FR2768746A1 - Promoteur specifique des petales et procede d'obtention de plantes a fleurs sans petale - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un promoteur spécifique des pétales ainsi qu'un procédé d'obtention de plantes à fleurs sans pétale.

Description

La présente invention concerne notamment un promoteur spécifique des pétales et un procédé d'obtention de plantes à fleurs sans pétale.

L'intérêt de l'obtention de plantes dépourvues de pétales est parti de l'observation que les pétales sénescents, en tombant sur les feuilles pourraient fournir des foyers d'infection privilégiés pour les spores de certains champignons pathogènes. Dans le cas du colza, par exemple, le mode d'infection de Sclerotislia sclerotiorum suit principalement cette voie. Ce champignon est responsable en effet d'importants dommages sur les cultures de colza (Lamarque, 1983) et on ne connaît pas de résistance génétique à celui-ci ni chez le colza ni chez les espèces apparentées. Ainsi, à l'heure actuelle, seuls les traitements chimiques préventifs sont utilisés.

La lutte contre Scièrotinia sclerotiorum par le biais de plantes dont les fleurs n'auraient pas de pétales permettrait de diminuer l'utilisation de fongicide et limiterait donc la pollution des sols subséquente.

Il s'agit donc de produire des plantes à fleurs sans pétale et d'éprouver ainsi une stratégie de lutte contre le susdit champignon basée sur une résistance "physique" et non pas sur l'utilisation de génes de résistance au sens classique.

La présente invention propose donc d'obtenir des plantes dont les fleurs seraient dépourvues de pétales. Elle consiste à mettre en oeuvre une région promotrice contrôlant l'expression spécifiquement dans les pétales d'une séquence (orf) codant pour une molécule susceptible de modifier les caractéristiques naturelles du pétale voire d'en inhiber la formation.

Ainsi, on peut envisager de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la structure des pétales de fleurs en plaçant, en aval de la région promotrice ci-dessus décrite des gènes impliqués dans la biosynthèse des pigments ou des gènes de régulation comme les protéines MYB (Noda et al. 1994). Ce type d'expérience a déjà été réalisé (Elomma et al., 1996 , Gutterson, 1995). Toutefois, les promoteurs utilisés sont plutôt de types constitutifs comme le 35S du CaMV alors qu'il serait intéressant de confiner l'expression du transgéne à l'organe ciblé.

On peut donc, dans le cadre de la présente invention, envisager la création de plantes ornementales originales.

La présente invention a donc pour objet une séquence nucléotidique dont il a été démontrée que le gène correspondant s'exprime spécifiquement dans le pétale, cette séquence nucléotidique correspond à SEQ ID N" 5.

Par conséquent, la présente invention a pour objet une séquence nucléotidique qui correspond à tout ou partie:
a) de la séquence selon SEQ ID N" 5, ou
b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou
c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).

Dans le cadre de la présente invention, la partie la plus intéressante de cette séquence nucléotidique est la région promotrice définie comme étant la séquence précédant (côté 5') le codon du début de traduction (ATG). Strito sensu cette région promotrice s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3265 (c'est-à-dire au dernier nucléotide précédant immédiatement le codon ATG) mais, compte tenu des sites de restriction, cette région s'étend préférentiellement du nucléotide 1 au nucléotide 3233 (correspondant au site AvaI) et plus préférentiellement encore du nucléotide 2911 au nucléotide 3233 de SEQ ID N" 5.

Cette région promotrice précède donc à l'état naturel, un orf qui est exprimé spécifiquement dans les pétales et dans le cas où cet orf est remplacé (par manipulation génétique) par un autre orf dont le produit est une molécule cytotoxique, cette dernière est susceptible de ne détruire que lesdits pétales. Le remplacement peut également être réalisé par une partie de gène susceptible, lors de son expression spécifique dans le pétale, d'en modifier les caractéristiques d'origine.

La présente invention a donc également pour objet des vecteurs d'expression cellulaire comprenant une région promotrice telle que ci-dessus décrite placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un produit capable de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la texture des pétales de fleurs, ainsi qu'un procédé d'obtention de plantes ornementales comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un de ces vecteurs. L'invention comprend également le cas où ladite séquence d'ADN code pour un produit cytotoxique.

Avantageusement, le produit cytotoxique en question est une ribonucléase.

En effet, lorsque cette RNase s'exprimera spécifiquement dans les pétales, elle en détruira tous les ARN, ce à quoi le pétale ne pourra pas survivre.

Préférentiellement, la RNase est la bamase, dont l'off correspondant a été isolé de
Bacillus amyloliquefasciens (Hartley RW, 1988).

Il s'agit donc d'introduire un vecteur conforme à l'invention dans une souche bactérienne susceptible de réaliser la transformation de cellules de plantes telles qu'Agrobacterium tumefaciens. Ceci peut notamment être réalisée par la méthode d'infiltration de plantes d'A rab idopsis thaliana décrite par Bechtold et al.; 1993. Cette technique consiste à introduire la bactérie dans les cellules des hampes florales par infiltration sous vide. Les plantes sont ensuite repiquées en serre et leurs graines recoltées. Environ une graine sur mille donne naissance à des plantes dont toutes les cellules portent le transgène. La transformation d'autres plantes et notamment du colza peut être réalisée par l'intermédiaire d'Agro- bacterium tumefaciens et/ou d' > lgrobacterium rhizogenes à l'aide de diverses techniques, maintenant classiques (transformation de disques foliaires, d'hypocotyles de hampes florales....) associant une phase de co-culture de la bactérie avec les tissus végétaux, suivie de la sélection et de la régénération des cellules transformées en plantes entières. D'autres techniques de transformation ne font pas intervenir cette bactérie et permettent de transférer directement le gène cloné dans des cellules ou des tissus (électroporation, canon à particules...) et de sélectionner et d'obtenir des plantes transformées (technique revue par Siemens et Schieder).

La présente invention a également pour objet des cellules de plantes transformées avec un vecteur conforme à l'invention ainsi que des plantes comprenant lesdites cellules. L'invention a également pour objet des plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales.

Comme indiqué précédemment, la présente invention permet donc l'obtention de plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales , le procédé conforme à l'invention comprenant l'insertion dans les plantes d'un vecteur tel que ci-dessus décrit et comprenant une séquence d'ADN codant pour un produit cytotoxique.

Dans le cadre de la présente invention, on peut également envisager d'obtenir des plantes hybrides par croisement de deux lignées dont on chercherait à associer les qualités agronomiques. Cependant, afin que la pollinisation entomophile s'opère de façon optimum, il est nécessaire que les parents de l'hybride en question portent des pétales. Un tel croisement n'est donc possible qu'au moyen d'un système d'activation du gène toxique à double composante. Le principe d'un tel système consiste à disposer de deux lignées portant chacune un constituant n'ayant pas d'activité cytotoxique. L'activité toxique spécifique est alors restaurée dans les hybrides de ces deux lignées par combinaison des deux constituants.

Un exemple possible d'un tel système consiste à inactiver le produit d'expression que l'on veut contrôler par insertion d'au moins un codon stop au début de la séquence codante correspondante puis d'ajouter en trans dans le système, un ARNt dit "suppresseur" qui va reconnaître le ou les codon(s) stop et apporter l'acide aminé qu'il porte au lieu de terminer la traduction. La protéine pourra alors être traduite intégralement et son activité restaurée. Un tel système a déjà été expérimenté concernant la séquence codante du gène GUS dans laquelle a été insérée le codon stop ambre, l'ARNt suppresseur utilisé étant porteur de la leucine. De plus, la fonctionnalité d'un tel système de transactivation utilisant un ARNtLCU suppresseur a été vérifié in planta dans Arabidopsis thaliana et
Nicotiana tabacum. Ce modèle a été ensuite appliqué au cas de la barnase. Des gènes mutés (c'est-à-dire dans lesquels ont été insérés un codon stop) codant pour la barnase et dépendant de l'expression du gène de ARNtLCU ont été obtenus et testés en expression transitoire dans des protoplastes de tabac (Choisne Nathalie, 1997).

La présente invention concerne donc également un procédé d'obtention de plantes hybrides dont les fleurs n'ont pas de pétale et comprenant les étapes de
a) transformation de plantes d'une lignée A avec un vecteur conforme à
l'invention et comprenant une séquence d'ADN codant pour séquence
cytotoxique modifiée par l'insertion d'au moins un codon stop,
b) croisement des plantes de lignée A ainsi obtenues avec des plantes de
lignée B exprimant le gène d'un ARNt suppresseur,
c) sélection des plantes hybrides avec des fleurs sans pétales.

Dans le cadre de la présente invention, les plantes de lignée A sont transformées par une construction sirnilaire à piu3352 telle que représentée dans la figure 7.

Avantageusement, les plantes conformes à l'invention appartiennent à la famille des Brassicacées, préférentiellement, il s'agit du colza.

La figure 1 illustre l'analyse par hybridation de type Northern d'ARN polyA+ (2 pg) et des ARN totaux (10 ug) de colza. La membrane est hybridée avec l'ADNc 9.2 entier marqué au 32P. La révélation est faite après 24 heures d'exposition à - 80"C avec un écran. Les ARNm identifiés ont une taille approximative de 800 pb. Plantule 1: plantule d'une semaine, Plantule 2: plantule de deux semaines
La figure 2 illustre la comparaison des séquences protéiques d 'Arabidopsis thaliana (en haut) et du colza (en bas) déduites respectivement de ADNc X74360 (SEQ ID N" 1) et 9.2 (SEQ ID N" 2). La protéine d'Arabidopsis thaliatia présente une longueur de 140 aa alors que la protéine de colza présente une longueur de 147 aa. L'homologie entre les deux étant de 74,6 %. Les étoiles repèrent les acides aminés communs aux deux séquences et les points figurant dans l'ADNc d'Arabidopsis thaliana n'ont été indiqués que pour permettre de placer l'une en face de l'autre les séquences communes aux deux plantes, la séquence d 'Arabidopsis thaliana devant se lire en continu, c'est-à-dire en faisant abstraction desdits points.

La figure 3 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des
ADNc 9.2 du colza (en bas) et X74360 d 'Arabidopsis thaliana (en haut), les deux séquences présentant une homologie totale de 83 %.

La figure 4 représente les cartes de restriction partielles des clones génomiques (A : Aval, B : BamH1, EI : EcoR1, EV : EcoRV, H : HindIII, He
HincII, P : PstI, S : Sac1, S1 : Sal1, Xb : Xba1, Xh : Xho1).

La figure 5 représente la séquence 5'- > 3' du clone génomique 4.1.1 (SEQ
ID N 5). La séquence palindromique a été soulignée deux fois, la séquence codante a été soulignée une fois. Les sites de restriction suivants ont été repérés
BamHI (en position 1) : GGATCC, SalI (en position 2911) : GTCGAC et AvaI (en position 3229) :CCCGAG.

La figure 6 représente les constructions réalisées avec les promoteurs des clones génomiques 4. 1. I et S. 1.1.

<SEP> ICLLC]
<tb> CH2
<tb> <SEP> 322pb
<tb> <SEP> Gus
<tb> <SEP> tcodantc
<tb> <SEP> ES
<tb> région promotrice distale du clone génomique 4.1.1 séquence palindromique région promotrice proximale du clone génomique 4. 1.1 région promotrice de 322 pb du clone génonlique 4. I. région promotrice de 322 pb du clone génomique S. I. terminateur du gène de la nopaline synthase séquence codante du gène rapporteur gus séquence codante du gène 4. 1.1 région 3' du gène 4.1.1 non traduite
La figure 7 illustre les constructions réalisées avec le promoteur de 322 pb du clone génomique 4.1.1

<tb> 399 <SEP> pb
<tb> GUS
<tb> <SEP> Barnase+
<tb> <SEP> amasemuté
<tb> promoteur de 322 pb du clone génomique 4. 1. séquence codante du gène rapporteur gus séquence codante du gène de la barnase sauvage séquence codante du gène de la barnase mutée

terminateur du gène de la nopaline s)'nthase terminateur 19S du CaMV
L'invention ne se limite pas à seule description ci-dessus, elle sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne sont cependant donnés qu'à titre illustratif.

EXEMPLE 1 : Mise en évidence d'un promoteur spécifique des pétales
La première étape a consisté en obtention de clones d'ADN complémentaires (ADNc) exprimés spécifiquement dans le pétale. Pour cela, les
ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN messagers (ARNm) dc pétale de colza.

Parallèlement, des ADNc ont été synthétisés à partir d'ARNm de feuilles, de boutons floraux dont les pétales ont été enlevés et d'étamines.

Les ADNc provenant desdits organes ou tissus ont été soustraits aux
ADNc dérivés des ARNm exprimés dans le pétale de colza. Les moléculcs résultant de cette soustraction ont été utilisées lors d'une expérience d'hybridation différentielle d'une banque d'ADNc de pétale selon une technique similaire à celle présentée par Atanassov et al. 1996.

Plusieurs clones d'ADN de colza ont été isolés à l'issue de cette expérience.

Leur profil d'expression a été étudié par la technique d'hybridation moléculaire de type Northern. En l'absence de clone strictemcnt spécifiques du pétale (au seuil de détection de la technique) le candidat le plus pertinent a été retenu pour la suitc des études , il s'agit du clone 9.2. Ce clone est fortement exprimé dans le pétale au stade jeune (bouton de 3 mm environ) et très faiblement dans les étamines (figure 1).

Les recherches d'homologie de séquences dans les banques de données montrent une forte similitude entre la protéine déduite de la phase ouverte dc lecture (orf) du clone 9.2 et la séquence codante d'un gène d'Arabidopsis thaliana
Les recherches d'homologie de séquences dans les banques de données montrent une forte similitude entre la protéine déduite de la phase ouverte de lecture (orf) du clone 9.2 et la séquence codante d'un gène d'Arabidopsis thaliazla (X74360) codant pour une protéine putative de la paroi dont l'expression est régulée par les gibbérellines (Phillips et Huttly, 1994) (figure 2). Le degré d'homologie présenté par les séquences d'ADNc respectives correspondantes est supérieur à 80 % dans les 500 premières bases puis disparaît totalement sur les 220 restantes (figure 3).

Le clone d'ADNc 9.2 de colza a servi de sonde pour cribler une banque génomique de colza. Sept clones génomiques ont été isolés. Sur la base des cartes de restriction et des séquences, ces sept clones se répartissent en deux groupes suggérant l'existence chez le colza d'une famille d'au moins deux gènes nommés dans la suite du texte 4.1.1 et 8.1.1 (figure 4). L'ADNc 9.2 est dérivé du gène correspondant du clone génomique 4.1.1.

Une étude préliminaire par amplification PCR a été réalisée sur le clone 9.4.1 appartenant au groupe du 4.1.1. En effet, la structure du clone génomique a permis d'amplifier une région amont de 3233 pb en utilisant des techniques d'amplification de grands fragments d'ADN et de séquençage progressif par PCR.

Cette région de 3233 pb s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3233 de la séquence représentée sur la figure 5 et elle se termine au niveau du site AvaI au niveau duquel la coupure a été effectuée ainsi que le clonage pour l'obtention de "bouts francs".

Puis les régions amonts susceptibles de contenir les séquences régulatrices ont été sous-clonées dans des vecteurs de clonage à partir des deux clones génomiques (4.1.1 et 8.1.1). On dispose donc actuellement, pour le clone 4.1.1, de plus de 4 kb de séquence correspondant majoritairement à l'off et aux régions amonts (figure 5).

EXEMPLE 2: Vérification de la spécificité de la région oromotrice
Différentes constructions comprenant le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle de certaines de ces séquences ont été réalisées afin d'étudier l'expression de ces gènes chimériques (c'est-à-dire constitués de la séquence codante d'un gène connu précédé de la région promotrice conforme à l'invention) dans des plantes transformées d'Arabidopsis thaliatia et de colza.

Ces constructions se regroupent en deux catégories en fonction de l'off placée sous le contrôle des séquences régulatrices
- le gène rapporteur GUS pour étudier les profils d'expression et vérifier
la spécificité conférée par le promoteur,
- le gène de barnase sauvage ou inactivé pour empêcher la formation du
pétale par expression dans cet organe de ce gène toxique (les figures 6
et 7 détaillent la composition de chaque construction).

Les profils d'expression du gène rapporteur GUS chez les transformants d'Arabidopsis obtenus dans le cas du pIB100 montrent une certaine variabilité sur l'ensemble des plantes (voir tableau 1 ci-après qui énumère les parties des plantes transformées chez lesquelles on a observé une coloration bleue). Cependant, chez près de la moitié des plantes présentant une coloration bleue (13/30), le gène rapporteur ne s'exprime que dans les pétales (au seuil de détection de la technique). On retrouve chez certaines plantes une faible expression dans les étamines, peu surprenante du fait des résultats des hybridations de type Northern, mais aussi parfois une expression dans d'autres organes floraux ce qui pourrait suggérer l'influence d'effets de position du transgène dus à sa petite taille.

Toutefois l'existence d'une proportion significative de plantes présentant le profil attendu laisse à penser que le fragment proximal de 322 pb est capable de conférer une expression spécifique du pétale. La stabilité de cette expression a été testée sur les descendants en autofécondation de ces plantes. Pour la plupart, on retrouve bien la spécificité "pétale" (données non montrées).

Des séquences promotrices plus longues ont également été mises en oeuvre par le biais des constructions pIB102 et pIB 105 et les plantes transformées d'Arabidopsis thatiana ont été observées (le tableau 2 énumère les parties des plantes transformées par pIB 102 et présentant une coloration bleue, le tableau 3 énumère les parties des plantes transformées par pIBlOS et présentant une coloration bleue). On ne retrouve pas la spécificité pétale dans la proportion précédemment observée car dans presque tous les cas, le gène rapporteur est effectivement exprimé dans le pétale mais également dans d'autres organes de la fleur.

De même, des plantes transformées de colza ont été obtenues avec une construction comportant comme séquence régulatrice le fragment amont du gène 4.1.1 de 3233 pb cloné après amplification par PCR. Sur les neuf plantes de colza qui ont déjà pu être observées, le gène rapporteur s'exprime dans le pétale mais aussi dans d'autres organes de la fleur (données non montrées), comme on l'observe chez Arabidopsis avec ces grandes régions promotrices.

Ces résultats suggèrent que ces fragments sont trop longs alors que l'on pense que le précédent (322 pb) pourrait être un peu court et donc amplifier les effets de position éventuels. Ce dernier cependant donne lieu aux résultats les plus prometteurs.

Les promoteurs pIB351 et pIB352 (figure 7) analogues au pIB 100 mais comportant respectivement la séquence codante du gène de la barnase sauvage et cette même séquence inactivée par insertiOn d'un codon stop (dénommée alors barnase mutée) au lieu de la séquence codante du gène rapporteur ont été introduites dans Arabidopsis thaliana (résultats non encore disponibles).

TABLEAU 1

SEPALES <SEP> PETALES <SEP> ETAMINES <SEP> PISTILS <SEP> FEUILLES <SEP> SILIQUES <SEP> AUTRES <SEP> PLANTES
<tb> (Nombre) <SEP> TRANSFORMEES
<tb> (Nombre)
<tb> - <SEP> 4 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 13
<tb> - <SEP> 4 <SEP> - <SEP> haut <SEP> stigmate <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> - <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 2/4 <SEP> - <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> 2 <SEP> pointes <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> <SEP> 1 <SEP> fleur <SEP> - <SEP> sous <SEP> papille <SEP> 1 <SEP> fleur <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> pointe <SEP> jeune <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> étamine <SEP> pistil <SEP> - <SEP> - <SEP> Pédoncule <SEP> floral <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> haut <SEP> filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> légers <SEP> petit <SEP> bouton <SEP> intérieur <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> - <SEP> intérieur <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> jeune <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> - <SEP> peu <SEP> haut <SEP> stigmate <SEP> - <SEP> - <SEP> 3
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> tissu <SEP> connectif <SEP> stigmate <SEP> pointe <SEP> - <SEP> Pédoncule <SEP> floral
<tb> pointe <SEP> 4 <SEP> haut <SEP> filet <SEP> intérieur <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> certains <SEP> 4 <SEP> connectif <SEP> pistil <SEP> pointe <SEP> + <SEP> marge <SEP> - <SEP> 1
<tb> bord <SEP> 4 <SEP> pointe <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bord <SEP> 4 <SEP> haut <SEP> sac <SEP> pollinique <SEP> haut <SEP> stigmate <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> 30 <SEP> plantes
<tb> TABLEAU 2

SEPALES <SEP> PETALES <SEP> ETAMINES <SEP> PISTILS <SEP> FEUILLES <SEP> SILIQUE <SEP> AUTRES <SEP> PLANTES
<tb> (Nombre) <SEP> TRANSFORMEES
<tb> (Nombre)
<tb> - <SEP> 2 <SEP> sur <SEP> qq <SEP> fleurs <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> - <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> - <SEP> 4 <SEP> filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> - <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> sac <SEP> pollinique;filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 2
<tb> + <SEP> + <SEP> + <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> entier <SEP> bouton <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> âgée <SEP> pointe <SEP> haut <SEP> - <SEP> Pédoncule <SEP> floral <SEP> 1
<tb> 19 <SEP> plantes
<tb> TABLEAU 3

SEPALE <SEP> PETALE <SEP> ETAMINE <SEP> PISTIL <SEP> FEUILLE <SEP> SILIQUE <SEP> AUTRES <SEP> PLANTES
<tb> (Nombre) <SEP> TRANSFORMEES
<tb> (Nombre)
<tb> - <SEP> 1 <SEP> fleur <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> - <SEP> - <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> - <SEP> 4 <SEP> sac <SEP> pollinique,filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> - <SEP> 4 <SEP> entier <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> bordure <SEP> - <SEP> Pédoncule <SEP> floral <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> entier <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 1
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> entier <SEP> sauf <SEP> papille <SEP> petites <SEP> - <SEP> Pédoncule <SEP> floral <SEP> 3
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> sac <SEP> pollinique,filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> - <SEP> - <SEP> 19
<tb> bouton <SEP> 4 <SEP> filet <SEP> sous <SEP> papille <SEP> pointes <SEP> - <SEP> 3
<tb>
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA)
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75007
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PROMOTEUR SPECIFIQUE DES PETALES ET PROCEDE
D'OBTENTION DE PLANTES A FLEURS SANS PETALE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 140 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: protéine A.thaliana
(x,) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Ala Ser Ser Leu Ile Thr Ser Ala Val Ile Val Val Val Leu Ser
1 5 10 15
Leu Val Leu Gly Ser Val Glu Gln Val Ser Gly Leu Arg His Val Pro
20 25 30
Lys Ser Pro Lys Ile Thr Asp Val Lys His Pro Asp Phe Leu Val Thr
35 40 45
Ile Glu Pro Lys Pro Thr Ile Leu Ile Pro Gly Val Gly Arg Phe Leu
50 55 60
Leu Pro Pro Lys Cys Lys Lys Pro Phe Tyr Pro Tyr Asn Pro Val Thr
65 70 75 80
Gly Ala Pro Leu Thr Gly Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Asn Gly Gly Gln
85 90 95
Gly Ala Gly Pro His Thr Gln Leu Pro Gly Gly Asp Asp Thr Leu Val
100 105 110
Pro Asn Pro Gly Phe Glu Glu Pro Thr Pro Thr Ile Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Gly Ser Asn Gly Gln Val Pro Pro Val Pro Leu Pro
130 135 140 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 147 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: protéine colza
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ala Ala Ala Val Thr Val Met
1 5 10 15
Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gly Pro Ala Glu Gln Val Ser Gly Leu Arg
20 25 30
His Ile Pro Lys Ser His Lys Thr Thr Asp Val Lys His Pro Glu Phe
35 40 45
Leu Val Thr Ile Glu Pro Lys Pro Thr Ile Leu Ile Pro Gly Val Gly
50 55 60
Arg Phe Leu Leu Pro Pro Lys Cys Lys Lys Pro Phe Tyr Pro Tyr Asn
65 70 75 80
Pro Val Thr Gly Ala Pro Leu Thr Gly Gly Ser Ile Gly Gly Gln Ile
85 90 95
Pro Ser Phe Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Ala Arg Thr Gln Leu Pro
100 105 110
Gly Gly Asp Asp Thr Leu Val Pro Asn Pro Gly Phe Glu Thr Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly Asn Asn Gly Gln Val Pro Pro Val
130 135 140
Pro Leu Pro
145
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 641 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: clone 9.2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AGCAGTCACT GTCATGATTC TTAGCCTACT GCTTGGACCT GCAGAGCAAG TTAGCGGACT 60
GCGTCATATT CCCAAGTCCC ATAAGACCAC TGATGTCAAA CACCCTGAGT TTCTTGTCAC 120
CATTGAGCCA AAACCAACTA TTCTCATCCC CGGTGTTGGA AGGTTCTTGC TTCCTCCCAA 180 ATGTAAGAAA CCATTCTACC CATACAATCC AGTCACTGGA GCTCCCCTTA CTGGCGGGTC 240
TATCGGTGGT CAAATCCCAT CATTTGGTGG TGGACAAGGA GGCGGAGCTC GCACCCAGCT 300
CCCTGGTGGC GATGATACCC TTGTCCCAAA CCCCGGATTT GAAACTCCAA CCCCTGCCAC 360
TGGAGCTGGC GCTGGAAACA ACGGCCAAGT TCCTCCGGTG CCACTACCCT GATTTCTTTT 420
TCAATATCTG TCAACAAATA AGCATTTCTT TAATGCAAAA GTGTCTATTT GAGTCTTACC 480
TTCTGGTTTA CTAGCCGTCA CCTTAAGAGT CATATGTTTG TCATCTCTCT CTTTCTTTTT 540
GGAAGAGAGA ATCTTGTGTC TTATGCCGTC AGAAGAAATT TAAAGCATTT GTTTACATGC 600
CATTACATTC AACTATCAAA ATGCTTTATG ATAAAAAAAA A 641
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE
(A) NOM/CLE: X74360
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GCTTTCTCCT CTACAACAAA ATAAAATAAA ATTAATGGCT TCTTCACTTA TCACCTCCGC 60
AGTCATTGTC GTGGTTTTAA GCCTAGTGCT TGGATCTGTA GAGCAAGTGA GTGGACTACG 120
TCACGTTCCC AAGTCCCCTA AGATCACTGA TGTCAAACAC CCTGACTTTC TTGTAACCAT 180
TGAGCCCAAA CCAACTATTC TCATTCCCGG TGTTGGAAGG TTCTTGCTTC CTCCCAAATG 240
CAAGAAGCCG TTCTACCCTT ACAATCCTGT CACCGGAGCT CCACTTACTG GTGGGGGAAT 300
CCCATCATAT AATGGTGGAC AAGGGGCCGG ACCTCACACC CAACTCCCTG GTGGCGATGA 360
TACGCTTGTC CCAAACCCCG GATTTGAAGA GCCAACCCCG ACCATTGGAG CTGGCACAGG 420
AAGCAACGGC CAAGTTCCAC CAGTGCCACT ACCCTGAGTA TTATTAATCT GTCAACARAT 480
AAGCATATCT TAGATGCAAA CATGTCTGTT TTGGTGTCTT GAGTCTTGGT TAGATAAGTA 540
ACCCGCTACT TTACTAGCCG TTTCGTTTGC CATCTCTTTT TCTCTCTGTG TCTCTCTCTA 600
TTTGCTACAA AAAGAGAGAA TCTTGTTTCA TGTTTTTCAG TTTGTCTTTA GATGAATTCA 660
TTTTCACATA CCATTATATT AAAATAAAGG AAATGTTCCG CAGTAAAAAA A 711
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4516 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: clone génomique 4.1.1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GGATCCGTTG TTAGGATTTT AGGGCTTTGT GAGTTCAGAA AATCTCTAAA GCTTCATTTT 60
TATCAATCAA GCTTTTTTTT TTTAAATTAA ACATTCTAAA GTCTCTAAAG TCATTATAAG 120
TTTATTTCTC CTCTTTTGTG TTGGTTTTTC TAAAACCAAT AATGCGTGAT TTTTGCAATT 180
TTTTTTTTTC ACTAAAAATG TTTTATTTTC TTTTTACTTT GTAACTAAAT CACTTATTTA 240
AGTTTATAAC AATTTCGTTG AAATTTAAAA TTGACAAATT AATCATTGAA TTTTTTTCTT 300
GTTCATTTAA GATCCGTATT GTACTACTTT TATAATCATC TATATTTAAA TTTTTAATAG 360
TATCATAATT TTATTTTTTA ATAAAATATT TAAATATTAT CCAAACCTAT AATTTTAATA 420
CCAATCTGTT TTAATAAAAC GTAAACGAAT CAGCCAAATT CCTATGGCCA TAATTCTGAA 480
TCCAAGCTTA AACAAAAGTA CTTATCAATC GGACCCTAAG AGTCCTCGTA ATTAGGGTTC 540
TTTAAGATTT TTACCATTTG AGCAGTTGAA TCAATGATCG TTTTCATGCG AGTAAACTTA 600
TTTGTAATAT TTAGTGGGGG CAGCTGCCTC CTCCCTGAAC ACCGTAGATC TCCCCCCTGT 660
TTCTATCTCT TACTGTGGAT GTAAGATCTA TTATTTTCTT GGGTTTTGTG TTTGTGAATG 720
CGTCTTATAT AGTGAGCATT AGCTTAGAGT TTCCCATTTT ATTGAATATT TTCATTCTTA 780
TTCATGTGGG TATCACAAAG GCATGGCCGA CTACCACTAT GTTATTCCTA TTCCTCCAGA 840
TATTGCACAG CAGAAGAAGA GGAAATGGAT GGAGGTGAAG TCGCTTGCAG GTGATTCTTT 900
TCCGTTCATT TTGGTATTTT CATTATATTG CAAATCTTAA TATTTTGTAG CGAAAAGAAT 960
ATTTTGTAGC ATAGTTTAAA ATTTTAAATA CGTATTCTTG CTTTAAGCTG TGTTTTGATG 1020 TAAAGTAAAA CATATGTACC AAAAGAACAA GACAATGTTC AAGTCTATAC GGAACCCATA 1080
CGGGACCCTT GTCCTTGTCC AGTTGACATT GTTCAGGCCA AGAACTACAC CAACAATTTT 1140
AAATCAACCT ATTGAAATTA GAAAAGAAAT CCGCTAATGC AAATAAAAAG AAGTGACTCG 1200
CATATAGTTG CCAACTAATT GTTGATGTTA ATTAAAAAGA TTAACTGTTA AATTTATGAT 1260 AAA?iAGTGT TTAGGGATTG GATCTGGTGA TAAAAAAGAT TATGTAGATG TTTTTGCAGA 1320
AAAAGTGCTA AATAACATTT GTTTATTTTG TCATTATGTG TAGAATACAA AGAAGAAATG 1380
AACTAAGACT TTATAGTATA AATTATTGTG GTTGATTAAT TTTAGATCTT TTCCTGAAGA 1440
ATGATTGCTG AATAATAAAA TGTTCATTTG CTTAATGAGT ATGTCTACTC TTTAGTTATT 1500
TCTGACCCGA AACCAACAAA CACTAATGAT TGATTAAACT AACCAATCAA CTTAACTTGT 1560
AAAACGAGTT GGCTTAGAAC ATGATTATTG AGAGGTTCTT AGGGTGGAGT TCTTAGCGGA 1620
ATATAAGAAC CTGTGTCTTA ATTTTTAATT AAAAAAGCTA AGAACTGGCT CTTAAATAAG 1680
AGTTTAAGAG CCGGTTCTTA GTTTTTTTAG TTAAAAGTTA AGAGTCAGGT TTTTATATTC 1740
CGTTAAGAAC TTCACCTTAA GGACCTTCTA ATAATCATGC TCTTACGTTA TCTGACCAAA 1800
AATACGAACA GAAAAAATAA AAACTCACTT ACCTCATCAT ATGAGATATG ACAAATGCAC 1860
TACTATTTAA GAAAAAACAT TAAAAAPAAC ATTAATGGTG TGGGAGGGTC ATTAATGGAG 1920
GTCACACAAA AGAAAGGCCA GAGAAGGCAA ATTGAAGGTG ACTGTATACA AAAGTAGGTC 1980
TTTCAGTTTT GCNCAGAGGA AGCTCATGAC ATTCACCAAA GCAGCACGAA TGAAGTTCAT 2040
CAAGTTTTTA ATTAGGCTTC GCTTCTTGTG ATTCCTCGAA AATTTATATC ATTTCATACG 2100
TTCGTTCTTG TTTTCATGTG ACTTTCCTCT TCTCCTACCG TGAGTCTCAT CAATTTCGTA 2160
GATCGCTANG TTAACGATCC ACGTATCATA NATACACTTC TTTCTATAGC CGTACGTATA 2220
CCACACATTA CNTCATCCCA CTTCNTAACT TATATAATTT TACTACTCAG ATCACNAGAG 2280
TACGTATATC AGGAAGTCAT TTCTTCTCCT TGTCCTATTC CTCTCTTTCT TTGTCCGGCT 2340
CTTATCTTCG CTAGTAGGAA TTTTCCGACG CACCCTTATC CAAGTATGTA TGCTATTCTC 2400
TCTCACTCTC CTTAATTTTA CACACCTCTT TCACTATCTT CAATGTCTTT TAACTTGTTT 2460
CAATTATGTT CGTGTGGGTG GGCAGGTCAT AATCATCATC ATGTCGGAAT GATGGGTAGG 2520
ACAATGAAGC GTCAGAGGAG GCCGGACACG GTGCAGGTGG CAGGGTCTAG GCTGCCGGAC 2580
TGCTCACACG CGTGTGGCTC ATGCTCTCCA TGCCGTCTTG TGATGGTTAG CTTCGTGTGT 2640
GCATCGCTAG AGGAGGCTGA GACTTGTCCC ATGGCTTATA AGTGCATGTG CAAGAACAAA 2700
TCCTACCCAG TCCCATGATG AATTAGCCTC TCTCACACTT AACTCTATGC ATTCAGACGT 2760
TTTGTTTCTT TCCTTTTGCT TCTTCGGATA AATTACCCTG TGTATGTATA AAATGCATCT 2820
TTTCCTTTTT TTAATTCTTT TGTCTTTTTG ATATCTTAAA CACAGTTTTA CGAAACAAGA 2880 ATRAGATTAG TTGAGCCACT CAAAAGCGTG GTCGACTAAA TTGAAACAGA AAGCCACACA 2940
ACTCATTGGG CTCTTGTTTA TGGCCCATGA CACCGCATTT CAGACTGCAA CAACCAAAGT 3000
TGTAGAAAGA ATAATATTTA AAGGGCACGT ACATACGTTG TTGGCTTCCA CCAAACTTTG 3060
GAGGCTCTCT AATAATTAGC ACACTCCATT CTATGCATTT GTTACACACC TTCTATTTTC 3120
AACCATTTCA TCTCACCTTT TTTAAATGTT TCCACAGTTA GCTCAGTAAA TTCACTATAT 3180
ACAGACATAC ACCTTCCCTC CACAAGATCA AACAACCACA CTACCTTCCC CGAGTTTTCT 3240
CACTACAATT TAAAAGAAAA AACAAATGGC TTCGTCCCTG CTAACACTCG CAGCAGCAGC 3300
AGTCACTGTC ATGATTCTTA GCCTACTGCT TGGACCTGCA GAGCAAGTTA GCGGACTGCG 3360
TCATATTCCC AAGTCCCATA AGACCACTGA TGTCAAACAC CCTGAGTTTC TTGTCACCAT 3420
TGAGCCAAAA CCAACTATTC TCATCCCCGG TGTTGGAAGG TTCTTGCTTC CTCCCAAATG 3480
TAAGAAACCA TTCTACCCAT ACAATCCAGT CACTGGAGCT CCCCTTACTG GCGGGTCTAT 3540
CGGTGGTCAA ATCCCATCAT TTGGTGGTGG ACAAGGAGGC GGAGCTCGCA CCCAGCTCCC 3600 TGGTGGCGAT GATACCCTTG TCCCAAACCC CGGATTTGAA ACTCCAACCC CTGCCACTGG 3660
AGCTGGCGCT GGAAACAACG GCCAAGTTCC TCCGGTGCCA CTACCCTGAT TTCTTTTTCA 3720
ATATCTGTCA ACAAATAAGC ATTTCTTTAA TGCAAAAGTG TCTATTTGAG TCTTACCTTC 3780
TGGTTTACTA GCCGTCACCT TAAGAGTCAT ATGTTTGTCA TCTCTCTCTT TCTTTTTGGA 3840
AGAGAGAATC TTGTGTCTTA TGCCGTCAGA AGAAATCTAA AGCATTTGTT TACATGCCAT 3900
TACATTCAAC TATCAAAATG CTTTATGATA CATGTACTCT ACTCCTCCAT TTCGCATACT 3960
AAGTAGACTA GATGAAGACA AGTACTCAAT CAAAGCTGAA TACACTAATC ACCCATTCAA 4020
ATTATTTCCT AGAATTTGAA TGAACCAAAC TAACAAAAAA GAACAATTAC AACCTAATGA 4080
TACGCTGATG CAAAACTACA AAAGGAGGTC GAATAAGGTA AGAGGATGGA GCAGAGTCGT 4140
ATATATCAGA GAAAGATAGT ATAGTAAGAG AAAAAGAGGA AACACACAAA TGACAAATGA 4200
TAGTATTACA TTTTCTCATC ATTATTCAGA GTAAACAAAG CAATAAAGTG AAAGAATTCA 4260
CATAGTGTAA TCTTGGAATT GAGTATCTAC GGGGAGGAAG AAACTCGATC AGCCTCAATC 4320
ATGGACTTTA TGTNGTACTC TCCTGCTTTG TACGACGACC TAACCATCGG CCCTGATGCT 4380
ACGTACCTGA ATCCCTGTTT AACCAACAAA CCCATTTAGC CCTCTCCTTG TTTCCCATCA 4440
AATTTCCNGA ACTAAAAACA GANNAGANAN NAGGCTTACC ATTTCCATGC CNAGANGANG 4500
GTATCTCTCC AAAGCC 4516
REFERENCES
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Thèse de doctorat de l'université de Paris XI (N d'ordre 4691).

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Siemens and Schieder 1996. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 2, 66-75

Claims (3)

REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie a) de la séquence selon SEQ ID NO 5, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou
1. c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).

   2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 correspondant à tout ou partie

   a) de la séquence s'étendant du nucléotide 1 au nucléotide 3233 et de

   préférence du nucléotide 2911 au nucléotide 3233 de SEQ ID N" 5, ou

   b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou
2. c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).

   3. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la

   revendication 2 placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un

   produit capable de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la

   texture des pétales de fleurs.

   4. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la

   revendication 2 placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un

   produit cytotoxique.

   5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le produit

   cytotoxique est une ribonucléase et de préférence la barnase.

   6. Cellules de plante transformées par un vecteur selon l'une des revendications

   3 à 5.

   7. Plantes comprenant des cellules selon la revendication 6.

   8. Plantes dont les fleurs n'ont pas de pétale.

   9. Procédé d'obtention de plantes ornementales comprenant l'insertion dans

   lesdites plantes d'un vecteur selon la revendication 3.

   10. Procédé d'obtention de plantes dont les fleurs n'ont pas de pétale

   comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un vecteur selon la

   revendication 4 ou 5.

   11. Procédé d'obtention de plantes hybrides dont les fleurs n'ont pas de pétale

   comprenant les étapes de

   a) transformation de plantes d'une lignée A avec un vecteur selon la

   revendication 4 ou 5 modifié par insertion d'au moins un codon stop dans la

   séquence codante de l'ADN,

   b) croisement des plantes de lignée A obtenues en a) avec des plantes de

   lignées B exprimant le gène d'un ARNt suppresseur,
3. c) sélection des plantes hybrides avec des fleurs sans pétale.

   12. Plantes selon la revendication 7 ou 8 ou obtenues par la mise en oeuvre du

   procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisées en ce qu'elles

   appartiennent à la famille des Brassicacées et de préférence en ce qu'il s'agit

   du colza.