CA3125830A1 - Procede de purification de phycocyanines - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de phycocyanines produites par fermentation de microalgues, en particulier produites par Galdieria sulphuraria, qui comprend une dégradation enzymatique du glycogène.
Description
PROCÉDÉ DE PURIFICATION DE PHYCOCYANINES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de phycocyanines produites par fermentation de microalgues, en particulier produites par Galdieria sulphura ria, qui comprend une dégradation enzymatique du glycogène.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La purification de phycobiliprotéines extraites de Galdieria sulphuraria et de Spiruline par précipitation au sulfate d'ammonium a déjà été décrite dans la littérature (Moon et al., 2015 ; Cruz de Jesùs et al., 2006) mais elle est très difficilement applicable à l'échelle industrielle car elle demande beaucoup de sulfate d'ammonium, ce qui pose de gros problèmes de retraitement du sulfate d'ammonium et du surnageant.
Les autres méthodes de purification décrites permettant d'obtenir un taux de pureté
telles que des méthodes de chromatographie sont très couteuses à mettre en uvre.
Les procédés d'extraction des phycocyanines consistent généralement à faire précipiter les matières organiques autres que les phycocyanines présentes dans un extrait brut aqueux issu d'une fermentation de microalgues pour conserver les phycocyanines dans le surnageant qui sera filtré avant de faire précipiter les phycocyanines. Toutefois, certains composés organiques, notamment des polysaccharides complexes comme le glycogène, restent insensible à cette précipitation.
Dans un procédé industriel de purification de la phycocyanine, on peut employer une étape par filtration (ultrafiltration) pour éliminer l'eau afin de concentrer la phycocyanine et éliminer des petites molécules (protéines, ions, acide organique...) dont la taille est inférieure au seuil de coupure du filtre utilisé, pour obtenir une phycocyanine la plus pure possible. Toutefois, le seuil de coupure du filtre étant inférieur à la taille du glycogène celui-ci n'est pas éliminé et augmente la viscosité du rétentat, limitant la mise en uvre de filtration et le maintien des paramètres optimaux de celle-ci. L'effet viscosant du glycogène en fonction de sa concentration a été démontré à partir de glycogène purifié
de Galdieria sulphuraria (Martinez-Garcia et al., 2017).
De plus les phycocyanines purifiées obtenues conservent des taux élevés de ces sucres qui peuvent altérer les propriétés de celles-ci et des produits purifiés, notamment le pouvoir colorant, nécessitant une quantité de phycocyanines accrue pour un même rendu visuel. Ces polysaccharides résiduels se comportent comme une charge qui vient renchérir les coûts de fabrication de la phycocyanine et peut limiter les usages commerciaux de la phycocyanine obtenue, par exemple pour la préparation d'aliments qui ont une faible teneur en sucres. La présence de polysaccharides résiduels peut limiter l'usage du produit à
l'élaboration de produit alimentaire de faible teneur en sucres entrainant ainsi un surcoût à
l'élimination de ces dit sucres.
wo 2020/144330 2 PCT/EP2020/050547 Le glycogène est un sucre complexe, difficile à éliminer si l'on cherche à
préserver la phycocyanine des conditions usuelles de dégradation du sucre. Le glycogène est un polyglucoside branché constitué de chaines glucosidiques a (1-4) ramifiés par des liaisons a (1-6).
On connait l'utilisation d'enzymes pour la lyse cellulaire dans un procédé
d'extraction de phycocyanine à partir d'une culture de microorganismes (ON 106749633, et 0N1117973). Cette étape de lyse cellulaire, de rupture de la paroi cellulaire pour la libération des phycocyanines, suivie par l'extraction de la phycocyanine libérée dans le milieu, n'a pas d'action significative sur le glycogène libéré avec la phycocyanine et extrait avec cette dernière.
Il est possible de mettre en uvre une dégradation enzymatique du glycogène.
Toutefois, ce polysaccharide est un polymère partiellement résistant aux enzymes susceptibles de le dégrader. Du fait du nombre particulièrement important de ramification par liaison a1-6 glucosidique, l'utilisation d'enzymes telle que les [3 -amylase (a1-4 glucosidase) est inapproprié comme le montrent Martinez-Garcia & al. Ces auteurs montrent une activité relativement limitée d'une a-amylase (al -4 glucosidase) pancréatique sur le glycogène. La mesure de sucre réducteur, représentant le niveau de digestion, reste faible et sature rapidement. L'utilisation d'enzyme à activité al-6 glucosidase (isoamylase, pullulanase) pour débrancher le glycogène est possible comme le montrent les travaux de Martinez-Garcia et al. ou ceux de Shimonaga et al. . Mais encore une fois, les digestions sont incomplètes en libérant des polymères de glucose après des durées importantes de digestion (24 à 48 heures).
Ces expériences de digestion du glycogène rapportées dans l'état de la technique n'ont pas intégré la problématique de préservation de la phycocyanine alors que les enzymes employées peuvent affecter l'intégrité de la phycocyanine, altérant ainsi ses propriétés colorantes et anti-oxydantes.
On cherche donc à améliorer les procédés de purification des phycocyanines extraites d'une biomasse, tant d'un point de vue qualitatif, que d'un point de vue industriel et économique en diminuant la teneur résiduelle en sucres dans le produit final, en particulier la teneur résiduelle en glycogène tout en préservant les propriétés de la phycocyanine.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le procédé selon l'invention consiste à effectuer un traitement enzymatique de la solution de phycocyanine pour diminuer la teneur en glycogène avec une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène dans des conditions de température et de pH qui ne dégradent pas de manière substantielle les phycocyanines présentes, c'est-à-dire des enzymes actives à un pH inférieur à 6 et une température de réaction inférieure à 40 C, comme les glucoamylases, les pectinases et les pullulanases et leurs mélanges.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de phycobilliprotéines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria, la réaction enzymatique étant conduite à un pH inférieur à 6, avantageusement d'environ 4.
L'invention concerne également un extrait de phycocyanines avec un rapport glycogène/phycocyanines (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente les courbes de perte de phycocyanine (%) au cours du temps pour une digestion pH = 4 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 2 représente les courbes de perte de phycocyanine (%) au cours du temps pour une digestion pH = 7 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 3 représente les courbes de libération de glucose suite à la digestion du glycogène au cours du temps pour une digestion pH = 4 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 4 représente les courbes de libération de glucose suite à la digestion du glycogène au cours du temps pour une digestion pH = 7 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 5 représente l'évolution du flux de perméat en fonction du temps pour la filtration d'un extrait de phycocyanine (C-PC) avec ou sans digestion enzymatique.
La Figure 6 représente une courbe de suivi de la digestion du glycogène à pH=4 pour différentes enzymes.
La Figure 7 représente une courbe de suivi de la digestion du glycogène à pH=7 pour différentes enzymes.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé de purification de phycocyanines à partir d'une solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène, lequel comprend une étape de dégradation enzymatique du glycogène par une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène dans des conditions de température et de pH qui ne dégradent pas de manière substantielle les phycocyanines présentes et une étape de séparation des phycocyanines des produits de dégradation du glycogène.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification d'une solution de phycocyanine extraite d'une culture de microorganisme producteur de phycocyanines qui produit également du glycogène, en particulier dans le cadre d'un procédé industriel de production de phycocyanine qui comprend la culture des microorganismes, puis la récupération de la biomasse produite pour extraire la phycocyanine, et la récupération de la phycocyanine à partir de cette biomasse.
wo 2020/144330 PCT/EP2020/050547 Le procédé est particulièrement adapté pour les phycocyanines produites par des microorganismes qui produisent de fortes teneurs de glycogène, en particulier pour l'extraction et la purification des phycocyanines à partir d'une biomasse qui comprend plus de 10% de glycogène par rapport à la totalité de la matière sèche.
Des microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus, notamment les algues (ou microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarum, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria. On citera en particulier la souche Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium (UTEX 2919).
On citera aussi des producteurs connus de phycocyanines comme les cyanobactéries filamenteuses du genre Arthrospira, cultivées industriellement sous le nom commun de spiruline.
Les microorganismes qui produisent de la phycocyanine avec une teneur élevée en glycogènes sont plus particulièrement identifiés parmi les microorganismes cités précédemment, en particulier les espèces des genres Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, plus particulièrement Galdieria sulphuraria.
Le glycogène est un polysaccharide très largement présent dans la nature chez une diversité d'organismes (bactérie, levure, cellule animale, ...). Si la structure de polymère de glucose par liaison al-4 ramifié par liaison a1-6 est commune, la différence vient du pourcentage et de la distribution des ramifications. On entend en particulier par glycogène au sens de la présente invention le polymère de glucose présent chez les organismes producteurs de phycocyanines précédemment cités dont la particularité est une taille de ramification majoritaire inférieure à 10 unités de glucoses comme l'illustrent les travaux de Martinez-Garcia et al..
Les procédés industriels de culture de microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus de l'homme du métier. On citera en particulier les demandes WO
2017/093345, WO 2017/050917 et WO 2018/178334.
La récupération de la phycocyanine à partir de la biomasse est également connue de l'homme du métier. On citera notamment la demande WO 2018/178334. Elle requiert généralement une étape de lyse cellulaire, mécanique ou enzymatique de manière à libérer la phycocyanine produite dans les compartiments cellulaires des microorganismes. Cette lyse cellulaire va généralement générer une solution de phycocyanine qui comprend des matières organiques en suspensions (appelée suspension brute) qui peuvent être séparées par des méthodes usuelles de séparation, en particulier de filtration, notamment de microfiltration, ou de centrifugation puis filtration, plus particulièrement par microfiltration.
On obtient alors une solution brute de phycocyanine qui peut faire l'objet d'une nouvelle purification de manière à éliminer des résidus organiques de faible poids moléculaire par des méthodes usuelles d'ultrafiltration pour obtenir une solution raffinée à
partir de laquelle on obtiendra la phycocyanine par des méthodes usuelles de précipitation et séchage. On citera notamment la filtration tangentielle sur membranes céramiques ou membranes organiques tel que les fibres creuses en polyéthersulfone ou polysulfone, notamment celles proposées par les sociétés Repligen. Les seuils de ces filtres peuvent être choisis pour séparer des molécules de poids moléculaire supérieur ou inférieur aux phycocyanines ciblées.
La phycocyanine obtenue peut être ensuite purifiée, notamment par une étape de diafiltration pour éliminer le plus possible les résidus organiques de faible poids moléculaire.
Le traitement enzymatique selon l'invention peut être mis en uvre tant sur la suspension brute que sur la solution brute.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de solution de phycocyanines résistantes à des pH acides, en particulier les phycocyanines décrites dans la demande WO 2017/050918.
En particulier, le procédé selon l'invention est mis en uvre pour la purification de phycocyanines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria, plus particulièrement dans un procédé de production industrielle de ces phycocyanines par culture en fermenteur de Galdieria sulphuraria.
Les conditions préférées de mise en uvre de la réaction enzymatique sont un pH
inférieur à 7 et une température de réaction inférieure à 60 C, de préférence inférieure à
50 C, encore plus préférentiellement inférieure à 30 C.
De manière avantageuse, la lyse enzymatique du glycogène est mise en uvre à
un pH inférieure ou égal à 5, de préférence d'environ 4,5.
De manière préférentielle la réaction enzymatique est mise en uvre à
température ambiante. Cette température ambiante correspond à la définition d'une mise en uvre en zone tempérée ou dans un local de température correspondante à une zone tempérée, c'est à dire allant de 18 à 28 C, plus généralement de 20 C à 25 C.
Ces conditions de température et de pH sont particulièrement adaptées pour préserver la phycocyanine au cours de la réaction enzymatique.
Des enzymes actives en conditions de pH acide et à température ambiante sont connues de l'homme du métier. Toutefois les conditions de digestion du glycogène dans le but de préserver la phycocyanine et de faciliter sa production ne sont pas connues.
De manière surprenante, il a été trouvé que des enzymes connues pour une activité
galactosiduronique al-4 ont aussi une activité glucosidase al-4 (ou alpha-glucosidase) dans des conditions de pH et de température compatibles avec la purification de la phycocyanine.
C'est le cas en particulier des pectinases connues pour dégrader la pectine et en particulier des pectinases extraites de champignons filamenteux comme Aspergillus, plus particulièrement de pectinases extraites d'Aspegillus aculeatus, comme les enzymes commercialisées sous la dénomination Pectinex0 par la société Novozymes.
L'action de ces enzymes diminue la taille des chaines glucosidiques qui peuvent alors être éliminées par ultrafiltration dans des conditions qui permettent de retenir les phycocyanines tout en laissant passer les fragments de glycogène.
Les inventeurs ont pu constater que ces conditions de lyse enzymatique libèrent des chaines polyglucosidiques et peu de monomères de glucose et sont donc particulièrement adaptées pour éviter les contaminations par d'autres microorganismes, en particulier des organismes pathogènes pour l'homme ou l'animal, ce qui est indispensable lorsque la phycocyanine obtenue est employée comme colorant alimentaire.
Selon un mode particulier de réalisation, la lyse enzymatique du glycogène pourra également être réalisée avec une activité glucosidase al-6 en plus d'une activité
glucosidase al-4 ou d'une polygalacturonase.
L'enzyme employée dans le procédé peut alors être un mélange d'enzymes, une première enzyme ayant une activité glucosidase al-4 ou d'une polygalacturonase et une deuxième enzyme ayant une activité glucosidase al-6.
Des glucosidases al-6 actives dans les conditions de pH et de température exposées ci-dessus sont également connues de l'homme du métier. Il s'agit en particulier des pullulanases connues pour hydrolyser les liaisons glucosidiques al-6 de la pullulane, notamment connues pour supprimer les ramifications de l'amidon.
Il s'agit généralement d'enzymes extraites de bactéries, notamment des genres Bacillus. US 6,074,854, US 5,817,498 et WO 2009/075682 décrivent de telles pullulanases extraites de Bacillus deramificans ou de Bacillus acidopullulyticus. On connaît aussi des pullulanases disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations Promozyme D2 (Novozymes), Novozym 26062 (Novozymes) et Optimax L 1000 (DuPont-Genencor). On notera que des mélanges pullulanases/alpha-amylases sont décrits dans l'état de la technique, mais en particulier pour produire du sirop de glucose à
partir de l'amidon (US 2017/159090).
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme a à la fois une activité glucosidase al-4 et une activité glucosidase al-6.
C'est le cas en particulier des glucoamylases. Il s'agit également d'enzymes extraites wo 2020/144330 PCT/EP2020/050547 de microorganismes, notamment de levures ou de champignons, comme S.
diastaticus ou A. figer. De nombreuses glycoamylases sont connues de l'état de la technique, décrites dans la littérature et notamment des demandes de brevet comme WO 2019/036721.
Elles sont généralement employées dans des procédés de fermentation, soit pour la production d'alcools de consommation (bière, spiritueux) soit pour la fermentation de biomasse pour la production de bioéthanol. Elles sont également employées comme additifs de boulangerie ou comme compléments alimentaires. On connait des glucoamylases disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations Amylase AG
XXL
(Novozymes) ou Panzym AG XXL (Eaton).
De manière avantageuse, les enzymes employées dans le procédé selon l'invention sont des enzymes autorisées pour être employées dans l'industrie alimentaire.
La teneur optimale en enzymes employée dans cette étape de lyse du glycogène pourra être déterminée par l'homme du métier en fonction de l'activité des enzymes employées dans les conditions de température et de pH exposées précédemment.
Les concentrations en enzymes sont généralement de 0,0001% et 5%, préférentiellement 0,0025% et 1%, plus préférentiellement 0,005% et 0,5%, encore plus préférentiellement entre 0,01% et 0,25%, les pourcentages étant exprimés en volume de solution enzymatique par rapport au volume total de suspension brute ou de suspension brute.
Les solutions enzymatiques ont des concentrations en enzymes généralement allant de 100 à 20000 unités/ml, l'activité enzymatique étant celle communément attachée à ces enzymes, telles qu'identifiée par le fabriquant.
L'emploi de glucosidases al-6 permet de diminuer les quantités de glucosidase al-4 ou polygalacturonase employées. Les concentrations totales en enzymes (glucuronidase al-4 + glucosidases al-6) sont généralement de 0,0001% et 5%, préférentiellement 0,0025% et 1%, plus préférentiellement 0,005% et 0,5%, encore plus préférentiellement entre 0,01% et 0,25%, les pourcentages étant exprimés en volume de solution enzymatique par rapport au volume total de suspension brute ou de suspension brute.
Avec la glucosidase al-4 ou polygalacturonase seule ou en mélange avec la glucosidase al-6, ou avec l'enzyme à activité glucosidase al-4 et glucosidases al-6, la réaction est mise en uvre de manière avantageuse pendant moins de 48 h, de préférence moins de 24 h, plus préférentiellement de 5 h à 12h.
Pour le procédé selon l'invention et plus particulièrement pour l'étape de d'isolation par filtration tangentielle pour l'isolation de la phycocyanine, il n'est pas nécessaire d'obtenir une digestion totale du glycogène en monomère de glucose. Une digestion partielle du polysaccharide et sa réduction en oligomères de tailles inférieures au seuil de coupure de la filtration est suffisante pour éliminer le glycogène de la suspension ou bien de la solution de phycocyanine.
L'homme du métier saura déterminer le temps approprié pour réduire au mieux les quantités de glycogène en fonction de la teneur initiale en glycogène, la quantité d'enzymes employés et la pureté recherchée pour la phycocyanine produite.
La mise en uvre de la réduction du glycogène par digestion enzymatique peut être associée ou remplacée par l'usage de micro-organismes ayant la capacité de dégrader ce polysaccharide. L'homme du métier saura exploiter les capacités de ces micro-organismes à produire et sécréter dans l'extrait brut, des enzymes capables de digérer le glycogène, plus particulièrement les enzymes précédemment évoque. L'homme du métier saura sélectionner et exploiter les capacités de ces micro-organismes à métaboliser le glycogène ou les produits issus de la dégradation du polysaccharide. De manière avantageuse, l'homme du métier saura exploiter les capacités de ces micro-organisme à
limiter la croissance de micro-organismes indésirables ou pathogène notamment pas la synthèse de substance ayant une activité antimicrobienne.
Les conditions préférées de mise en uvre de la dégradation du glycogène ex vivo ou in vivo sont un pH inférieur à 7 et une température de réaction inférieure à 50 C, de préférence inférieure à 40 C, encore plus préférentiellement inférieure à 37 C.
De manière avantageuse, la dégradation du glycogène ex vivo ou in vivo est mise en uvre à un pH inférieure ou égal à 5, de préférence d'environ 4,5 ou 4.
De part leur caractéristique de croissance et de dégradation de polysaccharide les bactéries lactiques apparaissent particulièrement adaptées. Peuvent être cité
parmis elles, les bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Pediococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Atopobium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Melissococcus ou Bifidobacterium.
L'invention concerne également un extrait de phycocyanines avec un rapport glycogène/phycocyanine (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1.
Selon un premier mode de réalisation, cet extrait de phycocyanine est la suspension brute de phycocyanine obtenue après lyse enzymatique.
Cette suspension brute traitée également appelée suspension brute enzymée comprend en particulier la phycocyanine libérée après lyse cellulaire, des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène et le glycogène résiduel avec les insolubles résultants de la lyse cellulaire en suspension.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, l'extrait de phycocyanine est la solution brute de phycocyanine obtenue après séparation de la suspension brute et lyse enzymatique du glycogène, cette lyse ayant été mise en uvre avant ou après la séparation de la suspension brute, ou avant et après séparation (séparation de la suspension brute enzymée et/ou mise en uvre de la réaction enzymatique sur la solution brute).
Cette solution brute comprend en particulier la phycocyanine libérée après lyse cellulaire, des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène et le glycogène résiduel. Cette solution brute traitée, appelée également solution brute enzymée de phycocyanine comprend généralement de 0,1 à 10 g/L de phycocyanine, plus préférentiellement de 1 à 5 g/L.
Le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à
3, de préférence inférieur à 2,5.
La solution brute enzymée selon l'invention pourra éventuellement être concentrée par élimination d'une partie de l'eau selon les méthodes usuelles de la technique mises en uvre dans des conditions qui respectent substantiellement l'intégrité de la phycocyanine.
Dans ce cas, la teneur en phycocyanine d'une solution brute enzymée et concentrée sera avantageusement de 10 à 50 g/L.
Selon un autre mode de réalisation, l'extrait de phycocyanine est la phycocyanine isolée après extraction à partir de la solution brute enzymée selon les méthodes décrites plus haut.
Pour la phycocyanine isolée, le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à 2, de préférence inférieur à 1.
Selon un autre mode de réalisation, l'extrait de phycocyanine est la phycocyanine purifiée obtenu après purification de l'extrait isolé selon les méthodes décrites plus haut, notamment par diafiltration.
Pour la phycocyanine purifiée, le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à 1, de préférence inférieur à 0,1.
La Phycocyanine isolée comme la phycocyanine purifiée peuvent encore contenir des traces d'oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène.
La phycocyanine obtenue a un pouvoir colorant El 0 de 90 à 400, préférentiellement d'au moins 120, plus préférentiellement d'au moins 150.
Pour une solution brute enzymée, le pouvoir colorant El 0 est avantageusement de 90 à 110.
Pour la phycocyanine isolée, le pouvoir colorant El 0 est avantageusement de 150 à
210.
Pour la phycocyanine purifiée, le pouvoir colorant est avantageusement de 210 à 400.
L'invention concerne aussi un procédé de production d'une phycocyanine d'origine microbienne qui comprend les étapes de (a) culture de microorganismes producteurs de phycocyanine tels que décrits plus haut dans des conditions de culture permettant de produire un mout de fermentation comprenant plus de 30 g/L de matière sèche et au moins 4% de phycocyanine par rapport à la matière sèche, (b) lyse cellulaire pour libérer la phycocyanine produite et le glycogène pour obtenir une suspension brute telle que définie précédemment, (c) séparation de la suspension brute pour récupérer une solution brute comprenant la phycocyanine et le glycogène, puis optionnellement (d) isolation de la phycocyanine à partir de la solution brute, puis optionnellement, (e) purification de la phycocyanine isolée, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lyse enzymatique du glycogène avec les enzymes et dans les conditions définis précédemment ou une dégradation au moyen de micro-organisme, ladite lyse enzymatique étant mise en uvre sur la suspension brute et/ou sur la solution brute.
De manière avantageuse, la phycocyanine obtenue est une phycocyanine qui comprend moins de 50 % de glycogène.
Les procédés de culture sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/093345 et WO 2018/178334.
Ils permettent d'obtenir des mouts de fermentation de plus de 30 g/L de matière sèche, pouvant aller à plus de 100 g/L de matière sèche.
La teneur en phycocyanine d'au moins 4% peut le cas échéant atteindre plus de 10%
selon les conditions de fermentation et les souches cultivées.
L'homme du métier saura déterminer les conditions de culture en fonction de son objectif industriel de production de phycocyanine.
L'étape (c) de séparation est également connue et décrite dans l'état de la technique, notamment par des méthodes usuelles de filtration, comme la microfiltration, ou la centrifugation puis filtration, en particulier par microfiltration L'invention concerne également l'utilisation des phycocyanines obtenues comme colorants, en particulier comme colorants alimentaires. Elle concerne aussi des aliments, solides ou liquides, en particulier des boissons qui comprennent une phycocyanine à faible teneur en glycogène selon l'invention.
La phycocyanine utilisée comme colorant peut l'être sous forme de solution brute enzymée, de phycocyanine isolée ou de phycocyanine purifiée, telle que définie plus haut.
EXEMPLES
Exemple 1 ¨ Suivi de la concentration en C-PC avant et après lyse enzymatique Le suivi de la concentration en phycocyanine d'un extrait brut est réalisé au pH4 et pH7 avec différentes quantités d'enzyme pectinex . L'extrait brut de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria est produit selon le procédé décrit dans la demande WO
2018/178334. Pour ce suivi, l'enzyme et l'extrait brut de phycocyanine sont filtrés sur filtre 0.22pm. La digestion est réalisée à température ambiante. Pour chaque point de cinétique une lecture des absorbances utiles à la détermination de la concentration de la phycocyanine sont mesurées, parallèlement à une mesure de glucose après dénaturation de l'enzyme (95 C, 5 minutes) avec l'analyseur biochimique YSI2700.
Les résultats sont représentés sur les Figures 1 à 4.
Ces résultats montrent que la quantité de glycogène digérée varie entre les différentes conditions de pH et de concentration en enzyme. Un excès d'enzyme peut entrainer une dégradation de la phycocyanine.
On voit toutefois qu'a moins de 24 h de digestion à pH = 4 et 0,05% de pectinex on obtient une lyse importante du glycogène tout en limitant de manière substantielle la dégradation de la phycocyanine.
Exemple 2 ¨ Suivi du taux de digestion du glycogène dans une solution brute de phycocyanine Le suivi du taux de digestion du glycogène dans une solution brute est réalisé
au pH4 et pH7 avec différentes enzymes : alpha amylase (Ban 480L de la société
Novozymes), polygalacturonase (Pectinex Ultra SP-L de la société Novozymes) et glucoamylase (Amylase AG XXL de la société Novozymes).
La solution brute de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria est produit selon le procédé décrit dans la demande WO 2018/178334. Pour ce suivi, l'enzyme et la solution brute de phycocyanine sont filtrés sur filtre 0.22pm. La digestion est réalisée à température ambiante. Pour chaque point de cinétique est réalisée une mesure de glucose après dénaturation de l'enzyme (95 C, 5 minutes) avec l'analyseur biochimique Y5I2700. Le pourcentage de digestion du glycogène correspond au rapport de la concentration de glucose sur la concentration en glucose après hydrolyse totale du polysaccharide.
Les résultats sont représentés sur les Figures 6 (pH=4) et 7 (pH=7).
Exemple 3 ¨ Teneur en glycogène dans le produit purifié avec ou sans lyse enzymatique Une solution brute de phycocyanine, non traitée ou digérée 12H avec 0.25%
(v/v) de glucosidases al-6, puis 2H avec 0,1% (v/v) de polygalacturonase al-4 est filtrée sur une membrane fibre creuse ayant une porosité de 70kDa avec une étape finale de diafiltration.
Les différentes mesures réalisées en fin de chaque filtration et/ou étape de filtration montrent que la concentration en glycogène augmente de façon significative dans le rétentat jusqu'à atteindre des concentrations non négligeables par rapport à
la PC. Il est donc nécessaire d'éliminer tout ou une partie de ce glycogène pour éviter de diluer le pouvoir colorant du produit final, et un pouvoir colorant El compris entre à
90 et 400.
wo 2020/144330 12 PCT/EP2020/050547 La valeur de couleur E10 (10% E618nm) indique la densité de couleur qui est mesurée à 618 nm après avoir dissous une poudre dans une solution aqueuse.
Protocole :
Mesurer 0,25 grammes de l'échantillon et le dissoudre dans 100 ml avec une solution tampon d'acide citrique ajusté pH6,0. Puis diluer la solution 10 fois également avec du tampon d'acide citrique et mesurer l'absorbance à 618 nm en utilisant une cuvette de 1 cm d'épaisseur. Valeur de couleur El 0 (10% E618nm) = Absorbance (à 618 nm) x 100/ 0,25 grammes.
Glycogène (%) C-PC en (%) Ratio Echantillon El 0 de produit final de produit final glycogène/PC
Brut 60 10 6 90 Filtré 50 20 2,5 180 Digéré Filtré 20 28 0,7 ...... 250 Digéré Filtré
3 40 0,075 360 diafiltré
Exemple 4 ¨ Pression transmembranaire avec ou sans lyse enzymatique Un extrait brut de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria produit selon le procédé
dans la demande de brevet WO 2018/178334 est clarifié sur membrane fibre creuse PES
0.05pm. Les résultats ci-dessous présentent le suivi de paramètre de filtration avec ou sans digestion avec le pectinex (0.05%, 5h30, à température ambiante et pH= 4) d'un même volume de 250 mL d'extrait brut.
Les résultats sont représentés sur la Figure 5. Ils montrent l'effet de la digestion du glycogène sur la microfiltration d'un extrait brut. On constate que pour filtrer un même volume, le temps requis pour l'échantillon digéré est environ deux fois plus court que pour l'échantillon non digéré, du fait de l'augmentation du flux transmembranaire.
REFERENCES
- Cruz de Jesùs et al., Int J Food Nutr Sci (2016) 3(3): 1-0 - Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. (2016) 89:12-8 - Martinez-Garcia et al., Carbohydrate Polymers (2017) 169: 75-82 - Moon et al., Korean Journal of Chemical Engineering (2014) 31, 490-495 - Shimonaga et al., Marine Biotechnology (2007) 9, 192-202.
- Shimonaga et al., Plant and Oeil Physiology (2008) 49, 103-116.
- ON 106749633, 0N102433015 et 0N1117973 - US 6,074,854, US 5,817,498, US 2017/159090 - WO 2009/075682, WO 2017/050917, WO 2017/050918, WO 2017/093345, WO
2018/178334, WO 2019/036721
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de phycocyanines produites par fermentation de microalgues, en particulier produites par Galdieria sulphura ria, qui comprend une dégradation enzymatique du glycogène.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La purification de phycobiliprotéines extraites de Galdieria sulphuraria et de Spiruline par précipitation au sulfate d'ammonium a déjà été décrite dans la littérature (Moon et al., 2015 ; Cruz de Jesùs et al., 2006) mais elle est très difficilement applicable à l'échelle industrielle car elle demande beaucoup de sulfate d'ammonium, ce qui pose de gros problèmes de retraitement du sulfate d'ammonium et du surnageant.
Les autres méthodes de purification décrites permettant d'obtenir un taux de pureté
telles que des méthodes de chromatographie sont très couteuses à mettre en uvre.
Les procédés d'extraction des phycocyanines consistent généralement à faire précipiter les matières organiques autres que les phycocyanines présentes dans un extrait brut aqueux issu d'une fermentation de microalgues pour conserver les phycocyanines dans le surnageant qui sera filtré avant de faire précipiter les phycocyanines. Toutefois, certains composés organiques, notamment des polysaccharides complexes comme le glycogène, restent insensible à cette précipitation.
Dans un procédé industriel de purification de la phycocyanine, on peut employer une étape par filtration (ultrafiltration) pour éliminer l'eau afin de concentrer la phycocyanine et éliminer des petites molécules (protéines, ions, acide organique...) dont la taille est inférieure au seuil de coupure du filtre utilisé, pour obtenir une phycocyanine la plus pure possible. Toutefois, le seuil de coupure du filtre étant inférieur à la taille du glycogène celui-ci n'est pas éliminé et augmente la viscosité du rétentat, limitant la mise en uvre de filtration et le maintien des paramètres optimaux de celle-ci. L'effet viscosant du glycogène en fonction de sa concentration a été démontré à partir de glycogène purifié
de Galdieria sulphuraria (Martinez-Garcia et al., 2017).
De plus les phycocyanines purifiées obtenues conservent des taux élevés de ces sucres qui peuvent altérer les propriétés de celles-ci et des produits purifiés, notamment le pouvoir colorant, nécessitant une quantité de phycocyanines accrue pour un même rendu visuel. Ces polysaccharides résiduels se comportent comme une charge qui vient renchérir les coûts de fabrication de la phycocyanine et peut limiter les usages commerciaux de la phycocyanine obtenue, par exemple pour la préparation d'aliments qui ont une faible teneur en sucres. La présence de polysaccharides résiduels peut limiter l'usage du produit à
l'élaboration de produit alimentaire de faible teneur en sucres entrainant ainsi un surcoût à
l'élimination de ces dit sucres.
wo 2020/144330 2 PCT/EP2020/050547 Le glycogène est un sucre complexe, difficile à éliminer si l'on cherche à
préserver la phycocyanine des conditions usuelles de dégradation du sucre. Le glycogène est un polyglucoside branché constitué de chaines glucosidiques a (1-4) ramifiés par des liaisons a (1-6).
On connait l'utilisation d'enzymes pour la lyse cellulaire dans un procédé
d'extraction de phycocyanine à partir d'une culture de microorganismes (ON 106749633, et 0N1117973). Cette étape de lyse cellulaire, de rupture de la paroi cellulaire pour la libération des phycocyanines, suivie par l'extraction de la phycocyanine libérée dans le milieu, n'a pas d'action significative sur le glycogène libéré avec la phycocyanine et extrait avec cette dernière.
Il est possible de mettre en uvre une dégradation enzymatique du glycogène.
Toutefois, ce polysaccharide est un polymère partiellement résistant aux enzymes susceptibles de le dégrader. Du fait du nombre particulièrement important de ramification par liaison a1-6 glucosidique, l'utilisation d'enzymes telle que les [3 -amylase (a1-4 glucosidase) est inapproprié comme le montrent Martinez-Garcia & al. Ces auteurs montrent une activité relativement limitée d'une a-amylase (al -4 glucosidase) pancréatique sur le glycogène. La mesure de sucre réducteur, représentant le niveau de digestion, reste faible et sature rapidement. L'utilisation d'enzyme à activité al-6 glucosidase (isoamylase, pullulanase) pour débrancher le glycogène est possible comme le montrent les travaux de Martinez-Garcia et al. ou ceux de Shimonaga et al. . Mais encore une fois, les digestions sont incomplètes en libérant des polymères de glucose après des durées importantes de digestion (24 à 48 heures).
Ces expériences de digestion du glycogène rapportées dans l'état de la technique n'ont pas intégré la problématique de préservation de la phycocyanine alors que les enzymes employées peuvent affecter l'intégrité de la phycocyanine, altérant ainsi ses propriétés colorantes et anti-oxydantes.
On cherche donc à améliorer les procédés de purification des phycocyanines extraites d'une biomasse, tant d'un point de vue qualitatif, que d'un point de vue industriel et économique en diminuant la teneur résiduelle en sucres dans le produit final, en particulier la teneur résiduelle en glycogène tout en préservant les propriétés de la phycocyanine.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le procédé selon l'invention consiste à effectuer un traitement enzymatique de la solution de phycocyanine pour diminuer la teneur en glycogène avec une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène dans des conditions de température et de pH qui ne dégradent pas de manière substantielle les phycocyanines présentes, c'est-à-dire des enzymes actives à un pH inférieur à 6 et une température de réaction inférieure à 40 C, comme les glucoamylases, les pectinases et les pullulanases et leurs mélanges.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de phycobilliprotéines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria, la réaction enzymatique étant conduite à un pH inférieur à 6, avantageusement d'environ 4.
L'invention concerne également un extrait de phycocyanines avec un rapport glycogène/phycocyanines (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente les courbes de perte de phycocyanine (%) au cours du temps pour une digestion pH = 4 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 2 représente les courbes de perte de phycocyanine (%) au cours du temps pour une digestion pH = 7 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 3 représente les courbes de libération de glucose suite à la digestion du glycogène au cours du temps pour une digestion pH = 4 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 4 représente les courbes de libération de glucose suite à la digestion du glycogène au cours du temps pour une digestion pH = 7 à différentes concentrations en enzyme.
La Figure 5 représente l'évolution du flux de perméat en fonction du temps pour la filtration d'un extrait de phycocyanine (C-PC) avec ou sans digestion enzymatique.
La Figure 6 représente une courbe de suivi de la digestion du glycogène à pH=4 pour différentes enzymes.
La Figure 7 représente une courbe de suivi de la digestion du glycogène à pH=7 pour différentes enzymes.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé de purification de phycocyanines à partir d'une solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène, lequel comprend une étape de dégradation enzymatique du glycogène par une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène dans des conditions de température et de pH qui ne dégradent pas de manière substantielle les phycocyanines présentes et une étape de séparation des phycocyanines des produits de dégradation du glycogène.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification d'une solution de phycocyanine extraite d'une culture de microorganisme producteur de phycocyanines qui produit également du glycogène, en particulier dans le cadre d'un procédé industriel de production de phycocyanine qui comprend la culture des microorganismes, puis la récupération de la biomasse produite pour extraire la phycocyanine, et la récupération de la phycocyanine à partir de cette biomasse.
wo 2020/144330 PCT/EP2020/050547 Le procédé est particulièrement adapté pour les phycocyanines produites par des microorganismes qui produisent de fortes teneurs de glycogène, en particulier pour l'extraction et la purification des phycocyanines à partir d'une biomasse qui comprend plus de 10% de glycogène par rapport à la totalité de la matière sèche.
Des microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus, notamment les algues (ou microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarum, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria. On citera en particulier la souche Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium (UTEX 2919).
On citera aussi des producteurs connus de phycocyanines comme les cyanobactéries filamenteuses du genre Arthrospira, cultivées industriellement sous le nom commun de spiruline.
Les microorganismes qui produisent de la phycocyanine avec une teneur élevée en glycogènes sont plus particulièrement identifiés parmi les microorganismes cités précédemment, en particulier les espèces des genres Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, plus particulièrement Galdieria sulphuraria.
Le glycogène est un polysaccharide très largement présent dans la nature chez une diversité d'organismes (bactérie, levure, cellule animale, ...). Si la structure de polymère de glucose par liaison al-4 ramifié par liaison a1-6 est commune, la différence vient du pourcentage et de la distribution des ramifications. On entend en particulier par glycogène au sens de la présente invention le polymère de glucose présent chez les organismes producteurs de phycocyanines précédemment cités dont la particularité est une taille de ramification majoritaire inférieure à 10 unités de glucoses comme l'illustrent les travaux de Martinez-Garcia et al..
Les procédés industriels de culture de microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus de l'homme du métier. On citera en particulier les demandes WO
2017/093345, WO 2017/050917 et WO 2018/178334.
La récupération de la phycocyanine à partir de la biomasse est également connue de l'homme du métier. On citera notamment la demande WO 2018/178334. Elle requiert généralement une étape de lyse cellulaire, mécanique ou enzymatique de manière à libérer la phycocyanine produite dans les compartiments cellulaires des microorganismes. Cette lyse cellulaire va généralement générer une solution de phycocyanine qui comprend des matières organiques en suspensions (appelée suspension brute) qui peuvent être séparées par des méthodes usuelles de séparation, en particulier de filtration, notamment de microfiltration, ou de centrifugation puis filtration, plus particulièrement par microfiltration.
On obtient alors une solution brute de phycocyanine qui peut faire l'objet d'une nouvelle purification de manière à éliminer des résidus organiques de faible poids moléculaire par des méthodes usuelles d'ultrafiltration pour obtenir une solution raffinée à
partir de laquelle on obtiendra la phycocyanine par des méthodes usuelles de précipitation et séchage. On citera notamment la filtration tangentielle sur membranes céramiques ou membranes organiques tel que les fibres creuses en polyéthersulfone ou polysulfone, notamment celles proposées par les sociétés Repligen. Les seuils de ces filtres peuvent être choisis pour séparer des molécules de poids moléculaire supérieur ou inférieur aux phycocyanines ciblées.
La phycocyanine obtenue peut être ensuite purifiée, notamment par une étape de diafiltration pour éliminer le plus possible les résidus organiques de faible poids moléculaire.
Le traitement enzymatique selon l'invention peut être mis en uvre tant sur la suspension brute que sur la solution brute.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de solution de phycocyanines résistantes à des pH acides, en particulier les phycocyanines décrites dans la demande WO 2017/050918.
En particulier, le procédé selon l'invention est mis en uvre pour la purification de phycocyanines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria, plus particulièrement dans un procédé de production industrielle de ces phycocyanines par culture en fermenteur de Galdieria sulphuraria.
Les conditions préférées de mise en uvre de la réaction enzymatique sont un pH
inférieur à 7 et une température de réaction inférieure à 60 C, de préférence inférieure à
50 C, encore plus préférentiellement inférieure à 30 C.
De manière avantageuse, la lyse enzymatique du glycogène est mise en uvre à
un pH inférieure ou égal à 5, de préférence d'environ 4,5.
De manière préférentielle la réaction enzymatique est mise en uvre à
température ambiante. Cette température ambiante correspond à la définition d'une mise en uvre en zone tempérée ou dans un local de température correspondante à une zone tempérée, c'est à dire allant de 18 à 28 C, plus généralement de 20 C à 25 C.
Ces conditions de température et de pH sont particulièrement adaptées pour préserver la phycocyanine au cours de la réaction enzymatique.
Des enzymes actives en conditions de pH acide et à température ambiante sont connues de l'homme du métier. Toutefois les conditions de digestion du glycogène dans le but de préserver la phycocyanine et de faciliter sa production ne sont pas connues.
De manière surprenante, il a été trouvé que des enzymes connues pour une activité
galactosiduronique al-4 ont aussi une activité glucosidase al-4 (ou alpha-glucosidase) dans des conditions de pH et de température compatibles avec la purification de la phycocyanine.
C'est le cas en particulier des pectinases connues pour dégrader la pectine et en particulier des pectinases extraites de champignons filamenteux comme Aspergillus, plus particulièrement de pectinases extraites d'Aspegillus aculeatus, comme les enzymes commercialisées sous la dénomination Pectinex0 par la société Novozymes.
L'action de ces enzymes diminue la taille des chaines glucosidiques qui peuvent alors être éliminées par ultrafiltration dans des conditions qui permettent de retenir les phycocyanines tout en laissant passer les fragments de glycogène.
Les inventeurs ont pu constater que ces conditions de lyse enzymatique libèrent des chaines polyglucosidiques et peu de monomères de glucose et sont donc particulièrement adaptées pour éviter les contaminations par d'autres microorganismes, en particulier des organismes pathogènes pour l'homme ou l'animal, ce qui est indispensable lorsque la phycocyanine obtenue est employée comme colorant alimentaire.
Selon un mode particulier de réalisation, la lyse enzymatique du glycogène pourra également être réalisée avec une activité glucosidase al-6 en plus d'une activité
glucosidase al-4 ou d'une polygalacturonase.
L'enzyme employée dans le procédé peut alors être un mélange d'enzymes, une première enzyme ayant une activité glucosidase al-4 ou d'une polygalacturonase et une deuxième enzyme ayant une activité glucosidase al-6.
Des glucosidases al-6 actives dans les conditions de pH et de température exposées ci-dessus sont également connues de l'homme du métier. Il s'agit en particulier des pullulanases connues pour hydrolyser les liaisons glucosidiques al-6 de la pullulane, notamment connues pour supprimer les ramifications de l'amidon.
Il s'agit généralement d'enzymes extraites de bactéries, notamment des genres Bacillus. US 6,074,854, US 5,817,498 et WO 2009/075682 décrivent de telles pullulanases extraites de Bacillus deramificans ou de Bacillus acidopullulyticus. On connaît aussi des pullulanases disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations Promozyme D2 (Novozymes), Novozym 26062 (Novozymes) et Optimax L 1000 (DuPont-Genencor). On notera que des mélanges pullulanases/alpha-amylases sont décrits dans l'état de la technique, mais en particulier pour produire du sirop de glucose à
partir de l'amidon (US 2017/159090).
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme a à la fois une activité glucosidase al-4 et une activité glucosidase al-6.
C'est le cas en particulier des glucoamylases. Il s'agit également d'enzymes extraites wo 2020/144330 PCT/EP2020/050547 de microorganismes, notamment de levures ou de champignons, comme S.
diastaticus ou A. figer. De nombreuses glycoamylases sont connues de l'état de la technique, décrites dans la littérature et notamment des demandes de brevet comme WO 2019/036721.
Elles sont généralement employées dans des procédés de fermentation, soit pour la production d'alcools de consommation (bière, spiritueux) soit pour la fermentation de biomasse pour la production de bioéthanol. Elles sont également employées comme additifs de boulangerie ou comme compléments alimentaires. On connait des glucoamylases disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations Amylase AG
XXL
(Novozymes) ou Panzym AG XXL (Eaton).
De manière avantageuse, les enzymes employées dans le procédé selon l'invention sont des enzymes autorisées pour être employées dans l'industrie alimentaire.
La teneur optimale en enzymes employée dans cette étape de lyse du glycogène pourra être déterminée par l'homme du métier en fonction de l'activité des enzymes employées dans les conditions de température et de pH exposées précédemment.
Les concentrations en enzymes sont généralement de 0,0001% et 5%, préférentiellement 0,0025% et 1%, plus préférentiellement 0,005% et 0,5%, encore plus préférentiellement entre 0,01% et 0,25%, les pourcentages étant exprimés en volume de solution enzymatique par rapport au volume total de suspension brute ou de suspension brute.
Les solutions enzymatiques ont des concentrations en enzymes généralement allant de 100 à 20000 unités/ml, l'activité enzymatique étant celle communément attachée à ces enzymes, telles qu'identifiée par le fabriquant.
L'emploi de glucosidases al-6 permet de diminuer les quantités de glucosidase al-4 ou polygalacturonase employées. Les concentrations totales en enzymes (glucuronidase al-4 + glucosidases al-6) sont généralement de 0,0001% et 5%, préférentiellement 0,0025% et 1%, plus préférentiellement 0,005% et 0,5%, encore plus préférentiellement entre 0,01% et 0,25%, les pourcentages étant exprimés en volume de solution enzymatique par rapport au volume total de suspension brute ou de suspension brute.
Avec la glucosidase al-4 ou polygalacturonase seule ou en mélange avec la glucosidase al-6, ou avec l'enzyme à activité glucosidase al-4 et glucosidases al-6, la réaction est mise en uvre de manière avantageuse pendant moins de 48 h, de préférence moins de 24 h, plus préférentiellement de 5 h à 12h.
Pour le procédé selon l'invention et plus particulièrement pour l'étape de d'isolation par filtration tangentielle pour l'isolation de la phycocyanine, il n'est pas nécessaire d'obtenir une digestion totale du glycogène en monomère de glucose. Une digestion partielle du polysaccharide et sa réduction en oligomères de tailles inférieures au seuil de coupure de la filtration est suffisante pour éliminer le glycogène de la suspension ou bien de la solution de phycocyanine.
L'homme du métier saura déterminer le temps approprié pour réduire au mieux les quantités de glycogène en fonction de la teneur initiale en glycogène, la quantité d'enzymes employés et la pureté recherchée pour la phycocyanine produite.
La mise en uvre de la réduction du glycogène par digestion enzymatique peut être associée ou remplacée par l'usage de micro-organismes ayant la capacité de dégrader ce polysaccharide. L'homme du métier saura exploiter les capacités de ces micro-organismes à produire et sécréter dans l'extrait brut, des enzymes capables de digérer le glycogène, plus particulièrement les enzymes précédemment évoque. L'homme du métier saura sélectionner et exploiter les capacités de ces micro-organismes à métaboliser le glycogène ou les produits issus de la dégradation du polysaccharide. De manière avantageuse, l'homme du métier saura exploiter les capacités de ces micro-organisme à
limiter la croissance de micro-organismes indésirables ou pathogène notamment pas la synthèse de substance ayant une activité antimicrobienne.
Les conditions préférées de mise en uvre de la dégradation du glycogène ex vivo ou in vivo sont un pH inférieur à 7 et une température de réaction inférieure à 50 C, de préférence inférieure à 40 C, encore plus préférentiellement inférieure à 37 C.
De manière avantageuse, la dégradation du glycogène ex vivo ou in vivo est mise en uvre à un pH inférieure ou égal à 5, de préférence d'environ 4,5 ou 4.
De part leur caractéristique de croissance et de dégradation de polysaccharide les bactéries lactiques apparaissent particulièrement adaptées. Peuvent être cité
parmis elles, les bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Pediococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Atopobium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Melissococcus ou Bifidobacterium.
L'invention concerne également un extrait de phycocyanines avec un rapport glycogène/phycocyanine (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1.
Selon un premier mode de réalisation, cet extrait de phycocyanine est la suspension brute de phycocyanine obtenue après lyse enzymatique.
Cette suspension brute traitée également appelée suspension brute enzymée comprend en particulier la phycocyanine libérée après lyse cellulaire, des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène et le glycogène résiduel avec les insolubles résultants de la lyse cellulaire en suspension.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, l'extrait de phycocyanine est la solution brute de phycocyanine obtenue après séparation de la suspension brute et lyse enzymatique du glycogène, cette lyse ayant été mise en uvre avant ou après la séparation de la suspension brute, ou avant et après séparation (séparation de la suspension brute enzymée et/ou mise en uvre de la réaction enzymatique sur la solution brute).
Cette solution brute comprend en particulier la phycocyanine libérée après lyse cellulaire, des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène et le glycogène résiduel. Cette solution brute traitée, appelée également solution brute enzymée de phycocyanine comprend généralement de 0,1 à 10 g/L de phycocyanine, plus préférentiellement de 1 à 5 g/L.
Le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à
3, de préférence inférieur à 2,5.
La solution brute enzymée selon l'invention pourra éventuellement être concentrée par élimination d'une partie de l'eau selon les méthodes usuelles de la technique mises en uvre dans des conditions qui respectent substantiellement l'intégrité de la phycocyanine.
Dans ce cas, la teneur en phycocyanine d'une solution brute enzymée et concentrée sera avantageusement de 10 à 50 g/L.
Selon un autre mode de réalisation, l'extrait de phycocyanine est la phycocyanine isolée après extraction à partir de la solution brute enzymée selon les méthodes décrites plus haut.
Pour la phycocyanine isolée, le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à 2, de préférence inférieur à 1.
Selon un autre mode de réalisation, l'extrait de phycocyanine est la phycocyanine purifiée obtenu après purification de l'extrait isolé selon les méthodes décrites plus haut, notamment par diafiltration.
Pour la phycocyanine purifiée, le rapport pondéral à sec glycogène/phycocyanine est avantageusement inférieur à 1, de préférence inférieur à 0,1.
La Phycocyanine isolée comme la phycocyanine purifiée peuvent encore contenir des traces d'oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène.
La phycocyanine obtenue a un pouvoir colorant El 0 de 90 à 400, préférentiellement d'au moins 120, plus préférentiellement d'au moins 150.
Pour une solution brute enzymée, le pouvoir colorant El 0 est avantageusement de 90 à 110.
Pour la phycocyanine isolée, le pouvoir colorant El 0 est avantageusement de 150 à
210.
Pour la phycocyanine purifiée, le pouvoir colorant est avantageusement de 210 à 400.
L'invention concerne aussi un procédé de production d'une phycocyanine d'origine microbienne qui comprend les étapes de (a) culture de microorganismes producteurs de phycocyanine tels que décrits plus haut dans des conditions de culture permettant de produire un mout de fermentation comprenant plus de 30 g/L de matière sèche et au moins 4% de phycocyanine par rapport à la matière sèche, (b) lyse cellulaire pour libérer la phycocyanine produite et le glycogène pour obtenir une suspension brute telle que définie précédemment, (c) séparation de la suspension brute pour récupérer une solution brute comprenant la phycocyanine et le glycogène, puis optionnellement (d) isolation de la phycocyanine à partir de la solution brute, puis optionnellement, (e) purification de la phycocyanine isolée, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lyse enzymatique du glycogène avec les enzymes et dans les conditions définis précédemment ou une dégradation au moyen de micro-organisme, ladite lyse enzymatique étant mise en uvre sur la suspension brute et/ou sur la solution brute.
De manière avantageuse, la phycocyanine obtenue est une phycocyanine qui comprend moins de 50 % de glycogène.
Les procédés de culture sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/093345 et WO 2018/178334.
Ils permettent d'obtenir des mouts de fermentation de plus de 30 g/L de matière sèche, pouvant aller à plus de 100 g/L de matière sèche.
La teneur en phycocyanine d'au moins 4% peut le cas échéant atteindre plus de 10%
selon les conditions de fermentation et les souches cultivées.
L'homme du métier saura déterminer les conditions de culture en fonction de son objectif industriel de production de phycocyanine.
L'étape (c) de séparation est également connue et décrite dans l'état de la technique, notamment par des méthodes usuelles de filtration, comme la microfiltration, ou la centrifugation puis filtration, en particulier par microfiltration L'invention concerne également l'utilisation des phycocyanines obtenues comme colorants, en particulier comme colorants alimentaires. Elle concerne aussi des aliments, solides ou liquides, en particulier des boissons qui comprennent une phycocyanine à faible teneur en glycogène selon l'invention.
La phycocyanine utilisée comme colorant peut l'être sous forme de solution brute enzymée, de phycocyanine isolée ou de phycocyanine purifiée, telle que définie plus haut.
EXEMPLES
Exemple 1 ¨ Suivi de la concentration en C-PC avant et après lyse enzymatique Le suivi de la concentration en phycocyanine d'un extrait brut est réalisé au pH4 et pH7 avec différentes quantités d'enzyme pectinex . L'extrait brut de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria est produit selon le procédé décrit dans la demande WO
2018/178334. Pour ce suivi, l'enzyme et l'extrait brut de phycocyanine sont filtrés sur filtre 0.22pm. La digestion est réalisée à température ambiante. Pour chaque point de cinétique une lecture des absorbances utiles à la détermination de la concentration de la phycocyanine sont mesurées, parallèlement à une mesure de glucose après dénaturation de l'enzyme (95 C, 5 minutes) avec l'analyseur biochimique YSI2700.
Les résultats sont représentés sur les Figures 1 à 4.
Ces résultats montrent que la quantité de glycogène digérée varie entre les différentes conditions de pH et de concentration en enzyme. Un excès d'enzyme peut entrainer une dégradation de la phycocyanine.
On voit toutefois qu'a moins de 24 h de digestion à pH = 4 et 0,05% de pectinex on obtient une lyse importante du glycogène tout en limitant de manière substantielle la dégradation de la phycocyanine.
Exemple 2 ¨ Suivi du taux de digestion du glycogène dans une solution brute de phycocyanine Le suivi du taux de digestion du glycogène dans une solution brute est réalisé
au pH4 et pH7 avec différentes enzymes : alpha amylase (Ban 480L de la société
Novozymes), polygalacturonase (Pectinex Ultra SP-L de la société Novozymes) et glucoamylase (Amylase AG XXL de la société Novozymes).
La solution brute de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria est produit selon le procédé décrit dans la demande WO 2018/178334. Pour ce suivi, l'enzyme et la solution brute de phycocyanine sont filtrés sur filtre 0.22pm. La digestion est réalisée à température ambiante. Pour chaque point de cinétique est réalisée une mesure de glucose après dénaturation de l'enzyme (95 C, 5 minutes) avec l'analyseur biochimique Y5I2700. Le pourcentage de digestion du glycogène correspond au rapport de la concentration de glucose sur la concentration en glucose après hydrolyse totale du polysaccharide.
Les résultats sont représentés sur les Figures 6 (pH=4) et 7 (pH=7).
Exemple 3 ¨ Teneur en glycogène dans le produit purifié avec ou sans lyse enzymatique Une solution brute de phycocyanine, non traitée ou digérée 12H avec 0.25%
(v/v) de glucosidases al-6, puis 2H avec 0,1% (v/v) de polygalacturonase al-4 est filtrée sur une membrane fibre creuse ayant une porosité de 70kDa avec une étape finale de diafiltration.
Les différentes mesures réalisées en fin de chaque filtration et/ou étape de filtration montrent que la concentration en glycogène augmente de façon significative dans le rétentat jusqu'à atteindre des concentrations non négligeables par rapport à
la PC. Il est donc nécessaire d'éliminer tout ou une partie de ce glycogène pour éviter de diluer le pouvoir colorant du produit final, et un pouvoir colorant El compris entre à
90 et 400.
wo 2020/144330 12 PCT/EP2020/050547 La valeur de couleur E10 (10% E618nm) indique la densité de couleur qui est mesurée à 618 nm après avoir dissous une poudre dans une solution aqueuse.
Protocole :
Mesurer 0,25 grammes de l'échantillon et le dissoudre dans 100 ml avec une solution tampon d'acide citrique ajusté pH6,0. Puis diluer la solution 10 fois également avec du tampon d'acide citrique et mesurer l'absorbance à 618 nm en utilisant une cuvette de 1 cm d'épaisseur. Valeur de couleur El 0 (10% E618nm) = Absorbance (à 618 nm) x 100/ 0,25 grammes.
Glycogène (%) C-PC en (%) Ratio Echantillon El 0 de produit final de produit final glycogène/PC
Brut 60 10 6 90 Filtré 50 20 2,5 180 Digéré Filtré 20 28 0,7 ...... 250 Digéré Filtré
3 40 0,075 360 diafiltré
Exemple 4 ¨ Pression transmembranaire avec ou sans lyse enzymatique Un extrait brut de phycocyanine issu de Galdieria sulphuraria produit selon le procédé
dans la demande de brevet WO 2018/178334 est clarifié sur membrane fibre creuse PES
0.05pm. Les résultats ci-dessous présentent le suivi de paramètre de filtration avec ou sans digestion avec le pectinex (0.05%, 5h30, à température ambiante et pH= 4) d'un même volume de 250 mL d'extrait brut.
Les résultats sont représentés sur la Figure 5. Ils montrent l'effet de la digestion du glycogène sur la microfiltration d'un extrait brut. On constate que pour filtrer un même volume, le temps requis pour l'échantillon digéré est environ deux fois plus court que pour l'échantillon non digéré, du fait de l'augmentation du flux transmembranaire.
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2018/178334, WO 2019/036721
Claims (33)
1. Procédé de purification de phycocyanines à partir d'une solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène, caractérisé en ce qu'il comprend (i) une étape de dégradation enzymatique du glycogène par une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène à un pH inférieur à 6 et une température de réaction inférieure à 40 C et (ii) une étape de séparation des phycocyanines des produits de dégradation du glycogène.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la température est inférieure à 30 C et/ou le pH est inférieur ou égal à 5.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme a une activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'enzyme est une pectinase.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'enzyme est un mélange d'enzyme qui comprend une enzyme à activité glucosidase al-6 en plus de l'enzyme a activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'enzyme a activité
glucosidase al-6 est une pullulanase.
glucosidase al-6 est une pullulanase.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le mélange d'enzyme comprend une pectinase et une pullulanase.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'enzyme a une activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase et une activité glucosidase al-6.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme est une glucoamylase.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène est une suspension brute obtenue après lyse cellulaire d'une biomasse de microorganisme producteur de phycocyanine.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène est une solution brute obtenue après filtration d'une suspension brute elle-même obtenue après lyse cellulaire d'une biomasse de microorganisme producteur de phycocyanine.
12. Procédé de production d'une phycocyanine d'origine microbienne qui comprend les étapes de (a) culture de microorganismes producteurs de phycocyanine tels que décrits plus haut dans des conditions de culture permettant de produire un mout de fermentation comprenant plus de 30 g/L de matière sèche et au moins 4% de phycocyanine par rapport à la matière sèche, (b) lyse cellulaire pour libérer la phycocyanine produite et le glycogène pour obtenir une suspension brute telle que définie précédemment, (c) séparation de la suspension brute pour récupérer une solution brute comprenant la phycocyanine et le glycogène, puis optionnellement (d) isolation de la phycocyanine à partir de la solution brute, puis optionnellement, (e) purification de la phycocyanine isolée, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lyse enzymatique du glycogène par une enzyme appropriée pour dégrader le glycogène à un pH inférieur à 6 et une température de réaction inférieure à 40 C, ladite lyse enzymatique étant mise en uvre sur la suspension brute obtenu en en (b) et/ou sur la solution brute obtenue en (c).
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la température est inférieure à 30 C et/ou le pH est inférieur ou égal à 5.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que l'enzyme a une activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'enzyme est une pectinase.
16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'enzyme est un mélange d'enzyme qui comprend une enzyme à activité glucosidase al-6 en plus de l'enzyme a activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'enzyme a activité
glucosidase al-6 est une pullulanase.
glucosidase al-6 est une pullulanase.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le mélange d'enzyme comprend une pectinase et une pullulanase.
19. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'enzyme a une activité glucosidase al-4 ou polygalacturonase et une activité
glucosidase al-6.
glucosidase al-6.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'enzyme est une glucoamylase.
21. Procédé selon l'une des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que la solution comprenant la ou les phycocyanines et du glycogène est une suspension brute obtenue en (b).
22. Procédé selon l'une des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que la lyse enzymatique est mise en uvre sur la solution brute obtenue en (c).
23. Procédé selon l'une des revendications 12 à 22, caractérisé en ce que la phycocyanine est une phycocyanine d'origine microbienne, produite par un microorganisme choisi parmi les espèces des genres Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, plus particulièrement Galdieria sulphuraria.
24. Phycocyanine isolée obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à
23.
23.
25. Phycocyanine isolée selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'elle comprend des traces d'enzymes à activité alpha 1-4 et/ou 1-6 glucosidase.
26. Phycocyanine isolée selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce qu'elle contient des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène.
27. Extrait de phycocyanine comprenant une phycocyanine et du glycogène, caractérisé en ce que le rapport pondéral en poids sec glycogène/phycocyanine est inférieur à 6, et caractérisé en ce qu'il comprend des traces d'enzymes à
activité alpha 1-4 et/ou 1-6 glucosidase et/ou des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène.
activité alpha 1-4 et/ou 1-6 glucosidase et/ou des oligomères de glucose, produits de la lyse enzymatique du glycogène.
28. Extrait selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport pondéral en poids sec glycogène/phycocyanine est inférieur à 4.
29. Extrait selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport pondéral en poids sec glycogène/phycocyanine est inférieur à 3.
30. Extrait selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport pondéral en poids sec glycogène/phycocyanine est inférieur à 2,5.
31. Extrait selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport pondéral en poids sec glycogène/phycocyanine est inférieur à 1.
32. Utilisation d'une phycocyanine isolée selon l'une des revendications 24 à 26 ou d'un extrait selon l'une des revendications 27 à 31 comme colorant alimentaire.
33. Aliment, caractérisé en ce qu'il comprend une phycocyanine isolée selon l'une des revendications 24 à 26 ou d'un extrait selon l'une des revendications 27 à
31.
31.
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