EP4463561A1 - Procede de determination de la resistance a la meticilline de souches de staphylococcus aureus - Google Patents

Procede de determination de la resistance a la meticilline de souches de staphylococcus aureus

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Publication number
EP4463561A1
EP4463561A1 EP23703516.7A EP23703516A EP4463561A1 EP 4463561 A1 EP4463561 A1 EP 4463561A1 EP 23703516 A EP23703516 A EP 23703516A EP 4463561 A1 EP4463561 A1 EP 4463561A1
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EP
European Patent Office
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biological sample
peptides
analysis
staphylococcus aureus
pbp2a
Prior art date
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Pending
Application number
EP23703516.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jérôme Lemoine
Francis DEFORET
François VANDENESCH
Olivier DAUWALDER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weezion
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Normale Superieure de Lyon
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Weezion
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Normale Superieure de Lyon
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
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    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Definitions

  • the present invention relates to a method for characterizing bacterial strains belonging to the staphylococci family, and in particular to a method for identifying bacterial strains resistant to certain antibiotics. This allows healthcare personnel to select appropriate antibiotics for each infected patient, based on this resistance data.
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus resistant to penicillin were characterized only two years after the introduction of this antibiotic in the treatment chain for bacterial infections (Kirby, 1944) and spread rapidly, resulting in the cessation progressive use of penicillin in the clinic in favor of new semi-synthetic antibacterial molecules such as methicillin and oxacillin.
  • MRSA Metalicillin Resistant Staphylococcus ureus
  • MRSA strains express a particular toxin, LPV or Panton-Valentine leucocidin. This so-called “porogen” toxin induces pores in the cell walls, in particular cells of the immune system, thus killing the cells capable of fighting against infection.
  • MRSA strains Although initially confined to the hospital setting, the MRSA strains then spread through the population. In 2019, in Europe, MRSA strains were estimated to account for between 1% and 46% of Staphylococcus aureus infections. According to the World Health Organization, a person infected with an MRSA strain has a 64% higher probability of death than a person infected with a non-resistant strain.
  • MRSA strains are therefore a major challenge for the care and treatment of patients with Staphylococcus aureus infections.
  • the MRS ⁇ phenotype is due to the expression of a specific protein, PBP2a for “Penicillin binding protein 2a”, encoded by the Mec A gene, and in more rare cases to the expression of the PBP2c protein encoded by the gene ecC.
  • PBP2a for “Penicillin binding protein 2a”, encoded by the Mec A gene
  • PBP2c protein encoded by the gene ecC These proteins "replace" the transpeptidase PBP2, an enzyme involved in the formation of the bacterial cell wall. Since the alternative proteins PBP2a and PBP2c have low affinity for methicillin and penicillin, the presence of these antibiotics does not inhibit their activity, and cell wall synthesis continues normally, thus ensuring bacterial growth even in the presence of these antibiotics .
  • Phenotypic methods are based on an evaluation of bacterial growth in the presence of an antibiotic
  • MecA and/or MecC genes are based on the detection of MecA and/or MecC genes in the bacterial genome of the strains studied;
  • Immunological and proteomic methods are based on the detection of the PBP2a protein or its peptides.
  • immuno-chromatography detection using antibodies
  • mass spectrometry methods are particularly used.
  • agar diffusion methods Although old, are still widely used in laboratories due to their simplicity and low cost. They consist of cultivating the bacteria on agar in the presence of an antibiotic disc, usually oxacillin or cefoxitin. The sensitive or resistant phenotype of the bacterial strain is determined by evaluating the diameter of the growth inhibition zone around the disc.
  • the article by Sparbier et al., 2013, discloses such a phenotypic method where bacterial growth is assessed in the presence of antibiotics.
  • the bacteria are incubated in the presence of oxacillin or cefoxitin, and "charged" lysine presenting a high molecular weight. Incorporation of this charged amino acid will only be observed in newly synthesized proteins. However, only bacteria resistant to antibiotics show significant protein biosynthesis activity. Proteins comprising the loaded lysine are then detected by M ⁇ LDI-TOF.
  • the main disadvantage of this technology is that it tends to generate "false positives", especially in the case of strains carrying an SSCmec cassette that does not contain the MecA gene, or for strains expressing a variant protein coded by a gene presenting a sequence slightly different from that established for the MecA gene.
  • the duration of the test as such is between 15 and 20 minutes. This test has very good performance with a sensitivity of 100% and a specificity greater than 99%.
  • the major disadvantage of this technique is that it requires a minimum quantity of 1.5 ⁇ 10 9 bacteria in the sample tested, which involves a bacterial culture step lasting at least 10 hours.
  • Immunochromatographic tests have also been marketed for the detection of MRS ⁇ strains, for example the ClearviewTM PBP2a S ⁇ Culture Colony Test kit distributed by ⁇ lere.
  • the ClearviewTM PBP2a S ⁇ Culture Colony Test can advantageously detect PBP2c from colonies growing at the edge of a cefoxitin disc after culture on agar. This induction step necessary for the detection of MecC, however, leads to an additional delay of approximately 18 hours before the result is rendered (Dupieux et al., 2017).
  • targeted indicates that specific peptide sequences are sought; they may be whole protein sequences or peptides resulting from an enzymatic digestion of said proteins.
  • Targeted mass spectrometry has been used successfully to characterize the resistance and virulence of Staphylococcus aureus strains by detecting in particular the PBP2a protein or virulence factors such as PVL (Charretier et al., 2015).
  • a method for identifying MRSA strains should meet at least the following criteria:
  • the inventors have developed a targeted method for detecting MRSA strains by liquid chromatography coupled with mass spectrometry, carried out directly from a positive blood culture flask, including an induction step and rapid sample preparation , and making it possible to obtain a result in less than 1 hour 30 minutes from the observation of the presence of a strain of Staphylococcus aureus in a biological sample.
  • the present invention relates to a method for determining the properties of resistance to methicillin of a strain of Staphylococcus aureus present in a biological sample, comprising the following steps: a) incubation of the biological sample containing said strain of S.
  • aureus for at least 15 minutes, in the presence of an antibiotic of the beta-lactam class chosen from the following group: cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid), b) isolation of the bacteria present in the said biological sample, c) lysis of the bacteria and hydrolysis of bacterial proteins, in order to obtain a mixture of peptides, d) analysis of this mixture of peptides by targeted mass spectrometry, the detection of at least one peptide derived from the protein PBP2a (SEQ ID NO. 1) or PBP2c (SEQ ID NO. 2) during this analysis step being indicative of the resistance to methicillin of the strain of Staphylococcus aureus present in said biological sample.
  • an antibiotic of the beta-lactam class chosen from the following group: cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid
  • the present invention also relates to a kit for implementing this method, comprising:
  • an antibiotic of the beta-lactam class chosen from the following group: cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid),
  • a reagent allowing selective lysis of the non-bacterial cells present in the biological sample, in particular a detergent chosen from saponin, Triton X100 and Sodium Dodecyl Sulfate (SDS),
  • Figure 1 represents a chromatogram resulting from an MRM type analysis of the MRSA26b strain.
  • Figure 2 represents the chromatograms resulting from an MRM3 type analysis of the MRSA26b strain.
  • A1 and A2) MRM3 chromatograms of the VALELGSK (A1) and FQITTSPGSTQKK (A2) peptides for the sample prepared without the induction step.
  • B1 and B2) MRM3 chromatograms of the VALELGSK (B1) and FQITTSPGSTQKK (B2) peptides for the sample prepared with the induction step.
  • FIG. 3 represents a chromatogram resulting from an MRM type analysis of the MRSA28b strain.
  • FIG. 4 represents the chromatograms resulting from an MRM3 type analysis of the MRS ⁇ 28b strain. ⁇ 1 and ⁇ 2) MRM3 chromatograms of the V ⁇ LELGSK ( ⁇ 1) and FQITTSPGSTQKK ( ⁇ 2) peptides for the sample prepared without the induction step. B1 and B2) MRM3 chromatograms of the V ⁇ LELGSK (B1) and FQITTSPGSTQKK (B2) peptides for the sample prepared with the induction step.
  • Figure 5 shows chromatograms of strain MSSA16b after an induction step.
  • Figure 6 shows chromatograms of the MSSAI b strain after an induction step.
  • Figure 7 represents a chromatogram resulting from an MRM type analysis of a strain expressing PBP2c.
  • the present invention relates to a method for detecting strains of Staphylococcus aureus resistant to methicillin, known as MRAS strains, making it possible to obtain a result in less than 1 hour 30 minutes from a biological sample identified as containing a strain of S. aureus.
  • Methicillin also spelled methicillin, is a beta-lactam antibiotic, belonging to the penicillin subfamily. Its CAS number is 61-32-5. It was widely used against Staphylococcus aureus infections, before being supplanted by cloxacillin, which presents less risk of bacterial resistance.
  • the method of the invention makes it possible to identify strains resistant to this antibiotic (MRAS) with a sensitivity and specificity close to 100%.
  • the method according to the invention uses a biological sample without a bacterial subculture step, for example a positive blood culture sample (containing blood cells and bacteria).
  • a first step of induction of expression of the PBP2a or PBP2c protein, using an antibiotic of the beta-lactam class, is followed by an isolation step bacteria, then a stage of lysis of bacteria and enzymatic digestion of proteins, and finally an analysis by targeted mass spectrometry for the detection of peptides resulting from the enzymatic digestion of the protein PBP2a or PBP2c.
  • the present invention relates to a method for determining the properties of resistance to methicillin of a strain of Staphylococcus aureus present in a biological sample, comprising the following steps: a) incubation of the biological sample containing said strain of Staphylococcus aureus for at least 15 minutes, in the presence of an antibiotic of the beta-lactam class chosen from the following group: cefoxitin and 6-APA (6-aminopenicillanic acid), b) isolation of the bacteria present in the said biological sample, c) lysis bacteria and hydrolysis of the bacterial proteins, in order to obtain a mixture of peptides, d) analysis of this mixture of peptides by targeted mass spectrometry, the detection of at least one peptide derived from the protein PBP2a or PBP2c during this step of analysis being indicative of the resistance to methicillin of the strain of Staphylococcus aureus present in said biological sample.
  • the inventors have identified that the PBP2a protein is expressed very heterogeneously among the MRSA strains, at very different expression levels.
  • PBP2a expression heterogeneity exists between different MRSA strains. Some strains naturally express PBP2a at high levels (detectable without induction) and others have very low basal expression levels, not allowing the detection of PBP2a by direct analysis, without an induction step.
  • the present application relates to an improvement of said method, consisting of the addition of a step (a) of incubation of the biological sample containing said strain of S. aureus for at least 15 minutes, in the presence of an antibiotic beta -lactam, for induce the expression of the PBP2a protein or of the PBP2c protein and thus have a new level of expression sufficient to detect the variant protein expressed in 100% of the MRS ⁇ strains.
  • the PBP2a protein has the following sequence:
  • the PBP2c protein has the following sequence:
  • the method of the present invention makes it possible to detect the two proteins PBP2a and PBP2c, but also variant proteins.
  • variant protein is understood to mean a protein exhibiting a peptide sequence exhibiting strong sequence identity with the sequences SEQ ID NO. 1 or 2, in particular a sequence identity of at least 90%, or better of at least 95%, or even 99% with one of the sequences SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2.
  • Variant proteins generally have one, two or three point mutations in the sequences of wild-type proteins, ie they only differ for one, two or three amino acids in the peptide sequence.
  • the percentages of identity to which reference is made in the context of the presentation of the present invention are determined after optimal alignment of the sequences to be compared, which can therefore comprise one or more additions, deletions, truncations and/or substitutions.
  • This percentage of identity can be calculated by any sequence analysis method well known to those skilled in the art.
  • the percentage of identity can be determined after global alignment of the sequences to be compared taken in their entirety, over their entire length. Besides manually, it is possible to determine the global alignment of sequences using the algorithm of Needleman and Wunsch (1970).
  • the comparison of the sequences can be carried out using any software well known to those skilled in the art, such as for example the Needle software.
  • the parameters used may in particular be the following: “Gap Open” equal to 10.0, “Gap Extend” equal to 0.5 and the matrix BLOSUM62.
  • the percentage of identity defined in the context of the present invention is determined by means of an overall alignment of the sequences to be compared over their entire length.
  • Induction consists of carrying out a rapid incubation (in particular, for less than 3 hours and preferably less than one hour) in the presence of an antibiotic in order to activate the systems for regulating the expression of the proteins PBP2a or PBP2c and thus lead to an overexpression of these proteins.
  • an antibiotic of the beta-lactam class chosen from cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid induces the expression at least one protein chosen from PBP2a and PBP2b in said bacterial strain.
  • the antibiotic used is of the beta-lactam class, i.e. an antibiotic containing a beta-lactam nucleus.
  • This antibiotic is chosen from cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid).
  • Cefoxitin is an antibiotic from the beta-lactam family, classified among the so-called second-generation cephalosporins. Cefoxitin exerts a bactericidal action by inhibiting cell wall synthesis.
  • 6-Aminopenicillanic acid abbreviated 6-APA, CAS number 551 -16-6, is a derivative of penicillin.
  • the antibiotic used for induction step (a) is cefoxitin.
  • the induction of the expression of PBP2a or PBP2c is carried out by incubation of the biological sample in the presence of a suitable quantity of antibiotic, typically at a temperature between 30° and 40° Celsius.
  • the incubation of the biological sample will preferably take place at 37° C, with shaking.
  • the incubation step (a) is carried out for a period of at least 15 minutes.
  • this incubation step (a) is carried out for a period of less than 3 hours, or less than 2 hours, or preferably less than 1 hour.
  • the incubation time may be at least 15 minutes, at least 20 minutes, at least 25 minutes, at least 30 minutes, at least 35 minutes, at least 40 minutes or even at least 45 minutes.
  • this incubation step (a) is carried out for one of the following durations:
  • the bacteria can be isolated by any means known to those skilled in the art, in particular by centrifugation.
  • step (b) also comprises a step of selective lysis of the non-bacterial cells present in the biological sample, this step of selective lysis being carried out before the centrifugation of the sample.
  • Detergent compounds allow lysis of animal cells by dissociation of the membrane. Since the bacteria are composed of a rigid peptidoglycan wall, they are not lysed by the action of the detergent.
  • a detergent compound can for example be selected from the following group of compounds: saponin, Triton X100 or Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
  • saponin Triton X100
  • SDS Sodium Dodecyl Sulfate
  • bacterial cell lysis can be employed. Examples include thermal methods (temperature above 100°C for 10 minutes, or freezing in liquid nitrogen), enzymatic (action of lysozyme or lyticase) or mechanical (high pressure, grinding or sonication).
  • the lysis of the bacteria is carried out by sonication.
  • hydrolysis of bacterial proteins into peptides is generally carried out according to one of the following two processes: a) By the action of chemical agents such as hydroxyl radicals which induce random cuts at the level of the peptide bonds, or b) By the action of proteolytic enzymes (proteases) which have an action of hydrolysis of protein bonds.
  • chemical agents such as hydroxyl radicals which induce random cuts at the level of the peptide bonds
  • proteolytic enzymes proteolytic enzymes
  • the hydrolysis of the bacterial proteins in step (c) is an enzymatic hydrolysis.
  • pepsin which preferentially hydrolyzes the peptide bonds before the aromatic amino acids (Tyrosine, Tryptophan and Phenylalanine), the endoproteinase GluC which cuts the peptide bond at the level of the glutamate residues, or even trypsin which cleaves proteins on the C-terminal side of the amino acids lysine and arginine.
  • trypsin is used as an enzyme for the step of hydrolysis of bacterial proteins. Trypsin is indeed preferred for the specific nature of its activity, the suitable size of the peptides it generates, and the nature of the "tryptic" peptides which have on the C-terminal side an amino acid which can be positively charged (lysine or arginine ), thus facilitating analysis by mass spectrometry (analysis of charged molecules).
  • Mass spectrometry is a physical analysis technology for detecting and identifying molecules of interest. It is also known as single reaction monitoring, or multiple reaction monitoring, or parallel reaction monitoring. Her principle lies in the gas phase separation of charged molecules (ions) according to their mass/charge ratio (m/z).
  • Mass spectrometers comprise: i) an ionization source intended to ionize the molecules to be analyzed, that is to say to impart a positive or negative charge to these molecules; ii) a mass analyzer intended to separate the ionized molecules according to their mass-to-charge ratio (m/z); iii) a detector intended to measure the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • an ionization source intended to ionize the molecules to be analyzed, that is to say to impart a positive or negative charge to these molecules
  • a mass analyzer intended to separate the ionized molecules according to their mass-to-charge ratio (m/z)
  • a detector intended to measure the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • the ionization step necessary for the implementation of mass spectrometry can be implemented by any method known to those skilled in the art.
  • the ionization source makes it possible to bring the molecules to be dosed in a gaseous and ionized state.
  • An ionization source can be used either in positive mode to study positive ions or in negative mode to study negative ions.
  • the mass analyzer in which the step of separating the ionized markers according to their mass/charge ratio (m/z) is implemented is any mass analyzer known to those skilled in the art. Mention may be made of low resolution analyzers, of the quadrupole or quadrupole (Q), 3D ion trap (IT) or linear (LIT) type, also called ion trap, and high resolution analyzers, making it possible to measure the exact mass of the analytes and which use in particular the magnetic sector coupled to an electric sector, the time of flight (TOF), the orbitrap.
  • Q quadrupole or quadrupole
  • IT 3D ion trap
  • LIT linear
  • TOF time of flight
  • the separation of the molecular ions according to their m/z ratio can be implemented once (single mass spectrometry or MS), or else several successive MS separations can be carried out.
  • MS/MS single mass spectrometry
  • MS/MS/MS single mass spectrometry
  • Targeted mass spectrometry is a variant in which the molecules of interest sought by this analysis technique are known beforehand, and the analysis is used to identify their presence or not in a sample.
  • the targeted approaches consist of the selection by a first analyzer of a mass precise corresponding to the peptide of interest which is then fragmented in a collision cell. The generated fragments are then monitored by a third analyzer and their signal/intensity is measured.
  • the signal of the fragments is measured as a function of time to be represented in the form of a chromatogram, the appearance of concomitant chromatographic peaks (simultaneous detection of the fragments) therefore indicating the presence of the peptide in the sample. .
  • the principle of the SRM mode, or else of the MRM mode, is to specifically select a precursor ion, to fragment it, then to specifically select one of its fragment ions.
  • devices of the triple quadrupole type or triple quadrupole ion trap hybrids are generally used.
  • the DI ⁇ /SW ⁇ TH analysis mode consists in recording fragmentation spectra of contiguous selection windows of precursor ions, most often overlapping by 1 unit of mass-to-charge ratio (m/z), the windows being characterized by a width fixed or variable in m/z, or by using a sliding window of fixed width in m/z, while ensuring that the total cycle time to cover all of these windows makes it possible to sample each chromatographic peak by at least 5 points.
  • m/z mass-to-charge ratio
  • the analysis by mass spectrometry is targeted during the analysis (SRM/MRM, MRM, MRM3, PRM type mode) or after the analysis (DI ⁇ /SW ⁇ TH type mode ).
  • the analysis by targeted mass spectrometry is carried out in MRM or MRM3 mode, and most preferably is carried out in MRM3 mode.
  • the targeted mass spectrometry is coupled with a separation of the peptides, preferably by chromatographic or electrophoretic separation of the peptides.
  • the separation of the peptides can be carried out by any technique known to those skilled in the art, and in particular can be carried out by reverse phase liquid chromatography, by liquid chromatography in the normal phase, by liquid chromatography in the hydrophilic phase, or by capillary electrophoresis.
  • the separation of the peptides is carried out by reverse phase liquid chromatography.
  • the peptides sought during this analysis step are peptides derived from the PBP2a or PBP2c proteins, specific for said proteins.
  • the at least one peptide derived from the PBP2a or PBP2c protein which is detected, that is to say whose presence is demonstrated by targeted mass spectrometry is selected from the group of 12 peptides having the following sequences: SEQ ID NO. 3 to SEQ ID NO. 14 presented in Tables 1 and 2 below.
  • the biological sample is chosen from:
  • a biological fluid for example blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, and tears;
  • a bacterial culture for example a blood culture, a bacterial colony on agar, a bacterial culture broth;
  • It will preferably be a biological fluid, in particular a blood sample (blood, serum, plasma), and more particularly the medium of a positive blood culture containing Staphylococcus aureus.
  • a biological fluid in particular a blood sample (blood, serum, plasma), and more particularly the medium of a positive blood culture containing Staphylococcus aureus.
  • “Blood culture” means a sample of blood taken from a patient and then incubated under suitable conditions to allow proliferation of any bacteria present in said sample.
  • This blood culture can be carried out in blood culture bottles such as those sold in the Bact/ ⁇ lert range distributed by BioMérieux, or those in the Bactec range distributed by Becton Dickinson.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method as described above, comprising:
  • an antibiotic of the beta-lactam class chosen from the following group: cefoxitin and 6- ⁇ PA (6-aminopenicillanic acid),
  • a reagent allowing selective lysis of the non-bacterial cells present in the biological sample, for example a detergent.
  • a detergent compound selected from the following group of compounds: saponin, Triton X100 or Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).
  • the antibiotic used during the induction step is cefoxitin, but it is understood that 6- ⁇ PA can also be used.
  • Example 1 Materials and Methods
  • the induction step (a) is carried out according to the following protocol:
  • Step (b) of isolating the bacteria is advantageously carried out concomitantly with lysis of the blood cells, according to the following protocol:
  • Step (c) of mechanical lysis of bacteria and enzymatic digestion of proteins is carried out according to the following protocol:
  • Step (d) of analysis by targeted mass spectrometry is carried out according to the following protocol:
  • a volume of 5 ⁇ l of sample resulting from the preceding lysis/digestion step is injected into the chromatographic system.
  • Analysis is performed on a Waters XBridge Peptide BEH C18 reverse phase column, 1 mm internal diameter, 100 mm length, column size 3.5 ⁇ m particle, 130 ⁇ pore size using a chromatography system with an Agilent 1290 infinity LC pump, an Agilent 1290 Autosampler, and an Agilent 1290 TCC column oven set at 60°C.
  • the gradient used for the chromatographic separation is shown in Table 3.
  • Solvent A H2O + 0.1% formic acid
  • the output of the chromatographic system is directly connected to the ionization source of a QTRAP 6500+ mass spectrometer (Sciex) for online analysis of peptides resulting from the digestion of bacterial proteins.
  • the mass spectrometer is operated in MRM or MRM-cubed (MRM3) mode and the transitions followed, for the PBP2a protein, are detailed in Table 4.
  • Mass spectrometer parameters for MRM3 mode analysis are detailed in Table 7 (V ⁇ LELGSK peptide) and Table 8 (FQITTSPGSTQK peptide) below.
  • Figures 1 and 2 illustrate the necessity of the induction step for the detection of peptides from PBP2a by MRM.
  • the A chromatograms come from the analysis of the strains without an induction step, the B chromatograms correspond to the analysis of the same strains after an induction step.
  • the area under the curve was measured for each transition. Although not expressing PBP2a, the area under the curve was also measured for samples of MSSA sensitive strains over the peptide elution window, in order to obtain a baseline value. Indeed, the signal of a transition can be polluted by noise or interference due to the matrix, it is therefore necessary to evaluate this baseline in a matrix not containing the analyte (here the PBP2a) in order to establish thresholds above which we can confirm the presence of the peptides.
  • the threshold corresponds to 150% of the maximum area measured over the peptide elution window for the MSSA control samples.
  • Tables 9 and 10 below correspond to the results obtained during the MRM analysis of the 98 MRSAs without the induction step.
  • Tables 11 and 12 below correspond to the results obtained during the MRM analysis of the 98 MRSA with the induction step.
  • Table 9 Validation table of MRM transitions of PBP2a from strains MRSAIb to MRSA49b prepared WITHOUT induction step
  • 38 MRS ⁇ out of 98 show at least 2 positive transitions for at least 3 peptides, which corresponds to a detection sensitivity of 39%.
  • 96 out of 98 MRSA have at least 2 positive transitions for at least 3 peptides. This corresponds to a sensitivity of 98% detection of MRSA with these validation criteria.
  • Only the MRSA9b and MRSA41b strains are not correctly identified because only 2 peptides are detected with 2 transitions for the MRSA41b strain and 1 peptide with 2 transitions for the MRSA9b strain.
  • the MRM3 transitions for which the area value is greater than the threshold value were considered positive and are scored as 1.
  • the transitions for which the area is less than or equal to the threshold value are scored as 0 and considered as negative.
  • a sample was considered identified as MRS ⁇ if at least 1 MRM3 transition was detected positive.
  • the 19 MSSA strains were analyzed using the same method and the results are presented in the following tables.
  • Table 13 corresponds to the results obtained during the MRM3 analysis of the 98 MRS ⁇ without the induction step. It represents the validations of the MRM3 transitions of the 98 MRS ⁇ prepared WITHOUT the induction step
  • Table 14 corresponds to the results obtained during the MRM3 analysis of the 98 MRSA with the induction step. It represents the validations of the MRM3 transitions of the 98 MRSAs prepared with the induction step.
  • MRSA Low-Level Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d'une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : • a) incubation de l'échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d'un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), • b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, • c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d'obtenir un mélange de peptides, • d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d'au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette étape d'analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA RESISTANCE A LA METICILLINE DE SOUCHES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de caractérisation de souches bactériennes appartenant à la famille des staphylocoques, et en particulier à un procédé permettant d’identifier les souches bactériennes résistantes à certains antibiotiques. Ceci permet au personnel de santé de sélectionner des antibiotiques adaptés à chaque patient infecté, en fonction de ces données de résistance.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L’utilisation accrue d’antibiotiques au cours des dernières décennies a entraîné l’apparition de mécanismes de résistance chez de nombreuses espèces bactériennes.
Les premières souches de Staphylococcus aureus (staphylocoques dorés) résistantes à la pénicilline ont été caractérisées seulement deux ans après l’introduction de cet antibiotique dans la chaîne de traitement des infections bactériennes (Kirby, 1944) et se sont rapidement propagées, entraînant l’arrêt progressif de l’utilisation de la pénicilline en clinique au profit de nouvelles molécules antibactériennes semi-synthétiques telles que la méticilline et l’oxacilline.
Puis dans les années 1960, de nouvelles souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline, mais également à d’autres composés antibiotiques, sont apparues. Ces souches sont désignées par l’acronyme SARM ou plus communément par leur acronyme anglais MRSA (Meticillin Resistant Staphylococcus ureus).
Ces souches MRSA expriment une toxine particulière, la LPV ou leucocidine de Panton- Valentine. Cette toxine dite « porogène » induit des pores dans les parois cellulaires, notamment des cellules du système immunitaire, tuant ainsi les cellules capables de lutter contre l’infection.
Bien qu’initialement confinées au milieu hospitalier, les souches MRSA se sont ensuite propagées dans la population. En 2019, en Europe, on estimait que les souches MRSA représentent entre 1% et 46% des infections à Staphylococcus aureus. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, une personne souffrant d’une infection par une souche MRSA présente une probabilité de décès 64% plus élevée qu’une personne infectée par une souche non résistante.
La détection des souches MRSA est donc un enjeu majeur pour la prise en charge et le traitement des patients atteints d’infections à Staphylococcus aureus. Le phénotype MRSÀ est dû à l’expression d’une protéine spécifique, la PBP2a pour « Penicillin binding protein 2a », codée par le gène Mec A, et dans de plus rares cas à l’expression de la protéine PBP2c codée par le gène ecC. Ces protéines « remplacent » la transpeptidase PBP2, une enzyme impliquée dans la formation de la paroi cellulaire bactérienne. Les protéines alternatives PBP2a et PBP2c ayant une faible affinité pour la méthicilline et la pénicilline, la présence de ces antibiotiques n’inhibe pas leur activité, et la synthèse de la paroi cellulaire continue normalement, assurant ainsi la croissance bactérienne même en présence de ces antibiotiques.
Depuis l’apparition des premières souches MRSÀ, plusieurs méthodes de détection de cette propriété de résistance ont été élaborées, et ce selon trois approches principales :
- Les méthodes phénotypiques sont basées sur une évaluation de la croissance bactérienne en présence d’antibiotique ;
- Les méthodes de biologie moléculaire sont basées sur la détection des gènes MecÀ et/ou MecC dans le génome bactérien des souches étudiées ;
- Les méthodes immunologiques et protéomiques sont basées sur la détection de la protéine PBP2a ou de ses peptides. Parmi ces technologies, les méthodes d’immuno-chromatographie (détection grâce à des anticorps) et de spectrométrie de masse sont particulièrement utilisées.
Ces différentes approches sont brièvement présentées ci-après.
Méthodes phénotypiques
Les méthodes traditionnelles de diffusion sur gélose, bien qu’anciennes, sont encore largement utilisées dans les laboratoires du fait de leur simplicité et de leur faible cout. Elles consistent à cultiver sur gélose la bactérie en présence d’un disque d’antibiotique, usuellement de l’oxacilline ou de la céfoxitine. Le phénotype sensible ou résistant de la souche bactérienne est déterminé en évaluant le diamètre de la zone d’inhibition de croissance autour du disque.
Le principal désavantage de cette technologie est le délai nécessaire, d’environ 12 à 18 heures, pour obtenir le résultat (Felten, 2002).
L’arrivée sur le marché d’instruments tels que le Vitek® 2 distribué par BioMérieux, ou le Phoenix™ distribué par Becton Dickinson, a permis l’automatisation à haut débit des tests de susceptibilité aux antibiotiques. Bien que plus robustes que les méthodes de diffusion sur gélose, ces tests sont également limités par le temps de croissance des bactéries. Le résultat est, dans le cas d’un Staphylococcus aureus, obtenu en environ 10 à 13 heures.
Par exemple, l’article de Sparbier et al., 2013, divulgue une telle méthode phénotypique où la croissance bactérienne est évaluée en présence d’antibiotiques. Les bactéries sont incubées en présence d’oxacilline ou de céfoxitine, et de lysine « chargée » présentant un poids moléculaire élevé. L’incorporation de cet acide aminé chargé ne sera observée que dans les protéines nouvellement synthétisées. Or, seules les bactéries résistantes aux antibiotiques présentent une activité de biosynthèse protéique significative. Les protéines comprenant la lysine chargée sont ensuite détectées par MÀLDI-TOF.
L’inconvénient majeur de cette technologie dite « phénotypique » est qu’elle est sensible aux facteurs pouvant influencer la croissance bactérienne, tels que le volume d’inoculum, la durée et la température d’incubation, le milieu, le pH ou encore la concentration en sels (Tenover et al., 1999).
Méthodes de biologie moléculaire
L’arrivée des méthodes de biologie moléculaire a considérablement amélioré les délais d’identification des souches MRSÀ par rapport aux méthodes phénotypiques. La haute sensibilité et la grande spécificité des tests actuellement commercialisés font de la détection du gène MecA par PCR (Polymerase Chain Reaction) le « gold standard » pour le diagnostic des MRSÀ. Parmi les tests couramment utilisés, citons geneXpert MRSÀ/SÀ BC distribuée par Cepheid, GeneOhm™ StaphSR Assay distribué par Becton Dickinson, eazyplexOMRSAplus distribué par AmplexDiagnostics ou encore FilmArray BCID distribué par Biomérieux. Ces tests permettent la détection des souches MRSA en 1 à 3 heures, directement à partir d’un flacon d’hémoculture positif, en s’affranchissant des étapes de sous-culture préalables, consistant à isoler les bactéries et à les faire proliférer.
Le principal désavantage de cette technologie est qu’elle a tendance à générer des « faux positifs », notamment dans le cas de souches portant une cassette SSCmec ne contenant pas le gène MecA, ou pour des souches exprimant une protéine variante codée par un gène présentant une séquence légèrement différente de celle établie pour le gène MecA.
De plus, le cout élevé d’une analyse de biologie moléculaire reste un obstacle majeur à leur utilisation systématique.
Tests immunologiques : détection de la protéine PBP2A
L’utilisation de billes de latex couplées avec un anticorps monoclonal spécifique détectant la protéine PBP2a permet une visualisation à l’œil nu de l’agglutination, témoin de la présence de l’antigène dans l’échantillon. Il s’agit du principe sur lequel se basent les tests PBP2’ Oxoid distribué par Thermofischer Scientific ou Mastalex-MRSÀ distribué par Mast Diagnostic.
La durée du test en tant que tel est comprise entre 15 et 20 minutes. Ce test a très bonnes performances avec une sensibilité de 100% et une spécificité supérieure à 99%. Le désavantage majeur de cette technique est qu’elle nécessite une quantité minimale de 1 ,5 x 109 bactéries dans l’échantillon testé, ce qui implique une étape de culture bactérienne durant au minimum 10 heures.
De plus, ces tests ne permettent pas la détection des souches MRSÀ exprimant la protéine PBP2c, non reconnue par certains anticorps monoclonaux utilisés. Cela a notamment été montré pour le test PBP2’ Oxoid (Dupieux et al., 2017).
Des tests immuno-chromatographiques ont également été commercialisés pour la détection des souches MRSÀ, par exemple le kit Clearview™ PBP2a SÀ Culture Colony Test distribué par Àlere.
Bien que très rapide et possédant une sensibilité et une spécificité supérieurs à 98%, ce test nécessite également une étape de culture bactérienne.
Le test Clearview™ PBP2a SÀ Culture Colony Test peut avantageusement détecter la PBP2c à partir de colonies poussant en bordure d’un disque de céfoxitine après culture sur gélose. Cette étape d’induction nécessaire à la détection de MecC entraine cependant un délai supplémentaire d’environ 18 heures avant le rendu de résultat (Dupieux et al., 2017).
Spectrométrie de masse ciblée
De récentes études ont mis en évidence le potentiel des approches protéomiques dites « bottom-up » (ou ascendantes), c’est-à-dire basées sur des spectres de fragmentation de peptides par spectrométrie de masse ciblée, pour l’identification de pathogènes et la mise en évidence de mécanismes de résistance.
Ces approches comprennent les étapes suivantes :
1 ) Une lyse, mécanique ou chimique, de l’échantillon bactérien afin de libérer les protéines intracellulaires,
2) Une digestion enzymatique des protéines bactériennes à l’aide de protéases (typiquement la trypsine) pour générer un mélange de peptides
3) Une séparation chromatographique couplée à une analyse par spectrométrie de masse ciblée de l’échantillon, où le spectromètre de masse fonctionne en mode MS/MS pour la détection de peptides marqueurs des protéines de résistance
4) Le retraitement des résultats pour la validation de la présence/absence des peptides marqueurs dans l’échantillon.
Le terme « ciblée » indique que des séquences peptidiques spécifiques sont recherchées ; il peut s’agir de séquences de protéines entières ou de peptides issus d’une digestion enzymatique desdites protéines. La spectrométrie de masse ciblée a été utilisée avec succès pour caractériser la résistance et la virulence de souches de Staphylococcus aureus par détection notamment de la protéine PBP2a ou de facteurs de virulence tels que la PVL (Charretier et al., 2015).
La demande internationale WO 2011 /045544 décrit une méthode comprenant la caractérisation de la résistance et de la virulence de Staphylococcus aureus par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ciblée, où le matériel biologique de départ est une colonie isolée sur milieu gélosé.
Enfin, il a récemment été montré que la protéine PBP2a pouvait être détectée sous sa forme intacte, après séparation par chromatographie liquide et analyse MS (technologie « top- down » basée sur l’analyse de spectres de fragmentation de protéines entières). En l’absence de l’étape de digestion enzymatique de la protéine, le temps nécessaire pour obtenir un résultat est raccourci (Neil et al., 2021 ). Cependant, les auteurs n’ont pas démontré l’applicabilité de leur procédé à la détection de la PBP2a directement dans des échantillons d’hémoculture, sans étape de sous-culture préalable.
À ce jour, aucune technologie remplissant tous les critères requis pour une implantation en milieu hospitalier, notamment un temps d’analyse court, une simplicité de préparation d’échantillon, un coût limité et une performance satisfaisante, n’est connue.
Afin de répondre aux besoins actuels des laboratoires d’analyse, une méthode d’identification des souches MRSA devrait répondre au moins aux critères suivants :
- Pas d’étape de sous-culture des bactéries isolées du sang (analyse directement à partir du flacon d’hémoculture lorsque celui-ci est détecté comme positif),
- temps de préparation d’échantillon et d’analyse court (inférieur à 2 heures) afin d’obtenir un résultat rapidement, et ainsi permettre l’administration au patient d’un traitement antibiotique adapté dans les plus brefs délais,
- coût faible afin que le test puisse être réalisé systématiquement,
- test détectant les deux protéines PBP2a et PBP2c avec une sensibilité et spécificité proches de 100%, y compris des protéines variantes présentant une séquence peptidique présentant une identité de séquence avec les séquences SEQ ID NO. 1 ou 2.
Les inventeurs ont mis au point une méthode ciblée de détection des souches MRSA par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, réalisée directement à partir d’un flacon d’hémoculture positif, incluant une étape d’induction et une préparation rapide d’échantillon, et permettant d’obtenir un résultat en moins de 1 h30 à compter de la constatation de la présence d’une souche de Staphylococcus aureus dans un échantillon biologique.
EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de S. aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1 ) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette étape d’analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique.
La présente invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre de ce procédé, comprenant :
- un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique),
- de la trypsine,
- un réactif permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, en particulier un détergent choisi parmi la saponine, le Triton X100 et le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS),
- optionnellement, des réactifs pour la réalisation d’une spectrométrie de masse ciblée.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 représente un chromatogramme résultant d’une analyse de type MRM de la souche MRSA26b. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiqués par des flèches.
La figure 2 représente les chromatogrammes résultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSA26b. A1 et A2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (A1 ) et FQITTSPGSTQKK (A2) pour l’échantillon préparé sans l’étape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (B1 ) et FQITTSPGSTQKK (B2) pour l’échantillon préparé avec l’étape d’induction.
La figure 3 représente un chromatogramme résultat d’une analyse de type MRM de la souche MRSA28b. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiqués par des flèches. La figure 4 représente les chromatogrammes résultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSÀ28b. À1 et À2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VÀLELGSK (À1 ) et FQITTSPGSTQKK (À2) pour l’échantillon préparé sans l’étape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VÀLELGSK (B1 ) et FQITTSPGSTQKK (B2) pour l’échantillon préparé avec l’étape d’induction.
La figure 5 représente des chromatogrammes de la souche MSSÀ16b après une étape d’induction. À) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VÀLELGSK (B1 ) et FQITTSPGSTQKK (B2). Aucun peptide n’est détecté pour les deux types d’analyse.
La figure 6 représente des chromatogrammes de la souche MSSAI b après une étape d’induction. A) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VALELGSK (B1 ) et FQITTSPGSTQkk (B2). Aucun peptide n’est détecté pour les deux types d’analyse.
La figure 7 représente un chromatogramme résultant d’une analyse de type MRM d’une souche exprimant la PBP2c. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2c sont indiqués par des flèches.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de détection de souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline, dites souches MRAS, permettant d’obtenir un résultat en moins de 1 h30 à partir d’un échantillon biologique identifié comme contenant une souche de S. aureus.
La méticilline, également orthographiée méthicilline, est un antibiotique de la famille des beta-lactamines, appartenant à la sous-famille des pénicillines. Son numéro CAS est le 61 - 32-5. Elle a été largement utilisée contre les infections à Staphylococcus aureus, avant d’être supplantée par la cloxacilline, qui présente moins de risque de résistance bactérienne.
Avantageusement, le procédé de l’invention permet d’identifier les souches résistantes à cet antibiotique (MRAS) avec une sensibilité et une spécificité proches de 100 %.
Le procédé selon l’invention utilise un échantillon biologique sans étape de sous-culture bactérienne, par exemple un échantillon d’hémoculture positif (contenant cellules du sang et bactéries). Une première étape d’induction d’expression de la protéine PBP2a ou PBP2c, à l’aide d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines, est suivie d’une étape d’isolation rapide des bactéries, puis d’une étape de lyse des bactéries et de digestion enzymatique des protéines, et enfin d’une analyse par spectrométrie de masse ciblée pour la détection de peptides issus de la digestion enzymatique de la protéine PBP2a ou PBP2c.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a ou PBP2c lors de cette étape d’analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique.
Ce procédé a été élaboré à partir du procédé décrit dans la demande internationale WO 2011 / 045544.
Sur la base de ce procédé, les inventeurs ont identifié que la protéine PBP2a est exprimée de façon très hétérogène parmi les souches MRSA, à des niveaux d’expression très différents.
En utilisant une méthodologie similaire à celle présentée dans la demande WO 2011 /045544, mais avec pour échantillon biologique de départ un milieu d’hémoculture positif à Staphylococcus aureus, c’est-à-dire sans étape de sous-culture bactérienne, il a été mis en évidence sur une cohorte de 98 souches MRSA représentatives de l’épidémiologie française qu ’environ 60% desdites souches MRSA présentent un niveau d’expression de la PBP2a trop faible pour pouvoir être détecté par la méthodologie décrite (voir partie expérimentale).
En effet, une hétérogénéité d’expression de la PBP2a existe entre différentes souches MRSA. Certaines souches expriment naturellement la PBP2a a des niveaux importants (détectables sans induction) et d’autres possèdent des niveaux d’expression basale très faibles, ne permettant pas la détection de la PBP2a par analyse directe, sans étape d’induction.
Il a donc été conclu que la technologie décrite dans la demande WO 2011 /045544 n’est pas adaptée pour une implémentation dans un laboratoire d’analyse clinique, car de nombreuses souches MRSA ne peuvent être détectées.
La présente demande concerne une amélioration de ladite méthode, consistant en l’ajout d’une étape (a) d’incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de S. aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique beta-lactame, pour induire l’expression de la protéine PBP2a ou de la protéine PBP2c et ainsi disposer d’un nouveau d’expression suffisant pour détecter la protéine variante exprimée dans 100% des souches MRSÀ.
La protéine PBP2a présente la séquence suivante :
Séquence 1 , PBP2a, Staphylococcus aureus (NCBI ID : WP_001801873.1 ) :
MMKKIKIVPLILIWWGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKDSSYISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGV KDINIQDRKIKKVSKNKKRVDAQYKIKTNYGNIDRNVQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENL KSERGKILDRNNVELANTGTAYEIGIVPKNVSKKDYKAIAKELSISEDYIKQQMDQNWVQDDTFVPLKTVKKM DEYLSDFAKKFHLTTNETESRNYPLGKATSHLLGYVGPINSEELKQKEYKGYKDDAVIGKKGLEKLYDKKLQ HEDGYRVTIVDDNSNTIAHTLIEKKKKDGKDIQLTIDAKVQKSIYNNMKNDYGSGTAIHPQTGELLALVSTPS YDVYPFMYGMSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTAMIGLNNKTLDDKTSYKIDGKGWQKDKS WGGYNVTRYEWNGNIDLKQAIESSDNIFFARVALELGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPFYNAQISNKNLD NEILLADSGYGQGEILINPVQILSIYSALENNGNINAPHLLKDTKNKVWKKNIISKENINLLTDGMQQWNKTH KEDIYRSYANLIGKSGTAELKMKQGETGRQIGWFISYDKDNPNMMMAINVKDVQDKGMASYNAKISGKVYD ELYENGNKKYDIDE
La protéine PBP2c présente la séquence suivante :
Séquence 2, PBP2c, Staphylococcus aureus (NCBI ID : WP_000725529.1 ) :
MKKIYISVLVLLLIMIIITWLFKDDDIEKTISSIEKGNYNEVYKNSSEKSKLAYGEEEIVDRNKKIYKDLSVNNLKIT NHEIKKTGKDKKQVDVKYNIYTKYGTIRRNTQLNFIYEDKHWKLDWRPDVIVPGLKNGQKINIETLKSERGKI KDRNGIELAKTGNTYEIGIVPNKTPKEKYDDIARDLQIDTKAITNKVNQKWVQPDSFVPIKKINKQDEYIDKLI KSYNLQINTIKSRVYPLNEATVHLLGYVGPINSDELKSKQFRNYSKNTVIGKKGLERLYDKQLQNTDGFKVSI ANTYDNKPLDTLLEKKAENGKDLHLTIDARVQESIYKHMKNDDGSGTALQPKTGEILALVSTPSYDVYPFMN GLSNNDYRKLTNNKKEPLLNKFQITTSPGSTQKILTSIIALKENKLDKNTNFDIYGKGWQKDASWGNYNITRF KWDGNIDLKQAIESSDNIFFARIALALGAKKFEQGMQDLGIGENIPSDYPFYKAQISNSNLKNEILLADSGYG QGEILVNPIQILSIYSALENNGNIQNPHVLRKTKSQIWKKDIIPKKDIDILTNGMERWNKTHRDDIYKNYARII GKSGTAELKMNQGETGRQIGWFVSYNKNNPNMLMAINVKDVQNKGMASYNATISGKVYDDLYDNGKTQF DIDQ
Avantageusement, le procédé de la présente invention permet de détecter les deux protéines PBP2a et PBP2c, mais également des protéines variantes.
On entend par « protéine variante » une protéine présentant une séquence peptidique présentant une forte identité de séquence avec les séquences SEQ ID NO. 1 ou 2, en particulier une identité de séquence d’au moins 90%, ou mieux d’au moins 95%, voire de 99% avec l’une des séquences SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO.2. Les protéines variantes présentent en général une, deux ou trois mutations ponctuelles dans les séquences des protéines sauvages, c’est-à-dire qu’elles ne différent que pour un, deux ou trois acides aminés dans la séquence peptidique. Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions.
Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier.
Le pourcentage d’identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
De préférence, le pourcentage d’identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d’un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur.
Etape (a) d’induction de l’expression de PBP2a ou PBP2c
L’induction consiste à réaliser une incubation rapide (en particulier, durant moins de 3 heures et préférentiellement moins d’une heure) en présence d’un antibiotique afin d’activer les systèmes de régulation de l’expression des protéines PBP2a ou PBP2c et ainsi entrainer une surexpression de ces protéines.
Cette incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des bêtalactamines choisi parmi la céfoxitine et le 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique), induit l’expression d’au moins une protéine choisie parmi PBP2a et PBP2b dans ladite souche bactérienne.
L’antibiotique utilisé est de la classe des beta-lactamines, c’est-à-dire un antibiotique contenant un noyau beta-lactame. Cet antibiotique est choisi parmi la céfoxitine et le 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique).
La céfoxitine, de numéro CAS 35607-66-0, est un antibiotique de la famille des bêtalactamines, classé parmi les céphalosporines dites de seconde génération. La céfoxitine exerce une action bactéricide en inhibant la synthèse de la paroi cellulaire.
L’acide 6-aminopenicillanique, en abrégé 6-APA, de numéro CAS 551 -16-6, est un dérivé de la pénicilline. De préférence, l’antibiotique utilisé pour l’étape d’induction (a) est la céfoxitine.
L’induction de l’expression de PBP2a ou PBP2c est réalisée par incubation de l’échantillon biologique en présence d’une quantité adaptée d’antibiotique, typiquement à une température comprise entre 30° et 40° Celsius. L’incubation de l’échantillon biologique aura lieu de préférence à 37° C, sous agitation.
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé de l’invention, l’étape d’incubation (a) est réalisée pendant une durée d’au moins 15 minutes.
De préférence, cette étape d’incubation (a) est réalisée pendant une durée inférieure à 3 heures, ou inférieure à 2 heures, ou préférentiellement inférieure à 1 heure.
Avantageusement, le temps d’incubation pourra être d’au moins 15 minutes, au moins 20 minutes, au moins 25 minutes, au moins 30 minutes, au moins 35 minutes, au moins 40 minutes ou encore au moins 45 minutes.
En particulier, cette étape d’incubation (a) est réalisée pendant l’une des durées suivantes :
De 15 à 180 minutes ;
De 15 à 120 minutes ;
De 15 à 90 minutes ; ou encore
De 15 à 60 minutes.
Comme cela est présenté dans les exemples, en l’absence de cette étape d’induction de l’expression de PBP2a ou PBP2c, certaines souches de S. aureus résistantes à la méticilline ne sont pas identifiées en tant que telles, car la détection de l’une des protéines PBP2a ou PBP2c est impossible du fait de la trop faible expression de ladite protéine dans lesdites souches.
Etape (b) d’isolement des bactéries
Les bactéries peuvent être isolées par tout moyen connu de la personne de l’art, en particulier par centrifugation.
Selon une mise en oeuvre du procédé, l’étape (b) comprend également une étape de lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, cette étape de lyse sélective étant réalisée avant la centrifugation de l’échantillon.
Les composés détergents permettent une lyse des cellules animales par dissociation de la membrane. Les bactéries étant composées d’une paroi de peptidoglycane rigide, elles ne sont pas lysées par l’action du détergent.
Un composé détergent peut être par exemple sélectionné parmi le groupe de composés suivants : la saponine, le Triton X100 ou le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) En particulier, lorsque l’échantillon biologique est un échantillon de sang, l’étape (b) d’isolement des bactéries est avantageusement réalisée concomitamment avec une lyse des cellules sanguines présentes dans l’échantillon, grâce à l’addition d’un composé détergent.
Etape (c) de lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes
Différentes méthodes de lyse des cellules bactériennes peuvent être employées. On citera par exemple les méthodes thermiques (température supérieure à 100°C pendant 10 minutes, ou congélation dans l’azote liquide), enzymatiques (action du lysozyme ou de la lyticase) ou mécanique (haute pression, broyage ou sonication).
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé de l’invention, la lyse des bactéries est réalisée par sonication.
L’hydrolyse des protéines bactériennes en peptides est généralement réalisée suivant l’un des deux procédés suivants : a) Par action d’agents chimiques tels que les radicaux hydroxyles qui induisent des coupures aléatoires au niveau des liaisons peptidiques, ou b) Par action d’enzymes protéolytiques (protéases) qui ont une action d’hydrolyse des liaisons protéiques.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé, l’hydrolyse des protéines bactériennes à l’étape (c) est une hydrolyse enzymatique.
Parmi les protéases couramment utilisées, on citera la pepsine qui hydrolyse les liaisons peptidiques préférentiellement avant les acides aminés aromatiques (Tyrosine, Tryptophane et Phénylalanine), l’endoprotéinase GluC qui coupe la liaison peptidique au niveau des résidus glutamates, ou encore la trypsine qui clive les protéines du côté C-terminal des acides aminés lysine et arginine.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé de l’invention, la trypsine est utilisée comme enzyme pour l’étape d’hydrolyse des protéines bactériennes. La trypsine est en effet préférée pour le caractère spécifique de son activité, la taille adaptée des peptides qu’elle génère, et la nature des peptides « tryptiques » qui possèdent du coté C-terminal un acide aminé pouvant être chargé positivement (lysine ou arginine), facilitant ainsi l’analyse par spectrométrie de masse (analyse de molécules chargées).
Un protocole spécifique pour l’étape (c) est présenté dans la partie expérimentale.
Etape (d) d’analyse par spectrométrie de masse ciblée
La spectrométrie de masse est une technologie physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt. Elle est également connue sous le nom de single reaction monitoring, ou multiple reaction monitoring, ou parellel reaction monitoring. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
Les spectromètres de masse comportent : i) une source d'ionisation destinée à ioniser les molécules à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces molécules ; ii) un analyseur de masse destiné à séparer les molécules ionisées en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci- après.
L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en oeuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en oeuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées.
L'analyseur de masse dans lequel est mis en oeuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripole ou quadrupole (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), l’orbitrap.
La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en oeuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS3.
La spectrométrie de masse ciblée est une variante dans laquelle les molécules d’intérêt recherchées par cette technique d’analyse sont préalablement connues, et l’analyse sert à identifier leur présence ou non dans un échantillon.
Les approches ciblées (Multiple Reaction Monitoring, MRM ; Parallel Reaction Monitoring, PRM ; Multiple Reaction Monitoring-High Resolution, MRM-HR ; Multiple Reaction Monitoring cubed, MRM3, DIA/SWATH) consistent en la sélection par un premier analyseur d’une masse précise correspondant au peptide d’intérêt qui est ensuite fragmenté dans une cellule de collision. Les fragments générés sont ensuite monitorés par un troisième analyseur et leur signal/intensité est mesuré.
Dans le cas des couplages chromatographiques, le signal des fragments est mesuré en fonction du temps pour être représenté sous forme de chromatogramme, l’apparition de pics chromatographiques concomitants (détection simultanée des fragments) étant donc témoin de la présence du peptide dans l’échantillon.
Ces approches nécessitent un travail préalable de sélection et de validation des peptides marqueurs pour s’assurer de leur unicité de séquence/masse (ou ratio masse/charge, m/z) et de leur détectabilité.
Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripole ou des hybrides triple quadripole à trappe ionique sont généralement utilisés.
Le mode d’analyse DIÀ/SWÀTH consiste à enregistrer des spectres de fragmentation de fenêtres de sélection contiguës d’ions précurseurs, le plus souvent chevauchante de 1 unité de rapport masse sur charge (m/z), les fenêtres étant caractérisées par une largeur fixe ou variable en m/z, ou bien en utilisant une fenêtre glissante de largeur fixe en m/z, tout en faisant en sorte que le temps de cycle total pour couvrir l’ensemble de ces fenêtres permet d’échantillonner chaque pic chromatographique par au moins 5 points.
Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIÀ/SWÀTH).
Plus préférentiellement, l’analyse par spectrométrie de masse ciblée est réalisée en mode MRM ou MRM3, et de manière tout à fait préférée est réalisée en mode MRM3.
La spectrométrie de masse ciblée est couplée à une séparation des peptides, de préférence par séparation chromatographique ou électrophorétique des peptides.
La séparation des peptides peut être réalisée par toute technique connue de l’ Homme du métier, et en particulier peut être réalisée par chromatographie liquide en phase inverse, par chromatographie liquide en phase normale, par chromatographie liquide en phase hydrophile, ou par électrophorèse capillaire.
De manière préférée, la séparation des peptides est réalisée par chromatographie liquide en phase inverse. Les peptides recherchés pendant cette étape d’analyse sont des peptides issus des protéines PBP2a ou PBP2c, spécifiques desdites protéines.
Il est entendu qu’au moins un peptide issu de ces protéines pourra être détecté, mais que de préférence plusieurs peptides seront détectés lors de l’analyse, ce qui conforte les résultats obtenus.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé de l’invention, le au moins un peptide issu de la protéine PBP2a ou PBP2c qui est détecté, c’est-à-dire dont la présence est mise en évidence par spectrométrie de masse ciblée, est choisi parmi le groupe de 12 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 3 à SEQ ID NO. 14 présentées dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous.
Tableau 1. Séquences des peptides issus de PBP2a
Tableau 2. Séquences des peptides issus de PBP2c Avantageusement, tous ces peptides ont été sélectionnés dans des zones conservées des protéines et sont donc identifiés également dans les protéines variantes de PBP2a et PBP2c. Le procédé selon l’invention pourra être réalisé sur tout type d’échantillon biologique susceptible de contenir une souche de Staphylococcus aureus.
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé, l’échantillon biologique est choisi parmi :
- Un fluide biologique, par exemple du sang, sérum, plasma, urine, liquide céphalorachidien, et des larmes ;
- Une culture bactérienne, par exemple une hémoculture, une colonie bactérienne sur gélose, un bouillon de culture bactérienne ;
- Un échantillon alimentaire, et
- tout autre type d’échantillon biologique.
Il s’agira préférentiellement d’un fluide biologique, en particulier d’un échantillon sanguin (sang, sérum, plasma), et plus particulièrement le milieu d’une hémoculture positive contenant un Staphylococcus aureus.
Par « hémoculture », on entend un échantillon de sang prélevé chez un patient puis incubé dans des conditions adéquates pour permettre une prolifération des éventuelles bactéries présentes dans ledit échantillon.
Cette hémoculture pourra être réalisée dans des flacons d’hémoculture tels que ceux commercialisés dans la gamme Bact/Àlert distribuée par BioMérieux, ou ceux de la gamme Bactec distribuée par Becton Dickinson.
Kit pour la mise en oeuvre du procédé
La présente invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre du procédé tel que décrit ci-dessus, comprenant :
- un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique),
- de la trypsine,
- un réactif permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, par exemple un détergent.
Par exemple, parmi les réactifs permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes, on citera un composé détergent sélectionné parmi le groupe de composés suivants : la saponine, le Triton X100 ou le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).
EXEMPLES
Les exemples présentés ci-après ont pour but d’illustrer le procédé selon l’invention, mais ne sont en aucun cas une limitation de l’objet de l’invention.
En particulier, dans les exemples présentés ci-après, l’antibiotique utilisé lors de l’étape d’induction est la céfoxitine, mais il est entendu que le 6-ÀPÀ pourra être également utilisé. Exemple 1. Matériel et Méthodes
L’étape (a) d’induction est réalisée selon le protocole suivant :
Réaliser l’asepsie du septum du flacon d’hémoculture
- À l’aide d’une seringue et d’une aiguille 21 G, prélever 3,8 mL de milieu d’hémoculture positif puis les transférer dans un tube de 15 mL
- Ajouter 200 pL d’une solution de céfoxitine à 8 pg/mL
Homogénéiser le mélange puis incuber le tube à 37° C sous agitation (180 rpm) pendant 30 minutes
L’étape (b) d’isolement des bactéries est avantageusement réalisée concomitamment avec une lyse des cellules sanguines, selon le protocole suivant :
- Après les 30 minutes d’induction, transférer 1 mL de milieu dans un tube de 1 ,5 mL et ajouter 200 pl d’une solution de SDS à 12 % puis vortexer 10 secondes. Centrifuger pendant 2 minutes à 16100 g et éliminer le surnageant Resuspendre le culot dans 1 mL de sérum physiologique
Centrifuger 1 minute à 16100 g et éliminer le surnageant Resuspendre dans 1 mL de sérum physiologique
L’étape (c) de lyse mécanique des bactéries et digestion enzymatique des protéines est réalisée selon le protocole suivant :
- T ransférer 200 pL de la suspension bactérienne préparée précédemment dans un tube eppendorf LoBind de 1 ,5 mL contenant environ 70 mg de billes de verre (Glass beads, acid-washed, 150-212 pm, Sigma-Aldrich, ref G1145)
- Ajouter 50 pL d’une solution de trypsine à 1 mg/mL préparée extemporanément dans du tampon bicarbonate d’ammonimum à 150 mM à partir de trypsine lyophilisée Placer immédiatement l’échantillon dans le bain marie d’un sonicateur réglé à 50° C puis débuter 10 cycles d’ultrasons (puissance faible) o 30 secondes ultrasons en marche o 30 secondes ultrasons arrêtés
Directement à la fin des 10 cycles d’ultrasons, ajouter 5 pL d’acide formique Centrifuger le tube à 9600 g pendant 5 minutes
- Transférer 150 pL de surnageant dans un flacon en verre ambré de 2 mL muni d’un insert pour l’analyse par spectrométrie de masse.
L’étape (d) d’analyse par spectrométrie de masse ciblée est réalisée selon le protocole suivant :
Un volume de 5 pL d’échantillon issu de l’étape de lyse/digestion précédente est injecté sur le système chromatographique. L’analyse est réalisée sur une colonne en phase inverse Waters XBridge Peptide BEH C18, diamètre interne de 1 mm, longueur 100 mm, taille de particule 3,5 pm, taille de pore 130 Â grâce à un système chromatographique doté d’une pompe Agilent 1290 infinity LC, d’un passeur Agilent 1290 Autosampler et d’un four à colonne Agilent 1290 TCC réglé à 60 °C. Le gradient utilisé pour la séparation chromatographique est présenté dans le tableau 3. Solvant A : H2O + 0,1 % acide formique
Solvant B : Acétonitrile + 0,1 % acide formique
Tableau 3. Paramètres d’analyse
La sortie du système chromatographique est directement reliée à la source d’ionisation d’un spectromètre de masse QTRAP 6500+ (Sciex) pour analyse en ligne des peptides issus de la digestion des protéines bactériennes. Le spectromètre de masse est opéré en mode MRM ou MRM-cubed (MRM3) et les transitions suivies, pour la protéine PBP2a, sont détaillées dans le tableau 4.
Tableau 4. Liste des transitions suivies pour la détection de la PBP2a.
Les transitions suivies pour la protéine PBP2c sont détaillées dans le tableau 5.
Tableau 5. Liste des transitions suivies pour la détection de la PBP2c
Les paramètres du spectromètre de masse pour l’analyse en mode MRM sont détaillés dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6. Paramètres du spectromètre de masse pour analyse en mode MRM
Les paramètres du spectromètre de masse pour l’analyse en mode MRM3 sont détaillés dans le tableau 7 (peptide VÀLELGSK) et dans le tableau 8 (peptide FQITTSPGSTQK) ci- dessous.
Tableau 7. Paramètres du spectromètre de masse pour analyse en mode MRM3 Tableau 8. Paramètres du spectromètre de masse pour analyse en mode MRM3
Exemple 2. Premiers résultats
Les figures 1 et 2 illustrent la nécessité de l’étape d’induction pour la détection des peptides issus de la PBP2a par MRM.
Les chromatogrammes A sont issus de l’analyse des souches sans étape d’induction, les chromatogrammes B correspondent à l’analyse des mêmes souches après une étape d’induction.
En absence d’induction, les pics des peptides issus de la PBP2a sont confondus avec le bruit de fond et donc non détectables.
Au contraire, après une étape d’induction, les pics caractéristiques sont observés : ils sont correctement dessinés et au-dessus du bruit de fond. La PBP2a est correctement détectée.
Des hémocultures ont été ensemencées pour 98 souches de MRSA et 19 souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méticilline (methicilin-sensible Staphylococcus aureus, MSSA en anglais) n’exprimant pas la PBP2a, puis les échantillons ont été préparés à positivité du flacon et analysés selon les protocoles de l’exemple 1.
L’aire sous la courbe a été mesurée pour chaque transition. Bien que n’exprimant pas la PBP2a, l’aire sous la courbe a également été mesurée pour les échantillons se souches sensibles MSSA sur la fenêtre d’élution du peptide, afin d’obtenir une valeur de ligne de base. En effet, le signal d’une transition peut être pollué par du bruit ou des interférences dues à la matrice, il est donc nécessaire d’évaluer cette ligne de base dans une matrice ne comportant pas l’analyte (ici la PBP2a) afin d’établir des seuils au-dessus desquels nous pouvons confirmer la présence des peptides.
Pour chaque transition, le seuil correspond à 150% de l’aire maximale mesurée sur la fenêtre d’élution du peptide pour les échantillons contrôles MSSA.
Exemple 3. Résultats de spectrométrie MRM
Toutes les transitions MRM pour lesquelles la valeur d’aire est supérieure à la valeur seuil ont été considérées positives et sont notées 1 dans les tableaux de résultats suivants. Les transitions pour lesquelles l’aire est inférieure à la valeur seuil sont notées 0 et donc considérées comme étant négatives. Un échantillon a été considéré comme identifié comme comprenant une souche MRSA dans les cas où au moins 3 peptides sont détectés avec au moins 2 transitions positives.
Les tableaux 9 et 10 ci-dessous correspondent aux résultats obtenus lors de l’analyse MRM des 98 MRSA sans l’étape d’induction. Les tableaux 11 et 12 ci-dessous correspondent aux résultats obtenus lors de l’analyse MRM des 98 MRSA avec l’étape d’induction.
Tableau 9 : Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSAIb à MRSA49b préparées SANS étape d’induction
Tableau 10. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches
MRSA50b à MRSA98b préparées SANS étape d’induction
Tableau 11. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSAIb à MRSA49b préparées AVEC étape d’induction
Tableau 12. Tableau de validation des transitions MRM de la PBP2a des souches MRSA50b à MRSA98b préparées AVEC étape d’induction
Àu regard des résultats présentés dans les tableaux 9 à 12, les conclusions suivantes peuvent être énoncées :
Sans étape d’induction, 38 MRSÀ sur 98 présentent au moins 2 transitions positives pour au moins 3 peptides ce qui correspond à une sensibilité de détection de 39%. Avec l’étape d’induction, 96 MRSA sur 98 possèdent au moins 2 transitions positives pour au moins 3 peptides. Ceci correspond à une sensibilité de 98% de détection des MRSA avec ces critères de validation. Seules les souches MRSA9b et MRSA41 b ne sont pas correctement identifiées car seuls 2 peptides sont détectés avec 2 transitions pour la souche MRSA41 b et 1 peptide avec 2 transitions pour la souche MRSA9b.
Tous les MSSA analysés suivant le même procédé ont pour chaque transition, une valeur d’aire sous la courbe inférieure aux valeurs seuil fixées précédemment. Cela signifie qu’aucun MSSA n’est identifié comme MRSA ce qui équivaut à une spécificité de 100%.
Exemple 4. Résultats de spectrométrie MRM3 pour PBP2A
Les transitions MRM3 pour lesquelles la valeur d’aire est supérieure à la valeur seuil ont été considérées positives et sont notées 1. Les transitions pour lesquelles l’aire est inférieure ou égales à la valeur seuil sont notées 0 et considérées comme négatives. Un échantillon a été considéré comme identifié en tant que MRSÀ si au moins 1 transition MRM3 a été détectée positive. Les 19 souches MSSÀ ont été analysées suivant le même procédé et les résultats sont présentés dans les tableaux suivants.
Le tableau 13 correspond aux résultats obtenus lors de l’analyse MRM3 des 98 MRSÀ sans l’étape d’induction. Il représente les validations des transitions MRM3 des 98 MRSÀ préparés SANS l’étape d’induction
Le tableau 14 correspond aux résultats obtenus lors de l’analyse MRM3 des 98 MRSA avec l’étape d’induction. Il représente les validations des transitions MRM3 des 98 MRSA préparés avec l’étape d’induction.
Tableau 13. Résultats analyse MRM3 sans étape d’induction
Tableau 14. Résultats d’analyse MRM3 avec étape d’induction
19 souches sensibles à la méticilline (MSSÀI b, 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b, 8b, 9b, 10b, 11 b, 12b, 13b 14b, 15b, 16b, 17b, 18b et 19b) ont été testées : aucun peptide issu de PBP2a n’a été détecté, comme attendu. Les résultats ayant tous une valeur de zéro ne sont pas présentés en détail.
Sans l’étape d’induction, 87 souches sur 98 présentent au moins une transition positive, ce qui correspond à 89% de sensibilité (tableau 12).
Avec l’étape d’induction, la totalité des souches MRSA testées ont au moins une transition MRM3 positive, ce qui correspond à 100% de sensibilité (tableau 13). Tous les MSSA analysés suivant le même procédé (avec l’étape d’induction) ont pour chaque transition, une valeur d’aire sous la courbe inférieure ou égale aux valeurs seuil fixées précédemment. Cela signifie qu’aucune souche sensible MSSÀ n’est identifiée comme étant MRSÀ, ce qui équivaut à une spécificité de 100%.
Conclusions
Les performances du procédé selon l’invention sont présentées dans le tableau 15 ci-dessous, qui illustre l’importance de l’étape d’induction.
Tableau 15. Sensibilité du procédé de l’invention
Ces résultats montrent que le procédé selon l’invention permet une identification rapide des MRSÀ en moins de 1 h30, directement à partir d’un échantillon sanguin (hémoculture) positif, et avec des performances supérieures aux autres méthodes actuellement sur le marché (98% de sensibilité et 100% de spécificité en MRM, et 100% de sensibilité et 100% de spécificité en MRM3).
La mise en oeuvre du protocole de préparation de l’échantillon est simple et le coût en consommables par analyse est minime.
De plus, l’éventualité de non-détection, dans le cas d’une protéine variante de la PBP2a possédant une ou plusieurs mutations ponctuelles, est très peu probable, étant donné que l’analyse se base sur la détection de 8 peptides différents de la protéine PBP2a.
Enfin, il a également été montré que l’étape d’induction du procédé est nécessaire pour la détection de la protéine PBP2c dans une souche de staphylococcus aureus exprimant la protéine. Les résultats présentés en figure 7 montrent que la détection aurait été impossible sans l’étape préalable d’induction par incubation avec un antibiotique de la famille des bêtalactamines. REFERENCES
WO 2011 / 045544
Kirby, W.M.M. (1944). Extraction of a highly potent penicillin inactivator from penicillin resistant staphylococci. Science 99, 452-453.
Felten, A., Grandry, B., Lagrange, P.H., and Casin, I. (2002). Evaluation of Three Techniques for Detection of Low-Level Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a Disk Diffusion Method with Cefoxitin and Moxalactam, the Vitek 2 System, and the MRSA-Screen Latex Agglutination Test. J Clin Microbiol 40, 2766-2771.
Sparbier K, Lange C, Jung J, Wieser A, Schubert S, Kostrzewa M. MALDI biotyper-based rapid resistance detection by stable-isotope labeling. J Clin Microbiol. 2013 Nov;51 (11 ):3741 -8.
Tenover, F.C., Jones, R.N., Swenson, J.M., Zimmer, B., McAllister, S., and Jorgensen, J.H. (1999). Methods for Improved Detection of Oxacillin Resistance in Coagulase- Negative Staphylococci: Results of a Multicenter Study. J Clin Microbiol 37, 4051 -4058.
Dupieux, C., Bouchiat, C., Larsen, A.R., Pichon, B., Holmes, M., Teale, C., Edwards, G., Hill, R., Decousser, J.-W., Trouillet-Assant, S., et al. (2017). Detection of mecC-Positive Staphylococcus aureus: What To Expect from Immunological Tests Targeting PBP2a? J Clin Microbiol 55, 1961 -1963.
Charretier, Y., Dauwalder, O., Franceschi, C., Degout-Charmette, E., Zambardi, G., Cecchini, T., Bardet, C., Lacoux, X., Dufour, P., Veron, L., et al. (2015). Rapid Bacterial Identification, Resistance, Virulence and Type Profiling using Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry. Sci Rep 5, 13944.
Neil JR, Verma A, Kronewitter SR, McGee WM, Mullen C, Viirtola M, Kotovuori A, Friedrich H, Finell J, Rannisto J, Syka J EP, Stephenson JL Jr. Rapid MRSA detection via tandem mass spectrometry of the intact 80 kDa PBP2a resistance protein. Sci Rep. 2021 Sep 15;11 (1 ):18309.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la céfoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une séparation des peptides, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1 ) ou de la protéine PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de l’étape d’analyse (d) étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la séparation des peptides est une séparation par chromatographie ou par électrophorèse.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape d’incubation (a) est réalisée pendant une durée comprise entre 15 et 180 minutes.
5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape (b) comprend également une étape de lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique.
6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’hydrolyse des protéines bactériennes à l’étape (c) est une hydrolyse enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l’enzyme est la trypsine.
8. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le au moins un peptide détecté est choisi parmi le groupe de 12 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 3 à SEQ ID NO. 14.
9. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est choisi parmi :
- Un fluide biologique tel que sang, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, et
37 larmes ;
- Une culture bactérienne telle que une hémoculture, une colonie sur gélose, ou un bouillon de culture ;
- Un échantillon alimentaire, et - tout autre type d’échantillon biologique.
10. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 9, comprenant :
- au moins un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la céfoxitine et le 6-ÀPÀ (acide 6-aminopenicillanique),
- de la trypsine, et - un réactif permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, par exemple un détergent.
38
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