CA2409500A1 - Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques - Google Patents
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Classifications
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Abstract
La présente invention concerne l'identification de gènes humains codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4X et s on homologue fonctionnel HNL4Y codé par un gène du chromosome Y. L'invention vise égaiement les polynucléotides codant pour les protéines HNL4X et HNL4Y mutées ou non et HNL3 mutées, les vecteurs d'expression cellulaire comprenan t les séquences d'acide nucléiques exprimant HNL3, HNL4X, HNL4Y mutées ou non, et les anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer sur un de ces peptides et/ou polynucléotides mentionnés précédemment. La présente invention concerne également (utilisation de polypeptides, de polynucléotide s, un vecteur, une cellule hôte, etlou un anticorps tels que définis précédemment pour la préparation d'une composition utile dans le traitement d'une maladie mentale ou neurologique telle (autisme, le syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome ADHB.
Description
POLYNUCLÉOTIDE ET PROTÉINE IMPLIQUÉS DANS LA
SYNAPTOGEN~SE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
aj Domaine de l'invention La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et de son orthologue marin, et dont la mutation est associée chez (homme au développement de maladies neurologiques etlou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
L'invention concerne aussi les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification de l'implication d'un défaut d'une protéine de la famille des neuroligines dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
bj Brève description de l'art antérieur L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les critères cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans l'ouvrage DSM-IV TRT"" (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme.
Ä partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe et al. (Human Molecular Genetics, 1999, 8:805-812} décrit 11 régions chromosomiques susceptibles d'être impliquées dans ie développement de l'autisme parmi lesquelles une région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genet., 1999, 104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des
SYNAPTOGEN~SE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
aj Domaine de l'invention La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et de son orthologue marin, et dont la mutation est associée chez (homme au développement de maladies neurologiques etlou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
L'invention concerne aussi les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification de l'implication d'un défaut d'une protéine de la famille des neuroligines dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
bj Brève description de l'art antérieur L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les critères cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans l'ouvrage DSM-IV TRT"" (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme.
Ä partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe et al. (Human Molecular Genetics, 1999, 8:805-812} décrit 11 régions chromosomiques susceptibles d'être impliquées dans ie développement de l'autisme parmi lesquelles une région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genet., 1999, 104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des
2 patients atteints d'autisme et Milunsky et a!. (Clin. Genet., 1999, 55:455-460) décrit des délétions en Xp22 chez des patients atteints de schizophrénie et suggère plus précisément l'implication d'une délétion en Xp22.3 dans le développement de la cette maladie psychiatrique. Toutefois, ni le gène impliqué
dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
Les neuroligines (HNLs) sont des protéines d'adhésion cellulaire qui peuvent déclencher à elles seules la synaptogenèse c'est-à-dire la formation de synapses (Scheiffele etal., Cell, 2000, 101:657-669). Les Neuroligines NL1, NL2 et NL3 ont été clonées originalement chez le rat (Ichtchenko et al. Cell 1995, 81 (3) :435-43;
Ichtchenko et al. J. Biol. Chem. 1996, 271 (5) :2676-82). Les neuroligines HNL1 et HNL2 sont localisées sur des autosomes (3q26 et 17p13). Ces gènes sont des cibles pour la susceptibilité aux maladies psychiatriques et plusieurs variations protéiques de HNL2 ont été mise en évidence par les inventeurs chez des patients autistes (R734H, G754R, A755V). Une protéine HNL4X (Human Neuroligline-4) a été décrite par Bollinger et al. (Biochem. J. 2001, 356:581-588) sans description génomique ni fonction biologique associée. D'autre part, la base de données LOCUSLINKTM (htta:/Iwww:ncbi:nim.nih.aov) du 13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951 des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en outre inconnue.
Toutes les neuroligines possèdent un domaine extràcellulaire homologue à
l'Acetylcholine esterase CACHE). Au niveau de cette partie extracellulaire, les neuroligines interagissent avec les ~-neurexines (Ichtchenko et al. Cell 1995, 81 (3) :435-4.3). Cette interaction peut être modulée par l'ACHE elle méme (Grifman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23) :13935-40). Au niveau cytoplasmique, les neuroligines interagissent avec plusieurs protéines contenant des domaines PDZ (Irie et al. Sciences 1997, 277(5331) :1511-5; Hirao et al.
J.
Biol. Chem.1998, 273(33), 21105-10; Kurschner et al. Mol. Cell Neurosci. 1999, 11(3) :161-72 ; Bolliger et al. Biochem J. 2001, 356 :581-8; Toyooka et al. J
Neurochem. 2002, 83(4) :797-806) . Parmi ces protéines, on trouve les protéines de la famille DLG1-5 (3q29, 11q13, Xq13.1, 17p13.1 et 10q22.3), la protéine S-SCAM (7q21.11 ), les protéines de la famille CIPP (MPDZ, 9p23 et INADL, 1 p31 ), la protéine CASK (Xp11).
dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
Les neuroligines (HNLs) sont des protéines d'adhésion cellulaire qui peuvent déclencher à elles seules la synaptogenèse c'est-à-dire la formation de synapses (Scheiffele etal., Cell, 2000, 101:657-669). Les Neuroligines NL1, NL2 et NL3 ont été clonées originalement chez le rat (Ichtchenko et al. Cell 1995, 81 (3) :435-43;
Ichtchenko et al. J. Biol. Chem. 1996, 271 (5) :2676-82). Les neuroligines HNL1 et HNL2 sont localisées sur des autosomes (3q26 et 17p13). Ces gènes sont des cibles pour la susceptibilité aux maladies psychiatriques et plusieurs variations protéiques de HNL2 ont été mise en évidence par les inventeurs chez des patients autistes (R734H, G754R, A755V). Une protéine HNL4X (Human Neuroligline-4) a été décrite par Bollinger et al. (Biochem. J. 2001, 356:581-588) sans description génomique ni fonction biologique associée. D'autre part, la base de données LOCUSLINKTM (htta:/Iwww:ncbi:nim.nih.aov) du 13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951 des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en outre inconnue.
Toutes les neuroligines possèdent un domaine extràcellulaire homologue à
l'Acetylcholine esterase CACHE). Au niveau de cette partie extracellulaire, les neuroligines interagissent avec les ~-neurexines (Ichtchenko et al. Cell 1995, 81 (3) :435-4.3). Cette interaction peut être modulée par l'ACHE elle méme (Grifman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23) :13935-40). Au niveau cytoplasmique, les neuroligines interagissent avec plusieurs protéines contenant des domaines PDZ (Irie et al. Sciences 1997, 277(5331) :1511-5; Hirao et al.
J.
Biol. Chem.1998, 273(33), 21105-10; Kurschner et al. Mol. Cell Neurosci. 1999, 11(3) :161-72 ; Bolliger et al. Biochem J. 2001, 356 :581-8; Toyooka et al. J
Neurochem. 2002, 83(4) :797-806) . Parmi ces protéines, on trouve les protéines de la famille DLG1-5 (3q29, 11q13, Xq13.1, 17p13.1 et 10q22.3), la protéine S-SCAM (7q21.11 ), les protéines de la famille CIPP (MPDZ, 9p23 et INADL, 1 p31 ), la protéine CASK (Xp11).
3 Au vu de ce qui précède, il est clair que la connaissance des bases moléculaires de l'autisme et tout particulièrement du gène impliqué dans la maladie est fortement souhaitée afin de permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques, de nouveaux médicaments et des tests diagnostiques.
II existe également un besoin concernant l'identification de la fonction biologique des neurofigines ainsi que (identification de la séquence nucléique et protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL3 et HNL4X.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification de gënes humains et de leur orthologue murin codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques ~ tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse. Le polynucléotide de la présente invention est caractérisé en ce qu'au moins une mutation dans la séquence en acide nucléique dudit polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Préférentiellement, la présente invention concerne un polynucléotide codant pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4X (précédemment appelée HNL4) et son homologue fonctionnel HNL4Y (précédemment appelée HNLS) codé par un gène du chromosome Y.
II existe également un besoin concernant l'identification de la fonction biologique des neurofigines ainsi que (identification de la séquence nucléique et protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL3 et HNL4X.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification de gënes humains et de leur orthologue murin codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques ~ tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse. Le polynucléotide de la présente invention est caractérisé en ce qu'au moins une mutation dans la séquence en acide nucléique dudit polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Préférentiellement, la présente invention concerne un polynucléotide codant pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4X (précédemment appelée HNL4) et son homologue fonctionnel HNL4Y (précédemment appelée HNLS) codé par un gène du chromosome Y.
4 La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour la protéine de souris MNL4 orthologue des protéines HNL4X et HNL4Y.
Selon un autre objet, la présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide tel que défini précédemment. Plus particulièrement, le polypeptide selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenése, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Selon un autre objet, la présente invention propose un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, etlou une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini précédemment;
- la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini précédemment;
- la mesure de l'activité d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de (interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires protéiques.
Un autre objet de l'invention esfi de fournir un kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, etlou d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques etlou d'une maladie mentale; etlou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ü) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de l'interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires
Selon un autre objet, la présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide tel que défini précédemment. Plus particulièrement, le polypeptide selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenése, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Selon un autre objet, la présente invention propose un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, etlou une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini précédemment;
- la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini précédemment;
- la mesure de l'activité d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de (interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires protéiques.
Un autre objet de l'invention esfi de fournir un kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, etlou d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques etlou d'une maladie mentale; etlou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ü) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de l'interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires
5 protéiques.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide non muté
codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polypeptide non muté
impliqué dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
La présente invention propose également un procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide défini précédemment ou l'activité biologique du polypeptide défini précédemment, comprenant:
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
Un autre objet de la présente invention vise une méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini précédemment.
La présente invention propose également un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un géne codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenése, caractérisé par a) l'utilisation de cellules souches dudit patient;
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide non muté
codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polypeptide non muté
impliqué dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
La présente invention propose également un procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide défini précédemment ou l'activité biologique du polypeptide défini précédemment, comprenant:
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
Un autre objet de la présente invention vise une méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini précédemment.
La présente invention propose également un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un géne codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenése, caractérisé par a) l'utilisation de cellules souches dudit patient;
6 b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide tel que défini précédemment; et c) !a réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
L'invention concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un des polynuciéotides de l'invention ou un fragment de celui-ci;
une cellule hôte contenant un pofynucléotïde etlou un vecteur selon l'invention ;
ou des anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides de (invention et/ou au moins un des polypeptides de l'invention L'invention vise également une composition contenant au moins un élément choisi dans le groupe constitué par a) un polypeptide, b) un polynucléotide, c) un vecteur, d) une cellule hôte ou e) un anticorps, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène HNL4X.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
La Figure 4 est un schéma qui montre la localisation chromosomique et l'évolution des gènes HNL4X et HNL4Y.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes Neuroligines humaines.
Les Figures fia, 6b et 6c montrent le résultat de l'analyse par SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène codant pour la protëine HNL4X ainsi que la séquence de cette mutation:
La Figure ? est un schéma qui montre ia localisation de la protéine HNL4X et les effets de la mutation sur HNL4X.
La Figure 8a représente la séquence génomique (SEQ fD NO: 1) du gène humain HNL4X sauvage (non muté).
La Figure 8b représente la séquence en acides nucléiques (SEQ ID NO : 16) de l'exon 1 de la figure 8a.
L'invention concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un des polynuciéotides de l'invention ou un fragment de celui-ci;
une cellule hôte contenant un pofynucléotïde etlou un vecteur selon l'invention ;
ou des anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides de (invention et/ou au moins un des polypeptides de l'invention L'invention vise également une composition contenant au moins un élément choisi dans le groupe constitué par a) un polypeptide, b) un polynucléotide, c) un vecteur, d) une cellule hôte ou e) un anticorps, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène HNL4X.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
La Figure 4 est un schéma qui montre la localisation chromosomique et l'évolution des gènes HNL4X et HNL4Y.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes Neuroligines humaines.
Les Figures fia, 6b et 6c montrent le résultat de l'analyse par SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène codant pour la protëine HNL4X ainsi que la séquence de cette mutation:
La Figure ? est un schéma qui montre ia localisation de la protéine HNL4X et les effets de la mutation sur HNL4X.
La Figure 8a représente la séquence génomique (SEQ fD NO: 1) du gène humain HNL4X sauvage (non muté).
La Figure 8b représente la séquence en acides nucléiques (SEQ ID NO : 16) de l'exon 1 de la figure 8a.
7 La Figure 9 représente la séquence d'ADN complémentaire (SEQ ID NO: 2) du gène humain HNL4X sauvage (non muté).
La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3) de fa protéine humaine HNL4X sauvage (non muté), La Figure 11a représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 4) du gène humain HNL4Y.
La Figure 11b représente la séquence en acides nucléiques {SEQ ID NO : 17) de l'exon 1 de la figure 11a.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 5) du gène humain HNL4Y sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés {SEQ ID NO : 6) de la protéine humaine HNL4Y sauvage.
La Figure 14 représente !a séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 7) d'un transcrit alternatif du gène humain HNL4Ysauvage.
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 8) correspondant â la séquence alternative de la Figure 14.
La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la protéine humaine HNL4X mutée.
La Figure 17 montre la localisation chromosomique des gènes HNL3, HNL4X et HNL4Y et pedigree d'une famille présentant une mutation dans HNL4X chez un garçon autiste et un garçon atteint d'un syndrome d'Asperger.
La Figure 18 est un schéma qui montre la conservation des mutations HNL3.
La Figure 19a montre la séquence en acides nucléiques de l'ADNc de MNL4 (orthologue de HNL4X et HNL4Y).
La Figure 19b représente la séquence en acides aminés de la protéine MNL4.
La Figure 20 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes HNL1, HNL2 et HNL3, ainsi que la localisation des mutations observées chez HNL3.
La Figure 21 est un schéma qui montre la structure génomique de HNL4X et HNL4Y.
La Figure 22 montre une portion de la séquence en acides aminés (SEQ ID
N0:10) de la protéine HNL3 mutée en position 451.
La Figure 23 montre une autre portion de la séquence en acides aminés (SEQ
ID N0:11) de la protéine HNL3 mutée en position 796.
La Figure 24 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID
NO : 12) du transcrit HNL3 sauvage.
La Figure 25 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID
NO : 13) du transcrit HNL3 mutë.
La Figure 26 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO : 14) de la protéine humaine HNL3 sauvage.
La Figure 27 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO : 15) de la protéine humaine HNL3 mutée.
DESCRIPTION DÉTAfLLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la séquence génomique du gène HNL4X localisé en Xp22.3 et d'un homologue fonctionnel HNL4Y placé sur le chromosome Y localisé en Yq11.22 ainsi que leur orthologue murin MLN4.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication des protéines de la synaptogenèse, en particulier HNL3 et HNL4 dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques telle que l'autisme.
1. Polypeptide et polynuCléotide Selon un premier aspect; la prësente invention vise un polypeptide isolé
ou purifié, qui, dans sa forme sauvage (i.e. non-muté), est impliqué dans la synaptogenèse, dont au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au développemenf de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques.
Par « désordres mentaux ou maladies psychiatriques », on entends des maladies telles l'autisme, le Syndrome d'Asperger, la schizophrénie et le syndrome de ADHD (Attention Deficit Hyperactivity Disorder).
Préférablement, le polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement, le polypeptide consiste en la protéine HNL3, la HNL4X ou la protéine HNL4Y. Avantageusement; lorsque le polypeptide est le HNL3, il comprends une séquence d'acides aminés selon la SEQ ID NO : 13 et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO : 13. Lorsque le polypeptide de (invention est ta HNL4X ou la protéine HNL4Y, il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ 1D N0:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID N0:8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID N0:6 ou de la SEQ ID N0:8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage, de préférence une neuroligine telle que HNL3, HNL4X ou HNL4Y.
Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence peptidique substantiellement identique! au moins en partie, à la séquence peptidique de la protéine sauvage. II peut s'agir par exemple de polypeptides modifiés chimiquement ayant une séquence peptidique 100% identique à une portion de la protéine sauvage. 11 peut s'agir aussi de polypeptides hybrides ayant une première portion 100% identique à une première portion de fa protéine sauvage et une seconde portion aucunement/partiellement identique à une seconde portion de la protéine sauvage. II peut s'agir encore de polypeptides ayant une homologie totalelpartielle avec une portion de la protéine sauvage.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage; on entend tous les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution de un ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. II peut également s'agir d'une modification apportée par l'addition de channes carbonées fixées sur au moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la protéine humaine HNL3, HNL4X ou HNL4Y.
Selon un mode de réalisation privilégié, et dans le cas où le polypeptide est un HNL3 muté selon la présent invention, il possède la SEQ ID N0:10, la 5 SEQ ID N0:11 ou la SEQ ID NO:15, et une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID
N0:10, la SEQ ID NO:11 ou la SEQ ID N0:15. Dans le cas où le polypeptide est un HNL4X muté ou un HN!_4Y muté selon la présent invention, il possède la SEQ
ID N0:9 ou une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides 10 aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID N0:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "polypeptide" est définit comme étant tout peptide ou protéine comprenant au moins deux acide aminés liés par un lien peptidique modifié ou non. Le terme polypeptide se réfère à
des molécules de courtes chaînes telles que des peptides, oligopeptides ou oligomères ou a des longues chaînes telles des protéines. Un polypeptide selon la présente invention peut comprendre des acides aminés modifiés. Ainsi, le polypeptide de la présente invention peut également être modifié par un procédé
naturel tel que les modifications post-transcriptionel ou par un procédé
chimique.
Quelques exemples de ces modifications sont: acétylation, acylation, ADP-ribosylation, amidafion, liaison covalente avec la flavine, liaison covalente avec un hème, liaison covalente avec un nucléotide ou un dérivé nucléotidique, liaison avec un lipide ou un dérivé lipidique, liaison covalente avec un phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de lien Bisulfure, déméthylation, formation de molécule cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, hydroxylation, iodination, méthylation, oxidation, phosphorylation, racérnisation, hydroxyfation; etc. Ainsi, toute modification du polypeptide qui n'a pas pour effet d'éliminer les caractéristiques biochimiques du polypeptide d'origine, c'est-à-dire la capacité de former des synapses fonctionnelles, est couverte dans la portée de la présente invention.
Selon un aspect connexe, (invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus particulièrement un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques etlou à une prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies psychiatriques.
Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c'est-à-dire, si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucl'eotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification etlou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant "isolé". D'ai;lleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit organisme.
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN
possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées (ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucléotides selon la présent invention. Tout polynucléotide qui ont été
modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui ont conservé les propriétés biochimiques du polypeptide d'origine c'est-à-dire qui a conservé son pouvoir de former des synapses fonctionnelles, est incluse dans la portée de la présente invention.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL3 ou un fragment de cette protéine, cette ' dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 14.
Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:12, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ
ID NO:12.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL4X ou HNL4Y ou un fragment de cette protéine; cette dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8. Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:1, la SEQ ID N0:2, la SEQ ID N0:4, la SEQ ID N0:5, la SEQ ID N0:7, la SEQ ID N0:16, 1a SEQ ID N0:17, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ouplus dérivées de ces séquences.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour une protéine HNL3 muté ou HNL4X mutée. Dans le cas ou la protéine est la HNL4X, le polynucléotide est muté de telle sorte que la mutation provoque une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide de l'invention comprend la SEQ ID N0:1 et la mutation consiste est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9 (ORF).
Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison précoce de la protéine (D396stop). Dans le cas ou la protéine mutée est Ia HNL3, la mutation provoque une modification de la séquence protéique telle qu'une substitution d'acide aminé à la position 451 etlou 796 de la Figure 18 ou 21.
Plus particulièrement, la mutation produite à ia position 451 consiste en la substitution d'une arginine par une cystéine, tandis que la mutation produite à la position consiste en la substitution d'une asparagine par une sérine. Cet acide aminé, arginine 8451, est localisé dans le domaine acétylcholine esterase des neuroligines et est extrêmement conservé dans toutes les neuroligines séquencées à ce jour et dans les acétylcholine esterases de poissons, d'oiseaux et de reptiles (Figure 6) Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon !a présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée; ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de (invention saura obtenir différents polynucléotideslpolypeptides et elfe saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotideslpolypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
2. Vecteur, Anticorps et Cellule Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage etlou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protëines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera pas décrite plus en détail.
Les polypeptides et pofynucléotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bïen connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuons cultures of fused tells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-497). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps sont de type « humanisés ». Une personne versée dans le domaine de par ses connaissances générales saura comment préparer ces types d'anticorps.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "vecteur" se réfère à
une construction polynucléotidique conçu pour être transfecté dans différents types cellulaires. De ce fait ces vecteurs visent les vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'une séquence nuctéotidique dans une cellule hôte; les vecteurs de clonage conçus pour l'isolation, propagation et la réplication de nucléotides insérés; les vecteurs viraux conçu pour la production de virus recombinant ou de particule virale (viral-like particle); ou des vecteurs navettes qui comprennent des attributs de plus d'un vecteur.
3. Méthodes et Procédé d'utilisation Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNl_4Y. Des exemples de polynucléotides non mutés sont donnés précédemment.
L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL3 ou HNL4X. Préférablement les cellules dans lequel le polynucléotide est inséré sont des cellules souches. Des exemples de polynucléotides satisfaisant sont données précédemment.
e Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant:
a) l'utilisation de cellules souches du patient;
5 b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL3 ou HNL4X; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de 10 traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, les polynucléotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer dans les cellules et le mode et la quantité de polynucléotides ou de cellules devant être administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: ia nature du traitement, la séquence exacte des polynucléotides; le stade de ta 15 maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation, la stabilisation et/ou la reconnaissance des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques etlou une maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger..
Ainsi, le procédé comprend au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène;
- la détection de la présence d'une protéïne impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques. Un procédé pour mesurer une telle interaction est par exemple décrit dans Ichtchenko et al. (J. Biol. Chem. 1996, 271 (5) :2676-82) ou Grifman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23) :13935-4.0).
Selon un mode de réalisation privilégié; le procédé comprend:
a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse; l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN
messager.
Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse) pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale: Selon un mode de réalisation préféré; le kit comprend au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide, ces éléments permettant:
i) la détection d'une mutatïon dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; etlou .
ü) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques. , Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement pour une protéine appartenant à fa famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNL4Y.
Avantageusement, le gène codeï dans sa forme sauvage, pour une protéine comprenant la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8 ou la SEQ ID NO : 14. Plus préférablement, le gène comprend la SEQ ID N0:1, la SEQ !D N0:4 ou la SEQ ID NO : 12.
La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au développement 'de l'autisme ou du Syndrome d'Asperges ouvre la porte à la découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter la maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide codé par le polynucléotide tel que défini précédemment; ou l'activité
biologique du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé de tri comprend:
a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
4. Compositions La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucléotides les codant pour la préparation de compositions thérapeutiques utile dans le traitement d'une maladie mentale ou neurologique, tel l'autisme, le Syndrome d'Asperges; la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un élément choisi dans le groupe constitué par - un polynucléotide selon la présente invention;
- un polypeptide selon la présente invention;
- un anticorps selon 1a présente invention;
- un vecteur selon la présente inventïon; et - une cellule hôte selon fa présente invention.
Les compositions selon ia présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée.
Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez l'humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et la quantité devant être administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que 1'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Introduc~on Un locus de prédisposition à l'autisme a été suggéré en Xp22.3 par l'observation de plusieurs délétions chromosomiques indépendantes: et de no~o dans cette région. La taille de la région critique supprimée chez ces patients était approximativement de 10 Mb, délimitée par DXYS232X (6 cM) et DXS7103 (16 cM). Ä l'appui de ces résultats, !'analysa globale du génome effectuée par l'étude PARIS (Philippe et al., 1999) indique que le LOD maximal pour le chromosome X
est localisé dans cette région (11 cM) Dans cet intervalle, nous avons identifié le gène humain de la neuroligine 4 (HNL4~, codant un nouveau membre de la famille des neuroligines (Scheiffele et al., 2000; Song et al., 1999). Ces molécules d'adhésion, cellulaire possèdent une homologie avec les acétylcholines estérases et sont spécifiquement localisées dans la membrane postsynaptique des synapses excitatrices (Song et al., 1999). Elles sont des facteurs cruciaux pour la formation des synapses fonctionnelles car l'expression des neuroligines dans des cellules HeLa ou de reins peut déclencher le développement de structures présynaptiques dans les neurones en contact (Scheiffele et al., 2000). Nous avons identifié cinq gènes HNL dans le génome humain, localisés sur les chromosomes 3q26 (HNL1), 17p13 (HNL2), Xq13 (HNL3), Xp22.3 {HNL4X) et Yq11.2 (HNL4Y). La phylogénie des neuroligines uggère que HNL3 est l'ancêtre commun de HNL4X et HNL4Y.
Le profil d'expression des HNLs a été déterminé par RT-PCR spécifiques dans différents tissus de cerveaux adultes (ma"les et femelles). L'expression des gènes HNLl-3 et de leurs transcrits alternatifs est retrouvée dans toutes les régions de cerveau. HNL4X et HNL4Y sont exprimés à des niveaux. semblables dans le cerveau mâlè sans difFérences significatives entre les différents tissus.
Comme attendu, HNL4Y n'est pas exprimé dans le cerveau femelle, tandis que HNL4X
l'est.
Exemple 1 : Caractérisation des gènes HNL4X et HNL4Y et leur implication dans les syndromes ps,Ychiatriaues.
L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4X localisé sur le chromosome X et HNL4Y localisé sur le chromosome Y ont commencé à
diverger, il y a environ 40 millions d'années, pendant l'évolution des primates.
Alors que tous les gènes du chromosome Y qui ont divergé à cette date sont devenus des pseudo gènes (gènes inactifs), HNL4Y est fortement conservé
(Table 1 ).
Table 1: conservation des gènes HNL4X et HNL4Y au cours de l'évolution Paire de Ks KA Ks/KA DivergenceDivergenceSquence gne ADN Protine compare (~) (~) (nuclotides) Group 4 GYG2JGYG2P* 0.11 0.06 1.8 7 12 525 ARSDJARSDP* 0.09 0.07 1.3 7 13 846 ARSE/ARSEP* 0.05 0.04 1.2 4 9 615 Paire de Ks KA KsIKA DivergenceDivergenceSquence gne ADN Protine compare (%~ (lo) (nuciotides) _ _ 0.03 ___ 5 8 1020 PRKXIY 0.07 2.3 HNL4XI4Y 0.079 0.012 6.456 3 2 2451 STSISTSP* 0.12 0.10 1.2 11 18 852 KAL1/KALP* 0.07 0.06 1.2 6 12 1302 AMELXIY 0.07 0.07 1.0 7 12 576 Croup 3 TB4XIY 0.29 0.04 7.3 7 7 135 EI F 1 AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432 2FX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394 DFFRXIY 0.33 0.05 6.6 11 9 7671 DBXIY 0.36 0.04 9.0 12 9 1932 CASK/CASKP* 0.24 0.22 1.1 15 32 156 UTXIY 0.26 0.08 3.3 12 15 4068 Croup 2 UBE1XIY 0.58 0.07 8.3 16 13 693 SMCXIY 0.52 0.08 6.5 17 15 4623 Croup ~
RPS4XIY 0.97 0.05 19 18 18 792 RBMX/Y 0.94 0.25 3.8 29 38 1188 SOX3/SRY 1.25 0.19 6.6 28 29 264 PCDHXIY 0.006 0.008 0.809 1 2 2850 Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes (KA) de tous les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y. Le rapport KSlKA est une indication de la conservation des 5 gènes. KS est le taux de substitution synonyme par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la séquence de la protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme qui représente les modifications qui changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1 alors le gène n'est pas conservé car il y a autant de modification synonymes et 10 non-synonymes. C'est le cas pour les cooptes XlY possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y (par ex. KAL11KALP*). Si KS/KA >1, alors le gène varie au cours de l'évolution mais la protéine est bien conservée.
C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la variation génétique entre ces gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences protéiques 15 de HNL4X et HNL4Y.
Pour la détection de mutations sur le gène HNL4X, les étapes suivantes ont été utilisées:
Matérïeïs et Méthodes Identification de ta séquence des gènes HNL4X. HNL4Y et MNL4 L'isolement des gènes HNL4X et HNL4Y a été efFectué par l'analyse informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par l'amplification des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux.
Analyse informatique Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du génome humain {http:llqenome.usc.edu et http/lwww.ensembl.orgl genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le.marqueur génétique qui montre la liaison la plus' significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et al.
{1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était localisë
dans un gène putatif KIAA12fi0 et qu'il y existait un homologue putatif localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de !a séquence génomique.
Une analyse par alignement de séquence {BLAST) et un arbre phylogénétique regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de la famille des neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4X et HNL4Y.
Analyse des transcrits HNL4X ef HNL4Y
Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes (n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux.
Les ADNc complets des ARNm HNL4X et HNL4Y ont été retrotranscrits; amplifiés et directement séquencés. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et le séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
Séauençaae des grènes HNL4X et HNL4Y chez les surets autistes et Asperger Chaque exon des gènes HNL4X et HNL4Y a été amplifié et séquencé à
partir de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués dans Ie Tableau 3.
Tableau 2. Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et squencer les ADNc de HNL4X et HNL4Y.
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG SEQ ID NO : 18 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ ID NO : 19 Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO : 20 HNLXY4 GCTCTGAATGATGGCCTTCTG SEQ ID NO : 21 Exons 4~ HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC SEQ ID NO : 22 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAARTAG SEQ ID NO : 23 Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO : 24 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ iD NO : 25 Pour les amorces utilisation du code universel dgnres, : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K{GT), V{ACG),D(AGT), B(CGT), N(ACGT) H(ACT), Tableau 3. Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les gnes HNL4X et HNL4Y.
Exons Amorces Squences SEQ ID NO
Exon 1a HNL4X HNLXYE1aFGAAACAACGAATTTCCTCCAAA 26 HNLXYE1aR AGTGAGGCTTTCCATCCTTTGC 27 Exon 1b HNL4X HNLXE1F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC 28 Exon 1 HNL4Y HNLYE1F GGGGTGCTTCTTTTGGGAGGCT 30 Exon 2 HNLXIY HNLXYE2F GGATG'fGGATGCAGATTTGAA 32 HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG 33 Exon 3 HNL4X/Y HNLXYE3FTGTGTTTCCGTACTTGGCTTT 34 Exon 4 HNL4x HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT 36 Exon 4 HNL4Y HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT 38 Exon 5 HNL4XlY HNLXYESdFTG'fCCRCAATTTTGCACCTGC 40 Exons Amorces Séquences SEQ ID NO
HNLXYESdR AGGAYAGTGATACCCCAACA 41 Exon 6 HNL4XlY HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG 42 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG 43 Pour les amorces dégénérées; utilisation du code universel : M(AC), R(AG),.
W(AT), S(CG);
Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Tableau 4. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de f'ADNc MNL4 (souris 57BL6).
Amorce Squence SEQ ID NO
MNL4R8 GTAGCCAAGGCCCCTGCATG'fC 45 Tableau 5. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de MNL4 en trois PCR d'environ 1 kb.
Amorce Squence SEQ ID NO
.
Tableau 6. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de HNL3.
Amorce Squence SEQ ID NO
HNL3E3Fbis TTGAGCTCCAGGTTGAGCAACC 54 HNL3E5R GGAAGATGAGTGAAGGGGTACC' S9 Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont été amplifiées.
Ainsi, 140 garçons et 18 filles autistes ont été testés pour la majorité de la partie codante HNL4X/4Y.
Dans une famille Suédoise avec deux frères atteints, l'un avec un autisme et l'autre présentant un syndrome d'Asperger, une thymidine supplémentaire a été identifiée au nucléotide 1186 du gène HNL4X, créant un codon stop (Figure 17). Cette mutation (D396stop) est localisée dans le domaine estérase, produisant un arrêt prématuré de la protéine et supprimant le domaine transmembranaire. Ce changement est hérité de la mère, mais est absent chez la grand-mère maternelle, chez ies deux tantes maternelles et chez l'enfant non atteint, indiquant le statut de no~o de cette mutation chez la mère des garçons atteints. En outre, cette mutation n'a pas été trouvée dans 350 contrôles (250 femmes et 100 hommes).
D'autre part, le ratio garçon/fille; lequel est de quatre pour l'autisme et de neuf pour de Syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle HNL4Xf4Y influe sur la synaptogenèse et la mutation de HNL4XI4Y constitue un facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le Syndrome d'Asperges.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première mutation décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose tuberculeuse, etc.).
Exempte 2 : Caractérisation du a'ene HNL3 et son implication dans les syndromes asvchiatripues.
Lors de la recherche de mutations dans HNL3, le gène ancestral de HNL4XlY localisé dans la région Xql3, chez deux familles indépendantes, deux changements d'acides aminés situés dans des régions fortement conservées de la protéine ont été identifiés. Une des deux familles est très semblable à la première famille mutée dans HNL4X. Les deux frères atteints, le premier d'autisme et le second du syndrome d'Asperger, reçoivent la mutation de leur 5 mère. De façon intéressante, la mère a aussi un frère avec syndrome d'Asperger et d'autres parents avec des désordres psychiatriques. La mutation (R451 C) est située dans le domaine estérase de la protéine et concerne un acide aminé
conservé au cours de l'évolution car il est présent dans toutes les neuroligines (y compris chez D: melanogaster) et dans toutes les acétylcholine estérases de 10 mammifères, de poissons, de reptiles et d'oiseaux séquencées à ce jour {voir Figure 6). La mutation est absente chez 200 contrôles (100 femmes et 100 hommes). Ces résultats soutiennent le rôle des neuroligines dans l'étiologie de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et du syndrome d'Asperger. MNL4, forthologue de HNL4X chez la souris a aussi été identifié.
Ce 15 nouveau gène devrait permettre fa compréhension du déficit induit par une mutation telle que la mutation HNL4X dans l'autisme (voir Figure 19).
Le dernier tour du génome effectué sur des familles d'autistes Finlandais (Auranen, et al. 2002) a identifié 2 pics de liaison très significatifs en 3q26 (exactement où est situé HNL9) et en Xq13-21 (exactement où est situé HNL3).
20 La région Xp22.3, contenant HNL4X, est aussi délétée chez deux patients schizophrènes. II est donc possible que les neuroligines soient aussi responsables de la susceptibilité à ce syndrome (la schizophrénie affecte 1 %
de la population).
La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3) de fa protéine humaine HNL4X sauvage (non muté), La Figure 11a représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 4) du gène humain HNL4Y.
La Figure 11b représente la séquence en acides nucléiques {SEQ ID NO : 17) de l'exon 1 de la figure 11a.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 5) du gène humain HNL4Y sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés {SEQ ID NO : 6) de la protéine humaine HNL4Y sauvage.
La Figure 14 représente !a séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 7) d'un transcrit alternatif du gène humain HNL4Ysauvage.
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 8) correspondant â la séquence alternative de la Figure 14.
La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la protéine humaine HNL4X mutée.
La Figure 17 montre la localisation chromosomique des gènes HNL3, HNL4X et HNL4Y et pedigree d'une famille présentant une mutation dans HNL4X chez un garçon autiste et un garçon atteint d'un syndrome d'Asperger.
La Figure 18 est un schéma qui montre la conservation des mutations HNL3.
La Figure 19a montre la séquence en acides nucléiques de l'ADNc de MNL4 (orthologue de HNL4X et HNL4Y).
La Figure 19b représente la séquence en acides aminés de la protéine MNL4.
La Figure 20 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes HNL1, HNL2 et HNL3, ainsi que la localisation des mutations observées chez HNL3.
La Figure 21 est un schéma qui montre la structure génomique de HNL4X et HNL4Y.
La Figure 22 montre une portion de la séquence en acides aminés (SEQ ID
N0:10) de la protéine HNL3 mutée en position 451.
La Figure 23 montre une autre portion de la séquence en acides aminés (SEQ
ID N0:11) de la protéine HNL3 mutée en position 796.
La Figure 24 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID
NO : 12) du transcrit HNL3 sauvage.
La Figure 25 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID
NO : 13) du transcrit HNL3 mutë.
La Figure 26 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO : 14) de la protéine humaine HNL3 sauvage.
La Figure 27 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO : 15) de la protéine humaine HNL3 mutée.
DESCRIPTION DÉTAfLLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la séquence génomique du gène HNL4X localisé en Xp22.3 et d'un homologue fonctionnel HNL4Y placé sur le chromosome Y localisé en Yq11.22 ainsi que leur orthologue murin MLN4.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication des protéines de la synaptogenèse, en particulier HNL3 et HNL4 dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques telle que l'autisme.
1. Polypeptide et polynuCléotide Selon un premier aspect; la prësente invention vise un polypeptide isolé
ou purifié, qui, dans sa forme sauvage (i.e. non-muté), est impliqué dans la synaptogenèse, dont au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au développemenf de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques.
Par « désordres mentaux ou maladies psychiatriques », on entends des maladies telles l'autisme, le Syndrome d'Asperger, la schizophrénie et le syndrome de ADHD (Attention Deficit Hyperactivity Disorder).
Préférablement, le polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement, le polypeptide consiste en la protéine HNL3, la HNL4X ou la protéine HNL4Y. Avantageusement; lorsque le polypeptide est le HNL3, il comprends une séquence d'acides aminés selon la SEQ ID NO : 13 et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO : 13. Lorsque le polypeptide de (invention est ta HNL4X ou la protéine HNL4Y, il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ 1D N0:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID N0:8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID N0:6 ou de la SEQ ID N0:8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage, de préférence une neuroligine telle que HNL3, HNL4X ou HNL4Y.
Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence peptidique substantiellement identique! au moins en partie, à la séquence peptidique de la protéine sauvage. II peut s'agir par exemple de polypeptides modifiés chimiquement ayant une séquence peptidique 100% identique à une portion de la protéine sauvage. 11 peut s'agir aussi de polypeptides hybrides ayant une première portion 100% identique à une première portion de fa protéine sauvage et une seconde portion aucunement/partiellement identique à une seconde portion de la protéine sauvage. II peut s'agir encore de polypeptides ayant une homologie totalelpartielle avec une portion de la protéine sauvage.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage; on entend tous les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution de un ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. II peut également s'agir d'une modification apportée par l'addition de channes carbonées fixées sur au moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la protéine humaine HNL3, HNL4X ou HNL4Y.
Selon un mode de réalisation privilégié, et dans le cas où le polypeptide est un HNL3 muté selon la présent invention, il possède la SEQ ID N0:10, la 5 SEQ ID N0:11 ou la SEQ ID NO:15, et une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID
N0:10, la SEQ ID NO:11 ou la SEQ ID N0:15. Dans le cas où le polypeptide est un HNL4X muté ou un HN!_4Y muté selon la présent invention, il possède la SEQ
ID N0:9 ou une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides 10 aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID N0:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "polypeptide" est définit comme étant tout peptide ou protéine comprenant au moins deux acide aminés liés par un lien peptidique modifié ou non. Le terme polypeptide se réfère à
des molécules de courtes chaînes telles que des peptides, oligopeptides ou oligomères ou a des longues chaînes telles des protéines. Un polypeptide selon la présente invention peut comprendre des acides aminés modifiés. Ainsi, le polypeptide de la présente invention peut également être modifié par un procédé
naturel tel que les modifications post-transcriptionel ou par un procédé
chimique.
Quelques exemples de ces modifications sont: acétylation, acylation, ADP-ribosylation, amidafion, liaison covalente avec la flavine, liaison covalente avec un hème, liaison covalente avec un nucléotide ou un dérivé nucléotidique, liaison avec un lipide ou un dérivé lipidique, liaison covalente avec un phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de lien Bisulfure, déméthylation, formation de molécule cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, hydroxylation, iodination, méthylation, oxidation, phosphorylation, racérnisation, hydroxyfation; etc. Ainsi, toute modification du polypeptide qui n'a pas pour effet d'éliminer les caractéristiques biochimiques du polypeptide d'origine, c'est-à-dire la capacité de former des synapses fonctionnelles, est couverte dans la portée de la présente invention.
Selon un aspect connexe, (invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus particulièrement un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques etlou à une prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies psychiatriques.
Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c'est-à-dire, si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucl'eotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification etlou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant "isolé". D'ai;lleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit organisme.
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN
possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées (ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucléotides selon la présent invention. Tout polynucléotide qui ont été
modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui ont conservé les propriétés biochimiques du polypeptide d'origine c'est-à-dire qui a conservé son pouvoir de former des synapses fonctionnelles, est incluse dans la portée de la présente invention.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL3 ou un fragment de cette protéine, cette ' dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 14.
Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:12, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ
ID NO:12.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL4X ou HNL4Y ou un fragment de cette protéine; cette dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8. Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:1, la SEQ ID N0:2, la SEQ ID N0:4, la SEQ ID N0:5, la SEQ ID N0:7, la SEQ ID N0:16, 1a SEQ ID N0:17, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ouplus dérivées de ces séquences.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour une protéine HNL3 muté ou HNL4X mutée. Dans le cas ou la protéine est la HNL4X, le polynucléotide est muté de telle sorte que la mutation provoque une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide de l'invention comprend la SEQ ID N0:1 et la mutation consiste est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9 (ORF).
Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison précoce de la protéine (D396stop). Dans le cas ou la protéine mutée est Ia HNL3, la mutation provoque une modification de la séquence protéique telle qu'une substitution d'acide aminé à la position 451 etlou 796 de la Figure 18 ou 21.
Plus particulièrement, la mutation produite à ia position 451 consiste en la substitution d'une arginine par une cystéine, tandis que la mutation produite à la position consiste en la substitution d'une asparagine par une sérine. Cet acide aminé, arginine 8451, est localisé dans le domaine acétylcholine esterase des neuroligines et est extrêmement conservé dans toutes les neuroligines séquencées à ce jour et dans les acétylcholine esterases de poissons, d'oiseaux et de reptiles (Figure 6) Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon !a présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée; ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de (invention saura obtenir différents polynucléotideslpolypeptides et elfe saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotideslpolypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
2. Vecteur, Anticorps et Cellule Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage etlou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protëines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera pas décrite plus en détail.
Les polypeptides et pofynucléotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bïen connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuons cultures of fused tells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-497). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps sont de type « humanisés ». Une personne versée dans le domaine de par ses connaissances générales saura comment préparer ces types d'anticorps.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "vecteur" se réfère à
une construction polynucléotidique conçu pour être transfecté dans différents types cellulaires. De ce fait ces vecteurs visent les vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'une séquence nuctéotidique dans une cellule hôte; les vecteurs de clonage conçus pour l'isolation, propagation et la réplication de nucléotides insérés; les vecteurs viraux conçu pour la production de virus recombinant ou de particule virale (viral-like particle); ou des vecteurs navettes qui comprennent des attributs de plus d'un vecteur.
3. Méthodes et Procédé d'utilisation Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNl_4Y. Des exemples de polynucléotides non mutés sont donnés précédemment.
L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL3 ou HNL4X. Préférablement les cellules dans lequel le polynucléotide est inséré sont des cellules souches. Des exemples de polynucléotides satisfaisant sont données précédemment.
e Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant:
a) l'utilisation de cellules souches du patient;
5 b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL3 ou HNL4X; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de 10 traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, les polynucléotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer dans les cellules et le mode et la quantité de polynucléotides ou de cellules devant être administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: ia nature du traitement, la séquence exacte des polynucléotides; le stade de ta 15 maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation, la stabilisation et/ou la reconnaissance des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques etlou une maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger..
Ainsi, le procédé comprend au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène;
- la détection de la présence d'une protéïne impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques. Un procédé pour mesurer une telle interaction est par exemple décrit dans Ichtchenko et al. (J. Biol. Chem. 1996, 271 (5) :2676-82) ou Grifman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23) :13935-4.0).
Selon un mode de réalisation privilégié; le procédé comprend:
a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse; l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN
messager.
Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse) pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale: Selon un mode de réalisation préféré; le kit comprend au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide, ces éléments permettant:
i) la détection d'une mutatïon dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; etlou .
ü) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques. , Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement pour une protéine appartenant à fa famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNL4Y.
Avantageusement, le gène codeï dans sa forme sauvage, pour une protéine comprenant la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8 ou la SEQ ID NO : 14. Plus préférablement, le gène comprend la SEQ ID N0:1, la SEQ !D N0:4 ou la SEQ ID NO : 12.
La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au développement 'de l'autisme ou du Syndrome d'Asperges ouvre la porte à la découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter la maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide codé par le polynucléotide tel que défini précédemment; ou l'activité
biologique du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé de tri comprend:
a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
4. Compositions La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucléotides les codant pour la préparation de compositions thérapeutiques utile dans le traitement d'une maladie mentale ou neurologique, tel l'autisme, le Syndrome d'Asperges; la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un élément choisi dans le groupe constitué par - un polynucléotide selon la présente invention;
- un polypeptide selon la présente invention;
- un anticorps selon 1a présente invention;
- un vecteur selon la présente inventïon; et - une cellule hôte selon fa présente invention.
Les compositions selon ia présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée.
Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez l'humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et la quantité devant être administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que 1'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Introduc~on Un locus de prédisposition à l'autisme a été suggéré en Xp22.3 par l'observation de plusieurs délétions chromosomiques indépendantes: et de no~o dans cette région. La taille de la région critique supprimée chez ces patients était approximativement de 10 Mb, délimitée par DXYS232X (6 cM) et DXS7103 (16 cM). Ä l'appui de ces résultats, !'analysa globale du génome effectuée par l'étude PARIS (Philippe et al., 1999) indique que le LOD maximal pour le chromosome X
est localisé dans cette région (11 cM) Dans cet intervalle, nous avons identifié le gène humain de la neuroligine 4 (HNL4~, codant un nouveau membre de la famille des neuroligines (Scheiffele et al., 2000; Song et al., 1999). Ces molécules d'adhésion, cellulaire possèdent une homologie avec les acétylcholines estérases et sont spécifiquement localisées dans la membrane postsynaptique des synapses excitatrices (Song et al., 1999). Elles sont des facteurs cruciaux pour la formation des synapses fonctionnelles car l'expression des neuroligines dans des cellules HeLa ou de reins peut déclencher le développement de structures présynaptiques dans les neurones en contact (Scheiffele et al., 2000). Nous avons identifié cinq gènes HNL dans le génome humain, localisés sur les chromosomes 3q26 (HNL1), 17p13 (HNL2), Xq13 (HNL3), Xp22.3 {HNL4X) et Yq11.2 (HNL4Y). La phylogénie des neuroligines uggère que HNL3 est l'ancêtre commun de HNL4X et HNL4Y.
Le profil d'expression des HNLs a été déterminé par RT-PCR spécifiques dans différents tissus de cerveaux adultes (ma"les et femelles). L'expression des gènes HNLl-3 et de leurs transcrits alternatifs est retrouvée dans toutes les régions de cerveau. HNL4X et HNL4Y sont exprimés à des niveaux. semblables dans le cerveau mâlè sans difFérences significatives entre les différents tissus.
Comme attendu, HNL4Y n'est pas exprimé dans le cerveau femelle, tandis que HNL4X
l'est.
Exemple 1 : Caractérisation des gènes HNL4X et HNL4Y et leur implication dans les syndromes ps,Ychiatriaues.
L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4X localisé sur le chromosome X et HNL4Y localisé sur le chromosome Y ont commencé à
diverger, il y a environ 40 millions d'années, pendant l'évolution des primates.
Alors que tous les gènes du chromosome Y qui ont divergé à cette date sont devenus des pseudo gènes (gènes inactifs), HNL4Y est fortement conservé
(Table 1 ).
Table 1: conservation des gènes HNL4X et HNL4Y au cours de l'évolution Paire de Ks KA Ks/KA DivergenceDivergenceSquence gne ADN Protine compare (~) (~) (nuclotides) Group 4 GYG2JGYG2P* 0.11 0.06 1.8 7 12 525 ARSDJARSDP* 0.09 0.07 1.3 7 13 846 ARSE/ARSEP* 0.05 0.04 1.2 4 9 615 Paire de Ks KA KsIKA DivergenceDivergenceSquence gne ADN Protine compare (%~ (lo) (nuciotides) _ _ 0.03 ___ 5 8 1020 PRKXIY 0.07 2.3 HNL4XI4Y 0.079 0.012 6.456 3 2 2451 STSISTSP* 0.12 0.10 1.2 11 18 852 KAL1/KALP* 0.07 0.06 1.2 6 12 1302 AMELXIY 0.07 0.07 1.0 7 12 576 Croup 3 TB4XIY 0.29 0.04 7.3 7 7 135 EI F 1 AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432 2FX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394 DFFRXIY 0.33 0.05 6.6 11 9 7671 DBXIY 0.36 0.04 9.0 12 9 1932 CASK/CASKP* 0.24 0.22 1.1 15 32 156 UTXIY 0.26 0.08 3.3 12 15 4068 Croup 2 UBE1XIY 0.58 0.07 8.3 16 13 693 SMCXIY 0.52 0.08 6.5 17 15 4623 Croup ~
RPS4XIY 0.97 0.05 19 18 18 792 RBMX/Y 0.94 0.25 3.8 29 38 1188 SOX3/SRY 1.25 0.19 6.6 28 29 264 PCDHXIY 0.006 0.008 0.809 1 2 2850 Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes (KA) de tous les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y. Le rapport KSlKA est une indication de la conservation des 5 gènes. KS est le taux de substitution synonyme par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la séquence de la protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme qui représente les modifications qui changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1 alors le gène n'est pas conservé car il y a autant de modification synonymes et 10 non-synonymes. C'est le cas pour les cooptes XlY possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y (par ex. KAL11KALP*). Si KS/KA >1, alors le gène varie au cours de l'évolution mais la protéine est bien conservée.
C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la variation génétique entre ces gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences protéiques 15 de HNL4X et HNL4Y.
Pour la détection de mutations sur le gène HNL4X, les étapes suivantes ont été utilisées:
Matérïeïs et Méthodes Identification de ta séquence des gènes HNL4X. HNL4Y et MNL4 L'isolement des gènes HNL4X et HNL4Y a été efFectué par l'analyse informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par l'amplification des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux.
Analyse informatique Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du génome humain {http:llqenome.usc.edu et http/lwww.ensembl.orgl genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le.marqueur génétique qui montre la liaison la plus' significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et al.
{1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était localisë
dans un gène putatif KIAA12fi0 et qu'il y existait un homologue putatif localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de !a séquence génomique.
Une analyse par alignement de séquence {BLAST) et un arbre phylogénétique regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de la famille des neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4X et HNL4Y.
Analyse des transcrits HNL4X ef HNL4Y
Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes (n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux.
Les ADNc complets des ARNm HNL4X et HNL4Y ont été retrotranscrits; amplifiés et directement séquencés. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et le séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
Séauençaae des grènes HNL4X et HNL4Y chez les surets autistes et Asperger Chaque exon des gènes HNL4X et HNL4Y a été amplifié et séquencé à
partir de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués dans Ie Tableau 3.
Tableau 2. Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et squencer les ADNc de HNL4X et HNL4Y.
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG SEQ ID NO : 18 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ ID NO : 19 Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO : 20 HNLXY4 GCTCTGAATGATGGCCTTCTG SEQ ID NO : 21 Exons 4~ HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC SEQ ID NO : 22 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAARTAG SEQ ID NO : 23 Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO : 24 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ iD NO : 25 Pour les amorces utilisation du code universel dgnres, : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K{GT), V{ACG),D(AGT), B(CGT), N(ACGT) H(ACT), Tableau 3. Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les gnes HNL4X et HNL4Y.
Exons Amorces Squences SEQ ID NO
Exon 1a HNL4X HNLXYE1aFGAAACAACGAATTTCCTCCAAA 26 HNLXYE1aR AGTGAGGCTTTCCATCCTTTGC 27 Exon 1b HNL4X HNLXE1F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC 28 Exon 1 HNL4Y HNLYE1F GGGGTGCTTCTTTTGGGAGGCT 30 Exon 2 HNLXIY HNLXYE2F GGATG'fGGATGCAGATTTGAA 32 HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG 33 Exon 3 HNL4X/Y HNLXYE3FTGTGTTTCCGTACTTGGCTTT 34 Exon 4 HNL4x HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT 36 Exon 4 HNL4Y HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT 38 Exon 5 HNL4XlY HNLXYESdFTG'fCCRCAATTTTGCACCTGC 40 Exons Amorces Séquences SEQ ID NO
HNLXYESdR AGGAYAGTGATACCCCAACA 41 Exon 6 HNL4XlY HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG 42 HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG 43 Pour les amorces dégénérées; utilisation du code universel : M(AC), R(AG),.
W(AT), S(CG);
Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Tableau 4. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de f'ADNc MNL4 (souris 57BL6).
Amorce Squence SEQ ID NO
MNL4R8 GTAGCCAAGGCCCCTGCATG'fC 45 Tableau 5. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de MNL4 en trois PCR d'environ 1 kb.
Amorce Squence SEQ ID NO
.
Tableau 6. Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de HNL3.
Amorce Squence SEQ ID NO
HNL3E3Fbis TTGAGCTCCAGGTTGAGCAACC 54 HNL3E5R GGAAGATGAGTGAAGGGGTACC' S9 Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont été amplifiées.
Ainsi, 140 garçons et 18 filles autistes ont été testés pour la majorité de la partie codante HNL4X/4Y.
Dans une famille Suédoise avec deux frères atteints, l'un avec un autisme et l'autre présentant un syndrome d'Asperger, une thymidine supplémentaire a été identifiée au nucléotide 1186 du gène HNL4X, créant un codon stop (Figure 17). Cette mutation (D396stop) est localisée dans le domaine estérase, produisant un arrêt prématuré de la protéine et supprimant le domaine transmembranaire. Ce changement est hérité de la mère, mais est absent chez la grand-mère maternelle, chez ies deux tantes maternelles et chez l'enfant non atteint, indiquant le statut de no~o de cette mutation chez la mère des garçons atteints. En outre, cette mutation n'a pas été trouvée dans 350 contrôles (250 femmes et 100 hommes).
D'autre part, le ratio garçon/fille; lequel est de quatre pour l'autisme et de neuf pour de Syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle HNL4Xf4Y influe sur la synaptogenèse et la mutation de HNL4XI4Y constitue un facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le Syndrome d'Asperges.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première mutation décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose tuberculeuse, etc.).
Exempte 2 : Caractérisation du a'ene HNL3 et son implication dans les syndromes asvchiatripues.
Lors de la recherche de mutations dans HNL3, le gène ancestral de HNL4XlY localisé dans la région Xql3, chez deux familles indépendantes, deux changements d'acides aminés situés dans des régions fortement conservées de la protéine ont été identifiés. Une des deux familles est très semblable à la première famille mutée dans HNL4X. Les deux frères atteints, le premier d'autisme et le second du syndrome d'Asperger, reçoivent la mutation de leur 5 mère. De façon intéressante, la mère a aussi un frère avec syndrome d'Asperger et d'autres parents avec des désordres psychiatriques. La mutation (R451 C) est située dans le domaine estérase de la protéine et concerne un acide aminé
conservé au cours de l'évolution car il est présent dans toutes les neuroligines (y compris chez D: melanogaster) et dans toutes les acétylcholine estérases de 10 mammifères, de poissons, de reptiles et d'oiseaux séquencées à ce jour {voir Figure 6). La mutation est absente chez 200 contrôles (100 femmes et 100 hommes). Ces résultats soutiennent le rôle des neuroligines dans l'étiologie de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et du syndrome d'Asperger. MNL4, forthologue de HNL4X chez la souris a aussi été identifié.
Ce 15 nouveau gène devrait permettre fa compréhension du déficit induit par une mutation telle que la mutation HNL4X dans l'autisme (voir Figure 19).
Le dernier tour du génome effectué sur des familles d'autistes Finlandais (Auranen, et al. 2002) a identifié 2 pics de liaison très significatifs en 3q26 (exactement où est situé HNL9) et en Xq13-21 (exactement où est situé HNL3).
20 La région Xp22.3, contenant HNL4X, est aussi délétée chez deux patients schizophrènes. II est donc possible que les neuroligines soient aussi responsables de la susceptibilité à ce syndrome (la schizophrénie affecte 1 %
de la population).
Claims (71)
1. Polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse, caractérisé en ce qu'au moins une mutation dans la séquence en acide nucléique dudit polynuctéotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
2. Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
3. Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite protéine appartient à la famille des neuroligines humaines.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est muté de manière à coder pour une protéine mutée non fonctionnelle.
5. Polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL3.
6. Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11, et les fragments de cette protéine.
7. Polynucléotide selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO:13, et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés de ladite séquence.
8. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite protéine est fa HNL4X ou la HNL4Y.
9. Polynucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO:8 et les fragments de cette protéine.
10. Polynucléotide selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:7, la SEQ ID
NO:16, la SEQ ID NO:17 et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés desdites séquences.
NO:16, la SEQ ID NO:17 et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés desdites séquences.
11. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la protéine est la HNL4X et en ce que ledit polynucléotide est muté de telle sorte que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
12. Polynucléotide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
13. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire.
14. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme, du Syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
15. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenèse, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
17. Polypeptide selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine d'adhésion cellulaire.
18. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines.
19. Polypeptide selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il est muté
et non-fonctionnel.
et non-fonctionnel.
20. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il consiste en la protéine HNL3.
21. Polypeptide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:10, la SEQ ID
NO:11, la SEQ ID NO: 15 et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO:10, de la SEQ ID NO:11 ou de la SEQ ID NO:15.
NO:11, la SEQ ID NO: 15 et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO:10, de la SEQ ID NO:11 ou de la SEQ ID NO:15.
22. Polypeptide selon la revendication 21, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une substitution d'acide aminé à la position 451 ou 796 de la Figure 18.
23. Potypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 451 est une substitution d'une arginine par une cystéine.
24. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 796 est une substitution d'une asparagine par une sérine.
25. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il consiste en la protéine HNL4X ou la protéine HNL4Y.
26. Polypeptide selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8, et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO:3; la SEQ ID NO:6 ou de la SEQ ID NO:8.
27. Polypeptide selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de ladite protéine.
28. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que ladite mutation engendre une protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
29. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison D396stop de la protéine.
30. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 29, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme, du Syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
31. Procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la mesure de (activité d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la mesure de (activité d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
32. Procédé selon la revendication 31, comprenant:
- l'amplification d'un gène codant dans sa forme sauvage (non mutée) pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène;
la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager.
- l'amplification d'un gène codant dans sa forme sauvage (non mutée) pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène;
la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager.
33. Procédé selon la revendication 31 ou 32, caractérisé en ce que le gène code dans sa forme sauvage pour une protéine d'adhésion cellulaire.
34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisé
en ce que ladite protéine appartient à 1a famille des Neuroligines humaines.
en ce que ladite protéine appartient à 1a famille des Neuroligines humaines.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé
en ce que ladite protéine est la HNL3.
en ce que ladite protéine est la HNL3.
36. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 35, caractérisé
en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:14.
en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:14.
37. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 à 35, caractérisé
en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:12.
en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:12.
38. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 à 37, caractérisé
en ce que ladite mutation provoque une substitution d'acide aminé à la position 451 ou 796 de la Figure 18.
en ce que ladite mutation provoque une substitution d'acide aminé à la position 451 ou 796 de la Figure 18.
39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite mutation à
la position 451 est une substitution d'une arginine par une cystéine.
la position 451 est une substitution d'une arginine par une cystéine.
40. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite mutation à
la position 796 est une substitution d'une asparagine par une sérine.
la position 796 est une substitution d'une asparagine par une sérine.
41. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé
en ce que ladite protéine est la HNL4X ou la HNL4Y.
en ce que ladite protéine est la HNL4X ou la HNL4Y.
42. Procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou la SEQ ID NO:8.
43. Procédé selon la revendications 41 ou 42, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:4.
44. Procédé selon l'une quelconque des revendications 41 à 43, caractérisé
en ce que ladite protéine est la HNL4X et en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
en ce que ladite protéine est la HNL4X et en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
45. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production de ladite protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
46. Procédé selon l'une quelconque des revendications 41 à 45, caractérisé
en ce que ledit gène consiste en la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
en ce que ledit gène consiste en la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
47. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 46, caractérisé
en ce que le désordre ou la maladie mentale consiste en l'autisme, le Syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
en ce que le désordre ou la maladie mentale consiste en l'autisme, le Syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
48. Kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant:
i) a détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
i) a détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
49. Kit selon la revendication 48, caractérisé en ce que ledit gène code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:3; la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8; ou la SEQ ID NO:14.
50. Kit selon la revendication 48 ou 49, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO : 16 ou 1a SEQ ID NO : 17.
51. Kit selon l'une quelconque des revendications 48 à 50, caractérisé en ce que ladite protéine comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par:
la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8, ou la SEQ ID NO:14.
la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8, ou la SEQ ID NO:14.
52. Utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
53. Utilisation d'une protéine non-mutée qui est impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
54. Utilisation selon la revendication 52 ou 53, caractérisée en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
55. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 52 à 54, caractérisée en ce que ladite protéine appartient à la famille des Neuroligines humaines.
56. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 52 à 55, caractérisée en ce que ladite protéine est la HNL3 ou la HNL4X.
57. Utilisation selon Dune quelconque des revendications 52 à 56, caractérisée en ce que ladite maladie mentale est l'autisme, du Syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
58. Procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 14 ou l'activité biologique du polypeptide selon l'une des revendications 15 à 29;
comprenant:
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou ta mesure de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
comprenant:
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou ta mesure de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
59. Méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel pue défini à la revendication 16.
60. Méthode selon la revendication 59, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules souches.
61. Méthode selon la revendication 59 ou 60; caractérisé en ce que ladite maladie mentale est l'autisme, le Syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou te syndrome ADHD.
62. Méthode selon l'une quelconque des revendications 59 à 61, caractérisé
en ce l'on insère un gène codant pour une protéine HNL3 fonctionnelle et/ou pour une protéine HNL4X fonctionnelle.
en ce l'on insère un gène codant pour une protéine HNL3 fonctionnelle et/ou pour une protéine HNL4X fonctionnelle.
63. Méthode selon la revendication 62, caractérisé en ce que la protéine HNL3 possède la SEQ ID NO:14.
64. Méthode selon la revendication 62, caractérisé en ce que la protéine HNL4X possède la SEQ ID NO:3.
65. Procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, caractérisé par a) l'utilisation de cellules souches dudit patient;
b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide tel que déni à la revendication 1; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon (étape b).
b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide tel que déni à la revendication 1; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon (étape b).
66. Anticorps monoclonaux ou poiyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides définis aux revendications 1 à
14 et/ou au moins un des polypeptides définis aux revendications 15 à 30.
14 et/ou au moins un des polypeptides définis aux revendications 15 à 30.
67. Anticorps selon la revendication 66, caractérisés en ce qu'ils sont humanisés.
68. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un des polynucléotides définis aux revendications 1 à 14 ou un fragment de celui-ci.
69. Un vecteur selon la revendication 68, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les plasmides, les cosmides ou les pliages.
70. Cellule hôte comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et/ou un vecteur selon la revendication 68 ou 69:
71. Composition caractérisée en ce qu'elle contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable; et au moins un élément choisi dans le groupe constitué par:
- un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14;
- un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 30;
- un anticorps selon la revendication 66 ou 67 ;
- un vecteur selon la revendication 68 ou 69 ; et - une cellule hôte selon la revendication 70.
- un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14;
- un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 30;
- un anticorps selon la revendication 66 ou 67 ;
- un vecteur selon la revendication 68 ou 69 ; et - une cellule hôte selon la revendication 70.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA 2409500 CA2409500A1 (fr) | 2001-11-30 | 2002-11-29 | Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA2,364,106 | 2001-11-30 | ||
| CA002364106A CA2364106A1 (fr) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques |
| CA 2409500 CA2409500A1 (fr) | 2001-11-30 | 2002-11-29 | Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2409500A1 true CA2409500A1 (fr) | 2003-05-30 |
Family
ID=25682805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA 2409500 Abandoned CA2409500A1 (fr) | 2001-11-30 | 2002-11-29 | Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CA (1) | CA2409500A1 (fr) |
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2002
- 2002-11-29 CA CA 2409500 patent/CA2409500A1/fr not_active Abandoned
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