CA2309327A1 - Cible cellulaire d'agents therapeutiques contre candida albicans - Google Patents

Description

1. Titre de l'invention Identification d'une cible cellulaire pour le développement d'agents thérapeutiques contre le pathogène fongique Candida albicans.

2. Domaines d'a~nIication de l'invention Biomédical.

3. Applications commerciales de l'invenüon Développement d'agents thérapeutiques antifongiques dirigés contre le pathogène humain Candida albicans.

4. Résumé de l'invention Nous avons identifié, cloné et séquencé le gène codant pour la sous-unité
régulatrice d'une protéine kinase AMP cyclique dépendante (CAMP-dependent prôtein kinase: PKA) chez le pathogène humain Candida albicans. Les résultats d'expériences visant à
déléter ce gène ont démontré que sa présence était essentielle à la croissance du pathogène. Cette caractéristique en fait une cible cellulaire pour le développement d'agents thérapeutiques asti-Candida. De telles cibles sont extrêmement rares.
Description de l'invention ~.1. Le pathogène L'incidence des infections fongiques a augmenté de façon dramatique au cours des deux dernières décennies. L'augmentation a été telle que les mycoses systémiques représentent maintenant une importante cause de morbidité et de mortalité. Parmi toutes les mycoses, les candidiases, causées par Candida albicans sont de loin les plus importantes (Groll et al., 1998;
Pfaller 199?).
C. albicans est un mycète opportuniste normalement présent dans les muqueuses buccale, intestinale et vaginale. Celui-ci devient cependant pathogène lorsqu'un déséquilibre survient dans le système de défense de l'hôte ou que la flore microbienne indigêne est perturbée (traitements aux antibiotiques). Ainsi, les candidiases accompagnent souvent l'immunosuppression (e.g. lors de greffes, de thérapies cytotoxiques, de radiothérapie ou d'usage de corticostéroïdes), l'immunoincompétence et l'immunodéficience. Chez les patients sévèrement immunocompromis, C. albicans peut causer des infections systémiques graves menant fréquemment au décès (Groll et al., 1996; Walsh et al., 1996; Minamoto & Rosenberg, 1997).
Étant donné l'intérêt des compagnies pharmaceutiques et biotechnologiques pour de telles cibles, il est certain que si nos résultats ne sont pas protégés, ils seront récupérés par ces dernières. Toutes les retombées potentielles, en terme de recherche et de développement, seraient alors perdues.

5.2. Le contexte de recherche Le nombre limité de médicaments antifongiques efficaces et sans effet secondaire important, de même que l'augmentation de la prévalence des infections fongiques mettent en évidence l'urgence de développer de nouveaux agents antifongiques (Sternberg 1994).
Au cours des dernières années, une approche basée sur l'identification et la dissection de réactions enzymatiques et de sentiers métaboliques essentiels au fonctionnement de la cellule, a été exploitée pour l'identification de cibles avec lesquelles il serait possible d'interférer. En sélectionnant de telles cibles, il est ensuite possible d'identifier des substances antagonistes de leur fonction pouvant par la suite être utilisées pour la production d'agents thérapeutiques.

5.3. L'approche de recherche Comme plusieurs autres mycètes d'importance médicale, C. albicans peut de manière réversible alterner entre une croissance levuriforme (cellules ovoïdes) et une croissance mycélienne (cellules hyphoïdes), ce qu'est le dimorphisme. Comme chez C albicans la forme mycélienne est impliquée dans la virulence, et comme le dimorphisme est particulier aux champignons, celui-ci représente une source potentielle de cibles pour le développement de substances antifongiques. En utilisant une approche moléculaire, nous avons entrepris de démontrer l'implication d'une enzyme, appelée cAMP-dependent protein kinase (PKA), dans le contrôle de la transition levure-mycélium. Plusieurs données suggéraient que cette enzyme pouvait être impliquée dans le contrôle du dimorphisme.
La PKA est une protéine tétramérique composée de deux sous-unités catalytiques (PKA-C) et de deux sous-unités régulatrices (PKA-R). Sous sa forme tétramérique, la PKA est inactive.
Cependant, en présence d'adénosine monophosphate cyclique (AMP cyclique), les sous-unités régulatrices se dissocient des sous-unités catalytiques qui deviennent alors actives (Figure 5.1).
5.1. Représentation schématique de la cAMP-dependenr prorein kinase (PK.A). A.
Forme tétramérique inactive de la PKA. Le rôle des sous-unités régulatrices PKA-R est de s'associer aux sous-unitës catalyriques PKA-C aün de les maintenir inactives. B. La présence d'AMPc sur les sous-unités régulatrices entraîne la libération de PKA-C monomériques actives.
Afin de déterminer l'implication de PKA-C et PKA-R dans le contrôle de la transition levure-mycélium, nous avons cloné les gènes les encodant. Pour ce faire nous avons fait une analyse des séquences de gènes homologues chez d'autres organismes fongiques afin d'identifier des régions conservées. Ä partir de deux courtes régions relativement bien conservées, nous avons synthétisé des amorces dégénérées afin d'amplifier une portion des gènes par la techniqué de Polymerase chain reaction (PCR). La portion amplifiée de chacun des deux gènes a ensuite été
utilisée comme sonde afin d'isoler des clones à partir d'une banque génomique fosmidique de C.
albicans.l Par la suite, des sous-clones ont été utilisés afin de déterminer la séquence des gènes Pka-r et Pka-c encodant les sous-unités régulatrices et catalytiques respectivement.
Selon notre hypothèse de travail, l'activation de la PKA (en présence d'AMP
cyclique) permet de déclencher la transition levure-mycélium. Afin de vérifier l'implication des gènes codant pour les sous-unités catalytiques et régulatrices dans le contrôle du dimorphisme, nous avons entrepris de déléter chacun de ceux-ci chez C. albicans. Ainsi, la délétion du gène Pka-c (aucune PKA-C active dans la cellule) devait empêcher la souche d'opérer la transition levure-mycélium en présence d'AMP cyclique, alors que la délétion du gène Pka-r (PKA-C toujours active dans la cellule, puisque la PKA-R n'est pas présente pour l'inactiver) devait permettre une croissance mycélienne constitutive, c'est-à-dire même en absence d'AMP
cyclique.
' Une banque fosmidique est construite dans un vecteur contenant l'origine de réplication du plasmide F' de E. coli.
Ce vecteur, présent en une seule copie par cellule, diminue les possibilités de réarra~ement à l'intérieur des clones.

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Les mutants pka-c obtenus ne pouvaient effectivement opérer la transition levure-mycélium en présence d'AMP cyclique. Ces résultats supportaient donc notre hypothèse selon laquelle la PKA est impliquée dans le contrôle de la transition levure-mycélium. Afin de confirmer notre hypothèse, nous avons alors entrepris de générer des mutants pour le gène Pka-r.

5.4. La muta~énèse de Pka-r Afin de faciliter la compréhension des résultats obtenus lors des expériences de mutagénèse de Pka-r, des explications sont données sur le fonctionnement de la méthode utilisée.
C. albicans est un organisme diploide, c'est-à-dire qu'il possède deux copies de chacun des chromosomes (donc deux allèles pour chacun des gènes). Pour générer un mutant, il faut donc inactiver les deux allèles du gène à l'étude. Ainsi, pour réaliser les expériences de mutagénèse (pour les gènes Pka-c et Pka-r), nous avons utilisé la URA blaster technique permettant de déléter les deux allèles d'un gène chez C. albicans. Cette méthode, mise au point il y a quelques années, permet de déléter séquentiellement les deux allèles avec une efficacité variant entre 20 et 100%.2 Ainsi, l'analyse d'une dizaine de transformants permet généralement d'identifier les mutants recherchés.
Une construction (appelée-pMPl) fut d'abord générée, dans laquelle une cassette - contenant le gène Ura3 situé entre deux séquences répétées caf - fut flanquée de séquences situées de part et d'autre du gène Pka-r (Figure ~.2). Dans cette construction, le gêne Ura3 (impliqué dans la synthèse de l'uracil) est utilisé comme marqueur pour la sélection des transformants (utilisation d'une souche parentale auxotrophe pour l'uracil; ura3-), alors que les séquences caf (séquences partielles du gène codant pour la chloramphenicol acetyl rransferase) permettent une recombinaison infra-chromosomique afin d'éliminer le gène Ura3 (l'utilité de ceci est expliquée plus loin).
\\ \\ // /~%~~~//% chromosome . ~ ~ ' construction séquence en amont du gène cassette séquence en aval du gène) p(~~ p~
5.2. Construction de pMPl pour la muta~énèse du âène Pka-r. Les séquences situées en amont et en aval du gène Pka-r ont été introduites de pan et d'autre de la cassette caf-Ura3-car.
La construction pMPl fut utilisée pour transformer la souche CAI4 (ura3-) de C. albicans.3 La sélection des transformants fut faite sur milieu minimal afin de permettre uniquement la croissance de ceux ayant intégré la cassette caf-Ura3-caf à leur génome. Neuf des transformants obtenus ont été testés par analyse de type Southern, afin de vérifier le remplacement d'un premier allèle du gène Pka-r par la cassette (Figure 5.3).
Deux des transformants vérifiés se sont avérés être les mutants hémizygotes recherchés, c'est-à-dire ne possédant plus qu'un seul allèle du gène Pka-r (génotype Pka-r lepka-r:: caf-Ura3-caf).
Ces mutants hémizygotes avaient un phénotype mycélien constitutif. Ces résultats confirmaient à nouveau l'implication de la PKA dans le contrôle du dimorphisme (tout comme l'avait fait la mutagénèse du gène Pka-c; section 5.4).
Afin de pouvoir déléter le deuxième allèle du gène Pka-r, il a d'abord fallu rétablir l'auxotrophie à l'uracile chez un des mutants hémizygotes. Pour ce faire, le mutant hémizygote fut placé sur milieu complet permettant ainsi la perte du gène Ura3 par une recombinaison entre les séquences caf situées de part et d'autre de celui-ci (menant à l'excision du gène Ura3). Les 1 Selon la littérature et notre expérience personnelle.
3 CAI4 est une souche standard utilisée dans plusieurs laboratoires à travers le monde.

révertants ura3- furent ensuite sélectionnés sur milieu contenant du 5-FOA, une substance toxique pour les cellules possédant encore un gène Ura3 fonctionnel. Vingt-trois révertants ura3-furent vérifiés par analyse de type Southern afin de confirmer la perte du gène Ura3 (Figure 5.4).

\ \~~~~ chromosome I' %/// /%/ chromosome 1 cortstrucfiorc plasmidique W\\ sW\\ ~ chromosome2 ~
WW ° ~ ~ : - agi/ chromasomey 5.3 Représentation schématique du mécanisme ayant mené à la mutagénèse du premier allèle du gène Pka-r. A. Alignement des séquences homologues situées de part et d'autre du gène Pka-r et de la cassette car-Ura3-car. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences homologues, remplacement du gène Pka-r par la cassette.
\\~\\\~\\ %%~// %///%/ chromosome) ~
\\\\ //~%/ chromosome Z
5.4. Représentation schématique des loci Pka-r à la suite de la recombinaison entre les séquences cat ayant mené à l'excision du gène Ura3.
Un de ces révertants (Pka-rldpka-r:: cat) fut sélectionné pour la mutagénèse du deuxième allèle Pka-r en utilisant à nouveau la construction plasmidique pMPl (Figure S.5).
Plusieurs séries de transformants furent analysées par Southern afin de détecter un mutant ayant subi' la délétion du deuxième allèle Pka-r. Au total, 113 transformants furent ainsi analysés parmi lesquels aucun ne s'avéra être un mutant pl,:a-r homozygote nul (apka-r:: cat-Ura3-catldpka-r:: cat).
corcstruction P~~ PM
\ ~//%~// ~/ chromosome l' chromosome 1 \~\~~\~\~ \\ Cg ~~ ~' . %%/~~~/~/~/~~/ hromosome hromosome Figure 5.5. Représentation schématique de la mutagénèse attendue lors d'expériencesvisant la délétion du deuxième allèle du gène Pka-r. A. Alisnement des séouences homolo_ues situées de art et d'autre du gène Pka-r. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences situées de part et d'autre du cène Pka-r, remplacement de celui-ci par la cassette car-Ura3-cat.

En fait, on observait dans la presque totalité des cas que le locus Pka-r déjà
délété était à
nouveau la cible de la double recombinaison (Figure 5.6).
\\\\\\\\ \~\\\\\\\\ // %%//% chrorr~SOrne l' ~\~\\\ \ / %%//// chromosome r construction pLasmidique %/ ctu-omosorr~ ~
\\\ \\\\\ ' 3FTA3:.: :- /%%~%%/%/ / / chromosome 5.6. Représentation schématique de la mutagénèse observée lors de tentatives pour déléter le deuxième allèle du gène Pka-r. A. Alignement des séquences homologues situées de part et d'autre de la séquence cat restante suite à la délétion du premier allèle. B. Suite à une double recombinaison impliquant les séquences situées de part et d'autre de la séquence cat, remplacement de celle-ci la cassette cat-Ura3-car.
Ces résultats ne pouvaient s'expliquer par des problèmes techniques de mutagénèse. Étant donné le nombre élevé de transformants analysés, ces résultats suggéraient plutôt une impossibilité de déléter les deux allèles du gène Ph:a-r. Afin vérifier cette hypothèse, une nouvelle construction fut générée pour la mutagénèse. Dans cette construction, appelée pMP3, le gène Ura3 fut placé au centre de la séquence codant pour le gène Pka-r (sans les séquences situées en amont et en aval du gène; Figure 5.7).
corLStruction :.,.: P~ P~3 \ \\\\\\\\\ ~/G%%~/%%%% ~ ~o~noSOme l \\\\\\ //////%%%%~%%/ ~~~SO~ T
5.7. Représentation schématique de la mutagénèse attendue avec la construction plasmidique pMP3.
Ä noter l'absence d'homologie de séquence entre pMP3 et le locus de l'allèle déjà délété.
Comme les séquences présentes sur cette construction ne se retrouvent qu'au locus non encore délété, cette situation devait forcer l'intégration du gène Ura3 dans l'allèle Pka-r restant.
Cependant, aucun des 20 transformants vérifiés par analyse de type Southern n'eût le deuxième allèle Pka-r délété.
Ces résultats négatifs furent alors considérés en même temps que deux autres observations que nous avions faites lors de ces expériences de mutagénèse. Premièrement, le nombre de transformants obtenus lors des expériences visant la délétion du deuxième allèle Pka-r (avec pMPl et pMP3) était environ 30% inférieur à celui obtenu normalement lors d'expériences de mutagénèse semblables (visant d'autres gènes). Deuxièmement, une portion importante des transformants ne formait que de très petites colonies sur les pétris de transformation; diamètre de 0.5 mm comparativement au diamètre habituel de 2-3 mm.4 Lorsque ces petites colonies furent repiquées en milieu liquide ou réétalées sur milieu gélosé, aucune croissance ne fut observée. Prises ensemble, ces observations suggéraient qu'en perdant le deuxième allèle du gène Pka-r, les transformants ne pouvaient tout simplement pas croître (réduction du nombre de transformants obtenus), ou encore croître uniquement pour une période de temps limitée (présence de petites colonies non-viables).
Comme les difficultés à identifier des mutants pka-r homozygotes nuls ne semblaient pas être de nature technique, nous avons alors posé comme hypothèse que la présence dans la cellule de PKA-C toujours active (le rôle de PKA-R étant de s'associer à l'enzyme PKA-C
afin de la maintenir dans un état inactif) s'avérait létale pour C. albicans. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons entrepris de générer un mutant pka-r homozygote nul chez une souche ne possédant pas d'enzyme PKA-C (mutant pka-c homozygote nul). En théorie, chez un tel mutant, l'absence de PKA-R ne devrait pas nuire à la cellule puisque celle-ci ne renferme pas d'enzyme PKA-C.
Lors de la mutagénèse du premier allèle de Pka-r, cinq des seize transformants vérifiés par analyse de type Southern se sont avérés être du génotype attendu (Pka-rldpka-r:: cat-Ura3-cat dpka-c: : cat l dpka-c: : cat).5 Tout comme décrit précédemment, un de ces mutants fut utilisé
pour obtenir des révertants ura3-. Un des révertants obtenus (Pka-r l dpka-r:
: cat dpka-c: : cat l dpka-c:: cat) fut utilisé pour la mutagénèse du second.allèle Pka-r, après vérification du génotype par analyse de type Southern. Neuf des 31 transformants obtenus lors de ces expériences furent confirmés être des mutants pka-r homozygotes nuls (apka-r:
: cat- Ura3-cat l dpka-r: : cat dpka-c:: cat l apka-c:: cat) par analyse de type Southern. Ces résultats confirmaient que l'impossibilité d'obtenir des mutants pka-r homozygotes nuls à partir de la souche CAI4 n'était pas due à un problème technique mais plutôt à la létalité
de la condition (Tableau ~.1).
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Pka-c l dpka-c: : ~ 10 10 (100) cat- Ura3-cat dpka-c:: car-Ura3-cat:: cat 36 7 (20) ldpka-c Pka-r l dpka-r: : 9 2 (23) cat-Ura3-cat (avec pMPl) dpka-r: : car- Ura3-cat: : cat 113 0 (0) l dpka-r (avec pMPl J

pka-r: : ura3 / dpka-r: 20 0 (0) : cat (avec pMP3) 4 Ces petites colonies furent observées lors d'expérience de mutagénèse tant avec pMPl qu'avec pMP3.
Ces expériences de muta~énèse ont été réalisées avec la construction pMPl en utilisant une souche pka-c homozygote nul (epka-c:: cat l'pka-c:: cat) issue de nos expériences de mutagénèse sur le âène Pka-c.

Pka-r ldpka-r:: cat-Ura3-cat 16 5 l32) dpka-c: : cat l dpka-c: : cat ra~«
pMPI ) dpka-r: : cat-Ura3-cat l dpka-r:: cat 31 9 X29) dpka-c: : cat l dpka-c: : cat ~ aMPll Tableau 5.1. Sommaire des résultats d'expériences de mutagénèse visant l'obtention de mutants pka-c et pka-r homozygotes nuls chez C. albicans.
Des observations faites en microscopie optique ont révélé que les doubles mutants avaient une morphologie cellulaire atypique (forme cellulaire très irré=ulière). De plus, contrairement à la coloration blanche habituelle, les colonies de ces doubles mutants adoptaient une coloration jaune très distinctive.

RÉFÉRENCES
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6. Utilité principale de l'invention et ses avantages 6.1 Positionnement de la découverte Traditionnellement, la découverte de nouveaux médicaments a été basée sur le criblage systématique de produits naturels et synthétiques dans des tests biologiques et pharmacologiques. Cependant, cette approche n'a pas permis de générer le nombre de composés antifongiques requis; l'arsenal étant encore extrêmement limité, particulièrement en ce qui regarde le traitement des infections fongiques systémiques (Tableau 6.1).
CLASSE ET COMPOS ~MOLCULE CIBLE / MODE D'ACTION
~

Polyne Interaction avec l'ergostrol de la membrane, formation de Amphotricine B canaux, permabilit aux cations entranant la mort cellulaire Analogue de nuclosides Damination intracellulaire en 5-fluorouracil, interfrence 5-Fluorocytosine avec la synthse et les rles biologiques de l'ADN et de l'ARN

Drivs azotes Interaction avec le cytochrome P-450, inhibition de la Ktoconazole dmthylation du lanostrol entranant un puisement de Fluconazole l'ergostrol et l'accumulation de strols toxiques dans la Itraconazole membrane cellulaire Allylamines Inhibition de la squalne poxidase, pisement de Terbinafme l'ergostrol et accumulation de strols toxiques dans la membrane cellulaire Inhibiteur de mitose Inhibition de la mitose en mtaphase par interaction avec Grisofulvine les microtubules Tableau 6.1. Adents antifongiques systémiques en usage clinique.
L'Amphotéricine B et le fluconazole sont de loin les ântifongiques les plus couramment utilisés et ce, en dépit du fait que fAmphotéricine B entraîne des effets secondaires importants (fièvre, nausée, et cytotoxicité rénale), et que le fluconazole, mis sur le marché il y a une douzaine d'années seulement, soit déjà confronté à des problèmes importants de résistance (Edwards, 199I; White, 1997).
Afin de combler ce manque flagrant de médicaments antifongiques efficaces et sans effet secondaire, une nouvelle approche basée sur l'identification et la dissection de réactions enzymatiques essentielles au fonctionnement de la cellule s'est développée au cours des dernières années. Plusieurs laboratoires se sont lancés dans cette quête de cibles cellulaires essentielles à la survie des pathogènes fongiques (Kurtz 1998; Mitchell 1998).
Malgré ces efforts, encore peu de cibles ont été identifiées. Parmi celles-ci, seulement quelques unes sont actuellement utilisées pour le développement de composés antifongiques (Groll et al., 1998;
Tableau 6.2).

CLASSE ET MOLCULE CIBLE / MODE D'ACTION
MPOS _ ~
CO
~

_ Interaction avec le cytochrome P-450, _ inhibition de la Triazoles ~

UK 109496 dmthylation du lanostrol entranant un puisement de l'ergostrol et l'accumulation de strols toxiques dans la membrane cellulaire Echinocandines Inhibition de la ~i-(1,3)glucane synthtase entranant un LY 303366 puisement en glucanes et donc une fragilit osmotique Pradimicines Formation de complexes avec les mannoprotines de la BMS 181184 paroi cellulaire, entranant des perturbations au niveau de la Benanomvcin A membrane et la mort cellulaire Polynes Interaction avec l'ergostrol de la membrane, formation de Nystatin liposomique canaux, permabilit aux cations entranant la mort cellulaire Nikkomycines ( Inhibition de la synthse de la chitine entranant un arrt de Nikkom cin Z croissance et une fra ilit osmoti ue Sordarines Interaction avec le facteur d'longation 2 impliqu dans la GM 237354 s nthse des rotines Tableau 6 ~. Agents antifongiques systémiques en développement.
La difficulté dans l'identification de cibles tient au fait que les cellules fongiques, tout comme les cellules humaines, sont eucaryotes, limitant ainsi considérablement le nombre de cibles cellulaires sur lesquelles il est possible d'agir sans interférer avec le fonctionnement normal des cellules humaines.
6.2 Avantages de PKA-R comme cible Un premier avantage d'utiliser la PKA-R comme cible est que sa fonction cellulaire, de même que son mode d'action sont déjà connus (par analogie avec ce qui ~a été
observé chez d'autres orga.nismes). Ce mode d'action rend d'ailleurs la PKA-R particulièrement attrayante pour le développement de composés antifongiques. En effet, comme la PKA-R exerce son action en interagissant physiquement avec la PKA-C, une stratégie simple peut être envisagée pour bloquer l'interaction entre ces deux protéines. Ainsi, en empêchant l'interaction PKA-C l PKA-R, on créerait une condition simulant l'absence de PKA-R ce qui s'avérerait létal pour les -cellules de C. albicans. Ainsi, pour empêcher l'association de PKA-R à PKA-C, on pourrait développer des molécules qui, en se liant à la PKA-R, préviendraient son interaction avec PKA-C (Figure 6.1).6 6 Deux autres straté;ies sont é~_alement possibles: (1) empêcher la PKA-C de s'associer à la PKA-R par l'intermédiaire de molécules qui, en se liant à celle-ci (sans interférer avec l'activité
kinase de la PKA-C), bloqueraient l'interaction avec la PKA-R; et (2) bloquer ou diminuer la production de PK.A-R sous un seuil létal par l'intermédiaire de molécules qui interféreraient avec les protéines impliquées dans le contrôle de l'expression du gène Pka-r. Cette dernière approche requerrait cependant des recherches supplémentaires sur la régulation de (expression du gène Pkct-r.

A B

sous-unités aalalytiques PKA-C actives (PKA-C) molécules empéchpl~
sous-unités régulatrices ~ Iyn~~~n avec P~.'~.G
IPKA-I~
FORME INACTIVE
Figure 6.1. Stratégie pour empêcher l'inactivation de la PKA-C. A. La PKA est inactive sous sa forme tétramérique. B. Molécules qui, en se Liant à la PKA-R, empêchent son interaction avec PKA-C

CA 02309327 2000-06-06 Pagel8 La recherche de telles molécules pourrait se faire en utilisant la chimie combinatoire (voir travail proposé à la section 8.0). Les molécules ayant une affinité pour PKA-R
pourraient facilement être évaluées pour leur capacité à interférer avec l'interaction PKA-C / PKA-R par un test simple et rapide mesurant in vitro l'activité de la PKA-C. Ce test rend encore plus attrayant l'utilisation de la PKA-R comme cible cellulaire. En effet, celui-ci permettra de déterminer rapidement si les molécules ayant une affinité pour PKA-R ont un potentiel comme agent thérapeutique.
Nous avons aussi déterminé et comparé la séquence de la protéine PKA-R de C.
albicans avec celle de chacune des quatre sous-unités régulatrices existant chez l'humain soit PKA-R Ia, PKA-R Ip, PKA-R IIa et PILA-R III. Cette analyse a démontré qu'il existe peu d'homologie entre les PKA-R de ces deux organismes; l'homologie maximale étant de seulement 34.0 %
avec la protéine PKA-R I~3. De plus, la délétion d'un gène PKA-R chez la souris - la seule à
avoir été tentée chez les cellules de mammifères - ne s'est pas pas avérée létale. Ces données renforcent l'idée que le gène Pka-r puisse constituer une cible intéressante pour le développement de substances antifongiques.? En effet, comme la PKA-R de C.
albicans est différente de celles présentes chez l'humain, les chances sont faibles pour qu'une molécule mise au point pour contrer l'activité de la PKA-R de C. albicans ait le même effet sur les PKA-R
humaines. De même, comme chez la souris l'absence complète d'une sous-unité
PKA-R ne semble pas affecter la survie des cellules, il est possible que par analogie, les cellules humaines tolèrent l'inactivation de PILA-R humaines.
6.3 Intérêt pour cette découverte Plusieurs compagnies pharmaceutiques et biotechnologiques consentent actuellement des sommes importantes à la recherche de cibles cellulaires pour le développement de composés antifongiques. ~-RÉFÉRENCES
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7. Art antérieur pertinent Une recherche sommaire réalise sur le «IBM patent serven>
(http://patent.womplex.ibm.cornn en utilisant «Candide» et «kinase» Gommé mots-clef, n'a pas permis de trouver de brevets portant sur le même sujet.

8. Description détaillée du travail à réaliser Afm d'augmenter l'attrait de la découverte pour l'industrie, nous proposons d'initier la recherche menant à l'identification de molécules ayant une afrinité pour PKA-R et pouvant inhiber l'interaction PKA-C / PKA-R. Pour ce faire, la chimie comôinatoire est l'approche privilégiée.
Comme première étape, nous proposons l'utilisation du «pliage display», une approche permettant l'identification de séquences peptidiques interagissant avec une protéine cible (Cortese et al., 1990. Dans le cas présent, nous chercherions~des séquences peptidiques ayant une affinité pour PK.A-R. L'approche du «pliage display» requiert que l'on possède de brandes quantités de la protéine cible, en l'occurence PKA-R. Nous proposons donc d'effectuer le clonaje du gène Pl,;a-r dans un vecteur d'expression afin de le surexprimer dans E. coli. La protéine surproduite sera ensuite utilisée comme appât dans les expériences de «pliage display»
en utilisant des banques peptidiques disponibles commercialement. Par la suite, à partir des séquences consensus identifiées chez les clones sélectionnés, des peptides seraient synthétisés et testés in vitro afin de déterminer s'ils peuvent s'associer à PKA-R et prévenir l'interaction PKA-C / PKA-R.9 Afin de vérifier l'effet des peptides identifiés par «pliage display» sur l'interaction PKA-C /
PKA-R, une source de PKA-C est également nécessaire. C'est pourquoi nous proposons le clonage du gène Pka-c dans un vecteur d'expression afin de surproduire PKA-C.
Les sous-sections suivantes (8.1 à 8.3 ) présentent une description détaillée du travail proposé.
8.1 Mutagénèse des cènes Pka-r et Pka-c C. albicans n'utilise pas le code génétique universel pour le codon CUG, traduisant celui-ci en sérine plutôt qu'en leucine comme c'est le cas chez les autres organismes (Santos & Tuite, 1995). Cette particularité doit être prise en considération lors d'expériences visant l'expression de gènes de C. albicans dâns E. coli.
Dans le cas du gène Pka-c, quatre codons CUG sont présents dans la séquence.
Ceux-ci sont situés aux positions 13, 16, 390 et 413 par rapport au codon d'initiation Met (longueur totale de PKA-C: 442 acides aminés). Comme il est possible que la substitution de ces sérines par des leucines (lors de la traduction dans E. coli) induise des changements conformationels de nature à affecter soit l'activité de la PKA-C soit son interaction avec PKA-R, il apparaît essentiel de convertir - par mutagénèse - les codons CUG en codons ACG (sérine). La protéine surproduite dans E. coli serait ainsi identique en séquence à celle produite dans C.
albicans. Le même type de changement serait nécessaire dans le cas du gène Pka-r qui contient un codon CUG à la position 96 relativement au codon d'initiation Met (longueur totale de PKA-R:
459 acides aminés).
Pour leur mutagénèse, les cadres de lecture des Qènes Pka-c et Pka-r seraient d'abord amplifiés par PCR puis clonés dans le phaQemide pTZl8 (Pharmacia). Afin de faciliter le clonage ultérieur des gènes Pka-c et Pka-r dans un vecteur d'expression (section 8.2), un site de restriction NdeI - comprenant le codon d'initiation ATG (CATATG) - sera incorporé dans les amorces complémentaires du début du cadre de lecture de chacun des gènes. De la même manière, un site de restriction BamHI - comprenant le codon de terminaison TAG
(TAGGATCC) - sera introduit dans les amorces complémentaires de la fin du cadre de lecture de chacun des gènes. Les clones retenus pour Pka-c et Pka-r seront séquencés afin de vérifier l'intégrité de la séquence (i.e. qu'aucun changement n'ait été introduit au cours de l'amplification PCR).
La mutagénèse sera effectuée à l'aide du «Site-directed mutagenesis system»
(BioRad) en utilisant trois oligonucléotides pour la mutagénèse de Pka-c (à cause de leur proximité, les codons 13 et 16 nécessiteront un seul oligonucléotide), et un pour celle de Pka-r. Afin d'identifier les mutants désirés, cinq clones seront séquencés dans la région d'intérêt après chacune des étapes de mutagénèse. Le mutant retenu à chaque étape sera séquencé
complètement afin de vérifier l'intégrité du reste du gène.
8.2 Cloner le cène Pka-r dans un vecteur d'expression Le «pET expression system» (Novagen) sera utilisé pour la surproduction des protéines PKA-C
et PKA-R dans E. coli. Les séquences mutagénisées de Pka-r et Pka-c seront excisées du

9 Le cribla?e de banques de molécules chimiques de nature non-peptidique permettrait probablement aussi d'identifier des composés ayant une affinité pour PKA-R et prévenant l'interaction PKA-C /
PKA-R. Cependant, à ce stade-ci (i.e. sans protection par un brevet), toute démarche dans ce sens auprès de compagnies possédant de telles banques nous apparaît prématurée.

vecteur pTZl 8 à l'aide des enrymes de restriction NdeI et BamHI (sites de restriction incorporés aux amorces PCR), puis clonées dans le vecteur pET28a en utilisant les même sites. La production de PKA-C et PKA-R dans E. coli sera vérée sur gel d'acrylamide selon le protocole de Novagen.
Le clonage de Pka-r et Pka-c dans le site NdeI du vecteur pET28a permet la production d'une protéine recombinante possédant un «His~Tag» (une séquence de six histidines suivie d'un site de clivage par la thrombine - une endopeptidase) à son extrémité N-terminale.
Ce «His~Tag»
permet la purification de la protéine à l'aide d'une colonne d'affinité de nickel «His~Bind»
(Novagen). Afin d'éviter que le «His~Tag» n'interfere avec Ies fonctions et les interactions des protéines PKA-C et PKA-R, celui-ci sera enlevé à l'aide de thrombine biotinylée (utilisée dans un ratio 1:2000 thrombine:protéine recombinante). La thrombine biotinylée sera par la suite enlevée par passage sur streptavidine-agarose (Novagen).
La concentration protéique des PKA-C et PKA-R purées sera déterminée à l'aide du «protein assay kin> de Sigma (basé sur la méthode micro-Lowry modifiée pâr Peterson).
L'activité
enrymatique de la PKA-C sera testée in vitro par la méthode de phosphorylation de Roskosky (1983) en utilisant du [y 3zP]ATP et le substrat spécifique «Kempzide» (un heptapeptide).
L'activité de la PKA-R sera mesurée par son habileté à inactiver la PKA-C dans les tests de phosphorylation in vitro.
Il a été observé que les protéines surproduites dans E. coli peuvent parfois être obtenues sous la forme faggrégats insolubles (appelés «corps d'inclusion»). Ce problème est le plus souvent résolu en modifiant les conditions de croissances (durée, température et concentration de l'inducteur) ou en dénaturant et renaturant lentement les protéines.
Cependant, en dépit de la présence de «corps d'inclusion», une portion significative de protéines solubles peut généralement être obtenue. Avec la grande eff cacité de la méthode de purification par le «His~Tag», cette portion soluble est généralement suffisanw pour permettre la purification de grandes quantités de protéines actives.
8.3 Exuériences de <mhaQe disalav»
Le «phage display» est une technique de sélection utilisant des peptides exprimés à la surface de phages recombinants. Par cette approche, on permet l'établissement d'un lien physique entre les peptides d'une banque de séquences aléatoires et une protéine cible.
Deux banques peptidiques construites dans la protéine pIl1 du phage M13 seraient utilisées pour cette approche. La première serait Ia «Disulfzde Constrained Peptide Library»
(New England Biolabs) contenant 3.7 x 109 clones indépendants. Cette banque d'heptapeptides est suffisamment complexe pour contenir la plupart sinon toutes les séquences possibles (20' = 1.28 x 109). Les heptapeptides sont flanqués d'une paire de résidus cystéine qui, dans des conditions non-dénaturantes, forment spontanément des ponts disulfides, produisant alors des peptides cycliques. De telles banques peptidiques ont été utilisées avec succès pour l'identification de molécules possédant des propriétés thérapeutiques (Wrighton et al., 1996;
Cwirla et al., 1997).
La deuxième banque utilisée serait la «Peptide 12-mer library» (New England Biolabs) contenant 1.9 x 109 clones indépendants. Cette banque ne contient donc pas tous les peptides possibles (2012 = 4.1 x 1015). Elle est plutôt considérée comme une banque d'heptapeptides distribués sur une «fenêtre» de 12 résidus de largeur. Cette banque peut permettre (identification de peptides lorsque: (1) la protéine cible requiert plus de 7 acides aminés pour une intéraction stable;
(2) l'interaction des 7 acides aminés doit se faire sur une plus grande distance; (3) une structure tertiaire est nécessaire pbur l'interaction avec la protéine cible.
Les banques seront criblées suivant les recommandations du manufacturier en utilisant la sous-unité PKA-R comme protéine cible. Pour chacune des banques, une quarantaine de clones démontrant une affinité pour PKA-R seront séquencés. Les séquences obtenues seront analysées afin de détecter la présence de séquences consensus. Si tel est le cas, celle-ci sera ensuite utilisée pour permettre la synthèse d'un peptide (initialement, un par banque) qui sera testé pour sa capacité à se lier à PKA-R et à empêcher l'interactiôn PKA-C /
PKA-R in vitro lors de tests de phosphorylation (Roskosky, 1983).
Il est possible que la protéine cible reconnaisse une structure plutôt qu'une séquence. Dans ce cas, une séquence consensus ne pourra être observée. Il faudra alors synthétiser quelques-uns des peptides, avec des cystéines aux extrémité N- et C- terminales, et ies tester pour leur capacité à inhiber l'interaction PKA-C I PKA-R dans des essais de phosphorylation in vitro (Koivunen et al., 1994; Luzzaao et al., 1993; Pasqualini et al., 1990.
Mon laboratoire possède l'expertise nécessaire pour mener à bien les expériences proposées.
L'amplification et le clonage de produits PCR sont réalisés de façon routinière dans mon laboratoire. Je suis également familier avec le «Site-directed mutagenesis system» de BioRad, l'ayant utilisé au cours de mes études doctorales pour introduire des mutations dans un g ène d'origine fong ique. De plus, lors de mon stage postdoctoral, j'ai eu l'occasion d'utiliser le système d'expression pET de Novagen pour surexprimer un gène d'origine fongique. Le test de Roskos~.y (1983) pour mesurer l'activité de la PKA-C est utilisé de façon routinière dans le laboratoire. En ce qui concerne les expériences de «phage display», nous pourrons compter sur la collaboration du Dr Guy Bellemare (Dépt biochimie, Université Laval) qui possède l'expertise dans ce domaine.
L'équipement requis pour réaliser ces travaux (hotte à flux laminaire pour travail avec C.
albicans, appareil PCR, équipement d'électrophorèse pourADN et protéines, centrifugeuses;
incubateurs...) est disponible dans mon laboratoire. Nous disposons également d'un laboratoire poacr les travaux impliquant l'utilisation de radioisotopes.
RÉFÉRENCES
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SFOIJENC.E DLJ T.OCiJS DU GLNT: PKA-R DE CANDIRA AZBICANS
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