CA3083840A1

CA3083840A1 - Bacterie genetiquement modifiee pour produire du lactate a partir de co2

Info

Publication number: CA3083840A1
Application number: CA3083840A
Authority: CA
Inventors: Cedric Boisart; Nicolas Chabot
Original assignee: Enobraq
Current assignee: Enobraq
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-06-06
Also published as: US20210324427A1; EP3717639A1; FR3074188A1; CN111417723A; WO2019106134A1

Abstract

L'invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase et à un procédé de production de lactate à partir de CO2 utilisant une telle bactérie.

Description

Bactérie génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2 Domaine de l'invention L'invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de 002. L'invention a également trait à un procédéde production de lactate, ou d'acide lactique, à partir de CO2 utilisant une telle bactérie génétiquement modifiée.
Etat de la technique L'acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par exemple, l'acide lactique est utilisé comme précurseur de l'acide polylactique (PLA) qui est un polymère entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages alimentaires. L'acide lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu'antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût par l'industrie agroalimentaire. En cosmétique, l'acide lactique est généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling.
Actuellement, la production à l'échelle industrielle de l'acide lactique repose principalement sur la fermentation d'hydrate de carbone, et notamment de glucose, lactose, sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la transformation de ces sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de produire exclusivement de l'acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de plusieurs acides organiques.
En outre, la production d'acide lactique à partir de sucres fermentescibles, tels que le glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l'alimentation et la production de produits de commodité comme l'acide lactique.
En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (002) dans l'atmosphère ne cessent de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus métaboliques biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour produire des molécules d'intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de production restent insuffisants et limitent l'intérêt économique de ces systèmes.
De même, des méthodes mettant en oeuvre des cellules bactériennes génétiquement modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules d'intérêt dans des systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayr & al. (2012) décrit la surexpression de la lactate déshydrogénase de Bacillus subtilis dans la cyanobactérie Synechocystis. WO
2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries méthanotrophes dont la source d'énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent plusieurs inconvénients.
En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la contamination, ce qui impacte considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes

2 hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec l'alimentation, puisque des sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux négatifs.
Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules, telles que l'acide lactique, en grandes quantités à
partir de CO2 .. comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec l'alimentaire tout en réduisant les émissions de gaz à effet de serre.
Résumé de l'invention En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de forcer des bactéries oxydant naturellement l'hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de 002, dans une voie de synthèse de lactate, au détriment éventuellement d'autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n'est pas ou peu exprimée naturellement dans la bactérie, en jouant sur l'expression du ou des gènes associés à cette voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries oxydant l'hydrogène peuvent être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l'expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate, afin de produire du lactate à partir de 002. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la bactérie Cupriavidus necator (également appelée Hydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ou Wautersia eutropha) peut être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en jouant sur le promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate déshydrogénase notamment, de manière à produire du lactate à partir de 002. De manière alternative ou complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant un ou plusieurs gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant l'expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate.
L'invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de 002, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase.
Selon l'invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie selon l'invention pour la .. production de lactate à partir de 002, Préférentiellement pour la production exclusivement de L-lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate.

3 L'invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir de 002, comprenant les étapes consistant à
- cultiver la bactérie avec du CO2 comme seule source de carbone, puis - récupérer le lactate.
Description des figures La figure 1 montre une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène selon l'invention apte à produire du lactate à partir de CO2 et H2.
La figure 2 montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement chez Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin.
La figure 3 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de L-lactate à partir de 002.
La figure 4 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de D-lactate à partir de 002.
La figure 5 est un tableau récapitulant les différentes abréviations utilisées dans la description et les figures 2, 3 et 4.
La figure 6 représente la production de lactate par la bactérie 0N0002 à
partir de fructose.
La figure 7 représente la production de lactate par la bactérie oxydant naturellement l'hydrogène 0N0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de 002.
Description détaillée de l'invention L'invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de 002, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase Dans le contexte de l'invention, une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable, d'utiliser l'hydrogène gazeux comme donneur d'électron et l'oxygène comme accepteur d'électron, et capable de fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries knallgas . Les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone comme source de carbone et d'hydrogène comme source d'énergie.
Selon l'invention, la bactérie oxydant naturellement l'hydrogène est préférentiellement sélectionnée parmi Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp.; Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp., Cupriavidus sp., Co uynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodospirillum sp., Rhodococcus sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hydrogenomonas sp., Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogenautresmus sp., Helicobacter sp.,

4 Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobium sp., Alcaligenes sp., Amycolata sp.;
Aquaspirfflum sp., Arthrobacter sp., Azospirfflum sp., Variovouax sp., Acidovouax sp., Bacillus sp., Calderobacterium sp., Derxia sp., Flavobacterium sp., Microcyclus sp., Mycobacterium sp., Paracoccus sp., Persephonefia sp., Renobacter sp., Thermocrinis sp., Wautersia sp., et les .. cyan obactéries telles que Anabaena sp.
Notamment, la bactérie est sélectionnée parmi Rhodococcus opacus, Rhodococcus jostii, Hydrogenovibrio marin us, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeoficus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Couynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas sphe roides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirfflum rubrum, Rhodococcus opacus, Rhizobium japonicum, Thiocapsa roseopersicina, Pseudomonas facilis, Pseudomonas fia va, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovouaõ Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas hydrogenothermophila, Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenophilus isleticus, Hydrogenophilus thermoluteolus, Hydrogenautresmus marinus, Heficobacter pyloui, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter fia vus, Hydrogenophaga fia va, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Ralstonia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes la tus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirfflum autotrophicum, Arthrobacter strain 11/X, Azospirfflum fipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax facilis, Bacillus schlegefii, Bacillus tusciae, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Para coccus denitrificans, Persephonefia marina, Persephonefia guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocrinis ruber, Wautersia sp., Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides et Anabaena cyfindrica.
Les termes bactérie recombinante et bactérie génétiquement modifiée sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été
génétiquement modifiées pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par altération , on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il est entendu que les termes bactérie recombinante et bactérie génétiquement modifiée se réfèrent non seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la descendance ou à la descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant se produire dans

5 les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.
Selon l'invention, on entend par surexpression d'un gène le fait que ledit gène est plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non génétiquement modifiée pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production plus importante de la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate déshydrogénase) et notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l'invention, une telle surexpression s'entend de l'expression d'une lactate déshydrogénase endogène, qui n'est pas ou peu exprimée dans la bactérie non génétiquement modifiée, ou de l'expression d'une lactate déshydrogénase exogène.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène possédant une lactate déshydrogénase endogène.
Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi Cupriavidus sp., telle que Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcus opacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogenothermophila Les termes "endogène" ou "natif' désignent un gène qui est normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l'inverse, les termes exogène ou hétérologue tels qu'utilisés ici en référence à un gène (séquence nucléotidique) désignent un gène qui n'est pas normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée.
Dans le cas d'une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il est possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une surexpression dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d'un promoteur permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à
l'extrémité 5 'du gène structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D'une manière générale, selon l'invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. De manière alternative ou

6 complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur endogène, par exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est également possible de surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de copies du gène dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant des séquences nucléotidiques à d'autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc.
Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshydrogénase endogène ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d'exemples, des séquences codant pour des L-lactate déshydrogénase et des D-lactate déshydrogénase, respectivement, de différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes.
Selon l'invention, ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de multiplication, pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate à partir de 002.
Tableau 1: Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27) Microorganisme Gène GenBank Séquence protéique Cupriavidus necator H16 ldh 0AJ91814.1 SEQ

Pediococcus acidilactici IdhA

Streptococcus equinus (streptococcus bovis) ldh KFN85486.1 SEQ ID N 3 Bacillus coagulans ldh AGU00860.1 SEQ ID N 4 Lactobacillus casei ldh 0AQ65818.1 SEQ ID N 5 Lactobacillus helveticus ldh ABX26516.1 SEQ

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ldh KRN37463.1 SEQ ID N 7 Lactobacillus plantarum ldh EFK28653.1 SEQ

Lactobacillus pentosus ldh EIW14906.1 SEQ

Lactococcus lactis subsp. lactis ldh BAL51029.1 SEQ ID N 10 Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28) Microorganisme Gène GenBank Séquence protéique Cupriavidus necator H16 IdhA1 0AJ92810.1 SEQ

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus IdhA 0AI96942.1 SEQ

Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 IdhA 16129341 SEQ

Bacillus coagulans IdhA
ADV02473.1 SEQ ID N 14

7 Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérie Cupriavidus necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s) codant pour la L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène, afin de favoriser l'expression de l'un et/ou de l'autre gène. En effet, les inventeurs ont découvert que Cupriavidus necator possède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase (ldh) et une D-lactate déshydrogénase (IdhA1) endogènes, dont l'expression dépend des conditions de culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments.
Selon l'invention, cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de la séquence nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation négative et permettre l'expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il est notamment possible de modifier Cupriavidus necator de manière à associer la ou les séquences codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à
un promoteur constitutif ou à un promoteur inductible.
Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous contrôle d'un promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou inductible en présence d'une molécule particulière. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser des promoteurs constitutifs tels que pLAC, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), un promoteur inductible tel que le promoteur pBAD, inductible à l'arabinose (Grousseau et al., 2014), le promoteur pPHAP
inductible en limitation phosphate (Barnard et al. 2015), le promoteur pCBBL
inductible en conditions autotrophes (Lütte et al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible au rhamnose (Sydow et al., 2017) .
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l'invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine présentant au moins 50% d'homologie avec SEQ ID N 1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Dans un autre mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine présentant au moins 50%
d'homologie avec SEQ ID N 11 (séquence d'une D-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène, ou hétérologue.
Selon l'invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à
intégrer une séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène.
Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d'un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l'invention,

8 le génome de la bactérie s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu dans ladite bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel dans ladite bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome de la bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d'intérêt, placée sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s) et d'un ou plusieurs sites de liaison au ribosome. Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription.
Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être dérivé d'une bactérie, d'un champignon, d'une levure ou d'un mammifère.
Préférentiellement, un tel gène est dérivé d'une bactérie et notamment de E. cou, Bacillus coagulans, Pediococcus acidilactici, Streptococcus bovis (Streptococcus equinus), d'une bactérie lactique, et notamment de Lactobacillus case!, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactis subsp. lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent également être utilisés pour modifier génétiquement une bactérie selon l'invention.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Pediococcus acidilactici (SEQ ID N 2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Streptococcus equinus (Streptococcus bovis) (SEQ ID N 3), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Bacillus coagulans (SEQ ID N 4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase .. hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Lactobacillus

9 casei (SEQ ID N 5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID N 12), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Escherichia cou/
(SEQ ID N 13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase Bacillus coagulans (SEQ ID N 14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue), de manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-lactate seulement.
De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue) de manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-lactate seulement.
Selon l'invention, on entend par inhibition de l'expression d'un gène le fait que ledit gène n'est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est réduite, comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber l'expression du gène), conduisant à l'absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l'inhibition peut être totale, c'est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n'est plus du tout produite. L'inhibition de l'expression d'un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré.
Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique. Selon l'invention, toute méthode d'inhibition d'un gène, connue en soi par l'homme de l'art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par exemple, l'inhibition de l'expression d'un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko et al., 2000;
Lodish et al., 2000) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l'expression d'un gène et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas et al., 1987) ; modification d'une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., 2011) ;
ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons), d'origine naturelle

10 ou artificielle ou par exemple par insertion d'une cassette antibiotique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interférent"
ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN
bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L'inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al., 1996), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites TALEN (Ousterout et al. 2016), d'un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites 'CRISPR' (Mali et al., 2013), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., 2012). L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène.
L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré.
L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome en amont du gène considéré.
En travaillant sur les modifications génétiques à apporter à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir de 002, les inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible d'inhiber au moins partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit pyruvate.
En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l'hydrogène et susceptible d'être modifiées génétiquement selon l'invention, présentent une voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C'est le cas notamment de Cupriavidus

11 necator (figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition avec la voie de synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie.
Aussi, dans un mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il est possible d'inhiber au moins partiellement l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour l'Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), l'Acetoacétyl-CoA
réductase (EC: 1.1.1.36) et la poly(3-hydroxybutyrate) synthase (EC :2.3.1.-), préférentiellement l'expression d'au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l'expression desdits trois gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un et préférentiellement des trois gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: 0AJ91322.1), une phaB
(GenBank:
0AJ92574.1) et une phaC (GenBank: 0AJ92572.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par la voie de production du PHB.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l'expression d'un gène codant pour une phosphoenolpyruvate synthase (EC: 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en phosphoenol pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC: 6.4.1.1) et/ou un complexe pyruvate dehydrogenase (EC: 1.2.4.1) et/ou une fumarate reductase (EC: 1.3.5.4).
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les gènes codant pour une ppsa (GenBank: 0AJ93138.1), une pyc (GenBank: 0AJ92391.1), une pdhA
(GenBank: 0AJ92510.1) et une sdhABCD (GenBank: 0AJ93711.1, 0AJ93712.1, 0AJ93713.1, 0AJ93714.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de l'Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d'inhiber au moins partiellement l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-CoA hydrolase (EC: 3.1.2.1), une phosphate acétyltransférase (EC: 2.3.1.8), une Acétate kinase (EC:
2.7.2.1), une propionate CoA-transferase (EC: 2.8.3.1), une succinyl-CoA
:acetate CoA-transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC: 1.2.1.10).

12 Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les gènes codant pour une Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: 0AJ96157.1), une Phosphate acétyltransférase (pta1, pta2) (GenBank: 0AJ96416.1, GenBank: 0AJ96653.1), une Acétate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: 0AJ91818.1, GenBank: 0AJ96415.1), une Propionate CoA-transferase (GenBank: 0AJ93797.1), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank:
0AJ92496.1) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: 0AJ92911.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.
Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène possèdent un ou des gènes codant pour une Lactate ferricytochrome C reductase. C'est le cas notamment de Cupriavidus necator qui possèdent trois gènes IldD (EC : 1.1.2.3, GenBank:
0AJ95257.1), IldA
(EC : 1.1.2.3, GenBank: 0AJ96599.1), dld (EC :1.1.2.4, GenBank: 0AJ94166.1) codant pour une telle Lactate ferricytochrome C reductase. Or, les inventeurs ont découvert qu'une telle enzyme est susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en convertissant ledit lactate en pyruvate. Aussi, selon l'invention, dans le cas où la bactérie possède une telle Lactate ferricytochrome C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est avantageusement au moins partiellement inhibé.
L'invention propose avantageusement d'utiliser une bactérie génétiquement modifiée selon l'invention pour produire du lactate à partir de 002. Avantageusement, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une L-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du L-lactate. De manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du D-lactate.
L'invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate à partir de 002, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture continue, une bactérie génétiquement modifiée selon l'invention en présence de CO2 et on récupère le lactate produit.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, une solution de base est ajoutée pendant la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le milieu de fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium, lactate de calcium ou lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour réguler le pH du milieu de fermentation).

13 Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu de fermentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures diverses) et le sel de lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation peut notamment être mise en oeuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu'une centrifugeuse, un dispositif de microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d'une part une biomasse cellulaire concentrée et d'autre part une solution de sel de lactate.
Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de lactate en acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide lactique à partir du milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de l'acide lactique en tant que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide sulfurique.
Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou hydrolyse peut ensuite être réalisée, afin d'obtenir un acide lactique à haut degré de pureté.
Selon l'invention, la source de CO2 peut être du CO2 pur ou du CO2 issu d'émissions des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole, les cimenteries, les productions d'ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO2 peut également être un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO2, un gaz CO2 au moins partiellement purifié, une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La teneur du gaz total en CO2 peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO2 peut être injecté
directement ou via une étape intermédiaire de capture ou purification du CO2. La purification du CO2 peut être réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d'amines, ou par traitement enzymatique mettant par exemple en oeuvre une anhydrase carbonique.
Selon l'invention, la source l'hydrogène peut être un produit du vaporeformage du méthane, de l'électrolyse de l'eau ou être un co-produit (hydrogène fatal ) des procédés industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du dichlore ou l'incinération des déchets.
Selon l'invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de croissance de la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels que du glucose du fructose ou du glycérol. Il est également possible de cultiver la bactérie en présence de CO2 et d'une autre source de carbone lors de l'étape de production de lactate.
EXEMPLES
Exemple 1 - souche productrice de lactate CN0001 Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-6-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0001 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in vitro via le

14 protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides 1 (5' GGATCCAAAC TCGAGTAAGG
ATCTCC 3') et 2 (5' ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GO Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJM3 (Müller et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est amplifié à l'aide des oligonucléotides 3 (5' GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3') et 4 (5' CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France).Le produit de PCR
est digéré par l'enzyme Dpnl (New England Biolabs, Evry, France) : 1p1 de Dpnl est ajouté à
50pL de produit PCR, puis incubé 15-60min à 37 C, l'enzyme est ensuite inactivée 10min à 80 C.
Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pJM3-ldh. 5p1 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou/ Stellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25pg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 5 (5' GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3') et 6 (5' CGAACGCCCT
AGGTATAAAC GCAG 3').
Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 par électroporation (protocole adapté de Taghavi et al., 1994). Des cellules Cupriavidus necator sont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3m1 dans des tubes 10m1) et incubées une nuit à
30 C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1m1 de la culture est transféré
dans un erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30 C, 200 rpm jusqu'à
atteindre une D0600nm de 0,5-0,6. Les cellules sont alors récoltées et lavées deux fois avec 25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 90% eau [vol/vol]). Les cellules rendues par ce procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de lavage afin d'obtenir une D0600nm de 50 et aliquotées par 150pL.
Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5p1 d'ADN
plasmidique (100-15Ong/p1). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5m1 est agité par de légers tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré
dans une cuvette d'électroporation froide (0.2 cm, 10573463, Fisher scientific, Illkirch).
L'électroporation est réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5kV, capacité 25pF, résistance externe 200 Cl Immédiatement après l'électroporation les cellules sont mélangées avec 1mL de milieu SOC

(tryptone 2 (Y0, extrait de levure 0,5 (Y0, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30 C puis étalées sur des boites de pétri maintenue à 30 C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 mg/L de gentamycine et 200 mg/L de kanamycine).
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pJM3-Idh est récupérée et nommée 10 CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquencçage.
Milieux Pour les précultures, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2PO4, 4,0 g/L ;
Na2HPO4, 4,6 g/L; K2504, 0,45 g/L; MgSO4 0,39 g/L, CaCl2, 0,062 g/L; NH4CI
0.05 %
(w/v), trace d'éléments, 1mI/L (FeSO4=7H20, 15 g/L; MnSO4=H20, 2.4 g/L ;
ZnSO4=7H20, 2.4 g/L; CuSO4=5H20, 0,48 g/L dans HCM 0,1M).

15 Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par litre :
MgSO4,7H20, 0,75 g; phosphate (Na2HPO4,12H20, 1,5g; KH2PO4, 0,25 g); acide nitrilotriacetique, 0,285g; citrate d'ammonium de fer(III), 0,9 g; CaCl2, 0,015 g; trace d'éléments (H3B03, 0,45 mg; CoC12,6H20, 0,3 mg; ZnSO4,7H20, 0,15 mg; MnC12,4H20, 0,045 mg;
Na2Mo04,2H20, 0,045 mg; NiC12,6H20, 0,03 mg; CuSO4, 0,015 mg); kanamycin, 0,1 g.
Précultures Une colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour ensemencer la première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10 mg/L de gentamycine et 200 mg/L de kanamycine, dans un erlenmeyer baflé de 100 mL.
Deux autres étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 mL et 300 mL de milieu minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL et 3 L).
Chaque culture est cultivée à 30 C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur.
Cette préculture est utilisée pour inoculer l'étape de culture en bioréacteurs.
Culture en bioréacteurs La culture de la souche CN0001 en fed-batch est réalisée en trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée sur fructose pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0,16 h-1. Après la consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre l'adaptation du métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de 0,22 L/min d'un mélange commercial H2/02/CO2/N2 (`)/0 molaire: 60:2:10:28, Air Liquide, Paris, France). La troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats gazeux couplée à la production de lactate. Cette phase est initiée par l'ajout de 1 g/L de L-arabinose pour induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à
partir d'une solution de 56 g/L de NH3, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de 0,02 h-1. Cette

16 culture est menée dans des bioréacteurs de 1,4 L BDCU B.Braun. La température est régulée à 30 C et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M.
Analyse du lactate et des métabolites Afin de déterminer les concentrations en acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de fermentation est analysé par chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1 mL) est d'abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 pm (Minicart RC4, Sartorius). Le système HPLC utilisé est un Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC, couplé à un réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 pL de chaque échantillon est injecté sur une colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad). L'éluant est une solution aqueuse d'acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du four est de 45 C.
Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à
une gamme étalon appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués.
Résultat La souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100 mg/L de lactate.
Exemple 2: Construction d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à
partir de CO2 (CN0002).
Souche et constructions génétiques Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-6-hydroxy-butyrate (PHB).
La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh (GenBank: CAJ91814.1) est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides 7 (5' AAGGAGATAT
ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3') et 8 (5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG
GCCGTGGGGA CGGC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC

Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS
(Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d'éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de bases

17 contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de selection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pBAD-Idh(cn). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou/ StellarTM (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (GibcoTm). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 (5' CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3') et 10 (5' CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène 1.1dh est confirmée par séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11 (5' CATTGATTAT

TTGCACGGCG TCAC 3').
Le plasmide pBAD-1.1dh(cn) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia .. cou/ S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 10. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou/ S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est réalisée comme suit:
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB

contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20 h à 30 C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia cou/ sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37 C
sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOsoonm) est mesurée pour chaque culture et l'équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1,5 ml et centrifugées (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1m1 de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia cou/ sont prélevés et mélangés dans un tube 1,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30 C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000ème et 100 pL de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber

18 24h à 30 C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30 C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-Idh(cn) est réalisée par PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 10.
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(cn) est récupérée et nommée CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en Erlenmeyer d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CN0002) Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C.
necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à
l'arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20;
0,45 de g/L
K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaCl2 2H20 et 1 ml/L de solution de trace d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/L de FeSO4 7H20;
2,4 g/L MnSO4 H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H20 dans 0,1 M de HCI. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH4CI (0,5 g/L) a été utilisé
comme source d'azote pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH
ont été
ajoutés.
Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de culture a été tout d'abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la souche), dans des tubes de culture, à
C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une DOsoo initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30 C, 200 rpm.
Cette seconde préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de milieu MMR en présence de gentamycine (10 mg/L) et de kanamycine (200 mg/L) (dépendant de la souche).
La DOsoo initiale visée a été de 0,05.
Culture en Erlenmeyer La culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de MMR
de 50 mL dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL, à une température de 30 C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d'une durée de 20h a été
réalisée jusqu'à
l'obtention d'une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance, une modification de l'aération est opérée (2% air soit 0,4% d'02), une induction du promoteur de la

19 LDH est réalisée par l'ajout de 1 g/L d'arabinose (dépendant de la souche) ce qui conduit à une phase de production de lactate d'une durée de 120 h.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de 1mL ont été
prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité
optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d'être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L
dans de l'eau.
Résultats La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition hétérotrophe atteint p.= 0,14 h'. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1,3 g/L, a été atteint après 139 h de culture comme représenté à la figure 6. Il est à noter que dans les mêmes conditions de culture, la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 sans surexpression de lactate déshydrogénase ne produit pas de lactate.
Exemple 4: Production de lactate à partir de CO2 par fermentation d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CNO002).
Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C.
necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à
l'arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20;
0,45 de g/L
K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaCl2 2H20 et 1 ml/L de solution de trace d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/L de FeSO4 7H20;
2,4 g/L MnSO4 H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H20 dans 0,1 M de HCI. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NI-14C1 (0,5 g/L) a été utilisé
comme source d'azote pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH
ont été
ajoutés.
Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz (milieu FAME) était constitué de : 0,29 g/L d'acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate d'ammonium ferrique ;
0,75 g/L de MgSO4 7H20; 0,015 g/L de CaCl2 2H20 et 1,5 ml/L de solution de trace élément.
La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H3B03; 0,2 g/L de CoCl2 6H20;
0,1 g/L de ZnSO4 7H20; 0,03 g/L de MnCl2 4H20; 0,03 g/L de Na2Mo04 2H20; 0,02 g/L de NiCl2 6H20; 0,01 g/L de CuSO4 5H20. (NH4)2SO4 (1,6 g/L) a été utilisé comme source d'azote pour atteindre une concentration en biomasse d'environ 2,5 g/L. Le pH a été
ajusté à 7 avec 2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile de Na2HPO4 12H20 (concentration finale de 1,6 g/L) et de KH2PO4 (concentration finale de 2,9 g/L) a été

ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L
de biomasse) ainsi qu'une solution stérile de FeSO4 7H20 (10,7 g/L; concentration finale 0,032 g/L).
Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de culture a été tout d'abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des Erlenmeyers bafflés de 50 mL, à 30 c sous agitation (110 rpm). Le milieu de culture a été ensuite centrifugé durant 10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et ont été
utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 mg/L de gentamycine et 100 mg/L de kanamycine (dépendant de la souche) dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui ont été
incubés durant 20-24 h à 30 C, 110 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé
durant 5 min à

4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 mL de milieu FAME, et ont été utilisées pour inoculer les 300 mL de milieu FAME (avec si besoin 100 mg/L de kanamycine) dans le bioréacteur gaz. La DOsoo initiale visée a été de 0,2.
Bioréacteur gaz La culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz avec un volume de travail de 330 mL. La température a été réglée à 30 C, le pH à
7. La pression et

20 la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture.
Les débits de gaz étaient contrôlés individuellement (CO2, H2, air). Un analyseur de gaz a été
utilisé pour l'analyse des gaz de sortie (`)/0 02 et CO2) et un volumètre pour mesurer les débits de gaz de sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/L de biomasse ont été atteint, la concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été
produits.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons (environ 1 ml) ont été
prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un septum avec une seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/HPAIC comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des échantillons ont été
filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.
Fermentation La production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée en bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est représentée à la figure 7. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition autotrophe atteint p. = 0,14 h'. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 160 mg/L, a été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 7.

21 Exemple 5: Construction et évaluation d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de Streptococcus bovis est surexprimée (CN0003).
Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-6-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0003 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (ldh, EC:1.1.1.27) de Streptococcus bovis (ATCC 33317) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in vitro via .. le protocole d'assemblage In-Fusion (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh (GenBank: KFN85486.1) est recodé selon le biais d'usage de codon décrit pour Cupriavidus necator H16 et synthetisé in vitro (GenScripti0). Il est amplifié par PCR à
l'aide des oligonucléotides 12 (5' AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3') et 13 (5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS
(Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d'éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de bases contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pBAD-Idh(sb). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou/ StellarTM (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (GibcoTm). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14 (5' GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC
3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11.
Le plasmide pBAD-Idh(sb) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou/ S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

22 La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé
une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n 541) est réalisé comme suit :
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB

contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20h à 30 C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia cou sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37 C
sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOsoonm) est mesurée pour chaque culture et l'équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1,5m1 et centrifugé (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS
(Sigma-Aldrich).
Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia cou sont prélevées et mélangées dans un tube 1,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30 C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000eme et 100 pl de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30 C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30 C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- Idh(sb) est réalisée par PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14.
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) est récupérée et nommée CNO003.
Evaluation de la souche CN0003 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) (CN0003) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0003 produit 1 g/L de lactate après 140h de culture.
Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0003 n'a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que la souche .. CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0002.

23 Exemple 6: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée (CNO004).
Souche Pour la production de lactate, la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC
17699) est utilisée. La délétion de l'opéron de voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est inhibée par insertion d'une lactate déshydrogénase endogène.
Constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0004 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose ainsi que les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron phaCAB est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France).
Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 15 (5' AGACAATCAA ATCTTTACAC
TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT
TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont de l'opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac (en italique) provenant du pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5' CCAGGCCGGC AGGTCAGGCC
GTGGGGACGG CCA 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie amont de l'opéron phaCAB est amplifiée par PCR
sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 17 (5' GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pJQ200mpTet et 18 (5' CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 5' de la séquence du promoteur pLac et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5%
de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB est amplifiée par PCR
sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 19 (5' CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3') présentant en 5' une zone de

24 recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la séquence du gène ldh de la souche Cupriavidus necator H16 et 20 (5' TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG
GATGTCGATG AAGGCCTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d'obtenir le plasmide pJQ200mp-AphaCABC2pLac L-ldh. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène ldh, de la séquence de la zone d'homologie amont et de la séquence de la zone d'homologie aval est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 (5' TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3'), 22 (5' CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3'), 23 (5' CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3') et 24 (5' CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3').
Le plasmide pJQ200mp-AphaCABC2pLac L-ldh est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron phaCAB et d'y insérer pLac L-ldh. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à
l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) (Kraufle et al., 2009).
La souche Cupriavidus necator H16 AphaCABOpLAC_L-Idh C.necator est récupérée et 5 nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0004 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AphaCABOpLAC_L-Idh C.necator (CN0004) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0004 produit 1,5 g/L de lactate après 140 h de culture.
10 Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0004 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en plus à partir de 15 CO2 que la souche CN0002.
Exemple 7: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate carboxylase est délétée (CN0005) 20 Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour la pyruvate carboxylase (pyc) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England

25 Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 25 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 26 (5' TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour pyc et de l'enzyme KOD Hot Start DNA

Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides

26

27 (5' TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour pyc et 28 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT
CTTCAACACC AGCAGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 31 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Apyc. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29 (5' GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3'), 30 (5' CGCCATATCG
GATGCCGTTC 3') et 31(5' TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3').
Le plasmide pL03-Apyc est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pyc.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0005 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0005) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0005 produit 21% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0005 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 8: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006) Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour le composant El de la pyruvate deshydrogénase (pdhA2) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pdhA2 est amplifiée .. par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 32 (5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT
TCCAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité
3' du plasmide pL03 et 33 (5' CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 34 (5' GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour pdhA2 et 35 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC

28 GATCC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité
5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-ApdhA2. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB
5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5' TAATCCACTT
CCAGCGCGAT AAG 3'), 37 (5' CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3'), 38 (5' GTTCGAAGCC
ACCGAGTATG AC 3') et 29 (5' GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3').
Le plasmide pL03-.8.pdhA2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pdhA2.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

29 Evaluation de la souche CN0006 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0006) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0006 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 9: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate synthase sont délétées (CN0007) Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0007 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (pta1) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA
Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pta1 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 39 (5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 40 (5' TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour ackA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5%
de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 41(5' ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour pta1 et 42 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT

AGTGGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Apta1-ackA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes.
Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron ackA-pta1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43 (5' GACTTCCGGC
AGGTCATGC 3'), 44 (5' CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3'), 45 (5' GCCAAGCCGG
AACGCGTC 3') et 46 (5' GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3').

Le plasmide pL03-Apta1-ackA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron pta1-ackA. Après la

30 première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA
Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

31 Evaluation de la souche CN0007 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0007) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0007 produit 11% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0007 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0007 produisait 11% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0007 produirait 11% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 10: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008) Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du site actif de la L-Lactate cytochrome c reductase (1IdD, 1.1.2.3) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldD est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 47 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pJQ200mpTet et 48 (5' AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldD et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldD est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 49 (5' CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldD et 50 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG
3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5%

32 de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR
clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlIdD. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène IldD est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24 (5' CTGGCACGAC
AGGTTTCCCG A 3'), 51 (5' TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3') et 52 (5' GAACAGCTGC ACGCCGAG 3').
Le plasmide pJQ200mpTet -AlIdD est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour IldD.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

33 Evaluation de la souche CN0008 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0008) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0008 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0008 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 11 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009) Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour L-Lactate cytochrome reductase (IldA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 53 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3') .. présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pJQ200mpTet et 54 (5' GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA
AAACAAAAAG CTGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA et de l'enzyme KOD
Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 55 (5' AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldA et 56 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG
TAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec

34 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié
sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pJQ200mpTet -3,11dA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène IldA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21(5' TGCAAGGCGA
TTAAGTTG 3'), 57 (5' CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3'), 58 (5' CCATGTGATAGCGTCTATGAGG 3') et 24 (5' CTGGCACGACAGGTTTCCCGA 3').
Le plasmide pJQ200mpTet -3,11dA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour IldA.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0009 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator (CN0009) a été
évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0009 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
5 Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0009 n'a pas été réalisée à partir de 002. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à
partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en moins à partir de 10 CO2 que la souche CN0004.
Exemple 12: Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CNO010) 15 Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CNO010 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New 20 England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 59 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3') 25 .. présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 60 (5' ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit 30 Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 61 (5' AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie

35 amont du gène codant pour ppsA et 62 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA
GCACGTGCT TGTAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA
Polymerase

36 (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-AppsA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB
5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5' ATGAACACCG
GCACCTTCTA CC 3'), 91 (5' CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3') et 29 (5' GCAAACAAAC
CACCGCTGGT 3').
Le plasmide pL03-AppsA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia cou S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37 C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15%
de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour ppsA.
Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR
sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm).
Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM
Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABC2pLAC_L-Idh C.necator est récupérée et nommée CNO010. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

37 RÉFÉRENCES
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Claims

REVENDICATIONS

1. Bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase.

2. Bactérie selon la revendication 1, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase endogène.

3. Bactérie selon la revendication 1 ou 2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase exogène, préférentiellement dérivé d'une bactérie, d'un champignon, d'une levure ou d'un mammifère, plus préférentiellement dérivé d'une bactérie.

4. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une L-lactate déshydrogénase et optionnellement dans laquelle l'expression d'au moins un gène codant une D-lactate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée.

5. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une D-lactate déshydrogénase et optionnellement dans laquelle l'expression d'au moins un gène codant une L-lactate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée.

6. Bactérie selon l'une des revendications précédentes, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement au moins une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate.

7. Bactérie selon la revendication 6, dans laquelle la voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) est au moins partiellement inhibée.

8. Bactérie selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant l'Acétyl-CoA acetyltransférase, l'Acetoacétyl-CoA réductase et la poly(3-hydroxybutyrate) synthase est au moins partiellement inhibée, préférentiellement l'expression d'au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l'expression desdits trois gènes.

9. Bactérie selon l'une des revendications 6 à 8, dans laquelle l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant une phosphoenolpyruvate synthase et une pyruvate carboxylase est au moins partiellement inhibée.

10. Bactérie selon l'une des revendications 6 à 9, dans laquelle la voie de conversion de l'Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde est au moins partiellement inhibée, préférentiellement, l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant une phosphate acétyltransférase, une Acétate kinase et une Acétaldéhyde déhydrogénase est au moins partiellement inhibée.

11. Bactérie selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'expression d'au moins un gène codant une lactate ferricytochrome C reductase est au moins partiellement inhibée.

12. Utilisation d'une bactérie selon l'une des revendications 1 à 11, pour la production de lactate à partir de CO2, Préférentiellement pour la production exclusivement de L-lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate.

13. Procédé de production de lactate à partir de CO2, comprenant les étapes consistant à
- cultiver la bactérie selon l'une des revendications 1 à 11 en présence de CO2 comme seule source de carbone, puis - récupérer le lactate.