CA2309323A1 - Gene codant pour la thanatine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la thanatine, un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation. L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, la drosomycine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Description
WO 99/24594 , PCT/FR98/_02375 Cane cotant pour la thanatine. vecteur le contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la thanatine.
un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme.
L' invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, la thanatine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
I1 existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter. d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à
1 ~ transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à
même d'assurer leur défense contre ces maladies.
On connait différentes substances d'origine naturelle. en particulier des peptides.
présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. .-~u sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
La thanatine est un peptide produit par induction bactérienne sur Psodizrs sp.
de préférence nraculivenrris adultes. Sa préparation par induction bactérienne est décrite dans la demande de brevet FR ? 733 237, de mëme que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro.
Après avoir d'abord identifié le gène de la thanatine, on a également trouvé
qu'il pouvait ètre inséré dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer la thanatine et conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour la 3~ thanatine. un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour la thanatine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte. en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des or;anismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé.
Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 nucléique codant pour la thanatine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne entin un procédé de tran,ti~rmation des plantes pour les cendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour la thanatine au moyen d'un vecteur approprié.
Par thanatine, on entend selon l'invention tout peptide comprenant essentiellement la séquence peptidique de 11 acides aminés décrite dans la demande de brevet ?37, ainsi que les séquences homologues équivalentes dans lesquelles certains acides aminés sont remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique décrite.dans la demande de brevet FR 3 733 237. on entend non seulement la séquence définie par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), mais également une telle séquence comprenant à l'une ou l'autre de ses extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à son expression et ciblage dans un organisme hôte. en 1 ~ particulier une cellule végétale ou une plante.
La thanatine est un peptide de formule (I):
Xaa- Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys- Xab (I) dans laquelle:
Xaa est NH2 ou un reste variable de séquence comprenant de 1 à 10 acides aminés, et Xab est OH ou un reste variable de séquence comprenant de 0 à ~ acides aminés.
De manière avantageuse, lorsque Xaa comprend au moins un acide aminé. celui-ci est l'un des 20 acides aminés de base et plus particulièrement choisi dans le ~=roupe comprenant Gly. Ser. Lys. Pro et Val. Lorsque Xab comprend au moins un acide aminé.
celui-ci est l'un des 20 acides aminés de base et plus particulièrement choisi dans le groupe comprenant Gln, Arg et Met.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les 2 résidus c~~stéines du peptide de formule (I) forment un pont disulfure intramoléculaire.
La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour la thanatine définie ci-dessus. I1 peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Psodius sp, de préférence maculiventr-is, ou encore un fragment dérivé, adapté pour l'expression de la thanatine dans l'organisme hôte où le peptide sera exprimé. le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon tes techniques usuelles d'hybridations successives d'oIigonucléotides synthétiques. Ces techniqûes sont notamment décrites par Ausubel & colt.
Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, WO 99124594 ~ PCT/FR98/02375 w particulier ADNc. notamment double brin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'aride nucléique codant pour la thanatine comprend la séquence d'ADN décrite par l'identiticateur de séquence n°
1 (SEQ ID NO I 1. une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
De manière avantageuse. le fragment d'acide nucléique selon l'invention comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID
NO 2), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par l'identificateur de séquence n° 1 ou n° 2 et codant pour la thanatine. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation. ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons 1 ~ d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un méme acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par l'identifcateur de séquence n° 1 ou n° 2 et ('homologue peuvent ëtre importantes. d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure à 100 acides nucléiques, réalisable par synthèse.
De manière avantageuse. le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de '_'0 référence. de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres. c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la thanatine résultante.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en _'~ position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte.
en particulier les cellules végéales ou les plantes. la séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour la thanatine tel que défini ci-dessus.
Par organisme hôte. on entend tout organisme mono ou pluricellulaire.
inférieur ou suppérieur. dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit.
pour la 30 production de thanatine. II s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures. en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale". on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons. des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs. le blé, le colza, le soja, le riz. la canne à sucre.
la betterave, Ie WO 99/24594 ~ PCT/FR98l02375 tahac. le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'erpression du fra~Tmem d'ADM codant pour lu thanatine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte.
( I; comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, pies peptides de transit, dos séquences terminatrices. y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Le fragment d'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre une séquence d'acide nucléique fusionnée en ~' et/ou en 3' à la séquence codant pour la thanatine. de manière à obtenir une protéine de fusion « protéine-thanatine ».
dont la coupure par les systèmes enzymatiques de l'organisme hôte permet la libération de la thanatine. Cette protéine fusionnée à la thanatine peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la thanatine de manière spécitique dans une partie de l'organisme hôte. comme par exemple le cytoplasme. la 1 s membrane cellulaire. ou dans le cas des plantes dans un type particulier de tissus ou dans la matrice e~ctracellulaire.
Selon un mode de réalisation. le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
?0 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut ëtre un signal '~-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans te réticulum endopIasmique. ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le üeu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de Ea protéine produite. comme par exemple le clivage du peptide signal.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne. virale ou végétale tel que, par exemple.
celui d'un gène 30 de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple. celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 3~S), ou un promoteur inducible par les pathogènes comme PR-la du tabac ou AoPRT-L
d'asperge.
tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de 35 manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple. celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
Selon l'invention. on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice. d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante. telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). comme par WO 99/24594 ~ PCT/FR98/OZ375 wemplc l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TV1V ) décrit dans la dcman~3c Wn 871076.1:1. ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
«u des peptides de transit. soit simples. soit doubles. et dans ce cas éventuellement séparés par unc séquence intermédiaire. c'est à dire comprenant. dans le sens de la transcription.
une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. une partie de séquence de la partie mature ~I-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation piastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à
localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 X08 909. Comme peptide de transit. on peut citer le peptide signal du gène PR-la du tabac décrit par Cornelissen & coll., réprésenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n° 3.
La séquence codant pour la protéine de fusion peptide si~:nal PR-la-thanatine et 1 s cette protéine de fusion sont également partie de la présente invention.
Cette séquence est notamment décrite par l'identiticateur de séquence n° 5, plus particulièrement la partie codante de cette séquence. correspondant aux bases 12 à 164.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation. on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne. comme par exemple le terminateur nos d'.-Igrobacterium tumefacic~ns, ou encore d'origine végétale. comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon la présente invention. le gène chimère peut également comprendre un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, comme la pénicilline. ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus. au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide. un bactériophage ou un virus. transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à
transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes. il s'agira notamment 3~ d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'im~ention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hüt~s. rn particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nu cléiqm ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut ëtre ubtenuc par tout moyen connu approprié. amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. L ne autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation. ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte. en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
1 ~ La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour la thanatine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées. en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La ?0 régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes. on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,459,355, LAS ~1.~36.~7~. US 5.464.763. US 6.177.010. US 5.187,073, EP 267,159, EP 604 662. EP
'_~ 67? 75?. L'S 4.945.050. US 5.036.006. US 5.100.792, US 5,371,014. LS
5,478,744, US
5.179.02?. US 5,565.346. US 5.484,956, US 5,508.468, US 5,538,877, US
5,554,798, US
5.489.520. US 5,510.318, US 5,204.253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, ?34. EP 539 563, EP 674 725. WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la 30 culture etiou du croisement des plantes régénérées ei-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à
certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN
codant pour la thanatine peut ëtre intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes 3 5 résistantes aux dites maladies, Ia thanatine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola.
Cladosporürm en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium eulmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora c~inncrmomi.
WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 Le ~;cne chimère pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection. tel qu'un ou plusieurs ~~ènes de tolérance aux herbicides.
La séquence d'r~DV codant pour la thanatine peut é~~alement ëtre intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérét. comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 11~ 673. WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la thanatine, d'autres séquences hétérologues codant pour d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
Les autres séquences peuvent ëtre intégrées au moyen du même vecteur I s comprenant un cène chimère. lequel comprend une première séquence codant pour la thanatine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence. selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore ëtre obtenues par croisement de parents. l'un portant le gène selon l'invention codant pour la thanatine.
l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques. on peut citer celle codant pour la drosomvcine, décrite dans la demande de brevet FR 2 7?~ 99? et par ?~ Fehlbaum & colt. (1994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 0911 déposée le 34 juillet 1997, ou celle codant pour l'androctonine décrite dans la demande de brevet FR 2 745 004 et dans la demande de brevet non publiée FR 97 10362 déposée le 20 août 1997.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour la thanatine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformées. Les figures 1 à ~ en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiqcres.
3 ~ Exemple 1: Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans .~usubel & colt.
WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac.
Les deux uli~;onucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo ? ci-après. sont hybridés à 6s 'C pendant ~ minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
Oligol: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC
ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' Oligo~: S' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA
GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3' Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2. l'ADN resté simple brin sert de 1 ~ matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et Nael et cloné dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction.
On ?0 obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR-la du tabac (SEQ ID NO 3).
pRPA-PS-PRIa-than: Création d'une séquence codant pour la thanatine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.
Les deux o(igonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oliao 3 et Oligo .~ selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.
Oligo3: 5' GGTTCCAAGA AGCCAGTGCC AATCATCTAC TGCAACAGGA
CG 3' Oligo ~: 5 ' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCACATCC
TCTGGCACTT ACCAGTCCTC CTGTTGCAGT AGATGATTGG
CACTGGC 3' 3~ Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de la thanatine (SEQ ID NO 1 ) est ensuite cloné
directement WO 99124594 ~~ PCT/F'R98/02375 dans le plasmide pRPA-~1D-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction :Vcrel.
L'orientation correcte du clone ohtenu est vérifiée par séquenFage. On obtient alors un clunc comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine située entre les sites de restriction :Vtol â l'extrémité N-terminale et Scal Surll ot BcrnrHl à l'extrémité
C-terminale (SEQ ID NO ~).
pRPA-RD-229: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine.
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Jim Carrington (Texas A&M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 3~S
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x3~S: Odell &
coll., 198 ) qui dirige l'expression d'un AR:~1 contenant séquence non traduite en ~' du virus etch du tabac (TEV ~' UTR; Carrington & Freed. 1990). le gène de la (3-glucuronidase de E.
1 ~ coli (GUS Jefferson & coll.. i 987) suivi du site de polyadenylation de l'ARN 3~S de CaM V (CaMV polyA; Odell & coll.. 1980.
Le plasmide pRTL-? GUS est digéré avec les enzymes de restriction ~-'cvl et BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PR 1 a-than est digéré avec les enzymes de restriction :Vtol et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-thanatine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure ?. « PR-la-thanatine »
représente la région codante pour la protéine de fusion PR-la-thanatine de pRPA-RD-'?30.
La thanatine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide sisnal PR-la.
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-19~ est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo ~
et Oligo 6 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-'KID-P.
3~ Oligo~: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
CATGC 3' WO 99/24594 1 ~~ PCT/FR98/02375 ()ligu li: 5 ' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTT.~1A TT.~AAAGC T ~_' GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' 1_'oligonucléotide double brin ubtenu est ensuite lié dans pL'C-19 qui a été
s préalablement digéré aveu les enzymes de restriction EcoRI et Hir:dlll et rendu bouts francs en employant le fragment ktenow de l'ADN polymérise 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'.4grobacterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage muitiple est représentée sur la figure 3.
l~
pRPA-RD-232: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-thanatine de pRPA-RD-229 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction HindlIL Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-thanatine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorvlé avec la phosphatase intestinale de veau.
pRPA-RD-17-t: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRl de pRPA-BL-1~OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérise kienovsv dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoymil à proximité de sa bordure droite, un cène ?s de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure. "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefacivns (Bevan & colt.. 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tcrrnefacie»s (Bevan & colt., 1983).
"NPT II"
représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E.
coli (Rothstein & colt., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & colt., 1980, "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. o=aenae (Stalker & colt.. 1988). "RB" et "LB" représentent respectivement les 3~ bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-17~1.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, WO 99/24594 l 1 PCT/FR98/02375 sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRf:~-V1D-P.
Oli~:o 7: 5' CCGGCCAGTC AGGCCa'AC"_' TAATTAAGT'~' T~'..nCGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGG~' sTG i GCTCGAGGGC CC.'~i-~CCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3' Oligo8: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3' L'oligonucléotide double brin hybridé (9s paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme dé restriction .~Cmal. et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.
1 ~ On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de séiection.
La structure schématique du plasmide pRP:~-RD-184 est représentée sur la figure 3 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro". "3~S pro", "BRX gene", "RB" et "LB"
ont la même signification que pour la figure 4.
pRPA-RD-235: Création d'un vecteur d'.Agrobacterium tumefacirrrs contenant la construction du gène codant pour la thanatine dirigée vers la matrice extracellulaire.
La plasmide pRPA-RD-232 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et Asc~l
un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme.
L' invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes, la thanatine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
I1 existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter. d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à
1 ~ transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à
même d'assurer leur défense contre ces maladies.
On connait différentes substances d'origine naturelle. en particulier des peptides.
présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à
trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. .-~u sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
La thanatine est un peptide produit par induction bactérienne sur Psodizrs sp.
de préférence nraculivenrris adultes. Sa préparation par induction bactérienne est décrite dans la demande de brevet FR ? 733 237, de mëme que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro.
Après avoir d'abord identifié le gène de la thanatine, on a également trouvé
qu'il pouvait ètre inséré dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer la thanatine et conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour la 3~ thanatine. un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour la thanatine ainsi que des éléments de régulation en position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte. en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des or;anismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé.
Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 nucléique codant pour la thanatine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne entin un procédé de tran,ti~rmation des plantes pour les cendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour la thanatine au moyen d'un vecteur approprié.
Par thanatine, on entend selon l'invention tout peptide comprenant essentiellement la séquence peptidique de 11 acides aminés décrite dans la demande de brevet ?37, ainsi que les séquences homologues équivalentes dans lesquelles certains acides aminés sont remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique décrite.dans la demande de brevet FR 3 733 237. on entend non seulement la séquence définie par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), mais également une telle séquence comprenant à l'une ou l'autre de ses extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à son expression et ciblage dans un organisme hôte. en 1 ~ particulier une cellule végétale ou une plante.
La thanatine est un peptide de formule (I):
Xaa- Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys- Xab (I) dans laquelle:
Xaa est NH2 ou un reste variable de séquence comprenant de 1 à 10 acides aminés, et Xab est OH ou un reste variable de séquence comprenant de 0 à ~ acides aminés.
De manière avantageuse, lorsque Xaa comprend au moins un acide aminé. celui-ci est l'un des 20 acides aminés de base et plus particulièrement choisi dans le ~=roupe comprenant Gly. Ser. Lys. Pro et Val. Lorsque Xab comprend au moins un acide aminé.
celui-ci est l'un des 20 acides aminés de base et plus particulièrement choisi dans le groupe comprenant Gln, Arg et Met.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les 2 résidus c~~stéines du peptide de formule (I) forment un pont disulfure intramoléculaire.
La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour la thanatine définie ci-dessus. I1 peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Psodius sp, de préférence maculiventr-is, ou encore un fragment dérivé, adapté pour l'expression de la thanatine dans l'organisme hôte où le peptide sera exprimé. le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon tes techniques usuelles d'hybridations successives d'oIigonucléotides synthétiques. Ces techniqûes sont notamment décrites par Ausubel & colt.
Selon la présente invention, on entend par « fragment d'acide nucléique » une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, WO 99124594 ~ PCT/FR98/02375 w particulier ADNc. notamment double brin.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'aride nucléique codant pour la thanatine comprend la séquence d'ADN décrite par l'identiticateur de séquence n°
1 (SEQ ID NO I 1. une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
De manière avantageuse. le fragment d'acide nucléique selon l'invention comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID
NO 2), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par l'identificateur de séquence n° 1 ou n° 2 et codant pour la thanatine. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation. ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons 1 ~ d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un méme acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par l'identifcateur de séquence n° 1 ou n° 2 et ('homologue peuvent ëtre importantes. d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure à 100 acides nucléiques, réalisable par synthèse.
De manière avantageuse. le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de '_'0 référence. de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres. c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la thanatine résultante.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en _'~ position ~' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte.
en particulier les cellules végéales ou les plantes. la séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour la thanatine tel que défini ci-dessus.
Par organisme hôte. on entend tout organisme mono ou pluricellulaire.
inférieur ou suppérieur. dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit.
pour la 30 production de thanatine. II s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures. en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale". on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons. des parties de plantes. des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs. le blé, le colza, le soja, le riz. la canne à sucre.
la betterave, Ie WO 99/24594 ~ PCT/FR98l02375 tahac. le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'erpression du fra~Tmem d'ADM codant pour lu thanatine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte.
( I; comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, pies peptides de transit, dos séquences terminatrices. y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.
Le fragment d'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre une séquence d'acide nucléique fusionnée en ~' et/ou en 3' à la séquence codant pour la thanatine. de manière à obtenir une protéine de fusion « protéine-thanatine ».
dont la coupure par les systèmes enzymatiques de l'organisme hôte permet la libération de la thanatine. Cette protéine fusionnée à la thanatine peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la thanatine de manière spécitique dans une partie de l'organisme hôte. comme par exemple le cytoplasme. la 1 s membrane cellulaire. ou dans le cas des plantes dans un type particulier de tissus ou dans la matrice e~ctracellulaire.
Selon un mode de réalisation. le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
?0 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut ëtre un signal '~-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans te réticulum endopIasmique. ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le üeu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de Ea protéine produite. comme par exemple le clivage du peptide signal.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne. virale ou végétale tel que, par exemple.
celui d'un gène 30 de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple. celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 3~S), ou un promoteur inducible par les pathogènes comme PR-la du tabac ou AoPRT-L
d'asperge.
tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de 35 manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple. celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
Selon l'invention. on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice. d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante. telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). comme par WO 99/24594 ~ PCT/FR98/OZ375 wemplc l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TV1V ) décrit dans la dcman~3c Wn 871076.1:1. ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
«u des peptides de transit. soit simples. soit doubles. et dans ce cas éventuellement séparés par unc séquence intermédiaire. c'est à dire comprenant. dans le sens de la transcription.
une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. une partie de séquence de la partie mature ~I-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation piastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à
localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 X08 909. Comme peptide de transit. on peut citer le peptide signal du gène PR-la du tabac décrit par Cornelissen & coll., réprésenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n° 3.
La séquence codant pour la protéine de fusion peptide si~:nal PR-la-thanatine et 1 s cette protéine de fusion sont également partie de la présente invention.
Cette séquence est notamment décrite par l'identiticateur de séquence n° 5, plus particulièrement la partie codante de cette séquence. correspondant aux bases 12 à 164.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation. on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne. comme par exemple le terminateur nos d'.-Igrobacterium tumefacic~ns, ou encore d'origine végétale. comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Selon la présente invention. le gène chimère peut également comprendre un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, comme la pénicilline. ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus. au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide. un bactériophage ou un virus. transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à
transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes. il s'agira notamment 3~ d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'im~ention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hüt~s. rn particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nu cléiqm ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut ëtre ubtenuc par tout moyen connu approprié. amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. L ne autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation. ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte. en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
1 ~ La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour la thanatine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées. en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La ?0 régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes. on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,459,355, LAS ~1.~36.~7~. US 5.464.763. US 6.177.010. US 5.187,073, EP 267,159, EP 604 662. EP
'_~ 67? 75?. L'S 4.945.050. US 5.036.006. US 5.100.792, US 5,371,014. LS
5,478,744, US
5.179.02?. US 5,565.346. US 5.484,956, US 5,508.468, US 5,538,877, US
5,554,798, US
5.489.520. US 5,510.318, US 5,204.253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, ?34. EP 539 563, EP 674 725. WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la 30 culture etiou du croisement des plantes régénérées ei-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à
certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN
codant pour la thanatine peut ëtre intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes 3 5 résistantes aux dites maladies, Ia thanatine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Cercospora, en particulier Cercospora beticola.
Cladosporürm en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium eulmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora c~inncrmomi.
WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 Le ~;cne chimère pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection. tel qu'un ou plusieurs ~~ènes de tolérance aux herbicides.
La séquence d'r~DV codant pour la thanatine peut é~~alement ëtre intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérét. comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 11~ 673. WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la thanatine, d'autres séquences hétérologues codant pour d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
Les autres séquences peuvent ëtre intégrées au moyen du même vecteur I s comprenant un cène chimère. lequel comprend une première séquence codant pour la thanatine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence. selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore ëtre obtenues par croisement de parents. l'un portant le gène selon l'invention codant pour la thanatine.
l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques. on peut citer celle codant pour la drosomvcine, décrite dans la demande de brevet FR 2 7?~ 99? et par ?~ Fehlbaum & colt. (1994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 0911 déposée le 34 juillet 1997, ou celle codant pour l'androctonine décrite dans la demande de brevet FR 2 745 004 et dans la demande de brevet non publiée FR 97 10362 déposée le 20 août 1997.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour la thanatine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformées. Les figures 1 à ~ en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiqcres.
3 ~ Exemple 1: Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans .~usubel & colt.
WO 99/24594 ~ PCT/FR98/02375 pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac.
Les deux uli~;onucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo ? ci-après. sont hybridés à 6s 'C pendant ~ minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
Oligol: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC
ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' Oligo~: S' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA
GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3' Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2. l'ADN resté simple brin sert de 1 ~ matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et Nael et cloné dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction.
On ?0 obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR-la du tabac (SEQ ID NO 3).
pRPA-PS-PRIa-than: Création d'une séquence codant pour la thanatine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'.
Les deux o(igonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oliao 3 et Oligo .~ selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P.
Oligo3: 5' GGTTCCAAGA AGCCAGTGCC AATCATCTAC TGCAACAGGA
CG 3' Oligo ~: 5 ' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCACATCC
TCTGGCACTT ACCAGTCCTC CTGTTGCAGT AGATGATTGG
CACTGGC 3' 3~ Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Oligo 4, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de la thanatine (SEQ ID NO 1 ) est ensuite cloné
directement WO 99124594 ~~ PCT/F'R98/02375 dans le plasmide pRPA-~1D-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction :Vcrel.
L'orientation correcte du clone ohtenu est vérifiée par séquenFage. On obtient alors un clunc comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine située entre les sites de restriction :Vtol â l'extrémité N-terminale et Scal Surll ot BcrnrHl à l'extrémité
C-terminale (SEQ ID NO ~).
pRPA-RD-229: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine.
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Jim Carrington (Texas A&M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 3~S
dupliqué
isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x3~S: Odell &
coll., 198 ) qui dirige l'expression d'un AR:~1 contenant séquence non traduite en ~' du virus etch du tabac (TEV ~' UTR; Carrington & Freed. 1990). le gène de la (3-glucuronidase de E.
1 ~ coli (GUS Jefferson & coll.. i 987) suivi du site de polyadenylation de l'ARN 3~S de CaM V (CaMV polyA; Odell & coll.. 1980.
Le plasmide pRTL-? GUS est digéré avec les enzymes de restriction ~-'cvl et BamHl et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PR 1 a-than est digéré avec les enzymes de restriction :Vtol et BamHl et le petit fragment d'ADN
contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR-la-thanatine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure ?. « PR-la-thanatine »
représente la région codante pour la protéine de fusion PR-la-thanatine de pRPA-RD-'?30.
La thanatine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide sisnal PR-la.
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-19~ est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo ~
et Oligo 6 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-'KID-P.
3~ Oligo~: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
CATGC 3' WO 99/24594 1 ~~ PCT/FR98/02375 ()ligu li: 5 ' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTT.~1A TT.~AAAGC T ~_' GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' 1_'oligonucléotide double brin ubtenu est ensuite lié dans pL'C-19 qui a été
s préalablement digéré aveu les enzymes de restriction EcoRI et Hir:dlll et rendu bouts francs en employant le fragment ktenow de l'ADN polymérise 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'.4grobacterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage muitiple est représentée sur la figure 3.
l~
pRPA-RD-232: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-thanatine de pRPA-RD-229 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction HindlIL Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-thanatine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorvlé avec la phosphatase intestinale de veau.
pRPA-RD-17-t: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRl de pRPA-BL-1~OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérise kienovsv dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoymil à proximité de sa bordure droite, un cène ?s de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure. "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefacivns (Bevan & colt.. 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tcrrnefacie»s (Bevan & colt., 1983).
"NPT II"
représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E.
coli (Rothstein & colt., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & colt., 1980, "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. o=aenae (Stalker & colt.. 1988). "RB" et "LB" représentent respectivement les 3~ bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-17~1.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, WO 99/24594 l 1 PCT/FR98/02375 sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRf:~-V1D-P.
Oli~:o 7: 5' CCGGCCAGTC AGGCCa'AC"_' TAATTAAGT'~' T~'..nCGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGG~' sTG i GCTCGAGGGC CC.'~i-~CCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3' Oligo8: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA
CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3' L'oligonucléotide double brin hybridé (9s paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme dé restriction .~Cmal. et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés.
1 ~ On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de séiection.
La structure schématique du plasmide pRP:~-RD-184 est représentée sur la figure 3 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro". "3~S pro", "BRX gene", "RB" et "LB"
ont la même signification que pour la figure 4.
pRPA-RD-235: Création d'un vecteur d'.Agrobacterium tumefacirrrs contenant la construction du gène codant pour la thanatine dirigée vers la matrice extracellulaire.
La plasmide pRPA-RD-232 est digéré avec les enzymes de restriction Pmel et Asc~l
2~ et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-thanatine est purifié. Le plasmide pRPA-RD-184 est digéré avec les mëme enzymes de restriction. Le tiagment d'ADN
contenant la cassette d'expression de PR-la-thanatine est ensuite liée dans pRPA-RD-184.
On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterizrrn tunrefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine qui conduit à l'expression de la thanatine dans la matrice extracellulaire de la plante.
xem le 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2-1- Transformation Le vecteurs pRPA-RD-235 est introduit dans la souche c~:4grobacterium tumefaciens EHA101 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK29l (Komari &
coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll.
( 1985).
2-2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants WO 99/24594 1, PCT/FR98/02375 foliaires est réalisée sur un miliru de base Murashi~~e et Skoog (MS) comprenant 30 ~ 1 de saccharose ainsi que ?00 u:.,: ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur ~i~s plantes cultivées en serre uu irr ~~iwc~ et régénérées selon la technique des disques tiUiaires ( Hursh & roll.. 198 > ~n trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0.05 m~Jl d'acide naphtylacétique (ANA) et ? mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 1~
jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 1 ~ jours, tes pousses enracinées sont passées en terre.
2-3- Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-?3~. Ces plantes ont été traitées en serre au stade ~
feuilles avec 1 ~ une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de la thanatine 30 par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques.
REFERENCES
.~usubel. F. :~. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley 8; Sons.
Bevan, M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-38~.
Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-197.
Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-?9~4a.
Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.
30 Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & colt. {1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & colt. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell. J.T. & coll. (1980. Nature 313:810-812.
LISTE DE SEQUENCES
(:.) INFORMATIONS GENERALES:
(i ü) NOMBRE DE SEQUENCES: 13 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (H) TYPE: nuciéotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..33 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 63 paires de bases !B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..63 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GGT TCC AAG AAG CCA GTG CCA ATC ATC TAC TGC AAC AGG AGG ACT GGT .~g Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 98 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linêaire !i~; TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..63 Ixi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly AAG TGC CAG AGG ATG TGAGCTCGGC GAGGCGAACG TGTCGACGGA TCCGG 9g Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 106 paires de bases (H) TYPE: nucléotide (C) NOMHRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..101 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 197 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
contenant la cassette d'expression de PR-la-thanatine est ensuite liée dans pRPA-RD-184.
On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterizrrn tunrefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-thanatine qui conduit à l'expression de la thanatine dans la matrice extracellulaire de la plante.
xem le 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2-1- Transformation Le vecteurs pRPA-RD-235 est introduit dans la souche c~:4grobacterium tumefaciens EHA101 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK29l (Komari &
coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll.
( 1985).
2-2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants WO 99/24594 1, PCT/FR98/02375 foliaires est réalisée sur un miliru de base Murashi~~e et Skoog (MS) comprenant 30 ~ 1 de saccharose ainsi que ?00 u:.,: ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur ~i~s plantes cultivées en serre uu irr ~~iwc~ et régénérées selon la technique des disques tiUiaires ( Hursh & roll.. 198 > ~n trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0.05 m~Jl d'acide naphtylacétique (ANA) et ? mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 1~
jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 1 ~ jours, tes pousses enracinées sont passées en terre.
2-3- Tolérance au bromoxvnil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-?3~. Ces plantes ont été traitées en serre au stade ~
feuilles avec 1 ~ une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de la thanatine 30 par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques.
REFERENCES
.~usubel. F. :~. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley 8; Sons.
Bevan, M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-38~.
Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-197.
Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-?9~4a.
Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.
30 Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & colt. {1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Rothstein & colt. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell. J.T. & coll. (1980. Nature 313:810-812.
LISTE DE SEQUENCES
(:.) INFORMATIONS GENERALES:
(i ü) NOMBRE DE SEQUENCES: 13 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (H) TYPE: nuciéotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..33 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 63 paires de bases !B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..63 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GGT TCC AAG AAG CCA GTG CCA ATC ATC TAC TGC AAC AGG AGG ACT GGT .~g Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 98 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linêaire !i~; TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..63 Ixi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly AAG TGC CAG AGG ATG TGAGCTCGGC GAGGCGAACG TGTCGACGGA TCCGG 9g Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 106 paires de bases (H) TYPE: nucléotide (C) NOMHRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:12..101 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 197 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
3 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMErTT:12..164 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 75 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 6:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 2"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: ?:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMErTT:12..164 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 75 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 6:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 2"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: ?:
4 PCT/FR98/02375 aAAGATGGAA GC 72 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: B:
(i) CARACTERISTIQUES DE LR SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléeotide synthétique 3~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 97 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 4"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 5"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 10:
(~) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 110:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucl,ique (A) DESCRIPTION: /desc ~ "oligonucléotide synthétique 6"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 7"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQ~ENCE: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc ~ "oligonucléotide synthétique 8"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LR SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléeotide synthétique 3~~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 97 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 4"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = ~~oligonucléotide synthétique 5"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 10:
(~) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 110:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucl,ique (A) DESCRIPTION: /desc ~ "oligonucléotide synthétique 6"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 7"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQ~ENCE: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc ~ "oligonucléotide synthétique 8"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Claims (30)
1. Fragment d'acide nucléique. caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant pour la thanatine.
2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence nucléotidique de type ADN.
3. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique de type ADN comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
4. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique de type ADN comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n° 2 (SEQ ID NO 2), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique fusionnée en 5' et/ou en 3' à la séquence codant pour la thanatine. de manière à obtenir une protéine de fusion « protéine-thanatine ».
en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique fusionnée en 5' et/ou en 3' à la séquence codant pour la thanatine. de manière à obtenir une protéine de fusion « protéine-thanatine ».
6. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la protéine est un peptide signal ou un peptide de transit.
7. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le peptide signal est le peptide signal du gène PR-la du tabac.
8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 7. caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n°
5 (SEQ ID NO
5), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
5 (SEQ ID NO
5), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence.
9. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la partie codante de la SEQ ID NO 5, correspondant aux bases 12 à
164.
164.
10. Protéine de fusion « protéine-thanatine », caractérisée en ce que la protéine est un peptide signal ou un peptide de transit.
11. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que le peptide signal est le peptide signal du géne PR-la du tabac.
12. Protéine de fusion selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est décrite par l'identificateur de séquence n° 5 (SEQ ID NO 5).
13. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte. en particulier les plantes, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins un fragment d'ADN codant pour la thanatine tel que défini dans les revendications 1 à 9.
14. Gène chimère selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les cellules végétales et les plantes.
15. Gène chimère selon l'une des revendications 13 ou 14. caractérisé en ce qu'il comprend également un marqueur de sélection.
16. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte craractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication et au moins un gène chimére tel que défini dans les revendications 13 à 15.
17. Vecteur selon la revendication 16. caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression.
18. Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
19. Organismes hôtes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent une quantité efficace d'un gène chimère selon les revendications 13 à 15.
20. Organisme hôte transformé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit de cellules végétales ou de plantes.
21. Organisme hôte transformé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une plante contenant des cellules transformées.
22. Organisme hôte selon la revendication 21. caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir des cellules transformées.
23. Cellule végétale transformée. caractérisée en ce qu'elle contient un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon les revendications 13 à 15.
24. Plante transformée résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellule végétale transformée selon la revendication 23.
25. Plante transformée selon la revendication ?4, caractérisée en ce qu'elle est résistante aux maladies causées par Cercospora. en particulier Cercospora beticola.
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinnamomi.
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinnamomi.
26. Plante transformée résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes selon l'une des revendications 24 ou 25.
27. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 24 à 26.
28. Procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales ou des plantes, caractérisé en ce que l'on insère dans ledit organisme hôte au moins un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon l'une des revendication 13 à 15.
29. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies fongiques ou bactériennes, caractérisé en ce que l'on insère dans la plante au moins un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon les revendications 13 à 15.
30. Procédé selon l'une des revendications 28 ou 29, caractérisé en ce que le gène chimère est inséré au moyen d'un vecteur selon l'une des revendications 16 à 18.
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