CA3247165A1 - Procédé de détermination de la résistance à la méticilline de souches de staphylococcus aureus - Google Patents

Procédé de détermination de la résistance à la méticilline de souches de staphylococcus aureus

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Francis Deforet
François VANDENESCH
Olivier Dauwalder
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Weezion
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Normale Superieure de Lyon
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Abstract

"La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : • a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6 -APA (acide 6-aminopenicillanique), • b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, • c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, • d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette étape d’analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique."

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA RESISTANCE A LA METICILLINE DE SOUCHES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DOMAINE DE L'INVENTION La presente invention concerne un procede de caracterisation de souches bacteriennes appartenant a la famille des staphylocoques, et en particulier a un procede permettant d’identifier les souches bacteriennes resistantes a certains antibiotiques. Ceci permet au personnel de sante de selectionner des antibiotiques adaptes a chaque patient infecte, en fonction de ces donnees de resistance. ETAT DE LA TECHNIQUE L’utilisation accrue d’antibiotiques au cours des dernieres decennies a entraine I’apparition de mecanismes de resistance chez de nombreuses especes bacteriennes. Les premieres souches de Staphylococcus aureus (staphylocoques dores) resistantes a la penicilline ont ete caracterisees seulement deux ans apres I’introduction de cet antibiotique dans la chaine de traitement des infections bacteriennes (Kirby, 1944) et se sont rapidement propagees, entrainant l’arret progressif de l’utilisation de la penicilline en clinique au profit de nouvelles molecules antibacteriennes semi-synthetiques telles que la meticilline et I’oxacilline. Puis dans les annees 1960, de nouvelles souches de Staphylococcus aureus resistantes a la meticilline, mais egalement a d’autres composes antibiotiques, sont apparues. Ces souches sont designees par I’acronyme SARM ou plus communement par leur acronyme anglais MRSA (Meticillin Resistant Staphylococcus ureus). Ces souches MRSA expriment une toxine particuliere, la LPV ou leucocidine de PantonValentine. Cette toxine dite « porogene » induit des pores dans les parois cellulaires, notamment des cellules du systeme immunitaire, tuant ainsi les cellules capables de lutter centre I’infection. Bien qu’initialement confinees au milieu hospitalier, les souches MRSA se sont ensuite propagees dans la population. En 2019, en Europe, on estimait que les souches MRSA representent entre 1% et 46% des infections a Staphylococcus aureus. D’apres I’Organisation Mondiale de la Sante, une personne souffrant d’une infection par une soucheMRSA presente une probabilite de deces 64% plus elevee qu’une personne infectee par une souche non resistante. La detection des souches MRSA est done un enjeu majeur pour la prise en charge et le traitement des patients atteints d’infections a Staphylococcus aureus. 15 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Le phenotype MRSA est du a I’expression d’une proteine specifique, la PBP2a pour « Penicillin binding protein 2a », codee par le gene MecA, et dans de plus rares cas a I’expression de la proteine PBP2c codee par le gene MecC. Ces proteines « remplacent » la transpeptidase PBP2, une enzyme impliquee dans la formation de la paroi cellulaire bacterienne. Les proteines alternatives PBP2a et PBP2c ayant une faible affinite pour la methicilline et la penicilline, la presence de ces antibiotiques n’inhibe pas leur activite, et la synthese de la paroi cellulaire continue normalement, assurant ainsi la croissance bacterienne meme en presence de ces antibiotiques. Depuis l’apparition des premieres souches MRSA, plusieurs methodes de detection de cette propriete de resistance ont ete elaborees, et ce selon trois approches principales : - Les methodes phenotypiques sont basees sur une evaluation de la croissance bacterienne en presence d’antibiotique; - Les methodes de biologie moleculaire sont basees sur la detection des genes MecA et/ou MecC dans le genome bacterien des souches etudiees ; - Les methodes immunologiques et proteomiques sont basees sur la detection de la proteine PBP2a ou de ses peptides. Parmi ces technologies, les methodes d’immuno-chromatographie (detection grace a des anticorps) et de spectrometrie de masse sont particulierement utilisees. Ces differentes approches sont brievement presentees ci-apres. Methodes phenotypiques Les methodes traditionnelles de diffusion sur gelose, bien qu’anciennes, sont encore largement utilisees dans les laboratoires du fait de leur simplicite et de leur faible cout. Elles consistent a cultiver sur gelose la bacterie en presence d’un disque d’antibiotique, usuellement de I’oxacilline ou de la cefoxitine. Le phenotype sensible ou resistant de la souche bacterienne est determine en evaluant le diametre de la zone d’inhibition de croissance autour du disque. Le principal desavantage de cette technologie est le delai necessaire, d’environ 12 a 18 heures, pour obtenir le resultat (Felten, 2002). L’arrivee sur le marche d’instruments tels que le Vitek® 2 distribue par BioMerieux, ou le Phoenix™ distribue par Becton Dickinson, a permis l’automatisation a haut debit des tests de susceptibilite aux antibiotiques. Bien que plus robustes que les methodes de diffusion sur gelose, ces tests sont egalement limites par le temps de croissance des bacteries. Le resultat est, dans le cas d’un Staphylococcus aureus, obtenu en environ 10 a 13 heures. Par exemple, Particle de Sparbier et al., 2013, divulgue une telle methode phenotypique ou la croissance bacterienne est evaluee en presence d’antibiotiques. Les bacteries sont incubees en presence d’oxacilline ou de cefoxitine, et de lysine « chargee » presentant un 25 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 poids moleculaire eleve. [.’incorporation de cet acide amine charge ne sera observee que dans les proteines nouvellement synthetisees. Or, seules les bacteries resistantes aux antibiotiques presentent une activite de biosynthese proteique significative. Les proteines comprenant la lysine chargee sont ensuite detectees par MALDI-TOF. L’inconvenient majeur de cette technologie dite « phenotypique >> est qu’elle est sensible aux facteurs pouvant influencer la croissance bacterienne, tels que le volume d’inoculum, la duree et la temperature d’incubation, le milieu, le pH ou encore la concentration en seis (Tenover etal., 1999). Methodes de biolosie moleculaire L’arrivee des methodes de biologie moleculaire a considerablement ameliore les delais d’identification des souches MRSA par rapport aux methodes phenotypiques. La haute sensibilite et la grande specificite des tests actuellement commercialises font de la detection du gene MecA par PCR (Polymerase Chain Reaction) le « gold standard » pour le diagnostic des MRSA. Parmi les tests couramment utilises, citons geneXpert MRSA/SA BC distribute par Cepheid, GeneOhm™ StaphSR Assay distribue par Becton Dickinson, eazyplex®MRSAplus distribue par AmplexDiagnostics ou encore FilmArray BCID distribue par Biomerieux. Ces tests permettent la detection des souches MRSA en 1 a 3 heures, directement a partir d’un flacon d’hemoculture positif, en s’affranchissant des etapes de sous-culture prealables, consistant a isoler les bacteries et a les faire proliferer. Le principal desavantage de cette technologie est qu’elle a tendance a generer des « faux positifs », notamment dans le cas de souches portant une cassette SSCmec ne contenant pas le gene MecA, ou pour des souches exprimant une proteine variante codee par un gene presentant une sequence legerement differente de celle etablie pour le gene MecA. De plus, le cout eleve d’une analyse de biologie moleculaire reste un obstacle majeur a leur utilisation systematique. Tests immunolosiques : detection de la proteine PBP2A L’utilisation de billes de latex couplees avec un anticorps monoclonal specifique detectant la proteine PBP2a permet une visualisation a I’oeil nu de l’agglutination, temoin de la presence de l’antigene dans I’echantillon. Il s’agit du principe sur lequel se basent les tests PBP2’ Oxoid distribue par Thermofischer Scientific ou Mastalex-MRSA distribue par Mast Diagnostic. La duree du test en tant que tel est comprise entre 15 et 20 minutes. Ce test a tres bonnes performances avec une sensibilite de 100% et une specificite superieure a 99%. 35 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Le desavantage majeur de cette technique est qu’elle necessite une quantite minimale de 1,5 x 109 bacteries dans I’echantillon teste, ce qui implique une etape de culture bacterienne durant au minimum 10 heures. De plus, ces tests ne permettent pas la detection des souches MRSA exprimant la proteine PBP2c, non reconnue par certains anticorps monoclonaux utilises. Cela a notamment ete montre pour le test PBP2’ Oxoid (Dupieux et al., 2017). Des tests immuno-chromatographiques ont egalement ete commercialises pour la detection des souches MRSA, par exemple le kit Clearview™PBP2a SA Culture Colony Test distribue par Alere. Bien que tres rapide et possedant une sensibilite et une specificite superieurs a 98%, ce test necessite egalement une etape de culture bacterienne. Le test Clearview™ PBP2a SA Culture Colony Test peut avantageusement detecter la PBP2c a partir de colonies poussant en bordure d’un disque de cefoxitine apres culture sur gelose. Cette etape d’induction necessaire a la detection de MecC entraine cependant un delai supplementaire d’environ 18 heures avant le rendu de resultat (Dupieux et al., 2017). Spectrometrie de masse ciblee De recentes etudes ont mis en evidence le potentiel des approches proteomiques dites « bottom-up » (ou ascendantes), c’est-a-dire basees sur des spectres de fragmentation de peptides par spectrometrie de masse ciblee, pour Tidentification de pathogenes et la mise en evidence de mecanismes de resistance. Ces approches comprennent les etapes suivantes : 1) Une lyse, mecanique ou chimique, de I’echantillon bacterien afin de liberer les proteines intracellulaires, 2) Une digestion enzymatique des proteines bacteriennes a l’aide de proteases (typiquement la trypsine) pour generer un melange de peptides 3) Une separation chromatographique couplee a une analyse par spectrometrie de masse ciblee de I’echantillon, ou le spectrometre de masse fonctionne en mode MS/MS pour la detection de peptides marqueurs des proteines de resistance 4) Le retraitement des resultats pour la validation de la presence/absence des peptides marqueurs dans I’echantillon. Le terme « ciblee » indique que des sequences peptidiques specifiques sont recherchees ; il peut s’agir de sequences de proteines entieres ou de peptides issus d’une digestion enzymatique desdites proteines. 45 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 La spectrometrie de masse ciblee a ete utilisee avec succes pour caracteriser la resistance et la virulence de souches de Staphylococcus aureus par detection notamment de la proteine PBP2a ou de facteurs de virulence tels que la PVL (Charretier et al., 2015). La demande internationale WO 2011/045544 decrit une methode comprenant la caracterisation de la resistance et de la virulence de Staphylococcus aureus par chromatographie liquide couplee a la spectrometrie de masse ciblee, ou le materiel biologique de depart est une colonie isolee sur milieu gelose. Enfin, il a recemment ete montre que la proteine PBP2a pouvait etre detectee sous sa forme intacte, apres separation par chromatographie liquide et analyse MS (technologie « topdown » basee sur l’analyse de spectres de fragmentation de proteines entieres). En I’absence de I’etape de digestion enzymatique de la proteine, le temps necessaire pour obtenir un resultat est raccourci (Neil et al., 2021). Cependant, les auteurs n’ont pas demontre l’applicabilite de leur procede a la detection de la PBP2a directement dans des echantillons d’hemoculture, sans etape de sous-culture prealable. A ce jour, aucune technologie remplissant tous les criteres requis pour une implantation en milieu hospitalier, notamment un temps d’analyse court, une simplicity de preparation d’echantillon, un cout limite et une performance satisfaisante, n’est connue. Afin de repondre aux besoins actuels des laboratoires d’analyse, une methode d’identification des souches MRSA devrait repondre au moins aux criteres suivants : - Pas d’etape de sous-culture des bacteries isolees du sang (analyse directement a partir du flacon d’hemoculture lorsque celui-ci est detecte comme positif), - temps de preparation d’echantillon et d’analyse court (inferieur a 2 heures) afin d’obtenir un resultat rapidement, et ainsi permettre I’administration au patient d’un traitement antibiotique adapte dans les plus brefs delais, - cout faible afin que le test puisse etre realise systematiquement, - test detectant les deux proteines PBP2a et PBP2c avec une sensibilite et specificite proches de 100%, y compris des proteines variantes presentant une sequence peptidique presentant une identite de sequence avec les sequences SEQ ID NO. 1 ou 2. Les inventeurs ont mis au point une methode ciblee de detection des souches MRSA par chromatographie liquide couplee a la spectrometrie de masse, realisee directement a partir d’un flacon d’hemoculture positif, incluant une etape d’induction et une preparation rapide d’echantillon, et permettant d’obtenir un resultat en moins de 1h30 a compter de la constatation de la presence d’une souche de Staphylococcus aureus dans un echantillon biologique. EXPOSE DE L'INVENTION 55 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 La presente invention concerne un procede de determination des proprietes de resistance a la meticilline d’une souche de Staphylococcus aureus presente dans un echantillon biologique, comprenant les etapes suivantes : a) incubation de I’echantillon biologique contenant ladite souche de S. aureus pendant au moins 15 minutes, en presence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : cefoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bacteries presentes dans ledit echantillon biologique, c) lyse des bacteries et hydrolyse des proteines bacteriennes, afin d’obtenir un melange de peptides, d) analyse de ce melange de peptides par spectrometrie de masse ciblee, la detection d’au moins un peptide issu de la proteine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette etape d’analyse etant indicative de la resistance a la meticilline de la souche de Staphylococcus aureus presente dans ledit echantillon biologique. La presente invention concerne egalement un kit pour la mise en oeuvre de ce procede, comprenant : - un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : cefoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), - de la trypsine, - un reactif permettant une lyse selective des cellules non-bacteriennes presentes dans I’echantillon biologique, en particulier un detergent choisi parmi la saponine, le Triton X100 et le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), - optionnellement, des reactifs pour la realisation d’une spectrometrie de masse ciblee. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 represente un chromatogramme resultant d’une analyse de type MRM de la souche MRSA26b. A) Echantillon prepare sans I’etape d’induction. B) Echantillon prepare avec I’etape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiques par des fleches. La figure 2 represente les chromatogrammes resultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSA26b. A1 et A2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (A1) et FQITTSPGSTQKK (A2) pour I’echantillon prepare sans I’etape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQKK (B2) pour I’echantillon prepare avec I’etape d’induction. La figure 3 represente un chromatogramme resultat d’une analyse de type MRM de la souche MRSA28b. A) Echantillon prepare sans I’etape d’induction. B) Echantillon prepare avec I’etape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiques par des fleches. 65 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 La figure 4 represente les chromatogrammes resultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSA28b. A1 et A2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (A1) et FQITTSPGSTQKK (A2) pour I’echantillon prepare sans I’etape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (B1) et FQJTTSPGSTQKK (B2) pour I’echantillon prepare avec I’etape d’induction. La figure 5 represente des chromatogrammes de la souche MSSA16b apres une etape d’induction. A) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VALELGSK (B1) et FQJTTSPGSTQKK (B2). Aucun peptide n’est detecte pour les deux types d’analyse. La figure 6 represente des chromatogrammes de la souche MSSAIb apres une etape d’induction. A) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQkk (B2). Aucun peptide n’est detecte pour les deux types d’analyse. La figure 7 represente un chromatogramme resultant d’une analyse de type MRM d’une souche exprimant la PBP2c. A) Echantillon prepare sans I’etape d’induction. B) Echantillon prepare avec I’etape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2c sont indiques par des fleches. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La presente invention concerne un procede de detection de souches de Staphylococcus aureus resistantes a la meticilline, dites souches MRAS, permettant d’obtenir un resultat en moins de 1h30 a partir d’un echantillon biologique identifie comme contenant une souche de S. aureus. La meticilline, egalement orthographiee methicilline, est un antibiotique de la famille des beta-lactamines, appartenant a la sous-famille des penicillines. Son numero CAS est le 61- 32-5. Elle a ete largement utilisee centre les infections a Staphylococcus aureus, avant d’etre supplantee par la cloxacilline, qui presente moins de risque de resistance bacterienne. Avantageusement, le procede de I’invention permet d’identifier les souches resistantes a cet antibiotique (MRAS) avec une sensibilite et une specificite proches de 100 %. Le procede selon I’invention utilise un echantillon biologique sans etape de sous-culture bacterienne, par exemple un echantillon d’hemoculture positif (contenant cellules du sang et bacteries). Une premiere etape d’induction d’expression de la proteine PBP2a ou PBP2c, a l’aide d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines, est suivie d’une etape d’isolation 75 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 rapide des bacteries, puis d’une etape de lyse des bacteries et de digestion enzymatique des proteines, et enfin d’une analyse par spectrometrie de masse ciblee pour la detection de peptides issus de la digestion enzymatique de la proteine PBP2a ou PBP2c. Ainsi, la presente invention concerne un procede de determination des proprietes de resistance a la meticilline d’une souche de Staphylococcus aureus presente dans un echantillon biologique, comprenant les etapes suivantes : a) incubation de I’echantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en presence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : cefoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bacteries presentes dans ledit echantillon biologique, c) lyse des bacteries et hydrolyse des proteines bacteriennes, afin d’obtenir un melange de peptides, d) analyse de ce melange de peptides par spectrometrie de masse ciblee, la detection d’au moins un peptide issu de la proteine PBP2a ou PBP2c Lors de cette etape d’analyse etant indicative de la resistance a la meticilline de la souche de Staphylococcus aureus presente dans ledit echantillon biologique. Ce procede a ete elabore a partir du procede decrit dans la demande internationale WO 2011/045544. Sur la base de ce procede, les inventeurs ont identifie que la proteine PBP2a est exprimee de facon tres heterogene parmi les souches MRSA, a des niveaux d’expression tres differents. En utilisant une methodologie similaire a celle presentee dans la demande WO 2011/045544, mais avec pour echantillon biologique de depart un milieu d’hemoculture positif a Staphylococcus aureus, c’est-a-dire sans etape de sous-culture bacterienne, il a ete mis en evidence sur une cohorte de 98 souches MRSA representatives de I’epidemiologie fran^aise qu’environ 60% desdites souches MRSA presentent un niveau d’expression de la PBP2a trop faible pour pouvoir etre detecte par la methodologie decrite (voir partie experimentale). En effet, une heterogeneite d’expression de la PBP2a existe entre differentes souches MRSA. Certaines souches expriment naturellement la PBP2a a des niveaux importants (detectables sans induction) et d’autres possedent des niveaux d’expression basale tres faibles, ne permettant pas la detection de la PBP2a par analyse directe, sans etape d’induction. Il a done ete conclu que la technologie decrite dans la demande WO 2011/045544 n’est pas adaptee pour une implementation dans un laboratoire d’analyse clinique, car de nombreuses souches MRSA ne peuvent etre detectees. La presente demande concerne une amelioration de ladite methode, consistant en l’ajout d’une etape (a) d’incubation de I’echantillon biologique contenant ladite souche de S. aureus pendant au moins 15 minutes, en presence d’un antibiotique beta-lactame, pour 85 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 induire [’expression de la proteine PBP2a ou de la proteine PBP2c et ainsi disposer d’un nouveau d’expression suffisant pour detecter la proteine variante exprimee dans 100% des souches MRSA. La proteine PBP2a presente la sequence suivante : Sequence 1, PBP2a, Staphylococcus aureus (NCBI ID : WP_001801873.1) : MMKKIKIVPLILIWWGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKDSSYISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGV KDINIQDRKIKKVSKNKKRVDAQYKIKTNYGNIDRNVQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENL KSERGKILDRNNVELANTGTAYEIGIVPKNVSKKDYKAIAKELSISEDYIKQQMDQNWVQDDTFVPLKTVKKM DEYLSDFAKKFHLTTNETESRNYPLGKATSHLLGYVGPINSEELKQKEYKGYKDDAVIGKKGLEKLYDKKLQ HEDGYRVTIVDDNSNTIAHTLIEKKKKDGKDIQLTIDAKVQKSIYNNMKNDYGSGTAIHPQTGELLALVSTPS YDVYPFMYGMSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTAMIGLNNKTLDDKTSYKIDGKGWQKDKS WGGYNVTRYEWNGNIDLKQAIESSDNIFFARVALELGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPFYNAQISNKNLD NEILLADSGYGQGEILINPVQILSIYSALENNGNINAPHLLKDTKNKVWKKNIISKENINLLTDGMQQWNKTH KEDIYRSYANLIGKSGTAELKMKQGETGRQIGWFISYDKDNPNMMMAINVKDVQDKGMASYNAKISGKVYD ELYENGNKKYDIDE La proteine PBP2c presente la sequence suivante : Sequence 2, PBP2c, Staphylococcus aureus (NCBI ID : WP_000725529.1) : MKKIYISVLVLLLIMIIITWLFKDDDIEKTISSIEKGNYNEVYKNSSEKSKLAYGEEEIVDRNKKIYKDLSVNNLKIT NHEIKKTGKDKKQVDVKYNIYTKYGTIRRNTQLNFIYEDKHWKLDWRPDVIVPGLKNGQKINIETLKSERGKI KDRNGIELAKTGNTYEIGIVPNKTPKEKYDDIARDLQIDTKAITNKVNQKWVQPDSFVPIKKINKQDEYIDKLI KSYNLQINTIKSRVYPLNEATVHLLGYVGPINSDELKSKQFRNYSKNTVIGKKGLERLYDKQLQNTDGFKVSI ANTYDNKPLDTLLEKKAENGKDLHLTIDARVQESIYKHMKNDDGSGTALQPKTGEILALVSTPSYDVYPFMN GLSNNDYRKLTNNKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTSIIALKENKLDKNTNFDIYGKGWQKDASWGNYNITRF KWDGNIDLKQAIESSDNIFFARIALALGAKKFEQGMQDLGIGENIPSDYPFYKAQISNSNLKNEILLADSGYG QGEILVNPIQILSIYSALENNGNIQNPHVLRKTKSQIWKKDIIPKKDIDILTNGMERWNKTHRDDIYKNYARII GKSGTAELKMNQGETGRQIGWFVSYNKNNPNMLMAINVKDVQNKGMASYNATISGKVYDDLYDNGKTQF DIDQ Avantageusement, le procede de la presente invention permet de detecter les deux proteines PBP2a et PBP2c, mais egalement des proteines variantes. On entend par « proteine variante » une proteine presentant une sequence peptidique presentant une forte identite de sequence avec les sequences SEQ ID NO. 1 ou 2, en particulier une identite de sequence d’au moins 90%, ou mieux d’au moins 95%, voire de 99% avec I’une des sequences SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO.2. Les proteines variantes presentent en general une, deux ou trois mutations ponctuelles dans les sequences des proteines sauvages, c’est-a-dire qu’elles ne different que pour un, deux ou trois acides amines dans la sequence peptidique. 95 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Les pourcentages d’identite auxquels il est fait reference dans le cadre de I’expose de la presente invention sont determines apres alignement optimal des sequences a comparer, qui peuvent done comprendre une ou plusieurs additions, deletions, troncatures et/ou substitutions. Ce pourcentage d’identite peut etre calcule par toute methode d’analyse de sequences bien connue de I’homme du metier. Le pourcentage d’identite peut etre determine apres alignement global des sequences a comparer prises dans leur integralite, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de determiner l’alignement global de sequences au moyen de I’algorithme de Needleman et Wunsch (1970). Pour les sequences d’acides amines, la comparaison des sequences peut etre effectuee a l’aide de tout logiciel bien connu de I’homme du metier, comme par exemple le logiciel Needle. Les parametres utilises peuvent notamment etre les suivants : « Gap Open » egal a 10,0, « Gap Extend » egal a 0,5 et la matrice BLOSUM62. De preference, le pourcentage d’identite defini dans le cadre de la presente invention est determine au moyen d’un alignement global des sequences a comparer sur toute leur longueur. Etape (a) d’induction de I’expression de PBP2a ou PBP2c L’induction consiste a realiser une incubation rapide (en particulier, durant moins de 3 heures et preferentiellement moins d’une heure) en presence d’un antibiotique afin d’activer les systemes de regulation de I’expression des proteines PBP2a ou PBP2c et ainsi entrainer une surexpression de ces proteines. Cette incubation de I’echantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en presence d’un antibiotique de la classe des beta¬ lactamines choisi parmi la cefoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), induit I’expression d’au moins une proteine choisie parmi PBP2a et PBP2b dans ladite souche bacterienne. L’antibiotique utilise est de la classe des beta-lactamines, e’est-a-dire un antibiotique contenant un noyau beta-lactame. Cet antibiotique est choisi parmi la cefoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique). La cefoxitine, de numero CAS 35607-66-0, est un antibiotique de la famille des beta¬ lactamines, classe parmi les cephalosporines dites de seconde generation. La cefoxitine exerce une action bactericide en inhibant la synthese de la paroi cellulaire. L’acide 6-aminopenicillanique, en abrege 6-APA, de numero CAS 551-16-6, est un derive de la penicilline. io5 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 De preference, l’antibiotique utilise pour I’etape d’induction (a) est la cefoxitine. L’induction de I’expression de PBP2a ou PBP2c est realisee par incubation de I’echantillon biologique en presence d’une quantite adaptee d’antibiotique, typiquement a une temperature comprise entre 30° et 40° Celsius. L’incubation de I’echantillon biologique aura lieu de preference a 37°C, sous agitation. Selon une mise en oeuvre particuliere du procede de I’invention, I’etape d’incubation (a) est realisee pendant une duree d’au moins 15 minutes. De preference, cette etape d’incubation (a) est realisee pendant une duree inferieure a 3 heures, ou inferieure a 2 heures, ou preferentiellement inferieure a 1 heure. Avantageusement, le temps d’incubation pourra etre d’au moins 15 minutes, au moins 20 minutes, au moins 25 minutes, au moins 30 minutes, au moins 35 minutes, au moins 40 minutes ou encore au moins 45 minutes. En particulier, cette etape d’incubation (a) est realisee pendant I’une des durees suivantes : De 15 a 180 minutes ; De 15 a 120 minutes ; De 15 a 90 minutes ; ou encore De 15 a 60 minutes. Comme cela est presente dans les exemples, en I’absence de cette etape d’induction de I’expression de PBP2a ou PBP2c, certaines souches de S. aureus resistantes a la meticilline ne sont pas identifiees en tant que telles, car la detection de I’une des proteines PBP2a ou PBP2c est impossible du fait de la trop faible expression de ladite proteine dans lesdites souches. Etape (b) d’isolement des bacteries Les bacteries peuvent etre isolees par tout moyen connu de la personne de l’art, en particulier par centrifugation. Selon une mise en oeuvre du procede, I’etape (b) comprend egalement une etape de lyse selective des cellules non-bacteriennes presentes dans I’echantillon biologique, cette etape de lyse selective etant realisee avant la centrifugation de I’echantillon. Les composes detergents permettent une lyse des cellules animales par dissociation de la membrane. Les bacteries etant composees d’une paroi de peptidoglycane rigide, elles ne sont pas lysees par l’action du detergent. Un compose detergent peut etre par exemple selectionne parmi le groupe de composes suivants : la saponine, le Triton X100 ou le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 115 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 En particulier, lorsque I’echantillon biologique est un echantillon de sang, I’etape (b) d’isolement des bacteries est avantageusement realisee concomitamment avec une lyse des cellules sanguines presentes dans I’echantillon, grace a I’addition d’un compose detergent. Etape (c) de lyse des bacteries et hydrolyse des proteines bacteriennes Differentes methodes de lyse des cellules bacteriennes peuvent etre employees. On citera par exemple les methodes thermiques (temperature superieure a 100°C pendant 10 minutes, ou congelation dans I’azote liquide), enzymatiques (action du lysozyme ou de la lyticase) ou mecanique (haute pression, broyage ou sonication). Selon une mise en ceuvre preferee du procede de I’invention, la lyse des bacteries est realisee par sonication. L’hydrolyse des proteines bacteriennes en peptides est generalement realisee suivant I’un des deux procedes suivants : a) Par action d’agents chimiques tels que les radicaux hydroxyles qui induisent des coupures aleatoires au niveau des liaisons peptidiques, ou b) Par action d’enzymes proteolytiques (proteases) qui ont une action d’hydrolyse des liaisons proteiques. Selon une mise en oeuvre preferee du procede, l’hydrolyse des proteines bacteriennes a I’etape (c) est une hydrolyse enzymatique. Parmi les proteases couramment utilisees, on citera la pepsine qui hydrolyse les liaisons peptidiques preferentiellement avant les acides amines aromatiques (Tyrosine, Tryptophane et Phenylalanine), I’endoproteinase GluC qui coupe la liaison peptidique au niveau des residus glutamates, ou encore la trypsine qui dive les proteines du cote C-terminal des acides amines lysine et arginine. Selon une mise en oeuvre preferee du procede de I’invention, la trypsine est utilisee comme enzyme pour I’etape d’hydrolyse des proteines bacteriennes. La trypsine est en effet preferee pour le caractere specifique de son activite, la taille adaptee des peptides qu’elle genere, et la nature des peptides « tryptiques » qui possedent du cote C-terminal un acide amine pouvant etre charge positivement (lysine ou arginine), facilitant ainsi l’analyse par spectrometrie de masse (analyse de molecules chargees). Un protocole specifique pour I’etape (c) est presente dans la partie experimentale. Etape (d) d’analyse par spectrometrie de masse ciblee La spectrometrie de masse est une technologie physique d'analyse permettant de detecter et d'identifier des molecules d’interet. Elle est egalement connue sous le nom de single reaction monitoring, ou multiple reaction monitoring, ou parellel reaction monitoring. Son 125 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 principe reside dans la separation en phase gazeuse de molecules chargees (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Les spectrometres de masse comportent : i) une source d'ionisation destinee a ioniser les molecules a analyser, c'est-a-dire a conferer une charge positive ou negative a ces molecules ; ii) un analyseur de masse destine a separer les molecules ionisees en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; iii) un detecteur destine a mesurer le signal produit soit directement par les ions moleculaires, soit par des ions produits a partir des ions moleculaires, comme detailles ciapres. L'etape d'ionisation necessaire pour la mise en oeuvre d'une spectrometrie de masse peut etre mise en oeuvre par tout procede connu de I'homme du metier. La source d'ionisation permet d'amener les molecules a doser sous un etat gazeux et ionise. Une source d'ionisation peut etre utilisee soit en mode positif pour etudier les ions positifs, soit en mode negatif pour etudier les ions negatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisees en fonction du resultat recherche et des molecules analysees. L'analyseur de masse dans lequel est mis en oeuvre l'etape de separation des marqueurs ionises en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de I'homme du metier. On peut citer les analyseurs basse resolution, du type quadripole ou quadrupole (Q), piege a ions 3D (IT) ou lineaire (LIT), egalement appeles trappe ionique, et les analyseurs haute resolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnetique couple a un secteur electrique, le temps de vol (TOF), I’orbitrap. La separation des ions moleculaires en fonction de leur ratio m/z peut etre mise en oeuvre une seule fois (spectrometrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs separations MS successives peuvent etre menees. Lorsque deux separations MS successives sont realisees, l'analyse est appelee MS/MS ou MS2. Lorsque trois separations MS successives sont realisees, l'analyse est appelee MS/MS/MS ou MS3. La spectrometrie de masse ciblee est une variante dans laquelle les molecules d’interet recherchees par cette technique d’analyse sont prealablement connues, et l’analyse sert a identifier leur presence ou non dans un echantillon. Les approches ciblees (Multiple Reaction Monitoring, MRM ; Parallel Reaction Monitoring, PRM ; Multiple Reaction Monitoring-High Resolution, MRM-HR ; Multiple Reaction Monitoring cubed, MRM3, DIA/SWATH) consistent en la selection par un premier analyseur d’une masse 135 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 precise correspondant au peptide d’interet qui est ensuite fragments dans une cellule de collision. Les fragments generes sont ensuite monitores par un troisieme analyseur et leur signal/intensite est mesure. Dans le cas des couplages chromatographiques, le signal des fragments est mesure en fonction du temps pour etre represents sous forme de chromatogramme, l’apparition de pics chromatographiques concomitants (detection simultanee des fragments) etant done temoin de la presence du peptide dans I’echantillon. Ces approches necessitent un travail prealable de selection et de validation des peptides marqueurs pour s’assurer de leur unicite de sequence/masse (ou ratio masse/charge, m/z) et de leur detectabilite. Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de selectionner specifiquement un ion precurseur, de le fragmenter, puis de selectionner specifiquement I'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripole ou des hybrides triple quadripole a trappe ionique sont generalement utilises. Le mode d’analyse DIA/SWATH consiste a enregistrer des spectres de fragmentation de fenetres de selection contigues d’ions precurseurs, le plus souvent chevauchante de 1 unite de rapport masse sur charge (m/z), les fenetres etant caracterisees par une largeur fixe ou variable en m/z, ou bien en utilisant une fenetre glissante de largeur fixe en m/z, tout en faisant en sorte que le temps de cycle total pour couvrir I’ensemble de ces fenetres permet d’echantillonner chaque pic chromatographique par au moins 5 points. Selon une mise en oeuvre preferee de I’invention, l’analyse par spectrometrie de masse est ciblee pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM, MRM3, PRM) ou apres l’analyse (mode de type DIA/SWATH). Plus preferentiellement, l’analyse par spectrometrie de masse ciblee est realisee en mode MRM ou MRM3, et de maniere tout a fait preferee est realisee en mode MRM3. La spectrometrie de masse ciblee est couplee a une separation des peptides, de preference par separation chromatographique ou electrophoretique des peptides. La separation des peptides peut etre realisee par toute technique connue de I’Homme du metier, et en particulier peut etre realisee par chromatographie liquide en phase inverse, par chromatographie liquide en phase normale, par chromatographie liquide en phase hydrophile, ou par electrophorese capillaire. De maniere preferee, la separation des peptides est realisee par chromatographie liquide en phase inverse. 14WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Les peptides recherches pendant cette etape d’analyse sent des peptides issus des proteines PBP2a ou PBP2c, specifiques desdites proteines. Il est entendu qu’au moins un peptide issu de ces proteines pourra etre detecte, mais que de preference plusieurs peptides seront detectes lors de I’analyse, ce qui conforte les 5 resultats obtenus. Selon une mise en oeuvre preferee du procede de I’invention, le au moins un peptide issu de la proteine PBP2a ou PBP2c qui est detecte, c’est-a-dire dont la presence est mise en evidence par spectrometrie de masse ciblee, est choisi parmi le groupe de 12 peptides presentant les sequences suivantes : SEQ ID NO. 3 a SEQ ID NO. 14 presentees dans les 10 tableaux 1 et 2 ci-dessous. Tableau 1. Sequences des peptides issus de PBP2a SEQ ID NO. Peptide issu de PBP2a Localisation dans la sequence SEQ ID NO.1 3 IYNSLGVK 70 - 77 4 DINIQDR 78 - 84 5 ELSISEDYIK 190 - 199 6 FQITTSPGSTQK 396 - 407 7 ILTAMIGLNNK 408 - 418 8 YEWNGNIDLK 447 - 457 9 VALELGSK 471 - 478 10 SYANLIGK 591 - 598 Tableau 2. Sequences des peptides issus de PBP2c SEQ ID NO. Peptide issu de PBP2c Localisation dans la sequence SEQ ID NO.2 11 LAYGEEEIVDR 52 - 62 12 SYNLQINTIK 227 - 236 13 ILTSIIALK 404 - 412 14 IALALGAK 467 - 474 15 Avantageusement, tous ces peptides ont ete selectionnes dans des zones conservees des proteines et sont done identifies egalement dans les proteines variantes de PBP2a et PBP2c. 155 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Le procede selon I’invention pourra etre realise sur tout type d’echantillon biologique susceptible de contenir une souche de Staphylococcus aureus. Selon une mise en oeuvre particuliere du procede, I’echantillon biologique est choisi parmi : - Un fluide biologique, par exemple du sang, serum, plasma, urine, liquide cephalorachidien, et des larmes ; - Une culture bacterienne, par exemple une hemoculture, une colonie bacterienne sur gelose, un bouillon de culture bacterienne; - Un echantillon alimentaire, et - tout autre type d’echantillon biologique. Il s’agira preferentiellement d’un fluide biologique, en particulier d’un echantillon sanguin (sang, serum, plasma), et plus particulierement le milieu d’une hemoculture positive contenant un Staphylococcus aureus. Par « hemoculture », on entend un echantillon de sang preleve chez un patient puis incube dans des conditions adequates pour permettre une proliferation des eventuelles bacteries presentes dans ledit echantillon. Cette hemoculture pourra etre realisee dans des flacons d’hemoculture tels que ceux commercialises dans la gamme Bact/Alert distribuee par BioMerieux, ou ceux de la gamme Bactec distribuee par Becton Dickinson. Kit pour la mise en oeuvre du procede La presente invention concerne egalement un kit pour la mise en oeuvre du procede tel que decrit ci-dessus, comprenant : - un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : cefoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), - de la trypsine, - un reactif permettant une lyse selective des cellules non-bacteriennes presentes dans I’echantillon biologique, par exemple un detergent. Par exemple, parmi les reactifs permettant une lyse selective des cellules non-bacteriennes, on citera un compose detergent selectionne parmi le groupe de composes suivants : la saponine, le Triton X100 ou le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). EXEMPLES Les exemples presentes ci-apres ont pour but d’illustrer le procede selon I’invention, mais ne sont en aucun cas une limitation de I’objet de I’invention. En particulier, dans les exemples presentes ci-apres, l’antibiotique utilise lors de I’etape d’induction est la cefoxitine, mais il est entendu que le 6-APA pourra etre egalement utilise. 165 10 15 20 25 30 35 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Exemple 1. Materiel et Methodes L’etape (a) d’induction est realisee selon le protocole suivant : Realiser I’asepsie du septum du flacon d’hemoculture A l’aide d’une seringue et d’une aiguille 21G, prelever 3,8 mL de milieu d’hemoculture positif puis les transferer dans un tube de 15 mL Ajouter 200 pL d’une solution de cefoxitine a 8 pg/mL Homogeneiser le melange puis incuber le tube a 37° C sous agitation (180 rpm) pendant 30 minutes L’etape (b) d’isolement des bacteries est avantageusement realisee concomitamment avec une lyse des cellules sanguines, selon le protocole suivant : Apres les 30 minutes d’induction, transferer 1 mL de milieu dans un tube de 1,5 mL et ajouter 200 pl d’une solution de SDS a 12 % puis vortexer 10 secondes. Centrifuger pendant 2 minutes a 16100 g et eliminer le surnageant Resuspendre le culot dans 1 mL de serum physiologique Centrifuger 1 minute a 16100 g et eliminer le surnageant Resuspendre dans 1 mL de serum physiologique L’etape (c) de lyse mecanique des bacteries et digestion enzymatique des proteines est realisee selon le protocole suivant : Transferer 200 pL de la suspension bacterienne preparee precedemment dans un tube eppendorf LoBind de 1,5 mL contenant environ 70 mg de billes de verre (Glass beads, acid-washed, 150-212 pm, Sigma-Aldrich, ref G1145) Ajouter 50 pL d’une solution de trypsine a 1mg/mL preparee extemporanement dans du tampon bicarbonate d’ammonimum a 150 mM a partir de trypsine lyophilisee Placer immediatement I’echantillon dans le bain marie d’un sonicateur regie a 50° C puis debuter 10 cycles d’ultrasons (puissance faible) o 30 secondes ultrasons en marche o 30 secondes ultrasons arretes Directement a la fin des 10 cycles d’ultrasons, ajouter 5 pL d’acide formique Centrifuger le tube a 9600 g pendant 5 minutes Transferer 150 pL de surnageant dans un flacon en verre ambre de 2 mL muni d’un insert pour l’analyse par spectrometrie de masse. L’etape (d) d’analyse par spectrometrie de masse ciblee est realisee selon le protocole suivant : Un volume de 5 pL d’echantillon issu de l’etape de lyse/digestion precedente est injecte sur le systeme chromatographique. L’analyse est realisee sur une colonne en phase inverse Waters XBridge Peptide BEH C18, diametre interne de 1mm, longueur 100 mm, taille de 17WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 particule 3,5 pm, taille de pore 130 A grace a un systeme chromatographique dote d’une pompe Agilent 1290 infinity LC, d’un passeur Agilent 1290 Autosampler et d’un four a colonne Agilent 1290 TCC regie a 60 °C. Le gradient utilise pour la separation chromatographique est presente dans le tableau 3. 5 Solvant A : H2O + 0,1 % acide formique Solvant B : Acetonitrile + 0,1 % acide formique Tableau 3. Parametres d’analyse Temps (min) Debit (pL/min) Solvant A (%) Solvant B (%) 0 75 98 2 0,5 75 90 10 15,5 75 60 40 15,7 150 25 75 17 150 25 75 17,1 150 98 2 21,2 150 98 2 21,3 75 98 2 22 75 98 2 La sortie du systeme chromatographique est directement reliee a la source d’ionisation d’un 10 spectrometre de masse QTRAP 6500+ (Sciex) pour analyse en ligne des peptides issus de la digestion des proteines bacteriennes. Le spectrometre de masse est opere en mode MRM ou MRM-cubed (MRM3) et les transitions suivies, pour la proteine PBP2a, sont detaillees dans le tableau 4. Tableau 4. Liste des transitions suivies pour la detection de la PBP2a. Numero de la transition m/z filtre en Q1 m/z filtre en Q3 Dwell time (ms) Peptide Etat de charge du precurseur Ion fragment (monocharge) Potentiel d'orifice (Declustering potential) (V) Energie de collision (V) 1 437,225 645,331 20 DINIQDR 2 y5 43 24,6 18WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 2 437,225 531,289 20 DINIQDR 2 y4 43 24,6 3 437,225 418,204 20 DINIQDR 2 y3 43 24,6 4 594,344 961,514 20 ILTAMIGLNNK 2 y9 47,3 30,3 5 594,344 860,466 20 ILTAMIGLNNK 2 y8 47,3 30,3 6 594,344 789,429 20 ILTAMIGLNNK 2 y7 47,3 30,3 7 594,344 658,388 20 ILTAMIGLNNK 2 y6 47,3 30,3 8 594,344 545,304 20 ILTAMIGLNNK 2 y5 47,3 30,3 9 598,806 954,478 20 ELSISEDYIK 2 y8 47,5 30,4 10 598,806 867,446 20 ELSISEDYIK 2 y7 47,5 30,4 11 598,806 754,362 20 ELSISEDYIK 2 y6 47,5 30,4 12 598,806 667,33 20 ELSISEDYIK 2 y5 47,5 30,4 13 647,836 1019,537 20 FQITTSPGSTQK 2 y10 90 31 14 647,836 906,453 20 FQITTSPGSTQK 2 y9 90 31 15 647,836 805,405 20 FQITTSPGSTQK 2 y8 90 31 16 647,836 704,357 20 FQITTSPGSTQK 2 y7 90 31 17 647,836 617,325 20 FQITTSPGSTQK 2 y6 90 31 18 447,258 780,425 20 IYNSLGVK 2 y7 43,3 25 19 447,258 617,362 20 IYNSLGVK 2 y6 43,3 25 20 447,258 503,319 20 IYNSLGVK 2 y5 43,3 25 21 447,258 416,287 20 IYNSLGVK 2 y4 43,3 25 22 433,243 778,446 20 SYANLIGK 2 y7 42,9 24,5 23 433,243 615,382 20 SYANLIGK 2 y6 42,9 24,5 24 433,243 544,345 20 SYANLIGK 2 y5 42,9 24,5 25 408,745 717,414 20 VALELGSK 2 y7 20 20 26 408,745 646,377 20 VALELGSK 2 y6 20 20 27 408,745 533,293 20 VALELGSK 2 y5 20 20 28 408,745 404,25 20 VALELGSK 2 y4 20 20 29 632,333 971,552 20 YEWNGNIDLK 2 y9 48,4 31,6 19WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 30 632,333 872,484 20 YEWNGNIDLK 2 y8 48,4 31,6 31 632,333 773,415 20 YEWNGNIDLK 2 y7 48,4 31,6 32 632,333 659,372 20 YEWNGNIDLK 2 y6 48,4 31,6 Les transitions suivies pour la proteine PBP2c sont detaillees dans le tableau 5. Tableau 5. Liste des transitions suivies pour la detection de la PBP2c Numero de la transition m/z filtre en Q1 m/z filtre en Q3 Dwell time (ms) Peptide Etat de charge du precurseur Ion fragment (monocharge) Potentiel d'orifice (Declustering potential) (V) Energie de collision (V) 43 647,320 946,448 20 LAYGEEEIVDR 2 y8 48.8 32.2 44 647,320 889,426 20 LAYGEEEIVDR 2 y7 48.8 32.2 45 647,320 760,384 20 LAYGEEEIVDR 2 y6 48.8 32.2 46 647,320 631,341 20 LAYGEEEIVDR 2 y5 48.8 32.2 47 647,320 502,298 20 LAYGEEEIVDR 2 y4 48.8 32.2 48 597,330 943,557 20 SYNLQINTIK 2 y8 47.4 30.4 49 597,330 829,514 20 SYNLQINTIK 2 y7 47.4 30.4 50 597,330 716,430 20 SYNLQINTIK 2 y6 47.4 30.4 51 597,330 588,372 20 SYNLQINTIK 2 y5 47.4 30.4 52 597,330 475,287 20 SYNLQINTIK 2 y4 47.4 30.4 53 597,330 361,245 20 SYNLQINTIK 2 y3 47.4 30.4 54 486,329 745,482 20 ILTSIIALK 2 y7 44.4 26.4 55 486,329 644,434 20 ILTSIIALK 2 y6 44.4 26.4 56 486,329 557,402 20 ILTSIIALK 2 y5 44.4 26.4 57 486,329 444,318 20 ILTSIIALK 2 y4 44.4 26.4 58 486,329 331,234 20 ILTSIIALK 2 y3 44.4 26.4 59 378,753 643,414 20 IALALGAK 2 y7 41.5 22.5 60 378,753 572,377 20 IALALGAK 2 y6 41.5 22.5 20WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 61 378,753 459,293 20 IALALGAK 2 y5 41.5 22.5 62 378,753 388,255 20 IALALGAK 2 y4 41.5 22.5 63 378,753 275,171 20 IALALGAK 2 y3 41.5 22.5 64 378,753 218,150 20 IALALGAK 2 y2 41.5 22.5 Les parametres du spectrometre de masse pour l’analyse en mode MRM sont detailles dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6. Parametres du spectrometre de masse pour analyse en mode MRM Type de balayage MRM Polarite Positive Source d'ionisation Turbo Spray lonDrive (SCIEX) Resolution Q1 unit Resolution Q3 unit Pause inter-scan 5 ms Vitesse de balayage 10 Da/sec Gaz rideau 50.00 psi Tension de cone 5500.00 V Temperature de source 550.00 °C Gaz de nebulisation (GS1) 70.00 psi Gaz chauffant (GS2) 60.00 psi Gaz de collision high Potentiel d'entree (EP) 10.00 V Potentiel en sortie de cellule de collision (CXP) 12.00 V Version du logiciel Analyst 1.7.2 5 Les parametres du spectrometre de masse pour l’analyse en mode MRM3 sont detailles dans le tableau 7 (peptide VALELGSK) et dans le tableau 8 (peptide FQITTSPGSTQK) cidessous. Tableau 7. Parametres du spectrometre de masse pour analyse en mode MRM3 21WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Type de balayage MS/MS/MS (MS3) Premier precurseur 408,75 Da Second precurseur 646,38 Da Analyse centree (Ion de 3eme generation) 404,25 Da Fenetre de balayage 2 Da Polarite Positive Source d'ionisation Turbo Spray lonDrive (SCIEX) Resolution Q1 unit Resolution Q3 LIT Temps de remplissage fixe de la trappe a ion lineaire 200 ms Temps d'excitation 25 ms Barriere d'entee Q3 8 V Pause inter-scan 15 ms Piegage Q0 Enabled Vitesse de balayage 1000 Da/sec Gaz rideau 50.00 psi Tension de cone 5500.00 V Temperature de source 550.00 °C Gaz de nebulisation (GS1) 70.00 psi Gaz chauffant (GS2) 60.00 psi Gaz de collision high Potentiel d'orifice (DP) 20 V Energie de collision (CE) 20 V Propagation de I'energie de collision (CES) 0 V Energie d'excitation (AF2) 0,1 V Potentiel d'entree (EP) 10.00 V Potentiel en sortie de cellule de collision (CXP) 12.00 V Version du logiciel Analyst 1.7.2 22WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Tableau 8. Parametres du spectrometre de masse pour analyse en mode MRM3 Type de balayage MS/MS/MS (MS3) Premier precurseur 647,84 Da Second precurseur 805,41 Da Analyse centree (Ion de 3eme generation) 617,33 Da Fenetre de balayage 2 Da Polarite Positive Source d'ionisation Turbo Spray lonDrive (SCIEX) Resolution Q.1 unit Resolution Q3 LIT Temps de remplissage fixe de la trappe a ion lineaire 200 ms Temps d'excitation 25 ms Barriere d'entee Q3 8 V Pause inter-scan 15 ms Piegage Q0 Enabled Vitesse de balayage 1000 Da/sec Gaz rideau 50.00 psi Tension de cone 5500.00 V Temperature de source 550.00 °C Gaz de nebulisation (GS1) 70.00 psi Gaz chauffant (GS2) 60.00 psi Gaz de collision high Potentiel d'orifice (DP) 90 V Energie de collision (CE) 31 V Propagation de I'energie de collision (CES) 0 V Energie d'excitation (AF2) 0,11 V Potentiel d'entree (EP) 10.00 V Potentiel en sortie de cellule de collision (CXP) 12.00 V 235 10 15 20 25 30 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Version du logiciel Analyst 1.7.2 Example 2. Premiers resultats Les figures 1 et 2 illustrent la necessite de I’etape d’induction pour la detection des peptides issus de la PBP2a par MRM. Les chromatogrammes A sont issus de I’analyse des souches sans etape d’induction, les chromatogrammes B correspondent a I’analyse des memes souches apres une etape d’induction. En absence d’induction, les pics des peptides issus de la PBP2a sont confondus avec le bruit de fond et done non detectables. Au contraire, apres une etape d’induction, les pics caracteristiques sont observes : ils sont correctement dessines et au-dessus du bruit de fond. La PBP2a est correctement detectee. Des hemocultures ont ete ensemencees pour 98 souches de MRSA et 19 souches de Staphylococcus aureus sensibles a la meticilline (methicilin-sensible Staphylococcus aureus, MSSA en anglais) n’exprimant pas la PBP2a, puis les echantillons ont ete prepares a positivite du flacon et analyses selon les protocoles de I’exemple 1. L’aire sous la courbe a ete mesuree pour chaque transition. Bien que n’exprimant pas la PBP2a, l’aire sous la courbe a egalement ete mesuree pour les echantillons se souches sensibles MSSA sur la fenetre d’elution du peptide, afin d’obtenir une valeur de ligne de base. En effet, le signal d’une transition peut etre pollue par du bruit ou des interferences dues a la matrice, il est done necessaire d’evaluer cette ligne de base dans une matrice ne comportant pas l’analyte (ici la PBP2a) afin d’etablir des seuils au-dessus desquels nous pouvons confirmer la presence des peptides. Pour chaque transition, le seuil correspond a 150% de l’aire maximale mesuree sur la fenetre d’elution du peptide pour les echantillons controles MSSA. Exemple 3. Resultats de spectrometrie MRM Toutes les transitions MRM pour lesquelles la valeur d’aire est superieure a la valeur seuil ont ete considerees positives et sont notees 1 dans les tableaux de resultats suivants. Les transitions pour lesquelles l’aire est inferieure a la valeur seuil sont notees 0 et done considerees comme etant negatives. Un echantillon a ete considere comme identifie comme comprenant une souche MRSA dans les cas ou au moins 3 peptides sont detectes avec au moins 2 transitions positives. Les tableaux 9 et 10 ci-dessous correspondent aux resultats obtenus lors de I’analyse MRM des 98 MRSA sans I’etape d’induction. 24WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Les tableaux 11 et 12 ci-dessous correspondent aux resultats obtenus lors de l’analyse MRM des 98 MRSA avec I’etape d’induction. Tableau 9 : Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSAIb 5 a MRSA49b preparees SANS etape d’induction Numero de la transition 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 MRSA1 b 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA2 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA4 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA5 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA6 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA7 b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA8 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA9 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA1 Ob 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA1 1b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 MRSA1 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA1 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA1 4b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA1 5b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA1 6b 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA1 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 MRSA1 8b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA1 9b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA2 Ob 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 MRSA2 1b 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA2 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 MRSA2 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA2 4b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA2 5b 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MRSA2 6b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA2 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA2 8b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA2 9b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA3 Ob 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA3 1b 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA3 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA3 3b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 4b 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA3 5b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA3 6b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA3 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA3 8b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA3 9b 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MRSA4 Ob 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MRSA4 1b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 MRSA4 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA4 3b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA4 4b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MRSA4 5b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MRSA4 6b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA4 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA4 8b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA4 9b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tableau 10. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSA50b a MRSA98b preparees SANS etape d’induction Numero de la transition 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 MRSA5 Ob 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA5 1b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA5 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA5 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA5 4b 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA5 5b 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA5 6b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA5 7b 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA5 8b 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 MRSA5 9b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA6 Ob 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 MRSA6 1b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA6 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA6 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA6 4b 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA6 5b 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA6 6b 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 MRSA6 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA6 8b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA6 9b 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 MRSA7 Ob 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 MRSA7 1b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA7 2b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA7 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA7 4b 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 5b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA7 6b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA7 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA7 8b 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 9b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA8 Ob 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA8 1b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA8 2b 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA8 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 27WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA8 4b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 MRSA8 5b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA8 6b 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 MRSA8 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA8 8b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA8 9b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 MRSA9 Ob 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 MRSA9 1b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA9 2b 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 MRSA9 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA9 4b 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA9 5b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA9 6b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA9 7b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA9 8b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tableau 11. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSAIb a MRSA49b preparees AVEC etape d’induction Numero de la transition 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 MRSA1 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA2 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA4 b 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA5 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 MRSA6 b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA8 b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 MRSA9 b 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MRSA1 Ob 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA1 1b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA1 2b 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 28WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA1 3b 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 MRSA1 4b 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA1 5b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA1 6b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA1 7b 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA1 8b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA1 9b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA2 Ob 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA2 1b 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA2 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA2 3b 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA2 4b 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA2 5b 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA2 6b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA2 7b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA2 8b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 MRSA2 9b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA3 Ob 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA3 1b 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MRSA3 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 3b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 4b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA3 5b 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA3 6b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 7b 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA3 8b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA3 9b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA4 Ob 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA4 1b 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MRSA4 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA4 3b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA4 4b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 29WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA4 5b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA4 6b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 MRSA4 7b 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA4 8b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA4 9b 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 Tableau 12. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSA50b a MRSA98b preparees AVEC etape d’induction Numero de la transition 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 MRSA5 Ob 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA5 1b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA5 2b 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 MRSA5 3b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA5 4b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA5 5b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA5 6b 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA5 7b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA5 8b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA5 9b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 Ob 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA6 1b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 2b 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 3b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA6 4b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 5b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 6b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 7b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 8b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA6 9b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 Ob 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 1b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 30WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA7 2b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 3b 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA7 4b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 5b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 MRSA7 6b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 7b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 8b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA7 9b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA8 Ob 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA8 1b 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA8 2b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA8 3b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA8 4b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA8 5b 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 MRSA8 6b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA8 7b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA8 8b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 MRSA8 9b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA9 Ob 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 1b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 2b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 3b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 4b 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 5b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MRSA9 6b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 MRSA9 7b 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 MRSA9 8b 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 Au regard des resultats presentes dans les tableaux 9 a 12, les conclusions suivantes peuvent etre enoncees : Sans etape d’induction, 38 MRSA sur 98 presentent au moins 2 transitions positives pour au 5 moins 3 peptides ce qui correspond a une sensibilite de detection de 39%. 315 10 15 20 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 Avec I’etape d’induction, 96 MRSA sur 98 possedent au moins 2 transitions positives pour au moins 3 peptides. Ceci correspond a une sensibilite de 98% de detection des MRSA avec ces criteres de validation. Seules les souches MRSA9b et MRSA41b ne sont pas correctement identifiees car seuls 2 peptides sont detectes avec 2 transitions pour la souche MRSA41b et 1 peptide avec 2 transitions pour la souche MRSA9b. Tous les MSSA analyses suivant le meme procede ont pour chaque transition, une valeur d’aire sous la courbe inferieure aux valeurs seuil fixees precedemment. Cela signifie qu’aucun MSSA n’est identifie comme MRSA ce qui equivaut a une specificite de 100%. Exemple 4. ResuItats de spectrometrie MRM3 pour PBP2A Les transitions MRM3 pour lesquelles la valeur d’aire est superieure a la valeur seuil ont ete considerees positives et sont notees 1. Les transitions pour lesquelles I’aire est inferieure ou egales a la valeur seuil sont notees 0 et considerees comme negatives. Un echantillon a ete considere comme identifie en tant que MRSA si au moins 1 transition MRM3 a ete detectee positive. Les 19 souches MSSA ont ete analysees suivant le meme procede et les resultats sont presentes dans les tableaux suivants. Le tableau 13 correspond aux resultats obtenus lors de l’analyse MRM3 des 98 MRSA sans I’etape d’induction. Il represente les validations des transitions MRM3 des 98 MRSA prepares SANS I’etape d’induction Le tableau 14 correspond aux resultats obtenus lors de l’analyse MRM3 des 98 MRSA avec I’etape d’induction. Il represente les validations des transitions MRM3 des 98 MRSA prepares avec I’etape d’induction. Tableau 13. Resultats analyse MRM3 sans etape d’induction VALELGSK FQITTSPGSTQK 408,75/646, 38/404,25 647,84/805, 41/617,33 MRSA1b 1 1 MRSA2b 1 1 MRSA3b 1 0 MRSA4b 1 1 MRSA5b 1 0 MRSA6b 1 1 MRSA7b 1 0 MRSA8b 0 0 MRSA9b 0 0 MRSA10b 1 1 MRSA11b 1 0 MRSA12b 1 0 MRSA13b 0 0 MRSA14b 1 1 MRSA15b 1 1 MRSA16b 1 1 MRSA17b 1 0 VALELGSK FQITTSPGSTQK 408,75/646, 38/404,25 647,84/805, 41/617,33 MRSA50b 1 1 MRSA51b 1 0 MRSA52b 0 0 MRSA53b 1 1 MRSA54b 1 1 MRSA55b 1 0 MRSA56b 0 0 MRSA57b 1 1 MRSA58b 1 1 MRSA59b 1 1 MRSA60b 1 1 MRSA61b 1 1 MRSA62b 1 1 MRSA63b 1 1 MRSA64b 1 1 MRSA65b 1 1 MRSA66b 1 1 32WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA18b 1 0 MRSA19b 0 0 MRSA20b 1 1 MRSA21b 1 1 MRSA22b 1 0 MRSA23b 1 0 MRSA24b 0 0 MRSA25b 1 1 MRSA26b 0 0 MRSA27b 1 0 MRSA28b 1 1 MRSA29b 1 0 MRSA30b 1 0 MRSA31b 1 1 MRSA32b 1 1 MRSA33b 1 1 MRSA34b 1 1 MRSA35b 1 0 MRSA36b 1 1 MRSA37b 0 0 MRSA38b 1 1 MRSA39b 1 1 MRSA40b 1 1 MRSA41b 1 1 MRSA42b 1 1 MRSA43b 1 1 MRSA44b 1 1 MRSA45b 1 1 MRSA46b 0 0 MRSA47b 1 0 MRSA48b 1 0 MRSA49b 1 0 MRSA67b 1 1 MRSA68b 1 1 MRSA69b 1 1 MRSA70b 1 0 MRSA71b 1 1 MRSA72b 1 1 MRSA73b 0 0 MRSA74b 1 1 MRSA75b 1 0 MRSA76b 1 1 MRSA77b 1 0 MRSA78b 1 1 MRSA79b 1 1 MRSA80b 1 1 MRSA81b 1 1 MRSA82b 1 1 MRSA83b 1 1 MRSA84b 1 0 MRSA85b 1 1 MRSA86b 1 1 MRSA87b 1 1 MRSA88b 1 0 MRSA89b 1 1 MRSA90b 1 1 MRSA91b 1 1 MRSA92b 1 1 MRSA93b 1 0 MRSA94b 1 1 MRSA95b 1 1 MRSA96b 1 0 MRSA97b 1 0 MRSA98b 1 1 Tableau 14. Resultats d’analyse MRM3 avec etape d’induction VALELGSK FQITTSPGSTQK 408,75/646, 38/404,25 647,84/805, 41/617,33 MRSA1b 1 1 MRSA2b 1 1 MRSA3b 1 1 MRSA4b 1 1 MRSA5b 1 1 MRSA6b 1 1 MRSA7b 1 1 MRSA8b 1 1 MRSA9b 1 0 MRSAlOb 1 1 MRSA11b 1 1 MRSA12b 1 1 MRSA13b 1 1 MRSA14b 1 1 VALELGSK FQITTSPGSTQK 408,75/646, 38/404,25 647,84/805, 41/617,33 MRSA50b 1 1 MRSA51b 1 1 MRSA52b 1 1 MRSA53b 1 1 MRSA54b 1 1 MRSA55b 1 1 MRSA56b 1 1 MRSA57b 1 1 MRSA58b 1 1 MRSA59b 1 1 MRSA60b 1 1 MRSA61b 1 1 MRSA62b 1 1 MRSA63b 1 1 33WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 MRSA15b 1 1 MRSA16b 1 1 MRSA17b 1 1 MRSA18b 1 1 MRSA19b 1 1 MRSA20b 1 1 MRSA21b 1 1 MRSA22b 1 1 MRSA23b 1 1 MRSA24b 1 1 MRSA25b 1 1 MRSA26b 1 1 MRSA27b 1 1 MRSA28b 1 1 MRSA29b 1 1 MRSA30b 1 1 MRSA31b 1 1 MRSA32b 1 1 MRSA33b 1 1 MRSA34b 1 1 MRSA35b 1 0 MRSA36b 1 1 MRSA37b 1 1 MRSA38b 1 1 MRSA39b 1 1 MRSA40b 1 1 MRSA41b 1 1 MRSA42b 1 1 MRSA43b 1 1 MRSA44b 1 1 MRSA45b 1 1 MRSA46b 1 1 MRSA47b 1 1 MRSA48b 1 1 MRSA49b 1 1 MRSA64b 1 1 MRSA65b 1 1 MRSA66b 1 1 MRSA67b 1 1 MRSA68b 1 1 MRSA69b 1 1 MRSA70b 1 1 MRSA71b 1 1 MRSA72b 1 1 MRSA73b 1 0 MRSA74b 1 1 MRSA75b 1 1 MRSA76b 1 1 MRSA77b 1 1 MRSA78b 1 1 MRSA79b 1 1 MRSA80b 1 1 MRSA81b 1 1 MRSA82b 1 1 MRSA83b 1 1 MRSA84b 1 1 MRSA85b 1 1 MRSA86b 1 1 MRSA87b 1 1 MRSA88b 1 1 MRSA89b 1 1 MRSA90b 1 1 MRSA91b 1 1 MRSA92b 1 1 MRSA93b 1 1 MRSA94b 1 1 MRSA95b 1 1 MRSA96b 1 1 MRSA97b 1 1 MRSA98b 1 1 19 souches sensibles a la meticilline (MSSAIb, 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b, 8b, 9b, 10b, 11b, 12b, 13b 14b, 15b, 16b, 17b, 18b et 19b) ont ete testees : aucun peptide issu de PBP2a n’a ete detecte, comme attendu. Les resultats ayant tous une valeur de zero ne sont pas presentes 5 en detail. Sans I’etape d’induction, 87 souches sur 98 presentent au moins une transition positive, ce qui correspond a 89% de sensibilite (tableau 12). Avec I’etape d’induction, la totalite des souches MRSA testees ont au moins une transition MRM3 positive, ce qui correspond a 100% de sensibilite (tableau 13). 10 Tous les MSSA analyses suivant le meme procede (avec I’etape d’induction) ont pour chaque transition, une valeur d’aire sous la courbe inferieure ou egale aux valeurs seuil fixees 345 10 15 20 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 precedemment. Cela signifie qu’aucune souche sensible MSSA n’est identifiee comme etant MRSA, ce qui equivaut a une specificite de 100%. Conclusions Les performances du procede selon I’invention sont presentees dans le tableau 15 ci-dessous, qui illustre I’importance de I’etape d’induction. Tableau 15. Sensibilite du procede de I’invention Sensibilite de detection de la PBP2a Sans induction Avec induction Methode d'aquisition MRM 39% 98% MRM3 89% 100% Ces resultats montrent que le procede selon I’invention permet une identification rapide des MRSA en moins de 1h30, directement a partir d’un echantillon sanguin (hemoculture) positif, et avec des performances superieures aux autres methodes actuellement sur le marche (98% de sensibilite et 100% de specificite en MRM, et 100% de sensibilite et 100% de specificite en MRM3). La mise en oeuvre du protocole de preparation de I’echantillon est simple et le cout en consommables par analyse est minime. De plus, I’eventualite de non-detection, dans le cas d’une proteine variante de la PBP2a possedant une ou plusieurs mutations ponctuelles, est tres peu probable, etant donne que l’analyse se base sur la detection de 8 peptides differents de la proteine PBP2a. Enfin, il a egalement ete montre que I’etape d’induction du procede est necessaire pour la detection de la proteine PBP2c dans une souche de staphylococcus aureus exprimant la proteine. Les resultats presentes en figure 7 montrent que la detection aurait ete impossible sans I’etape prealable d’induction par incubation avec un antibiotique de la famille des beta¬ lactamines. 355 10 15 20 25 WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 REFERENCES WO 2011/045544 Kirby, W.M.M. (1944). Extraction of a highly potent penicillin inactivator from penicillin resistant staphylococci. Science 99, 452-453. Felten, A., Grandry, B., Lagrange, P.H., and Casin, I. (2002). Evaluation of Three Techniques for Detection of Low-Level Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a Disk Diffusion Method with Cefoxitin and Moxalactam, the Vitek 2 System, and the MRSA-Screen Latex Agglutination Test. J Clin Microbiol 40, 2766-2771. Sparbier K, Lange C, Jung J, Wieser A, Schubert S, Kostrzewa M. 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Claims (10)

  1. REVENDICATIONS 1. Procede de determination des proprietes de resistance a la meticilline d’une souche de Staphylococcus aureus presente dans un echantillon biologique, comprenant les etapes suivantes : a) incubation de I’echantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en presence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la cefoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bacteries presentes dans ledit echantillon biologique, c) lyse des bacteries et hydrolyse des proteines bacteriennes, afin d’obtenir un melange de peptides, d) analyse de ce melange de peptides par spectrometrie de masse ciblee couplee a une separation des peptides, la detection d’au moins un peptide issu de la proteine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou de la proteine PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de I’etape d’analyse (d) etant indicative de la resistance a la meticilline de la souche de Staphylococcus aureus presente dans ledit echantillon biologique.
  2. 2. Procede selon la revendication 1 , caracterise en ce que la separation des peptides est une separation par chromatographie ou par electrophorese.
  3. 3. Procede selon la revendication 1 ou 2, caracterise en ce que l’analyse par spectrometrie de masse est ciblee pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou apres l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
  4. 4. Procede selon I’une des revendications 1 a 3, caracterise en ce que I’etape d’incubation (a) est realisee pendant une duree comprise entre 15 et 180 minutes.
  5. 5. Procede selon I’une des revendications 1 a 4, caracterise en ce que I’etape (b) comprend egalement une etape de lyse selective des cellules non-bacteriennes presentes dans I’echantillon biologique.
  6. 6. Procede selon I’une des revendications 1 a 5, caracterise en ce que I’hydrolyse des proteines bacteriennes a I’etape (c) est une hydrolyse enzymatique.
  7. 7. Procede selon la revendication 6, caracterise en ce que I’enzyme est la trypsine.
  8. 8. Procede selon I’une des revendications 1 a 7 , caracterise en ce que le au moins un peptide detecte est choisi parmi le groupe de 12 peptides presentant les sequences suivantes : SEQ ID NO. 3 a SEQ ID NO. 14.
  9. 9. Procede selon I’une des revendications 1 a 8, caracterise en ce que I’echantillon biologique est choisi parmi : - Un fluide biologique tel que sang, serum, plasma, urine, liquide cephalo-rachidien, et 37WO 2023/135390 PCT/FR2023/050038 larmes ; - Une culture bacterienne telle que une hemoculture, une colonie sur gelose, ou un bouillon de culture; - Un echantillon alimentaire, et 5 - tout autre type d’echantillon biologique.
  10. 10. Kit pour la mise en oeuvre du procede selon I’une des revendications 1 a 9, comprenant : - au moins un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la cefoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), - de la trypsine, et 10 - un reactif permettant une lyse selective des cellules non-bacteriennes presentes dans I’echantillon biologique, par exemple un detergent. 38
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