TR201909794T4 - Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. - Google Patents

Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. Download PDF

Info

Publication number
TR201909794T4
TR201909794T4 TR2019/09794T TR201909794T TR201909794T4 TR 201909794 T4 TR201909794 T4 TR 201909794T4 TR 2019/09794 T TR2019/09794 T TR 2019/09794T TR 201909794 T TR201909794 T TR 201909794T TR 201909794 T4 TR201909794 T4 TR 201909794T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
specific
arabitol
nadph
ohmeri
xylitol
Prior art date
Application number
TR2019/09794T
Other languages
English (en)
Inventor
schaefer Astrid
Diefenbacher Melanie
Chang Yiming
HONDA MALCA Sumire
Schwab Markus
Defretin Sophie
Gerard Tania
Heysen Arnaud
THOR Friederike
Original Assignee
Roquette Freres
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres filed Critical Roquette Freres
Publication of TR201909794T4 publication Critical patent/TR201909794T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0101—L-Xylulose reductase (1.1.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01011—D-Arabinitol 4-dehydrogenase (1.1.1.11)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, ksilitol üretimine yönelik rekombinant bir mikrobiyal konak ile ilgilidir, rekombinant mikrobiyal konak substrat olarak D-arabitol kullanan ve ürün olarak D-ksiluloz üreten bir NAD + -spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan bir nükleik asit dizisi ve substrat olarak D-ksiluloz kullanan ve ürün olarak ksilitol üreten bir NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit dizisi içerir.

Description

TARIFNAME BIR REKOMBINANT sus ARACILIGIYLA GLIKOZDAN KSILITOL ÜRETIMI Bulus Sahas: Mevcut bulus ksilitolün üretimine yönelik genetigi degistirilmis mikroorganizmalar kullanFmTta dair bir yöntem ve bir adFmda kolay bir sekilde temin edilebilen D-glikoz gibi karbon kaynaklarîiü ksilitole dönüstürebilen genetigi degistirilmis bir mikroorganizmanît hazIIanmasIia dair bir yöntem ile ilgilidir. Bulusun Altyapßü Ksilitol, hijyen ve nutrasötik formülasyonlar ve ürünlerde uygulamalara sahip olan, (CHOH)3(CH20H)2 formülünün bir polialkol ve seker alkolüdür (alditol). Ksilitol, yaklasik olarak sakkaroz kadar tatli iolan %33 daha az kaloriye sahip diyabetik bir tatlandinici olarak kullan Iin. Diger dogal veya sentetik tatlandinicilarn aksine, ksilitol düzenli kullanimda tasiyiolarl Iüçte bire azaltma aracliglyla dis saglig. için etkin bir sekilde yararm T ve remineralizasyona yard rmcm T. Ksilitol, birçok meyve ve sebzenin liflerinde dogal olarak düsük konsantrasyonlarda bulunur ve mBI kabugu ve seker kamßEküspesi ve hus agacügibi fibröz materyalin yanßîa çesitli yumusak meyveler, yulaflar ve mantarlardan özütlenebilir. Ancak, endüstriyel üretim ksiloza hidrolizlenen ve katalitik olarak ksilitole hidrojenlenen, sert agaçlar veya mîsl koçanlarIidan özütlenen ksilandan (bir hemiselüloz) baslar. Ksiloz ve ayr ca ksilitolün saflastrlmas dolaysyla büyük ölçüde bir sorun ortaya koyar. Bu türde birçok proses bilinir. U.S. patentleri 4,075,406 ve 4,008,285 örnekler olarak bahsedilebilir. D-ksilozun ksilitole indirgenmesi ayrI3a dogadan (dogal sus suslar[)] izole edilen maya suslarüveya genetigi degistirilmis suslar kullanEtarak mikrobiyolojik bir proseste elde edilebilir. Ancak, kagt hamuru ve kagiti proseslerinden sülfit likörü gibi pahali iolmayan ksiloz kaynaklaaniLm maya büyümesini inhibe eden safszlklar içermesi nedeniyle maya fermentasyonuna yönelik uygun bir formda substratini, D-ksilozun, elde edilmesi bir sorundur. Ksilitolün üretimine yönelik cazip bir alternatif yöntem, D-glikoz gibi ucuz ve kolay bir sekilde temin edilebilen substratît fermantasyonu aracmîggila elde edilmesidir. Teknigin durumunda, D-ksiloz ve D-ksiluloz haricinde yaygît herhangi bir karbon kaynagnîi tek-admilübir fermantasyonu sîasîida belirli miktarlarda ksilitol üretebildigi açklanan birkaç rekombinant mikroorganizma mevcuttur. Bu rekombinant mikroorganizmalar, özellikle ozmofilik mayalar, örnegin Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha ve Toru/opsis candida baslang çta D- glikozdan D-arabitol olan pentitol ile yak ndan iliskili bir ksilitolün kaydadeger miktarlariri n üreticileri olarak bilinir (Lewis D.H. & Smith D.C., 1967, New Phytol. 66:143-184). Dolayßjila uluslararas: patent basvurusu WO 94/10325 D-ksiluloz veya D-ksiloz haricinde ve bunlarli polimerileri veya oligomerleri veya karSEhlarjharicinde karbon kaynaklarEi üzerinde büyümesi durumunda ksilitol üretebilen bu tür rekombinant konaklarîi olusturulmaslia yönelik yöntemler saglar. Mevcut patent basvurusunda, bu amaç istenen heterolog genlerin yerlestirilmesi ve ifade edilmesi araCJJgS/Ia istenen mikroorganizmann tercihen dogal olusumlu bir maya mikroorganizmasnmi metabolizmasnLni modifikasyonu aracUJgLyla elde edilir. Bu amaç ayrica dogal halindeki bu tür mikroorganizmaya homolog olan belirli genlerin aktivitesi veya ifadesini asini iifade etmek ve/veya etkisizlestirmek amaciyla bu tür istenen mikroorganizmann metabolizmasin n daha fazla modifikasyonu araciligiyla elde edilir. Ksilitol üretimine yönelik bu patent basvurusunda saglanan yöntem degistirilmis bir D- arabitol biyosentez yolunu kullanmgstî ve bu tür yol, D-ksiluloz olusturan D-arabitol dehidrojenaz:(EC 1.1.1.11) ve ksilitol dehidrojenazlia (EC 1.1.1.9) yönelik kodlama yapan genlerin bir D-arabitol üreten mikroorganizmaya yerlestirilmesi ve as rI [ifadesi aracillgiyla önceden mevcut olan D-arabitol yolunun genisletilmesi aracLLLgLyla büyük oranda degistirilmistir. Ancak, WO 94/10325 içinde açlklanan deneylerdeki ksilitol verimi, maya ekstraktlîia sahip bir ortam içinde 48 saatlik yetistirme akabinde yalnmca yaklask olarak 7.7 g/l olmustur. Bu birinci sonucu optimize etmeye çalßmak üzere, WO 94110325 içinde mutajenez veya gen bozulmasükullanttarak transketolaza (EC 2.2.1.1) yönelik kodlama yapan genler ve/veya D-ksilulokinaza (EC 2.7.1.17) yönelik kodlama yapan genin etkisizlestirilmesi ve ayria pentoz-fosfat yolunun oksidatif dal" enzimlerine yönelik kodlama yapan genlerin ve spesifik olarak bu tür mikroorganizmalar içindeki D-glikoz-6- fosfat dehidrojenaz (EC 1.1.1.49) ve/veya 6-fosfo-D-glukonat dehidrojenaz (EC 1.1.1.44) ve/veya D-ribuloz-S-fosfat epimeraz geninin (EC 5.1.3.1) as rl !ifade edilmesi önerilmistir. Ancak, hangi genetik kombinasyonun kullanildrgrl fark etmeksizin, ksilitol titresi herhangi bir zaman 9 g/I'den fazla olmamßtl. Lafayette et al (2005, Plant Cell Report, 24, 596-602) Escherichi'a Gol/"den Arabitol dehidrojenaz: kodlayan bir gen yapßliîaçtklar. U82011/027847, Pichia stipiti's'ten izole edilen NADP'ye spesifik ksilitol dehidrojenazlia ve genetigi degistirilmis mayaya yönelik bir geni açERIar. DolayLS'yla, bunun üretimini optimize etmek ve böylece bunu ticari olarak faydalihale getirmek amaciyla ksilitol üreten suslarlm daha iyi bir genetik manipülasyonuna yönelik giderilmemis bir ihtiyaç mevcuttur. Bulusun K sa Ac klamasi i Mevcut bulus ksilitol üretebilen bir rekombinant konak hücre ile ilgilidir, burada söz konusu konak hücre asagIaki unsurlarElçerir: substrat olarak D-arabitol kullanan ve ürün olarak D-ksiluloz üreten bir NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi; ve substrat olarak D-ksiluloz kullanan ve ürün olarak ksilitol üreten bir NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi, burada konak hücre, özellikle yüksek ozmotik basmç ortam_ aItTida, D- glikozdan D-arabitol üretir ve tek bir karbon kaynag Fblarak D-arabitol tüketmez. Daha çok tercih edildigi üzere, konak hücre bakteri, mantar ve mayadan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, konak hücre ozmofilik veya ozmotolerant bir maya, özellikle Pichia ohmeri'dir. Tercihen NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz (EC 1.1.1.11) E. coli veya Ra/stonia solanacearum'dandii Daha çok tercih edildigi üzere, NAD+-spesifik D- arabitol 4-oksid0redüktaz (EC 1.1.1.11) SEQ ID No 2 veya 43'ün dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklenmesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir düzenlemede, NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1 .11) kodlayan dizi SEQ ID No 3 veya 42'nin dizisini içerir veya bundan olusur. Tercihen, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, NADH ila NADPH arasmda kofaktör özgüllügünün degistirilmesine yönelik mutasyona ugratIan Pichi'a stipiti's veya Gluconobacter oxydans'dan bir ksilitol dehidrojenazdl. Daha çok tercih edildigi üzere, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz SEQ ID No 5 veya 8'in dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir düzenlemede, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazükodlayan dizi, SEQ ID No 6 veya 9'un dizisini içerir veya bundan olusur. Tercihen, konak hücre 48 saatlik bir kültür akabinde süpernatant içinde en az 15 g/I'lik bir ksilitol titresi üretebilir. Tercihen konak hücre, CNCM`de tevdi edilen suslar I-4982, I-4960 ve I-4981`den seçilen bir sustur. Tercihen konak hücre, NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazükodlayan bir dizinin birkaç kopyasinii !ve/veya NADPH'ye spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir dizinin birkaç kopyasnüçerir. Mevcut bulus ayrica istemler 1-13'ten herhangi birine göre bir rekombinant konak hücre kültürlenmesi ve ksilitolün geri kazanflmaslîi_içeren, ksilitol üretilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Mevcut tarifname ek olarak SEQ ID No 1, 3, 7 ve 9'dan olusan gruptan seçilen bir nükleik asit dizisini içeren veya bundan olusan bir nükleik asit, söz konusu nükleik asidi içeren bir ifade kaseti veya vektörünü açIslar. Son olarak, mevcut bulus ksilitol üretilmesine yönelik mevcut bulusa göre bir rekombinant konak hücrenin kullanLmUIe ilgilidir. _Bulusun DetavljAciklamasü Tanimlar Burada kullanIdgDüzere, "D-ksiloz ve D-ksiluloz haricinde bir karbon kaynagû ile D- ksiloz ve D-ksiluloz veya bunun polimerleri veya oligomerleri veya karßmnlarüwrnegin ksilan ve hemiselüloz) haricinde ksilitol üretimine yönelik bir karbon substratüifade edilir. Karbon kaynagütercihen D-glikoz ve çesitli D-glikoz içeren suruplarü ve D- glikozun diger sekerler ile karßînlarmüçerir. Burada kullariIdEgDüzere, "gen" ile bir proteine yönelik kodlama yapabilen bir nükleik asit dizisi, özellikle bir DNA dizisi ifade edilir. Burada kullanldigl Iüzere, "vektör" ile bir konak hücreye genetik bilgi, spesifik olarak DNA'yl Itasiyabilen bir plazmid veya herhangi bir diger DNA dizisi ifade edilir. Vektör ayr ca vektör ile aktar lan hücrelerin tanimlanmaslna kullanima yönelik uygun bir markör veya raportör ve bir veya daha fazla prokaryotik veya ökaryotik konaklarda vektörün korunmasüve replikasyonunu saglayan replikasyon kökenlerini içerir. Bir "plazmid", en az bir konak hücrede korunan ve otonom bir sekilde çogalan genellikle dairesel DNA olan bir vektördür. Burada kullanlldlg' 'üzere, "ifade vektörü" ile bir vektöre benzeyen ancak, bir konaga transformasyonu akabinde, buna klonlanan bir gen veya kodlama yapan nükleik asidin ifadesini destekleyen bir vektör ile ifade edilir.Kl0nlanan gen veya kodlama yapan nükleik asit genellikle vektör araclllg yla veya klonlanan genin rekombinant yapisil araclliglyla saglanabilen, promotör dizileri gibi belirli kontrol dizilerinin kontrolü altina yerlestirilir (diger bir deyisle çalßabilir bir sekilde baglanm). Ifade kontrol dizileri, vektörün bir prokaryotik veya ökaryotik konakta çalßabilir bir sekilde baglîgeni ifade etmek üzere tasarlanm› tasarlanmadglia bagIZOIarak degisecektir ve ek olarak arttIEbD elemanlar gibi transkripsiyonel elemanlar: (akîs yukarD aktivasyon dizileri) ve sonlandmma dizileri ve/veya translasyonel baslatma ve sonlandlma alanlarmüçerebilir. Burada kullanIdgDüzere, "konak" ile rekombinant materyalin almßüveya taslyîzßü olarak kullanilan prokaryotik veya ökaryotik bir hücre ifade edilir. Burada kullanlldigi lüzere, "Pentoz-Fosfat Yolunun Oksidatif Dali"i ile D-glikoz-ö-fosfat dehidrojenaz (EC 1.1.1.49) glukonolaktonaz (EC 3.1.1.17) ve 6-fosfo-D-glukonat dehidrojenaz (EC 1.1.1.44) araclliglyla katalizlenen reaksiyonlar gibi Oksidatif reaksiyonlar* katalizleyen ve pentoz fosfatlarýolusturmak üzere heksoz substratlarÜ kullanan pentoz-fosfat kese yolunun parçasliüiçerdigi ifade edilir. Pentoz- fosfat yolunun (bu ayrIa D-glikozdan net riboz olusumunu katalizler) "Oksidatif olmayan" parçasü transketolaz (EC 2.2.1.1), riboz-5-fosfat izomeraz (EC 5.3.1.6), D-ribuloz-S- fosfat-S-epimeraz (EC 5.1.3.1) ve transaldolaz (EC 2.2.1.2) araCJIgSIIa katalizlenen reaksiyonlar gibi Oksidatif olmayan izomerizasyonlar ile karakterize edilir. Bakma Biological Chemistry, H.R. Mahler & E.H.Cordes, Harper & Row, publishers, New York, 1966, pp. 448-454. Burada kullanildlgl lüzere, "kodlama yapan nükleik asit" ile bir nükleik asit molekülü (tercihen DNA) ifade edilir. Kodlama yapan nükleik asit bir proteini kodlayabilir ve birçok kaynaktan hazlnlanabilir. Bu kaynaklar genomik DNA, cDNA, sentetik DNA ve bunlar n kombinasyonlarini içerir. Burada kullanIdEgD üzere, "heterolog" bir gen veya kodlama yapan dizinin genetik mühendisligi aracEEglýla hücreye yerlestirilmesini ifade ettigi anlasE. Bu, epizomal veya kromozomal formda mevcut olabilir. Gen veya kodlama yapan dizi yerlestirildigi konak hücreden farkl:bir kaynaktan meydana gelebilir. Ancak, bu ayrma yerlestirildigi konak hücre ile ayni ltürden gelebilir fakat dogal olmayan ortam !nedeniyle heterolog olarak düsünülür. Örnegin, kendi dogal promotörü olmayan bir promotörün kontrolü alt nda olmas , kendi dogal konumundan farkl lbir konumda yerlestirilmesi nedeniyle, gen veya kodlama yapan dizi heterolog olarak refere edilir. Konak hücre heterolog genin yerlestirilmesi öncesinde genin endojen bir kopyasmiFliçerebilir veya endojen bir kopya içermeyebilir. Bulusun amacH Bulusa göre, spesifik bir mikrobiyal konagli dogal metabolik yollar: ksilitol üretimi haricindeki amaçlara yönelik karbon kullanEhîtü azaltmak veya ortadan kaldImak amaciyla manipüle edilir. Bu tür bir genetigi degistirilmis konak susu böylece yüksek bir verim ile bir fermantasyon adim nda ksilitol üretebilir. Örnegin, süpernatant içinde 48 saatlik kültür akabinde ksilitol titresi 15 g/I'den fazla, tercihen 25 g/I*den fazla, daha fazla tercih edildigi üzere 50, 60, 70, 80, 90 veya 100 g/I'den fazladln. Bulusun pratik uygulamaslida, bulusun genetigi degistirilmis konagziyrma, yalnüca D- ksiloz ve/veya D-ksilulozdan olmamak üzere D-glikoz gibi yapßal olarak iliskili olmayan karbon kaynaklarlidan ksilitol sentezleme yetenegi ile karakterize edilir. Tercihen, bulusun genetigi degistirilmis konagüayrîia sentezlenen ksilitolü ortama salgmayabilir. Spesifik olarak, örneklendirilen ve tercih edilen düzenlemelerde, bulusun genetigi degistirilmis konagl iarabitolün ksilitol olusumunda bir ara ürün oldugu bir yol ile karakterize edilir. Buna göre, bulusun rekombinant konak susu asag daki genetik degisimler ile karakterize edilir: (1) NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) aktivitesine sahip bir proteini kodlayan heterolog bir nükleik asit konak hücreye yerlestirilmistir - böylece D-arabitolün D-ksiluloza dönüsümü saglanm; ve (2) NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz aktivitesine sahip bir proteini kodlayan heterolog bir nükleik asit konak hücreye yerlestirilmistir - böylece D-ksilulozun ksilitole dönüsümü saglan T, burada konak hücre, özellikle yüksek ozmotik basmç ortam* altîtda, D- glikozdan D-arabitol üretir ve tek bir karbon kaynag :olarak D-arabitol tüketmez. Mikroorganizmalarüli seçimi Mevcut bulusa yönelik uygun mikroorganizmalar veya konak suslarüglikozdan D- arabitol üretebilir. Daha özellikle, bunlar yüksek ozmotik basnç ortam: altlida glikozdan kaydadeger miktarlarda D-arabitol üretebilir. "Yüksek ozmotik bas nç ortami'l ile burada %10-60 D-glikoz, tercihen yaklasik %25 D- glikoz içeren ortam refere etmek amaçlanirl. "D-arabitolün kaydadeger miktarlar** ile en az 100 g/L D-arabitol kast edilir. Özellikle, bir mikroorganizma veya konak susun ygmi kosullarîtda %25 D-glikoz içeren bir ortam içinde iGOg/L D-arabitol üretmesi durumunda bir mikroorganizma veya konak susun kaydadeger miktarlarda D-arabitol ürettigi düsünülür. Glikozden kaydadeger miktarlarda D-arabitol üretebilen konak sus örnekleri, ozmofilik veya ozmotolerant mayalar: özellikle Pichia, Kodamaea, Candida, Zygoaccharomyces, Debaromyces, Metschnikowia ve Hansenu/a türlerine ait olanlarm veya D-arabitol üreten mantarlarLJ özellikle Dendiyphie/Ia ve Schizophy/Ium türlerine ait olanlarL. özellikle DendryphieI/a salina ve Schizophy/lum commune'yi içerir. Pichia cinsi mikroorganizmalarin örnekleri Pichia ohmeri, Pichia stipitis, Pichia farinosa, Pichia haplophila'yiliçerir. Candida cinsi mikroorganizmalarn örnekleri Candi'da polymorpha ve Candida tropicalisî içerir. Zygoaccharomyces cinsi mikroorganizmalarn örnekleri Zygoaccharomyces rouxii'yi içerir. Diger örnekler Torulopsis candida ve Torulaspora hansenii'yi içerir. Metschnikowia cinsi mikroorganizmalarn örnekleri Metschnikowia pulcherr/'ma, Metschnikowia reukaufi'i, Metschnikowia bicuspidata, Metschnikowia Iunata ve Metschnikowia zobellii'yi içerir. Spesifik suslar olarak, Metschnikowia pulcherrima ATCC 18406, Metschni'kowia reukaufi'i ATCC 18407, Metschnikowia bicuspidata ATCC 24179, Metschni'kowia lunata ATCC 22033, Metschnikowia zobellii' ATCC 22302 ve Metschnikowia pulcherrima FERM BP- 7161'den bahsedilebilir. Bu suslar, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan elde edilebilir, Adresi: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Amerika Birlesik Devletleri. Metschnikowia pulcherrima FERN BP-7161 orijinal olarak, tevdi numarasi? FERM P-16592 altlida 16 Ocak 1998'de Biyolojik Bilim ve Insan-Teknolojisi Ulusal Enstitüsü, Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Ajansü Uluslararasü Ticaret ve Endüstri Bakanlglida (posta kodu: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonya) tevdi edilmistir ve 15 Mayß 2000`de Budapeste Antlasmaslia baglüolarak orijinal tevdisinden uluslararasütevdiye aktarImgstI ve tevdi numarasiFERM BP-7161 olarak tevdi edilmistir. Spesifik bir açIJa, mikroorganizma erisim numarasDFERM BP- 7161ie sahiptir. Daha fazla bilgi için, EP1065276'ya basvurunuz. Mikroorganizman n, D-arabitol üretme kapasitesini arttinmak ve/veya ksilitol üretiminden ayri bir amaca yönelik D-arabitol kullanma kapasitesini azaltmak amacyla genetigi degistirilebilir. Bulusa yönelik olarak, konak sus avantajlîbir sekilde spesifik metabolik özellikleri aracmgglla seçilir: - bu, yukarîja detaylandIIdEjD üzere, özellikle yüksek ozmotik basnç ortam: örnegin %10-60 D-glikoz ve tercihen %25 D-glikoz içeren ortam altîida glikozdan kaydadeger miktarlardaki D-arabitolün bir üreticisi olabilir ("Normal" ortam genellikle %2-3 glikoz içerir.) - bu, tek bir karbon kaynagLblarak D-arabitol tüketmeyebilir; - bunun redoks dengesi, karsilik gelen ketopentoz/pentoz alkol dönüsümüne yönelik gereken kofaktörlerin olusumunu saglar. Bulusun bir düzenlemesinde, ozmofilik maya Pichia ohmeri (ve bunun mutajeneze ugrayan türevleri) bir model ve tercih edilen bir konak olarak kullanÜInßtI. Pichia ohmeri baslangßtta salataltß tuzlu suyunda izole edilmistir ve yaygmi olarak tursular, kabuklar ve meyvelerin fermentasyonuna yönelik gIIa endüstrisinde kullanmnßtl. Pichia, Zygosaccharomyces, Debaromyces ve Hansenula gibi maya türlerinin, Saccharomyces cerevisiae'nmi aksine düsük su aktivitesi olan ortamlarda büyüyebildigi teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinir. Bu ozmotolerant veya ozmofilik mayalar, enzimleri koruyan ve dengeleyen gliserol, D-arabitol, eritritol ve manitol gibi uygun çözünen madde biriktirir, böylece ozmotik büyüme kosullar`nda hücresel fonksiyonlarm saglar. Üretilen polioller ayrüa redoks dengelemesinde bir rol oynar. Tercih edilen bir açma, mikroorganizma Pichia ohmeri'dir. Aslmda, konak sus Pichia ohmeri' 'nin ana karakteristigi, gliserol ve D-arabitol üreten Zygosaccharomyces rouxii'nin aksine uygun çözünen madde olarak yalnâca D-arabitol üretmesidir. Ek olarak, glikozdan D-arabitole metabolik yol Pichia ohmeri'de iyi bilinir. Zygoaccharomyces rouxii"de (J.M.INGRAM and W.A.WOOD, 1965, Journal of Bacteriology, Vol.89, N°5, 1186-1194) açiklandlg üzere, Pichia ohmeri'deki karbon ak sl,l iki NADPH molekülünün beraberinde gelen üretimi ile D-Glikozu D-ribuloz-5-P`ye dönüstürmek üzere Pentoz-Fosfat Yolunun (PPP) oksidatif parças ndan geçer. D- ribuloz-5-P, D-ribuloza defosforile edililir ve akabinde D-arabitole indirgenir. Pichia ohmeri'de konak susunda, Pentoz Fosfat Yolu (PPP) oldukça aktiftir ve %50'den fazla oldugu saptanm stm. Tercih edilen bir düzenlemede konak hücre, I-4605 sayßîaltîtda Institut Pasteur'ün (CNCM) Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu], 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15 ile 7 Mart 2012 tarihinde tevdi edilen bir mutant Pichia ohmeri'dir. Redoks reaksiyonlarüve enzimleri Bir reaksiyondan digerine elektronlarn tas yicilar olarak söz konusu redoks reaksiyonlar nda islev gösteren kofaktörler NADH ve NADPH, birçok biyolojik fonksiyon için gereklidir. Termodinamik bir itici kuvvet saglamak üzere NADPH/NADP+ çiftinin, NADH/NAD+ çiftinden daha fazla indirgenmis bir halde korundugunun farkmida olunarak, hücrelerin iki redoks çifti NADH/NAD* ve NADPH/NADP+"nin metabolik dengesini korumasEigerekir. Çogunlukla oksitlenmis form NAD+ halinde bulunan NADH, besinlerden oksidatif enerji saIEnIia dahil oldugu katabolik reaksiyonlarda ana ko- faktördür. NADH'n aksinde, NADPH yalnütca anabolik reaksiyonlarda veya oksidatif stres anlarinda yeniden oksitlenir. Redoks reaksiyonlarini içeren herhangi bir metabolik mühendislik stratejisi bu hücresel klSItlamalar altinda fonksiyon göstermek zorundadln. Bu, bulusun amac .olan genetigi degistirilmis susta gerçeklestirilmistir. Bulusçu tarafindan bulundugu üzere, özellikle "Contribution a l'étude du metabolisme des pentitols Chez Pichia ohmeri" (Sophie Huchette, University of Sciences and Technics of Lille. 1992) baslERlDPhD Tezi içinde, ketopentozlarn oksidoredüksiyonuna dahil edilen reaksiyonlarîi iki farleenzim tarafîidan katalizlendigi gösterilmistir. Böylece, konak sus D-ribulozdan D-arabitol olusturan ve D-ksilulozdan ksilitol olusturan, bir NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz olarak tanLmlanan bir enzime sahiptir. Konak sus ayr'ca sinaslyla D-ribuloz ve D-ksilulozdan ribitol ve ksilitol olusturan bir NADH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaza sahiptir. Bu enzim, Pichia stipitis'ten (XYL2) iyi bilinen NAD+-spesifik ksilitol dehidrojenaz E.C 1.1.1.9'a yaklnd r. D-ksilulozun aksine yalnzca intraselüler D-ribulozun temin edilebilmesi nedeniyle, konak sus NADPH/NADP+ redoks çiftini dogrudan D-ribulozdan D-arabitolün sitosolik olusumu aracElTggla NADPH'nin yeniden oksidasyonu ile dengeler. Akabinde, D- arabitol bir pasif difüzyon vasttas :da sîiEbesiyerine salg Ian . Bulusçular Pichia ohmeri"nin NADH- veya NADPH-spesifik-D-ketopentoz- oksidoredüktaz vasttlasjila bu polioli üretmek üzere tüm enzimatik araçlara sahip olmasîhalinde dahi, intraselüler D-ksilulozdeki eksikligin konak sus aracjigýla ksilitol üretimi olmamasîia yönelik temel neden olacagIiEbulmustur. Asl nda, sitosolik D-arabitolün D-ksiluloz ve NADH'ye dönüstürülmesini saglayan NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) aktivitesine (E.C.1.1.1.11) sahip bir proteini kodlayan bir geni, dogal sus konak susu Pichi'a ohmeri"ye klonlanmak seçilmistir. Böylece, intraselüler D-ksiluloz genetigi degistirilmis susta mevcut hale getirilir ve intrinsik NADH- ve NADPH-spesifik-D-ketopentoz-oksidoredüktaz araCJJggila azaltIabilir. Ancak, sus D-ksilulozü etkili bir sekilde ksilitole dönüstürebilen endojen enzimlerden yoksundur. Dolayîsgla, heterolog bir ksilitol dehidrojenazüyerlestirmek amaciyla susun genetigini degistirmek gereklidir. Patent WO 94110325 içinde, ksilitol üretimi saglanarak ve önceki metabolik adim aracillgiyla üretilen NADH oksidasyonu ile NADH/NAD+ redoks çifti dengelenerek, Pichia stipitis'ten (XYL2) NAD+-spesifik Ksilitol dehidrojenazî(E.C 1.1.1.9) klonlamak tercih edilmistir. Ancak daha önce belirtildigi üzere, sonuçlar gerçekten tatmin edici degildir. Bulusçular, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaza sahip mutasyona ugramß bir proteini kodlayan bir genin klonlanmasîaracmgßtla, D-ribulozdan D-arabitolün intrinsik üretimi aracmgßila gerçeklestirildigi gibi NADPH/NADP* redoks çiftini dengelemek üzere D- ksilulozun ksilitole dönüstürüldügünü bulmustur. NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktazlni D-arabitole yönelik düsük afinitesi nedeniyle, Pichia ohmeri dogal tip konak sus ekstraselüler D-arabitolü tüketmez. Genetigi degistirilmis susa bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (D-ksiluloz- olusturma) aktivitesinin yerlestirilmesi nedeniyle, sNýbesiyeri içinde üretilen D-arabitol sitosolik D-arabitol ile ayn :sekilde degistirilmis sus taraflidan iyi bir sekilde tüketilebilir. Sonuç olarak, ksilitol intraselüler ve ekstraselüler D-arabitolden ayn Zamanda üretilir. Bunun üretimi, aracü D-arabitolün dßarwa aktarürnasmdan tamamen kaçlimak amaclýla ksilitol yolu genislemesinin etkinliginin arttltlrnasEaraCJJgS/Ia arttltltabilir. Böylece, D-glikozdan yalnLZca D-arabitol ile ayn_ fizyolojik etkiye sahip ksilitol üretilebilecektir. Bu gelisme genetik modifikasyonlar n, ayrica kültür kosullarinn adaptasyonunun sonucu olabilir. Konak susta klonlanacak iki enzimatik aktivitenin seçimi Bu iki enzimatik aktivitenin seçimi, yukarmla açtRlandEgD üzere bunlari kofaktör özgüllügü ile desteklenir. Birinci enzim D-arabitolü D-ksiluloza oksitler. Iki tip D-arabitol dehidrojenaz bilinir: D-ksiluloz-olusturan (EC 1.1.1.11) (D- arabinitol:NAD+ 4-0ksid0redüktaz) ve D-ribuloz-olusturan (EC 1.1.1.250). Aksi belirtilmedikçe, burada ifade edilen D-ksiluloz-olusturan arabitol dehidrojenazdlTl ve burada arabitol dehidrojenaz olarak refere edilir. D-ribuloz-olusturan dehidrojenazlar dogal sus mayalarda ve mantarlarda bulunur. D-ksiluloz-olusturan arabitol dehidrojenaz basima bakterilerde bilinir. Örnegin, bunlar Enterobacteriaceae, özellikle E. coli, Klebsiella aerogenes ve Aerobacter aerogenes susu PRL-R3, Gluconobacter oxydans ve ek olarak ayrica Pichia stipi'tis içinde tan Inlanm :sti Özellikle, KIebs/el/a pneumoniae (# 052720), Ralstonia solanacearum (# P58708), Yersinia pestis (# P58709), Aerobacter aerogenes (#LBBEFO), E. 001/ (# K3EX35, I2ZSJ5, W1BYD6, W1H8N7, E7U4R7) gibi, birkaç enzim UniprotKB veri tabaninda refere edilir. Mevcut bulusun amaçlarina yönelik, Escheri'chia coli, NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz (D-ksiluloz-olusturma) geninin tercih edilen kaynaglîilr. Daha spesifik olarak, bunun amino asit dizisi SEQ ID No 2 içinde açklanm. Özellikle, SEQ ID No'lar 1 ve 3 Escheri'chia co/i'nin NAD*-spesifik D-arabitol 4-0ksxid0redüktazDkodlayan nükleik asitleri asklar. Kodlama dizisi, bunun kodon özgüllügü göz önüne alnarak Pichia ohmeri'ye yönelik optimize edilmistir. Ayrma Ralstonia solanacearum aynü zamanda NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz (D- ksilüloz-olusturan) genin tercih edilen bir kaynagElI. Daha spesifik olarak bunun amino asit dizisi, SEQ ID No 43"te açklanm. Özellikle SEQ ID No 42, Ra/stoni'a solanacearum'un zamanda NAN-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazimi aç klar. Kodlayan dizi, bunun kodon spesifikligi göz önünde bulundurularak Pichia ohmeri"ye yönelik optimize edilmistir. Ikinci enzim D-ksilulozu ksilitole dönüstürür. Çogu maya ve mantarîi endojen bir ksilitol dehidrojenaz (EC 1.1.1.9) genine sahip olmasîia ragmen, bunlarli NADH'den NADPH'ye kofaktör özgüllügündeki degisim mevcut bulusun uygulanmasna yönelik gereklidir. AslIida, mevcut bulus bir kilit noktasi,l bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kullanmaktin. Ek olarak, bu enzim tercihen konakta asmUfade edilir. Birçok ksilitol dehidrojenaz bilinir ve birkaç bilimsel makale kofaktör özgüllügünün NADHiden NADPH'ye nasm degistirilecegini açiRIar. Watanabe et al (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10340-10345) modifiye edilmis bir kofaktör özgüllügü ile Pichia stipi'tis'in mutasyona ugramß ksilitol dehidrojenazü özellikle üçlü mutant (D207A/l208R/F2098) ve dörtlü mutantü(D207A/I208R/F2098/N211R) açERIar. Dörtlü mutantli amino asit dizisi SEQ ID No 5'te açtRlanI. Bir NADPH kofaktör özgüllügüne sahip Gluconobacter oxydans'li (D38S/M39R) ksilitol dehidrojenazîili bir ikili mutantü Ehrensberger et al (2006, Structure, 14, 567-575) içinde açklanm Ikili mutantn amino asit dizisi SEQ ID No 8'de açIdanI. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan Pichia stipiti's XYL2 nükleik asit dizisinin mutasyonu ve klonlanmas bulusçular tarafindan haz rlanmlstin. Özellikle, SEQ ID No'lar 4 ve 6 Pichia stipiti's'in spesifik NADPH ksilitol dehidrojenaz nl lkodlayan nükleik asitleri açlklar. Alternatif olarak, bulusçular ayrma NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz: kodlayan GIuconobacter oxydans nükleik asit dizisinin mutasyonu ve klonlamasîiiü gerçeklestirmistir. Özellikle, SEQ ID No'lar 7 ve 9 Gluconobacter oxydans'îi NADPH'ye spesifik ksilitol dehidrojenazînükodlayan nükleik asitleri açEKIar. Kodlama dizisi, bunun kodon özgüllügü göz önüne alliarak Pichia ohmeri'ye yönelik optimize edilmistir. Ifade kaseti, vektör ve rekombinant konak hücre Belirli bir açlda, mevcut açiklama SEQ ID No 1, 3, 7, 9 ve 42'den olusan gruptan seçilen Pichia ohmerilye yönelik optimize edilen bir kodlama dizisini içeren bir nükleik asit ile ilgilidir. Ayrlîta bu, SEQ ID No 1, 3, 7, 9 ve 42"den olusan gruptan seçilen Pichia ohmeri'ye yönelik optimize edilen bir kodlama dizisini içeren bir nükleik asidi içeren bir ifade kaseti ile ilgilidir. Bu ayr Ca SEQ ID No 4'ün nükleik asit yapis ve söz konusu nükleik asit yapisini içeren bir nükleik asit ile ilgilidir. Ek olarak, bir rekombinant vektör, özellikle söz konusu nükleik asit veya ifade kasetini içeren bir ifade vektörü ile ilgilidir. Genel olarak, bir ifade kaseti bir proteine gen transkripsiyonu ve translasyonuna yönelik gerekli tüm elemanlari-içerir. Özellikle bu, bir promotör, istege baglüolarak bir arttmîzü bir transkripsiyon sonland BEn/e translasyona yönelik elemanlarü içerir. Daha özellikle, NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmi ifadesini kontrol etmek üzere kullanman promotör kuvvetli bir ifadeyi yönlendirmek üzere seçilir. AsIIida, bu enzim tercihen konak hücrede asî: ifade edilir. Bu tür promotörler teknikte iyi bilinir. Örnegin, promotör P. ohmeri' ribuloz redüktaz promotörü (poRR) veya P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGKt) olabilir. Bu, bir rekombinant vektör, özellikle bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz kodlayan bir nükleik asit ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü ile ilgilidir. Bu ayrica, bir rekombinant vektör, özellikle bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü ve bir rekombinant vektör, özellikle NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan bir nükleik asit içeren bir ifade vektörü içeren bir kit ile ilgilidir. Tercihen, söz konusu NADl-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz yukarla açmlanan enzimler araslidan seçilir. Özellikle, söz konusu NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz, SEQ ID No 2 veya 42'nin bir amino asit dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Özellikle, söz konusu NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, SEQ ID No 5 veya 8'in bir amino asit dizisini veya amino asitlerin 1-3 eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu ile bir dizi içerir veya bundan olusur. Tercih edilen bir vektör bir plazmiddir. Uygun plazmidler teknikte uzman kisiler taraf ndan iyi bilinir ve örnegin Örneklerde spesifik olarak açiklananlar aras ndan seçilebilir. Bulusun genetigi degistirilmis konagEilk olarak uygun promotörlerin kontrolü altinda NAD*-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaza yönelik kodlama yapan genlerin bir rekombinant vektöre klonlanmasüaraomggla üretilir ve transformasyon arac llg yla D-arabitol üreten organizmanin konak hücrelerine yerlestirilir. Mevcut tarifname bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz (EC 1.1.1.11) kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi ve bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan heterolog bir nükleik asit dizisi içeren rekombinant veya genetigi degisen bir konak hücre ile ilgilidir. NAD*-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz, substrat olarak D- arabitol kullanI ve ürün olarak D-ksiluloz üretir. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz, substrat olarak D-ksiluloz kullanl ve ksilitol üretir. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz ve NADIspesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz kodlayan dizi epizomal olabilir veya konak hücrenin kromozomu ile birlestirilebilir. Asllida, genetik olarak stabil transformantlar tercihen bir vektör kullanan transformasyon sistemleri araCJJgýla olusturulur, böylece istenen bir DNA konak kromozomu ile birlestirilir. Bu tür birlesme hücre içinde yeniden meydana gelir veya kromozomlardaki DNA dizilerinin birlesmesini gelistiren DNA elemanlar ile, fonksiyonel olarak kendisini konak kromozomuna ekleyen bir vektör ile transformasyon arac llg yla desteklenebilir. Rekombinant veya genetigi degistirilmis konak hücre,tercihen konak hücre kromozomuna entegre edilmis, bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazü kodlayan bir dizinin birkaç kopyasî'iüve/veya NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazü kodlayan bir dizinin birkaç kopyasnüiçerebilir. Özellikle rekombinant veya genetigi degistirilmis konak hücre, bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz:kodlayan iki, üç veya dört diziyi ve/veya NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazükodlayan iki, üç veya dört diziyi içerebilir. Örnegin konak hücre, E. coli'den iki veya üç NAD+-spesifik D- arabitol 4-0ksid0redüktazüve/veya R. solanacearunfdan bir veya iki NAD+-spesifik D- arabitol 4-oksidoredüktaz+ daha spesifik olarak E. coli'den iki veya üç NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ve/veya R. solanacearum'dan bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazli içerebilir. NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazlar, aynil organixmadan veya farkl organizmalardan olabilir. NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlari,l ayn Iorganixmadan veya farkl organizmalardan olabilir. Örnegin konak hücre, P. stipitis'ten bir, iki veya üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazü ve/veya G. oxydans'tan bir, iki veya üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazü daha spesifik olarak P. stipi'tis'ten bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazüve/veya G. oxydans'tan bir, üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazjçerebilir. Tarifnamenin belirli bir açîslida rekombinant veya genetigi degistirilen konak hücre, asagidakileri içeren bir Pichia ohmeri susudur: ' iki NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz ve iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya ° E. coli'den iki NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz ve biri P. stipitis'ten ve digeri G. oxydans'tan olmak üzere iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya . iki NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz ve üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya - E. coliyden iki NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ve biri P. stipitis'ten ve ikisi G. oxydansitan olmak üzere üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya - üç NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ve üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya - ikisi E. coli'den ve biri R. solanacearumldan olmak üzere üç NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz ve biri P. stipitis'ten ve ikisi G. oxydans'tan olmak üzere üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya ° dört NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ve dört NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz; veya - üçü E. coli'den ve biri R. solanacearum'dan olmak üzere dört NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz ve biri P. stipi'tisiten ve üçü G. oxydans'tan olmak üzere dört NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz. Konak hücre yukarIa detaylandlmain mikroorganizmalar arasîidan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, konak hücre Pichia ohmeri'dir. Baslangßc konak hücresi tercihen 1-4605 sayisEaltJ-:ida CNCM'de tevdi edilen mutant Pichia ohmerfdir. Bulusun belirli bir açis nda konak hücre, CNCM'de tevdi edilen suslar I-4982, I-4960 ve I-4981"den seçilen bir sustur. Mevcut bulus ksilitol üretilmesine yönelik bir kültür ortam nda rekombinant veya genetigi degisen konak hücrenin kültürlenmesi ve üretilen ksilitolün yeniden kazanmnasîiüiçeren bir yöntem ile ilgilidir. Tercihen, kültür ortamü uygun karbon kaynagüile mikroorganizmayüsaglar. Karbon kaynagütercihen D-glikoz ve çesitli D- glikoz içeren suruplarîve D-glikozun diger sekerler ile karîsmnlarîiüiçerir. Yöntem ayrCa ksilitolün bir saflast rma ad mini` içerebilir. Mevcut bulus, ksilitol üretmeye yönelik burada açlklandlgl lüzere rekombinant veya genetigi degistirilmis bir konak hücrenin kullanim ile ilgilidir. Bu tür genetigi degistirilmis suslar aracTFgýIa üretilen ksilitol, teknikte bilinen herhangi bir teknige göre bulusun konaklarliîi ortam Itidan saflastlmabilir. Örnegin US ,081,026, ksilitolün maya kültürlerinden kromatografik ayrImasIiDaçtElar. Böylece, fermantasyon adInIidan, ksilitol US 5,081,026 içinde açtKlandEgîüzere kromatografik admnlar, akabinde kristalizasyon kullan Iarak kültür ortamî'idan saflastlmabilir. Bulusun diger karakteristik özellikleri ve avantajlarüasagmlaki Örneklerin okunmasü üzerine belirgin olacaktLn. Ancak bunlar, burada yaln'zca bir açklama olarak saglanLn ve sini rlandln cl degildir. Sekiller ve diziler Sekil 1: 12 ABYWMP: Yaninda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarFrliTh bulundugu E. coli'den sentezlenen NAV-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazm restriksiyon haritasi] Sekil 2a: lig7.78: Pichia stipiti's'ten NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazm restriksiyon haritasD Sekil 2b: 12AALQTP: Yan Iida Hindlll ve Sacll restriksiyon alanlarMIi bulundugu Pichi'a stipi'ti's'ten sentezlenen NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz. Sekil 3: 13AAYSYP: Yanîida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarmiîi bulundugu G/uconobacter oxydans'tan sentezlenen NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaan restriksiyon haritasi .i Sekil 4: Yaninda örtüsme PCR'sini kullanan bir poRR promotörü ve sonlandlnlmsi Ibulunan bir açik okuma çerçevesinden olusan bir ifade kasetinin olusumu. Sekil 5: 12 AAMCJP: YanIida Hindlll ve Sacll restriksiyon alanlarliît bulundugu Pseudomonas cichori'i'den sentezlenen tagatoz-3-epimerazmi restriksiyon haritasD Sekil 6: poLEU2 ve poURA3 seçim markörleri ile P. ohmeri mekik vektörlerinin olusumu. Sekil 7: pEVE2523: Yanmda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonland r cisini n bulundugu Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-3- epimerazlmlni açik okuma çerçevesini içeren klonlanmls bir ifade kaseti ile, P, ohmeri poURA3 ifade vektörü pEVE25239ün restriksiyon haritaslî Sekil 8: pEVE2560: Yanmda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonland IEßIiIt bulundugu Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-3- epimerazmili açik okuma çerçevesini içeren klonlanmß bir ifade kaseti ile, P. ohmeri' poLEU2 ifade vektörü pEVE2560'mi restriksiyon haritasü Sekil 9: Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaziîi asîü ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu. Sekil 10: pEVE3284: YanIida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandlçsmin bulundugu Gluconobacter oxydans`n NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz'nl i içeren klonlanm s bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE3284 ifade vektörünün restriksiyon haritasl.i Sekil 11: Pichia stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlni as r. ifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörlerinin olusumu. Sekil 12: pEVE2562/pEVE2564: Smaswla, bir poURA3 veya poLEU2 seçim markörü ile yanlida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandmmßlim bulundugu Pichia stipi'ti's'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiü içeren klonlanmS bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE2562/pEVE2564 ifade vektörlerinin restriksiyon haritasi Sekil 13: Pichia stipitis NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazli asî: ifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörünün olusumu. Sekil 14: pEVE2563: Yan Itda bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandLnÇLSLnLm bulundugu Pichia stipitisin NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaz nl Içeren klonlanmls bir Ifade kaseti ile, P. ohmer/ pEVE2563 ifade vektörünün restriksiyon haritasi.l Sekil 15: Bir poURA3 seçim markörü kullan Iarak P. ohmeri ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandinlaini n kontrolü altinda E. coli NAV-spesifik D- arabitol 4-oksid0redüktazli asü ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu. Sekil 16: pEVE2839: Yan Iida bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandlmsmn bulundugu E. Coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmüiçeren klonlanmß bir ifade kaseti ile. P. ohmeri' pEVE2839 ifade vektörünün restriksiyon haritasi.i Sekil 17: Bir poURA3 seçim markörü kullanuarak P. ohmeri' fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland r clSl !kontrolü altinda E. coli' NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazlni aslnl !ifadesine yönelik bir P, ohmeri vektörünün olusumu. Sekil 18: pEVE3102: Yanmida bir P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve ribuloz redüktaz (poRR) sonlandllîslim bulundugu E. coli'nin NAD*-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz :içeren klonlanmîs bir ifade kaseti ile. P. ohmeri pEVE3102 ifade vektörünün restriksiyon haritas: Sekil 19: pEVE3123: Yanlida bir P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve bir transketolaz (poTKL) sonlandîîzßüve bir poURA3 seçim markörünün bulundugu E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaznü içeren klonlanms bir ifade kaseti ile, P. ohmeri' pEVE3123 ifade vektörünün restriksiyon haritasi .i Sekil 20: Bir poLEU2 seçim markörü kullanilarak P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland r cisi ikontrolü altinida E. 0011' NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazlni aslni !ifadesine yönelik bir P. ohmeri' vektörünün olusumu. Sekil 21: pEVE3157: Yanlida bir P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve bir transketolaz (poTKL) sonlandlmü ve bir poLEU2 seçim markörünün bulundugu E. coli'nin NAN-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaziiü içeren klonlanm3 bir ifade kaseti ile, P. ohmeri pEVE3157 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 22: Bir poLEU2 seçim markörü ile bir P. ohmeri onP vektörünün olusumu Sekil 23: pEVE2787: Yanlida iki onP alanlarübulunan, endojen promotör ve sonlandLiJLGLniIi kontrolü altinda klonlanlanmLs bir P. ohmeri LEU2 seçim markörü ile P. ohmeri pEVE2787 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritasi.! Sekil 24: 12ABTV4P: Yaninda Ascl ve Sphl restriksyon alanlar nlni bulundugu Streptomyces noursei'den sentezlenen nat1 geninin restriksiyon haritas .i Sekil 25: pEVE2798: Bir ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve bir 0rotidin-5'- fosfat dekarboksilaz (poURAS) sonlandIlItIJIi kontrolü aItIida klonlanmß bir nat1 markörü ile ile P. ohmeri pEVE2798 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 26: Bir nat1 seçim markörü ile bir P. ohmeri onP vektörünün olusumu. Sekil 27: pEVE2852: Yanlida iki onP alanD bulunan, bir ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve bir orotidin-5'-fosfat dekarboksilaz (poURA3) sonlandLnLaniIi kontrolü aItLmda klonlanms bir nat1 markörü ile ile P. ohmeri pEVE2852 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritasi.! Sekil 28: pEVE2855: Yan nda iki onP alani [bulunan LEU2 açik okuma çerçevesi ve bir nat1 markörünün yukarHyönIü 5' bölgesi ile homolog olan kIonIaans bir fragman ile P. ohmeri' pEVE2855 entegrasyon vektrörünün restriksiyon haritasü Sekil 29: LEU2 açtk okuma çerçevesinin delesyonuna yönelik bir P. ohmeri onP vektörünün olusumu. Sekil 30: pEVE2864: LEU2 açik okuma çerçevesinin yukarDyönlü 5` bölgesi ile homolog olan klonmß bir fragman ve LEU2 açk okuma çerçevesinin asagü yönlü 3' bölgesi ile homolog olan fragman ve yannda iki onP alanDbulunan bir nat1 seçim markörü ile P. ohmeri' pEVE2864 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritasi .i Sekil 31: P. stipi'ti's'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz n] [ve E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazlnii [içeren bir çift ifade plazmidin olusumu. Sekil 32: pEVE3318: P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaznrive E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazlili çift ifade olusumunu içeren P. ohmeri' pEVE3318 ifade vektörünün restriksiyon haritsD Sekil 33: pEVE2862: Yari Iida bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve bir orotidin-5'-fosfat dekarboksilaz (poURA3) sonlandIEZbulunan P. ohmeri LEU2 markörünü içeren P. ohmeri pEVE2862 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 34: P. ohmeri içinde Eco/i NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz geninin ve P. stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin genomik ifadesine yönelik bir bütünleyici vektörün olusumu. Sekil 35: pEVE2865: Yaninda iki onP alanlibulunan P. ohmeri LEU2 markörünü içeren P. ohmeri pEVE2865 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritasi.l Sekil 36: pEVE3387: Yan IJda iki onP alanübulunan bir P. ohmeri LEU2 seçim markörü ile P. stipiti's'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazî1li çift ifade yapßiîlüiçeren P. ohmerr' pEVE3387 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritas: Sekil 37: G. oxydans'li NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiüve E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazini içeren çift/üçlü ifade plazmidlerinin olusumu. Sekil 38: pEVE3322IpEVE3324: G. oxydans`ini NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazni Ne E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz nin çift ifade yaplîfîm veya G. oxydans'îi iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. coli'nin bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazî1m üçlü ifade yapIsIJiD içeren P. ohmeri pEVE3322/pEVE3324 ifade vektörlerinin restriksiyon haritasD Sekil 39: P. ohmeri içinde E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz geni ve G. oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin genomik ifadesine yönelik bir bütünleyici vektörün olusumu. Sekil 40: pEVE3390/pEVE3392: Yan Iida iki onP alanübulunan bir P. ohmeri' LEU2 seçim markörü ile G. oxydans'Lni NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazuve E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktaz nin çift ifade yapismi veya G. oxydans' n iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. coliinin bir NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaziniini üçlü ifade yaps nl Iiçeren P. ohmeri' pEVE3390/pEVE3392 entegrasyon vektörülerinin restriksiyon haritasH Sekil 41: P. ohmeri içinde E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz geni ve G. oxydans NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin genomik ifadesine yönelik bir bütünleyici vektörün olusumu. Sekil 42: pEVE4390: Yanîida iki onP alanElbulunan bir P. ohmeri LEU2 seçim markörü ile E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazD ve G. oxydans'n NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin çift ifade yapisliü içeren P. ohmeri pEVE4390 ifade vektrörünün restriksiyon haritasü Sekil 43: 13ABZEGF: Yanîiida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarîbulunan R. solanacearumdan sentezlenen NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaan restriksiyon haritasi .i Sekil 44: P. ohmeri' içinde R. solanacearum NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz genini ve G. oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin genomik ifadesine yönelik bir bütünleyici vektörün olusumu. Sekil 45: pEVE3898: Yan Ilda bir P. ohmer/ ribuloz redüktaz (poRR) promotörü ve sonlandîîzîbulunan Ralstonia solanacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmüiçeren klonlanmîs bir ifade kaseti ile P. ohmeri pEVE3898 ifade vektörünün restriksiyon haritasü Sekil 46: pEVE4077: G. oxydans'li NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlili ve R. so/anacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaziriiim çift ifade yapLsJIe P. ohmeri pEVE4077 ifade vektörünün restriksiyon haritasLJ Sekil 47: pEVE4377: G. oxydans'iiii NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaziniini ve R. solanacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazirii n bir çift ifade yapßîve yanmda iki onP alan-bulunan poLEU2 seçim markörü ile P. ohmeri pEVE4377 entegrasyon vektörünün restriksiyon haritasi? DIZI LISTESI SEQ ID No AçiKlama 1 Yanlida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarîili bulundugu E. coli'den NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazi2kodlayan dizi 2 E. coli*den NAD*-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktazîi amino asit dizisi 3 E. coli"den NAD*-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz:kodlayan dizi 4 Yannda Hindlll ve Sacll restriksiyon alanlarlim bulundugu Pichia stipiti's'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazwodlayan dizi P. stipi'tis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazini amino asit dizisi 6 Pichi'a stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazi kodlayan dizi 7 Yaninda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarini n bulundugu G/uconobacter oxydans"tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazi kodlayan dizi 8 Gluconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi amino asit dizisi 9 G/uconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenain kodlayan dizi Pseudomonas cichori'i ST24'ün tagatoz-3-epimerazîi[kodlayan dizi 11 Pseudomonas cichorii ST24'ün tagatoz-ß-epimerazîili amino asit dizisi 28 Yanlida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarü bulunan Streptomyces noursei'nin nat1 genini kodlayan dizi 42 YanLnida Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarLibulunan R. solanacearum'dan SEO ID No AçERlama NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazEkodlayan dizi 43 R. so/anacearum'dan NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazli amino asit dizisi ÖRNEKLER Örnek 1. Genetik mghendisligine yönelik tercih egilen konak olarak bir Pichig ohmeri susunun seçimi Konak susu seçimi olarak, Pichia ohmeri: - yüksek ozmotik basinç ortami] örnegin %10-60 D-glikoz ve tercihen %25 D-glikoz içeren ortam altîida glikozdan kaydadeger miktarlardaki arabitolün bir üreticisidir ("Normal" ortam genellikle %2-3 glikoz içerir.) - gerekli kofaktörlerin olusumunu saglayan bir redoks dengesine sahiptir. Performanslarnmi bir açlilamasüolarak, asaglaki tablo Pichia ohmeri'nin arabitolün metabolik yoluna dahil olan enzim aktivitelerini gösterir (Sophie HUCHETTE Thesis, 1992) Heksoz Monofosfat Yolu:GIikoz-6-P ila D-Ribuloz-5-P ve D-Ksiluloz-5-P PPP'nin, ayriîza Heksoz Monofosfat Yolu (HMP) olarak adlandean oksidatif parçasi? bir NADPH üreten yoldur. Glikoz-6-P dehidrojenaz (E.C.1.1.1.49) ve 6-P-Glukonat dehidrojenaz (E.C.1.1.1.44) olan iki NADP+-bagl_rinlîlenzim, 1 mol D-ribuloz-5-P içinde 1 mol glikoz-ö-Pinin oksidasyonuna katjm ve 2 mol NADPH olusturur. Tablo 1 P. ohmeri ATCC 20209'da Heksoz Monofosfat Yolu Enzim/er Spesifik aktivite U/mg NADP+ G6P dehidrojenaz 1.5 NADP+ 6PG dehidrojenaz 0.55 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstraktmi m1_ 'si basma dakika basDa 1 umo/ NAD(P)H veya NAD(P)+'nI7li tüketimi olarak tanleaanStm. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basima bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanm str. Asagldaki enzimlerin kinetik parametreleri belirlenmistir: D-ribuloz-5-P 3-epimeraz (E.C .1.3.1), D-riboz-5-P keto-izomeraz (E.C.5.3.1.6), transketolaz (E.C.2.2.1.1) ve asidik fosfatazlar (EC. 3.1.3.2). Tablo 2 P. ohmeri ATCC 20209'da substrat olarak D-Ribuloz-S-P kullanan enzimlerin kinetik parametreleri Enzim/er KM mM VM U/mg D-Ribuloz-5-P 3-epimeraz 6.3 3 D-Riboz-5-P keto-izomeraz 0.35 1.8 Asit fosfataz 4.3 0.65 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstraktm› m1_ *si basma dakika basîia 1 pmo/ NAD(P)H veya NAD(P)+,niIt tüketimi olarak tanlIn/anmßtm Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basma bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanmstr. Tablo 3 P. ohmeri ATCC 20209'da substrat olarak D-Ksiluloz-5-P kullanan enzimlerin kinetik parametreleri Enzim/er KM mM VM U/mg D-Ribuloz-5-P 3-epimeraz 6.6 0.7 Transketolaz (D-riboz-S-P) 0.2 0.9 Transketolaz (Eritr02-4-P) 0.6 1.45 Asit fosfataz 16 0.11 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstratini mL'si basima dakika bas na 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+"nIi tüketimi olarak belirlenmistir. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basma bir birim enzim aktivitesi olarak tan înlanmgstî. In vivo olarak, D-ribuloz-5-Plnin epimerizasyonundan sentezlenen D-ksilul02-5-P transketolizasyon vasIaslSiIa PPPlnin oksidatif olmayan parçasEila etkili bir sekilde girer. Sonuç olarak, D-ksiluloz-S-P, D-ksiluloza defosforilasyonuna yönelik mevcut degildir. NADH ve NADPH spesifik D-Ketopentoz-oksidoredüktaziar D-Ribuloz ve D-Ksiluloz, D-Ribuloz-5-P ve D-Ksiluloz-5-P"nin defosforilizasyonu aracillgiyla üretilir. MichaeIIs-Menten sabitleri, her bir substrata ve karsiiik gelen maksimum hîlara yönelik NADH ve NADPH-D-ketopentoz-oksidoredüktazlarTi afinitelerine dikkat çeker. Tablo 4 P. ohmeri ATCC 20209"un NADH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz'nin kinetik parametreleri Substrat KM mM VM U/mg D-Ribuloz 90 1 Ribitol 16 0.16 D-Ksiluloz 5 0.6 Ksilitol 7 0.2 Bir birim veya enzim aktivitesi, ham ekstratim mLjsi baslma dakika basina 1 pmol NAD(P)H veya NAD(P)+'nlTl tüketimi olarak beiirlenmistir. Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si basima bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanm st r. Slasyla D-ribuloz ve D-ksilulozdan ribitol ve ksilitol olusturan NADH-spesifik D- ketopentoz-oksidoredüktaz, D-ksiluloza yönelik D-ribulozdan daha yüksek afinite gösterir. Ters reaksiyon, bu iki poliol üzerindeki konak susun iyi büyümesini açiklayarak ksilitol ve ribitole yönelik iyi bir afinite gösterir. Tablo 5 P. ohmeri ATCC 20209"un NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz nlni kinetik parametreleri Substrat KM mM VM U/mg D-Ribuloz 72 3.4 D-Arabitol 1300 0.8 D-Ksiluloz 262 1.5 Ksilitol 200 0.15 Bir birim enzim aktivitesi, ham ekstraktm mL'si' basma dakika basra 1 pmo/ NAD(P)H veya NAD(P)+'nIn tüketimi olarak tanlmlanmlstiit Bir birim spesifik aktivite, ham ekstraktaki proteinlerin mg'si baslma bir birim enzim aktivitesi olarak tan mlanm str. D-ribulozdan D-arabitol ve D-ksilulozdan ksilitol olusturan NADPH-spesifik D- ketopentoz-oksidoredüktaz, D-ribuloza yönelik D-ksilulozdan daha yüksek bir afinite gösterir. Ters reaksiyon, bu poliol üzerinde konak susun büyümemesini açklayarak D- arabitole yönelik oldukça düsük bir afinite gösterir. Konak sustan iki ketopentoz-oksidoredüktaz, Ingram and Wood, 1965 (Journal of Bacteriology, vol.89, n°5, 1186-1194) tarafîidan Saccharomyces rouxii'de açmlanan önceki enzimlerden farkl: olarak karakterize edilmistir. Aslîida, Saccharomyces rouxii'de, D-ribuloz ve NADH'de herhangi bir ileri reaksiyon saptanmamßtl ve NADPH ile D-arabitolde bir geri reaksiyon saptanmîstî. Haldane iliskisi in vivo enzim kinetik davran slarini öngörür. Tablo 6 Haldane sabitlerinin belirlenmesi: NADH-spesifikD-Ketopentoz- oksidoredüktaz SubstratIÜrÜn Keq mM1 D-Ribuloz/Ribitol 78 D-Ksiluloz/Ksilitol 104 Haldane sabitlerinin belirlenmesi: NADPH-spesifikD-Ketopentoz- oksidoredüktaz SubstratIÜrün Keq mM1 D-RibuloziD-Arabitol 104 D-Ksiluloz/Ksilitol 24 Iki enzim geri reaksiyon (pentitol indirgemesi) yerine ileri reaksiyonu (D-ketopentoz oksidasyonu) tercih eder. Konak sustaki PPP oldukça etkilidir ve 2 mol NADPH tüketilen 1 mol glikozdan olusturulur. Sonuç olarak, NADPH anabolik reaksiyonlar ve sürdürme reaksiyonlarmîi her ikisine yönelik fazla miktarda mevcut olacakti. Konak sus, NADPH/NADP+ redoks çiftini dengelemek üzere D-ribulozdan D-arabitol veya D-ksilulozdan ksilitol üretmek zorundadin. NADPH-spesifik D-ketopentoz-oksidoredüktaz üzerinde NADP+ inhibitör etkisi in vitro olarak belirlenmistir. NADPhnlni fazla eklenmesi durumunda aktivite %80 daha azdln. Bu konsantrasyonun intraselüler NADP+ konsantrasyonu ile uyumlu olmamasFlhalinde dahi, bu sonuç NADPH-spesifik D-ketopentoz oksidoredüktazFrii NADPH/NADP+ redoks çiftinin dengesindeki rolünün genel bir degerlendirmesini verir. D-ksiluloz-S-P'nin PPP'nin oksidatif olmayan parçasî'ia girmesinden dolay: D- ksilulozun mevcut olmamasü nedeniyle konak sus yalnizca D-ribulozdan D-arabitol üretir. D-arabitol üretimi ile NADPH/NADP+ redoks dengesi arasLnida baglantu GIikoz-ö-P dehidrojenazn as rli ifadesinin D-arabitol üretimine etkisinin degerlendirilmesi aracillgiyla konak hücrede gösterilmistir. Böylece, elde edilen sus konak sus ile karsllast r Id ginida 1.5 kat daha yüksek bir G6PDH aktivitesine sahiptir ve %10 daha fazla D-arabitol üretir (FR 2772788). Örnek 2. Pichig ohmeri kogon kullanWnl'l P. ohmeri 'nin kodon kullanInDmevcut DNA ve bes P. ohmeri geninin karstm's gelen amino asit dizisinden belirlenmistir: transketolaz, glikoz-G-fosfat dehidrojenaz (FR 2772788), ribuloz redüktaz, beta-izopropilmalat dehidrojenaz - LEU2 (Piredda and Gaillardin, Yeast, v0l.10:1601-1612 (1994) ve 0rotidin-5'-fosfat dekarboksilaz - URAS (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarmla). Ayri iher bir gen, tek bir amino asit kodlayan nükleotid üçlülerine ayrllmistin. Bes gen toplam 2091 kodondan olusmustur. Her bir amino aside yönelik, bes gende mevcut her bir kodon say si isayilmistin, 2091 ile bölünmüstür ve 1000 ile çarpüInStI. Bu sekilde, 1000 kodondaki spesifik bir kodon stkltgîhesaplanmßtm. P. ohmeri'nin ön kodon kullanînETl'ablo 7'de belirtilir. P. stipitisiten ksilitol dehidrojenaz haricindeki, P. ohmeri'de ifade edilen tüm heterolog genler bu tablo ve http://qenomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer program kullanilarak kodon ile optimize edilmistir. Elde edilen dizi, enzim kodlayan dizinin ilgili 5' ve 3' uçlarTidaki restriksiyon enzimlerine yönelik tanWna alanlarmimi manuel eklenmesi akabinde gen sentezine yönelik gönderilmistir. Tablo 7. 5 kodlama dizisinden (CDS) derive edilen P. ohmeri*nin kodon kullanmnü tablosu Pichia ohmeri [gbpln]: 5 CDS (2091 kodon) alanlar: [üçlü] [SERIK: binde] ([sayEJJ) TTT 10.5( 22) TCT 30.6( 64) TAT 7.7( 16) TGT 5.7( 12) TTC 30.1( 63) TCC 23.4( 49) TAC 27.3( 57) TGC 1.4( 3) TTA 5.3( 11) TCA 4.8( 10) TAA 1.4( 3) TGA 0.0( 0) TTG 64.1( 134) TCG 9.6( 20) TAG 1.0( 2) TGG 12.9( 27) CTT 10.5( 22) CCT 12.0( 25) CAT 3.3( 7) CGT 5.7( 12) CTC 12.0( 25) CCC 0.0( 0) CAC 15.8( 33) CGC 1.0( 2) GTA 0.0( 0) CCA 34.0( 71) CAA 12.4( 26) CGA 0.0( 0) CTG 2.9( 6) CCC 0.5( 1) CAG 17.7( 37) CGG 0.5( 1) ATT 27.7( 58) ACT 22.0( 46) AAT 7.7( 16) AGT 1.9( 4) ATC 30.6( 64) ACC 24.4( 51) AAC 29.2( 61) AGC 2.4( 5) ATA 2.4( 5) ACA 3.3( 7) AAA 11.0( 23) AGA 26.3( 55) ATG 14.3( 30) ACG 1.4( 3) AAG 64.1( 134) AGG 0.0( 0) GTT 27.3 57 GCT 46.9 98) GAT 23.0( 48) GGT 60.7( 127) ( ) ( GTC 19.1( 40) GCC 27.7( 58) GAC 35.9( 75) GGC 10.5( 22) GTA 1.9( ) GCA 11.0( 23) GAA 18.7( 39) GGA 12.0( 25) GTG 21.5( ) GCG 3.3( 7) GAG 46.9( 98) GGG 1.0( 2) Örnek 3. E. coli bakteriyel NAN-spesifik D-arabitol 4-oksidoredükctaz (g ksiluloz-olustgrma) geninin klonlanmaiü E. Gol/'den NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz aItD kodlayan bir DNA fragmani, SEQ ID NO: 1'in verilen dizisinin verilen dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya). aItD genine yönelik kodlama yapan AF378082.1 dizisinin (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF378082 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 1441 ila 2808, sablon olarak kullantlrnßtî ve httpzllqenomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer program :kullanmarak örnek 2'nin Tablo 7'sine göre P. ohmeri ATCC 20209'da kullan Ina yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. Ortaya çÜKan dizinin 5' ve 3' uçlarmida, smaswla restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) ve Sphl"nin (GCATGC) tanmna alanlarlia yönelik kodlama yapan nükleotitler daha fazla klonlamay_kolaylastUJmak amaciyla eklenmistir. Ek olarak, bir adenozin üçlüsü mayalarlni Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATGinin önüne eklenmistir. Son dizi (SEO ID NO: 1) akabinde senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). E. coli'den NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz kodlayan sentezlenen DNA fragmanîbir pMK-RQ derive vektörde 5 pg Iiyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (12ABYWMP, Sekil 1). Daha fazla alt-klonlamaya yönelik, gen Ascl ve Sphl enzimleri ile restriksiyon kesimi aracmgiyla salnmstm (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Örnek 4. Pichia stipitis NADH ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlm mutajenezi ve klonlanmasLl Pichia stipitis NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin klonlanmasl l Ksilitol dehidrojenaz kodlayan maya (Pichia stipitis) geni XYL2'nin bilinen nükleotit dizisi (Kötter et al., Curr. Genet. 18:493-500 (1990)) FR 2 765 589 ilkesi izlenerek plazmidik vektör lig 7.78 içinde klonlanmßtl (bu patentin örnek 4 ve Sekil 7'sine bakiniz). Vektörün restriksiyon haritas Sekil 2a'da gösterilir. Pichia stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin mutajenezi ve klonlanmasi i Pichia stipi'ti's'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz XYL2 kodlayan bir DNA fragman: SEQ ID NO: 4)'ün dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya). XYL2 genine yönelik kodlama yapan dizi X55392.1'in (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucc0re/X55392.1 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 319 ila 1410 sablon olarak kullanImßtI. Watanabe et al. (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10340-10345) makalesine göre, ksilitol dehidrojanz ri kofaktör tercihi yayimlanan dört amino asit mutasyonunun yerlestirilmesi araciligiyla NADH'den NADPH'ye degistirilebilir: D207A/I208R/F2098/N211R (http://www.unipr0t.org/uniprot/P22144 sitesinden elde edilen P22144 protein dizisine baglîblarak numaraland Tma). Buna göre, D207, I208, F209 ve N211'e yönelik kodlama yapan kodonlarli smasgila, karsilik gelen dizide GCT, AGA, TCA ve AGA ile manuel olarak yeri degistirilmistir. Ek olarak, restriksiyon enzimleri Hindlll (AAGCTT) ve Sacll'nin (CCGCGG) tanmna alanlarlia yönelik kodlama yapan nükleotitler, daha fazla klonlamayükolaylastlmak amacßila ilgili 5' ve 3' uçlarda manuel olarak dahil edilmistir. Ayrica, bir adenozin üçlüsü mayalarin Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEO ID NO: 4) senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). P. stipitis'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan sentezlenmis DNA fragman: bir pMA-T derive vektörde 5 pg liyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (12AALQTP, Sekil 2b). Örnek 5. GIuconob_acter oxyigms NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaLz qeninin mutaienezi ve klonlanmasi'i Gluconobacter oxydanstan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz th kodlayan bir DNA fragman , SEQ ID NO: 7'nin verilen dizisine göre kimyasal olarak sentezlenmistir (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Almanya). th genine yönelik kodlama yapan ABOQ1690.1 dizisinin (http:l/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ABOQ1690.1 sitesinden elde edilmistir) nükleotitleri 1063 ila 1851 sablon olarak kullan Im :stî ve httpzl/genomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer programD kullanmarak Tablo Tye (Örnek 2) göre P. ohmeri ATCC 20209'da kullanmna yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. Ehrensberger et al. (Structure, 2006, 14, 567-575) yayiriia bagli iolarak enzimin kofaktör özgüllügü yayimlanan iki amino asit mutasyonunun yerlestirilmesi aracilig yla NADH'den NADPH'ye degistirilebilir: D38S/M39R (http://www.uniprot.orq/uniprot/QBGR61 sitesinden elde edilen QBGR61 protein dizisine baglFblarak numaralandmma). Bu nedenle D38 ve M39'a yönelik kodlama yapan kodonlarli slasgla, karsüm gelen dizide TCT ve AGA ile manuel olarak yeri degistirilmistir. Ek olarak, restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) ve Sphllnin (GCATGC) tanEna alanlarlia yönelik kodlama yapan nükleotitler, daha fazla kIonIamayEkolaylastImak amacßila ilgili 5' ve 3' uçlarda manuel olarak dahil edilmistir. Aeroa, bir adenozin üçlüsü mayalarLm Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEQ ID NO: 7) senteze yönelik verilmistir (GeneArt, Regensburg, Almanya). G/uconobacter oxydans'tan NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan sentezlenmis DNA fragmanübir pMA-T derive vektörde 5 ug liyofilize plazmid DNA olarak verilmistir (13AAYSYP, Sekil 3). Daha fazla alt klonlamaya yönelik, gen Ascl ve Sphl enzimleri ile restriksiyon kesimi aracEEgQla salmimßtî (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts). Örnek 6. poURA3 secim markörü kullan Tarak heteroloq qen ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Asagldaki unsurlar ile degistirilebilen bir vektörün klonlanmasizl - promotör, - açIg okuma çerçevesi ve - sonlandetEla-Iemanlar üç farklEfragmanIi ard SI( iki örtüsme PCR'si aracmgglla gerçeklestirilmistir (Sekil 4). Vektör orijinal olarak, rekombinant Pichia ohmeri' susunda tagatoz 3-epimeraz geninin klonlanmas _ve asIIJfadesini test etmek üzere bir ifade modeli olarak planlanmstm. Asaglda açlklanacagi lüzere, tagatoz 3-epimeraz geni, bu ayni iekleme alanlarin n kullanilmas araclllgiyla söz konusu herhangi bir genin klonlanmaslni saglayarak spesifik Ascl - Sphl restriksiyon alanlar kasetine klonlanmlstin. Klonlama asagIaki yöntem araCJJgSIla tasarlanmßtî. Birinci bir PCR'de (PCR1), yari mida Spel ve Ascl alanlarE(primer dizisinde aItElçizilidir) bulunan P. ohmeri*nin 490 bp uzunlugunda bir ribuloz redüktaz promotör fragmanD asagmlaki unsurlar kullan Iarak amplifiye edilmistir: - primer EV2960: GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG (SEO ID No 12) ve - primer EV2961: CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG (SEO ID No 13) Ek olarak, revers primer EV2961'in 5' ucunda, tagatoz-S-epimeraz geninin 5' ucunu temsil eden 13 nükleotit uzunlugunda bir fragman eklenmistir. Ascl alanIiIi 8 nükleotidi ve ribuloz redüktaz promotörünün 3' ucunun takip eden 10 nükleotidi ile birlikte bu fragmana, PCR1 fragmaninimi asagida açiklanan PCR2 fragman_ile kaynastmiimasna yönelik örtüsme olarak ihtiyaç duyulmustur. P. ohmeri ATCC 20209'un genomik DNA'si sablon olarak kullanilmistin. Bu amaca yönelik, yeni ekim yapilan P. ohmeri kolonisi 30 ul %0.2 SDS içinde yeniden süspanse edilmistir ve 4 dakika boyunca 95°C'de ßîilmigtî. Tam hümsantrifüjleme akabinde, 0.5 pl süpernatant PCR'ye yönelik kullanmnßtl. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/pl iProofTIVI polimeraz (BlO-RAD. Hercules. California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangu; denatürasyon admLJ akabinde 98°C'de 10 saniye / 50°C"de 20 saniye / 72°C'de 15 saniye ile 25 döngü ve 72°C"de 10 dakikalik bir nihai genlesme adimi iile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayrilmvst r, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazan m Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak saflastinilm str. Ikinci bir PCR'de (PCR2), yanlida Ascl ve Sphl alanlar:(primer dizisinde altüçizilidir) bulunan Pseudomonas cichor/i' ST24`ün tagatoz-3-epimerazliîli 911 bp uzunlugunda bir fragman :asag Baki unsurlar kullan [tarak amplifiye edilmistir: - primer EV2962: AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG (SEO ID No 14) ve - primer EV2963: TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG (SEQ ID No ). Primer EV2962'nin 5, ucu ribuloz redüktaz promotörünün 3' ucunu temsil eden 9 nükleotit uzunlugunda bir fragman içerir. Ascl alanîili 8 nükleotidi ve tagatoz-S-epimeraz açi: okuma çerçevesinin takip eden 12 nükleotidi ile birlikte bu fragman, PCR2 ürününün daha önce açmlanan PCR1 ürününe kaynast rmak üzere örtüsme PCR'sine yönelik kullanilin. Ek olarak, revers primer EV2963`ün 5` ucu P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandlnlolsmilni 5' ucunu temsil eden 12 nükleotit uzunlugunda bir fragman içerir. Sphl alanîtFrl 6 nükleotidi ve tagatoz-3-epimeraz açk okuma çerçevesinin 3' ucunun takip eden 12 nükleotidi ile birlikte bu fragmana, PCR2'nin asagîla açIglanan PCR3lün PCR fragman jle kaynastlmnasma yönelik örtüsme olarak ihtiyaç duyulur. Sablon olarak, sentezlenmis bir Pseudomonas cichorii' ST24'ün tagatoz-S-epimeraz geni kopyasîiüiçeren 25 ng vektör12AAMCJP (Sekil 5) (GeneArt, Regensburg, Almanya) kullanImStm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/A8000361 sitesinden A8000361.1,in nükleotit 719 ila 1591'i) - SEQ ID No: 11. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/pl iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karls mi içinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangg denatürasyon adînü akabinde 98°C'de 10 saniye / 48°C`de 20 saniye / 72°C'de 30 saniye ile 25 döngü ve 72°C'de 10 dakikalüi bir nihai genlesme adEnElle gerçeklestirilmistir. Üçüncü bir PCR'de (PCR3), yanîtda Sphl ve Sacll alanlarü(primer dizisinde altü çizilidir) bulunan P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandîbßlili 380 bp uzunlugunda bir fragman :asag Ilaki unsurlar kullan [Barak amplifiye edilmistir: - primer EV2964 AAGCTGGCCTGAGCATGCTCTCGAAGAGAATCTAG (SEO ID No 16) ve - primer EV2965 GTTCCGCGGAGAATGACACGGCCGAC (SEQ ID No 17) Primer EV2964'ün 5' ucu, Sphl alanîimi 6 nükleotidi ve P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandlmmm takip eden 12 nükleotidi ile birlikte PCRS'ün daha önce açmlanan PCR2'ye kaynastlmnasna yönelik kullanIan tagatoz-S-epimeraz açtk okuma çerçevesinin 3' ucunun 12 nükleotit uzunlugunda bir fragman'nl içerir. P. ohmeri ATCC 20209'un genomik DNA's sablon olarak kullanilmlst r. Tam hizli santrifüjleme akabinde, 0.5 pl süpernatant PCRide kullanIImIStln. Bu amaca yönelik, yeni ekim yapTan P. ohmeri kolonisi 30 pl %0.2 SDS içinde yeniden süspanse edilmistir ve 4 dakika boyunca 95°C'de ßîilmistf. Sablon, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 pM'si, her bir primerin 0.5 pM'si ve 0.02 U/pl iProofTM polimerazdan (BIO-RAD, Hercules, California) olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangg denatürasyon adînü akabinde 98°C'de 10 saniye / 50°C"de 20 saniye / 72°Cide 15 saniye ile 25 döngü ve 72°Cide 10 dakikalLk bir nihai genlesme adimi lile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayrllm st r, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazan m Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflast r Im stin. PCR ürün %1ylik bir agaroz jel üzerine ayrllmlstin, özütlenmistir ve ZymocleanT't'I Jel DNA Geri Kazanim Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California kullan Tarak saflastTTmßtT. Üç ayrüPCR fragmanîili kaynastlmhasüasaglîlaki sekilde gerçeklestirilmistir: PCR1 ve PCR2'nin jelle saflastIIan her bir ürününün 50 nglsi, EV2960 ve EV2963 ile bir PCR reaksiyonunda sablon olarak kullanlmßtl. YukarIa açklanan primer tasarEndan kaynaklanan, iki fragmandaki 30 nükleotit uzunlugunda bir homolog segment kaynastîma reaksiyonunda örtüsme olarak kullanümstr. Bu sekilde, yan nda Spel ve Ascl alanlari Ibulunan P. ohmeri'nin bir ribuloz redüktaz promotöründen olusan 1.4 kb uzunlugunda bir fragman, Pseudomonas cichorii ST24'ün tagatoz-3-epimerazin n açik okuma çerçevesine kaynastinilmistln. Sablonlar, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 uM'si, her bir primerin 0.5 uM'si ve 0.02 U/ul iProofTM polimerazdan (BIO-RAD, Hercules, California) olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslanglç denatürasyon ad mI,l akabinde 98°C'de 10 saniye / 62°Cide 20 saniye / 72°Cide 45 saniye ile 30 döngü ve 72°C"de 10 dakikalLk bir nihai genlesme adimi lile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayrilmst r, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazan m Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflastmllrn _st-r. SaflastIIan fragman ikinci bir örtüsme PCR'sinde PCR3 ürününe kaynastltlrnßtî. Her bir fragmanîi 40 ng'si sablon olarak kullanttmîst] ve EV2960 ve EV2965 ile amplifiye edilmistir. Yukarla açklanan primer tasarmidan kaynaklanan, iki fragmandaki 30 nükleotit uzunlugunda bir homolog segment kaynastlmada örtüsme olarak kullantlrnîstl. Bu sekilde, yan nda Spel ve Asal bulunan P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve yaninda Ascl ve Sphl alanlari ibulunan Pseudomonas cichorii ST24'ün tagatoz-ß- epimerazlnilni açik okuma çerçevesinden olusan 1.8 kb uzunlugunda bir fragman, P. ohmeri'nin ribuloz redüktaz sonlandinlc sirta kaynastlnilmistin. Sablonlar, uygun 1X tampon içinde her bir dNTP'nin 200 uM'si, her bir primerin 0.5 uMsi ve 0.02 U/ul iProofTM polimerazdan (BIO-RAD, Hercules, California) olusan bir reaksiyon karSInEiçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°Cde 30 saniyelik bir baslangm denatürasyon admnü akabinde 98°C'de 10 saniye / 65°Cide 20 saniye / 72°C'de 55 saniye ile 30 döngü ve 72°Cide 10 dakikalik bir nihai genlesme admnüile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayrilmsstr, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazanin Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflastlnilm st r. Yaninda bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonland rclSi l bulunan Pseudomonas cichori'i ST24iün tagatoz-3-epimerazmi n 1.7 kb uzunlugunda bir fragmanlrii olusan nihai PCR ürünü, restriksiyon enzimleri Spel ve Sacll (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 6) ile parçalanmStI, jelle saflastltlrnßtî ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullan [Barak bir Iig?.78 vektörü omurgasIiIi 9.8 kb uzunlugunda izole SpeI/Sacll fragman: ile bir gece boyunca 16°C'de baglanmistin. Ligasyon karisim ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir. Saflastmilmrs` plazmid DNA restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracittgßila daha fazla karakterizasyona yönelik kullanmniîstî. Yeni klonlanmß ifade plazmidi pEVE2523 (Sekil 7) replikasyonun bir bakteriyel (E. coli) kökeni ve bir ampisilin rezistans geni, maya (P. ohmeri) otonom replikasyon dizisi mayada seçime yönelik ve poURA3 (P. ohmeri) geninden olusan bir mekik E. coli - P. ohmeri' vektörüdür. Ayrica, bu Pseudomonas cichorii'nin (Ascl ve Sphl restriksiyonu vasitias yla degistirilebilir) tagatoz-3-epimerazini n bir açik okuma çerçevesinin yan nda bulunan degistirilebilir bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotör elemani i (Spel ve Ascl restriksiyonu vasitas yla) ve sonland ric eleman (Sphl ve Sacll vas tasyla) içerir. Örnek 7. goLEUZ secim markörü kullan T_arak heterolog_gen ifadesine vönelik b_ir P. ohmeri vektörünün olusumu Ikinci bir P. ohmeri' ifade vektörünün olusumuna yönelik, daha önce Örnek 6'da açIslanan plazmid pEVE2523'ün (Sekil 7) ifade kaseti P. ohmeri' poLEU2 seçim markörü (Sekil 6) içeren bir vektöre klonlanmStI. Spel ve Sacll (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesilmis vektör pEVE2523iün (Sekil 7) küntlesmis bir 1.7 kb fragman dolgu olarak kullanilm st r. Küntlesme oda sicakllg riida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karisimi i(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), akabinde 70°C'de 10 dakika boyunca enzimlerin isi ile etkisizlestirmesi ile gerçeklestirilmistir. Vektör omurgasü Sa/I (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile dogrusallastîman, küntlestirilen ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullantiarak 1 saat boyunca 37°C'de defosforile edilen bir poARS vektöründen (pligS - FR2772788) elde edilmistir. Jelle saflastIIan dolgu ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanan vektör omurgas+ T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak ile oda sicakllgiriida 1 saat boyunca baglanmistin. Ligasyon karßmfile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgmla daha fazla karakterizasyona yönelik kullanImßtm. Yeni klonlanmß ifade plazmidleri pEVE2560 (Sekil 8) replikasyonun bir bakteriyel (E. coli) kökeni ve bir ampisilin rezistans geni, maya (P. ohmeri') otonom replikasyon dizisi mayada seçime yönelik ve poLEU2 (P. ohmeri') geni içeren bir mekik E. 001/ - P. ohmeri vektörüdür. Ayrica, yaninda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü ve sonland ric si ibulunan Pseudomonas cichorii'nin tagatoz-S-epimerazimim açik okuma çerçevesi, Ascl ve Sphl restriksiyonu vaslfas yla degistirilebilir. Örnek 8. Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidroienazlni as ri ifadesine yönelik bir P. ohmerivektörünün olusumu Gluconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazm asliifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörü olusturulmustur. Ifade vektörüne klonlamaya yönelik, G/uconobacter oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmani.! Ascl ve Sphl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesme arac Ilg yla vektör 13AAYSYP'den (Sekil 3) sal nm stin. 803 bp fragman Zymocleanm1 Jel DNA Geri Kazanî'n Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak jelle saflastjmnîstm ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 9) kullanilarak 2 saat boyunca oda siakIEgInda pEVE2523'ün (Sekil 7) 9.8 kb Ascl/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastlnllan vektör omurgaslnia baglanm'stln. Ligasyon karisrm ile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çEBan plazmid pEVE3284 (Sekil 10) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandmßß: ve poURA3 seçim markörü bulunan G/uconobacter oxydans'mi kodon-optimizeli NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlijçerir. Örnek 9. Pichia stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi asmüifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörünün olusumu Ifade vektörüne alt-klonlamaya yönelik, Pichia stipiti's'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmaninim yan nda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarinin bulunmas *gerekir. Bu amaca yönelik: - EV3101 primer bir Ascl alanü (altü çizili) içeren AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC (SEO ID No 18) ve - EV3102 primer bir Sphl (alti. çizili) içeren GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG (SEO ID No 19) sablon olarak 30 ng vektör 12AALQTP (Sekil 2b) ile bir PCR reaksiyonunda kullanilmist r. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofT'VI polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslanglç denatürasyon ad mI,l akabinde 98°C'de 10 saniye / 55°Cide 20 saniye / 72°Cide 30 saniye ile 25 döngü ve 72°C"de 10 dakikaILk bir nihai genlesme adiml Ile gerçeklestirilmistir. 1.1 kb PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde aermßtlTl, özütlenmistir, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) ve Ascl ve Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile parçalanan restriksiyon kullanmarak saflastîjh'ißtî. DNA Clean & ConcentratorTM-S Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) ile kolon saflastlma akabinde, T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 11) kullanIarak slîasîyla, 2 saat boyunca oda sZcaklEgIida pEVE2523'ün (Sekil 7) 10.6 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastlman vektör omurgasüve pEVE2560`Ii (Sekil 8) 11.8 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastjîlan vektör omurgasmia baglanmLStLr. Ligasyon kariSlm ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde, plazmid DNA izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araclligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çERan plazmidler pEVE2562 ve pEVE2564 (Sekil 12) yanmida P. ohmeri'nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandlîzßüve smasgila poURA3 veya poLEU2 seçim markörü bulunan Pichia stipiti's'in kodon optimizeli NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi Üçerir. Örnek 10. Pichia stipi'tis NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazîi asîîifadesine vönelik bir P. ohmeri' vektörünün olusumu Ifade vektörüne alt-klonlamaya yönelik, Pichia stipitis'ten NADH-spesifik ksilitol dehidrojenaz kodlayan DNA fragmanlnln yan nda Ascl ve Sphl restriksiyon alanlarini n bulunmas gerekir. Bu amaca yönelik: - bir Ascl alanü (altD çizili) içeren EV3101 (AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC) (SEO lD No 18) ve - bir Sphl (altLçiziIi) içeren EV3102 (GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG) (SEQ ID N019) sablon olarak 30 ng vektör Iig7.78 (Sekil 2a) ile bir PCR reaksiyonunda kullanmnßtm. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangg denatürasyon adînü akabinde 98°C`de 10 saniye / 55°Clde 20 saniye / 72°C"de 30 saniye ile 25 döngü ve 72°Cide 10 dakikalEK bir nihai genlesme adLmUIe gerçeklestirilmistir. 1.1 kb PCR ürünü %1'Iik bir agaroz jel üzerinde ayr Imlstln, özütlenmistir, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ve Ascl ve Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile parçalanan restriksiyon kullanilarak saflastmrimrstm. DNA Clean & ConcentratorTM-S Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile kolon saflastlma akabinde, T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 13) kullan Iarak 2 saat boyunca oda sEtaklEgIida pEVE2560 'It (Sekil 8) 10.5 kb AscI/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastlüan vektör omurgasna baglanmßtl. Ligasyon karLSLriLile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde, plazmid DNA izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araclligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çtRan plazmid pEVE2563 (Sekil 14) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandImBElve poLEU2 seçim markörü bulunan Pichia stipitisin kodon optimizeli NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazlijçerir. Örnek 11. l_:'. coli' MALI-spesifik D-arabitol 4-oksigoregüktai_zm asîîifaglesine vönelik P. ohmeri vektörlerinin olusumu E. coli NAD"-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz n asin ifadesine yönelik bir P. ohmeri vektörü olusturulmustur. Ifade vektörüne klonlamaya yönelik, kodon-optimizeli E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz kodlayan DNA fragmanü Ascl ve Sphl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesme aractttgßila vektör 12ABYWMP'den (Sekil 1) salîtmîstm. 1.4 kb fragman ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak jelle saflastîimnîstm ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 16) kullanuarak 2 saat boyunca oda sicaklig riida pEVE2523"ün (Sekil 7) 9.8 kb Ascl/Sphl ile parçalanan ve jelle saflastinilan vektör omurgaslnia baglanm stiit Ligasyon karISim ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgßila daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çÜian plazmid pEVE2839 (Sekil 15) yan Iida P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonland Iîißüve poURA3 seçim markörü bulunan kodon -optimizeli E. 001/ NAV-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazüçerir. P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörüne ek olarak, E. Coli'den NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz ayrica P. ohmeri fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandric sini n kontrolü altinda klonlanmistin. Klonlama, ilk olarak poPGK1 promotörü ile ribuloz redüktaz promotörünün degistirilmesi, akabinde poTKL sonland Ißßlia yönelik ribuloz redüktaz sonlandlmnm bir degisimi aracmgßila iki ardîsm ad Inda gerçeklestirilmistir. P. ohmeri poPGK1 promotörünün 611 hp uzunlugunda bir fragmani IP. ohmeri'nin genomik DNA'sLnidan asag daki unsurlar kullanLlarak amplifiye edilmistir: - bir Spel alani l (alt çizili) içeren primer EV3177 (GAAGACTAGTTCACGTGATCTC) (SEQ ID No 20) ve - bir Ascl alan * (alti çizili) içeren primer EV3178 (CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC) (SEQ ID No 21). Genomik DNA sablonu 30 ul %O.2 SDS içinde yeni ekim yapman bir P. ohmeri' kolonisinin yeniden süspanse edilmesi ve 95°C'de 4 dakika boyunca BIÜInasD aracmgßila hazîlanmßtl. Tam hâlüsantrifüjleme akabinde, 0.5 ul süpernatant PCR'ye yönelik kullanElhiîstI. Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofT'V' polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 iJM'sinden olusan bir reaksiyon karlS ml içinde gerçeklestirilmistir. PCR 96°C'de 2 dakikalik bir baslangç` denatürasyon adini! akabinde 96°C'de 10 saniye / 58°C'de 10 saniye / 72°C'de 30 saniye ile 25 döngü ve 72°C'de 2 dakikalk: bir nihai genlesme admnüle gerçeklestirilmistir. PCR ürün %1'lik bir agaroz jel üzerine ayrImStm, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanIarak saflastllmnßt. Amplifiye edilmis 610 hp uzunlugundaki poPGK1 promotör fragman _iSpel ve Ascl (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmas na tabi tutulmustur ve T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 17) kullanilarak 2 saat boyunca oda scakl glrida pEVE2839'un (Sekil 16) 11.5 kb Spel/Ascl ile parçalanan ve jelle saflastlnilan vektör omurgasina baglanm stin. Ligasyon karßlîhîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgaoh, Isviçre) aracillglyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çkan plazmid pEVE3102 (Sekil 18) yanlnida P. ohmeriinin bir fosfogliserat kinaz (poPGKi) promotörü ve bir ribuloz redüktaz sonland rcisi lve poURA3 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. co/i NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazm içerir. Sonraki admnda pEVE3102'nin ribuloz redüktaz sonlandIEbBZP. ohmeri'nin tranketolaz (poTKL) sonland IßBIia yönelik degistirilmistir. P. ohmeri poTKL sonlandîîißliîi 213 bp uzunlugunda bir fragmanDP. ohmeri'nin genomik DNA'sIidan asag daki unsurlar kullanilarak amplifiye edilmistir: - bir Sphl alani i (alt çizili) içeren primer EV3817 (TAGCAGCATGCATAGGTTAGTGAATGAGGTATG) (SEQ ID No 22) ve - bir Sacll alan . (alt. çizili) içeren primer EV3818 (TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC) (SEQ ID No 23). Genomik DNA sablonu yukarmla açEltlandgîüzere hazIIanmStI. Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüçinde gerçeklestirilmistir. PCR 96°Cide 2 dakikalik bir baslangî; denatürasyon adînü akabinde 96°C'de 10 saniye / 57°C'de 10 saniye 72°C'de 30 saniye ile 25 döngü ve 72°C'de 2 dakikalLk bir nihai genlesme adimi [ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1'lik bir agaroz jel üzerinde ayr lm stln, özütlenmistir ve ZymocleanTNI Jel DNA Geri Kazanlm Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflast riilm st r. Amplifiye edilmis 213 bp uzunlugundaki poTKL sonlandIEDfragman Sphl ve Sacll (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîia tabi tutulmustur ve T4 DNA ligaz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil 17) kullantlarak 2 saat boyunca oda sîzaklglida pEVE3102'nin (Sekil 18) 11.5 kb SphI/Sacll ile parçalanan ve jelle saflastlnllan vektör omurgaslnia baglanm stln. Ligasyon karistm ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çJ'san plazmid pEVE3123 (Sekil 19) yanmida P. ohmeri'nin bir fosfogliserat kinaz (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandIEßEve poURA3 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazü içerir. Bir plazmidden diger bir seçim kullanilarak E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredükctazini ifade edebilmek amaciyla, pEVE31237ün poURA3 markörü, poLEU2 markörüne yönelik degistirilmistir. Bu amaca yönelik, poURA3 markörü Psil ve Afel (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalama aracmglýla vektör pEVE3123'ten (Sekil 19) salnmßtî 9.1 kb vektör omurgaSZZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanîn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanIarak jelle saflastllmnßt, 15 dakika boyunca oda smakltgînda Küntlesme Enzim KarISInD kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler @D ile etkisizlestirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 1 saat boyunca 37°C'de defosforile edilmistir. Dolgu olarak, Asel ve Afel restriksiyon parçalama aracllgiyla vektör pEVE2560'dan (Sekil 8) sallnian poLEU2 markörünün 3 kb küntlesmis ve jelle saflastinilan bir fragmani i kullanm'nßtî. Fragmanlarît Iigasyonu T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 20) kullanEarak 2 saat boyunca oda sîiaklglida gerçeklestirilmistir. Ligasyon karßmfîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracillgiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çkan plazmid pEVE3157 (Sekil 21) yanmda P. ohmeri'ni'n bir fosfogliserat kinaz (poPGK'I) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland Ißgüve poLEU2 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazü içerir. Örnek 12. Plazmidik E. coli NAN-spesifik _D-arapitol 4-oksic_loredüktaz]i ve Pichia ohmeri susu ATCC 20209'daki glazmidik Pichia stigitis NAQPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz qeninin ifadesi Arabitolün ksilitole biyosentetik dönüsümüne yönelik, NAD+-spesifik E. coli D-arabitol 4- oksidoredüktaz ve P. stipi'tisfn NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazlrti n eszamanli l ifadesi gereklidir. Birinci enzim ksiluloz olusumuna yol açar ve ikincisi ksilulozu ksilitole dönüstürür. ATCC 20209'dan derive ve Iösin ve urasile (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarmi'a) yönelik oksotrofik olan P. ohmeri' susu SRLU (MATh' LEU2 ura3) asaglaki plazmidler ile transformasyon aracmggila ksilitol salgüayan bir maya susunun olusumuna yönelik konak olarak kullanJmStI: - pEVE2839 (E. coli'nin NAV-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazL)J ve - sus EYS2755'e yol açan pEVE2564 (P. stipitisîn NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz.) Ek olarak, bir kontrol (WO 94/10325'in ilkesi izlenerek) olarak P. stipitis'in NADH- spesifik dogal sus ksilitol dehidrojenazlijfade eden bir sus ayrIa asag Baki plazmidler ile olusturulmustur: - pEVE2839 (E. Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz[)] ve - SRLU konak içinde sus EY82962iye yol açan pEVE2563 (P. stipit/'s'in NADH- spesifik dehidrojenazi)l. Kontrol olarak, s ras yla EYS2943, EY82696 ve EYS2697'ye yol açan tek plazmidler ile dönüstürülen suslar: - pEVE2839 (E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksxid0redüktazî, - pEVE2563 (P. stipiti's'in NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazî) ve - pEVE2564 (P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz[)i ayrma üretilmistir. Maya transformasyonu asagmlaki modifikasyonlar ile temel olarak Green et al. (Green E.D., Hieter, P., and Spencer F. A., Chapter 5 in Genome Analysis: A Laboratory Manual, Vol. 3, Cloning Systems, Birren et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, New York, 1999) sferoplast hale getirme yöntemi arac Ilg yla gerçeklestirilmistir: Lyticase yerine, Zymolyase 1OOT sferoplastlarln olusturulmasina yönelik kullanilmlst r ve enzim ile inkübasyon, Zymolyase islemi öncesinde hücre süspansiyonunun OD'si orijinal OD'nin %20-30'una ulasana kadar 37°C'de gerçeklestirilmistir. KBacasü P. ohmeri' hücreleri YPD ortam: (Maya ekstraktü%1 (w/v), Pepton %2 (w/v), Dekstroz %2 (w/v)) içinde bir gece boyunca 30°C'de 3-5 araslida bir nihai ODaoo'e büyütülmüstür. 200 ODGOO birimleri santrifüjleme aracmgßila toplanmßtl, bir kere su ve 1 M sorbitol ile ymanmßtî ve SCE tamponunda (1 M sorbitol, 100 mM sitrik asit trisodyum tuz dihidrat, 10 mM EDTA) 70 ODs/ml'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edilmistir. DTT ve Zymolase (LuBio Science, Luzern, Isviçre) sLijasLyla 10 mM ve 0.5 U/OD'lik bir nihai konsantrasyona eklenmistir ve karis m yavas çalkalama ile 37°C'de inkübe edilmistir. Hücre duvar parçalanmasin n akabinde su içinde seyreltilen solüsyonun optik yogunlugu ölçülmüstür. Bu degerin orijinalin %80'ine düsmesi durumunda, parçalanma dikkatli santrifüjleme ve 1 M sorbitol ve STC tamponu (0.98 M sorbitol, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM CaCIz) ile ykama aracEEgQla sonlandllmnßt. Sferoplastlar dikkatli bir sekilde 50 pg/ml dana-timüsü DNA's:(CaIbiochem/VWR, Dietikon, Isviçre) içeren STC tamponu içinde 200 OD/ml'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edilmistir. 100 pl'lik alikuotlar 100-200 ng plazmid DNA ile kar stln lmistin ve 10 dakika boyunca oda sicakliginida inkübe edilmistir. 1 ml PEG solüsyonu (%196 PEG 8000 w/v, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM CaCIz) süspansiyona eklenmistir, 10 dakika boyunca inkübe edilmistir ve pelletlenmistir. Sferoplastlar %25 YPD ve 7 mM CaCI2 içeren 1 M*Iik bir sorbitol solüsyonunun 1 ml'si içinde 1-2 saat boyunca 30°C'de yeniden olusturulmustur. Yeniden olusturulmus hücrelere 7 ml 50°C sßakltgîida üst agar (amino asitler olmadan %067 maya nitrojen baz: Iösin/urasil/histidin/triptofan/metiyonin olmadan %013 drop- out toz, %00.086 eksik olan gerekli amino asit, %2 glikoz, 1 M sorbitol, pH5.8 ve %25 Noble agar) eklenmistir ve karLSLm önceden L3LUMLS, sorbitol içeren seçmeli plakalara (amino asit olmadan %067 maya nitrojen bazl,l IÖsin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin olmadan %013 drop-out toz, %00.086 eksik olan gerekli amino asit, %2 glikoz, 1 M sorbitol, pH5.8) esit bir sekilde dökülmüstür. Plakalar 3-5 gün boyunca 30°C'de inkübe edilmistir. Transformantlar uygun seçmeli plakalar üzerinde yeniden seçilmistir. Olusturulan her bir sus arabitol, ksilitol ve ribitol üretimine yönelik üçlüler halinde test edilmistir. Bu amaca yönelik klonlar ilk olarak bir gece boyunca 30°C'de çimlenme ortamü(amino asitler olmadan %067 maya nitrojen baz: lösin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin olmadan %013 drop-out toz; %00.086 eksik olan gerekli amino asit; %5 glikoz; pH5.7) içinde yetistirilmistir. Bu bir gecelik kültürden, üretim ortamindaki (amino asitler olmadan %067 maya nitrojen baz; Iösin/urasiI/histidin/triptofan/metiyonin olmadan %013 drop-out toz; %00.086 eksik olan gerekli amino asit; %15 glikoz; pH5.7) bir ana kültür 02'lik bir baslangg OD600'ünde inoküle edilmistir. Bu kültür 48 saat boyunca 37°C'de yetistirilmistir ve süpernatantlarli arabitol, ksilitol ve ribitol konsantrasyonlar bir Aminex® HPX-87 kolonu (Bio-Rad, Hercules, California) ve bir Waters® TQ-Detector (üçlü bir kuadrupol dedektöre baglanan Acquity® UPLC, Waters, Milford, Massachusetts) ve mobil faz olarak %100 su ile izokratik kosullar kullanilarak HPLC/MS araclllg yla belirlenmistir. Test edilen tüm suslarýpoliol titreleri Tablo 8'de gösterilir. Tablo 8 P. stipitisîin NADH- ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazl !ve/veya E. coli'nin NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazi iiIe dönüstürülen P. ohmeri SRLU suslarini n poliol üretimi (üçlülerin 0rtalamasl)i Sus Arab/`tel (g/L) Ksi/itol (g/L) Ribitol (g/L) SRLU 32.9±2.4 nd nd EY82943 [pEVE2839] 26.4±2.8 2.3±0.1 0.7±1.2 EY82696 [pEVE2563] 36.0±2.7 nd. 0.8±0.1 EY82697 [pEVE2564] 31.1±1.6 nd 6.3±0.1 EYS2962 [pEVE2839/pEVE2563] 29.6±O.8 7.0±0.3 2.3±0.1 EY82755 [pEVE2839/pEVE2564] 16.4±2.2 19.9±0.8 10.9±0.4 nd - saptanmamist r P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaznmt kullanLmLJ dogal sus NADH- spesifik enzim ile karsilastinlldig nda ksilitol titrelerine kaydadeger bir artmaya yol açar. Örnek 13. Pichia ohmeri'de plazmidik GIuconobacter oxydans NADPH-spesifik k_silitol gehidroienag geninin ifadesi P. stipitis'in NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazîiükullanan bir ksilitol üreten susa ek olarak G. oxydans'îi NADP-spesifik ksilitol dehidrojenazliîifade eden ikinci bir sus tasarlanmîstl. ATCC 20209'dan derive ve Iösin ve urasile (Piredda and Gaillardin, 1994, yukarmla) yönelik oksotrofik olan P. ohmeri susu SRLU (MATh' LEU2 ura3) sus EY83324'e yol açan plazmidler pEVE3157 (E. co/i'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz) ve pEVE3284 (G. oxydans'ln NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz) ile transformasyon aracmglýla ksilitol salgmayan bir maya susunun olusumuna yönelik konak olarak kullanilmlst r. Kontrol olarak, sinas yla EY83067 ve EY83323,e yol açan, tek plazmidler ile dönüstürülen suslar: - pEVE3157 (E. CGI/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazi)l ve - pEVE3284 (G. oxydans'li NADH-spesifik ksilitol dehidrojenazî; ayrla üretilmistir. Yukarlaki suslarn olusumuna yönelik kullan Ian E. 0011' D-arabitol 4-0ksid0redüktaz, P. stipi'tis'in ksilitol dehidrojenazliiifade eden suslarda kullanman poRR promotörünün aksine poPGK1 promotörü aracmglýla kontrol edilir. Ancak, bir promotör etkisini hariç tutmak ve dolay'slyla, P. stipitis'ten karsillk gelen enzimleri ifade edenler ile birlikte G. oxydans'dan ksilitol dehidrojenaz ifade eden suslarda poliol seviyelerini kars Iastlnabilmek üzere, ek bir sus olusturulmustur. Bu sus EY82963 asagldaki unsurlar ile SRLU konagmmi dönüstürülmesi araclligýla elde edilmistir - pEVE3123 (E. Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazE)i ve - pEVE2564 (P. stipiti's'ten NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazE). Maya transformasyonu Örnek 12"de açklandgüüzere gerçeklestirilmistir. Olusturulan her bir sus Örnek 12'de açmlandtgîüzere arabitol, ksilitol ve ribitol üretimine yönelik üçlüler halinde test edilmistir. Test edilen tüm suslar n poliol titreleri Tablo 9'da gösterilir. Tablo 9 G. oxydansTrli NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazl'lve/veya E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazüile dönüstürülen P. ohmeri SRLU suslarlimi poliol üretimi (üçlülerin ortalamasî) Sus Arabitol (g/L) Ksilitol (g/L) Ribi'to/ (g/L) SRLU 32.9±2.4 nd nd EY83067 [pEVE3157] 29.0±3.8 1.5±0.3 1.8±0.4 EY83323 [pEVE3284] 32.8±O.6 nd nd EY83324 [pEVE3157/pEVE3284] 26.3±1] 21 .1±1 .1 1.2±0.1 EYs2963 [pEVE3123/pEVE2564] 27.3±2.5 17.7±1.? 13.9±0.7 nd - saptanmam @II G. oxydans'tan (EY83324) NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz ifade eden suslardaki ksilitol titreleri, P. stipitis'ten (EYS2963) karsIER gelen enzimi ifade eden suslarlikine benzerdir. Ancak, G. oxydans enzimi daha düsük ribitol titrelerine yol açar, böylece ksiluloze dogru daha yüksek bir substrat özgüllügü gösterir. Örnek 14. A_rtan arapitol salgtlama ile bir mgtant P. ohmeri susunun olusumu Daha yüksek bir arabitol üretici mutant, P. ohmeri ATCC 20209'dan UV ile @Elanan bir süspansiyondan seçilmistir. UV- slnlama sistemi (Vilber Lourmat, Fransa), mikroislemci ile kontrol edilen RMX-3 W radyometre ile donat Im st r. P.ohmeri , bir gece boyunca 37°C'de YPD agar (Dekstroz 20g/L) üzerinde yetistirilmistir. Bir süspansiyon, 10'5 cfu/mLyye (OD520=0.4) ulasmak üzere hazmlanmîstm ve 5 mL, steril bir Petri kablia yerlestirilmistir. Süspansiyon, kapagî'i kaptan çkarttlhiasîidan sonra @mlanmßtî UV dalgaboyu, 254 nm'dir ve ßîilama enerjisi, 1.8 10'2 J/cm2'dir. Maya hücrelerinin mortalitesinin %90'Delde edilmistir. lsIiIilaman durdurulmasive kapagît kabil üzerine tekrar koyulmaslidan sonra süspansiyon, bir buz banyosuna yerlestirilen steril bir tüpe aktarmnßtl. mL YPD sivi lortam, mutasyona ugramis süspansiyon ile inoküle edilmistir ve 37°C, 250 rpm'de 12 saat boyunca inkübe edilmistir. Inkübasyondan sonra mutasyona ugrams kültür, steril %40 gliserol (VIV) ile seyreltilmistir. Alikuotlar, 5 mL viyallere dag tüm Lstr ve -80°C'de dondurulmustur. Eleme, Dekstrozun (600 g/L'ye kadar) çok yüksek konsantrasyonlarlmda yetisebilen Pichia ohmeri 'nin ozmofilik özelligine baglßlîl. Amacßn: Dekstroz 600 g/L veya 700 g/L içeren YPD agar üzerinde ana sustan daha hâlEbüyüyebilen mutantlarEBeçmektir. Buzu giderilmis alikuotlar, YPDBOO ve YPDmo üzerinde yaymnßtl ve birinci görünen koloniler seçilmistir ve çalkalama balonlarlida arabitolün üretimine yönelik test edilmistir. Alt kültür ve üretim ortamlar , s ras yla glukoz SOg/L veya 100 g/L, maya ekstrakt Sg/L, MgSO4 1 g/L ve KH2P04 2g/L`den pH 5.7'de yap lmistln. Alt kültür (100 mL balon içinde mL), 37°C, 250 rpm'de 24 saat boyunca inkübe edilmistir. Ürün (500 mL balon içinde 40 mL), 5 mL alt kültür tarafindan inoküle edilmistir ve 37°C, 250rpm'de 64 saat boyunca inkübe edilmistir. Glukoz g/L 64 saat Arabitol g/L 64 saat P. ohmeri' ATCC 20209 6.0 52.7 P. ohmeriCNCM I-4605 0 58.6 Mutant P. ohmeri susu. bunun daha hülüglukoz tüketimi ve daha yüksek arabitol üretimine yönelik seçilmistir ve l-4605 sayßîaltnda Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu] of the Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15 ile 7 Mart 2012'de Fransaida tevdi edilmistir. Örnek 15. Bir LEU2 delesyon plazmidinin olusumu Plazmid seçimine ve gen entegrasyonuna yönelik yeni olusturulan CNCM I-4605 susunu kullanabilmek amacýla LEU2 açER okuma çerçevesinin delesyonuna yönelik bir plazmid olusturulmustur. Birinci bir ad Inda P. ohmeri"de kullantlabilen genel entegrasyon vektörü, S. cerew'si'ae CRE/loxP sisteminden adapte edilmistir. Vektör omurgas, Pstl ve EcoRV enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi araciLgyla pUG73'ten (Gueldener et al., 2002, Nucleic Acid Res, 30, e23) izole edilmistir. Dolgu olarak primer çift ile olusturulan, yan-nda onP alanlaerulunan P. ohmeri'nin LEU2 seçim markörünü içeren bir PCR fragmanFblarak islev görmüstür. ' EV3043 (CACTGGCGCGCCCACTGCATGCGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTA TAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGACACATCGTGGATCCAAG CTATCAACGAGAGAGTC) (SEQ ID No 24) ve ' EV3044 (AGTGGCTAGCAGTGCCATGGCCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATAC GAAGTTATATTAAGGGTTCTCGAGACGCGTCATCTAGCATCTCATCTACCA ACTC) (SEQ ID No 25) ve ' sablon olarak poARS (plig3 - FR 2772788 - bakin 2 Sekil 6). Ileri primer EV3043, bir 48 bp uzunlugunda onP fragman (koyu) ve bir Dralll alanliît (altýçizili) takip ettigi bir Sphl alanmdan (altFlçizili) önce gelen bir Ascl (altýçizili) alanFrlilT içerir. EV3043iün 3" ucu, P. ohmeri LEU2 geninin amplifikasyonuna yönelik 25 hp uzunlugunda ek bir fragmanüiçerir. Diger taraftan revers primer EV3044, bir 48 hp uzunlugunda onP fragmanD(k0yu) ve bir Mlul alanIiIi (altîçizili) takip ettigi bir Ncol alanndan (altîçizili) önce gelen bir Nhel (altüçizili) alanlijiçerir. EV3044'ün 3" ucu, P. ohmeri LEU2 geninin amplifikasyonuna yönelik 25 hp uzunlugunda ek bir fragmanü içerir. Sablon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP*nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon kar's mi liçinde amplifiye edilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangiç denatürasyon adim akabinde 98°C'de 10 saniye / 65°C'de 10 saniye / 72°Ctde 50 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 7 dakikal i( bir nihai genlesme adim ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde aermStFrl, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazaniîn Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullan Tarak saflastTTm _stî Amplifiye edilen fragmanlimi yannda daha fazla alt klonlamaya yönelik ikinci bir PCR reaksiyonunda bir Pstl ve EcoRV alanDbulunmustur. Amplifikasyon, asaglakiler ile gerçeklestirilmistir: ' Pstl alanü (altü çizili) içeren primer EV3056 (CACTCTGCAGCACTGGCGCGCCCACTGCAT) (SEQ ID No 26) ve - EcoRV alan J (alt_ çizili) içeren primer EV3057 (CACTGATATCAGTGGCTAGCAGTGCCATGG) (SEQ ID No 27) uygun 1X tampon içinde 0.02 U/|JI iProotTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karîsîhüiçinde. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangßt denatürasyon adînüakabinde 98°C'de 10 saniye / 72°C'de 45 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 7 dakikaIIg bir nihai genlesme adEh: ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImîstm, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri KazanEn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflastIImgstI. Amplifiye edilen 2.5 kb LEU2 markörü, Pstl ve EcoRV enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmaslna tabi tutulmustur, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanim Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile jelle saflastinilmistin ve 2 saat boyunca oda 8 cakl girida T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullan Iarak, jelle saflast rlan (ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmn Kiti - Zymo Research Corporation, Irvine, California) vektör pUGYS'ün omurgasîia (Gueldener et al., 2002 Nucleic Acid Res, 30, e23) olan 2.4 kb PstI/ECORV (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) baglanmßtl - (Sekil 22). Ligasyon karßînüile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aractttgglla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmid pEVE2787 (Sekil 23), yaninda iki onP alani ibulunan endojen promotör ve sonland rclrii n kontrolü altinda P. ohmeri LEU2 seçim markörünü içerir. Ek olarak bir Ascl ve Sphl alanl,l genom içinde entegrasyon alanlar na homoloh olan bölgelerin klonlanmasiriia yard mc olmak amaciyla birinci onP"nin yukari Iyönünde ve ikinci onP'nin asag :yönünde bir Nhel ve Ncol alanîia eklenmistir. Entegrasyon vektörünün LEU2 markörü akabinde endojen LEU2 açtk okuma çerçevesinin bir delesyonunun amaçlanmasl Inedeniyle ikinci bir klonlama adimiriida Streptomyces noursei'nin nat1 rezistans geni ile degistirilmistir. Streptomyces noursei'nin nat1 genini kodlayan bir DNA fragmanl,l SEQ ID No 28"in verilen dizisine göre GeneArt® Gen Sentezi (Life Technologies, Regensburg, Almanya) araciiigryla kimyasal olarak sentezlenmistir. nat1 genine yönelik kodlama yapan 8607061 dizisinin (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/860706.1 sitesinden elde edilmistir) nükleotidleri 204 ila 776 sablon olarak kullanmnßtiî ve httpzl/genomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer programikullanüarak Tablo 7'ye (yukarida) göre P. ohmeri' ATCC 20209`da kullanmia yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. Ortaya çikan dizinin 5' ve 3' uçlarinda, sliiasiyla restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) and Sphlinin (GCATGC) tan ma alanlarina yönelik kodlama yapan nükleotidler daha fazla klonlamayi ikolaylast rmak amaciyla metin dosyas na manuel olarak eklenmistir. Ek olarak, bir adenozin üçlüsü mayalarlrii Kozak-benzeri dizilerinde - 3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangîç ATGlnin önüne eklenmistir. Son dizi (SEQ ID No 28) akabinde GeneArt'a (Regensburg, Almanya) senteze yönelik verilmistir. nat1 genini kodlayan sentezlenmis DNA fragman: bir pMA-T derive vektörde (12ABTV4P, Sekil 24) 5 ug liyofilize plazmid DNA olarak dagImnStI. nat1 geninin klonlanmaslia yönelik bir ribuloz redüktaz (poRR) promotör ve sonlandmmü içeren bir vektör kullanillnßtl. Sonlandlmü bir orotidin-5'-fosfat dekarboksilaz (poURAS) sonlandrcLlile degistirilmistir ve nat1 geni, promotör ile sonlandinici diziler arasina eklenmistir. Bu amaçla orotidin-5'-fosfat dekarboksilaz (poURAS) sonlandin ci,iasag dakiler ile PCR taraf ndan olusturulmustur: 0 bir Sphl alanü (alt: çizili) içeren primer EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEO ID No 29) ve o bir Sacll alan: (alt: çizili) içeren primer EV3394 (GGACCGCGGAAAGGTGAGGAAGTATATGAAC) (SEO ID No 30) ve ' sablon olarak pEVE2523 (Sekil 7) Amplifikasyon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 pM'sinden olusan bir reaksiyon karis mI [içinde gerçeklestirilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangß denatürasyon adînîakabinde 98°C'de 10 saniye / 59°C'de 10 saniye / 72°Cide 10 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalk bir nihai genlesme adFrnýile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImîstI, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri KazanEn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanttarak saflastlmnßtî. 239 hp poURA3 sonlandîbü Sphl ve Sacll enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîia tabi tutulmustur ve Sphl ve Sacll restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Iinearize edilmis pEVE2681'in 11 kb vektör omurgasLnia oda sLcakILgnda 2 saat boyunca baglanmstm ve T4 DNA ligazl_i(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile jelle saflastlnllm st r. Ligasyon karISlm. ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgglla daha fazla karakterize edilmistir. Ikinci bir klonlama admnnda nat1 geni, Sphl ve Ascl enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi aracmgwla 12ABTV4P'den (Sekil 24) salnmßtî. Ek olarak oda slaklgmida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karîsmnü kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Sphl alanliît küntlesmesi akabinde 70°C'de 10 dakika boyunca enzimlerin LSLIiIe etkisiz hale getirilmesi, Sphl ve Ascl parçalanmasi iaraslmda gerçeklestirilmistir. 587 bp jelle saflastirllan fragman (ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti- Zymo Research Corporation, Irvine, California) akabinde Sphl ve Ascl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesilen yukarida aç klanan vektörün jelle saflastinllan 10.5 kb vektör omurgasmia baglanmîstI. Aynîzamanda vektörün Sphl alanü Küntlesme Enzim Karßînükiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile oda sîiaklglida 15 dakika boyunca akabinde Ascl ile parçalama gerçeklestirilmeden önce 70°C'de 10 dakikalER bir @yla etkisiz hale getirme adlml lile küntlesmistir. Ek olarak vektör, Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 37°C'de 1 saat boyunca fosforilden arlnidlnilmistin. Ligasyon, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 2 saat boyunca oda 3 cakl ginida gerçeklestirilmistir. Ligasyon karlSFrrfile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanttarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmggila daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çIgan plazmid pEVE2798 (Sekil 25), yanîtda bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz (poRR) promotör ve bir orotidin-S'-fosfat dekarboksilaz (poURA3) sonlandLnLc'_bulunan nat1 ilaç rezistans markörü içerir. nat1 ifade kaseti, bütünleyici vektörde P. ohmeri LEU2 seçim markörünü degistirmek üzere kullanlmst r. Tekrar klonlamay kolaylastrmak amaciyla nat1 kasedinin asagmakiler ile PCR tarafmdan yanmida Xbal (primer EV3643ite alçFlçizili) ve Mlul (primer EV3644'te altEçiziIi) bulunmas :gerekir: ° primer EV3643 (CACTTCTAGACACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEO ID No 31) ve ~ primer EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEQ ID No 32). Primer EV3643, Xbal alannütakip eden ek bir Clal alanü(n0ktalü çizgi) içerir. pEVE2798, sablon görevi görmüstür (Sekil 25). Amplifikasyon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProotTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP"nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karis mI [içinde gerçeklestirilmistir. PCR 98°C'de 30 saniyelik bir baslangß denatürasyon adlInZakabinde 98°C'de 10 saniye / 54°C'de 10 saniye / 72°C"de 25 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalE bir nihai genlesme adînîile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImîstI, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmi Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullan Iarak saflastllmnßt. 1.3 kb nat1 ifade kaseti, Mlul ve Xbal enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmas na tabi tutulmustur ve Mlul ve Xbal enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Iinearize edilmis pEVE2787'nin (Sekil 23) 2.6 kb vektör omurgaslna oda sicaklig nda 2 saat boyunca baglanmistlr ve T4 DNA Iigazl i(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 26) kullan Tarak ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile jelle saflastTTmStT. Ligasyon karßlîhîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çkan plazmid pEVE2852 (Sekil 27), ribuloz redüktaz (poRR) promotör ve orotidin-57-fosfat dekarboksilaz (poURA3) sonlandinlcinim kontrolü altinda nat1 seçim markörünü içerir ve yaninda iki onP alani bulunur. Entegrasyon plazmidi, genom içinde alana spesifik entegrasyona yönelik gerekli olan herhangi bir P. ohmeri homolog fragmanüiçermez. Bu alanlar, sonraki adEnlarda baglanmßtm. LEU2 açtlg okuma çerçevesinin yukarEiyönlü 5' homolog bölgesi, asag Zlakiler ile 50 ng poARS vektörden (Sekil 6) amplifiye edilmistir: ~ Pstl alanü (aItD çizili) içeren primer EV3548 (CACTCTGCAGGATCCAAGCTATCAACGAGA) (SEQ ID No 33) ve - bir Sphl alanU (alt'_ çizili) içeren primer EV3549 (CACTGCATGCGTTGCGGAAAAAACAGCC) (SEQ lD No 34). PCR, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTPinin 200 pMisi ve her bir primerin 0.5 pM'sinden olusan bir reaksiyon karßînüiçinde gerçeklestirilmistir. Amplifikasyon, 98°C'de 30 saniyelik bir baslangßb denatürasyon adm12akabinde 98°C'de 10 saniye / 61°C'de 10 saniye / 72°C"de 15 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalk bir nihai genlesme admnîile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImIstI, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanmt Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullan'larak saflastlnilmlstln. 567 bp fragman, Pstl ve Sphl enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasna tabi tutulmustur ve Pstl ve Sphl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Iinearize edilmis pEVE2852`nin (Sekil 27) 3.9 kb vektör omurgaslrta oda smaklfgl'nda 2 saat boyunca baglanm stiri ve T4 DNA IigazD(New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 29) kullan Tarak ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) ile jelle saflastIImîstI. Ligasyon karßînîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies. Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araciitgiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmid pEVE2855 (Sekil 28), LEU2 açik okuma çerçevesinin yukari l yönlü 5' bölgesine homolog olan bir fragmani Ive yan nda iki onP alan olan bir nat1 markörü nü içerir. LEU2 açk okuma çerçevesinin asagijyönlü 3' homolog bölgesi, asaglakiler ile 50 ng poARS vektörden (Sekil 6) amplifiye edilmistir: ° Ncol alanD (altD çizili) içeren primer EV355O (CACT CCATGG AGTAGGTATATAAAAATATAAGAG) (SEQ ID No 35) ve ~ bir Nhel alanü (alt: çizili) içeren primer EV3551 (CACTGCTAGCGTCGACAACAGCAACTAG) (SEQ ID No 36). PCR, uygun 1X tampon Içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BlO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karis ml Iiçinde gerçeklestirilmistir. Amplifikasyon, 98°C"de 30 saniyelik bir baslangiç denatürasyon adim akabinde 98°C'de 10 saniye / 51°C'de 10 saniye / 72°C'de 25 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikal k bir nihai genlesme adim ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImîstI, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanîn Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanIarak saflastltlmstî. 1.3 kb fragman, Ncol ve Nhel enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîia tabi tutulmustur ve Ncol ve Nhel restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Iinearize edilmis pEVE2855'in (Sekil 28) 4.4 kb vektör omurgas na oda sLcakILgLnda 2 saat boyunca baglanm stm ve T4 DNA ligazLKNew England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 29) kullan Iarak ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) ile jelle saflast r lmst r. Ligasyon karlsmfile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanttarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmggila daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çERan nihai LEU2 delesyon plazmidi pEVE2864 (Sekil 30), yukarü yönlü 5' bölgesine homolog olan bir fragman _ve LEU2 açU: okuma çerçevesinin asagLyönlü 3' bölgesine homolog olan bir fragamani Me yan nda iki onP alani olan bir nat1 markörünü içerir. Örnek 16. Lösine yönelik oksotrofik olan bir mutant P. ohmeri susunun olusumu Olusturulan P. ohmeri CNCM l-4605 susunun simdiye kadar herhangi bir oksotrofi göstermemesi nedeniyle gen entegrasyonlarmia yönelik LEU2 seçim markörünü kullanabilmek amacýla bir LEU2 açER okuma çerçevesi delesyonu gerçeklestirilmistir. Bu amaçla plazmid pEVE2864 (Sekil 30), 37°C'de 2.5 saat boyunca EcoRV ve Pstl enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîia tabi tutulmustur ve karßîn, Örnek 12'de açtklanan prosedüre göre Mut165 susunu dönüstürmek üzere kullanMLstLij. Yeniden olusturulan hücrelere 25 ug/ml natamisin ile 7 ml 50°C sldakllg nda üst agar (%1 maya ekstraktl,l %2 pepton, %2 glukoz, 1 M sorbitol, pH 5.8 ve %25 Noble agar) eklenmistir ve kar sim, 25 pg/ml natamisin ile önceden Isitllmis, sorbitol içeren seçim plakalarma (%1 maya ekstraktü %2 pepton, %2 glukoz, 1 M sorbitol, pH 5.8 ve %2 agar) esit bir sekilde dökülmüstür. Plakalar, 30°C'de 4 gün boyunca inkübe edilmistir. LEU2 açtk okuma çerçevesinin delesyonu, Iösin olmadan seçmeli plakalar üzerinde sttim büyüme ile dogrulanmßtl ve asagîdakiler kullantrarak koloni PCR tarafIidan onaylanm'st r: - primer EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEQ ID No 29) ve . primer EV3795 (CAAGTCGTGGAGATTCTGC) (SEQ ID No 37). 1.6 kb fragman, 98°C`de 30 saniyelik bir baslangß denatürasyon admnm akabinde 98°C'de 10 saniye / 51°C'de 10 saniye / 72°C'de 25 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalIs bir nihai genlesme adînjle amplifiye edilmistir. Ortaya çIgan sus, bir CNCM I-4605 altyapßîida LEU2 geninin tam açER okuma çerçevesi delesyonunu içerir ve l-4955 sayßüaltlida Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu] of the Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS cedex 15 ile 5 Subat 2015"te Fransa'da tevdi edilmistir. Örnek 17. P. stipitis'in'in NADPH-spesifik ksilitol dehidroienaz ve E. Coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazi1i` iceren bir çift ifade plazmidinin olusumu P. stipiti's'in'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîve E. Coli'nin NAD+-spesifik D- arabitol 4-oksidoredüktazli :ifade edebilmek amacwla sadece Iösine yönelik oksotrofik olan mutant P. ohmeri susunda bir çift ifade plazmidinin olusumu gerekli olmustur. P. stipiti's'in"in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiüiçeren ifade kasedi, Spel ve Sacll enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi aracmgiyla pEVE2562'den (Sekil 12) salitimLstLij. 1.9 kb fragman, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullan larak jelle saflastlnlm st n ve oda 3 cakl glnda 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Kar sim kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°C'de dakika boyunca enzimler slyla etkisiz hale getirilmistir. Dolgu akabinde oda sEtaklEgIJida 2 saat boyunca T4 DNA ligaz: (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 31) kullantllarak E. Coli'nin"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmü içeren 12.1 kb Spel-linearize edilmis, küntlesmis, fosforilden armdlmnß (Antarktik fosfataz - New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts kullantlarak 37°C'de 1 saat) ve jelle saflastIImîs pEVE3157 omurgaslia (Sekil 21) baglanmistin. Ligasyon karistm ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çtkan plazmid pEVE3318 (Sekil 32), yanîida P. ohmeri' fosforgliserit kinazD (poPGK1) promotörü ve ribuloz redüktaz (poRR) sonlandiîzü ve poLEU2 seçim markörünün kontrolü altîida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandîîzßü (poRR) olan P. stipiti'sin NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazIiIi ve E. Coli'nin NAD+- spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktaz'rimt çift ifade yapLsriUçerir. Örnek 18. P. ohmeri'de Ig. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaLqeni ve P. stipitis NADPH-spesifik ksilitol dehidroienaz qeninin ifadesine yönelik bütünleyici vektörlerin olusumu E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz geni ve P. stipitis'inin NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin sonuç olarak P. ohmeri genomunun bütünleyici bir parçasEblmasügerekir. Bu nedenle bir LEU2 seçim markörü ile bir bütünleyici vektörün pEVE28527ün nat1 seçim markörü degistirilerek ve arabitol oksidoredüktaz ve ksilitol dehidrojenazîi çift ifade yapßüdahil edilerek olusturulmasügerekir. Bu amaçla yanIida Ascl ve Sphl alanüolan P. ohmeri LEU2 açtk okuma çerçevesi, asagLdakiler ile PCR taraanidan olusturulmustur: . primer EV3645 (CAAGGCGCGCCAAAATGTCTACCAAAACCATTAC) (SEQ ID No 38) ve - primer EV3646 (GGAGCATGCCTACTTTCCCTCAGCCAAG) (SEQ ID No 39). Amplifikasyon, uygun 1X tampon içinde 0.02 U/pl iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTPSnin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînü içinde 50 ng poARS (Sekil 6) sablonu ile gerçeklestirilmistir. PCR, 98°C'de 30 saniyelik bir baslangßt denatürasyon admnü akabinde 98°C'de 10 saniye / 57°C'de 10 saniye / 72°C'de 20 saniye ile 30 döngü ve 72°Cide 5 dakikalik bir nihai genlesme ad mi iile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrimstl, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanin Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak saflastiriilmist r. Amplifiye edilen LEU2 açik okuma çerçevesi akabinde Ascl ve Sphl enzymes (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasha tabi tutulmustur. Ek olarak oda smakltgî'ida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karßkaiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Sphl alanîtli küntlesmesi akabinde 70°Cide 10 dakika boyunca enzimlerin :sjile etkisiz hale getirilmesi, Sphl ve Ascl parçalanmasiarasmida gerçeklestirilmistir. 1.1 kb jelle saflastlman fragman akabinde Sphl ve Ascl restriksiyon enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile kesilen pEVE2811"in 11 kb vektör omurgas'na baglanmLstLn. AynLizamanda vektörün Sphl alani,i Küntlesme Enzim Karisim kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile oda 5 cakl ginida 15 dakika boyunca akabinde Ascl ile parçalama gerçeklestirilmeden önce 70°Cide 10 dakikalik bir isiyla etkisiz hale getirme adimi iile küntlesmistir. Ek olarak vektör, Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullan Tarak 37°C`de 1 saat boyunca fosforilden arindrrilmßtm LEU2 açkê okuma çerçevesi ve vektör omurgasIiIi Iigasyonu, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanmarak 2 saat boyunca oda sîzakltgî'ida gerçeklestirilmistir. Ligasyon karßîniile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanttarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araciligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya ç kan plazmid pEVE2862 (Sekil 33), yaninda bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz (poRR) promotör ve bir 0rotidin-5'-fosfat dekarboksilaz (poURA3) sonlandiriic bulunan P. ohmeri LEU2 markörü içerir. Akabinde LEU2 markörü, asagmlakiler kullanmarak PCR tarafîtidan amplifiye edilmistir: ' C/al alanüiçeren primer EV3643 (CACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEO ID No 31) ve - Mlul alan_ (altu çizili) içeren EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEO ID No 32) ve sablon olarak pEVE2862 (Sekil 33). Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 Ulul iProofT'V' polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 uM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînjiçinde gerçeklestirilmistir. PCR, 98°C'de 30 saniyelik bir baslangm denatürasyon adînîakabinde 98°C`de 10 saniye / 54°C`de 10 saniye / 72°C'de 30 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalER bir nihai genlesme adiîn: ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrImîstI, özütlenmistir ve ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazanmi Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullaniarak saflastmumstm. Amplifiye edilmis 1.8 kb uzunlugundaki LEU2 fragman , Clal ve Mlul (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmas na tabi tutulmustur ve T4 DNA ligaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 34) kullanlarak 2 saat boyunca oda scakl giriida pEVE2852inin (Sekil 27) 2.6 kb Clal ve Mlul (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasma tabi tutulan ve jelle saflastrllan vektör omurgasFrla baglanmßtl. Ligasyon karßîhîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgßlla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya ç kan plazmid pEVE2865 (Sekil 35), yaninda iki onP alan bulunan P. ohmeri LEU2 markörünü içerir. Bütünleyici vektörü klonlamaya yönelik pEVE2865, Sali enzimi (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmaslia tabi tutulmustur, 15 dakika boyunca oda sßaklglida Küntlesme Enzim Karßînü kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler @Zile etkisizlestirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 1 saat boyunca 37°C'de defosforile edilmistir. Vektör omurgasln n 4.5 kb jelle saflastlnllmls fragmanl,l Iigasyona yönelik kullanilmistln. Dolgu olarak Pstipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genlerinin ve Ndel ve Sacll enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi aracmgfyla pEVE3318'den (Sekil 32) salFrtian E. co/i 'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmli çift ifade yapßüslevi görmüstür. 4.4 kb fragman, ZymocleanTM Jel DNA Geri KazanIn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanmarak jelle saflastjmnîstl ve 15 dakika boyunca oda smakltgîida Küntlesme Enzim Kargsînü kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler BD ile etkisizlestirilmistir akabinde ek bir jelle saflasttijma gerçeklestirilmistir. pEVE2865iin vektör omurgas 've pEVE3318'in dolgusu, T4 DNA Ilgaz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil 34) kullan Iarak 2 saat boyunca oda scaklig nda baglanmistln. Ligasyon karlSFrrFile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgwla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çtkan plazmid pEVE3387 (Sekil 36), P. ohmeri' fosfogliserat kinazü(poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandIErIiIi kontrolü altlida yannda bir P. ohmeri' ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandmLcLs_(poRR) olan P. stip/'ti's'in NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazlnirli çift ifade yap sirt içerir. Seçim markörü olarak yaninda iki onP alani l bulunan bir P. ohmeri LEU2 geni islevi görür. Örnek 19. Ortama ksilitol salgilayan birinci jenerasyon bütünleyici P.ohmeri susunun olusumu Daha önceden açîdanan vektör, E. co/i'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz genini ve P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genini P. ohmeri'nin genomuna rastgele bir sekilde entegre etmek üzere kullanumstm. Bu amaçla Iösine yönelik oksotrofik olan sus CNCM I-4955 (Örnek 16), Örnek 12'de açklanan prosedüre göre 37°C'de 3 saat boyunca Notl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasîrlia tabi tutulan pEVE3387 (Sekil 36) ile dönüstürülmüstür. Dönüstürülenler, herhangi bir Iösin olmadan sorbitol plakalarü üzerinde seçilmistir. Ortaya çERan sus, P. ohmeri"nin genomuna rastgele bir sekilde entegre edilen E. colinin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz genini ve P. stipitis'in NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz genini içerir ve I-4982 sayßîaltîida Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu] of the Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Cedex 15 ile 20 Mayis 2015`te Fransa'da tevdi edilmistir. Örnek 20. G. oxydans'lm NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz ve E. coli'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazimil içeren bir çift/üçlü ifade glazmidinin olusumu G. oxydans'li NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîve E. coli"nin NAD+-spesifik D- arabitol 4-oksidoredüktazli :ifade edebilmek amacßlla sadece Iösine yönelik oksotrofik olan mutant P. ohmeri susunda bir çift ifade plazmidinin olusumu gerekli olmustur. G. oxydans'I'i NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmüiçeren ifade kasedi, Spel ve Sacll enzimleri (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi aracillgiyla pEVE3284"ten (Sekil 10) salimmistin. 1.6 kb fragman, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullan larak jelle saflast r Im st r ve oda sicakllginida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Kar simi l kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°Clde dakika boyunca enzimler @Dile etkisiz hale getirilmistir. Kullantîan vektör omurgasü E. Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktazIiEliçeren 12.1 kb SpeI-Iinearize edilmis (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ve jelle saflastIImß (ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazanma Kiti - Zymo Research Corporation, Irvine, California) pEVE3157 omurgas ndan (Figure 21) olusmustur. Omurga ek olarak oda 8 Gaklig nda 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karls ml ikiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°Clde 10 dakika boyunca enzimler @Hile etkisiz hale getirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanilarak 37°C'de 1 saat boyunca fosforilden arndIÜmStI. Ligasyon, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 37) kullanilarak 2 saat boyunca oda sîtaklglida gerçeklestirilmistir. Ligasyon karßîniile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullandarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracillgiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmidler pEVE3322 ve pEVE3324 (Sekil 38), P. ohmeri fosforgliserat kinazU(poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland Tlößrrlih kontrolü altFrlda yanlida P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandIEßDmoRR) olan G. oxydans'mi NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîili ve E. coli"'nin NAD+-spesifik D- arabitol 4-0ksid0redüktazmiîi çift ifade yapßmiüveya P. ohmeri fosforgliserat kinazD (poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandIHSE ve poLEU2 seçim markörünün kontrolü aItIida yannda P. ohmeri' ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandlmßDmoRR) olan G. oxydansîi iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. acl/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazmIi üçlü ifade yapisiiü içerir. Örnek 21. P. ohmeri'de E. coli NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz geni ve G. oxydans NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ifadesine yönelik bütünleyici vektörlerin olusumu P. stipitis'in NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmîve E. Gol/"nin NAD+-spesifik D- arabitol 4-0ksidoredüktaz genini içeren bütünleyici vektörün yanErsma aynEZamanda G. oxydans'ml NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmijçeren plazmidler olusturulmustur. Bu amaçla G. oxydans'n bir veya iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazni ive E. Gol/"nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaani_içeren çift ve üçlü ifade kasetleri, Ndel ve Sacll enzimleri (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi arac Iig yla s ras yla pEVE3322 ve pEVE3324'ten (Sekil 38) sal nm stin. 4.1 kb ve 5.7 kb fragmanlar, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak jelle saflastIImSt] ve oda smakitgîiida 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karßînükiti (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°C'de 10 dakika boyunca enzimler :süle etkisiz hale getirilmistir. Vektör olarak jelle saflastIIan (ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti - Zymo Research Corporation, lrvine, California), 5.7 kb Sall- Iinearize pEVE2865 (Sekil 35) islevi görmüstür. Vektör omurgas ek olarak oda sicakliginda 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karis mi ikiti (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°Ctde 10 dakika boyunca enzimler is ile etkisiz hale getirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) kullanilarak 37°C'de 1 saat boyunca defosforilasyona tabi tutulmustur. Vektör ve dolgunun ligasyonu, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil 39) kullanilarak 2 saat boyunca oda sßakighda gerçeklestirilmistir. Ligasyon karßîniile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanitarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracuigiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya ç kan plazmidler pEVE3390 ve pEVE3392 (Sekil 40), P. ohmeri fosfogliserat kinazi i(poPGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonlandiriic nin kontrolü altinida yaninida bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotörü ve sonland rcisi i(poRR) olan G. oxydans'mi bir veya iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin ve E. co/i'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazlili çift veya üçlü ifade yapjlarmîiçerir. Seçim markörü olarak yanIida iki onP alanübulunan bir P. ohmeri LEU2 geni islevi görür. Örnek 2_2. 100 glLtden faz_la ksilitol salgtlayabilen ikinci ienerasvon bütünlevici suslarmi olusumu E. colinin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz geninin ve P. stipitis'in NADPH- spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin rastgele olarak entegre edilmis bir kopyasinil içeren birinci jenerasyon sus CNCM I-4982, iki heterolog enzimin ilave kopyalarîlm entegre etmek üzere kullan Tm Stm. Ancak yapmam üzerine entegre edebilmek amacwla LEU2 seçim markörünün uzaklastltlrnasîgerekir. Bu amaçla birinci jenerasyon sus CNCM I-4982, Örnek 12'de açIslanan prosedüre göre vektör pEVE3163 ile dönüstürülmüstür. Vektör pEVE3163. yanlida P. ohmeri' ribuloz redüktaz promotör ve sonlandlm: (poRR) bulunan bakteriyofaj P1'in (Tablo 7'ye göre optimize edilen kodon) CRE rekombinazmîiçerir. LEU2 seçim markörünün uzaklastmumasu Iösin olmadan plakalar üzerinde sLÜJ: klon büyümesi ile dogrulanmistm. Ortaya çikan sus EY83842, Örnek 12'de açklanan prosedüre göre 37°C'de 3 saat boyunca Notl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasha tabi tutulan pEVE3390 veya pEVE3392 (Sekil 40) ile dönüstürülmüstür. Dönüstürülenler, herhangi bir Iösin olmadan sorbitol plakalarü üzerinde seçilmistir. Ortaya çERan ikinci jenerasyon sus EYS3929, E. coli'nin iki NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaz genini ve biri G. oxydans'tan ve ikincisi genoma rastgele bir sekilde entegre edilen P. stipiti's'ten olmak üzere iki NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genini içerir. Diger taraftan sus EYS3930, G. oxydans'Ii ilave bir NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genini içerir. Örnek 23. E. colfnin NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazi Ne G. oxydans'mi NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaznLm ek qen kopyalarnmi entegrasyonuna yönelik kullanilan diger bir vektörün olusumu Diger bir entegrasyon vektörünü olusturmak amacgla E. coli"nin NAD+-spesifik D- arabitol 4-oksidoredüktazîim ve G. oxydans'li NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîin bir çift ifade kasti, asagmlakiler kullanilarak PCR taraflidan amplifiye edilmistir: - Smal alanLi içeren primer EV4904 (ATATCCCGGGCACCGTCATCACCGAAACGC) (SEQ ID No 40) ve . bir Smal alan . (alt. çizili) içeren primer EV4905 (ATATCCCGGGCACGACCACGCTGATGAGC) (SEQ ID No 41) ve sablon olarak pEVE3321. Amplifikasyon 1X tampon içinde 0.02 U/ul iProofTM polimeraz (BIO-RAD, Hercules, California) ile her bir dNTP'nin 200 pM'si ve her bir primerin 0.5 uM'sinden olusan bir reaksiyon karßînîiçinde gerçeklestirilmistir. PCR, 98°C'de 30 saniyelik bir baslangic denatürasyon admtiakabinde 98°Clde 10 saniye / 68°Clde 10 saniye / 72°C'de 75 saniye ile 30 döngü ve 72°C'de 5 dakikalEK bir nihai genlesme adiI'n: ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünü %1 bir agaroz jel üzerinde ayrimStm, özütlenmistir ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanim Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullan larak saflast r Im st r. Amplifiye edilmis 3.9 kb uzunlugundaki fragman, Smal (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasWta tabi tutulmustur ve T4 DNA IigazFl(New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) (Sekil 41) kullanilarak 2 saat boyunca oda sßaklghda pEVE2865'in (Sekil 35) 4.4 kb Pvull (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) linearize edilmis, Antarktik fosforataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) fosforilden armditlrnß ve jelle saflastIJTnîs vektör omurgasna baglanmßtl. Ligasyon karßînîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Clara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araclllglyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çEEan plazmidler pEVE4390 (Sekil 42), P. ohmeri fosfogliserat kinazEl(p0PGK1) promotörü ve transketolaz (poTKL) sonland IEÜtiIi kontrolü altlida E. coli'nin NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazliît ve yanmda bir P. ohmeri ribuloz redüktaz promotör ve sonlandmmß: (poRR) olan G. oxydans'li NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin çift ifade yapßliüiçerir. Seçim markörü olarak yanmda iki loxP alani bulunan bir P. ohmeri LEU2 geni islevi görür. Örnek 24. G. oxydansin NADPH-spesifik ksilitol dehidroienaz ve R. solanacearumiun NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz nin entegrasyonuna yönelik kullanilan bir vektörün olusumu G. oxydans'îti NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazmiîi ve R. solanacearum'un NAD+- spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazIiIi entegrasyonuna yönelik ilave bir bütünleyici vektörü, asaglaki gibi olusturulmustur: Birinci bir adinda yukarmlaki iki geni içeren bir çift ifade vektörü olusturulmustur. Bu çift ifade kaseti, bir bütünleyici onP vektöründe klonlanmßtî. Ra/stonia solanacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksid0redüktaz genini kodlayan bir DNA fragmani,i dizi SEQ ID No 42"nin verilen dizisine göre GeneArt® Gene Synthesis (Life Technologies, Regensburg, Almanya) tarafindan kimyasal olarak sentezlenmistir. daID genine yönelik kodlama yapanAL646052.1 dizisinin (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL646052 sitesinden elde edilmistir) nükleotidler 2310548 ila 2309151, sablon olarak kullanmnßtl ve http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/ sitesinden elde edilen Optimizer programü kullanmarak Tablo Tye (yukarmla) göre P. ohmeri' ATCC 20209ida kullanîna yönelik kodon optimizasyonuna tabi tutulmustur. Ortaya çtRan dizinin 5' ve 3' uçlarîida, slaslýla restriksiyon enzimleri Ascl (GGCGCGCC) and Sphl'nin (GCATGC) tanmna alanlarna yönelik kodlama yapan nükleotidler daha fazla klonlamayükolaylastîmak amacLyla metin dosyasLnia manuel olarak eklenmistir. Ek olarak, bir adenozin üçlüsü mayalarlni Kozak-benzeri dizilerinde -3 pozisyonundaki bir adenozini açiklamak üzere baslangiç ATG'nin önüne eklenmistir. Son dizi (SEQ ID No 42) akabinde GeneArt'a (Regensburg, Almanya) senteze yönelik verilmistir. daID genini kodlayan sentezlenmis DNA fragmanü bir pMA-RQ derive vektörde (13ABZEGP, Sekil 43) 5 ug Iiyofilize plazmid DNA olarak dagmümßtl. R. so/anacearum'dan'dan D-arabitol 4-oksidoredüktazli 1.4 kb fragmanDAscl ve Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmas na tabi tutulan ve ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) ile jelle saflastinilan vektör 13ABZEGP'den (Sekil 43) salinmist r. Dolgu akabinde Ascl ve Sphl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile Iinearize edilen ve T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 44) kullanilarak jelle saflastmiian pEVE2560'm (Sekil 8) 11.8 kb omurgasýile baglanmßtl. Ligasyon karßîhîile XL10 Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanilarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araciligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmid pEVE3898 (Sekil 45) yan nda P. ohmeri"nin bir ribuloz redüktaz promotörü ve sonlandrcisi ive poLEU2 seçim markörü bulunan kodon-optimizeli R. soianacearum NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktazi içerir. Bir sonraki ad mida yanmda fosfogliserat kinaz promotörü (poPGK) ve ribuloz redüktaz sonlandmmümoRR) bulunan G. oxydans'mi NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiü içeren ifade kaseti, Spel ve Sacll (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmas: aracjggrla pEVE3960'tan salmmßtl. 1.8 kb fragman, ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanm1 Kiti (Zymo Research Corporation, lrvine, California) kullanttarak jelle saflastlimnßt ve 15 dakika boyunca oda smakltgîîida Küntlesme Enzim KarîsEhD kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler su ile etkisizlestirilmistir. Vektör olarak jelle saflastrlms (ZymocleanTM Jel DNA Geri Kazanma Kiti - Zymo Research Corporation, lrvine, California), 13.2 kb Sali-Iinearize pEVE3898 islevi görmüstür. Vektör omurgasi iek olarak oda sicakliginda 15 dakika boyunca Küntlesme Enzim Karsmii kiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlesmistir akabinde 70°C'de 10 dakika boyunca enzimler @Dile etkisiz hale getirilmistir ve Antarktik fosfataz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanttarak 37°C'de 1 saat boyunca defosforilasyona tabi tutulmustur. Vektör ve dolgunun Iigasyonu, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Sekil 44) kullanffarak 2 saat boyunca oda sîzaklgnda gerçeklestirilmistir. Ligasyon karistm ile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyT'V' Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanffarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) aracmgiýla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çIsan plazmid pEVE4077 (Sekil 46), P. ohmeri ribuloz redüktaz promotör ve (poRR) sonlandmßßîve poLEU2 seçim markörünün kontrolü altnda yanlida bir P. ohmeri fosforgliserat kinaz promotörü (poPGK) ve bir ribuloz redüktaz sonlandlmü (poRR) bulunan G. oxydans'Ii NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaznîi ve R. so/anacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaaniLni çift ifade yapsLmU içerir. Son olarak G. oxydans' n NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazlni n ve R. soianacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksidoredüktazlmm çift ifade kaseti, Sapl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon kesimi arachgyla pEVE4077'den (Sekil 46) sallimßtl. 5.9 kb fragman, ZymocleanT'VI Jel DNA Geri Kazanmn Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanIarak jelle saflastllm'nßt ve 15 dakika boyunca oda smaklglida Küntlesme Enzim Karßînîkiti (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile küntlestirilmistir, akabinde 10 dakika boyunca 70°C'de enzimler :sü ile etkisizlestirilmistir. Vektör olarak jelle saflastlflmß (ZymocleanT'V' Jel DNA Geri Kazanma Kiti - Zymo Research Corporation, Irvine, California), Antarktik fosfataz (New England Biolabs, I pswich, Massachusetts) ile 37°Cide 1 saat boyunca fosforilden aanidLnuan, 4.4 kb EcoRV-Iinearize pEVE2865 (Sekil 35) islevi görmüstür. Vektör ve dolgunun ligasyonu, T4 DNA Iigaz (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) kullanllarak 2 saat boyunca oda scakllg nda gerçeklestirilmistir (Sekil 44). Ligasyon karßînîile XL1O Gold ultrakompetent hücrelerin (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) transformasyonu akabinde plazmid DNA, ZyppyTM Plazmid Miniprep Kiti (Zymo Research Corporation, Irvine, California) kullanitarak izole edilmistir ve restriksiyon parçalama ve dizileme (Microsynth, Balgach, Isviçre) araciligiyla daha fazla karakterize edilmistir. Ortaya çikan plazmid pEVE4377 (Sekil 47), G. oxydans'ini NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenazîiîri ve R. solanacearum'un NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktazmm çift ifade yapýsmiýve yanFriida iki onP alan *bulunan poLEU2 seçim markörünü içerir. Örnek 25. Ksilitolün artan verimliligi ile üçüncü ienerasvon bütünlevici suslarli olusumu Ikinci jenerasyon suslarDEY83929 ve EY83930'un LEU2 markörü (Örnek 22), vektör pEVE3163 kullanuarak Örnek 18'de açklandgLIgibi çkarim'stm. Ortaya çkan suslar EYS4118 ve EYS4119, sinas yla pEVE4377 (Sekil 47) ve pEVE4390 (Sekil 42) ile dönüstürülmüstür. Vektörler, Örnek 12'de açiklanan prosedüre göre 37°Cide 3 saat boyunca Notl (New England Biolabs, lpswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasna tabi tutulmustur. Dönüstürülenler, herhangi bir Iösin olmadan sorbitol plakalarrüzerinde seçilmistir. Ortaya çikan üçüncü jenerasyon sus EYS4353, ikisi E. coli'den ve biri R. solanacearum'dan olmak üzere üç NAD+-spesifik D-arabitol 4-oksidoredüktaz genini ve ikisi G. oxydans'tan ve biri genoma rastgele bir sekilde entegre edilen P. stipitis'ten olmak üzere üç NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genini içerir. Diger taraftan ikinci üçüncü jenerasyon sus, E. co/i'nin NAD+-spesifik D-arabitol 4- oksidoredüktaanLni üç kopyasmi; G. oxydans'Lni NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz nin üç kopyasini ive P. stipi'tis'ten bir kopyayi iiçerir ve I-4960 sayisi alt nda Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu] of the Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15 ile 5 Mart 2015'te Fransaida tevdi edilmistir. Örnek 26. Dördüncü ienerasvon bütünlevici suslarlîii olusumu Üçüncü jenerasyon suslar CNCM I-4960'Ii (Örnek 25) LEU2 markörü, vektör pEVE3163 kullanilarak Örnek 18'de açiklandig gibi çikarilmistin. Ortaya çikan sus EYS4955, Örnek 12'de açUstlanan prosedüre göre 37°C'de 3 saat boyunca Notl (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) ile restriksiyon parçalanmasinia tabi tutulan pEVE4377 (Sekil 47) ile dönüstürülmüstür. Dönüstürülenler, herhangi bir Iösin olmadan sorbitol plakalarFüzerinde seçilmistir. Ortaya çikan dördüncü jenerasyon sus, üçü E. Gol/,den ve biri R. solanacearum'dan olmak üzere dört NAD+-spesifik D-arabitol 4-0ksid0redüktaz genini ve üçü G. oxydans'tan ve biri genoma rastgele bir sekilde entegre edilen P. stipi'tis'ten olmak üzere dört NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz genini içerir ve I-4981 sayîsüaltîîda Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu] of the Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Cedex 15 ile 20 MayLs 2015ite Fransa'da tevdi edilmistir. Örnek 27. Pichi'a ohmeri suslari (sentetik ortam) ile poliol üretimi. Yukarida açiklandigi Iüzere olusturulan maya suslari ICNCM I-4605, CNCM I-4982, CNCM I-4960 & CNCM I-4981, asagdaki protokole göre fermente edilmistir. Fermentasyon prosesi, Nitrojen-sîillilamasDaltda gerçeklestirilmistir ve bir büyüme faz: ve bir üretme fazîia ayrmabilir. Büyüme faz: smaslida ortamdaki amonyak, biyokütleyi üretmek üzere tamamen tüketilir, biyokütle olusumu durdugunda üretim fazEi baslar ve Poliol seviyesi artar. Açmlanan fermentasyon prosesine yönelik kullanman platform, 1 L'lik bir çalßma hacmi olan hazneler kullanmarak INFORS HT'den bir Multifors 2 olmustur. Fermentörler, iki Rushton aItEbîsakl :disk türbinler ile donatilinßtiî. Hava, fermentörleri dag Imaya yönelik kullantlrnstî. Scakl k, pH, çalkalama ve havalandinma hizi,i yetistirme boyunca kontrol edilmistir. Scakl k, 36°C'de muhafaza edilmistir. pH, otomatik olarak 5M KOH eklenerek 3'te tutulmustur. Havalandlma ha: 1.0 vvm'de tutulmustur ve baslangß karßtlmühâ: 300 rpm'ye ayarlanmßtl. Çözünen Oksijenin (DO) %20'nin altIJa düsmesini önlemek amacgrla bir otomatik karßtmma kaskad :kullanmnßtß Fermentasyon prosesinde kullanman çalîsma kosullar: Tablo 10`da kßaca açERIan I. Tablo 10: Poliol üretim fermentasyonlarna yönelik çalßma kosullar: Parametre Ayar-noktasü S vl hacmi [L] 1 S cakl k [°C] 36 pH 3 Çalklama hîjrpm] Baslangßt olarak 300, akabinde DO ayar noktas :(%20) kontrollü karßtîmîkaskad Hava akS hüjvvm] 1 Fermentörlerin inokülasyonuna yönelik 1-asamall lpropagasyon kültürü kullanilmistln. Kullan lan propagasyon kültür ortamlniln bilesimi, tablo 11'de aç klanln. Propagasyon kültürleri, 4 bölmesi (girinti) olan 500-ml çalkalama balonunda 100 ml ortam inoküle edilerek hazIIanmîstm. Çalkalama balonlar: 30°C'de ve 150 rpm'de bir çalkalama tablaslnda inkübe edilmistir. Hücreler, orta-üssel fazda ~24 saat boyunca yetistirilmistir. Tablo 11: Propagasyon kültür ortamEbiIesimi. Ham madde Konsatrasyon [g/L] Glukoz monohidrat C6H1206*H20 46 Köpük önleyici Erol 18 1 damla Potasyum dihidrojenfosfat KH2PO4 6 Magnezyum sülfat heptahidrat MgSO4*7HZO 2.4 Amonyum sülfat (NH4)2804 0.16 Demir(ll) amonyum sülfat hekzahidrat Fe(SO4)2(NH4)2*6H20 0.012 Manganez (Il) sülfat monohidrat MnSO4*H20 0.0007 Çinko sülfat heptahidrat ZnSO4*7H20 0.00007 Biyotin C10H15N2038 0.0004 Sodyum fosfat NagHPO4 0.292 Sitrik asit monohidrat CGH807*H20 0.835 Inokülasyondan önce inokulumun miktarlTlia esdeger olan fermentör içindeki ortami-ni bir miktarîuzaklastltlîrnîstî ve propagasyon kültürünün bir alikuotu, fermentörün 1 L'Iik nihai hacme ve OD600 yaklasti& 0.2`de (CDW yaklasER 0.03 g/L) inokülasyonuna yönelik kullanilm str. Fermentörde kullan'lan ortamini bilesimi, tablo 12'de açklanln. Tablo 12: Fermantasyon ortam bilesimi. Ham madde Konsatrasyon [glL] Glukoz monohidrat C5H1208*H20 250 Köpük önleyici Erol 18 0.67 Potasyum dihidrojenfosfat KH2P04 6 Magnezyum sülfat heptahidrat MgSO4*7H20 2.4 Amonyum sülfat (NH4)ZSO4 4 Demir(ll) amonyum sülfat hekzahidrat Fe(SO4)2(NH4)2*6H20 0.012 Manganez (II) sülfat monohidrat MnSO4*H20 0.0007 Çinko sülfat heptahidrat ZnSO4*7H2O 0.00007 Biyotin C10H16N2038 0.0004 Numuneler, düzenli araIJ'slarda almmßtî ve toplam fermentasyon suyu, Glukoz tüketimine ve ekstrasülüler Poliol (Ksilitol, Arabitol ve Ribitol) olusumuna yönelik analiz edilmistir. Aeroa yaygn fermentasyon metabolitleri (Gliserol, Asetat, Etanol, Piruvat, Malat, Fumarat & Süksinat) belirlenmistir. Bir taraftan biyokütledeki arta ODSOO taraf'ndan ve diger taraftan hücre kuru aginllg I(CDW) belirlemesi taraf ndan takip edilmistir. Yukarida bahsedilen ölçümler, Poliol üretimi, Arabitol veya Ksilitol verimini ve verimliligi belirlemek üzere kullanilmßtl'rl; sonuçlar, tablo 13'te gösterilir. Tablo 13: Pichia ohmeri suslar7(sentetik ortam) ile poliol üretimi. CNCM I- CNCM I-4982 CNCM I- CNCM I- 4605 4960 4981 Geçen Fermentasyon süresi 67 79 146 64 66 (EFT) [saat] Glukoz [glL] 0 0 0 0 0 Arabitol [glL] 118 74 Ribitol [glL] 0 6 2 7 5 Ksilitol [glL] 0 28 60 110 120 Arabitol Verimi [%1 52 - - - - Ksilitol Verimi [%1 - 12 26 44 48 Verimlilik [glL/saat] 1.76 0.35 0.41 1.71 1.81 Pichi'a ohmeri CNCM l-4605, sadece arabitol üretir. Piohia ohmeri CNCM l-4982, arabitol, ksilitol ve ribitol üretir. Bu susta NAD+- D-arabitol 4-oksidoredüktaz geninin bir kopyasüve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaz geninin bir kopyasîentegre edilmistir. Modifiye edilen sus bu noktada arabitol tüketebilir. Sonuç olarak glukozun toplam tüketiminden sonra arabitol ve ribitol, daha fazla ksilitol üretmek üzere CNCM I-4982 tarafndan yeniden tüketilir. Pichia ohmeri' CNCM I-4960 (üçüncü jenerasyon) ve CNCM I-4981 (dördüncü jenerasyon), ksilitol ve ribitol üretir ancak daha fazla arabitol üretmez. Ksilüloz ve ksilitol içinde arabitolün intraselüler dönüsüm, arabitolün suyun içine atianhLm_önlemek üzere yeterlidir. NAD+-spesifik D-arabitol oksidoredüktaza ve NADPH-spesifik ksilitol dehidrojenaza yönelik kodlama yapan genlerin ne kadar fazla kopyasmiTi P. ohmeri"ye eklenmesi halinde ksilitolün titresi, verimi ve verimliligi o kadar yüksek olur. TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2019/09794T 2014-06-18 2015-06-17 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi. TR201909794T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14305934.3A EP2957640B1 (en) 2014-06-18 2014-06-18 Production of xylitol from glucose by a recombinant strain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201909794T4 true TR201909794T4 (tr) 2019-07-22

Family

ID=50981446

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08404T TR201808404T4 (tr) 2014-06-18 2014-06-18 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.
TR2019/09794T TR201909794T4 (tr) 2014-06-18 2015-06-17 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08404T TR201808404T4 (tr) 2014-06-18 2014-06-18 Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10494614B2 (tr)
EP (2) EP2957640B1 (tr)
JP (1) JP6537534B2 (tr)
KR (1) KR102496301B1 (tr)
CN (1) CN106661540B (tr)
CA (1) CA2952709C (tr)
DK (2) DK2957640T3 (tr)
ES (2) ES2673865T3 (tr)
MX (2) MX374308B (tr)
PL (2) PL2957640T3 (tr)
RU (1) RU2693593C2 (tr)
SG (1) SG11201610417XA (tr)
TR (2) TR201808404T4 (tr)
WO (1) WO2015193350A1 (tr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
EP2957640B1 (en) * 2014-06-18 2018-03-14 Roquette Freres Production of xylitol from glucose by a recombinant strain
CN108977432B (zh) * 2018-07-27 2021-04-06 浙江工业大学 重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用
CN114929870B (zh) * 2019-12-18 2024-04-30 埃沃尔瓦公司 宿主细胞及其用于产生核糖醇和其他单糖的用途
CN113025516A (zh) 2020-12-28 2021-06-25 浙江华康药业股份有限公司 一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法
CN113151367A (zh) * 2021-05-10 2021-07-23 湖北工业大学 一种自我保护的鲁氏结合酵母从头合成木糖醇的发酵方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4008285A (en) 1974-04-22 1977-02-15 Melaja Asko J Process for making xylitol
US4075406A (en) 1974-04-22 1978-02-21 Suomen Sokeri Osakeyhtio Process for making xylose
WO1990008193A1 (en) 1989-01-17 1990-07-26 Suomen Xyrofin Oy Method for the production of xylitol from mixtures containing xylose
FR2652589B1 (fr) 1989-10-04 1995-02-17 Roquette Freres Procede de fabrication de xylitol et de produits riches en xylitol.
ATE184917T1 (de) * 1992-11-05 1999-10-15 Xyrofin Oy Rekombinante methode und wirt zur herstellung von xylitol
FR2765589B1 (fr) 1997-07-03 1999-09-17 Roquette Freres Fragment d'adn comprenant le promoteur de la ribulose reductase nadph specifique de yamadazyma ohmeri, vecteur le contenant et procede de preparation de proteines utilisant ce vecteur
JPH11266888A (ja) * 1997-10-17 1999-10-05 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
FR2772788B1 (fr) 1997-12-19 2000-11-17 Roquette Freres Procede pour accroitre la production de certains polyols par une souche osmotolerante
JP2000295994A (ja) * 1999-02-09 2000-10-24 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
JP2001008682A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Ajinomoto Co Inc Ｄ−アラビトール、ｄ−キシルロース及びキシリトールの製造法
EP1075795B1 (en) * 1999-08-10 2003-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing xylitol of high purity
EP1254244B1 (en) * 2000-01-21 2010-04-14 Danisco A/S Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
JP4453869B2 (ja) * 2004-06-25 2010-04-21 信和化工株式会社 変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ酵素、これを産生する微生物、該酵素または微生物を用いたキシリトールをキシルロースに変換する方法
JP5219074B2 (ja) * 2008-01-24 2013-06-26 独立行政法人産業技術総合研究所 キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
KR101175418B1 (ko) * 2009-11-30 2012-08-20 전남대학교산학협력단 신규한 자일리톨 탈수소효소 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
CN101880643B (zh) * 2010-06-03 2012-04-25 南京工业大学 氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
CN102796797B (zh) * 2012-08-09 2014-07-09 山东天力药业有限公司 微生物转化葡萄糖制备木糖醇及其中间体d-木酮糖的方法及所用的菌种
EP2957640B1 (en) * 2014-06-18 2018-03-14 Roquette Freres Production of xylitol from glucose by a recombinant strain

Also Published As

Publication number Publication date
CN106661540B (zh) 2021-02-09
MX2020002674A (es) 2020-07-22
DK2957640T3 (en) 2018-06-25
EP3158074A1 (en) 2017-04-26
CA2952709C (en) 2022-11-08
US10494614B2 (en) 2019-12-03
CN106661540A (zh) 2017-05-10
RU2017101446A3 (tr) 2018-10-26
JP2017518066A (ja) 2017-07-06
EP2957640B1 (en) 2018-03-14
TR201808404T4 (tr) 2018-07-23
BR112016029704A2 (pt) 2017-10-24
RU2693593C2 (ru) 2019-07-03
MX374308B (es) 2025-03-06
KR102496301B1 (ko) 2023-02-07
EP3158074B1 (en) 2019-04-24
ES2673865T3 (es) 2018-06-26
CA2952709A1 (en) 2015-12-23
PL3158074T3 (pl) 2019-10-31
US20200032224A1 (en) 2020-01-30
US20170130209A1 (en) 2017-05-11
MX2016016923A (es) 2017-04-27
JP6537534B2 (ja) 2019-07-03
RU2017101446A (ru) 2018-07-18
KR20170020362A (ko) 2017-02-22
ES2733650T3 (es) 2019-12-02
PL2957640T3 (pl) 2018-09-28
EP2957640A1 (en) 2015-12-23
SG11201610417XA (en) 2017-01-27
DK3158074T3 (da) 2019-07-22
WO2015193350A1 (en) 2015-12-23
US10829742B2 (en) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201909794T4 (tr) Bir rekombinant suş aracılığıyla glikozdan ksilitol üretimi.
ES2620770T3 (es) Proceso de fermentación que emplea células de levadura que tienen una ruta alterada desde dihidroxiacetona fosfato hasta glicerol
US7109010B2 (en) Methods and materials for the synthesis of organic products
JP2001516584A (ja) 乳酸生産のための酵母菌株
MX2013005778A (es) Ingenieria del bacillus coagulans termotolerante para la produccion de acido d(-)-lactico.
JP5649119B2 (ja) シロ−イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ−イノシトール製造方法
HU219016B (hu) Rekombináns eljárás és gazdasejt xilitol előállítására
JP5320692B2 (ja) 酵母及びｌ−乳酸の製造方法
CA3083840A1 (fr) Bacterie genetiquement modifiee pour produire du lactate a partir de co2
US20070026104A1 (en) Alcohol dehydrogenase gene of acetic acid bacterium
JP2014207885A (ja) 遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム
JP2006006271A (ja) 乳酸生産酵母および乳酸生産方法
JP2006296377A (ja) 有機酸生産用形質転換体
JP5858463B2 (ja) 乳酸生産菌
BR112016029704B1 (pt) Produção de xilitol a partir de glicose por uma cepa recombinante
JP2006246701A (ja) 中央代謝系の酵素活性が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2006230329A (ja) 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP6012371B2 (ja) ４−ヒドロキシ−２−ブタノンまたはブタノールの製造方法
JP2005040079A (ja) 酢酸菌のグルタチオン依存型ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子、高度な酢酸耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法
JP2005013105A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2005013113A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2005040098A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子
JP2005046071A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子