CA2304569A1

CA2304569A1 - Promoteur specifique des petales et procede d'obtention de plantes a fleurs sans petale

Info

Publication number: CA2304569A1
Application number: CA002304569A
Authority: CA
Inventors: Ines Brocard; Florence Charlot; Evelyne Teoule; Philippe Guerche
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 1999-04-01
Also published as: AU740911C; AU9270898A; EP1017833A1; AU740911B2; WO1999015679A1; FR2768746A1; FR2768746B1; JP2001517450A

Abstract

L'invention concerne un promoteur spécifique des pétales ainsi qu'un procédé d'obtention de plantes à fleurs sans pétale.

Description

PROMOTEUR SPECIFIQUE DES PETALES ET PROCEDE
D'OBTENTION DE PLANTES A FLEURS SANS PETALE
La présente invention concerne notamment un promoteur spécifique des pétales et un procédé d'obtention de plantes à fleurs sans pétale.
L'intérêt de l'obtention de plantes dépourvues de pétales est parti de l'observation que les pétales sénescents, en tombant sur les feuilles pourraient fournir des foyers d'infection privilégiés pour les spores de certains champignons pathogènes. Dans le cas du colza, par exemple, le mode d'infection de Sclerotinia 1o sclero~iorr~m suit principalement cette voie. Ce champignon est responsable en effet d'importants dommages sur les cultures de colza (Lamarque, 1983) et on ne connaît pas de résistance génétique à celui-ci ni chez le colza ni chez les espèces apparentées. Ainsi, à l'heure actuelle, seuls les traitements chimiques préventifs sont utilisés.
La lutte contre Scleroti~ria sclerotiorum par le biais de plantes dont les fleurs n'auraient pas de pétales permettrait de diminuer l'utilisation de fongicide et limiterait donc la pollution des sols subséquente.
Il s'agit donc de produire des plantes à fleurs sans pétale et d'éprouver ainsi une stratégie de lutte contre le susdit champignon basée sur une résistance 2o "physique" et non pas sur l'utilisation de gènes de résistance au sens classique.
La présente invention propose donc d'obtenir des plantes dont les fleurs seraient dépourvues de pétales. Elle consiste à mettre en oeuvre une région promotrice contrôlant l'expression spécifiquement dans les pétales d'une séquence (ors codant pour une molécule susceptible de modifier les caractéristiques naturelles du pétale voire d'en inhiber la formation.
Ainsi, on peut envisager de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la structure des pétales de fleurs en plaçant, en aval de la région promotrice ci-dessus décrite des gènes impliqués dans la biosynthèse des pigments ou des gènes de régulation comme les protéines MYB (Noda et al. 1994). Ce type

2 d'expérience a déjà été réalisé (Elomma et al., 1996 ; Gutterson, 1995).
Toutefois, les promoteurs utilisés sont plutôt de types constitutifs comme le 3 5 S du CaMV
alors qu'il serait intéressant de confiner l'expression du transgène à
l'organe ciblé.
On peut donc, dans le cadre de la présente invention, envisager la création de plantes ornementales originales.
La présente invention a donc pour objet une séquence nucléotidique dont il a été démontrée que le gène correspondant s'exprime spécifiquement dans le pétale, cette séquence nucléotidique correspond à SEQ ID N° 5.
Par conséquent, la présente invention a pour objet une séquence 1o nucléotidique qui correspond à tout ou partie a) de la séquence selon SEQ ID N° 5, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).
Dans le cadre de la présente invention, la partie la plus intéressante de 15 cette séquence nucléotidique est la région promotrice définie comme étant la séquence précédant (côté 5') le codon du début de traduction (ATG). Strito sensu cette région promotrice s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3265 (c'est-à-dire au dernier nucléotide précédant immédiatement le codon ATG) mais, compte tenu des sites de restriction, cette région s'étend préférentiellement du nucléotide 1 au 2o nucléotide 3233 (correspondant au site Aval) et plus préférentiellement encore du nucléotide 2911 au nucléotide 3233 de SEQ B? N° 5.
Cette région promotrice précède donc à (état naturel, un orf qui est exprimé spécifiquement dans les pétales et dans le cas où cet orf est remplacé
(par manipulation génétique) par un autre orf dont le produit est une molécule 25 cytotoxique, cette dernière est susceptible de ne détruire que lesdits pétales. Le remplacement peut également être réalisé par une partie de gène susceptible, lors de son expression spécifique dans le pétale, d'en modifier les caractéristiques d'origine.

3 La présente invention a donc également pour objet des vecteurs d'expression cellulaire comprenant une région promotrice telle que ci-dessus décrite placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un produit capable de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la texture des pétales de fleurs, 5 ainsi qu'un procédé d'obtention de plantes ornementales comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un de ces vecteurs. L'invention comprend également le cas où ladite séquence d'ADN code pour un produit cytotoxique.
Avantageusement, le produit cytotoxique en question est une ribonucléase.
En effet, lorsque cette RNase s'exprimera spécifiquement dans les pétales, elle en 10 détruira tous les ARN, ce à quoi le pétale ne pourra pas survivre.
Préférentiellement, la RNase est la barnase, dont l'orf correspondant a été
isolé de Bacilles amyloliquefascierrs (Hartley RW, 1988).
Il s'agit donc d'introduire un vecteur conforme à l'invention dans une souche bactérienne susceptible de réaliser la transformation de cellules de plantes 15 telles qu'Agrobacterium tumefacierrs. Ceci peut notamment être réalisée par la méthode d'infiltration de plantes d'Arabidopsis thaliana décrite par Bechtold et al.; 1993. Cette technique consiste à introduire la bactérie dans les cellules des hampes florales par infiltratian sous vide. Les plantes sont ensuite repiquées en serre et leurs graines recoltées. Environ une graine sur mille donne naissance à des 2o plantes dont toutes les cellules portent le transgène. La transformation d'autres plantes et notamment du colza peut être réalisée par l'intermédiaire d'Agro-bacteriunr tumefaciens et/ou d'Agrobacterium rhizoge~res à l'aide de diverses techniques, maintenant classiques (transformation de disques foliaires, d'hypo-cotyles de hampes florales....) associant une phase de co-culture de la bactérie 25 avec les tissus végétaux, suivie de la sélection et de la régénération des cellules transformées en plantes entières. D'autres techniques de transformation ne font pas intervenir cette bactérie et permettent de transférer directement le gène cloné dans des cellules ou des tissus (électroporation, canon à particules.. . ) et de sélectionner et d'obtenir des plantes transformées (technique revue par Siemens et Schieder).

4 La présente invention a également pour objet des cellules de plantes transformées avec un vecteur conforme à l'invention ainsi que des plantes comprenant lesdites cellules. L'invention a également pour objet des plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales.
Comme indiqué précédemment, la présente invention permet donc l'obtention de plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales ; le procédé
conforme à
l'invention comprenant l'insertion dans les plantes d'un vecteur tel que ci-dessus décrit et comprenant une séquence d'ADN codant pour un produit cytotoxique.
Dans le cadre de la présente invention, on peut également envisager 1o d'obtenir des plantes hybrides par croisement de deux lignées dont on chercherait à
associer les qualités agronomiques. Cependant, afin que la pollinisation entomophile s'opère de façon optimum, il est nécessaire que les parents de l'hybride en question portent des pétales. Un tel croisement n'est donc possible qu'au moyen d'un système d'activation du gène toxique à double composante. Le 15 principe d'un tel système consiste à disposer de deux lignées portant chacune un constituant n'ayant pas d'activité cytotoxique. L'activité toxique spécifique est alors restaurée dans les hybrides de ces deux lignées par combinaison dés deux constituants.
Un exemple possible d'un tel système consiste à inactiver le produit 20 d'expression que fon veut contrôler par insertion d'au moins un codon stop au début de la séquence codante correspondante puis d'ajouter en trans dans le système, un ARNt dit "suppresseur" qui va reconnaître le ou les codons) stop et apporter (acide aminé qu'il porte au lieu de terminer la traduction. La protéine pourra alors être traduite intégralement et son activité restaurée. Un tel système a 25 déjà été expérimenté concernant la séquence codante du gène GUS dans laquelle a été insérée le codon stop ambre, fARNt suppresseur utilisé étant porteur de la leucine. De plus, la fonctionnalité d'un tel système de transactivation utilisant un ARNtL'° suppresseur a été vérifié in pla»ta dans Arabidopsis thaliana et Nicotiana tabacrrm. Ce modèle a été ensuite appliqué au cas de la barnase. Des WO 99!15679 PCT/FR98/02043 gènes mutés (c'est-à-dire dans lesquels ont été insérés un codon stop) codant pour la barnase et dépendant de l'expression du gène de ARI~TtL'° ont été
obtenus et testés en expression transitoire dans des protoplastes de tabac (Choisne Nathalie, 1997).

5 La présente invention concerne donc également un procédé d'obtention de plantes hybrides dont les fleurs n'ont pas de pétale et comprenant les étapes de a) transformation de plantes d'une lignée A avec un vecteur conforme à
l'invention et comprenant une séquence d'ADN codant pour séquence cytotoxique modifiée par l'insertion d'au moins un codon stop, lo b) croisement des plantes de lignée A ainsi obtenues avec des plantes de lignée B exprimant le gène d'un ARNt suppresseur, c) sélection des plantes hybrides avec des fleurs sans pétales.
Dans le cadre de la présente invention, les plantes de lignée A sont transformées par une construction similaire à pIB352 telle que représentée dans la figure 7.
Avantageusement, les plantes conformes à l'invention appartiennent à la famille des Brassicacées, préférentiellement, il s'agit du colza.
La figure 1 illustre l'analyse par hybridation de type Northern d'ARN
polyA+ (2 ~g) et des ARN totaux (10 pg) de colza. La membrane est hybridée 2o avec l'ADNc 9.2 entier marqué au 32P. La révélation est faite après 24 heures d'exposition à - 80°C avec un écran. Les ARNm identifiés ont une taille approximative de 800 pb. Plantule 1 : plantule d'une semaine ; Plantule 2 plantule de deux semaines La figure 2 illustre la comparaison des séquences protéiques d'Arabidopsis 25 thaliaua (en haut) et du colza (en bas) déduites respectivement de ADNc (SEQ TD N° 1) et 9.2 (SEQ ID N° 2). La protéine d'Arabidopsis thaliana présente une longueur de 140 aa alors que la protéine de colza présente une longueur de 147 aa. L'homologie entre les deux étant de 74,6 %. Les étoiles repèrent les acides aminés communs aux deux séquences et les points figurant

6 dans l'ADNc d'Arabidopsis Ihaliarra n'ont été indiqués que pour permettre de placer l'une en face de l'autre les séquences communes aux deux plantes, la séquence d'Arabidopsis thaliarra devant se lire en continu, c'est-à-dire en faisant abstraction desdits points.
5 La figure 3 représente I'aügnement des séquences nucléotidiques des ADNc 9.2 du colza (en bas) et X74360 d'Arabidopsis thaliana (en haut), les deux séquences présentant une homologie totale de 83 %.
La figure 4 représente les cartes de restriction partielles des clones génomiques (A : Aval, B : BamHl, EI : EcoRl, EV : EcoRV, H : HindIII, Hc HirrcII, P : PstI, S : Sacl, SI : Sall, Xb : Xbal, Xh : Xhol}.
La figure 5 représente la séquence S'-~3' du clone génomique 4.1.1 (SEQ
ID N° 5). La séquence palindromique a été soulignée deux fois, la séquence codante a été soulignée une fois. Les sites de restriction suivants ont été
repérés BanrHI (en position 1 ) : GGATCC ; SaII (en position 2911 ) : GTCGAC et Aval 15 (en position 3229) :CCCGAG.
La figure 6 représente les constructions réalisées avec les promoteurs des clones génomiques 4.1.1 et 8.1.1.
région promotrice distale du clone génomique 4.1.1 séquence palindromique 2o région promotrice proximale du clone génomique 4.1.1 région promotrice de 322 pb du clone génomique 4. I.1 région promotrice de 322 pb du clone génomique 8.1.1 terminateur du gène de la nopaline synthase séquence codante du gène rapporteur gus 25 séquence codante du gène 4.1.1 région 3' du gène 4.1.1 non traduite La figure 7 illustre les constructions réalisées avec le promoteur de 322 pb du clone génomique 4.1.I .

7 promoteur de 322 pb du clone génomique 4.1.1 séquence codante du gène rapporteur gus séquence codante du gène de la barnase sauvage séquence codante du gène de la barnase mutée terminateur du gène de la nopaline synthase terminateur 19S du CaMV
L'invention ne se limite pas à seule description ci-dessus, elle sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne sont cependant donnés qu'à
t0 titre illustratif EXEMPLE 1 ~ Mise en évidence d'un promoteur snécifïQue des en'ta~es La première étape a consisté en l'obtention de clones d'ADN
~5 complémentaires (ADNc) exprimés spécifiquement dans le pétale. Pour cela, les ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN messagers (ARNm) de pétale de colza.
Parallèlement, des ADNc ont été synthétisés à partir d'ARNm de feuilles, de boutons floraux dont les pétales ont été enlevés et d'étamines.
Les ADNc provenant desdits organes ou tissus ont été soustraits aux 2o ADNc dérivés des ARNm exprimés dans le pétale de colza. Les molécules résultant de cette soustraction ont été utilisées lors d'une expérience d'hybridation différentielle d'une banque d'ADNc de pétale selon une technique similaire à
celle présentée par Atanassov et al. 1996.
Plusieurs clones d'ADN de colza ont été isolés à l'issue de cette expérience.
25 Leur profil d'expression a été étudié par la technique d'hybridation moléculaire de type Northern. En l'absence de clone strictement spécifiques du pétale (au seuil de détection de la technique) le candidat le plus pertinent a été retenu pour la suite des études ; il s'agit du clone 9.2. Ce clone est fortement exprimé dans le pétale au

8 stade jeune (bouton de 3 mm environ) et très faiblement dans les étamines (figure 1 ).
Les recherches d'homologie de séquences dans les banques de données montrent une forte similitude entre la protéine déduite de la phase ouverte de 5 lecture (ouf du clone 9.2 et la séquence codante d'un gène d'Arabidopsis thaliaoa (X74360) codant pour une protéine putative de la paroi dont l'expression est régulée par les gibbérellines (Phillips et Huttly, 1994) (figure 2). Le degré
d'homologie présenté par les séquences d'ADNc respectives correspondantes est supérieur à 80 % dans les 500 premières bases puis disparaît totalement sur !es 220 restantes (figure 3).
Le clone d'ADNc 9.2 de colza a servi de sonde pour cribler une banque génomique de colza. Sept clones génomiques ont été isolés. Sur la base des cartes de restriction et des séquences, ces sept clones se répartissent en deux groupes suggérant l'existence chez le colza d'une famille d'au moins deux gènes nommés 15 dans la suite du texte 4.1.1 et 8.1.1 (figure 4). L'ADNc 9.2 est dérivé du gène correspondant du clone génomique 4.1.1.
Une étude préliminaire par amplification PCR a été réalisée sur le clone

9.4.1 appartenant au groupe du 4.1.1. En effet, la structure du clone génomique a permis d'amplifier une région amont de 3233 pb en utilisant des techniques 2o d'amplification de grands fragments d'ADN et de séquençage progressif par PCR.
Cette région de 3233 pb s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3233 de la séquence représentée sur la figure 5 et elle se termine au niveau du site Aval au niveau duquel la coupure a été effectuée ainsi que le clonage pour (obtention de "bouts francs".
25 Puis les régions amonts susceptibles de contenir les séquences régulatrices ont été sous-clonées dans des vecteurs de clonage à partir des deux clones génomiques (4.1.1 et 8.1.1). On dispose donc actuellement, pour le clone 4.1.1, de plus de 4 kb de séquence correspondant majoritairement à forf et aux régions amonts (figure 5).

EXEMPLE 2 ~ Vérification de la spécificité de la région promotrice Différentes constructions comprenant le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle de certaines de ces séquences ont été réalisées afin d'étudier l'expression de ces gènes chimériques (c'est-à-dire constitués de la séquence codante d'un gène connu précédé de la région promotrice conforme à
l'invention) dans des plantes transformées d'Arabidopsis thaliana et de colza.
Ces constructions se regroupent en deux catégories en fonction de l'orf placée sous le contrôle des séquences régulatrices - le gène rapporteur GUS pour étudier les profils d'expression et vérifier la spécificité conférée par le promoteur, - le gène de barnase sauvage ou inactivé pour empêcher la formation du pétale par expression dans cet organe de ce gène toxique (les figures 6 et 7 détaillent la composition de chaque construction).
Les profils d'expression du gène rapporteur GUS chez les transformants 1s d'Arabidopsis obtenus dans le cas du piB100 montrent une certaine variabilité sur l'ensemble des plantes (voir tableau 1 ci-après qui énumère les parties des plantes transformées chez lesquelles on a observé une coloration bleue). Cependant, chez près de la moitié des plantes présentant une coloration bleue (13/30), le gène rapporteur ne s'exprime que dans les pétales (au seuil de détection de la 2o technique). On retrouve chez certaines plantes une faible expression dans les étamines, peu surprenante du fait des résultats des hybridations de type Northern, mais aussi parfois une expression dans d'autres organes floraux ce qui pourrait suggérer l'influence d'effets de position du transgène dus à sa petite taille.
Toutefois l'existence d'une proportion significative de plantes présentant le profil 25 attendu laisse à penser que le fragment proximal de 322 pb est capable de conférer une expression spécifique du pétale. La stabilité de cette expression a été
testée sur les descendants en autofécondation de ces plantes. Pour la plupart, on retrouve bien la spécificité "pétale" (données non montrées).

Des séquences promotrices plus longues ont également été mises en oeuvre par le biais des constructions pIB102 et pIB105 et les plantes transformées d'Arabidopsis thaliana ont été observées (le tableau 2 énumère les parties des plantes transformées par pIB 102 et présentant une coloration bleue, le tableau 3 5 énumère les parties des plantes transformées par pIB 105 et présentant une coloration bleue). On ne retrouve pas la spécificité pétale dans la proportion précédemment observée car dans presque tous !es cas, le gène rapporteur est efFectivement exprimé dans le pétale mais également dans d'autres organes de la fleur.
1o De même, des plantes transformées de colza ont été obtenues avec une construction comportant comme séquence régulatrice le fragment amont du gène 4.1. I de 3233 pb cloné après amplification par PCR. Sur les neuf plantes de colza qui ont déjà pu être observées, le gène rapporteur s'exprime dans le pétale mais aussi dans d'autres organes de la fleur (données non montrées), comme on l'observe chez Arabidopsis avec ces grandes régions promotrices.
Ces résultats suggèrent que ces fragments sont trop longs alors que fon pense que le précédent (322 pb) pourrait être un peu court et donc amplifier les effets de position éventuels. Ce dernier cependant donne lieu aux résultats les plus prometteurs.
2o Les promoteurs pIB351 et pIB352 (figure 7) analogues au pIB100 mais comportant respectivement la séquence codante du gène de la barnase sauvage et cette même séquence inactivée par insertion d'un codon stop (dénommée alors barnase mutée) au lieu de la séquence codante du gène rapporteur ont été
introduites dans Arabidopsis thaliana (résultats non encore disponibles).

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REFERENCES
Atanassov I et al. (1996) Plant Science 118, 185-194 Bechtold N. et al (1993) Comptes-Rendus de l'Académie des Sciences 316, Choisne Nathalie ( 1997). Etude de l'expression in vivo d'une gène d'ARNt leu de Phascolus vulgaris et l'utilisation de ce gène dans un système de suppression.
Thèse de doctorat de l'université de Paris XI (N° d'ordre 4691).
Elomaa P. et al. (1996). Molecular Breeding 2 : 41-50.
Gutterson N. (1995). HortScience, Vol. 30(5), August 1995.
Hartley RW, 1988. Barnase and barstar : expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. J. Mol. Biol, 202, 913-915.
Lamarque C. (1983) Proc. 6'~ int. Rapeseed Cong. 1983, Paris, France, pp 903-Noda K-I, et al. (1994). Nature. Vol 369. 23 June 1994.
Phillips A.L. and Huttly A.K. (1994). Plant Mol Biol. 24 : 603-615 Siemens and Schieder 1996. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 2, 66-75 LISTE DE SÉQUENCES
(1) IhFORMATIOtdS GÉNÉRALES:
('_) DÉPOSANT:
(A) NOI~S: INSTITUT tdATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA) (B) RUE: 197 RUE DE L'UNIVERSITÉ
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75007 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR SPÉCIFIQUE DES PÉTALES ET PROCÉDÉ
D'OBTENTION DE PLANTES A FLEURS SANS PÉTALE
(iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 5 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EY.PLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1: , (i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 190 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: protéine (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: protéine A.thaliana (xi)DESCRIPTION DE SEQID
LA NO:
SQUENCE: 1:

MetAla SerSerLeuIle ThrSerAlaVal IleValVal ValLeuSer LeuVal LeuGlySerVal GluGlnValSer GlyLeuArg HisValPro LysSer ProLysIleThr AspValLysHis ProAspPhe LeuValThr IleGlu ProLysProThr IleLeuIlePro GlyValGly ArgPheLeu Leu Pro pro Lys Cys Lys Lys Pro Phe Tyr Pro Tyr Asn Pro Val Thr Giy Ala Pro Leu Thr Gly Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Asn Gly Gly Gln '''y Ala Gly Pro His Thr Gln Leu Pro Gly Gly Asp Asp Thr Leu Val Fro Asn Pro Gly Phe Glu Glu Pro Thr Pro Thr Ile Gly Ala Gly Thr Gly Ser Asn Gly Gln Val Pro Pro Val Pro Leu Pro ( 2 ) Its~ ORMATIOt~:S POUR LA SEQ ID N0: 2:
(_) CARrCTERISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 197 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: protéine (iy:) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: protéine colza (>:i) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 2:
Met Ala Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Met Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gly Pro Ala Glu Gln Val Ser Gly Leu Arg His Ile Pro Lys Ser His Lys Thr Thr Asp Val Lys His Pro Glu Phe Leu Val Thr Ile Glu Pro Lys Pro Thr Ile Leu Ile Pro Gly Val Gly Arg Phe Leu Leu Pro Pro Lys Cys Lys Lys Pro Phe Tyr Pro Tyr Asn r~o Val Thr Gly Ala Pro Leu Thr Gly Gly Ser Ile Gly Gly Gln Ile Pro Ser Phe Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Ala Arg Thr Gln Leu Pro _' y Glap Asp Thr Leu Val Pro Asn Gly Phe Glu Thr Pro Pro ~'.'.~.r ro Als Thr Gly Ala Gly Ala Gly Asn Gly Gln Val Pro Pro Asn Val .ro Leu Pro ~S5 (~; _.;-ORMi~TOU:S POUR LA SEQ ID
M:C: 3:

(-_) CARhCTERISTIQUES DE LA SQUENCE:
(~) LONGUEUR: 691 paires de bases (B} TYPE: nuclotide (C} NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (-_'_) TY?E DE MOLCULE: ADNc ('_~:) C-~a-~CTERISTIQUE:
(r} ts0!~/CLE: clone 9.2 (>:'_} DESCRIPTION DE LA SQUENCE: N0: 3:
SEQ ID

'r.VCAGCACT GTCATGATTC TTAGCCTACT GCAGAGCAAG TTAGCGGACT60 GCTTGGACCT

GCGTC.'-'.:ATT CCCAAGTCCC ATAAGACCAC CACCCTGAGT TTCTTGTCAC120 TGATGTCAAA

CATTGAGCCA AF~CCAACTA TTCTCATCCC CGGTGTTGGAAGGTTCTTGC TTCCTCCCAA180 :TGTr~GAAA CCATTCTACC CATACAATCC AGTCACTGGAGCTCCCCTTA CTGGCGGGTC240 Ti:TCGGGGT CP.P.F,:CCCAT CATTTGGTGG GGCGGAGCTC GCACCCAGCT300 TGGACAAGGA

CCCTGC:.~GC CnTGe=.TACCC TTGTCCCAAA GAAACTCCAA CCCCTGCCAC360 CCCCGGATTT

A

(2) I': FOR~.ATIOI~S POUR LA SEQ ID
N0: 4:

(i) CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) :OMBRE DE BRINS: simple (D} CONFIGURATION: linaire a (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (i~:) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: X79360 (::i) DcSCRIPTION N0: 9:
DE LA SQUENCE:
SEQ ID

TGAGCCCAP.'r. CCAACTATTCTCATTCCCGG TGTTGGAAGGTTCTTGCTTC CTCCCAAATG290 Cr~.AGAAGCCG TTCTACCCTTACAATCCTGT CACCGGAGCTCCACTTACTG GTGGGGGAAT300 P.AGCATATCT TAGATGCAAACATGTCTGTT TTGGTGTCTTGAGTCTTGGT TAGATAAGTA590 (2) INFORMATIONS LA SEQ ID N0: 5:
POUR

(i) CARACTRISTI QUES DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEU R: 9516 paires s de base (B) TYPE: n uclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION:
linaire (ii) TYPE DE MOLCULE:
ADN (gnomique) (i>:) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: clone génomique 4.1.1 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 5:

TTTrTTCTC TTGGTTTTTCTAAPACCAATAATGCGTGAT 180 CTCTTTTGTG TTTTGCP.ATT

TTTTTTTC TTTTATTTTCTTTTTACTTTGTAACTAP.F:TCACTTATTTA290 ACP.P.AAATG , AGTTT:P.AC AAATTTAAAATTGACAAATTAATCATTGAATTTTTTTCTT300 i_=.TTCGTTG

GTTCi:'"TTAA GTACTACTTTTATAATCATCTATATTTP.AATTTTTPATAG360 Gi:CCGTATT

HTCF:TP.P.TTTP.iTTTTTAATAAAATATTTP.AATATTATCCAAACCTi-~TAATTTTAATA420 TTTGT-ATATTT~.GTGGGGGCAGCTGCCTCCTCCCTGAACACCGTAGATCTCCCCCCTGT660 TTCTnTCTCTTACTGTGGATGTAAGATCTATTATTTTCTTGGGTTTTGTGTTTGTGAATG720 ATTTTGTAGCATrGTTTAAAATTTTAAATACGTATTCTTGCTTTAAGCTGTGTTTTGATG1020 TAAAGTP.AAACATATGTACCAAAAGAACAAGACAATGTTCAAGTCTATACGGAACCCATA1080 AAAACG=~GTTGGCTTAGAACATGATTATTGAGAGGTTCTTAGGGTGGAGTTCTTAGCGGA1620 ATATA~GAACCTGTGTCTTA AAAAAAGCTA CTTAAATAAG1680 ATTTTTAATT AGAACTGGCT

AGTTTP.AGAGCCGGTTCTTA TTTTATATTC1790 GTTTTTTTAG
TTAAAAGTTA
AGAGTCAGGT

WO 99/15679 PCT/FR9$/02043 G
CGTTPLGAF.C TTCACCTTAA GGACCTTCTA ATAATCATGC TCTTACGTTA 1800 TCTGACCAF_L

r.ATACGP.ACA GAP.AF.P.ATP~. AAACTCACTT ACCTCATCAT ATGAGATATG1860 ACAAATGCAC

T,.';CT~TTTP=~ GAPA~.~.ACrT TAAAA.~.AAAC ATTAATGGTG TGGGAGGGTC1920 ATTAATGGAG

GTCrCnCFn.~, i-~GAAAGGCCFs GAGAAGGCAA i-.TTGAAGGTG ACTGTATACA1980 AP.AGTAGGTC

T T TCi:G T TT T GCI~Ci-~GAGGi'-~. AGCTCATGAC ATTCACCAAiI20 GCAGCACGAA TGAAGTTCF.~ 9 CAAGTTTTTA ATTAGGCTTC GCTTCTTGTG ATTCCTCGP.A AATTTATATC 2100 ATTTCATACG

CAATTTCGTA

CGTACGTATA

CCF.CACATTA CIdTCATCCCA CTTCNTAACT TATATAATTT TACTACTCAG 2280 ATCACNAGAG

TACGTnTnTC AGGAAGTCAT TTCTTCTCCT TGTCCTATTC CTCTCTTTCT 2390 TTGTCCGGCT

TGCTATTCTC

TCTCnCTCTC CTTAATTTTA CACACCTCTT TCACTATCTT CAATGTCTTT 2960 TAACTTGTTT

GATGGGTAGG

GCTGCCGGAC

CTTCGTGTGT

CAAGAACAAA

CCTrCCCAG TCCCATGATG AATTAGCCTC TCTCACACTT AACTCTATGC 2760 ATTCAGACGT

AAATGCATCT

CGAAACAAGA

AAGCCACACA

CAACCAAAGT

CCAAACTTTG

TTCTATTTTC

i~ACCATTTCA TCTCACCTTT TTTAAATGTT TCCACAGTTA GCTCAGTAAA 3180 TTCACTATAT

::CAGACATAC ACCTTCCCTC CACAAGATCA AACAACCACA CTACCTTCCC 3290 CGAGTTTTCT

CAGCAGCAGC

~GTCACTGTC ATGATTCTTA GCCTACTGCT TGGACCTGCA GAGCAAGTTA 3360 GCGGACTGCG

TCrT~TCCCAAGTCCCATAAGACCACTGATGTCAAACACCCTGAGTTTCTTGTCACCA'~3920 TG.-'-.G~C~.AAACCAACTATTCTCATCCCCGGTGTTGGAAGGTTCTTGCTTCCTCCCAAATG3980 T~:G ~~.F:CCATTCTACCCATACAATCCAGTCACTGGAGCTCCCCTTACTGGCGGGTCTfiT3590 CGG~~:'CAi,ATCCCATCATTTGGTGGTGGACAAGGAGGCGGAGCTCGCACCCAGCTCCC3600 ''~~~~~~TGATi-:CCCTTGTCCCAAACCCCGGATTTGAAACTCCAACCCCTGCCACTGG3660 T G ~~.
. s.
....
v. .

TGGTTTnCTAGCCGTCACCTTAAGAGTCATATGTTTGTCATCTCTCTCTTTCTTTTTGGP.3890 nGi~G~GAnTCTTGTGTCTTATGCCGTCAGAAGAAATCTAAAGCATTTGTTTACATGCCA 3900 T~:C=.CP_~CTATCAAAATGCTTTATGATACATGTACTCTACTCCTCCATTTCGCATAC 3960 FAG.'-.GfiCTAGATG.~1AGACAAGTACTCAATCAAAGCTGAATACACTAATCACCCATTCAA4020 ATTA~TCCTAGAATTTGAATGAACCAAACTAACAAAAAAGAACAATTACAACCTAATGA9080 TACGCTGATGCP.AP.ACTACAAAAGGAGGTCGAATAAGGTAAGAGGATGGAGCAGAGTCGT9190 ATAT?.CAGAGAAAGATAGTATAGTAAGAGAAAAAGAGGAAACACACAAATGACAAATGA9200 TAGT=:'TACATTTTCTCATCATTATTCAGAGTAAACAAAGCAATAAAGTGAAAGAATTCF.9260 ATGGnC':TTATGTNGTACTCTCCTGCTTTGTACGACGACCTAACCATCGGCCCTGATGCT9380 ACGTACCTGAATCCCTGTTTAACCAACAAACCCATTTAGCCCTCTCCTTGTTTCCCATCfi9990 A.ATTTCCNGAACTAAAAACAGANNAGANANNAGGCTTACCATTTCCATGCNAGANGANG9500

Claims

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie a) de la séquence selon SEQ ID N o 5, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a).

2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 correspondant à tout ou partie :
a) de la séquence s'étendant du nucléotide i au nucléotide 3233 et de préférence du nucléotide 2911 au nucléotide 3233 de SEQ ID N o 5, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).

3 Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 2 placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un produit capable de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la texture des pétales de fleurs.

4. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 2 placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un produit cytotoxique.

5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le produit cytotoxique ~ ~ ~ et de préférence ~ ~.

6. Cellules de plante transformées par un vecteur selon l'une des revendications 3 à 5.

7, Plantes comprenant des cellules selon la revendication 6.

8. Procédé d'obtention de plantes ornementales comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un vecteur selon la revendication 3.

9. Procédé d'obtention de plantes dont les fleurs n'ont pas de pétale comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un vecteur selon la revendication 4 ou 5.

10. Procédé d'obtention de plantes hybrides dont les fleurs n'ont pas de pétale comprenant les étapes de:
a) transformation de plantes d'une lignée A avec un vecteur selon la revendication 4 ou 5 modifié par insertion d'au moins un codon stop dans la séquence codante de l'ADN, b) croisement des plantes de lignée A obtenues en a) avec des plantes de lignées B exprimant le gène d'un ARNt suppresseur, c) sélection des plantes hybrides avec des fleurs sans pétale.

11. Plantes dont les fleurs n'ont pas de pétale et sont susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9 ou 10.

12. Plantes selon la revendication 7 ou obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisées en ce qu'elles appartiennent à la famille des Brassicacées et de préférence en ce qu'il s'agit du colza.