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que l'inhibiteur administré est un fragment de la calpastatine.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que la mesure de la protéine p53 et des fragments de la protéine p53 est effectuée par électrophorèse.
De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse in vitro, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels. Lorsqu'un dérivé
tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité d'inhibiteur de l'activité des calpaïnes sur les protéines p53 peut être mise en évidence de plusieurs façons, et en particulier en mettant en présence ledit inhibiteur et les différentes formes de protéines p53, puis en détectant les produits de dégradation obtenus (voir exemples 1 à 3). Toute autre technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet.

4a Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise comme inhibiteur tout ou partie de la calpastatine, ou un acide nucléique codant pour tout ou partie de la calpastatine. Encore plus particulièrement, on utilise un peptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n I ou d'un dérivé de celle-ci.

Concernant plus spécifiquement les dérivés, on peut citer à titre d'exemple le composé de séquence SEQ ID n 2, qui correspond à un fragment de la calpastatine.
On utilise avantageusement tout dérivé composés de séquence SEQ ID n 1 ou 2 capable d'inhiber spécifiquement ou préférentiellement la dégradation de la protéine p53 sauvage par la calpaïne, Les composés capables de moduler l'activité de la calpaïne sur les protéines p53 au sens de la présente invention peuvent également être des dérivé de la calpaïne capable de dégrader spécifiquement ou préférentiellement les protéines p53 mutées.
De tels dérivés sont également très avantageux puisqu'ils permettent d'activer la dégration des protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet tumorigène et/ou pour augmenter la présentation de peptides immunogènes, sans affecter de manière significative les niveaux cellulaires de protéine p53 sauvage. De tels dérivés peuvent être obtenus à partir de la calpaïne, par modification(s) structurales de nature génétique et/ou chimique. La capacité des dérivés ainsi obtenus de dégrader spécifiquement ou préférentiellement les protéines p453 mutées peut ensuite être mise en évidence comme décrit dans les exemples 1 à 3., WO95/33060 9 0-',L g3 PCTIFR95100670 Préférentiellement, les modulateurs utilisés dans le cadre de l'invention sont des protéines ou polypeptides, ou des séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides ou protéines. Encore plus préférentiellement, les composés modulateurs sont des protéines ou polypeptides inhibiteurs spécifiques de l'activité de la calpaïne

5 sur la protéine p53 sauvage ou des formes de calpaïnes, modifiées ou non, pour dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées.

D'une manière particulièrement avantageuse, l'invention réside dans la possibilité de faire exprimer dans des cellules cancéreuses présentant à la fois un allèle p53 sauvage et un allèle p53 muté des séquences nucléiques codant pour des inhibiteurs de la calpaïne, comme la calpastatine ou partie de la calpastatine, ou des formes de calpaïnes, modifiées ou non, pour dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées.

La séquence d'acides nucléiques utilisée dans le cadre de la présente invention peut être administrée telle quelle, sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrés sous forme complexée, par exemple avec du DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), avec des lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), sous forme de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Préférentiellement, la séquence utilisée dans le cadre de l'invention fait partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur permet en effet d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter, et également d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable. De plus, il est possible d'introduire plusieurs séquences d'acide nucléique dans un même vecteur, ce qui augmente également l'efficacité du traitement.
Le vecteur utilisé peut être d'origine diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules cancéreuses humaines.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-associés (AAV) ou le virus de l'herpès.
A cet égard, la présente invention a également pour objet tout virus recombinant comprenant, inséré dans son génome, un acide nucléique codant pour un composé capable de moduler l'activité de la calpaïne. Préférentiellement, les virus

6 utilisés dans le cadre de l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule infectée. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence codant pour le modulateur des calpaïnes. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour le modulateur des calpaïnes. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, Ll-L5 sont non fonctionnels.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant WO95133060 f PCT1FR95/00670

7 entre autre la séquence d'ADN codant pour le modulateur des calpaïnes. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO
93/09239;
US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constrictions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
Les AAV
recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus. auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour le modulateur des

8 calpaïnes bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV
recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet.
Eng.
7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.

Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.

Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour le modulateur des calpaïnes est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules tumorales. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du modulateur. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques.
Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.
Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs EIA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules tumorales, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une _ cellule tumorale.
Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour un modulateur des calpaïnes sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR-RSV et le promoteur CMV.

2 t g PCTIFR95/00670

9 Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour un modulateur des calpaïnes sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules tumorales.
L'expression est considérée comme majoritaire au sens de l'invention lorsque, même si une expression résiduelle est observée dans d'autres types cellulaires, les niveaux d'expression sont supérieurs dans les cellules tumorales.

La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans la tumeur du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre plu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.

La présente invention est particulièrement adaptée au traitement des cancers dans lesquels des formes mutées de p53 sont observées. Plus spécifiquement, la WO 95/33060 9! a~ PCT/FR95/00670 présente invention est particulièrement avantageuse pour le traitement des cancers dans lesquels les allèles sauvage et mutés de p53 sont présents. De tels canccers sont notamment les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, 5 les cancers de la vessie, etc.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

légende des figures Figure 1 : Etude de la régulation de la protéine p53 par la calpaïne. La réaction est

10 effectuée dans un volume final de 30 pl, dont 1 provenant du mélange de traduction.
ligne 1 : TO; ligne 2 : 30 min en présence de 1 mM Calcium + 20 Mg/ml Calpaïne; ligne 4 : 30 min en présence de lmM Calcium + 20 gg/ml Calpaïne + 0,5 mg/ml calpastatine; ligne 5 : 30 min en présence de 1mM Calcium + 20 g/ml Calpaïne +
lOmM EGTA; ligne 6 : PBS; ligne 7 : PBS + calcium; ligne 8 : PBS +
calpastatine.

Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.

WO 95/33060 2 ILS 0t b-3 J PCT1FR95100670

11 Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Rolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym.. (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.

Exemples Exemple 1, Cet exemple montre que l'addition de m-calpaïne au lysat de réticulocyte de lapin induit la dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de certaines formes mutées. Cet exemple montre également que des inhibiteurs des calpaïnes sont capables d'inhiber la dégradation de p53 et donc de moduler l'activité de cette protéine.

1.1. Mise en évidence de la dégradation: Les protéines p53 sauvages de souris et d'homme ainsi que diverses protéines p53 mutées (protéines humaines C273, H273, H175, 1247) ont été traduites dans le lysat de réticulocyte de lapin. Les protéines ainsi 30- obtenues sont résistantes à toute dégradation, même en présence de haute concentration de calcium (co-facteur indispensable des calpaïnes). L'addition de m-calpaïne de boeuf (Sigma) au lysat de réticulocyte en présence de calcium a entrain la disparition rapide des protéines néo-synthétisées et l'apparition de fragments protéolytiques résolvables par électrophorèse. La résistance à la dégradation d'autres protéines comme la dihydrofolate réductase ou la glycéraldéhyde-3-phosphate

12 deshydrogénase dans les mêmes conditions expérimentales indique la spécificité
de substrat de la réaction.
1.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaïne pour moduler les niveaux de protéines p53 : Dans l'exemple 1.1. ci-dessus, il a été montré que l'addition de m-calpaïne induisait une dégradation des protéines p53. Dans cet exemple, en plus de m-calpaïne, différents composés ont été introduits au milieu pour tester leur capacité
d'inhiber l'activité de la calpaïne. Les résultats obtenus montrent que l'addition d'un chélateur du calcium (I'EGTA) ainsi que d'un peptide inhibiteur spécifique des calpaïnes (dérivé
d'un inhibiteur physiologique, la calpastatine ; Maki et al., J. Biol. Chem., 254, 18866-18869, 1989) sont capables d"inhiber de la dégradation des protéines p53 induite par la calpaïne exogène, mpl 2 Dans l'exemple précédent, il a été montré que l'addition de calpaïne exogène à
une solution de protéines p53 entrainait leur dégradation. Cet exemple montre que la dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de certaines formes mutées peut être induite par les calpaïnes endogènes dans des extraits cytoplasmiques. Cet exemple montre également que des inhibiteurs des calpaïnes sont capables, en présence de calpaine endogène, d'inhiber la dégradation de p53 et donc de moduler l'activité de cette protéine.

2.1. Dégradation par les calpaïnes endogènes : Les protéines p53 sauvages de souris et d'homme, ainsi que certaines formes mutées (Cf exemple 1) ont été
traduites dans le lysat de réticulocyte puis ont été incubées en présence d'extraits cytoplasmiques de cellules Iymphoblastoïdes humaines Daudi ou Jurkat. Les extraits cytoplasmiques ont été préparés de la manière suivante : Les cellules (accessibles à
l'ATCC) ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté de 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont ensuite été récoltées, lavées dans un tampon PBS, puis incubées 5 min dans un tampon de lyse hypotonique sans détergent (1-IFPES 20 mM
pH 7,5; KOAc 10 mM; MgOAc 1,5 mM; 2ml pour 5.108 cellules). La lyse a été
complété en utilisant un homogénéiseur Dounce*, puis vérifiée sous microscope.
Les noyaux ont ensuite été éliminés par centrifugation à 2000 g pendant 5 min, et les surnageants ont été centrifugés à 10 000g pendant 1 heure (Beckman SW60). Les extraits cytoplasmiques ont ensuite été aliquotés à raison de 5 à 12 mg/ml.

* (marques de commerce) WO 95/33060 219'D' PCTIMSI00670 âââ

13 Lorsque le lysat de réticulocutes a été incubé en présence d'extraits cytoplasmiques, en l'absence de calcium, aucune dégradation n'a été observée. Par contre, en présence de calcium, une dégradation très rapide des protéines p53 a été observée, avec apparition d'un profil de produits protéolytiques caractéristique proche de celui obtenu dans l'exemple 1. Cet expérience montre bien que les protéines p53 sont dégradées par les calpaïnes endogènes.
2.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaïne pour moduler les niveaux de protéines p53 : La chélation du calcium par lEGTA, ainsi que l'utilisation de toute une gamme d'inhibiteurs de protéases (leupeptin, aprotinin, soybean trypsin inhibitor et PMSF) et surtout le peptide calpastatine montrent que la dégradation de ces protéines est sous la dépendance des calpaïnes de l'extrait cytoplasmique, et que différents composés capables de moduler l'activité des calpaïnes peuvent être utilisés pour réguler les niveaux de protéine p53.

Exemple 3 Cet exemple démontre que les protéines p53 sauvages de souris et d'homme sont des substrats directs pour les calpaïnes dans les extraits cytoplasmiques.

Les exemples 1 et 2 montrent que les calpaïnes peuvent induire la dégradation de- p53 dans des mélanges réactionnels complexes. Ces expériences n'excluent cependant pas que dans les conditions utilisées les calpaïnes activent des protéases secondaires qui sont celles qui agissent véritablement sur p53. Dans cet exemple, l'expérience suivante a été conduite : (1) les protéines p53 sauvages de souris et d'homme néo-synthétisées dans le lysat de réticulocyte de lapin ont été
incubées pendant 30 minutes en présence d'extrait cytoplasmique de cellules Daudi ainsi qu'en présence de calcium pour activer les calpaïnes comme dans l'exemple 2, (2) de la protéine p53 a alors été rajoutée au mélange réactionnel et la réaction a été
poursuivie minutes dans des conditions permissives (mêmes conditions réactionnelles) ou non (addition soit d'EGTA pour chélater le calcium, soit de peptide calpastatine) pour les 30 calpaïnes. En présence de calcium, la protéine p53 nouvellement ajoutée est complètement dégradée indiquant que l'activité protéase est fonctionnelle tout le temps de l'expérience. Quand les calpaïnes sont inhibées par la présence d'EGTA ou, plus significativement, du peptide calpastatin, la protéine p53 nouvellement ajoutée n'est par contre plus dégradée. Cette dernière observation exclut donc la possibilité

WO 95133060 il) 7 PCT/F1195/00670

14 que dans la première partie de l'expérience les calpaïnes aient induit une seconde protéase responsable de la dégradation de p53 (figure 1).

Exemple 4 Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comportant une séquence d'acides nucléiques codant pour la calpastatine. Cet adénovirus est construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-d11324 et un plasmide portant la séquence SEQ ID n 1 sous controle du promoteur RSV.

4.1. Construction du plasmide SEQ ID n 1 Le plasmide SEQ ID n 1 comporte la séquence codant pour la calpastatine sous le contrôle du promoteur LTR-RSV, ainsi que des régions de l'adénovirus permettant la recombinaison homologue. Il est construit par insertion de la séquence SEQ ID n 1 dans le plasmide pAd.RSV(3gal. Le plasmide pAd.RSV(3Gal contient, dans l'orientation 5'->3', - le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant : la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur ElA;
- le gène codant pour la f3-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus AdS, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSV(3Ga1 et l'adénovirus d1324.
Le plasmide pAd.RSV(3Ga1 a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin.
Invest.
90 (1992) 626).

4.2. Construction de l'adénovirus recombinant Le vecteur décrit en 4.1. est linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (ElA et El1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus recombinant est obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-d11324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur décrit dans l'exemple 4.1., selon le protocole suivant : le plasmide SEQ ID n 1 et l'adénovirus Ad-d11324, linéarisé par l'enzyme Clal, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés W O 95/33060 /gg95/00670 sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN
de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à
un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié
ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
5 Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus obtenu peut être conservé à -80 C dans 20 %
de glycérol.

LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Methode de traitement des cancers par regulation de la protéine p53.
(iii) NOMBRE DE'SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release 111.0, Version 1{1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2085 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..2085 (D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "Calpastatine humaine"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Glu Gly Pro His Leu Pro Asn Lys Lys Lys His Lys Lys Gln Ala Val Lys Thr Glu Pro Glu Lys Lys Ser Gln Ser Thr Lys Leu Ser Val Val His Glu Lys Lys Ser Gln Glu Gly Lys Pro Lys Glu His Thr Glu 35 ,40 - 45 Pro Lys Ser Leu Pro Lys Gln Ala Ser Asp Thr Gly Ser Asn Asp Ala ~Q 3PCTIFR95100670 50 _ 55 60 His Asn Lys Lys Ala Val Ser Arg Ser Ala Glu Gln Gln Pro Ser Glu Lys Ser Thr Glu Pro Lys Thr Lys Pro Gln Asp Met Ile Ser Ala Gly GGA. GAG AGT GTT GCT GGT ATC ACT GCA ATA TCT GGC AAG CCG GGT GAC 336 Gly Glu Ser Val Ala Gly Ile Thr Ala Ile Ber Gly Lys Pro Gly Asp AAG AAA AAA GAA AAG AAA TCA TTA ACC CCA GCT GTG.CCA GTT GAA TCT 384 Lys Lys Lys Glu Lys Lys Ser Leu Thr Pro Ala Val Pro Val Glu Ser Lys Pro Asp Lys Pro Ser Gly Lys Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Leu Gly Gly Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu Ala Lys Lys Glu Gly Ile Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser Ser Lys Pro Ile Gly Pro Asp Asp Ala Ile Asp Ala Leu Ser--Ser Asp TTC ACC TGT GGG TCG CCT ACA GCT GCT_GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG 720 Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala Gin Ser Ala Gly Thr Val Arg Ser Ala Ala Pro Pro Gln Glu Lys Lys Arg Lys Val Glu Lys Asp Thr Met Ser Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu-Ser Ala Ser Leu Gly Thr Arg Gln Ala Glu Pro Glu Leu Asp Leu Arg Ser Ile Lys Glu Val Asp Glu Ala W O 95133060 !~ ~ J PCT/FR95/00670 Lys Ala Lys Glu Glu Lys Leu Glu Lys Cys Gly.Glu Asp Asp Glu Thr Ile Pro Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Pro Ala Thr Asp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Leu Pro Glu Pro Glu Glu Lys Pro Lys ProArg Ser Glu Ser Glu Leu Ile Asp Glu Leu Ser Glu Asp Phe Asp Arg Ser Glu Cys Lys Glu Lys Pro Ser Lys Pro Thr Glu Lys Thr Glu Glu Ser Lys Ala Ala Ala ProAla Pro Val Ser Glu Ala Val Ser Arg Thr Ser Met Cys Ser Ile Gln Ser Ala Pro ProGlu Pro Ala Thr Leu Lys Gly Thr Val Pro Asp Asp Ala Val Glu Ala Leu Ala Asp Ser Leu Gly Lys Lys Glu Ala Asp Pro Glu Asp Gly Lys Pro Val Met Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala Lys Glu Glu Asp Arg Glu Lys Leu Gly Glu Lys Glu Glu Thr Ile Pro Pro Asp Tyr Arg Leu Glu Glu Val Lys Asp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Lys Glu Gln Leu Pro Pro Met Ser Glu Asp Phe Leu Leu Asp Ala Leu Ser Glu Asp Phe Ser Gly Pro Gln Asn Ala Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ile Ser Glu Val Val Ser Gln Thr Pro Ala Ser Thr Thr Gln Ala Gly Ala Pro Pro Arg Asp Thr Ser Gln Ser Asp Lys Asp Leu Asp Asp Ala Leu Asp Lys Leu fi g _l& u 0 - 2 ' -Ser Asp Ser Leu Gly Gln Arg Gin Pro Asp Pro Asp Glu Asn Lys Pro - -= 5 ATG GGA GAT AAA GTA AAG GAA AAA GCT AAA GCT GAA CAT AGA GAC AAG 1776 Met Gly Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala Lys Ala Glu His Are Asp Lys Leu Gly Glu Are Asp Asp Thr Ile Pro Pro Glu Tyr Are His Leu Leu Asp Asp Asn Gly Gln Asp Lys Pro Val Lys Pro Pro Thr Lys Lys Ser Glu Asp Ser Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gln Asp Pro Ile Asp Ala Leu Ser Gly Asp Leu Asp Ser Cys Pro Ser Thr Thr Glu Thr Ser Gln Asn Thr Ala Lys Asp Lys Cys Lys Lys Ala Ala Ser Ser Ser Lys Ala Pro Lys Asn Gly Gly Lys Ala Lys Asp Ser Ala Lys Thr Thr Glu Glu Thr Ser Lys Pro Lys Asp Asp *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 399 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..399 -(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Leu Gly Gly 2 / u L 3 PCTJFR95/00670 Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu Ala Lys Lys Glu Gly Ile Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser Ser Lys Pro Ile Gly Pro Asp Asp GCT ATA GAC GCC TTG TCA TCT GAC TTC ACC TGT_GGG TCG CCT ACA GCT 288 Ala Ile Asp Ala Leu Ser Ser Asp Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala Gln Ser Ala Gly Thr Val Arg Ser Ala Ala Pro Pro Gln Glu Lys Lys Arg Lys Val Glu Lys

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Un procédé pour l'identification d'un inhibiteur de la dégradation d'une protéine p53 comprenant :

a) la mise à disposition d'un extrait cellulaire comprenant au moins une protéine p53 et au moins une calpaïne;

b) l'administration d'au moins une protéine et/ou d'au moins un polypeptide inhibiteur de l'activité calpaïne de l'extrait cellulaire; et c) la mise en évidence de la dégradation en mesurant la protéine p53 et les fragments de la protéine p53.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur administré est une calpastatine.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques codant pour la calpastatine est la séquence SEQ NO: 1 ou la séquence SEQ NO: 2.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'extrait cellulaire provient d'une cellule cancéreuse.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur administré est un fragment de la calpastatine.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la mesure de la protéine p53 et des fragments de la protéine p53 est effectuée par électrophorèse.