CA2309327A1 - Cell target of therapeutic agents against candida albicans - Google Patents

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CA2309327A1
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ura3
albicans
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Marc Parrot
Luc Giasson
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Universite Laval
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Description

1. Titre de l'invention Identification d'une cible cellulaire pour le développement d'agents thérapeutiques contre le pathogène fongique Candida albicans. 1. Title of the invention Identification of a cellular target for the development of agents therapeutic against fungal pathogen Candida albicans.

2. Domaines d'a~nIication de l'invention Biomédical. 2. Fields of a ~ nIication of the invention Biomedical.

3. Applications commerciales de l'invenüon Développement d'agents thérapeutiques antifongiques dirigés contre le pathogène humain Candida albicans. 3. Commercial applications of the invention Development of antifungal therapeutic agents directed against human pathogen Candida albicans.

4. Résumé de l'invention Nous avons identifié, cloné et séquencé le gène codant pour la sous-unité
régulatrice d'une protéine kinase AMP cyclique dépendante (CAMP-dependent prôtein kinase: PKA) chez le pathogène humain Candida albicans. Les résultats d'expériences visant à
déléter ce gène ont démontré que sa présence était essentielle à la croissance du pathogène. Cette caractéristique en fait une cible cellulaire pour le développement d'agents thérapeutiques asti-Candida. De telles cibles sont extrêmement rares.
Description de l'invention ~.1. Le pathogène L'incidence des infections fongiques a augmenté de façon dramatique au cours des deux dernières décennies. L'augmentation a été telle que les mycoses systémiques représentent maintenant une importante cause de morbidité et de mortalité. Parmi toutes les mycoses, les candidiases, causées par Candida albicans sont de loin les plus importantes (Groll et al., 1998;
Pfaller 199?).
C. albicans est un mycète opportuniste normalement présent dans les muqueuses buccale, intestinale et vaginale. Celui-ci devient cependant pathogène lorsqu'un déséquilibre survient dans le système de défense de l'hôte ou que la flore microbienne indigêne est perturbée (traitements aux antibiotiques). Ainsi, les candidiases accompagnent souvent l'immunosuppression (e.g. lors de greffes, de thérapies cytotoxiques, de radiothérapie ou d'usage de corticostéroïdes), l'immunoincompétence et l'immunodéficience. Chez les patients sévèrement immunocompromis, C. albicans peut causer des infections systémiques graves menant fréquemment au décès (Groll et al., 1996; Walsh et al., 1996; Minamoto & Rosenberg, 1997).
Étant donné l'intérêt des compagnies pharmaceutiques et biotechnologiques pour de telles cibles, il est certain que si nos résultats ne sont pas protégés, ils seront récupérés par ces dernières. Toutes les retombées potentielles, en terme de recherche et de développement, seraient alors perdues. 4. Summary of the invention We have identified, cloned and sequenced the gene encoding the subunit regulator of a cyclic AMP protein kinase (CAMP-dependent protein kinase: PKA) at the human pathogen Candida albicans. The results of experiments aimed at delete this gene have demonstrated that its presence was essential for the growth of the pathogen. This characteristic in makes a cellular target for the development of therapeutic agents Candida. Such targets are extremely rare.
Description of the invention ~ .1. The pathogen The incidence of fungal infections has increased dramatically during both past decades. The increase was such that systemic yeast infections represent now an important cause of morbidity and mortality. Among all yeast infections candidiasis caused by Candida albicans are by far the most important (Groll et al., 1998;
Pfaller 199?).
C. albicans is an opportunistic fungus normally found in the mucous membranes buccal, intestinal and vaginal. However, it becomes pathogenic when imbalance occurs in the host defense system or that the native microbial flora is disturbed (antibiotic treatments). Thus, candidiasis often accompany immunosuppression (eg during transplants, cytotoxic therapies, radiotherapy or use corticosteroids), immuno-competence and immunodeficiency. At the patients severely immunocompromised, C. albicans can cause systemic infections serious frequently leading to death (Groll et al., 1996; Walsh et al., 1996; Minamoto & Rosenberg, 1997).
Given the interest of pharmaceutical and biotechnology companies for such targets, it is certain that if our results are not protected, they will be recovered by these past. All the potential benefits, in terms of research and development, would then be lost.

5.2. Le contexte de recherche Le nombre limité de médicaments antifongiques efficaces et sans effet secondaire important, de même que l'augmentation de la prévalence des infections fongiques mettent en évidence l'urgence de développer de nouveaux agents antifongiques (Sternberg 1994).
Au cours des dernières années, une approche basée sur l'identification et la dissection de réactions enzymatiques et de sentiers métaboliques essentiels au fonctionnement de la cellule, a été exploitée pour l'identification de cibles avec lesquelles il serait possible d'interférer. En sélectionnant de telles cibles, il est ensuite possible d'identifier des substances antagonistes de leur fonction pouvant par la suite être utilisées pour la production d'agents thérapeutiques.

5.3. L'approche de recherche Comme plusieurs autres mycètes d'importance médicale, C. albicans peut de manière réversible alterner entre une croissance levuriforme (cellules ovoïdes) et une croissance mycélienne (cellules hyphoïdes), ce qu'est le dimorphisme. Comme chez C albicans la forme mycélienne est impliquée dans la virulence, et comme le dimorphisme est particulier aux champignons, celui-ci représente une source potentielle de cibles pour le développement de substances antifongiques. En utilisant une approche moléculaire, nous avons entrepris de démontrer l'implication d'une enzyme, appelée cAMP-dependent protein kinase (PKA), dans le contrôle de la transition levure-mycélium. Plusieurs données suggéraient que cette enzyme pouvait être impliquée dans le contrôle du dimorphisme.
La PKA est une protéine tétramérique composée de deux sous-unités catalytiques (PKA-C) et de deux sous-unités régulatrices (PKA-R). Sous sa forme tétramérique, la PKA est inactive.
Cependant, en présence d'adénosine monophosphate cyclique (AMP cyclique), les sous-unités régulatrices se dissocient des sous-unités catalytiques qui deviennent alors actives (Figure 5.1).
5.1. Représentation schématique de la cAMP-dependenr prorein kinase (PK.A). A.
Forme tétramérique inactive de la PKA. Le rôle des sous-unités régulatrices PKA-R est de s'associer aux sous-unitës catalyriques PKA-C aün de les maintenir inactives. B. La présence d'AMPc sur les sous-unités régulatrices entraîne la libération de PKA-C monomériques actives.
Afin de déterminer l'implication de PKA-C et PKA-R dans le contrôle de la transition levure-mycélium, nous avons cloné les gènes les encodant. Pour ce faire nous avons fait une analyse des séquences de gènes homologues chez d'autres organismes fongiques afin d'identifier des régions conservées. Ä partir de deux courtes régions relativement bien conservées, nous avons synthétisé des amorces dégénérées afin d'amplifier une portion des gènes par la techniqué de Polymerase chain reaction (PCR). La portion amplifiée de chacun des deux gènes a ensuite été
utilisée comme sonde afin d'isoler des clones à partir d'une banque génomique fosmidique de C.
albicans.l Par la suite, des sous-clones ont été utilisés afin de déterminer la séquence des gènes Pka-r et Pka-c encodant les sous-unités régulatrices et catalytiques respectivement.
Selon notre hypothèse de travail, l'activation de la PKA (en présence d'AMP
cyclique) permet de déclencher la transition levure-mycélium. Afin de vérifier l'implication des gènes codant pour les sous-unités catalytiques et régulatrices dans le contrôle du dimorphisme, nous avons entrepris de déléter chacun de ceux-ci chez C. albicans. Ainsi, la délétion du gène Pka-c (aucune PKA-C active dans la cellule) devait empêcher la souche d'opérer la transition levure-mycélium en présence d'AMP cyclique, alors que la délétion du gène Pka-r (PKA-C toujours active dans la cellule, puisque la PKA-R n'est pas présente pour l'inactiver) devait permettre une croissance mycélienne constitutive, c'est-à-dire même en absence d'AMP
cyclique.
' Une banque fosmidique est construite dans un vecteur contenant l'origine de réplication du plasmide F' de E. coli.
Ce vecteur, présent en une seule copie par cellule, diminue les possibilités de réarra~ement à l'intérieur des clones.

Page S
Les mutants pka-c obtenus ne pouvaient effectivement opérer la transition levure-mycélium en présence d'AMP cyclique. Ces résultats supportaient donc notre hypothèse selon laquelle la PKA est impliquée dans le contrôle de la transition levure-mycélium. Afin de confirmer notre hypothèse, nous avons alors entrepris de générer des mutants pour le gène Pka-r.

5.4. La muta~énèse de Pka-r Afin de faciliter la compréhension des résultats obtenus lors des expériences de mutagénèse de Pka-r, des explications sont données sur le fonctionnement de la méthode utilisée.
C. albicans est un organisme diploide, c'est-à-dire qu'il possède deux copies de chacun des chromosomes (donc deux allèles pour chacun des gènes). Pour générer un mutant, il faut donc inactiver les deux allèles du gène à l'étude. Ainsi, pour réaliser les expériences de mutagénèse (pour les gènes Pka-c et Pka-r), nous avons utilisé la URA blaster technique permettant de déléter les deux allèles d'un gène chez C. albicans. Cette méthode, mise au point il y a quelques années, permet de déléter séquentiellement les deux allèles avec une efficacité variant entre 20 et 100%.2 Ainsi, l'analyse d'une dizaine de transformants permet généralement d'identifier les mutants recherchés.
Une construction (appelée-pMPl) fut d'abord générée, dans laquelle une cassette - contenant le gène Ura3 situé entre deux séquences répétées caf - fut flanquée de séquences situées de part et d'autre du gène Pka-r (Figure ~.2). Dans cette construction, le gêne Ura3 (impliqué dans la synthèse de l'uracil) est utilisé comme marqueur pour la sélection des transformants (utilisation d'une souche parentale auxotrophe pour l'uracil; ura3-), alors que les séquences caf (séquences partielles du gène codant pour la chloramphenicol acetyl rransferase) permettent une recombinaison infra-chromosomique afin d'éliminer le gène Ura3 (l'utilité de ceci est expliquée plus loin).
\\ \\ // /~%~~~//% chromosome . ~ ~ ' construction séquence en amont du gène cassette séquence en aval du gène) p(~~ p~
5.2. Construction de pMPl pour la muta~énèse du âène Pka-r. Les séquences situées en amont et en aval du gène Pka-r ont été introduites de pan et d'autre de la cassette caf-Ura3-car.
La construction pMPl fut utilisée pour transformer la souche CAI4 (ura3-) de C. albicans.3 La sélection des transformants fut faite sur milieu minimal afin de permettre uniquement la croissance de ceux ayant intégré la cassette caf-Ura3-caf à leur génome. Neuf des transformants obtenus ont été testés par analyse de type Southern, afin de vérifier le remplacement d'un premier allèle du gène Pka-r par la cassette (Figure 5.3).
Deux des transformants vérifiés se sont avérés être les mutants hémizygotes recherchés, c'est-à-dire ne possédant plus qu'un seul allèle du gène Pka-r (génotype Pka-r lepka-r:: caf-Ura3-caf).
Ces mutants hémizygotes avaient un phénotype mycélien constitutif. Ces résultats confirmaient à nouveau l'implication de la PKA dans le contrôle du dimorphisme (tout comme l'avait fait la mutagénèse du gène Pka-c; section 5.4).
Afin de pouvoir déléter le deuxième allèle du gène Pka-r, il a d'abord fallu rétablir l'auxotrophie à l'uracile chez un des mutants hémizygotes. Pour ce faire, le mutant hémizygote fut placé sur milieu complet permettant ainsi la perte du gène Ura3 par une recombinaison entre les séquences caf situées de part et d'autre de celui-ci (menant à l'excision du gène Ura3). Les 1 Selon la littérature et notre expérience personnelle.
3 CAI4 est une souche standard utilisée dans plusieurs laboratoires à travers le monde.

révertants ura3- furent ensuite sélectionnés sur milieu contenant du 5-FOA, une substance toxique pour les cellules possédant encore un gène Ura3 fonctionnel. Vingt-trois révertants ura3-furent vérifiés par analyse de type Southern afin de confirmer la perte du gène Ura3 (Figure 5.4).

\ \~~~~ chromosome I' %/// /%/ chromosome 1 cortstrucfiorc plasmidique W\\ sW\\ ~ chromosome2 ~
WW ° ~ ~ : - agi/ chromasomey 5.3 Représentation schématique du mécanisme ayant mené à la mutagénèse du premier allèle du gène Pka-r. A. Alignement des séquences homologues situées de part et d'autre du gène Pka-r et de la cassette car-Ura3-car. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences homologues, remplacement du gène Pka-r par la cassette.
\\~\\\~\\ %%~// %///%/ chromosome) ~
\\\\ //~%/ chromosome Z
5.4. Représentation schématique des loci Pka-r à la suite de la recombinaison entre les séquences cat ayant mené à l'excision du gène Ura3.
Un de ces révertants (Pka-rldpka-r:: cat) fut sélectionné pour la mutagénèse du deuxième allèle Pka-r en utilisant à nouveau la construction plasmidique pMPl (Figure S.5).
Plusieurs séries de transformants furent analysées par Southern afin de détecter un mutant ayant subi' la délétion du deuxième allèle Pka-r. Au total, 113 transformants furent ainsi analysés parmi lesquels aucun ne s'avéra être un mutant pl,:a-r homozygote nul (apka-r:: cat-Ura3-catldpka-r:: cat).
corcstruction P~~ PM
\ ~//%~// ~/ chromosome l' chromosome 1 \~\~~\~\~ \\ Cg ~~ ~' . %%/~~~/~/~/~~/ hromosome hromosome Figure 5.5. Représentation schématique de la mutagénèse attendue lors d'expériencesvisant la délétion du deuxième allèle du gène Pka-r. A. Alisnement des séouences homolo_ues situées de art et d'autre du gène Pka-r. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences situées de part et d'autre du cène Pka-r, remplacement de celui-ci par la cassette car-Ura3-cat.

En fait, on observait dans la presque totalité des cas que le locus Pka-r déjà
délété était à
nouveau la cible de la double recombinaison (Figure 5.6).
\\\\\\\\ \~\\\\\\\\ // %%//% chrorr~SOrne l' ~\~\\\ \ / %%//// chromosome r construction pLasmidique %/ ctu-omosorr~ ~
\\\ \\\\\ ' 3FTA3:.: :- /%%~%%/%/ / / chromosome 5.6. Représentation schématique de la mutagénèse observée lors de tentatives pour déléter le deuxième allèle du gène Pka-r. A. Alignement des séquences homologues situées de part et d'autre de la séquence cat restante suite à la délétion du premier allèle. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences situées de part et d'autre de la séquence cat, remplacement de celle-ci la cassette cat-Ura3-car.
Ces résultats ne pouvaient s'expliquer par des problèmes techniques de mutagénèse. Étant donné le nombre élevé de transformants analysés, ces résultats suggéraient plutôt une impossibilité de déléter les deux allèles du gène Ph:a-r. Afin vérifier cette hypothèse, une nouvelle construction fut générée pour la mutagénèse. Dans cette construction, appelée pMP3, le gène Ura3 fut placé au centre de la séquence codant pour le gène Pka-r (sans les séquences situées en amont et en aval du gène; Figure 5.7).
corLStruction :.,.: P~ P~3 \ \\\\\\\\\ ~/G%%~/%%%% ~ ~o~noSOme l \\\\\\ //////%%%%~%%/ ~~~SO~ T
5.7. Représentation schématique de la mutagénèse attendue avec la construction plasmidique pMP3.
Ä noter l'absence d'homologie de séquence entre pMP3 et le locus de l'allèle déjà délété.
Comme les séquences présentes sur cette construction ne se retrouvent qu'au locus non encore délété, cette situation devait forcer l'intégration du gène Ura3 dans l'allèle Pka-r restant.
Cependant, aucun des 20 transformants vérifiés par analyse de type Southern n'eût le deuxième allèle Pka-r délété.
Ces résultats négatifs furent alors considérés en même temps que deux autres observations que nous avions faites lors de ces expériences de mutagénèse. Premièrement, le nombre de transformants obtenus lors des expériences visant la délétion du deuxième allèle Pka-r (avec pMPl et pMP3) était environ 30% inférieur à celui obtenu normalement lors d'expériences de mutagénèse semblables (visant d'autres gènes). Deuxièmement, une portion importante des transformants ne formait que de très petites colonies sur les pétris de transformation; diamètre de 0.5 mm comparativement au diamètre habituel de 2-3 mm.4 Lorsque ces petites colonies furent repiquées en milieu liquide ou réétalées sur milieu gélosé, aucune croissance ne fut observée. Prises ensemble, ces observations suggéraient qu'en perdant le deuxième allèle du gène Pka-r, les transformants ne pouvaient tout simplement pas croître (réduction du nombre de transformants obtenus), ou encore croître uniquement pour une période de temps limitée (présence de petites colonies non-viables).
Comme les difficultés à identifier des mutants pka-r homozygotes nuls ne semblaient pas être de nature technique, nous avons alors posé comme hypothèse que la présence dans la cellule de PKA-C toujours active (le rôle de PKA-R étant de s'associer à l'enzyme PKA-C
afin de la maintenir dans un état inactif) s'avérait létale pour C. albicans. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons entrepris de générer un mutant pka-r homozygote nul chez une souche ne possédant pas d'enzyme PKA-C (mutant pka-c homozygote nul). En théorie, chez un tel mutant, l'absence de PKA-R ne devrait pas nuire à la cellule puisque celle-ci ne renferme pas d'enzyme PKA-C.
Lors de la mutagénèse du premier allèle de Pka-r, cinq des seize transformants vérifiés par analyse de type Southern se sont avérés être du génotype attendu (Pka-rldpka-r:: cat-Ura3-cat dpka-c: : cat l dpka-c: : cat).5 Tout comme décrit précédemment, un de ces mutants fut utilisé
pour obtenir des révertants ura3-. Un des révertants obtenus (Pka-r l dpka-r:
: cat dpka-c: : cat l dpka-c:: cat) fut utilisé pour la mutagénèse du second.allèle Pka-r, après vérification du génotype par analyse de type Southern. Neuf des 31 transformants obtenus lors de ces expériences furent confirmés être des mutants pka-r homozygotes nuls (apka-r:
: cat- Ura3-cat l dpka-r: : cat dpka-c:: cat l apka-c:: cat) par analyse de type Southern. Ces résultats confirmaient que l'impossibilité d'obtenir des mutants pka-r homozygotes nuls à partir de la souche CAI4 n'était pas due à un problème technique mais plutôt à la létalité
de la condition (Tableau ~.1).
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Pka-c l dpka-c: : ~ 10 10 (100) cat- Ura3-cat dpka-c:: car-Ura3-cat:: cat 36 7 (20) ldpka-c Pka-r l dpka-r: : 9 2 (23) cat-Ura3-cat (avec pMPl) dpka-r: : car- Ura3-cat: : cat 113 0 (0) l dpka-r (avec pMPl J

pka-r: : ura3 / dpka-r: 20 0 (0) : cat (avec pMP3) 4 Ces petites colonies furent observées lors d'expérience de mutagénèse tant avec pMPl qu'avec pMP3.
Ces expériences de muta~énèse ont été réalisées avec la construction pMPl en utilisant une souche pka-c homozygote nul (epka-c:: cat l'pka-c:: cat) issue de nos expériences de mutagénèse sur le âène Pka-c.

Pka-r ldpka-r:: cat-Ura3-cat 16 5 l32) dpka-c: : cat l dpka-c: : cat ra~«
pMPI ) dpka-r: : cat-Ura3-cat l dpka-r:: cat 31 9 X29) dpka-c: : cat l dpka-c: : cat ~ aMPll Tableau 5.1. Sommaire des résultats d'expériences de mutagénèse visant l'obtention de mutants pka-c et pka-r homozygotes nuls chez C. albicans.
Des observations faites en microscopie optique ont révélé que les doubles mutants avaient une morphologie cellulaire atypique (forme cellulaire très irré=ulière). De plus, contrairement à la coloration blanche habituelle, les colonies de ces doubles mutants adoptaient une coloration jaune très distinctive.

RÉFÉRENCES
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365-400. 5.2. The research context The limited number of effective and ineffective antifungal drugs important secondary, from even as the increasing prevalence of fungal infections put evidence the urgency of developing new antifungal agents (Sternberg 1994).
In recent years, an approach based on the identification and dissection of enzymatic reactions and metabolic pathways essential to cell functioning, a been used to identify targets with which it would be possible to interfere. In selecting such targets, it is then possible to identify antagonistic substances of their function can then be used for the production of agents therapeutic.

5.3. The research approach Like many other fungi of medical importance, C. albicans can reversible way alternate between yeast-like growth (ovoid cells) and growth mycelial (hyphoid cells), what is dimorphism. As in C albicans the form mycelial is involved in virulence, and since dimorphism is peculiar to mushrooms, this represents a potential source of targets for the development of substances antifungals. Using a molecular approach, we set out to to prove the involvement of an enzyme, called cAMP-dependent protein kinase (PKA), in control of the yeast-mycelium transition. Several data suggested that this enzyme could be involved in the control of dimorphism.
PKA is a tetrameric protein composed of two catalytic subunits (PKA-C) and two regulatory subunits (PKA-R). In its tetrameric form, PKA is inactive.
However, in the presence of cyclic adenosine monophosphate (cyclic AMP), the subunits regulators dissociate from the catalytic subunits which then become active (Figure 5.1).
5.1. Schematic representation of cAMP-dependenr prorein kinase (PK.A). AT.
Tetrameric form PKA inactive. The role of the PKA-R regulatory subunits is to join the sub-units PKA-C catalyres to keep them inactive. B. The presence of cAMP on the subunits regulators results in the release of active monomeric PKA-C.
In order to determine the involvement of PKA-C and PKA-R in the control of yeast transition-mycelium, we cloned the genes encoding them. To do this we have do an analysis homologous gene sequences in other fungal organisms so to identify conserved regions. From two short regions relatively well preserved we have synthesized degenerate primers in order to amplify a portion of the genes by the technique of Polymerase chain reaction (PCR). The amplified portion of each of the two genes was then used as a probe to isolate clones from a genomic library fosmide of C.
albicans.l Subsequently, subclones were used to determine gene sequence Pka-r and Pka-c encoding the regulatory and catalytic subunits respectively.
According to our working hypothesis, the activation of PKA (in the presence of AMP
cyclic) allows trigger the yeast-mycelium transition. In order to verify the implication genes encoding for catalytic and regulatory subunits in the control of dimorphism we have undertook to delete each of these in C. albicans. So the deletion of the Pka-c gene (no active PKA-C in the cell) was to prevent the strain from working yeast transition-mycelium in the presence of cyclic AMP, whereas the deletion of the Pka-r gene (PKA-C always active in the cell, since PKA-R is not present to inactivate it) was to allow a constitutive mycelial growth, i.e. even in the absence of AMP
cyclic.
'' A phosphoric bank is constructed in a vector containing the origin of replication of plasmid F 'from E. coli.
This vector, present in a single copy per cell, reduces the possibilities of réarra ~ ement inside the clones.

Page S
The pka-c mutants obtained could not effectively effect the transition yeast-mycelium in presence of cyclic AMP. These results therefore supported our hypothesis according to which the PKA is involved in controlling the yeast-mycelium transition. In order to confirm our hypothesis, we then set out to generate mutants for the Pka- gene r.

5.4. The muta ~ enesis of Pka-r In order to facilitate understanding of the results obtained during the experiments mutagenesis of Pka-r, explanations are given on how the method works used.
C. albicans is a diploid organism, that is to say that it has two copies of each of chromosomes (therefore two alleles for each of the genes). To generate a mutant, must therefore inactivate the two alleles of the gene under study. So, to achieve the mutagenesis experiences (for the Pka-c and Pka-r genes), we used the technical blaster URA
allowing to delete the two alleles of a gene in C. albicans. This method, developed point there are some years, sequentially deletes the two alleles with a effectiveness varying between 20 and 100% .2 Thus, the analysis of a dozen transformants generally allows identify the mutants sought.
A construction (called-pMPl) was first generated, in which a cassette - containing the Ura3 gene located between two caf repeats - was flanked by sequences located on either side on the other side of the Pka-r gene (Figure ~ .2). In this construction, the Ura3 annoyance (involved in the uracil synthesis) is used as a marker for the selection of transformants (use an auxotrophic parent strain for uracil; ura3-), while the caf sequences (sequences partial of the gene coding for chloramphenicol acetyl rransferase) allow a subchromosomal recombination in order to eliminate the Ura3 gene (the usefulness of this is explained further).
\\ \\ // / ~% ~~~ //% chromosome . ~ ~ 'construction sequence upstream of the cassette gene sequence downstream of the gene) p (~~ p ~
5.2. Construction of pMPl for the muta ~ enesis of the donkey Pka-r. The sequences located upstream and downstream of the Pka-r gene were introduced from both sides of the caf- cassette Ura3-car.
The pMPl construct was used to transform the CAI4 (ura3-) strain of C. albicans. 3 La selection of transformants was made on minimal medium to allow only the growth of those who have integrated the caf-Ura3-caf cassette into their genome. New of transformants obtained were tested by Southern analysis, in order to check the replacement of a first allele of the Pka-r gene with the cassette (Figure 5.3).
Two of the transformants tested were found to be hemizygous mutants wanted, that is say having only one allele of the Pka-r gene (genotype Pka-r lepka-r :: caf-Ura3-caf).
These hemizygous mutants had a constitutive mycelial phenotype. These results confirmed again the involvement of PKA in the control of dimorphism (just as had done it mutagenesis of the Pka-c gene; section 5.4).
In order to be able to delete the second allele of the Pka-r gene, it was first necessary restore auxotrophy to uracil in one of the hemizygous mutants. To do this, the mutant hemizygote was placed on complete medium thus allowing the loss of the Ura3 gene by recombination between the cif sequences located on either side of it (leading to excision of the Ura3 gene). The 1 According to the literature and our personal experience.
3 CAI4 is a standard strain used in several laboratories across the world.

ura3- revertants were then selected on medium containing 5-FOA, a substance toxic to cells still having a functional Ura3 gene. Twenty-three revertants ura3-were verified by Southern analysis to confirm the loss of the Ura3 gene (Figure 5.4).

chromosome I ' % /// /% / chromosome 1 cortstrucfiorc plasmid W \\ sW \\ ~ chromosome2 ~
WW ° ~ ~: - agi / chromasomey 5.3 Schematic representation of the mechanism that led to the mutagenesis of first allele of the gene Pka-r. A. Alignment of the homologous sequences located on either side of the Pka-r gene and car-Ura3-car cassette. B. Following a double recombination involving the sequences homologs, replacement of the Pka-r gene by the cassette.
\\ ~ \\\ ~ \\ %% ~ //% ///% / chromosome) ~
\\\\ // ~% / Z chromosome 5.4. Schematic representation of Pka-r loci following recombination between cat sequences leading to the excision of the Ura3 gene.
One of these revertants (Pka-rldpka-r :: cat) was selected for mutagenesis of the second allele Pka-r again using the pMP1 plasmid construct (Figure S.5).
Several series of transformants were analyzed by Southern to detect a mutant having suffered 'deletion of second Pka-r allele. A total of 113 transformants were thus analyzed among which none did not turn out to be a mutant pl,: ar homozygous null (apka-r :: cat-Ura3-catldpka-r :: cat).
corcstruction P ~~ PM
//% ~ // ~ / chromosome l ' chromosome 1 \ ~ \ ~~ \ ~ \ ~ \\ Cg ~~ ~ '. %% / ~~~ / ~ / ~ / ~~ / hromosome hromosome Figure 5.5. Schematic representation of the mutagenesis expected during experiences with deletion second allele of the Pka-r gene. A. Alignment of the homologous sequences located of art and on the other side of the Pka-r gene. B. Following a double recombination involving the located sequences of on either side of the last supper Pka-r, replacement of this by the cassette cassette Ura3-cat.

In fact, it was observed in almost all cases that the Pka-r locus already deleted was at again the target of the double recombination (Figure 5.6).
\\\\\\\\ \ ~ \\\\\\\\ // %% //% chrorr ~ SOrne l ' ~ \ ~ \\\ \ / %% //// chromosome r construction plasmid % / ctu-omosorr ~ ~
\\\ \\\\\ '3FTA3:.:: - / %% ~ %% /% / / / chromosome 5.6. Schematic representation of the mutagenesis observed during attempts to delete the second allele of the Pka-r gene. A. Alignment of homologous sequences located on the side and other of the remaining cat sequence following deletion of the first allele. B. Following a double recombination involving the sequences located on either side of the cat sequence, replacement thereof the cat-Ura3-car cassette.
These results could not be explained by technical problems of mutagenesis. Being given the high number of transformants analyzed, these results suggested rather a unable to delete the two alleles of the Ph: ar gene. In order to verify this hypothesis, a new construction was generated for mutagenesis. In this construction, called pMP3, the Ura3 gene was placed in the center of the sequence encoding the Pka-r gene (without the sequences located upstream and downstream of the gene; Figure 5.7).
corLStruction :.,.: P ~ P ~ 3 \ \\\\\\\\\ ~ / G %% ~ / %%%% ~ ~ o ~ noSOme l \\\\\\ ////// %%%% ~ %% / ~~~ SO ~ T
5.7. Schematic representation of the expected mutagenesis with construction plasmid pMP3.
Ä note the absence of sequence homology between pMP3 and the allele locus already deleted.
As the sequences present on this construction are found only at locus not yet deleted, this situation was to force the integration of the Ura3 gene into the allele Pka-r remaining.
However, none of the 20 transformants verified by Southern analysis weren't the second deleted Pka-r allele.
These negative results were then considered together with two other observations that we had done during these mutagenesis experiments. First, the number of transformants obtained during experiments aiming at the deletion of the second allele Pka-r (with pMPl and pMP3) was approximately 30% lower than that normally obtained during experiences of similar mutagenesis (targeting other genes). Second, a serving important of transformants formed only very small colonies on the kneads of transformation; diameter 0.5 mm compared to the usual diameter of 2-3 mm. 4 When these small colonies were transplanted in liquid medium or spread on agar medium, none growth was not observed. Taken together, these observations suggested that by losing the second allele of Pka-r gene, transformants just couldn't grow (reduction in the number of transformants obtained), or even grow only for a period of time limited (presence of small non-viable colonies).
As the difficulties in identifying zero homozygous pka-r mutants does not didn't seem to be from technical in nature, we then assumed that the presence in the cell of PKA-C always active (the role of PKA-R being to associate with the enzyme PKA-C
in order to maintain inactive state) was fatal for C. albicans. In order to verify this hypothesis, we set out to generate a zero homozygous pka-r mutant in a strain not possessing no PKA-C enzyme (zero homozygous pka-c mutant). In theory, in such a mutant, the absence of PKA-R should not harm the cell since it does not contain PKA-C enzyme.
During mutagenesis of the first Pka-r allele, five of the sixteen transformants verified by Southern analysis turned out to be of the expected genotype (Pka-rldpka-r :: cat-Ura3-cat dpka-c:: cat l dpka-c:: cat) .5 As described above, one of these mutants was used to obtain ura3- revertants. One of the revertants obtained (Pka-r l dpka-r:
: cat dpka-c:: cat l dpka-c :: cat) was used for the mutagenesis of the second allele Pka-r, after verification of genotype by Southern type analysis. Nine of the 31 transformants obtained during of these experiments were confirmed to be zero homozygous pka-r mutants (apka-r:
: cat- Ura3-cat l dpka-r:: cat dpka-c :: cat l apka-c :: cat) by Southern analysis. These results confirmed that the inability to obtain zero homozygous pka-r mutants from the CAI4 strain was not due to a technical problem but rather to lethality of the condition (Table ~ .1).
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Pka-c l dpka-c:: ~ 10 10 (100) cat- Ura3-cat dpka-c :: car-Ura3-cat :: cat 36 7 (20) ldpka-c Pka-r l dpka-r:: 9 2 (23) cat-Ura3-cat (with pMPl) dpka-r:: car- Ura3-cat:: cat 113 0 (0) l dpka-r (with pMPl J

pka-r:: ura3 / dpka-r: 20 0 (0) : cat (with pMP3) 4 These small colonies were observed during mutagenesis experiments both with pMPl than with pMP3.
These muta ~ enesis experiments were carried out with the construction pMPl in using a pka-c strain homozygous null (epka-c :: cat l'pka-c :: cat) resulting from our mutagenesis experiments on the donkey Pka-c.

Pka-r ldpka-r :: cat-Ura3-cat 16 5 l32) dpka-c:: cat l dpka-c:: cat ra ~ "
pMPI) dpka-r:: cat-Ura3-cat l dpka-r :: cat 31 9 X29) dpka-c:: cat l dpka-c:: cat ~ aMPll Table 5.1. Summary of the results of mutagenesis experiments aimed at obtaining mutants pka-c and pka-r zero homozygotes in C. albicans.
Observations made under light microscopy revealed that the double mutants had a atypical cell morphology (very irritated cell form = ulcer). Moreover, unlike the usual white coloration, the colonies of these double mutants adopted a coloring very distinctive yellow.

REFERENCES
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6. Utilité principale de l'invention et ses avantages 6.1 Positionnement de la découverte Traditionnellement, la découverte de nouveaux médicaments a été basée sur le criblage systématique de produits naturels et synthétiques dans des tests biologiques et pharmacologiques. Cependant, cette approche n'a pas permis de générer le nombre de composés antifongiques requis; l'arsenal étant encore extrêmement limité, particulièrement en ce qui regarde le traitement des infections fongiques systémiques (Tableau 6.1).
CLASSE ET COMPOS ~MOLCULE CIBLE / MODE D'ACTION
~

Polyne Interaction avec l'ergostrol de la membrane, formation de Amphotricine B canaux, permabilit aux cations entranant la mort cellulaire Analogue de nuclosides Damination intracellulaire en 5-fluorouracil, interfrence 5-Fluorocytosine avec la synthse et les rles biologiques de l'ADN et de l'ARN

Drivs azotes Interaction avec le cytochrome P-450, inhibition de la Ktoconazole dmthylation du lanostrol entranant un puisement de Fluconazole l'ergostrol et l'accumulation de strols toxiques dans la Itraconazole membrane cellulaire Allylamines Inhibition de la squalne poxidase, pisement de Terbinafme l'ergostrol et accumulation de strols toxiques dans la membrane cellulaire Inhibiteur de mitose Inhibition de la mitose en mtaphase par interaction avec Grisofulvine les microtubules Tableau 6.1. Adents antifongiques systémiques en usage clinique.
L'Amphotéricine B et le fluconazole sont de loin les ântifongiques les plus couramment utilisés et ce, en dépit du fait que fAmphotéricine B entraîne des effets secondaires importants (fièvre, nausée, et cytotoxicité rénale), et que le fluconazole, mis sur le marché il y a une douzaine d'années seulement, soit déjà confronté à des problèmes importants de résistance (Edwards, 199I; White, 1997).
Afin de combler ce manque flagrant de médicaments antifongiques efficaces et sans effet secondaire, une nouvelle approche basée sur l'identification et la dissection de réactions enzymatiques essentielles au fonctionnement de la cellule s'est développée au cours des dernières années. Plusieurs laboratoires se sont lancés dans cette quête de cibles cellulaires essentielles à la survie des pathogènes fongiques (Kurtz 1998; Mitchell 1998).
Malgré ces efforts, encore peu de cibles ont été identifiées. Parmi celles-ci, seulement quelques unes sont actuellement utilisées pour le développement de composés antifongiques (Groll et al., 1998;
Tableau 6.2).

CLASSE ET MOLCULE CIBLE / MODE D'ACTION
MPOS _ ~
CO
~

_ Interaction avec le cytochrome P-450, _ inhibition de la Triazoles ~

UK 109496 dmthylation du lanostrol entranant un puisement de l'ergostrol et l'accumulation de strols toxiques dans la membrane cellulaire Echinocandines Inhibition de la ~i-(1,3)glucane synthtase entranant un LY 303366 puisement en glucanes et donc une fragilit osmotique Pradimicines Formation de complexes avec les mannoprotines de la BMS 181184 paroi cellulaire, entranant des perturbations au niveau de la Benanomvcin A membrane et la mort cellulaire Polynes Interaction avec l'ergostrol de la membrane, formation de Nystatin liposomique canaux, permabilit aux cations entranant la mort cellulaire Nikkomycines ( Inhibition de la synthse de la chitine entranant un arrt de Nikkom cin Z croissance et une fra ilit osmoti ue Sordarines Interaction avec le facteur d'longation 2 impliqu dans la GM 237354 s nthse des rotines Tableau 6 ~. Agents antifongiques systémiques en développement.
La difficulté dans l'identification de cibles tient au fait que les cellules fongiques, tout comme les cellules humaines, sont eucaryotes, limitant ainsi considérablement le nombre de cibles cellulaires sur lesquelles il est possible d'agir sans interférer avec le fonctionnement normal des cellules humaines.
6.2 Avantages de PKA-R comme cible Un premier avantage d'utiliser la PKA-R comme cible est que sa fonction cellulaire, de même que son mode d'action sont déjà connus (par analogie avec ce qui ~a été
observé chez d'autres orga.nismes). Ce mode d'action rend d'ailleurs la PKA-R particulièrement attrayante pour le développement de composés antifongiques. En effet, comme la PKA-R exerce son action en interagissant physiquement avec la PKA-C, une stratégie simple peut être envisagée pour bloquer l'interaction entre ces deux protéines. Ainsi, en empêchant l'interaction PKA-C l PKA-R, on créerait une condition simulant l'absence de PKA-R ce qui s'avérerait létal pour les -cellules de C. albicans. Ainsi, pour empêcher l'association de PKA-R à PKA-C, on pourrait développer des molécules qui, en se liant à la PKA-R, préviendraient son interaction avec PKA-C (Figure 6.1).6 6 Deux autres straté;ies sont é~_alement possibles: (1) empêcher la PKA-C de s'associer à la PKA-R par l'intermédiaire de molécules qui, en se liant à celle-ci (sans interférer avec l'activité
kinase de la PKA-C), bloqueraient l'interaction avec la PKA-R; et (2) bloquer ou diminuer la production de PK.A-R sous un seuil létal par l'intermédiaire de molécules qui interféreraient avec les protéines impliquées dans le contrôle de l'expression du gène Pka-r. Cette dernière approche requerrait cependant des recherches supplémentaires sur la régulation de (expression du gène Pkct-r.

A B

sous-unités aalalytiques PKA-C actives (PKA-C) molécules empéchpl~
sous-unités régulatrices ~ Iyn~~~n avec P~.'~.G
IPKA-I~
FORME INACTIVE
Figure 6.1. Stratégie pour empêcher l'inactivation de la PKA-C. A. La PKA est inactive sous sa forme tétramérique. B. Molécules qui, en se Liant à la PKA-R, empêchent son interaction avec PKA-C

CA 02309327 2000-06-06 Pagel8 La recherche de telles molécules pourrait se faire en utilisant la chimie combinatoire (voir travail proposé à la section 8.0). Les molécules ayant une affinité pour PKA-R
pourraient facilement être évaluées pour leur capacité à interférer avec l'interaction PKA-C / PKA-R par un test simple et rapide mesurant in vitro l'activité de la PKA-C. Ce test rend encore plus attrayant l'utilisation de la PKA-R comme cible cellulaire. En effet, celui-ci permettra de déterminer rapidement si les molécules ayant une affinité pour PKA-R ont un potentiel comme agent thérapeutique.
Nous avons aussi déterminé et comparé la séquence de la protéine PKA-R de C.
albicans avec celle de chacune des quatre sous-unités régulatrices existant chez l'humain soit PKA-R Ia, PKA-R Ip, PKA-R IIa et PILA-R III. Cette analyse a démontré qu'il existe peu d'homologie entre les PKA-R de ces deux organismes; l'homologie maximale étant de seulement 34.0 %
avec la protéine PKA-R I~3. De plus, la délétion d'un gène PKA-R chez la souris - la seule à
avoir été tentée chez les cellules de mammifères - ne s'est pas pas avérée létale. Ces données renforcent l'idée que le gène Pka-r puisse constituer une cible intéressante pour le développement de substances antifongiques.? En effet, comme la PKA-R de C.
albicans est différente de celles présentes chez l'humain, les chances sont faibles pour qu'une molécule mise au point pour contrer l'activité de la PKA-R de C. albicans ait le même effet sur les PKA-R
humaines. De même, comme chez la souris l'absence complète d'une sous-unité
PKA-R ne semble pas affecter la survie des cellules, il est possible que par analogie, les cellules humaines tolèrent l'inactivation de PILA-R humaines.
6.3 Intérêt pour cette découverte Plusieurs compagnies pharmaceutiques et biotechnologiques consentent actuellement des sommes importantes à la recherche de cibles cellulaires pour le développement de composés antifongiques. ~-RÉFÉRENCES
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Biochim. Pol. 42: 505-508. 6. Main utility of the invention and its advantages 6.1 Positioning of the discovery Traditionally, the discovery of new drugs has been based on the screening systematic of natural and synthetic products in biological tests and pharmacological. However, this approach did not generate the number of compounds antifungals required; the arsenal still being extremely limited, particularly with regard to look at the treatment of systemic fungal infections (Table 6.1).
CLASS AND COMPOS ~ TARGET MOLECULE / ACTION MODE
~

Polyne Interaction with ergostrol from the membrane, formation of Amphotricin B channels, permeability to entraining cations the death cellular Analogue of nucleosides Intracellular damination in 5-fluorouracil, interference 5-Fluorocytosine with synthesis and biological roles DNA and RNA

Nitrogen drivs Interaction with cytochrome P-450, inhibition of the Ktoconazole methylation of lanostrol causing a drawdown of Fluconazole ergostrol and accumulation of strols toxic in the Itraconazole cell membrane Allylamines Inhibition of squalne poxidase, laying of Terbinafme ergostrol and accumulation of toxic strols in the cellular membrane Mitosis inhibitor Inhibition of mtaphase mitosis by interaction with Grisofulvin microtubules Table 6.1. Systemic antifungal adents in clinical use.
Amphotericin B and fluconazole are by far the most common antifungal agents commonly used despite the fact that Amphotericin B has side effects important (fever, nausea, and renal cytotoxicity), and that fluconazole, placed on the market has a dozen only years, either already facing significant problems of resistance (Edwards, 199I; White, 1997).
In order to fill this glaring lack of effective antifungal drugs and Without effect secondary, a new approach based on identification and dissection reactions essential for the functioning of the cell developed course of last years. Several laboratories have embarked on this quest for cellular targets essential for the survival of fungal pathogens (Kurtz 1998; Mitchell 1998).
Despite these efforts, still few targets have been identified. Of these, only some are currently used for the development of antifungal compounds (Groll et al., 1998;
Table 6.2).

TARGET CLASS AND MOLCULE / ACTION MODE
MPOS _ ~
CO
~

_ Interaction with cytochrome P-450, _ inhibition of Triazoles ~

UK 109496 methylation of lanostrol causing draw from ergostrol and strol accumulation toxic in the cellular membrane Echinocandins Inhibition of ~ i- (1,3) glucan synthtase causing a LY 303366 glucan drawdown and therefore fragility osmotic Pradimicines Complex formation with mannoprotins of the BMS 181184 cell wall, causing disturbances at the level of Benanomvcin A membrane and cell death Polynes Interaction with the membrane ergostrol, formation of Liposomal nystatin channels, permeability to entraining cations the death cellular Nikkomycins (inhibition of chitin synthesis causing a judgment of Nikkom cin Z growth and a fra ilit osmoti ue Sordarines Interaction with the elongation factor 2 involved in the GM 237354 rattan s nthse Table 6 ~. Systemic antifungal agents in development.
The difficulty in identifying targets is due to the fact that cells fungal, just like human cells are eukaryotic, greatly limiting the number of targets cells on which it is possible to act without interfering with the normal operation of human cells.
6.2 Advantages of PKA-R as a target A first advantage of using PKA-R as a target is that its function cell, likewise that its mode of action are already known (by analogy with what ~ has been observed in others organisms). This mode of action also makes PKA-R particularly attractive to the development of antifungal compounds. Indeed, as PKA-R exercises its action in interacting physically with PKA-C, a simple strategy may be envisaged for block the interaction between these two proteins. So by preventing the interaction PKA-C l PKA-R, we would create a condition simulating the absence of PKA-R which would prove lethal for -cells of C. albicans. So, to prevent the association of PKA-R with PKA-C, we could develop molecules which, by binding to PKA-R, would prevent its interaction with PKA-C (Figure 6.1) .6 6 Two other strategies are also possible: (1) prevent PKA-C from join PKA-R through molecules which, by binding to it (without interfering with the activity PKA-C kinase), would block the interaction with PKA-R; and (2) block or decrease the production of PK.AR under a lethal threshold via molecules that would interfere with proteins involved in control of the expression of the Pka-r gene. This last approach however would require additional research on the regulation of (gene expression Pkct-r.

AB

active PKA-C analytical subunits (PKA-C) empechpl molecules ~
regulatory subunits ~ Iyn ~~~ n with P ~. '~ .G
IPKA-I ~
INACTIVE FORM
Figure 6.1. Strategy to prevent inactivation of PKA-CA PKA is inactive in its form tetrameric. B. Molecules which, by Binding to PKA-R, prevent its interaction with PKA-C

CA 02309327 2000-06-06 Pagel8 The search for such molecules could be done using chemistry combinatorics (see work proposed in section 8.0). Molecules with an affinity for PKA-R
could easily be assessed for their ability to interfere with the interaction PKA-C / PKA-R by a simple and rapid test measuring the activity of PKA-C in vitro. This test makes again more attractive the use of PKA-R as a cellular target. Indeed, this will quickly determine if molecules with an affinity for PKA-R have a potential like therapeutic agent.
We also determined and compared the sequence of the PKA-R protein from C.
albicans with that of each of the four regulatory subunits existing in humans either PKA-R Ia, PKA-R Ip, PKA-R IIa and PILA-R III. This analysis demonstrated that there are few of homology between the PKA-Rs of these two organizations; the maximum homology being only 34.0%
with the protein PKA-R I ~ 3. In addition, the deletion of a PKA-R gene in the mouse - the only one have been attempted in mammalian cells - has not been shown to be lethal. Those data reinforce the idea that the Pka-r gene could constitute an interesting target for the development of antifungal substances.? Indeed, like the PKA-R of C.
albicans is different from those in humans, the chances are low for that a molecule put developed to counteract the PKA-R activity of C. albicans has the same effect on PKA-R
human. Similarly, as in mice the complete absence of a subunit PKA-R ne not seem to affect cell survival, it's possible that by analogy, human cells tolerate inactivation of PILA-R human.
6.3 Interest in this discovery Several pharmaceutical and biotechnology companies agree currently are important in the search for cellular targets for development of compounds antifungals. ~ -REFERENCES
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7. Art antérieur pertinent Une recherche sommaire réalise sur le «IBM patent serven>
(http://patent.womplex.ibm.cornn en utilisant «Candide» et «kinase» Gommé mots-clef, n'a pas permis de trouver de brevets portant sur le même sujet. 7. Relevant prior art A summary research carried out on the "IBM patent serven>
(http: //patent.womplex.ibm.cornn using "Candide" and "kinase" Gommé keywords, did not find patents on the same subject.

8. Description détaillée du travail à réaliser Afm d'augmenter l'attrait de la découverte pour l'industrie, nous proposons d'initier la recherche menant à l'identification de molécules ayant une afrinité pour PKA-R et pouvant inhiber l'interaction PKA-C / PKA-R. Pour ce faire, la chimie comôinatoire est l'approche privilégiée.
Comme première étape, nous proposons l'utilisation du «pliage display», une approche permettant l'identification de séquences peptidiques interagissant avec une protéine cible (Cortese et al., 1990. Dans le cas présent, nous chercherions~des séquences peptidiques ayant une affinité pour PK.A-R. L'approche du «pliage display» requiert que l'on possède de brandes quantités de la protéine cible, en l'occurence PKA-R. Nous proposons donc d'effectuer le clonaje du gène Pl,;a-r dans un vecteur d'expression afin de le surexprimer dans E. coli. La protéine surproduite sera ensuite utilisée comme appât dans les expériences de «pliage display»
en utilisant des banques peptidiques disponibles commercialement. Par la suite, à partir des séquences consensus identifiées chez les clones sélectionnés, des peptides seraient synthétisés et testés in vitro afin de déterminer s'ils peuvent s'associer à PKA-R et prévenir l'interaction PKA-C / PKA-R.9 Afin de vérifier l'effet des peptides identifiés par «pliage display» sur l'interaction PKA-C /
PKA-R, une source de PKA-C est également nécessaire. C'est pourquoi nous proposons le clonage du gène Pka-c dans un vecteur d'expression afin de surproduire PKA-C.
Les sous-sections suivantes (8.1 à 8.3 ) présentent une description détaillée du travail proposé.
8.1 Mutagénèse des cènes Pka-r et Pka-c C. albicans n'utilise pas le code génétique universel pour le codon CUG, traduisant celui-ci en sérine plutôt qu'en leucine comme c'est le cas chez les autres organismes (Santos & Tuite, 1995). Cette particularité doit être prise en considération lors d'expériences visant l'expression de gènes de C. albicans dâns E. coli.
Dans le cas du gène Pka-c, quatre codons CUG sont présents dans la séquence.
Ceux-ci sont situés aux positions 13, 16, 390 et 413 par rapport au codon d'initiation Met (longueur totale de PKA-C: 442 acides aminés). Comme il est possible que la substitution de ces sérines par des leucines (lors de la traduction dans E. coli) induise des changements conformationels de nature à affecter soit l'activité de la PKA-C soit son interaction avec PKA-R, il apparaît essentiel de convertir - par mutagénèse - les codons CUG en codons ACG (sérine). La protéine surproduite dans E. coli serait ainsi identique en séquence à celle produite dans C.
albicans. Le même type de changement serait nécessaire dans le cas du gène Pka-r qui contient un codon CUG à la position 96 relativement au codon d'initiation Met (longueur totale de PKA-R:
459 acides aminés).
Pour leur mutagénèse, les cadres de lecture des Qènes Pka-c et Pka-r seraient d'abord amplifiés par PCR puis clonés dans le phaQemide pTZl8 (Pharmacia). Afin de faciliter le clonage ultérieur des gènes Pka-c et Pka-r dans un vecteur d'expression (section 8.2), un site de restriction NdeI - comprenant le codon d'initiation ATG (CATATG) - sera incorporé dans les amorces complémentaires du début du cadre de lecture de chacun des gènes. De la même manière, un site de restriction BamHI - comprenant le codon de terminaison TAG
(TAGGATCC) - sera introduit dans les amorces complémentaires de la fin du cadre de lecture de chacun des gènes. Les clones retenus pour Pka-c et Pka-r seront séquencés afin de vérifier l'intégrité de la séquence (i.e. qu'aucun changement n'ait été introduit au cours de l'amplification PCR).
La mutagénèse sera effectuée à l'aide du «Site-directed mutagenesis system»
(BioRad) en utilisant trois oligonucléotides pour la mutagénèse de Pka-c (à cause de leur proximité, les codons 13 et 16 nécessiteront un seul oligonucléotide), et un pour celle de Pka-r. Afin d'identifier les mutants désirés, cinq clones seront séquencés dans la région d'intérêt après chacune des étapes de mutagénèse. Le mutant retenu à chaque étape sera séquencé
complètement afin de vérifier l'intégrité du reste du gène.
8.2 Cloner le cène Pka-r dans un vecteur d'expression Le «pET expression system» (Novagen) sera utilisé pour la surproduction des protéines PKA-C
et PKA-R dans E. coli. Les séquences mutagénisées de Pka-r et Pka-c seront excisées du 8. Detailed description of the work to be carried out In order to increase the attractiveness of discovery for the industry, we offer to initiate research leading to the identification of molecules having an affinity for PKA-R and can inhibit PKA-C / PKA-R interaction. To do this, the combinatorial chemistry is the preferred approach.
As a first step, we propose the use of "display folding", a approach allowing the identification of peptide sequences interacting with a target protein (Cortese et al., 1990. In the present case, we would look for ~ sequences peptides having an affinity for PK.AR. The “display folding” approach requires that we has brands amounts of the target protein, in this case PKA-R. We therefore propose to perform the clone of the Pl,; ar gene in an expression vector in order to overexpress it in E. coli. The overproduced protein will then be used as bait in the experiments of "Folding display"
using commercially available peptide libraries. Over there next, from consensus sequences identified in selected clones, peptides would be synthesized and tested in vitro to determine if they can combine with PKA-R and prevent PKA- interaction C / PKA-R.9 In order to verify the effect of the peptides identified by "display folding" on PKA-C interaction /
PKA-R, a source of PKA-C is also required. That's why we propose the cloning of the Pka-c gene into an expression vector in order to overproduce PKA-C.
The following subsections (8.1 to 8.3) provide a detailed description of the proposed work.
8.1 Mutagenesis of the Pka-r and Pka-c supper C. albicans does not use the universal genetic code for the CUG codon, translating this into serine rather than leucine as is the case in other organisms (Santos & Tuite, 1995). This particularity must be taken into account during experiments targeting expression genes of C. albicans in E. coli.
In the case of the Pka-c gene, four CUG codons are present in the sequence.
These are located at positions 13, 16, 390 and 413 relative to the initiation codon Met (total length of PKA-C: 442 amino acids). As it is possible that the substitution of these serines by leucines (when translating into E. coli) induces changes conformational by nature to affect either the activity of PKA-C or its interaction with PKA-R, it appears essential to convert - by mutagenesis - the CUG codons to ACG codons (serine). The overproduced protein in E. coli would thus be identical in sequence to that produced in C.
albicans. The same type of change would be necessary in the case of the Pka-r gene which contains a CUG codon at position 96 relative to the Met initiation codon (total length of PKA-R:
459 acids amines).
For their mutagenesis, the Qene Pka-c and Pka-r reading frames would be first amplified by PCR then cloned into phaQemide pTZl8 (Pharmacia). In order to facilitate cloning subsequent of the Pka-c and Pka-r genes in an expression vector (section 8.2), a site of NdeI restriction - including the ATG initiation codon (CATATG) - will be incorporated into primers complementary to the start of the reading framework for each of the genes. Of the same way, a BamHI restriction site - including the TAG termination codon (TAGGATCC) - will be introduced in the additional primers at the end of reading frame of each of the genes. The clones selected for Pka-c and Pka-r will be sequenced in order to check sequence integrity (ie no changes have been made to the amplification course PCR).
The mutagenesis will be carried out using the "Site-directed mutagenesis system"
(BioRad) in using three oligonucleotides for Pka-c mutagenesis (because of their proximity, the codons 13 and 16 will require a single oligonucleotide), and one for that of Pka-r. To identify the desired mutants, five clones will be sequenced in the region of interest after each of the mutagenesis stages. The mutant selected at each stage will be sequence completely to verify the integrity of the rest of the gene.
8.2 Clone the Pka-r suppressor in an expression vector The “pET expression system” (Novagen) will be used for the overproduction of PKA-C proteins and PKA-R in E. coli. The mutagenized sequences of Pka-r and Pka-c will be excised from

9 Le cribla?e de banques de molécules chimiques de nature non-peptidique permettrait probablement aussi d'identifier des composés ayant une affinité pour PKA-R et prévenant l'interaction PKA-C /
PKA-R. Cependant, à ce stade-ci (i.e. sans protection par un brevet), toute démarche dans ce sens auprès de compagnies possédant de telles banques nous apparaît prématurée.

vecteur pTZl 8 à l'aide des enrymes de restriction NdeI et BamHI (sites de restriction incorporés aux amorces PCR), puis clonées dans le vecteur pET28a en utilisant les même sites. La production de PKA-C et PKA-R dans E. coli sera vérée sur gel d'acrylamide selon le protocole de Novagen.
Le clonage de Pka-r et Pka-c dans le site NdeI du vecteur pET28a permet la production d'une protéine recombinante possédant un «His~Tag» (une séquence de six histidines suivie d'un site de clivage par la thrombine - une endopeptidase) à son extrémité N-terminale.
Ce «His~Tag»
permet la purification de la protéine à l'aide d'une colonne d'affinité de nickel «His~Bind»
(Novagen). Afin d'éviter que le «His~Tag» n'interfere avec Ies fonctions et les interactions des protéines PKA-C et PKA-R, celui-ci sera enlevé à l'aide de thrombine biotinylée (utilisée dans un ratio 1:2000 thrombine:protéine recombinante). La thrombine biotinylée sera par la suite enlevée par passage sur streptavidine-agarose (Novagen).
La concentration protéique des PKA-C et PKA-R purées sera déterminée à l'aide du «protein assay kin> de Sigma (basé sur la méthode micro-Lowry modifiée pâr Peterson).
L'activité
enrymatique de la PKA-C sera testée in vitro par la méthode de phosphorylation de Roskosky (1983) en utilisant du [y 3zP]ATP et le substrat spécifique «Kempzide» (un heptapeptide).
L'activité de la PKA-R sera mesurée par son habileté à inactiver la PKA-C dans les tests de phosphorylation in vitro.
Il a été observé que les protéines surproduites dans E. coli peuvent parfois être obtenues sous la forme faggrégats insolubles (appelés «corps d'inclusion»). Ce problème est le plus souvent résolu en modifiant les conditions de croissances (durée, température et concentration de l'inducteur) ou en dénaturant et renaturant lentement les protéines.
Cependant, en dépit de la présence de «corps d'inclusion», une portion significative de protéines solubles peut généralement être obtenue. Avec la grande eff cacité de la méthode de purification par le «His~Tag», cette portion soluble est généralement suffisanw pour permettre la purification de grandes quantités de protéines actives.
8.3 Exuériences de <mhaQe disalav»
Le «phage display» est une technique de sélection utilisant des peptides exprimés à la surface de phages recombinants. Par cette approche, on permet l'établissement d'un lien physique entre les peptides d'une banque de séquences aléatoires et une protéine cible.
Deux banques peptidiques construites dans la protéine pIl1 du phage M13 seraient utilisées pour cette approche. La première serait Ia «Disulfzde Constrained Peptide Library»
(New England Biolabs) contenant 3.7 x 109 clones indépendants. Cette banque d'heptapeptides est suffisamment complexe pour contenir la plupart sinon toutes les séquences possibles (20' = 1.28 x 109). Les heptapeptides sont flanqués d'une paire de résidus cystéine qui, dans des conditions non-dénaturantes, forment spontanément des ponts disulfides, produisant alors des peptides cycliques. De telles banques peptidiques ont été utilisées avec succès pour l'identification de molécules possédant des propriétés thérapeutiques (Wrighton et al., 1996;
Cwirla et al., 1997).
La deuxième banque utilisée serait la «Peptide 12-mer library» (New England Biolabs) contenant 1.9 x 109 clones indépendants. Cette banque ne contient donc pas tous les peptides possibles (2012 = 4.1 x 1015). Elle est plutôt considérée comme une banque d'heptapeptides distribués sur une «fenêtre» de 12 résidus de largeur. Cette banque peut permettre (identification de peptides lorsque: (1) la protéine cible requiert plus de 7 acides aminés pour une intéraction stable;
(2) l'interaction des 7 acides aminés doit se faire sur une plus grande distance; (3) une structure tertiaire est nécessaire pbur l'interaction avec la protéine cible.
Les banques seront criblées suivant les recommandations du manufacturier en utilisant la sous-unité PKA-R comme protéine cible. Pour chacune des banques, une quarantaine de clones démontrant une affinité pour PKA-R seront séquencés. Les séquences obtenues seront analysées afin de détecter la présence de séquences consensus. Si tel est le cas, celle-ci sera ensuite utilisée pour permettre la synthèse d'un peptide (initialement, un par banque) qui sera testé pour sa capacité à se lier à PKA-R et à empêcher l'interactiôn PKA-C /
PKA-R in vitro lors de tests de phosphorylation (Roskosky, 1983).
Il est possible que la protéine cible reconnaisse une structure plutôt qu'une séquence. Dans ce cas, une séquence consensus ne pourra être observée. Il faudra alors synthétiser quelques-uns des peptides, avec des cystéines aux extrémité N- et C- terminales, et ies tester pour leur capacité à inhiber l'interaction PKA-C I PKA-R dans des essais de phosphorylation in vitro (Koivunen et al., 1994; Luzzaao et al., 1993; Pasqualini et al., 1990.
Mon laboratoire possède l'expertise nécessaire pour mener à bien les expériences proposées.
L'amplification et le clonage de produits PCR sont réalisés de façon routinière dans mon laboratoire. Je suis également familier avec le «Site-directed mutagenesis system» de BioRad, l'ayant utilisé au cours de mes études doctorales pour introduire des mutations dans un g ène d'origine fong ique. De plus, lors de mon stage postdoctoral, j'ai eu l'occasion d'utiliser le système d'expression pET de Novagen pour surexprimer un gène d'origine fongique. Le test de Roskos~.y (1983) pour mesurer l'activité de la PKA-C est utilisé de façon routinière dans le laboratoire. En ce qui concerne les expériences de «phage display», nous pourrons compter sur la collaboration du Dr Guy Bellemare (Dépt biochimie, Université Laval) qui possède l'expertise dans ce domaine.
L'équipement requis pour réaliser ces travaux (hotte à flux laminaire pour travail avec C.
albicans, appareil PCR, équipement d'électrophorèse pourADN et protéines, centrifugeuses;
incubateurs...) est disponible dans mon laboratoire. Nous disposons également d'un laboratoire poacr les travaux impliquant l'utilisation de radioisotopes.
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SFOIJENC.E DLJ T.OCiJS DU GLNT: PKA-R DE CANDIRA AZBICANS
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pTZl 8 vector using NdeI and BamHI restriction enrymes ( built-in restriction PCR primers), then cloned into the pET28a vector using the same Site (s. The production of PKA-C and PKA-R in E. coli will be verified on acrylamide gel according to Novagen protocol.
The cloning of Pka-r and Pka-c in the NdeI site of the vector pET28a allows the production of a recombinant protein with a "His ~ Tag" (a sequence of six histidines followed by a site of cleavage by thrombin - an endopeptidase) at its N-terminal end.
This "His ~ Tag"
allows the purification of the protein using an affinity column of nickel "His ~ Bind"
(Novagen). In order to prevent the "His ~ Tag" from interfering with the functions and interactions of protein PKA-C and PKA-R, this will be removed using biotinylated thrombin (used in a ratio 1: 2000 thrombin: recombinant protein). Biotinylated thrombin will be continued removed by switch to streptavidin-agarose (Novagen).
The protein concentration of PKA-C and PKA-R purees will be determined using of "protein assay kin> by Sigma (based on the micro-Lowry method modified by Peterson).
The activity of PKA-C will be tested in vitro by the phosphorylation method from Roskosky (1983) using [y 3zP] ATP and the specific substrate "Kempzide" (a heptapeptide).
PKA-R activity will be measured by its ability to inactivate PKA-C in the tests of in vitro phosphorylation.
It has been observed that proteins overproduced in E. coli can sometimes be obtained under the forms insoluble faggregates (called "inclusion bodies"). This problem is the more often resolved by modifying the growth conditions (duration, temperature and concentration of inductor) or by slowly denaturing and renaturing proteins.
However, despite the presence of "inclusion bodies", a significant portion of protein soluble can generally be obtained. With the great efficiency of the purification by "His ~ Tag", this soluble portion is generally sufficient to allow the purification of large amounts of active protein.
8.3 Experiences of <mhaQe disalav »
The "phage display" is a selection technique using peptides expressed on the surface of recombinant phages. By this approach, we allow the establishment of a link physics between peptides from a random sequence bank and a target protein.
Two peptide libraries constructed in the p13 protein of phage M13 would be used to this approach. The first would be the "Disulfzde Constrained Peptide Library"
(New England Biolabs) containing 3.7 x 109 independent clones. This bank of heptapeptides East complex enough to contain most, if not all, sequences possible (20 '= 1.28 x 109). The heptapeptides are flanked by a pair of cysteine residues which, In the conditions non-denaturing, spontaneously form disulfide bridges, producing peptides cyclical. Such peptide libraries have been used successfully for identification of molecules with therapeutic properties (Wrighton et al., 1996;
Cwirla et al., 1997).
The second bank used would be the “Peptide 12-mer library” (New England Biolabs) containing 1.9 x 109 independent clones. This bank therefore does not contain all peptides possible (2012 = 4.1 x 1015). Rather it is considered a bank heptapeptides distributed over a "window" 12 residues wide. This bank can to permit (identification of peptides when: (1) the target protein requires more than 7 amino acids for stable interaction;
(2) the interaction of the 7 amino acids must take place over a greater distance; (3) a structure tertiary is required for interaction with the target protein.
Banks will be screened according to the manufacturer's recommendations in using the sub PKA-R unit as target protein. For each of the banks, around forty clones demonstrating an affinity for PKA-R will be sequenced. The sequences obtained will analyzed to detect the presence of consensus sequences. If this is the case, this will be then used to allow the synthesis of a peptide (initially, one per bank) who will tested for its ability to bind to PKA-R and prevent PKA-C / interaction PKA-R in vitro during phosphorylation tests (Roskosky, 1983).
The target protein may recognize a structure rather than a sequence. In this In this case, a consensus sequence cannot be observed. It will then be necessary synthesize some peptides, with cysteines at the N- and C-terminal ends, and ies test for their ability to inhibit PKA-C I PKA-R interaction in in vitro phosphorylation (Koivunen et al., 1994; Luzzaao et al., 1993; Pasqualini et al., 1990.
My laboratory has the necessary expertise to carry out the proposed experiences.
Amplification and cloning of PCR products is carried out routine in my laboratory. I am also familiar with the "Site-directed mutagenesis system "from BioRad, having used it during my doctoral studies to introduce mutations in a gene of fungal origin. In addition, during my postdoctoral internship, I had the opportunity to use the Novagen pET expression system to overexpress an original gene fungal. The test Roskos ~ .y (1983) to measure the activity of PKA-C is used routine in the laboratory. Regarding the phage display experiments, we can count on the collaboration of Dr Guy Bellemare (Dept biochemistry, Laval University) who possesses expertise in this area.
The equipment required to carry out this work (laminar flow hood for work with C.
albicans, PCR apparatus, electrophoresis equipment for DNA and proteins, centrifuges;
incubators ...) is available in my laboratory. We also have of a laboratory for work involving the use of radioisotopes.
REFERENCES
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SFOIJENC.E DLJ T.OCiJS OF GLNT: PKA-R BY CANDIRA AZBICANS
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2004053150A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Mss4 as an antifungal target
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