CA3020055C - Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l'addiction au tabac - Google Patents

Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l'addiction au tabac

Info

Publication number
CA3020055C
CA3020055C CA3020055A CA3020055A CA3020055C CA 3020055 C CA3020055 C CA 3020055C CA 3020055 A CA3020055 A CA 3020055A CA 3020055 A CA3020055 A CA 3020055A CA 3020055 C CA3020055 C CA 3020055C
Authority
CA
Canada
Prior art keywords
tobacco
tobacco leaf
extract
weight
leaf extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CA3020055A
Other languages
English (en)
Other versions
CA3020055A1 (fr
Inventor
Bruno Lafont
Original Assignee
NFL Biosciences SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1653079A external-priority patent/FR3049866B1/fr
Application filed by NFL Biosciences SA filed Critical NFL Biosciences SA
Publication of CA3020055A1 publication Critical patent/CA3020055A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of CA3020055C publication Critical patent/CA3020055C/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

La présente invention concerne un extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5% en poids, par rapport au poids total de l'extrait, de protéines et essentiellement exempt de molécules de masse moléculaire inférieure à 10 kDa. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique contenant un tel extrait et son utilisation dans le traitement de l'addiction au tabac.

Description

EXTRAIT DE FEUILLES DE TABAC ET UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DE L'ADDICTION AU TABAC DOMAINE DE L'INVENTION 5 La presente invention concerne un extrait de feuilles de tabac, ainsi qu'une composition pharmaceutique contenant cet extrait de feuilles de tabac et son utilisation dans le traitement de ['addiction au tabac.
ART ANTERIEUR De maniere generale, la dependance ou addiction a ete definie par ['Organisation 10 Mondiale de la Sante comme « un syndrome pour lequel la consommation d'un produit devient une exigence superieure a celles d 'autres comportements qui avaient auparavant une plus grande importance.
Dans sa forme extreme l'etat de dependance se caracterise par un besoin irresistible d'un produit qui pousse l'individu souffrant de cette dependance a la recherche impulsive de ce produit ».
La dependance au tabac entra1ne des problemes de sante publique important, les maladies etant liees au tabagisme etant tres nombreuses tel que le cancer (poumon, gorge, bouche, levres ... ), les maladies cardio-vasculaires, la bronchite chronique ...
De plus, au-dela des maladies a proprement parler, le tabagisme entra1ne de nombreux 20 effets secondaires (diminution de la fertilite, alteration de l'epiderme, alteration de la muqueuse buccale et nasale, alteration des arteres cerebrales, atteintes de l'resophage, de l'estomac, carences en vitamine Bet C. .. ).
I l existe trois type de dependance au tabac qui agissent concomitamment : la 25 dependance physique qui est due essentiellement a la presence de nicotine dans le tabac et qui se traduit par une sensation de manque (pulsion forte a fumer, irritabilite, nervosite, agitation, anxiete, perturbation du sommeil. .. ) ; la dependance psychologique qui est liee aux effets psychoactifs de la nicotine qui procure plaisir, detente, stimulation intellectuelle, action anxiolytique, anti depressive et coupe- 30 faim ; et la dependance environnementale ou comportementale qui depend de la 2 pression sociale et conviviale.
La dependance physique dispara1t en moyenne en quelques semaines.
Les symptomes du sevrage atteignent leur maximum aux alentours de trois a quatre jours apres l'arret tabagique et peuvent durer quelques semaines.
La dependance psychologique est plus longue a s'estomper et peut durer plusieurs mois.
La dependance au tabac est maintenue par des renforcements positifs et negatifs.
La nicotine est a l'origine de la liberation de dopamine, un neurotransmetteur du circuit de la recompense.
Le fumeur fume a la fois pour reproduire les sensations de plaisir provoquees par la liberation de dopamine (c'est le renforcement positif de la 1 0 cigarette) et pour eviter les symptomes de manque lorsque que son taux dopamine est trop bas (c'est le renforcement negatif de la cigarette). ll existe trois methodes principales de traitement pharmacologique de la dependance tabagique.
La premiere vise a un arret immediat a partir d'une date d'arret cible 15 initialement fixee, les traitements pharmacologiques sont alors administres apres cette date d'arret cible dans le cas des substituts nicotiniques et une semaine avant dans le cas du bupropion ou de la varenicline (afin d'atteindre une concentration plasmatique suffisante au moment de la date d'arret cible).
La seconde consiste a reduire sa consommation avant une tentative d'arret, la phase de reduction 20 correspond alors a un pretraitement pendant lequel les traitements pharmacologiques sont administres.
La troisieme est celle de la prevention des rechutes apres un arret reussi.
Aces trois methodes s'ajoute la reduction de la consommation sans pour autant chercher a effectuer une tentative d'arret. 25 L'efficacite de chacune de ces methodes se trouve renforcee par une phase de preparation du fumeur qui doit se convaincre de la necessite d'arreter de fumer et de renforcer sa motivation a y parvenir.
Les notices des traitements pharmacologiques de la dependance tabagique indiquent ainsi que les traitements du sevrage tabagique ont plus de probabilites de succes chez les patients motives pour arreter de fumer.
I l existe actuellement quatre grands types de traitement de la dependance tabagique (sans parler des psychotherapies comportementales, de ['acupuncture ou de l'hypnose), qui sont les substituts nicotiniques, le bupropion, la varenicline et l'homeopathie.
Le principe d'action de chacune de ces quatre methodes est fonde sur 3 le fait que la nicotine est la molecule responsable du mecanisme de la dependance tabagique.
Les substituts nicotiniques peuvent etre administres de diverses manieres : par voie 5 transdermique sous forme de patchs ou timbres, par voie orale sous forme de gommes a macher, comprimes a sucer ou comprimes sublinguaux, ou par voie aerienne sous forme d'inhalateur. L'administration de substituts nicotiniques permet principalement la reduction des renforcements negatifs de la cigarette en evitant autant que possible au fumeur de ressentir les symptomes de manque lies au sevrage, la nicotine apportee 1 0 par les substituts compensant celle des cigarettes. L'efficacite des substituts nicotiniques varient selon la methode employee, le taux de sevrage etant generalement compris entre 15 a 20 %.
Les substituts nicotiniques sont utilises lors de tentatives d'arret immediat et aussi en pretraitement avant une tentative d'arret afin d'aider les fumeurs a reduire leur consommation de cigarettes dans le cadre d'un arret 15 graduel (reduire pour arreter). lls peuvent aussi etre utilises uniquement dans le but de reduire la consommation de tabac.
Leur efficacite dans le cadre de la prevention des rechutes n'a a ce jour pas ete demontree.
Le bupropion commercialise par les laboratoires GlaxoSmithKline (sous le nom 20 commercial Zyban®), agit sur certains neuromediateurs cerebraux comme les catecholamines, la noradrenaline et la dopamine.
Le bupropion est un inhibiteur selectif de la recapture neuronale des catecholamines, ce qui lui confere des proprietes d'antidepresseur.
Son efficacite est equivalente a celle obtenue apres ['utilisation de timbres nicotiniques (taux de sevrage autour de 20 %). ll est moins 25 prescrit que les substituts nicotiniques car il presente un moins bon rapport benefices/risques pour une efficacite comparable. ll peut en effet conduire a des tentatives de suicide.
La varenicline commercialisee par les laboratoires Pfizer (sous le nom commercial 30 Chantix® ou Champix®) est un agoniste partiel des recepteurs nicotiniques a l'acethylcholine.
La varenicline cible ces recepteurs avec une double action : agoniste partiel des recepteurs a4B2, elle engendre une reaction similaire a celle induite par la nicotine avec une intensite moindre (et done reduit les effets de manque lors du sevrage) et en debut de traitement quand le fumeur est traite tout en fumant de fac;:on 35 occasionnelle, elle attenue la stimulation neurochimique en presence de nicotine 4 (antagoniste partiel des recepteurs a4B2).
La varenicline reduit done les renforcements negatifs (effet de manque) et positifs (envie de fumer) de la cigarette.
En pratique, la varenicline diminue le plaisir que constitue le tabagisme, ce qui serait un critere de futur succes pour arreter de fumer.
Son efficacite est superieure a celle 5 des substituts nicotiniques (taux de sevrage de l'ordre de 28 %).
La varenicline est utilisee lors de tentatives d 'arret immediat et aussi en pretraitement pendant quelques semaines avant une tentative d'arret afin d'aider les fumeurs a reduire leur consommation de cigarettes dans le cadre d'un arret graduel (reduire pour arreter).
Dans une premiere etude (NCT00789074), 35 % des fumeurs parviennent a reduire d'au 1 0 moins 50 % leur consommation de cigarettes d'apres un point fait apres 3 semaines de pretraitement avec la varenicline.
Dans une seconde etude (NCT00835900), le pourcentage de reduction du nombre de cigarettes fumees d'apres un point fait a 4 semaines de pretraitement avec la varenicline est de 42 %.
Dans une troisieme etude (NCT01370356), 47 % des fumeurs parviennent a reduire d'au moins 50 % leur 15 consommation de cigarettes d'apres un point fait apres 4 semaines de pretraitement avec la varenicline.
Son efficacite dans le cadre de la prevention des rechutes n'a ace jour pas ete demontree.
Par contre, la varenicline induit des effets secondaires frequents (nausees) et peut etre a l'origine de problemes cardiaques ou de tentatives de suicide.
Ces effets secondaires font qu'en depit d'une efficacite superieure a celle 20 des substituts nicotiniques, la varenicline n'est souvent prescrite qu'en seconde intention apres un echec avec les substituts nicotiniques.
La quatrieme voie de sevrage est l'homeopathie qui repose sur ['utilisation a doses infinitesimales de la substance provoquant les symptomes que l'on desire combattre. 25 Un extrait de « tabacum » est souvent utilise dans le sevrage tabagique.
La demande de brevet irlandaise IE 960 511 decrit notamment ['utilisation de dilutions homeopathiques d'extrait de tabac pour la fabrication d'un medicament destine a la restauration des fonctions neuronales et au soulagement des symptomes de sevrage de la nicotine.
Comme les autres techniques non conventionnelles de sevrage, son 30 efficacite n'est pas suffisante chez les gros fumeurs.
Malgre les nombreuses recherches dans ce domaine, il existe toujours la necessite de trouver de nouveaux traitements ou d'ameliorer les traitements existants permettant de traiter la dependance tabagique.
Dans la demande PCT /FR2007 /000786, la Demanderesse avait decouvert que ['injection chez un fumeur d'une solution aqueuse d'extrait de feuilles tabac permettait de traiter la dependance au tabac dudit fumeur.
Cette decouverte etait reellement inattendue car la Demanderesse avait pu determiner que ledit extrait 5 aqueux de feuilles de tabac contenait de faibles quantites de nicotine.
Ainsi, le mecanisme d'action implique dans le traitement de la dependance tabagique a l'aide de cet extrait aqueux de feuilles de tabac n'est pas l'apport de nicotine au fumeur.
Neanmoins le fait que ledit extrait aqueux de feuilles de tabac contenait de faibles 1 O quantites de nicotine ne renseignait pas sur sa composition et son mode de fabrication.
La teneur en nicotine des extraits aqueux de feuilles de tabac peut en effet varier considerablement en fonction de nombreux facteurs.
La teneur en nicotine dans les feuilles de tabac peut ainsi varier de 0,5 a 8 % pour les 15 principaux types de tabac cultives (Davis et Al., "Production, Chemistry, and Technology", ISBN-13: 978-0632047918, Chapter 8, page 275).
Le tabac Burley contient ainsi environ 2 fois plus de nicotine que le tabac Marynland et 3 fois plus de nicotine que le tabac Oriental (Leffingwell, « Chemical constituents 20 of tobacco leaf and differences among tobacco types », Leffingwell Reports, Vol. 1 (No. 2), February, 2001 ).
L'utilisation d'engrais azotes influence la teneur en nicotine des feuilles de tabac et la teneur en nicotine est plus importante dans les feuilles de l'etage haut que dans 25 celles de l'etage intermediaire qui est elle-meme plus importante que dans celles de l'etage bas (Xiao-Tang et al., « Yield and nicotine content of flue-cured tobacco as affected by soil nitrogen mineralization », Pedosphere 18(2): 227-235, 2008, ISSN 1002-0160/CN 32-1315/P). 30 La rotation des cultures influence la teneur en nicotine des feuilles de tabac (Butorac et al., « The Effect of Tobacco Monoculture and Crop Rotations on Tobacco Leaf Composition », Agriculturae Conspectus Scientificus, Vol. 69 (2004) No. 4 (95-101) ).
La composition chimique et la teneur en nicotine des feuilles de tabac sont influencees par les rayonnement ultra-violet et l'intensite lumineuse (Andersen et al., « Chemical 6 composition of tobacco leaves altered by near-ultraviolet and intensity of visible light», Plant Physiol. (1973) 51, 723-726).
Les methodes de preparation des extraits influencent aussi la teneur en nicotine, 5 notamment les temps et conditions de maceration, les methodes de sterilisation et les separations physiques et chimiques.
Un extrait de tabac tel que celui decrit dans la demande PCT /FR2007 /000786 comprend des molecules de faible masse moleculaire, i.e. inferieure a 1 O kDa.
Parmi ces molecules de faible poids moleculaire, on peut notamment citer les N-nitrosamines 1 O (TSNA) et les N-nitrosoamino acides specifiques au tabac derives d 'alcalo"ides nonvolatiles, des aldehydes volatiles, des hydrocarbures aromatiques polynucleaires (tel que le benzo[a]pyrene), des lactones, des urethanes, ou des metaux tel que le cadmium par exemple (cf.
Wagner et al., Plant Physiol. 1986, 82, 274-279 et IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human, vol.49).
Ces composes 15 peuvent etre carcinogenes, mutagenes ou toxiques et peuvent provoquer des cancers, des problemes renaux ou osseux.
Ces composes sont done mauvais pour la sante du patient auquel on a administre une composition les comprenant.
Un tel extrait de tabac comprend de nombreuses proteines de tout poids moleculaire. 20 La base de donnees SwissProt identifie ainsi 759 proteines de tabac.
La proteine RuBisCO peut representer a elle seule de 30 a 50 % des proteines solubles.
Une proteine RuBisCO complete compte typiquement huit sous-unites formant un complexe proteique d'environ 540 kDa.
La toxicite de ces proteines administrees en sous-cutane dans une solution les comprenant est inconnue alors que rien n'indique qu'elles 25 puissent toutes ou certaines etre impliquees dans un quelconque effet therapeutique.
L'objectif de la presente invention est de fournir un traitement de ['addiction au tabac qui soit efficace.
De maniere avantageuse, ce traitement n'est pas toxique, est bien tolere par les patients et presente un risque limite en reduisant autant que possible ['administration de molecules a la toxicite inconnue et qui ne presentent a priori pas 30 d'effet therapeutique.
Alors que les extraits de tabac contiennent des milliers de composes, la Demanderesse a decouvert de maniere surprenante que des proteines des extraits de feuilles de tabac permettent d'induire une reponse immunitaire de type lgG specifique qui favorise le 35 sevrage tabagique.
Ainsi, l'extrait de feuilles de tabac selon ['invention comprenant 7 une teneur elevee en proteines et une composition proteique particuliere permet d'induire une reponse immunitaire de type lgG specifique qui favorise le sevrage tabagique. 5 Cette decouverte est d'autant plus surprenante que les extraits aqueux de feuilles de tabac contiennent des milliers de composes, les proteines ne constituant qu'une famille de composes parmi d'autres.
Les proteines de tabac ne sont pas connues pour jouer un role dans ['addiction au tabac et rien n'incite done a les utiliser dans le sevrage tabagique.
La Demanderesse montre notamment que les extraits de feuilles de tabac selon l'invention presentent une teneur elevee en proteines et une composition proteique particuliere.
Cette composition proteique particuliere peut etre notamment obtenue lorsque des feuilles de tabac sechees sont utilisees.
Le sechage favorise la degradation 15 des proteines, par exemple par des mecanismes d'hydrolyse, et ['augmentation des acides amines libres dans les feuilles de tabac (Hamilton & Lowe, 1978 ; Long & Weybrew, 1981 ; Burton, et al., 1983).
La Demanderesse a decouvert de maniere surprenante que des proteines des extraits 20 de feuilles de tabac selon l'invention permettent d'induire la generation d'anticorps lgG specifiques qui favorisent le sevrage tabagique.
La Demanderesse montre que ['administration de l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention induit la reponse immunitaire de type lgG specifique et permet d'obtenir le traitement efficace de ['addiction au tabac, meme sans ajouter a l'extrait d'adjuvant pouvant favoriser une 25 reponse immunitaire.
La Demanderesse montre que la reponse immunitaire de type lgG specifique, le traitement de ['addiction au tabac et le sevrage tabagique sont particulierement efficaces lorsque des extraits de feuilles de tabac sechees sont utilises. 30 Cette decouverte est d'autant plus surprenante que rien dans l'art anterieur n'indique que des anticorps lgG specifiques des proteines d'extraits de feuilles de tabac sont susceptibles d'aider les fumeurs a reduire ou a arreter leur consommation tabagique.
L'activation d'une reponse immunitaire de type lgG specifique suite a ['administration d'extraits de tabac, et le role d'extraits de tabac dans le sevrage tabagique n'avait 35 jamais ete decrit a ce jour.
Un tel lien entre le systeme immunitaire (implique 8 notamment dans la production des anticorps lgG specifiques), et le systeme nerveux, (implique notamment dans la perception de l'acte de fumer et le comportement) pouvant favoriser le sevrage tabagique n'a jamais ete decrit a ce jour. 5 De maniere avantageuse, le traitement de ['addiction au tabac selon la presente invention necessite ['administration de la composition pharmaceutique selon ['invention que peu de fois, avantageusement une seule administration, pour que des effets des renforcements de la cigarette ne soient plus ressentis ou ressentis de fac;:on significativement attenuee par le patient, et notamment l'envie de fumer 1 0 (renforcement positif), l'appetence de la cigarette est reduite.
RESUME DE L'INVENTION Dans un premier aspect, la presente invention concerne un extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec, de 15 proteines de masse moleculaire superieure a 1 O kDa et essentiellement exempt de molecules de masse moleculaire inferieure a 1 O kDa.
De preference, lesdites proteines sont choisies parmi le groupe constitue des familles de proteines suivantes : peroxidase anionique formant de la lignine, glucan endo-1,3-beta-glucosidase, endochitinase, proteine liee a la pathogenese, osmotine et inhibiteur de proteinase ainsi que leurs 20 melanges.
L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant ledit extrait de feuilles de tabac et son utilisation dans le traitement de ['addiction au tabac.
L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant ledit extrait de feuilles de tabac et son utilisation dans le sevrage tabagique.
L'invention concerne en outre une methode de traitement de ['addiction au tabac 30 comprenant ['administration dudit extrait de feuilles de tabac a un sujet souffrant d'addiction ou de dependance au tabac. 9 L'invention concerne en outre une methode de traitement de ['addiction au tabac comprenant ['administration de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit extrait de feuilles de tabac a un sujet souffrant d'addiction au tabac. 5 Dans le cadre de la presente invention, le traitement de la dependance ou de ['addiction au tabac englobe toutes les formes de consommation de tabacs, a savoir les tabacs fumes, sous forme de cigarettes manufacturees ou roulees, de cigarillos ou cigares, de tabacs fumes dans la pipe, mais aussi des tabacs non fumes tels que des tabacs a priser, chiquer ou sucer.
L'invention concerne egalement le procede de preparation dudit extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec, de proteines de masse moleculaire superieure a 1 0 kDa et essentiellement exempt de molecules de masse moleculaire inferieure a 1 0 kDa comprenant les etapes suivantes : a.
Sechage de feuilles de tabac, b.
Broyage de feuilles de tabac sechees pour obtenir un broyat de feuilles de tabac sechees, c.
Extraction du broyat de feuilles de tabac sechees sous agitation mecanique avec un solvant, par exemple un solvant aqueux, de preference une solution tampon aqueuse a pH compris entre 6,0 et 8,5, d.
Separation des residus solides de la solution de l'extrait du broyat de feuilles de tabac sechees par filtration ou centrifugation afin d'obtenir une solution d'extrait de broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide, 25 e.
Diafiltration a volume constant de la solution obtenue a l'etape d avec un solvant, de preference un solvant aqueux, en une quantite allant de 2 a 12 fois en volume, de preference de 3 a 1 0 fois en volume, de preference de 4 a 8 fois en volume, de preference 6 fois en volume, par rapport au volume de l'extrait, et avec une membrane ayant un seuil de coupure a 1 0 kDa, 30 f.
Eventuellement lyophilisation de la solution proteique obtenue a l'etape e.
L'invention concerne egalement un kit comprenant une composition pharmaceutique comprenant ledit extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec, de proteines de masse moleculaire superieure a 1 0 kDa et essentiellement exempt de molecules de masse moleculaire inferieure a 10 kDa.
DESCRIPTION DES FIGURES 5 Figure 1.
Illustration d'un profil electrophoretique de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 : Fractionnement en gel NuPage 4 % - 12 % en tampon MES et en presence d'agent reducteur.
Figure 2.
Induction d'lgG apres injection de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 a des souris.
Figure 3.
Illustration d'un immunophenotypage pour la caracterisation de cellules immunes activees.
Figure 4.
Activation des cellules Natural Killer par l'extrait de feuilles de tabac selon 15 l'exemple 1.
Figure 5.
Activite de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 sur les lymphocytes T et B. 20 Figure 6.
Induction de cytokines pro-inflammatoires et d'IFNy par l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1.
Figure 7.
Induction de cytokines TH2 et de chimiokines et facteur de croissance hematopo"ietique par l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1.
Figures 8 et 9.
Evolution de la consommation de tabac chez des patients traites par ['administration de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1. 11 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Extrait de feuilles de tabac La presente invention concerne un extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait sec, de preference au moins 1 0 % en 5 poids, de preference au moins 15 % en poids, de preference environ 20 % en poids de proteines de masse moleculaire superieure a 1 O kDa et essentiellement exempt de molecules de masse moleculaire inferieure a 1 O kDa.
L'extrait sec est avantageusement obtenu avant lyophilisation de l'extrait de feuilles 1 O de tabac selon l'invention, puis mise sous cloche a vide, de preference en presence de P20s, jusqu'a obtention d'une masse d'extrait constante.
De maniere avantageuse, la teneur en molecules de masse moleculaire inferieure a 1 O kDa est inferieure a 5 % en poids par rapport au poids total de l'extrait, de 15 preference inferieure 2,5 % en poids, et mieux encore inferieure a 1 % en poids.
Au sens de la presente invention, on entend par« environ » plus ou moins 1 % en raison des incertitudes de mesure. 20 La teneur en proteines de masse moleculaire superieure a 1 O kDa habituellement mesuree dans des extraits de feuilles de tabac est d'environ 1 %. L'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention a done une teneur en proteines de masse moleculaire superieure a 10 kDa bien plus elevee que ce qui etait connu jusque-la. 25 De preference, les proteines presentes dans l'extrait selon la presente invention sont choisies parmi le groupe constitue des familles de proteines suivantes : peroxidase anionique formant de la lignine, glucan endo-1,3-beta-glucosidase, endochitinase, proteine liee a la pathogenese, osmotine et inhibiteur de proteinase ainsi que leurs melanges.
Les noms indiques pour les proteines presentes dans l'extrait selon la presente invention correspondent aux noms renseignes dans la banque de donnees Swissprot qui est une banque de donnees biologiques repertoriant les sequences proteiques. 12 Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention comprend au moins une proteine appartenant a la famille des glucan endo-1,3-beta-glucosidases, et de preference choisie(s) parmi l'isoforme acide PR-Q' de la beta-1,3-endoglucanase (PR36401 selon la base UniProt), l'isoforme vacuolaire basique GLB de la 5 beta-1,3-endoglucanase (P27666 selon la base UniProt), et leurs melanges.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention comprend au moins une proteine appartenant a la famille des endochitinases, et de preference choisie(s) parmi l'endochinitase P acide (P17513 selon la base UniProt), l'endochinitase 10 Q acide (P17514 selon la base UniProt), l'endochinitase B (P24091 selon la base UniProt), et leurs melanges.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention comprend au moins de l'osmotine (P14170 selon la base UniProt).
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention comprend au moins une peroxidase anionique formant de la lignine (P11965 selon la base UniProt). 20 Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention comprend au moins une proteine liee a la pathogenese, et de preference choisie(s) parmi la proteine R liee a la pathogenese (P13046 selon la base UniProt), la proteine PR-4A liee a la pathogenese (PR29062 selon la base UniProt), la proteine PR-4B liee a la pathogenese (PR29063 selon la base UniProt), et leurs melanges.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention comprend au moins une proteine appartenant a la famille des inhibiteurs de proteinase, et de preference choisie(s) parmi l'inhibiteur de proteinase I-B (Q03199 selon la base UniProt), l'inhibiteur de proteinase I-A (Q03198 selon la base UniProt), 30 et leurs melanges.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac comprend egalement des polysaccharides de masse moleculaire superieure a 1 0 kDa et de preference hyd roso lu b les. 13 De preference, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention comprend au moins 5 % en poids par rapport au poids total de l'extrait sec, de preference au moins 1 0 % en poids, de preference au moins 15 % en poids, de preference environ 20 % en poids de proteines choisies parmi le groupe constitue des familles de proteines 5 suivantes : peroxidase anionique formant de la lignine, glucan endo-1,3-betaglucosidase, endochitinase, proteine liee a la pathogenese, osmotine et inhibiteur de proteinase ainsi que leurs melanges.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention 1 0 est essentiellement exempt de proteines de haute masse moleculaire.
Au sens de la presente invention, on entend par « proteine de haute masse moleculaire » une proteine dont la masse moleculaire est superieure a 500 kDa de preference dont la masse moleculaire est superieure a 400 kDa, de preference encore 15 dont la masse moleculaire est superieure a 300 kDa, de maniere preferentielle dont la masse moleculaire est superieure a 200 kDa, de maniere plus preferentielle encore dont la masse moleculaire est superieure a 150 kDa, et mieux encore dont la masse moleculaire est superieure a 100 kDa. 20 Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention est essentiellement exempt de proteines dont la masse moleculaire est superieure a 50 kDa.
Au sens de la presente invention, on entend par« essentiellement exempt » une teneur 25 en molecules inferieure a 15 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de preference une teneur en molecules inferieure a 1 0 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de preference encore inferieure a 7,5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de preference encore inferieure a 5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de maniere 30 preferentielle inferieure 2,5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de maniere plus preferentielle encore inferieure 1 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, et mieux encore inferieure a 0,5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait. 14 De maniere avantageuse, la teneur en proteines de haute masse moleculaire est inferieure a 15 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de preference inferieure a 1 0 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de preference encore inferieure a 7,5 % en poids par rapport au poids proteique total 5 de l'extrait, de preference encore inferieure a 5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de maniere preferentielle inferieure 2,5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, de maniere plus preferentielle encore inferieure 1 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait, et mieux encore inferieure a 0,5 % en poids par rapport au poids proteique total de l'extrait.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention est essentiellement exempt de proteines RuBisCO.
Selon un mode de realisation, les feuilles de tabac sont de la variete Nicotiana Tabacum ou de la variete Nicotiana Rustica.
Les feuilles de tabac peuvent provenir 15 d'un tabac brun ou blond et peut etre notamment choisi parmi le tabac de Virginie, le tabac Burley, le tabac oriental, le tabac Latakia, le tabac Perique, le tabac Maryland, le tabac Kentucky, le tabac de Californie, le tabac Tex Mex, et leurs melanges.
Bien entendu, l'extrait n'est pas necessairement constitue par un extrait pur de 20 feuilles de tabac et des proteines extraites du cannabis, peuvent etre ajoutees pour traiter conjointement la dependance au tabac et au cannabis.
Selon un mode particulier de realisation, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir d'un melange 1 /1 /1 de tabac brun, de tabac de Virginie et de Burley.
Selon un mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de tabac Burley.
Selon un mode de realisation, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de 30 feuilles de tabac sechees.
Selon un mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees a l'air libre.
Selon un mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees a l'air libre pour une duree adaptee aux conditions climatiques locales, de preference pour une duree minimum d'un mois. 5 Au sens de la presente invention, on entend par« sechage a l'air libre » ou « sechage naturel » un sechage realise en presence de l'air libre naturel, a l'exterieur ou a l'interieur.
Le sechage a l'air libre peut etre realise dans un local ouvert ou ferme, couvert ou non.
Un sechage a l'air libre peut par exemple etre realise en sechoir naturel.
Dans ce cas, les feuilles de tabac fraichement recoltees ou presechees sont 1 0 laissees a secher de maniere naturelle sous l'effet de l'air libre.
Les feuilles de tabac peuvent par exemple etre suspendues dans des hangars ventiles non chauffes.
Les feuilles de tabac peuvent etre par exemple laissees a secher naturellement jusqu'a ce qu'elles prennent une couleur brune.
Ace stade, il n'y a pratiquement plus de sucre dans la feuille.
Avantageusement, le sechage est realise pour une duree adaptee aux 15 conditions climatiques locales, de preference pour une duree minimum d'un mois. A titre d'exemple, le sechage peut etre realise entre septembre et decembre pour les recoltes du centre de la France.
Les feuilles de tabac peuvent etre retournees ou aerees une ou plusieurs fois durant le sechage, de maniere a permettre un sechage homogene et eviter la formation de condensation, le pourrissement ou la degradation 20 des feuilles.
La methode de sechage a l'air libre peut etre utilisee par exemple pour le tabac de variete Burley.
Selon un mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees en sechoir naturel.
Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees en sechoir chauffant.
Dans ce cas, le sechage peut etre realise dans un hangar OU un local Chauffe a une temperature adaptee. 30 Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees par sechage au four.
Dans ce cas, le sechage peut etre realise dans un local ou un hangar chauffe a une temperature adaptee.
La chaleur peut etre introduite dans le local ou le hangar par des conduits relies a une chaudiere exterieure.
Ce chauffage controle permet d'obtenir des feuilles d'une couleur jauneCA 03020055 2018-10-04 16 orange.
Ces feuilles contiennent alors un fort taux de sucre.
Le tabac de Virginie peut par exemple etre seche selon cette methode.
Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu 5 a partir de feuilles de tabac sechees par sechage au soleil.
Dans ce cas, les feuilles de tabac peuvent etre etendues sur des claies et exposees au soleil pendant 12 a 30 jours.
Sous la chaleur et le rayonnement directs du soleil, les feuilles prennent une couleur jaune ou orange et gardent un fort taux de sucre.
Le tabac oriental est generalement seche selon cette methode.
Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait de feuilles de tabac est obtenu a partir de feuilles de tabac sechees par sechage au feu.
Dans ce cas, on peut brGler du petit bois sous les feuilles de tabac, qui sechent en s'impregnant d'un arome « fume ». 15 L'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention est avantageusement un extrait aqueux.
L'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention est avantageusement un extrait aqueux de couleur brune.
De preference, l'extrait de feuilles de tabac est susceptible d'etre obtenu par un procede d'extraction par un solvant, par exemple un solvant aqueux, d'un broyat de feuilles de tabac sechees suivie d'une separation des residus solides de la solution d'extrait de broyat de feuilles de tabac sechees puis d'une diafiltration a volume 25 constant de la solution d'extrait de broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide avec un solvant aqueux en une quantite allant de 2 a 12 fois en volume, de preference 3 a 10 fois en volume, de preference 4 a 8 fois en volume, de preference 6 fois en volume, par rapport au volume de l'extrait et avec une membrane ayant un seuil de coupure a 1 0 kDa.
Bien entendu, d'autres types de solvant peuvent etre utilises pour realiser le procede d'extraction de l'extrait de feuilles de tabac. L'extraction de l'etape c peut etre realisee avec un solvant organique ou inorganique, ou avec un melange de solvants organiques et/ ou inorganiques. 17 Pour assurer une bonne efficacite et un bon rendement d'extraction, et pour obtenir un extrait de bonne qualite presentant les proprietes de purete et la composition desirees, l'homme du metier saura aisement selectionner le ou les solvants appropries selon les criteres suivants : 5 la polarite du solvant ou du melange de solvant (polaire ou apolaire) ; l'etat physique du solvant ou du melange de solvant (par exemple liquide, solide, supercritique, ou gazeux) ; la nature chimique du solvant ou du melange de solvant (par exemple organique ou inorganique) ; la charge du solvant ou du melange de solvant (par exemple ionique ou non ionique) ; l'origine du solvant ou du melange de solvant ; la miscibilite du solvant ou du melange de solvant ; la solubilite du solvant ou du melange de solvant.
L'homme du metier saura quelle technique utiliser pour selectionner le ou les solvants correspondant a ses criteres, en fonction du rendement d'extraction, de la purete et de la composition de l'extrait desires. 20 Avantageusement, l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention est obtenu par le procede de preparation de feuilles de tabac decrit ci-apres.
Composition pharmaceutique Dans un deuxieme aspect, la presente invention concerne une composition 25 pharmaceutique comprenant a titre de principe actif l'extrait de feuilles de tabac tel que decrit ci-dessus.
La composition pharmaceutique selon la presente invention comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, tel que les solvants 30 pharmaceutiquement acceptables, et par exemple de l'eau.
Avantageusement, la composition pharmaceutique comprend des proteines presentes dans l'extrait de feuilles de tabac selon l'invention en une teneur allant de 1 a 18 1 000 μg/ml, de preference de 10 a 500 μg/ml, de preference de 50 a 300 μg/ml, de preference de 60 a 200 μg/ml, de preference entre 80 et 150 μg/ml.
La composition pharmaceutique selon l'invention est de preference une composition 5 aqueuse.
Selon un mode de realisation particulier, la composition pharmaceutique peut comprendre en outre un actif agissant sur le renforcement negatif, tel que par exemple un substitut nicotinique, la varenicline ou le bupropion.
Selon un mode de realisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un adjuvant.
On peut notamment citer comme adjuvant les agents de gonflement comme par exemple un sucre tel que le lactose, le saccharose, le trehalose, le sorbitol, le glucose, le raffinose, le mannitol, de preference le lactose, le saccharose, le 15 trehalose, le glucose, ou le mannitol, un acide amine tel que ['arginine, la glycine, ou l'histidine, de preference la glycine, ou des polymeres de type dextrane ou polyethylene glycol, ou leurs melanges.
Selon ce mode de realisation, la composition pharmaceutique comprend 50 a 99 % en poids d'adjuvants, de preference de 80 a 97 % en poids, par rapport au poids total de la composition pharmaceutique.
Selon un mode de realisation particulier, la composition pharmaceutique peut comprendre en outre des proteines extraites du cannabis.
Selon un mode de realisation, la composition pharmaceutique selon la presente 25 invention est presentee sous une forme propre a une administration sous cutanee.
Selon un autre mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme propre a une administration a l'aide d'un systeme therapeutique transdermique adhesif.
Avantageusement, la composition pharmaceutique est 30 presentee sous une forme de patch.
Selon un autre mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme propre a une administration par pulverisation ou par vaporisation.
Avantageusement, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme de 35 pulverisateur, de vaporisateur, ou de spray. 19 La composition pharmaceutique selon l'invention est de preference preparee selon le procede de preparation de composition pharmaceutique comprenant l'extrait de feuilles de tabac decrit ci-apres. 5 Utilisation de la composition pharmaceutique Dans un troisieme aspect, la presente invention concerne ['utilisation de la composition pharmaceutique pour le traitement de ['addiction au tabac.
Par « traitement de ['addiction au tabac » ou par « traitement de la dependance au 1 0 tabac », on entend plus precisement au sens de la presente invention la reduction des renforcements addictifs de la cigarette. L'administration de la composition pharmaceutique selon l'invention permet notamment de reduire les renforcements positifs de la cigarette et notamment l'envie de fumer. 15 La presente invention concerne egalement une composition comprenant un extrait de feuilles de tabac tel que defini ci-dessus pour son utilisation dans le traitement de ['addiction au tabac.
En d'autres termes, la presente invention concerne egalement une methode pour 20 traiter ['addiction ou la dependance au tabac, comprenant ['administration d'une composition comprenant un extrait de feuilles de tabac tel que defini ci-dessus.
Avantageusement, ['administration de la composition selon ['invention permet au patient d'arreter de fumer, de diminuer sa consommation ou de prevenir sa rechute 25 apres un arret en attenuant les renforcements positifs du tabac et notamment l'envie de fumer, facilitant ainsi le sevrage tabagique.
Avantageusement, ['administration de la composition aide tout type de fumeur, i.e. y compris les gros fumeurs, a arreter de fumer, a diminuer ou a eviter de rechuter en cas d'arret. 30 Avantageusement, ['administration de la composition selon ['invention comprenant en outre des proteines extraites du cannabis permet de traiter conjointement la dependance ou ['addiction au tabac et au cannabis.
Selon un mode de realisation, la composition selon la presente invention est administree par injection sous-cutanee.
Selon ce mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme propre a une administration sous cutanee.
Selon un mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme de dosage de 0,03 ml a 10 ml, de preference de 0, 1 ml a 5 ml, de preference de 0,5 a 2 ml.
La composition pharmaceutique est alors de preference administree en une quantite de 0,03 ml a 10 ml, de preference de 0, 1 a 5 ml, de preference de 1 0 0,5 ml a 2 ml par injection sous-cutanee.
Selon un mode de realisation, la composition selon la presente invention est administree a l'aide d'un systeme therapeutique transdermique adhesif contenant l'extrait de feuilles de tabac tel que defini ci-dessus.
Selon ce mode de realisation, la 15 composition pharmaceutique est presentee sous une forme propre a une administration a l'aide d'un systeme therapeutique transdermique adhesif.
Avantageusement, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme de patch.
Le patch peut se presenter sous la forme d'un patch de type reservoir a un ou plusieurs 20 compartiments ou bien de type matriciel.
La realisation pratique des patchs sera determinee par l'homme du metier en application de ses connaissances generales en la matiere pour obtenir une administration systemique controlee et prolongee de l'extrait de feuilles de tabac, sur toute la periode d'application du patch, par exemple pendant une duree d'environ 2h a 24h.
Le type de patch reservoir comportera un ou plusieurs reservoir(s) separe(s) contenant le ou les principe(s) actif(s) (dont l'extrait de feuilles de tabac) en solution ou en suspension dans la matrice polymere venant au contact de la peau par l'intermediaire d'une membrane polymerique semi-permeable permettant d'ajuster la vitesse de 30 liberation du ou des principe(s) actif(s).
Le patch de type matriciel comportera une masse polymerique a l'interieur de laquelle le ou les principe(s) actif(s) se trouveront dissous ou disperses dans les proportions adequates.
La liberation de ces principes actifs se fait par diffusion au travers des 35 cha1nes polymeres de ladite matrice. 21 Selon un mode de realisation particulier de ce type de patch, l'adhesif recouvre la totalite de la surface de liberation de la matrice et fait partie integrante de cette derniere.
On se trouve ainsi en presence d'un patch de type adhesif actif bien connu de l'homme du metier qui releve d'une fabrication simplifiee et qui permet des 5 realisations de patchs de faible epaisseur et de souplesse appropriee permettant une application confortable sur la peau du patient.
Pour assurer une bonne infusion de ces principes actifs de maniere sous-cutanee, ou dans la circulation sanguine, a la dose appropriee, a la vitesse de diffusion appropriee, 1 O et pour la duree appropriee, l'homme du metier pourra aisement fixer les parametres suivants : le rapport des surfaces et des volumes de chacun des compartiments du patch ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs additif(s) hydrophile(s) ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) activateur(s) ou inhibiteur(s) de diffusion ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) de solubilisation ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) de stabilisation ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs promoteur(s) d'absorption, et; de fac;:on plus generale, tout type d'additifs bien connus de l'homme du metier permettant de bien controler les flux et la stabilite de l'extrait de feuilles de tabac.
L'homme du metier saura quelle technique utiliser pour fixer les parametres listes cidessus en fonction de la solubilite et de la stabilite desiree.
Les differents parametres de fabrication du patch seront aisement adaptes l'homme du metier pour arriver au dosage souhaite.
De maniere en soi connue, un tel patch comprend un film protecteur retirable qui est 30 destine a preserver la face adhesive a appliquer sur la peau apres la fabrication du patch et durant toute sa duree de stockage.
De maniere en soi connue, l'homme du metier aura par exemple recours a des films polyesters dont l'une des faces peut etre traitee par des silicones anti-adherentes. 22 Selon un autre mode de realisation, la composition selon la presente invention est administree a l'aide d'un systeme de pulverisation ou de vaporisation contenant l'extrait de feuilles de tabac tel que defini ci-dessus.
Selon ce mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme propre a une administration 5 par pulverisation ou par vaporisation.
Avantageusement, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme de pulverisateur, de vaporisateur, ou de spray.
Le pulverisateur, le vaporisateur, ou le spray, peut se presenter sous la forme d'un 1 0 pulverisateur, le vaporisateur, ou le spray presentant un reservoir a un ou plusieurs compartiments.
La realisation pratique des pulverisateurs, vaporisateurs, ou sprays sera determinee par l'homme du metier en application de ses connaissances generales en la matiere pour obtenir une administration systemique controlee et prolongee de l'extrait de feuilles de tabac.
Le pulverisateur, le vaporisateur, ou le spray comportera un ou plusieurs reservoir(s) separe(s) contenant le ou les principe(s) actif(s) (dont l'extrait de feuilles de tabac) en solution ou en suspension.
Le ou les principe(s) act if (s) sont alors administres par pulverisation ou vaporisation sur la zone du corps a traiter.
La pulverisation ou 20 vaporisation peut par exemple etre realisee sur la peau.
Le ou les principe(s) actif(s) peuvent etre administres par pulverisation ou vaporisation dans les muqueuses.
Pour assurer une bonne infusion de ces principes actifs de maniere sous-cutanee, ou dans la circulation sanguine, a la dose appropriee, a la vitesse de diffusion appropriee, 25 et pour la duree appropriee, l'homme du metier pourra aisement fixer les parametres suivants : le rapport des surfaces et des volumes de chacun des compartiments ou reservoir du pulverisateur, vaporisateur, ou spray ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs additif(s) hydrophile(s) ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) activateur(s) ou inhibiteur(s) de diffusion ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) de solubilisation ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs agent(s) de stabilisation ; l'ajout eventuel d'un ou plusieurs promoteur(s) d'absorption, et; 23 de fac;:on plus generale, tout type d'additifs bien connus de l'homme du metier permettant de bien controler les flux et la stabilite de l'extrait de feuilles de tabac. 5 L'homme du metier saura quelle technique utiliser pour fixer les parametres listes cidessus en fonction de la solubilite et de la stabilite desiree.
Les differents parametres de fabrication du pulverisateur, du vaporisateur, ou du spray seront aisement adaptes l'homme du metier pour arriver au dosage souhaite.
Selon un premier mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme destinee a etre administree une seule fois.
Selon ce mode de realisation, la composition pharmaceutique est administree une seule fois permettant ainsi une diminution voire une suppression des renforcements positifs du tabac et 15 notamment l'envie de fumer.
Selon un autre mode de realisation, la composition pharmaceutique est presentee sous une forme destinee a etre administree plusieurs fois, de preference deux ou trois fois.
Selon ce mode de realisation, la composition pharmaceutique est de preference 20 administree a JO et J1 O ou a JO, a J1 O et a J30 permettant ainsi une diminution voire une suppression des renforcements positifs du tabac et notamment l'envie de fumer.
Dans ce mode de realisation, la dose injectee la deuxieme fois, et eventuellement la troisieme fois, est identique a la dose injectee la premiere fois. 25 Selon un mode de realisation particulier, la composition pharmaceutique selon la presente invention peut etre administree avec une composition comprenant un actif agissant sur le renforcement negatif, tel qu'un substitut nicotinique, la varenecline, le bupropion ou leurs melanges.
Selon ce mode de realisation, plusieurs modes d'administration particuliers peuvent etre envisages : 30 (i) une administration prealable a la tentative d'arret de fumer de la composition pharmaceutique selon ['invention afin de diminuer la consommation de cigarettes, suivie d'une administration de l'actif agissant sur le renforcement negatif afin de limiter les effets du renforcement negatif, et notamment la sensation de manque; 24 (ii) une administration concomitante de la composition pharmaceutique selon l'invention et d'un actif agissant sur le renforcement negatif au moment de la tentative d'arret de fumer, dans le but d'un arret immediat; (iii) une administration au moment de la tentative d'arret de fumer d'un actif agissant sur le renforcement negatif, par exemple pendant 12 semaines apres la tentative d'arret, suivie d'une administration de la composition pharmaceutique selon l'invention, par exemple pendant 2 semaines apres la fin de ['administration de l'actif agissant sur le renforcement negatif, dans le but de prevenir les rechutes.
Preparation de l'extrait de feuilles de tabac Dans un quatrieme aspect, la presente invention concerne la preparation d'un extrait de feuilles de tabac selon la presente invention. 15 Avantageusement, le procede de preparation de l'extrait de feuilles de tabac selon la presente invention comprend les etapes suivantes : a.
Sechage de feuilles de tabac, b.
Broyage de feuilles de tabac sechees pour obtenir un broyat de feuilles de tabac sechees, c.
Extraction du broyat de feuilles de tabac sechees sous agitation mecanique avec un solvant, par exemple un solvant aqueux, de preference une solution tampon aqueuse a pH compris entre 6,0 et 8,5, d.
Separation des residus solides de la solution de l'extrait du broyat de feuilles de tabac sechees par filtration ou centrifugation afin d'obtenir une solution d'extrait de broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide, e.
Diafiltration a volume constant de la solution obtenue a l'etape d avec un solvant, de preference un solvant aqueux, en une quantite allant de 2 a 12 fois en volume, de preference 3 a 10 fois en volume, de preference de 4 a 8 fois en volume, de preference 6 fois en volume, par rapport au volume de l'extrait, et avec une membrane ayant un seuil de coupure a 1 0 kDa, f.
Eventuellement lyophilisation de la solution proteique obtenue a l'etape e.
Selon un mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise a l'air libre, dit naturel.
Dans ce cas, le sechage est realise en presence de l'air libre naturel, a l'exterieur OU a l'interieur.
Le sechage peut etre realise dans un local ouvert OU ferme, couvert ou non.
Un sechage a l'air libre peut par exemple etre realise en sechoir 5 naturel.
Dans ce cas, les feuilles de tabac fraichement recoltees ou presechees sont laissees a secher de maniere naturelle sous l'effet de l'air libre.
Les feuilles de tabac peuvent par exemple etre suspendues dans des hangars ventiles non chauffes.
Les feuilles de tabac peuvent etre par exemple laissees a secher naturellement jusqu'a ce qu'elles prennent une couleur brune.
Ace stade, il n'y a pratiquement plus de sucre 1 0 dans la feuille.
Avantageusement, le sechage est realise pour une duree adaptee aux conditions climatiques locales, de preference pour une duree minimum d'un mois. A titre d'exemple, le sechage peut etre realise entre septembre et decembre pour les recoltes du centre de la France.
Les feuilles de tabac peuvent etre retournees une ou plusieurs fois durant le sechage, de maniere a permettre un sechage homogene et 15 eviter la formation de condensation ou le pourrissement ou la degradation des feuilles.
La methode de sechage a l'air libre peut etre utilisee par exemple pour le tabac de variete Burley.Selan un mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise en sechoir naturel. 20 Selon un autre mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise en sechoir chauff ant.
Dans ce cas, le sechage peut etre realise dans un hangar ou un local Chauffe a une temperature adaptee.
Selon un autre mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise par 25 sechage au four.
Dans ce cas, le sechage peut etre realise dans un local ou un hangar chauffe a une temperature adaptee.
La chaleur peut etre introduite dans le local ou le hangar par des conduits relies a une chaudiere exterieure.
Ce chauffage controle permet d'obtenir des feuilles d'une couleur jaune-orange.
Ces feuilles contiennent alors un fort taux de sucre.
Le tabac de Virginie peut par exemple etre seche selon 30 cette methode.
Selon un autre mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise par sechage au soleil.
Dans ce cas, les feuilles de tabac peuvent etre etendues sur des claies et exposees au soleil pendant 12 a 30 jours.
Sous la chaleur et le rayonnement 26 directs du soleil, les feuilles prennent une couleur jaune ou orange et gardent un fort taux de sucre.
Le tabac oriental est generalement seche selon cette methode.
Selon un autre mode de realisation particulier, le sechage de l'etape a est realise par sechage au feu.
Dans ce cas, on peut brGler du petit bois sous les feuilles de tabac, qui 5 sechent en s'impregnant d'un arome « fume ».
De maniere avantageuse le sechage de l'etape a favorise la degradation des proteines de tabac de haute masse moleculaire, telle que la RuBisCO, par exemple par des mecanismes d'hydrolyse.
Les etapes ca e correspondent aux etapes d'extraction, de filtration et de diafiltration du type de celle decrites dans le brevet US 5,770,698 (colonne 6, ligne 47 a colonne 7, ligne 7) et la demande de brevet US 2009 /0162403 (paragraphes [0032] a [0040] ). 15 De preference, ['extraction a l'etape c est realisee a une temperature comprise entre 4 et 20 ° C, de preference entre 4 et 1 O O C.
De preference, l 'extraction a l 'etape c est realisee pendant 12 a 36 h, de preference 22 a 26h, de preference 24h.
Selon un mode de realisation particulier, le solvant utilise a l'etape c est un solvant aqueux.
De preference, le solvant aqueux utilise a l'etape c est une solution tampon aqueuse de bicarbonate d'ammonium, de preference a une concentration comprise entre 2 et 6 g/L, de preference de 4 g/L.
Bien entendu, d'autres types de solvants peuvent etre utilises pour realiser l'extraction de l'etape c. L'extraction de l'etape c peut etre realisee avec un solvant organique ou inorganique, ou avec un melange de solvants organiques et/ou inorganiques.
Pour assurer une bonne efficacite et un bon rendement d'extraction, et pour obtenir un extrait de bonne qualite presentant les proprietes de purete et la composition desirees, l'homme du metier saura aisement selectionner le ou les solvants appropries selon les criteres suivants : 27 la polarite du solvant ou du melange de solvants (polaire ou apolaire) ; l'etat physique du solvant ou du melange de solvants (par exemple liquide, solide, supercritique, ou gazeux) ; la nature chimique du solvant ou du melange de solvants (par exemple organique ou inorganique) ; la charge du solvant ou du melange de solvants (par exemple ionique ou non ionique) ; l'origine du solvant ou du melange de solvants ; la miscibilite du solvant ou du melange de solvants ; la solubilite du solvant ou du melange de solvants.
L'homme du metier saura quelle technique utiliser pour selectionner le ou les solvant(s) correspondant aces criteres, en fonction du rendement d'extraction, de la purete et de la composition de l'extrait desires.
De preference, l'extraction a l'etape c est realisee en mettant en suspension le broyat de feuilles de tabac sechees dans une solution tampon, de preference a une concentration en broyat de feuilles de tabac sechees dans la solution tampon de 30 a 70 g/L, de preference de 40 a 60 g/L, et plus preferentiellement de 50 g/L.
Les residus 20 solides en suspension sont ensuite elimines par filtration, par exemple par filtration sur Buchner (etape d), afin d'obtenir un broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide.
De preference, le solvant aqueux utilise a l'etape d est de l'eau PPI (eau pour 25 preparation injectable).
De maniere avantageuse, l'etape e permet d'eliminer plus de 99 % des molecules de masse moleculaire inferieure a 1 0 kDa et notamment des acides amines libres, des proteines et peptides de masse moleculaire inferieure a 1 0 kDa et des residus 30 proteiques de masse moleculaire inferieure a 1 0 kDa issus de la degradation des proteines de l'etape a.
De preference, la solution proteique obtenue a l'etape e est soumise a une etape e', prealablement a l'etape f, de filtration sterilisante. 28 L'extrait de feuilles de tabac selon l'invention obtenu a l'issue du procede decrit cidessus peut etre conserve tel qu'obtenu a l'issu de l'etape d' de filtration sterilisante, OU lyophilise tel qu'obtenu a ['issue de l'etape f. 5 Preparation de composition pharmaceutique comprenant l'extrait de feuilles de tabac Dans un cinquieme aspect, la presente invention concerne la preparation de la composition pharmaceutique comprenant l'extrait de feuilles de tabac selon ['invention.
La composition pharmaceutique peut etre preparee selon un procede comprenant les etapes suivantes : a.
Preparation d'un extrait de feuilles de tabac tel que defini ci-dessus, b.
Ajustement de la concentration proteique de sorte a obtenir une concentration en proteine allant de 100 a 200 μg/mL, c.
Addition du ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, et d.
Eventuellement addition a cet extrait d'adjuvant(s), de preference addition de mannitol. 20 L'extrait de feuilles de tabac utilise a l'etape b peut etre soit celui directement obtenu apres l'etape de diafiltration sur membrane ayant un seuil de coupure a 1 0 kDa, soit celui obtenu apres l'etape de diafiltration sterilisante, soit l'extrait de feuilles de tabac lyophilise puis reconstitue par exemple dans du serum physiologique ou de l'eau. 25 Avantageusement, l'ajustement de la concentration a l'etape b peut etre realise : soit par dilution avec de l'eau afin d'abaisser la concentration en proteines, soit par diafiltration afin d'augmenter la concentration en proteines.
Un excipient pharmaceutiquement acceptable particulierement prefere a l'etape c est 30 l'eau.
Les adjuvants pouvant etre additionnes a l'etape d peut etre notamment les agents de gonflement comme par exemple un sucre tel que le lactose, le saccharose, le trehalose, le sorbitol, le glucose, le raffinose, le mannitol, de preference le lactose, 29 le saccharose, le trehalose, le glucose, ou le mannitol, un acide amine tel que ['arginine, la glycine, ou l'histidine, de preference la glycine, ou des polymeres de type dextrane ou polyethylene glycol ; ou leurs melanges. 5 Selon un mode de realisation particulier, l'etape d comprend au moins d'addition de mannitol.
Kit comprenant la composition pharmaceutique comprenant l'extrait de feuilles de tabac 1 0 Dans un sixieme aspect, la presente invention concerne un kit comprenant des doses d'extrait de feuilles de tabac ou de composition pharmaceutique selon ['invention.
Selon un premier mode de realisation, le kit comprend une ou des dose(s) d'extrait de feuilles de tabac, de preference sous forme lyophilisee, ainsi qu'une ou des dose(s) de 15 serum physiologique ou d'eau PPI pour preparer la composition pharmaceutique selon ['invention juste avant ['administration.
Selon un autre mode de realisation, le kit comprend une ou des dose(s) de composition pharmaceutique prete(s) a etre administree(s) au patient. 20 Le kit peut eventuellement comprendre une ou des seringue(s) afin d'administrer la composition pharmaceutique par injection sous-cutanee.
Le kit peut eventuellement comprendre un ou des patch(s) afin d'administrer la composition pharmaceutique de maniere transdermique.
Les exemples qui suivent visent a illustrer la presente invention.
EXEMPLES Exemple 1 : Preparation d'un extrait de feuilles de tabac selon !'invention 30 Des feuilles de tabac Burley sont utilisees pour preparer l'extrait. 100 g de feuilles de tabac Burley sechees par sechage naturel pendant environ trois mois (dans le centre de la France, entre septembre et decembre) sont broyes.
Le broyat est mis en suspension pendant 24h a une temperature de 4 a 1 O ° C dans 1 892 g d'eau PPI a laquelle 8 g de bicarbonate d'ammonium ont ete ajoutes.
Les residus 5 solides en suspension sont ensuite elimines par filtration sur Buchner.
Une filtration clarifiante a 0,2 μm de l'extrait est alors realisee. L'extrait obtenu est de couleur brune. L'extrait est ensuite pese afin de determiner le volume d'eau PPI a utiliser lors de l'etape de diafiltration a volume constant, la masse de l'extrait liquide 1 O est alors de 1 680 g.
Une extraction des proteines de cet extrait de broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide est ensuite realisee : 1 O 080 g d'eau PPI sont alors ajoutes a l'extrait de broyat de feuilles de tabac sechees sans residu solide.
Les 11 760 g de solution ainsi 15 obtenus sont diafiltres a volume constant contre 6 fois le volume avec un seuil de coupure a 1 O kDa (MerckMillipore) jusqu'a ramener la masse du retentat jusqu'a 1 680 g.
Le retentat obtenu apres la diafiltration constitue un melange proteique dans lequel 20 les proteines de masse moleculaire inferieure a 1 O kDa sont decelees avec une concentration de 99 % inferieure a leur concentration initiale.
La couleur du retentat obtenu est situee entre B2 et B3 selon l'echelle de mesure EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0, 2.2.2, Degree of coloration of liquids. 25 Ce diafiltrat peut etre lyophilise, apres ajout de mannitol par exemple, par exemple a l'aide d'un lyophilisateur SMH 150, pour obtenir un extrait de feuilles de tabac lyophilise.
Exemple 2 : Determination de la composition proteique de l'extrait de feuilles de 30 tabac prepare selon l'exemple 1 Les proteines de l'extrait de feuilles de tabac de l'exemple 1 sont prealablement separees sur un gel de polyacrylamide.
Pour cela, l'extrait a analyser est ajoute a un gel NuPage® Bis-Tris (4-12 %) et l'electrophorese est effectuee a 200 V pendant 35 min, avant d'etre mis au contact de 20 ml d'lnstant Blue pendant 1h puis rinse a l'eau 31 pendant une nuit.
Les bandes de gel de polyacrylamide selectionnees sont excisees (6 bandes), puis decolorees avec un tampon NH4CQ3 50 mM/CH3CN (50/50).
Les ponts disulfures sont ensuite reduits avec une solution de dithiothreitol 1 O mM/NH4CQ3 50 mM pendant 40 min a 55 ° C.
Les cysteines reduites sont en suite alkylees avec une 5 solution d'iodoacetamide 100 mM/NH4CQ3 50 mM pendant 30 min a temperature ambiante et dans l'obscurite.
La solution proteique ainsi obtenue est digeree grace a une enzyme afin d'obtenir des fragments de proteines ou de peptides : la digestion est realisee avec de la trypsine 1 O (trypsine V5111 de Promega) en quantite adaptee a la coloration des bandes de gel de polyacrylamide dans une solution de NH4CQ3 50 mM pendant une nuit a 37 ° C.
Les peptides du digestat peptidique sont alors separes par nanochrommatographie liquide (appareil U3000 nanoLC system de ThermoFischer Scientific) avec 15 preconcentration sur C18 PepMap micro-precolumn (5 μm; 100 A; 300 μm x 5 mm; Thermo Fisher Scientific) puis elution sur C18 PepMap nanocolumn (3 μm; 100 A; 75 μm x 250 mm; ThermoFisher Scientific) en mode gradient lineaire ; tampon A 0.1 % HCOOH dans H2O/CH3CN (95/5), tampon B 0.1 % HCOOH dans H2O/CH3CN (20/80), Gradient 0 a 60 % Ben 60 min, debit de 300 μL/min).
Les peptides sont ensuite analyses par spectrometrie de masse sur un instrument LTQ Velos (Dual Pressure Linear Ion Trap; ThermoFisher Scientific) equipe d'une source nanospray (ThermoFisher Scientific) et couple a l'appareil U3000 nanoLC.
Les donnees sont acquises avec le logiciel Excalibur 2.1 (ThermoFisher Scientific) en mode positif 25 par cycle de un scan MS de m/z 400 a 1600 en mode « Resolution Enhanced » suivie de scans MSMS en mode« Resolution Normal» sur les 20 ions MS les plus intenses (charge 2 et plus) en mode CID sous Helium avec une energie de collision de 35 eV.
Les ions MS precedemment fragmentes sont exclus dynamiquement pendant 30 s avec une tolerance en masse de 50 mmu.
Les masses des peptides et de leurs fragments sont comparees aux donnees existantes dans les banques de donnees afin de les identifier.
Pour cela, les donnees MS et MSMS sont traitees avec le logiciel ProteomeDiscoverer 1.4 selon l'algorithme de recherche MASCOT (Version 2.4) et la banque de donnees UniprotKB/Swiss-Prot (release April 35 2015) reduite a l'espece TOBAC est interrogee. 32 L'identification des proteines est validee selon la valeur de confiance p inferieure a 0,05.
Seules les proteines identifiees avec au moins 2 peptides de confiance maximale sont retenues. 5 Les scores de chaque proteine ainsi identifiee ne permettent qu'un classement relatif des proteines entre elles, ce classement etant correle aux concentrations de ces proteines.
Les valeurs absolues de ces scores dependent des conditions operatoires, de la prise d'essai, des quantites deposees. 1 O La liste des 12 proteines ainsi identifiees et classees par ordre decroissant de leurs scores (de la plus presente a la moins presente) est la suivante: P36401 ; E13H_ TOBAC ; Glucan endo-1,3-beta-glucosidase, acidic isoform PRQ' (EC 3.2.1.39) ((1->3)-beta-glucan endohydrolase) ((1->3)-beta-glucanase) (Beta-1,3-endoglucanase) (PR-35) ; MM : 36995 Da 15 P17513; CHIP_TOBAC; Acidic endochitinase P (EC 3.2.1.14) (Pathogenesisrelated protein P) (PR-P); MM: 27469 Da P17514 ; CHIQ_ TOBAC ; Acidic endochitinase Q (EC 3.2.1.14) (Pathogenesisrelated protein Q) (PR-Q); MM: 27633 Da P27666 ; E13F TOBAC ; Glucan endo-1,3-beta-glucosidase, basic vacuolar 20 isoform GLB (EC 3.2.1.39) ((1->3)-beta-glucan endohydrolase) ((1->3)-betaglucanase) (Beta-1,3-endoglucanase, basic) (Glucanase GLB); MM: 40443 Da P14170; OSMO_TOBAC; Osmotin; MM: 26681 Da P24091 ; CHl2_ TOBAC ; Endochitinase B (CHN-B) (EC 3.2.1.14); MM: 34721 Da P11965 ; PERX_ TOBAC ; Lignin-forming anionic peroxidase (EC 1.11.1. 7) 25 (TOPA); MM: 34674 Da P13046 ; PRR1_ TOBAC ; Pathogenesis-related protein R major form (Thaumatin-like protein E22); MM: 24667 Da P29062 ; PR4A_ TOBAC ; Pathogenesis-related protein PR-4A; MM: 16221 Da - Q03199; IPIB_TOBAC; Proteinase inhibitor I-B (Pl-IB) (Inhibitor of microbial 30 serine proteinases major isoform); MM: 11916 Da - Q03198; IPIA_TOBAC; Proteinase inhibitor I-A (Pl-IA) (Inhibitor of microbial serine proteinases minor isoform); MM: 11880 Da P29063 ; PR4B_ TOBAC ; Pathogenesis-related protein PR-4B ; MM: 16235 Da 33 Le procede de preparation de l'extrait de feuilles de tabac permet done de concentrer certaines proteines et d'en eliminer d'autres.
Ainsi, parmi les 759 proteines de l'espece Nicotiana tabacum listees dans Swissprot, uniquement 6 familles et 12 proteines sont tres majoritairement presentes dans l'extrait de feuilles de tabac 5 prepare selon l'exemple 1.
Les 12 proteines qui sont tres majoritairement presentes dans l'extrait de feuilles de tabac prepare selon l'exemple 1 presentent une masse moleculaire comprise entre 1 0 et 50 kDa.
Exemple 3 : determination de la teneur en proteines La teneur en proteines dans l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 (avant et apres l'etape de diafiltration) a ete determinee selon la methode de Bradford.
L'extrait de l'exemple 1 est dissout dans du serum physiologique.
Trois solutions standard de proteine ont ete preparees : 50 μL d'une solution d'albumine de serum bovin a 2mg/ml (Sigma Aldrich, reference P0834) sont dilues 20 fois avec 950 μL de serum physiologique afin d'obtenir des solutions standardisees a exactement 100 μg/ m L.
Chaque tube teste comprend 80 μl d'echantillon de proteine et 920 μL de reactif de Bradford (Sigma Aldrich reference B6916).
Apres addition du reactif de Bradford dans chaque tube, les tubes sont agites doucement de sorte a observer un vortex, puis incubes pendant 5 min a temperature ambiante.
Les echantillons sont transferes dans 25 des cuvettes de 1,5 ml et leur absorbance est mesuree a 595 nm pendant 1 h.
La concentration en proteine a ete determinee par comparaison avec les solutions standards de proteine preparees. 30 Les quantites de proteines mesurees sont de : avant diafiltration : 295,45 +/- 9,91 μg/ml apres diafiltration : 160,61 +/- 1,31 μg/ml. 34 Le profil electrophoretique de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 a ete determine apres l'etape de diafiltration.
Des quantites de 2, 5, 10 and 15 μg de proteines ont ete deposees sur un gel NuPage. 5 Le gel Nupage 4 % -12 % a ete prepare pendant 35 minutes puis mis dans 20 ml de Bleu de Commassie pendant 1 h et rince avec de l'eau pendant une nuit.
Le gel a ete analyse en utilisant le systeme ChemiDoc™ XRS de Biorad avec le logiciel Image Lab™.
Trois bandes principales sont detectees aux alentours de 15 kDa et 30 kDa (Fig. 1 ). 1 O Deux autres bandes sont egalement perceptibles a environ 40 kDa.
Les resultats montrent que la quantite de proteines de masse moleculaire superieure a 100 kDa detectee est faible compare a la quantite de proteines de masse moleculaire comprise entre 10 et 50 kDa, dans cet extra it de feuilles de tabac.
Exemple 4 : Influence du volume de diafiltration sur !'elimination des molecules de masse moleculaire inferieure a 1 0 kDa dans un extrait de feuilles de tabac selon !'invention 20 L'elimination des molecules de poids moleculaire inferieur a 10 kDa dans l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 a ete suivie lors de l'etape de diafiltration selon le volume de diafiltration utilise.
Le suivi est effectue par dosage par chromatographie en phase gazeuse d'un traceur analytique (nicotine) de masse moleculaire inferieure a 10 kDa.
Les resultats sont reportes dans le tableau suivant : Prelevements en fonction Aire de pies du traceur Pourcentage de traceur du volume de diafiltration analytique analytique restant Avant diafiltration 54913 100 % Diafiltration x3 volume 2630 4,79 % Diafiltration x4 volume 809 1,47 % Diafiltration x5 volume 247 0,045 % Diafiltration x6 volume NQ NQ L'elimination des molecules de poids moleculaire inferieur a 1 0 kDa est de plus en plus efficace lorsque le volume de diafiltration augmente et est totale lorsque ce volume de diafiltration est de 6 fois le volume initial. 5 Exemple 5 : activite biologique de l'extrait de l'exemple 1 in vitro sur des cellules mononucleees humaines et in vivo sur des souris Materiels et methodes : Produits utilises 1 0 PMA/lonomycin (reference P8139/I0634 de Sigma-Aldrich) BSA (reference A7020 de Sigma Aldrich) PBS (reference H15-002 de PM Laboratories) Tween 20 (reference P1379 de Sigma Aldrich) Goat anti-mouse lgG (g chain specific)- Alkaline Phosphatase (reference 1030-04 de 15 SouthemBiotech) Biotin-anti mouse lgE (reference BLE406904 de Biolegend) Streptavidin - Alkaline Phosphatase (Southern Biotech ref7100-04) Preparation et mode de stimulation des cellules 20 Des cellules mononucleees du sang peripherique de differents donneurs sains ont ete isolees par centrifugation sur un gradient de densite (milieu de separation : LMS 1077 PM Laboratories).
Les cellules mononucleees obtenues ont ete stimulees avec l'extrait selon l'exemple 1 a differentes dilutions pendant 24h ou 48h.
Les surnageants ont ete preleves puis stockes a -80° C apres 24h ou 48h de stimulation pour l'analyse du profil 25 cytokinique par la technique Luminex.
Apres 24h de stimulation les cellules ont egalement ete prelevees pour l'analyse phenotypique par cytometrie de flux. - Analyse phenotypique par cytometrie Les cellules ont ete marquees dans un premier temps par un marqueur de viabilite 30 (Dye eFluor 450 (65-0863-14 eBioscience) puis dans un deuxieme temps par des anticorps couples directement a des fluorochromes pour la detection de differents marqueurs membranaires.
Les populations de lymphocytes T et de lymphocytes B ont ete identifiees avec les marqueurs CD3 et CD19.
Les cellules NK ont ete detectees soient avec le marqueur NKp46 ou la combinaison des marqueurs CD56 et CD16 ou via 35 ['expression de CD56 en ['absence de CD3. A partir de ces populations cellulaires, des 36 « gates » ont ete effectuees pour analyser differents marqueurs d'activation (CD69, CD25, HLA-DR).
La liste des anticorps utilises pour l'analyse phenotypique par cytometrie est donnee 5 dans le tableau suivant : Clone Reference et fournisseur Anti-CD45-Krome Orange J.33 A96416 ; Beckman Coulter Anti-CD56 APC B159 555518 ; Becton Dickinson Anti-CD25PC7 M-A251 557741 ; Becton Dickinson Anti-CD25 PC5 B1 .49.9 IM2646 ; Beckman Coulter Anti-CD69 FITC FN50 557049 ; Becton Dickinson Anti-CD69 PE L78 341652 ; Becton Dickinson Anti-CD3 ECD UCHT1 A07748 ; Beckman Coulter Anti-KpP46 APC 9E2/NKp46 558051 ; Becton Dickinson Anti-CD19 FITC HIB19 11-0199-42 ; eBioscience Anti-HLA-DR PE G46-6 347401 ; Becton Dickinson Des controles isotypes ont ete utilises dans chaque experience et une matrice de compensation realisee pour cette analyse phenotypique multiparametrique. 1 O Les echantillons marques ont ete analyses sur un cytometre Navios (Beckman Coulter 1 O couleurs) avec une acquisition d'un minimum de 100 000 evenements par tube.
Les donnees acquises ont ensuite ete analysees sur le logiciel Kaluza. - Analyse du profil de secretion cytokinique par Luminex et ELISA 15 Cette technologie basee sur des principes de technique ELISA et de cytometrie permet le dosage de plusieurs analytes simultanement.
Des microbilles possedant un code couleur unique sont couplees a des anticorps de capture specifique pour chaque analyte.
Apres une incubation avec les echantillons a 20 doser, des anticorps de detection couples a un fluorochrome vont permettre ['analyse par un systeme optique de deux lasers (Bio-plex 200 system Bio-rad).
Le premier laser permet ['identification de la microbille et le second permet de quantifier les anticorps de detection couples au fluorochrome. 17 analytes peuvent etre doses avec le kit BioPlex Pro Human Cytokine Grp1 panel 17 plex (Bio-rad) sur les echantillons preleves au 37 cours des differentes experiences de stimulations realisees sur les cellules.
Les cellules stimulees par le milieu de culture sans l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 permettent d'obtenir le taux basal pour chaque cytokine. 5 L'ELISA IL-8 repose sur une technique sandwich immunoenzymatique classique.
Les trousses commerciales utilisees ont ete achetees chez Eurobio-Diaclone (Besanc;:on).
Immunisation des souris avec l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 Des souris femelles de 7 semaines C57BL/6 et Balb/c ont ete achetees chez Charles 1 0 River (L'Arbresles, France).
Les souris ont ete immunisees a JO et J21 par voie intraperitoneale avec 200 μL de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 lyophilise puis reconstitue dans 5 ml de serum physiologique.
Du sang de souris a ete preleve chez toutes les souris avant et apres immunisation.
Apres centrifugation, le serum a ete congele a -20°C.
ELISA lgG et lgE Pour ['experience ELISA, un flacon du produit a ete reconstitue avec 2,5 ml de tampon carbonate-bicarbonate (0.1M, pH 9).
Des plaques Nunc Maxisorb 96W ont ete incubees avec 100 μL de l'extrait de feuilles de tabac lyophilise selon l'exemple 1 puis 20 reconstitue, et laissees incuber 18h.
Apres lavage des plaques en tampon PBS-Tween 0,05 %, les plaques sont saturees avec 200 μL de tampon PBS-BSA 1 % pendant une heure a temperature ambiante.
Apres lavage des plaques en tampon PBS-Tween 0,05 %, 100 μL de serum des souris, dilue au 1 /20 dans du PBS-BSA 1 % sont incubes pendant 2 heures a temperature ambiante.
Elisa lgG : Apres lavage en tampon PBS-Tween 20, 100 μL d'un anticorps secondaire de chevre anti-lgG de souris couple a la phosphatase alcaline (Southern Biotechnology ref 1030- 04) et dilue dans du PBS-BSA 1 % est incube pendant 1 heure a temperature.
Apres des 30 lavages en PBS-Tween 0.05 %, 100 μL du substrat p-Nitrophenyl phosphate (pNPP de Sigma) de la phosphatase alcaline est ajoute et laisse 15 min a temperature ambiante a l'obscurite.
La reaction est ensuite arretee en ajoutant 50 μL de NaOH 3M et les densites optiques (DO) sont lues a 405 nm. 38 Elisa lgE Apres lavage en tampon PBS-Tween 20, 100 μL d'un anticorps secondaire de rat antilgE de souris couple a la biotine (Biolegend Ref BLE406904) et dilue dans du PBS-BSA 1 % est incube pendant 1 heure a temperature ambiante.
Apres des lavages en PBS- 5 Tween 0,05 %, 100 μL de streptavidine coup lee a la phosphatase alcaline (Southern Biotechnology Ref 7100-04) est ajoute et incubee pendant 1 h a temperature ambiante (dilution 112oooeme dans PBS-BSA 1 % selon les recommandations du fournisseur).
Apres de nouveaux lavages en PBS-Tween 0,05 %, 100 μL du substrat pNPP de la phosphatase alcaline est ajoute et laisse 15 min a temperature ambiante a l'obscurite.
La reaction 1 O est ensuite arretee en ajoutant 50 μL de Na OH 3M et les densites optiques (DO) sont lues a 405 nm.
Resultats: L'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 entraine une reponse humorale de type lgG specifique chez des souris.
Apres 2 immunisations de souris avec l'extrait de feuille de tabac lyophilise selon l'exemple 1 puis reconstitue dans 5 ml de serum physiologique, une induction d'lgG a ete observee contre des composants du produit.
Ainsi, 4/5 souris C57BL/6 et 4/5 souris Balb/c ont presente une augmentation de leur lgG contre l'extrait de feuilles de tabac 20 a J28, soit 7 jours apres la 2eme vaccination (Fig. 2).
La seule souris dans chaque groupe n'ayant pas repondu avait des taux d'anticorps de type lgG a l'etat basal.
Les titres d'anticorps semblent plus faibles chez les souris Balb/c que chez les souris C57BL/6 (Fig. 2). 25 Par contre, aucune reponse humorale de type lgE apres 2 vaccinations des souris avec l'extrait de feuilles de tabac n'a ete detectee.
Les densites optiques (DO) etaient inferieures a 0,05 dans tous les dosages realises sur les differents serums.
L'extrait de feuilles de tabac active preferentiellement les cellules Natural Killer du sang peripherique Apres isolement des cellules mononucleees du sang peripherique par gradient de densite (Ficoll), differentes populations cellulaires (lymphocytes T et B, cellules NK ... ) peuvent etre caracterisees (Fig. 3).
Ainsi les cellules NK ont ete identifiees par les marqueurs CD56 et CD16 dans la population CD3 negative ou par le marqueur NKp46. 35 Apres incubation des cellules mononucleees avec l'extrait de feuilles de tabac selon 39 l'exemple 1, une augmentation d'expression des marqueurs d'activation CD69, CD25 et HLA-DR a ete observee sur les cellules NK aussi bien identifiee par les marqueurs CDl6+CD56+ (CD3-) (Fig. 4A) que par le marqueur NKp46 (Fig. 4B).
Les resultats sont plus marques avec l'extrait de feuilles de tabac dilue au ½ et pour ['expression du 5 CD69.
Ainsi plus de 60 % des cellules NK expriment le marqueur CD69, 24 heures apres la mise en contact avec l'extrait de feuilles de tabac (Fig. 4A-B).
Au repos, moins de 5 % des cellules NK du sang expriment CD69.
L'effet de l'extrait de feuilles de tabac sur ['activation des lymphocytes du sang 1 0 peripherique est beaucoup plus faible.
Ainsi, au repos 2 % des lymphocytes T expriment CD69 et cette expression augmente a 6 % apres 24 heures de culture avec l'extrait de feuilles de tabac (Fig. 5A). L'expression du CD25 n'est pas augmentee sur les lymphocytes T sensibilises avec l'extrait de feuilles de tabac (Fig. 5A).
De meme, sur les lymphocytes B du sang peripherique, l'extrait de feuilles de tabac n'a pas d'activite 15 significative, car moins de 3 % des lymphocytes B expriment CD69 apres 24 heures de co-culture avec cet extrait (Fig. 5B).
Profil de cytokines induit par l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 sur les cellules mononucleees du sang humain 20 Des cellules mononucleees du sang peripherique ont ete mises en contact pendant 24 heures avec l'extrait de feuilles de tabac lyophilise selon l'exemple 1 puis reconstitue avec 5 ml de PBS a differentes dilutions (1 /2 ou 112oeme) et des dosages de cytokines, chimiokines et facteurs de croissance ont ete realisees par Luminex dans le surnageant.
La figure 6 montre une induction de cytokines pro-inflammatoires (IL-1 B, IL-6, TNFa, I L-17) importantes par l 'extra it de feuilles de tabac.
Ainsi les taux basaux de ces cytokines lorsque les cellules mononucleees ne sont pas mises en presence de l'extrait de feuilles de tabac sont inferieurs a 1 O pg/ml (Fig. 6A).
Les concentrations des cytokines IL-1 B, IL-6 et TNFa sont mesurees a plus de 1 000 pg/ml apres incubation avec l'extrait de feuilles de tabac dilue au ½ (Fig. 6A).
Cette nette induction de cytokines pro-inflammatoires est egalement observee lorsque l'extrait de feuille de tabac est dilue au 112oeme (Fig. 6A).
Les resultats sont assez 35 homogenes entre les differents donneurs testes.
Parmi les cytokines TH1 (IL-2, IFNy, IL-12) favorisant une immunite a mediation cellulaire, seule l'IFNy est significativement stimulee par l'extrait de feuilles de tabac dilue au 1 /2 et au 112oeme (Fig. 6B). L'extrait de feuilles de tabac induit de tres faibles concentrations de cytokines TH2 (IL-4, IL-5, IL-13) de l'ordre de quelques pg/ml (Fig. 7A).
Par contre, 5 l'extrait de feuilles de tabac stimule la production d'IL-10 par les cellules mononucleees avec des taux de 750 pg/ml retrouves dans le surnageant des cellules mises en contact avec l' extra it de feuilles de tabac dilue au 1 /2 (Fig. 7 A). L'I L-1 0 eta it initialement consideree comme une cytokine TH2 mais elle peut etre produite aussi par des lymphocytes T regulateurs appeles Tr1.
Nous avons montre que l'extrait de feuilles de tabac pouvait egalement induire la production de facteurs de croissance hematopo"ietique comme le G-CSF qui favorise ['expansion et le recrutement de neutrophiles et de chimiokines comme le MCP-1 connue pour exercer un effet chimiotactique sur les macrophages (Fig. 7B).
Par contre, 15 l'extrait de feuilles de tabac ne semble pas stimuler de fac;:on significative d'autres facteurs de croissance comme l'IL-7 ou le GM-CSF (Fig. 7B).
Le meme profil de cytokines/chimiokines a ete retrouve lorsque les dosages ont ete realises sur des surnageants recueillis 48 heures apres la mise en culture avec l'extrait de feuilles de tabac.
Conclusion L'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 est capable d'induire une reponse humorale de type lgG specifique dirigee contre des proteines presentes dans le produit chez deux lignees de souris de fond genetique differents.
Aucune reponse humorale de type lgE n'a ete observees apres deux administrations du produit chez ces memes souris.
In vitro, l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 induit preferentiellement 30 ['activation des cellules NK parmi les cellules mononucleees du sang peripherique.
Cette activation est refletee par ['augmentation d'expression des molecules CD69, CD25 et HLA-DR.
L'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 induit in vitro des cytokines pro- 35 inflammatoires comme l'IL-1 B, l'IL6, l'IL-17, l'IL-8 et du TNFa.
Ces cytokines sont 41 presentes a fortes concentrations dans le surnageant de culture preleve 24 heures apres la stimulation.
L'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 induit egalement de l'IFNy, de l'IL-10, 5 du G-CSF et du MCP-1.
Par contre, cet extrait n'induit pas de fac;:on significative la production de cytokines TH2 (IL-4, IL-5, IL-13).
Exemple 6 : etude toxicologique d'un extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 10 Materiels et methodes : Toutes les etudes ci-dessous ont ete realisees avec l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1.
La voie d'administration est la voie sous-cutanee dans tous les cas.
Les etudes toxicologiques ont ete realisees sur des rongeurs (rats Han Wistar).
Les etudes 15 toxicologiques ont ete realisees selon les principes de l'OCDE en matiere de bonnes pratiques de laboratoire (Acceptation Mutuelle des Donnees (AMD) dans ['evaluation des donnees, 26 novembre 1997 (((97) 186 Final) et selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire (GLP) publiees par le Ministere franc;:ais de l'Emploi et de la Solidarite (n° 2000/5bis, arrete du 14 mars 2000, JO 23/03/2000).
Etude de la toxicite sous-cutanee a 14 jours L'objectif de cette etude a ete de determiner la toxicite de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 dans les rats suivant ['administration sous-cutanee (une fois par semaine pendant 2 semaines).
L'etude a ete menee comme suit: Groupe Dose exprimee Volume de Concentration de Nombre no en proteines dose dose exprimee en d'animaux (μg/kg/adm) (ml/kg/adm) proteines (μg/mL) males femelles 1 0 2 0 6 6 2 11,2 0,4 28 6 6 3 56 2 28 6 6 42 Les resultats de l'etude ont montre que : aucune mortalite n'est observee quelle que soit la dose ; aucun signe clinique lie au traitement n'est observe et ['administration souscutanee est localement bien toleree (les signes clinique et la tolerance locale ont ete observes avant et apres injection, et une fois par jour quand aucun traitement n'est administre) ; les consequences sur le poids corporel et la consommation de nourriture (compares aux controles) ne sont pas prejudiciables ; la leucocytemie presente des differences, entre les rongeurs traites et non traites, considerees comme significatives biologiquement mais sans effet toxique; des variations ont ete observees entre le groupe traite et celui non traite en ce qui concerne les concentrations en proteines et en cholesterol, mais ces variations sont restees dans ou proches de celles du groupe controle.
Ces effets ne sont pas prejudiciables ; aucune modification n'a ete observee pour ce qui est du poids des organes entre le groupe traite et le groupe controle.
L'administration sous-cutanee aux rats Wistar de l'extrait de feuille de tabac selon 20 l'exemple 1 une fois par semaine pendant 2 semaines a des doses de 11,2 et de 56 μg de proteines/kg/adm a ete done bien toleree.
Etude de la toxicite sous-cutanee pendant 4 semaines L'objectif etait de determiner la toxicite de l'extrait de feuilles de tabac selon 25 l'exemple 1 suivant ['administration sous-cutanee une fois par semaine a des rats Wistar et de determiner la regression de tout signe de toxicite durant une periode de 4 semaines sans traitement.
Une attention particuliere a ete portee a de potentiels phenomenes immunologiques. 43 L'etude a ete menee comme suit: Groupe/ Dose(1l Volume Concentratio Nombre d'animaux traitement (μg/kg de dose n de dose Apres Apres periode / adm) (ml/kg (μg/mL) traitement(2l d 'observation(3l / adm) male femelle male femelle s s s s 1.
Controle (vehicule: 0,0 4,0 0,0 10 10 5 5 0,9 % NaCl) 2. faible 16,8 0,6 28,0 10 10 I I dose 3. dose intermediair 33,6 1,2 28,0 10 10 I I e 4. forte dose 112,0 4,0 28,0 10 10 5 5 (1) Exprime en proteines (2) Rats tues 2 jours apres la derniere administration (23ieme jour) (3) Rats tues 4 semaines apres la derniere administration (49ieme jour) Pendant la periode de traitement, les rats ont ete observes avant et au moins 3 fois apres ['administration.
Pendant la periode d'observation, les rats etaient observes une fois par jour. 1 0 Un examen clinique complet etait realise une fois par semaine.
La tolerance locale a ete notee avant et apres chaque injection, une fois par jour durant la premiere semaine et ensuite deux fois par semaine jusqu'a la fin de la periode d'observation.
La temperature corporelle a ete mesuree le lendemain de chaque administration (jours 1, 8, 15 et 22).
Des examens ophtalmologiques ont ete realises avant le test, ainsi que un jour apres le premier et le dernier jour d'administration (jours 1 et 22).
Les poids corporels individuels et la consommation de nourriture ont ete mesures 2 fois 20 par semaine. 44 Des analyses hematologiques, de coagulation, des parametres de la chimie clinique serique et de lymphocites ont ete realises les 23eme et 49/48eme jours (male/femelle respectivement).
Des analyses d'urine ont ete effectuees le 23eme jour. 5 Tous les animaux ont ete tues 2 jours apres la derniere administration ou apres une periode d'observation de 4 semaines et autopsies.
Certains organes ont ete peses et utilises pour les examens histopathologiques.
Les resultats de l'etude ont montre que : aucune mortalite n'est observee quelle que soit la dose ; l'administration sous-cutanee a des doses exprimees en proteines de 16,8, 33,6 et 112,0 μg/kg/adm a ete bien toleree localement; aucun signe clinique lie au traitement n'est observe ; la temperature corporelle n'est pas affectee ; aucun impact ophtalmologique lie au traitement n'a ete observe; le poids corporel et la consommation alimentaire ne sont pas affectes ; aucune difference significative en ce qui concerne l'hematologie, la coagulation et l'urine n'a ete observee ; l'activite enzymatique des creatine-kinases a diminue dans les groupes 3 et 4 de femelles (doses intermediaire et forte; 33,6 et 112 μg/kg/adm respectivement) a la fin de la periode de traitement.
Ces variations n'ont pas ete considerees comme prejudiciables dans la mesure ou elles ne sont pas associees a des caracteristiques histopathologiques ; une legere diminution du nombre de cellules NK circulantes chez les femelles traitees et chez les males traites avec des doses intermediaire et forte (groupes 3 et 4) ; a la fin de la periode d'observation, la valeur moyenne du nombre de cellules NK circulantes chez les males traites a forte dose (groupe 4) etait plus faible ; aucune modification du poids des organes n'a ete observee ; une tache sombre a ete observee au niveau du lieu d'injection, ce qui correspond a des hemorragies sous-cutanees durant ['evaluation histopathologique.
Cette observation est consideree comme non liee a la procedure d'administration.
A la fin du traitement, des changements inflammatoires cutanes minimes ou legers au lieu d'injection des groupes 3 et 4, tandis que quasi aucun changement inflammatoire n'a ete observe pour les groupes 1 et 2. 5 A la fin de la periode d'observation, les changements inflammatoires observes precedemment pour le groupe 4 ont montre un retablissement quasi-total.
Les 4 injections sous-cutanees de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 jusqu'a une dose de 112 μg/kg/adm ont ete bien tolerees et seulement de minimes et 1 O reversibles changements inflammatoires sont apparus chez les rats traites comparativement aux rats non traites.
En conclusion, dans les conditions experimentales definies ci-dessus, ['administration sous-cutanee dans des rats Wistar de l'extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 15 une fois par semaine pendant 4 semaines, a des doses de 16,8, 33,6 et 112 μg/kg/adm, a ete bien toleree et n'est pas associe a un quelconque effet indesirable.
Exemple 7 : etude clinique suite a !'administration d'un extrait de feuilles de tabac selon l'exemple 1 Une composition pharmaceutique comprenant de l'extrait de feuille de tabac selon l'exemple 1, contenant 100 μg ou 200 μg de proteines et du mannitol, a ete administree par injection sous cutanee une premiere fois a JO et une seconde fois un mis apres a J29 (1 ml dans chaque bras a chaque fois) a 24 fumeurs.
Les inclusions ont ete realisees 25 suivant le principe d 'extension de cohortes, 6 premiers patients recevant 100 μg etant inclus en premier, suivis de 6 premiers patients recevant 200 μg, avant ['inclusion de 6 patients supplementaires recevant 100 μg.
La population de sujets traites etait constituee de 24 personnes, 14 hommes et 10 femmes, d'age compris entre 30 et 65 ans avec un age median de 44,5 ans. ll convient de noter qu'aucune des doses testees n'a genere une toxicite de niveau 3-4 selon les grades de toxicite de la classification Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v 4.0 du Na tional Cancer Institute. 46 Les caracteristiques initiales des sujets en matiere de consommation de tabac sont mentionnees dans le tableau ci-dessous.
N % Mediane Etendue Statut du consommateur Fumeur 24 100 Consommation Cigarette manufacturees, 18 75 20 (15;30) Nb/J 3 12.5 20 (15;30) Cigarettes roulees, Nb/ J 3 12.5 20 (15;20) Cigarillos, Nb/ J Niveau de dependance Fagerstom 5 11 46 6 5 21 7 2 8 8 3 12.5 9 3 12.5 Mesure du CO exhale (ppm) 24 24.5 (9 ; 45) Souhaitez-vous arreter de fumer? Non 24 100 Qui Les figures 8 et 9 montrent ['evolution de la consommation de tabac.
La formule de calcul de la diminution du nombre de cigarettes s'etablit comme suit: (Nb de cigarettes visite n - Nb de cigarettes a l'inclusion) / Nb de cigarettes a 10 ['inclusion.
Un point fait a 4 semaines a mis en evidence que 16 fumeurs (soit 67 % des fumeurs) avaient arrete de fumer ou reduit leur consommation quotidienne de cigarettes d'au moins 50 % et que la consommation de cigarettes quotidiennes des 24 fumeurs avait 15 diminue de 60 %. 47 Un point fait a 12 semaines a mis en evidence que 15 fumeurs (soit 63 % des fumeurs) avaient arrete de fumer ou reduit leur consommation quotidienne de cigarettes d'au moins 50 % et que la consommation de cigarettes quotidiennes des 24 fumeurs avait diminue de 60 %. ll est interessant de relever que les 12 derniers fumeurs (soit 12 sur 24) ont beneficie d'un delai plus long (parfois d'un mois ou plus) entre leur premiere prise de contact avec le centre d'etude clinique et l'injection d'un extrait de tabac selon l'exemple 1 alors que les 12 premiers fumeurs ont beneficie d'un delai plus court (souvent de 1 0 quelques jours seulement).
Pour ces 12 fumeurs ayant beneficie d'un delai plus long, le pourcentage de fumeurs ayant reduit d'au moins 50 % ou arrete leur consommation a 3 et 4 semaines est de 83 % (1 0 fumeurs sur 12) alors qu'il est de 50 % (6 fumeurs sur 12) pour les 12 fumeurs ayant beneficie d'un delai plus court.
Cette efficacite superieure s'explique par la meilleure preparation de ces fumeurs qui ont eu plus de 15 temps pour renforcer leur motivation avant de recevoir une injection d'un extrait de tabac selon l'exemple 1.
Sur ces 12 derniers fumeurs, 5 etaient abstinents continus depuis une semaine apres la fin de traitement jusqu'a la semaine 12 (fin du suivi) et 8 etaient abstinents continus sur les 7 derniers jours a la semaine 12. 20 Les fumeurs traites decrivent une reduction de leur attirance pour la cigarette et de leur desir de fumer ainsi que l'instauration d'une certaine indifference a la cigarette. lls notent une reduction de l'appetence des cigarettes.
Certains parlent d'un changement de gout des cigarettes.
Leur motivation a arreter est renforcee. 25 Avant administration de la composition pharmaceutique des anticorps lgG diriges contre la composition pharmaceutique ont ete detectes chez tous les patients.
Avant traitement les concentrations moyennes d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique etaient de 6,07 microg/ml (ecart type: 2,98 microg/ml). 30 Apres administration de la composition pharmaceutique, une augmentation significative des concentrations d'lgG anti- composition pharmaceutique a ete observee.
Ainsi, les concentrations d'lgG mesurees 29 jours apres ['administration de la composition pharmaceutique etaient de 7, 19 microg/ml (ecart type: 4,04 microg/ml) et ces concentrations augmentaient a 7,5 microg/ml (ecart type 35 4,28 microg/ml) lorsqu'elles etaient dosees 8 semaines apres la premiere administration de la composition pharmaceutique.
Les variations des concentrations 48 d'lgG etaient significatives (t-test seuil de significativite p<0.05) entre J29 et JO (p = 0.02) et entre les dosages de la semaine 8 et le JO (p = 0.006).
Une difference significative etait egalement observee entre les concentrations d'lgG anti- composition pharmaceutique a la semaine 8 et a J29 (p = 0.029).
L'analyse statistique croisant les concentrations d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique et le sevrage tabagique a mis en evidence des correlations (test de Wilcoxon, seuil de significativite p<0.05) entre des niveaux plus eleves d'lgG diriges contre la composition pharmaceutique et le sevrage tabagique.
Les patients qui ont reduit leur consommation d'au moins 50 % une semaine apres la premiere administration de la composition pharmaceutique ont eu des taux plus eleves d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique a J29 (p=0.034) et a la semaine 8 (p=0.044).
Les patients qui ont ete abstinents sur 7 jours consecutif (abstinence prevalente) a J36 ont eu des taux plus eleves d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique a J29 (p<0.001) et a la semaine 8 (p<0.001 ). 20 Les patients qui ont ete abstinents sur 7 jours consecutif (abstinence prevalente) a la semaine 12 ont eu des taux plus eleves d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique a J29 (p=0.013) et a la semaine 8 (p=0.016).
Les patients qui ont ete abstinents continus jusqu'a la semaine 12 ont eu des taux plus 25 eleves d'lgG dirigees contre la composition pharmaceutique a J29 (p=0.007) et a la semaine 8 (p=0.009). ll n'a pas ete detecte d'anticorps de type lgE suite a l'administration de la composition pharmaceutique.

Claims (28)

  1. 49 REVENDICATIONS 1. Extrait de feuilles de tabac contenant au moins 5 % en poids, par rapport au poids total de l’extrait sec, de protéines de masse moléculaire supérieure à 10 kDa et essentiellement exempt de molécules de masse moléculaire inférieure à 10 kDa ; 5 ledit extrait de feuilles de tabac étant caractérisé en ce que : - la teneur en protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 500 kDA, supérieure à 400 kDa, supérieure à 300 kDa, supérieure à 200 kDa, supérieure à 100 kDa ou supérieure à 100 kDa, est inférieure à 15%, inférieure à 10%, en inférieure à 7,5%, inférieure à 5%, inférieure à 1%, ou inférieure à 0,5% en poids 10 par rapport au poids protéique total de l’extrait ; et - la teneur en molécules de masse moléculaire inférieure à 10 kDa est inférieure à 5% en poids par rapport au poids total de l’extrait.
  2. 2. Extrait de feuilles de tabac selon la revendication 1, dans lequel lesdites protéines sont choisies parmi le groupe constitué des familles de protéines suivantes : 15 peroxidase anionique formant de la lignine, glucan endo-1,3-béta-glucosidase, endochitinase, protéine liée à la pathogénèse, osmotine, et inhibiteur de protéinase, ainsi que leurs mélanges.
  3. 3. Extrait de feuilles de tabac selon la revendication 1 ou 2, étant obtenu par un procédé d’extraction par un solvant, d’un broyat de feuilles de tabac séchées ; 20 suivie d’une séparation des résidus solides de la solution d’extrait de broyat de feuilles de tabac séchées ; puis d’une diafiltration à volume constant de la solution d’extrait de broyat de feuilles de tabac séchées sans résidu solide avec une membrane ayant un seuil de coupure à 10 kDa, et avec un solvant aqueux en une quantité allant de 2 à 12 fois en volume, ou 3 à 10 fois en volume, ou 4 à 8 fois en 25 volume, ou 6 fois en volume, par rapport au volume de l’extrait.
  4. 4. Extrait de feuilles de tabac selon la revendication 3, dans lequel le solvant du procédé d’extraction est un solvant aqueux.
  5. 5. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant au moins une protéine appartenant à la famille des glucan endo-1,3-30 CA 3020055 50 béta -glucosidases, ou comprenant au moins une protéine choisie dans le groupe constitué par l’isoforme acide PR-Q’ de la béta-1,3-endoglucanase (P36401 selon la base UniProt), l’isoforme vacuolaire basique GLB de la béta-1,3-endoglucanase (P27666 selon la base UniProt), et leurs mélanges.
  6. 6. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, 5 comprenant au moins une protéine appartenant à la famille des endochitinases, ou comprenant au moins une protéine choisie dans le groupe constitué par l’endochinitase P acide (P17513 selon la base UniProt), l’endochinitase Q acide (P17514 selon la base UniProt), l’endochinitase B (P24091 selon la base UniProt), et leurs mélanges. 10
  7. 7. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant au moins de l’osmotine (P14170 selon la base UniProt).
  8. 8. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant au moins une peroxidase anionique formant de la lignine (P11965 selon la base UniProt). 15
  9. 9. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant au moins une protéine liée à la pathogénèse, ou comprenant au moins une protéine choisie dans le groupe constitué par la protéine R liée à la pathogénèse (P13046 selon la base UniProt), la protéine PR-4A liée à la pathogénèse (P29062 selon la base UniProt), la protéine PR-4B liée à la 20 pathogénèse (P29063 selon la base UniProt), et leurs mélanges.
  10. 10. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins une protéine appartenant à la famille des inhibiteurs de protéinase, ou comprenant au moins une protéine choisie dans le groupe constitué par l’inhibiteur de protéinase I-B (Q03199 selon la base UniProt), l’inhibiteur de 25 protéinase I-A (Q03198 selon la base UniProt), et leurs mélanges.
  11. 11. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la teneur en protéines dans l’extrait sec est d’au moins 10 % en poids, ou d’au moins 15 % en poids, ou d’au moins 20 % en poids, par rapport au poids total de l’extrait sec. 30 CA 3020055 51
  12. 12. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant au moins 5% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec, ou au moins 10% en poids, ou au moins 15% en poids, ou environ 20% en poids, de protéines choisies parmi le groupe constitué des familles de protéines suivantes : peroxidase anionique formant de la lignine, glucan endo-1,3-béta-glucosidase, 5 endochitinase, protéine liée à la pathogénèse, osmotine, et inhibiteur de protéinase, ainsi que leurs mélanges.
  13. 13. Extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel la teneur en RuBisCO est inférieure à 15 % en poids par rapport au poids protéique total de l’extrait, ou inférieure à 10 % en poids, ou inférieure à 7,5 % 10 en poids, ou inférieure à 5 % en poids, ou inférieure à 2,5 % en poids, ou inférieure 1 % en poids, ou inférieure à 0,5 % en poids, par rapport au poids protéique total de l’extrait.
  14. 14. Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 ainsi qu’un 15 excipient pharmaceutiquement acceptable.
  15. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, dans laquelle les protéines présentes dans ledit extrait de feuilles de tabac sont présentes en une quantité allant de 1 à 1 000 μg/mL, ou de 10 à 500 μg/mL, ou de 50 à 300 μg/mL, ou 60 à 200 μg/mL, ou entre 80 et 150 μg/mL. 20
  16. 16. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 ou la revendication 15, comprenant en outre des protéines extraites du cannabis.
  17. 17. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 14 à 16, présentée sous une forme propre à une administration par injection sous cutanée, ou sous une forme propre à une administration à l’aide d’un système 25 thérapeutique transdermique adhésif, ou sous une forme propre à une administration par pulvérisation ou par vaporisation.
  18. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17, caractérisée en ce que le système transdermique adhésif est un patch.
  19. 19. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 14 à 18 30 pour son utilisation dans le traitement de l’addiction au tabac. CA 3020055 52
  20. 20. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, pour son utilisation dans le traitement conjoint de l’addiction au tabac et au cannabis.
  21. 21. Composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement de l’addiction au tabac selon la revendication 19, ou dans le traitement conjoint de l’addiction au tabac et au cannabis selon la revendication 20, la composition pharmaceutique 5 étant présentée sous une forme de dosage de 0,03 mL à 10 mL, ou de 0,1 mL à 5 mL, ou de 0,5 à 2 mL.
  22. 22. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 14 à 18, dans le traitement de l’addiction au tabac.
  23. 23. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 16, dans le 10 traitement conjoint de l’addiction au tabac et au cannabis.
  24. 24. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 14 à 18, pour fabriquer un médicament pour traiter l’addiction au tabac.
  25. 25. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 16, pour 15 fabriquer un médicament pour traiter conjointement l’addiction au tabac et au cannabis.
  26. 26. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 22 à 25, la composition pharmaceutique étant présentée sous une forme de dosage de 0,03 mL à 10 mL, ou de 0,1 mL à 5 mL, ou de 0,5 à 2 mL. 20
  27. 27. Procédé de préparation d’un extrait de feuilles de tabac selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant les étapes suivantes : a. séchage de feuilles de tabac, b. broyage de feuilles de tabac séchées pour obtenir un broyat de feuilles de tabac séchées, 25 c. extraction du broyat de feuilles de tabac séchées sous agitation mécanique avec un solvant, ou un solvant aqueux, ou une solution tampon aqueuse à pH compris entre 6,0 et 8,5, d. séparation des résidus solides de la solution de l’extrait du broyat de feuilles de tabac séchées par filtration ou centrifugation afin d’obtenir une 30 solution d’extrait de broyat de feuilles de tabac séchées sans résidu solide, CA 3020055 53 e. diafiltration à volume constant de la solution obtenue à l’étape d avec un solvant, ou un solvant aqueux, en une quantité allant de 2 à 12 fois en volume, ou de 3 à 10 fois en volume, ou de 4 à 8 fois en volume, ou de 6 fois en volume, par rapport au volume de l’extrait, et avec une membrane ayant un seuil de coupure à 10 kDa. 5
  28. 28. Procédé selon la revendication 27, comprenant en outre une étape f de lyophilisation de la solution protéique obtenue à l’étape e.
CA3020055A 2016-04-07 2017-04-07 Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l'addiction au tabac Active CA3020055C (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1653079 2016-04-07
FR1653079A FR3049866B1 (fr) 2016-04-07 2016-04-07 Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l'addiction au tabac
PCT/EP2017/058398 WO2017174787A1 (fr) 2016-04-07 2017-04-07 Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l'addiction au tabac

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CA3020055A1 CA3020055A1 (fr) 2017-10-12
CA3020055C true CA3020055C (fr) 2026-02-24

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11865156B2 (en) Treatment of tobacco addiction by a tobacco leaf extract
KR101845862B1 (ko) 특발성 폐섬유증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물
EP0131477B1 (fr) Utilisation d&#39;un sel de l&#39;acide N-acetyl (alpha, beta) aspartylglutamique pour la préparation d&#39;un médicament à activité anti-allergique pour administration locale
EP3765067B1 (fr) Vaccins autologues contre le cancer
FR2523976A1 (fr) Nouveau produit proteique, obtention et application comme medicament, en particulier immunoregulateur et antiallergique
WO2016019548A1 (fr) Utilisation pharmaceutique de polysaccharide de dendrobium officinale
CA3020055C (fr) Extrait de feuilles de tabac et utilisation pour le traitement de l&#39;addiction au tabac
JP4988144B2 (ja) 炎症過程の調節に有用なチラコイドを含む組成物
CN114632096A (zh) 杨梅果实花色苷提取物在制备治疗腹泻的药物中的应用
BE1028268B1 (fr) Cyclodextrine utilisée dans le traitement et la prévention de la bronchoconstriction en phase tardive de l&#39;asthme provoqué par des allergènes
JP2022527455A (ja) 活性化線維芽細胞及びそのエキソソーム誘導体を用いた慢性閉塞性肺疾患及び肺変性の治療
KR100535266B1 (ko) 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물
EA040213B1 (ru) Экстракт табачного листа и его применение для лечения табачной зависимости
KR100597612B1 (ko) 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물을 포함하는 식품 조성물
KR20250105395A (ko) 금연을 돕기 위한 담배 잎 추출물을 포함하는 치료 방법
RU2304978C2 (ru) Средство тканеспецифического регулирования митохондриальных процессов и его применение при лечении заболеваний (варианты)
Nemmar et al. Research Article Waterpipe Smoke Exposure Triggers Lung Injury and Functional Decline in Mice: Protective Effect of Gum Arabic
KR101454076B1 (ko) 결석 제거에 도움이 되는 참가시나무 잎 액기스 제조 방법
JPH10130158A (ja) 免疫を賦活させる方法
EP4637780A1 (fr) Phytoecdysones pour leur utilisation dans le traitement de pathologies respiratoires inflammatoires
CN121100863A (zh) 一种尼古丁袋安全性评价方法
Valenca et al. Efectos de la Nicotina Oral en la Estereología del Hígado de Rata
Schachter et al. Response to oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) extract by sensitized and nonsensitized guinea pig trachea
KR20150096238A (ko) 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 천식 예방 또는 치료용 조성물