CA2339901A1 - Procede d'obtention in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé de production in vitro de séquences polynucléotidiques recombinées à partir d'une banque de séquences polynucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: ( a) la fragmentation d'une banque initiale de séquences polynucléotidiques doubl e- brins; (b) la dénaturation des fragments issus de l'étape (a) éventuellement en présence d'une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage; (c) l'hybridation desdits fragments avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage si celle(s)- ci n'est (ne sont) pas présente(s) à l'étape (b); (d) la ligation desdits fragments; (e) éventuellement le clonage des séquences polynucléotidiques recombinées, et la sélection des séquences polynucléotidiques recombinées, e t la sélection des séquences polynucléotidiques présentant des propriétés avantageuses par rapport à une ou plusieurs séquences de référence.
Claims (29)
1) Procédé d'obtention in vitro de séquences polynucléotidiques recombinées à partir d'une banque de séquences polynucléotidiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) la fragmentation d'une banque de séquences polynucléotidiques double-brins, b) 1a dénaturation des fragments éventuellement en présence d'une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage, c) l'hybridation desdits fragments avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage si celle(s)-ci n'est (ne sont) pas présente(s) à l'étape (b), d) la ligation desdits fragments pour obtenir des séquences polynucléotidiques recombinées, e) la sélection des séquences polynucléotidiques recombinées présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes à
une ou plusieurs séquences de référence.
a) la fragmentation d'une banque de séquences polynucléotidiques double-brins, b) 1a dénaturation des fragments éventuellement en présence d'une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage, c) l'hybridation desdits fragments avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage si celle(s)-ci n'est (ne sont) pas présente(s) à l'étape (b), d) la ligation desdits fragments pour obtenir des séquences polynucléotidiques recombinées, e) la sélection des séquences polynucléotidiques recombinées présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes à
une ou plusieurs séquences de référence.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend à l'issue de l'étape (d) et avant l'étape (e), la répétition des étapes (b), (c) et (d) avec les fragments ligués et non ligués issus de l'étape (d).
3) procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séparation des séquences polynucléotidiques recombinées de la ou des matrice(s) d'assemblage avant l'étape (e).
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend l'amplification des séquences polynucléotidiques recombinées double brin avant l'étape (e).
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend avant l'étape (e), le clonage de séquences polynucléotidiques recombinées éventuellement après séparation des brins recombinés de la ou des matrices et obtention du double brin correspondant.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les extrémités des fragments générés à l'étape (a) sont telles qu'il puisse y avoir hybridation adjacente de ces extrémités sur la ou les matrice(s) d'assemblage à l'étape (c) et ligation de ces fragments les uns avec les autres à
l'étape (d) .
l'étape (d) .
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les séquences polynucléotidiques de la banque initiale présentent des zones d'homologie soit entre elles, soit avec les matrices d'assemblage, de façon à générer à
l'étape (a) des extrémités de fragments qui permettent l'hybridation adjacente de ces extrémités sur la ou les matrice(s) d'assemblage à l'étape (c) et ligation de ces fragments les uns avec les autres à l'étape (d).
l'étape (a) des extrémités de fragments qui permettent l'hybridation adjacente de ces extrémités sur la ou les matrice(s) d'assemblage à l'étape (c) et ligation de ces fragments les uns avec les autres à l'étape (d).
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes (c) et (d) sont réalisées simultanément.
9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fragmentation des séquences polynucléotidiques à l'étape (a) se fait de manière contrôlée ou de manière aléatoire.
10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape (a) consiste à soumettre les séquences polynucléotidiques de la banque initiale à une hydrolyse par l'action d'une ou plusieurs enzymes de restriction.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le degré
de recombinaison et la position des points de recombinaison des séquences polynucléotidiques recombinées sont déterminés par la fragmentation de l'étape (a) si elle est réalisée de manière contrôlée.
de recombinaison et la position des points de recombinaison des séquences polynucléotidiques recombinées sont déterminés par la fragmentation de l'étape (a) si elle est réalisée de manière contrôlée.
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que la fragmentation aléatoire des séquences polynucléotidiques à
l'étape (a) se fait par tout moyen enzymatique au mécanique connu.
l'étape (a) se fait par tout moyen enzymatique au mécanique connu.
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute à l'étape (c) et/ou à l'étape (d) des enzymes capables de reconnaître et de couper de manière spécifique les extrémités non hybridées des fragments, lorsque lesdites extrémités recouvrent d'autres fragments hybridés sur la même matrice.
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on ajoute à l'étape (c) et/ou à
l'étape (d) l'enzyme Flap endonucléase.
l'étape (d) l'enzyme Flap endonucléase.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise à l'étape (d) une ligase active à haute température et de préférence thermostable.
16) Procédé selon les revendications 13 et 14, caractérisé en ce que les endonucléases capables de reconnaître et de couper de manière spécifique les extrémités non hybridées des fragments ajoutées à l'étape (c) et/ou à l'étape (d) ont les mêmes propriétés de thermorésistante et d'activité à haute température que la ligase utilisée à l'étape (d).
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque initiale de séquences polynucléotidiques est générée à
partir d'un gène sauvage par étapes de mutagénèse dirigée successives, par PCR error prone, par mutagénèse aléatoire chimique, par mutagénèse aléatoire in vivo, ou en combinant des gènes de familles proches ou distinctes au sein de la même espèce ou d'espèces différents de façon à disposer d'une variété de séquences polynucléotidiques dans la banque initiale.
partir d'un gène sauvage par étapes de mutagénèse dirigée successives, par PCR error prone, par mutagénèse aléatoire chimique, par mutagénèse aléatoire in vivo, ou en combinant des gènes de familles proches ou distinctes au sein de la même espèce ou d'espèces différents de façon à disposer d'une variété de séquences polynucléotidiques dans la banque initiale.
18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la banque initiale de séquences polynucléatidiques double-brins est constituée de séquences synthétiques qui seront fragmentées à l'étape (a) ou qui peuvent constituer les fragments de l'étape (a)
19) procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, 13 à 18, caractérisé en ce que l'étape (a) consiste à soumettre la banque initiale à une hydrolyse par l'action d'enzymes de restriction ayant un grand nombre de sites de coupure sur les séquences polynucléotidiques de la banque initiale, ou en combinant plusieurs enzymes de restriction.
20) procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 12 à 18, caractérisé en ce que l'étape (a) consiste en un traitement aléatoire avec la DNAse I d'une banque initiale de séquences polynucléotidiques double brins partiellement hétérologues.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 ou 20, caractérisé en ce que l'on utilise des fragments générés par un traitement de façon aléatoire comme matrices les uns pour les autres, pour l'hybridation au cours de l'étape (c) ou de la réaction des étapes (c) et (d) simultanées.
22) Procédé selon l'une des revendications 10 ou 19, caractérisé en ce que l'étape (b) est réalisée en combinant au moins deux banques de fragments distinctes générées séparément à l'étape (a) à partir de la même banque initiale par un traitement avec des enymes de restriction différentes.
23) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'an utilise les fragments obtenus à
l'étape (a) par un traitement aven des enzymes de restriction comme matrices les uns pour les autres, pour l'hybridation au cours de l'étape (c) ou de la réaction de des étapes (c) et (d) simultanées.
l'étape (a) par un traitement aven des enzymes de restriction comme matrices les uns pour les autres, pour l'hybridation au cours de l'étape (c) ou de la réaction de des étapes (c) et (d) simultanées.
24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, 11, 13 à 17 caractérisé en ce que les fragments de l'étape (a) sont obtenus par des réactions d'amplification menées sur les séquences polynucléotidiques de la banque initiale.
25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que les réactions d'amplification sont réalisées avec des oligonucléotides amorces permettant de générer des fragments dont les extrémités sont adjacentes tout au long de la séquence d'assemblage.
26) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que les réactions d'amplification sont réalisées avec des oligonucléotides amorces permettant de générer des fragments ayant des séquences communes, lesdits fragments servant de matrice d'assemblage les uns pour les autres à l'étape (b) ou à l'étape (c).
27) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que à l'étape (a) la banque initiale est fragmentée en n fragments, n étant supérieur ou égal à trois.
28) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, 24 à 27, caractérisé en ce que la matrice d'assemblage à l'étape (b) ou (c) est une séquence polynucléotidique issue de la banque initiale ou une séquence consensus de ladite banque, simple ou double brin.
29) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, 24 à 27, caractérisé en ce que l'on utilise comme matrice d'assemblage aux étapes étapes (b) ou (c) des oligonucléotides simple ou double brin juste complémentaires de l'extrémité 3' d'un fragment et 5' du fragment adjacent.
31) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute à l'étape (b) ou (c) en plus de la matrice, des oligonucléotides, simple ou double brin, de longueur variable.
32) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, avant l'étape (e), on sépare les séquences polynucléotidiques recombinées de la matrice d'assemblage grâce à un marqueur présent sur la matrice d'assemblage ou sur les séquences polynucléotidiques recombinées.
33) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les séquences polynucléotides recombinées obtenues à l'étape (d) et éventuellement clonées sont criblées par tout moyen approprié pour sélectionner les séquences polynucléotidiques recombinées ou les clones présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence.
34) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque de séquences polynucléotidiques initiale est constituée par une ou plusieurs banques restreintes préparées par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 33, éventuellement mélangées avec d'autres séquences polynucléotidiques.
35) Une séquence polynucléotidique recombinée présentant une ou plusieurs propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence, obtenue et sélectionnée par un procédé selon l'une quelconque des revendications l à 34, ladite séquence ayant une taille supérieure à 1,5 kpb.
36) Un vecteur contenant une séquence polynucléotidique selon la revendication 35.
37) Un hôte cellulaire transformé par une séquence polynucléotidique recombinée selon la revendication 35 ou par un vecteur selon la revendication 36.
38) Une protéine codée par une séquence polynucléotidique reccmbinée selon la revendication 37.
39) Une banque constituée de séquences polynucléotidiques recombinées selon la revendication 35, ou de vecteur selon la revendication 36, ou d'hôtes cellulaires selon la revendication 37, ou de protéines selon la revendication 38.
31) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute à l'étape (b) ou (c) en plus de la matrice, des oligonucléotides, simple ou double brin, de longueur variable.
32) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, avant l'étape (e), on sépare les séquences polynucléotidiques recombinées de la matrice d'assemblage grâce à un marqueur présent sur la matrice d'assemblage ou sur les séquences polynucléotidiques recombinées.
33) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les séquences polynucléotides recombinées obtenues à l'étape (d) et éventuellement clonées sont criblées par tout moyen approprié pour sélectionner les séquences polynucléotidiques recombinées ou les clones présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence.
34) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la banque de séquences polynucléotidiques initiale est constituée par une ou plusieurs banques restreintes préparées par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 33, éventuellement mélangées avec d'autres séquences polynucléotidiques.
35) Une séquence polynucléotidique recombinée présentant une ou plusieurs propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence, obtenue et sélectionnée par un procédé selon l'une quelconque des revendications l à 34, ladite séquence ayant une taille supérieure à 1,5 kpb.
36) Un vecteur contenant une séquence polynucléotidique selon la revendication 35.
37) Un hôte cellulaire transformé par une séquence polynucléotidique recombinée selon la revendication 35 ou par un vecteur selon la revendication 36.
38) Une protéine codée par une séquence polynucléotidique reccmbinée selon la revendication 37.
39) Une banque constituée de séquences polynucléotidiques recombinées selon la revendication 35, ou de vecteur selon la revendication 36, ou d'hôtes cellulaires selon la revendication 37, ou de protéines selon la revendication 38.
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