Verfahren zur Herstellung eines wundenheilenden Präparates aus Embryonalstoffen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wunden heilenden (epithelisierenden) Präparates aus Embryonalstoffen.
Es ist an sich bekannt, dass im Innern der Zellen von Embryonen von Wirbeltieren Stoffe vorhanden sind, die fördernd auf die Schnelligkeit der Wundenheilung bei Men schen und Tieren wirken. Beispielsweise ist es schon seit langem von Carrel beobachtet worden, dass ein Brei aus Embryonalgeweben in dieser Weise benutzt werden kann, wie auch Versuche gezeigt haben, dass ein aus Hühnerembryonen unter aseptischen Bedin gungen gewonnener Presssaft in durchaus frischem Zustande heilungsfördernd auf Wunden bei Hunden wirkt.
Es ist indessen bisher nicht gelungen, aus Embryona,lgewe- ben oder Presssaft oder Extrakten daraus wundenheilende Präparate herzustellen, die in der klinischen Praxis anwendbar sind, und die Ursache hierfür muss in dem Umstand erblickt werden, dass die Notwendigkeit der Zubereitung der Präparate unter aseptischen Bedingungen und die geringe Haltbarkeit der Stoffe der Herstellung, Verteilung und der praktischen Anwendung der Stoffe unüber steigbare Hindernisse in den Weg gelegt haben.
Die erwähnten Stoffe sind nicht nur epi- thelisierend, sondern besitzen auch im ganzen die Eigenschaft, :das Zellenwachstum in tie rischen Geweben zu unterstützen. Diese Stoffe enthaltende Extrakte haben daher auf einem begrenzten Feld allgemeine Anwen dung gefunden, das heisst zur künstlichen Züchtung tierischer Zellengewebe, und es bat sich erwiesen, dass diese Stoffe notwendig sind, um während längerer Zeit. die Lebens tätigkeit eines tierischen Zellengewebes ausser halb des Organismus aufrechterhalten zu können.
Bei den Arbeiten über künstliche Gewebezüchtung hat man gefunden, dass die in Embryonalgeweben vorkommenden wachs tumfördernden Stoffe gattungsunspezifisch und im übrigen ausserordentlich labil sind. Hinsichtlich der näheren Einzelheiten bei der Anwendung von Embryonalstoffen bei der Züchtung von Zellengeweben kann auf A. Fischer: Gewebezüchtung, München 193,0, verwiesen werden.
Zur Beleuchtung des labi len Charakters der Stoffe kann angeführt werden (l. c. pag. 37-41), dass die Aktivität eines Embryonalextraktes schon durch Auf- bewahrung in Kälte, durch Schütteln oder durch Erwärmung vermindert wird.
'Man hat g o efunden, da.ss solche Extrakte bei Filtrie- rung durch ein Chamberland-Filter vollstän dig unwirksam werden, während die Aktivi tät bei Filtrierung durch ein Berkefelt-Filter bedeutend abnimmt.
Beij Eindämpfung eines Embryonalextraktes in eine dünne Schicht in einem Vakuumexsiklzator über Schwefel säure oder Kalziumehlorid wurde ebenfalls eine bedeutende Verringerung der Aktivität festgestellt.
Die zur Gewebezüchtung in Laboratorien allgemein angewendete Technik zur Herstel lung von Embryonalsaft besteht. darin., dass frische Embryone mit Sand in einem Mörser zerquetscht oder zerkleinert oder zu einem feinen Brei durch Pressen durch die Öffnun gen eines Siebes zerschnitten werden. Durch Schleudern werden die festen Bestandteile von der Flüssigkeit, die in diesem Zustand oder nach Verdünnung angewendet wird, ge trennt. Aus der festen Gewebesubstanz kann man durch Ausziehen mit einer geeigneten wässrigen Flüssigkeit, z.
B. Ringer-Löaun-, eine oder mehrere Portionen weiteren wirk samen Embryonalextraktes erzielen. In die ser Technik hat man so gut wie ausschliess lich 7-10 Tage alte Hülinerembryone als Grundmaterial benutzt, wobei diese unter streng aseptischen Bedingungen aus den Eiern entnommen und unmittelbar nach der Entnahme verwendet werden. Lm die bei der Herstellung des Embry onalsaftes in jedem einzelnen Laboratorium verursachten Be schwerlichkeiten und .den Zeitverlust zu ver meiden, wurde vorgeschlagen,
den Saft azif Trockenheit nach dem Gaede-Staubsehen Verfahren einzudampfen. Die in dieser Weise hergestellten Präparate haben sich jedoch nicht als gleichwertig in ihrer Haltbarkeit erwiesen, weshalb sie in den Laboratorien keine Ausbreitung fanden.
Während man in den Cre -ebezüclitungs- laboratorien sich finit der Forderung der be ständigen Herstellung frischen Embryonal extraktes unter aselitiscbeii Bedingungen ab finden konnte. ist diese Forderung mit: der Anwendung dieser Extrakte bei der pral- tischen Wundbehandlung unvereinbar.
Das Verfahren gemäss der Erfindung ist nun dadurch ""-elzemizeichtiet, dass die Em- bryonalstoffe einer Trocknung unterR-orfen werden, bei der eine Denaturierung von in dem @u@.;an gsmat:erial vorhandenen Protein stoffen stattfindet, welche Trocknung eine Temperatur von 50 C nicht überschreitet.
und dass sodann das so vorbehandelte Prä- parat einer Sterilisierung ohne Erhitzen auf hohe Temperaturen unterworfen \vird.
Die Sterilisierung wird nach der Trock nung der Eml)ryonalstoffe durchgeführt. Sie kann aber, abgesehen hiervon. an einer belie bigen Stufe des Herstellungsverfahrens statt finden, wobei der Stoff sich entweder wieder in flüssigem oder in noch festem Zustand be finden kann.
Die der Sterilisierung vorausgehende Eintrocknung soll so weit gehen, dass das Produkt dabei in wasserfreien oder im wesent lichen wasserfreien Zustand überführt wird. Als Ausgangsmaterialien für die Herstellung des Präparates können @mbryonalgcwebe oder Extrakte oder Zellsaft daraus verwendet werden.
Infol-e der Sterilisierung des Stoffes ver meidet man die Notwendigkeit der asep tischen Herstellung, weshalb man als Grund material Emliryonalgewebe von Embryonen "ebrauchen haiiii. die nicht aseptisch ge won- sind oder gewonnen werden können.
Dass <B>i</B> nen eine solche Sterilisierung möglich sei, konnte nicht vorausgesehen werden, und die Beclin- gungen dafür, class sie geschehen kann, ohne dass die Fähigkeit der Wach.stumförderung von Zehengewebe Lind Heilförderung von Wunden verlorengeht, ist nach der Erfin dung nur dadurch geschaffen. dass der zu sterilisierende Stoff im voraus einer Ein trocknung unterworfen war.
Durch diese Eintrocknung erreicht das Produkt eine solche Beständigkeit, dass eine vollständige Tötung der vorhandenen Mikroorganismen durchgeführt werden kann, ohne dass,die Ak tivität verlorengeht, was wohl dadurch zu erklären ist, dass bei .der Überführung in den wasserfreien Zustand die Begleitstoffe, die die Haltbarkeit des aktiven Prinzips ver mindern, unschädlich gemacht werden.
Die Überführung der Embryonalstoffe in den wasserfreien oder im wesentlichen -was serfreien Zustand zu einem oder andern Zeit punkt, der der Sterilisierung vorausgeht, kann durch eine Wegtrocknung oder Ab- dampfung des Wassers, vorzugsweise unter Vakuum, wobei die Temperatur nicht wesent lich 40 C übersteigen darf, oder durch Extrahierung mit Lösungsmitteln, die Was ser aufnehmen können, z.
B. Äthylalkohol, Aceton, Methylalkohol oder ähnlichen Stof fen, gegebenenfalls mit nachfolgender Be handlung mit. einem flüchtigeren, jedoch weniger wasseraufnehmenden Lösungsmittel, uvie z. B. Äther, geschehen. Wird die letztere Arbeitsweise benutzt, sollte während der Extrahierung zweckmässig auf eine so hohe Konzentration des organischen Lösungsmit tels gehalten werden, dass nicht wesentliche Mengen des wasserlöslichen aktiven Prin zips extrahiert werden.
Die beiden erwähn ten Arbeitsweisen zur Trocknung können gegebenenfalls kombiniert werden, so dass eine teilweise Trocknung dumch Abdampfung von Wasser ausgeführt wird, wonach eine weitere Trocknung durch Extrahierung ge schieht. Nach der Extrahierung wird das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Zur Beschleunigung .der Verdampfung kann, sei es, dass es sieh um Wasser oder um Lö sungsmittel dreht, ein Strom eines luftförmi- ;en Trägers, z. B. atmosphärische Luft oder Stickstoff, über oder durch :das zu trock nende Material geführt werden.
Die Überführung der Embryonalstoffe in den wasserfreien öder im wesentlichen was- .;c#rfreien Zustand, um sie der Sterilisierung gegenüber beständig zu machen, kann in ver schiedenen Stadien der Herstellung geschehen und auf die Embryonalstoffe in verschiede ner Form zur Anwendung gebracht werden. Beispielsweise kann das Embryonalgewebe zuerst einer zerkleinernden mechanischen Be handlung, z.
B. einer Zerquetschung, Zer- schneidung, Pressung, oder einer Kombination solcher Behandlungen, \wodurch die Zellen geöffnet werden, unterworfen werden, und ,die Gewebesäfte von den festen Stoffen oder einem grösseren oder kleineren Teil derselben :durch Sieben, Filtrieren, Schleudern oder Abgiessen entfernt werden, wie auch die festen Stoffe gegebenenfalls einer Extrahie- rung mit Wasser oder wässerigen Flüssig keiten, z.
B. Ringer-Lösung, vor der Trock nung unterworfen werden können, so dass der einer Trocknung zu unterziehende Stoff ein Gewebesaft oder Gewebeextrakt wird. Eben falls kann es vorteilhaft sein, verbleibende Extrahierungsreste- zu trocknen und aufs neue zu extrahieren.
Man kann indessen auch das Embryonal gewebe einer Trocknung in frischem Zustand unterwerfen, bevor es eine andere Behand lung erfahren hat, abgesehen von einer grö sseren oder kleineren Zerkleinerung und Weg- schneidung von Organen oder Teilen, die weniger wertvoll für die Herstellung von wachstumfördernden Stoffen sind oder die einen grösseren Wert für andere Zwecke haben, z. B. Drüsen, soweit -diese im Embryo zur Entwicklung gelangt sind. Hierbei kann dann die weitere Behandlung, z. B:. -die Steri lisation, in einem späteren Zeitpunkt vorge nommen werden, da der Embryo oder :das Embryonalbewehe in getrocknetem Zustand einen Transport aushalten kann.
Das getrock nete Embryonalgewebe kann ebenfalls wäh rend längerer Zeit aufbewahrt werden., ohne dass :das wachstumfördernde Vermögen ver lorengeht.
Die weitere Verarbeitung der in wasser freien oder im wesentlichen wasserfreien Zu stand überführten Embryonals.toffe kann gegebenenfalls nur in einer Sterilisierung be stehen, wobei :die Embryonaalstoffe, soweit sie in der Form getrocli:neter ganzer<B>Em-</B> bryonen oder Stücke von Embryonen oder Embryonalgewebe vorliegen, die nicht zer kleinert sind. natürlich zuerst einer Verinah- lung unterzogen werden müssen.
Es kann jedoch auch auf diesem Stadium der Herstel lung eine Behandlung eingeschaltet werden, die nur den Zweck hat, die Embryonalstoffe in flüssige Form zu überführen, oder die gleichzeitig eine grössere oder geringere Reini gung des Produktes von unwirksainen Be standteilen und Konzentrierung des wirk samen Produktes bezwecken.
Zu diesem Zweck wird der von Wasser ganz oder im wesentlichen befreite Em- bryonalstoff mit oder ohne vorhergehende Vermahlung oder Zerkleinerung einer Extra- hierung mit Wasser oder wasserhaltigen Mit tels, z. B. Ringer-Lösung, unterworfen, und der hierdurch erzielte Extrakt kann unmittel bar oder nach Filtrieren, Schleudern oder Stehenlassen und Abgiessen einer Sterilisie rung unterworfen werden.
Man kann indessen auch den Extrakt einer Fraktionierung unterwerfen, wobei der Extrakt in eine mehr und eine minder wirk same Fraktion geteilt wird, und es hat sieh erwiesen, dass eine :solche Fraktionierung vor teilhaft durch einen Fällungsvorgang durch geführt werden kann. Beispielsweise wird bei Behandlung von Embryonalextrakten mit verdünnten Säuren (vorzug-s =eise Salzsäure oder Essigsäure) ein Niederschlag gebildet. der nach Entfernung als reicher an dem aktiven Prinzip erwiesen wird als die rest liche Lösung.
Der Niederschlag kann in der Form, in welcher er ausgefällt ist, benutzt werden, gegebenenfalls nach Waschen oder Trocknen, oder er kann aufs neue durch An wendung einer kleinen Menge Alkali in Lö sung gebracht werden. Wenn hierbei ein un- löslicher Rest hinterlassen wird, kann dieser durch Schleudern oder Filtrieren oder in anderer Weise entfernt werden.
Es hat sich gezeigt, dass eine Ausfällung des aktiven. Stoffes auch mittels Aceton oder Alkohol erzielt werden kann, da hierbei die Unreinheiten teilweise in der Lösung blei- ben. Auch der hierbei gebildete Niederseblag kann entweder in Form eines Pulvers oder in gelöstem Zustande verwendet werden.
Diese Massnahme zur Reinigung oder Iioiizentrierung des aktiven. wundenheilen- den Prinzip; können. we 111i erwünscht, auch wiederholt oder kombiniert oder mit andern Reinigungsmethoden. wie z.
B. Sehütteln. an gewendet werden, ebenso wie bei dem Fäl- lungsvorgang gegebenenfalls -iiueh andere Fä llungsmittel als die erwähnten verwendet werden können, z. B. Salze.
Die Sterilisierum,- kann auf einer beliebi gen Stufe der Behandlung ausgeführt. wer den, nachdem dass wundenheilende Prinzip enthaltende Präparat einmal in den wasser freien oder in dein im wesentlichen wasser freien Zustand gebracht war.
Es kann also entweder die Aufgabe vorliegen. einen festen Stoff oder eine Lösung zu sterilisieren. und die Sterilisierung kann nicht als eine Wärme sterilisierung ausgeführt werden, da der aktive Stoff, selbst wenn seine Stabilität durch die Trocknung stark erhöht worden ist. keine Erhitzung auf Temperaturen nahe am Siedepunkt, geschweige denn über diesen Punkt, ertragen kann.
Liegt ein fester Stoff zur Sterilisierung vor, wie z. B. frisch getrocknete Embryonen oder Teile solcher, frisch getrocknetes Em- bryonälgewebe in mehr oder minder fein zer teilten Zustand, ein eingedampfter Extrakt oder Embryonalsaft oder ein das aktive Prin zip enthaltender Bodensatz, kann die Sterili- sieruiig zweclzmässig durch Behandlung mit sterilisierenden Mitteln geschehen. Als solche haben besonders organische Lösemittel, wie z. B.
Benzol, Methylalkohol, Äthylalkohol oder Aceton, vorzugsweise in konzentriertem oder wasserfreiem Zustand, sich als geeignet erwiesen, da gegebenenfalls vorhandene Vi- kroorganismen mittels dieser Sterilisierungs- mittel unfehlbar durch eine oder mehrere Be handlungen getötet werden, ohne dass das aktive Prinzip verlorengeht.
Bei Vornahme der Sterilisierung mittels eines sterilisierenden Mittels kann dieselbe in direkter -%.n1nürpfung an den Trockenprozess durchgeführt werden, indem letzterer durch Extrahierung der Embryonalstoffe mit einem Lösungsmittel, das Wasser aufnehmen kann, unter Benutzung eines Mittels ausgeführt wird, das sterilisierend wirkt, sobald das Wasser im wesentlichen von den Embryonal stoffen entfernt worden ist. Als solches steri lisierendes Mittel ist z. B. Aceton besonders geeignet.
In diesem Falle liegt keine scharfe zeitmässige Abgrenzung zwischen dem Troek- nungs- und Sterilisierungsprozess vor.
Liegt dagegen eine Lösung des aktiven Prinzips zur Sterilisierung vor, z. B. ein Extrakt des getrockneten Embryonalgewebes, oder des getrockneten Zellsaftes oder einer Lösung eines ausgefällten Konzentrates, bei dessen Herstellung die Embryonalstoffe vor gängig einer Trocknung unterzogen worden sind, hat es sich als zweckmässig erwiesen, die Sterilisierung durch Filtrierung durch ein bakteriendichtes Filter vorzunehmen, wobei es sich als bedeutungslos gezeigt hat, ob man hierzu ein Chamberland-Filter, ein Berkefelt-Filter oder ein Seitz-Filter benutzt,
da die Aktivität in keinem Fall wesentlich bei dieser Behandlung .abnimmt, was das Resultat der grösseren Stabilität ist, die da durch erreicht wurde, dass das Präparat zu einem Zeitpunkt, -der vor der Sterilisierungs- behandlung liegt, in den wasserfreien oder im wesentlichen wasserfreien Zustand überführt war.
Wenn der Sterilisierung andere Behand lungen folgen, müssen diese unter aseptischen Bedingungen ausgeführt werden, ebenso wie gegebenenfalls dem Präparat hinzuzusetzende Stoffe steril sein müssen.
Bei einer Ausführungsform nach der Er findung geht man in der Weise vor, dass ein Extrakt der getrockneten Embryonalstoffe auf einem indifferenten Adsorptionsmittel eingetrocknet und dann sterilisiert wird. Der Extrakt kann jedoch auch zum voraus steri lisiert werden oder aus getrockneten und sterilisierten Embryonalstoffen hergestellt sein, wonach dann die Eintrocknung auf einem sterilen indifferenten Adsorptions- mittel erfolgt und unter aseptischen Bedin- gungen gearbeitet wird.
Dabei kann nach der Eintrocknung auf dem Adsorptionsmittel sterilisiert werden, z. B. mit Aceton.
Die biologische Aktivität des Produktes wird zweckmässigerweise während des ganzen Verfahrens durch' Entnahme geeigneter Pro ben überwacht, wobei Chargen, die sich ent weder infolge unzweckmässigen Zustandes der Rohmaterialien oder unzweckmässiger Behandlung als unwirksam erweisen, aus dem Verfahren entfernt werden. Die Über wachung kann entweder durch Prüfung des Vermögens der Wachstumförderung künst licher Gewebekulturen, z. B. unter dem Mi kroskop, oder durch direkte Prüfung der wundenheilenden Wirkung an geeigneten Versuchstieren, z. B. Hunden, ausgeführt werden.
Im Einklang mit dem Ergebnis die ser Proben kann das Präparat gegebenenfalls auf eine im voraus bestimmte Aktivität ein gestellt werden, oder durch Mischung von Chargen verschiedener Aktivität oder durch Verdünnung mit indifferenten Verdünnungs mitteln in flüssigem oder festem Zustand, z. B. Ringer-Lösung bezw. Bolus Alba.
Das. Präparat kann, wenn erwünscht, auch mit andern Stoffen, die eine vorteil hafte Wirkung auf Wundbehandlung haben, gemischt werden.
Das als Rohmaterial benutzte Embryonal- gewebe braucht nicht, wie bei der Herstel lung von Embryonalextrakt für Laborato rien, aus Hühnerembryonen gewonnen zu werden, sondern man kann auch Embryonen anderer eierlegender Wirbeltiere oder Säuge tiere in einem geeigneten Entwicklungs- stadium anwenden, wobei es an sich bekannt ist, dass tierische Gewebe ein waehs.tumför- derndes Prinzip in desto wirksamerer Form enthalten, in je früherer Entwicklungsstufe sie sich befinden.
Als Grundmaterial können ganze Embryonen oder Teile von solchen ver wendet werden.
Als Beispiel einer praktischen Ausfüh rung des erfindungsgemässen Verfahrens sei die Behandlung von Säugetierembryonen, z. B. 2@-3 Monate alten Kälteembryonen, be schrieben. Diese werden durch Aufhängen in evakuierten Kammern oder in von reiner, gegebenenfalls steriler, trockener Luft oder Gas :durchströmten Kammern getrocknet, oder sie werden in mehr oder minder zerklei nertem Zustand, ohne dass die Zerkleinerung jedoch so weitgehend ist, dass ein wesent licher Teil des Zellsaftes verlorengeht, in den in -der Nahrungsmittelindustrie zur Behand lung von Fleisch und Gemüsen oder in der pharmazeutischen Industrie zur Behandlung von Organen, z. B.
Drüsen, verwendeten Trockenapparaten getrocknet. Die Trocknung kann beispielsweise in rotierenden Trocken trommeln, die von Trockenluft durchströmt oder evakuiert werden, geschehen. Die Tem peratur darf unter keinen Umständen etwa. 50 C wesentlich übersteigen und sollte vor- zugsweise niedriger sein, ebenso wie es ..ich als vorteilhaft erwiesen hat, die Trocknung unter Vakuum auszuführen. Bevor die Trock nung vorgenommen wird, können gegebenen falls einzelne Organe von den Embryonen entfernt werden, z.
B. Tymus oder Anlagen von Klauen und Zähnen, die entweder in anderer Weise verwendet werden können oder nur in geringem Masse zur Produktion der proliferatischen Stoffe beitragen, oder wie die Leber oder andere Verdauungsdrüsen bei verhältnismässig stark entwickelten Em bryonen herabsetzend auf die Aktivität des hergestellten proliferatischen Stoffes wirken.
Wenn das getrocknete Embryonalgewebe nicht extrahiert werden soll, wird es dann in an sieh bekannter Weise in einem geeig neten Mahlapparat zerkleinert, und das da durch erzielte Pulver kann nun sterilisiert werden.
Die Sterilisierung geschieht bei dieser Ausführungsform der Erfindung z. B. durch Behandlung mit Aceton oder einem Alkohol. Das Produkt wird mit einer geeigneten Menge des Lösungsmittels, z. B. dem 1- bis 10fachen seines Volumens, angerührt, worauf es eine Stunde stehengelassen und sodann von der Flüssigkeit geschieden wird. Die Be handlung wird .so oft wiederholt, bis das Prä parat nach Trocknung einer Probe sich als steril erweist, worauf dass Ganze bei niedri- ger Temperatur, vorzugsweise in Vakuum, nochmals getrocknet wird.
Vor oder nach der Behandlung mit den Sterilisierunbsmit- tclii kann das Pulver mit einem Pulverförmi- gen Verdünnungsmittel, z. B. Bolus Alba oder Talkum, gemischt werden. Wenn der Zusatz des Verdünnungsmittels nach der Sterilisierung geschieht, muss das Verdün nungsmittel im voraus sterilisiert sein, z. B. durch Erhitzung. Die Verdünnung geschieht. vorteilhaft auf Basis von Proben, so dass eine angestrebte, im voraus festgelegte Aktivität erzielt wird.
Geht man von einem Presssaft oder Ex trakt, von nicht im voraus getrockneten Embryonen aus, so geschieht. die Trocknung vorzugs"veise dadurch, da.ss der Extrakt zuerst auf ein pulverförmiges Absorptionsmitte! aufgenommen wird, das in einer solchen Menge hinzugesetzt wird, dass ein mehr oder minder trockener Brei entsteht. \Nenn z. B.
Kieselgur verwendet wird, kann die Menge dreimal so gross wie die Menge des zu trock nenden Extraktes. dem Volumen gerech net, sein.
Die Sterilisierung kann sodann in glei- eher Weise wie oben beschrieben durchge führt werden.
Process for the production of a wound-healing preparation from embryonic substances. The present invention relates to a method for producing a wound-healing (epithelializing) preparation from embryonic materials.
It is known that inside the cells of vertebrate embryos there are substances that promote the speed of wound healing in humans and animals. For example, it has long been observed by Carrel that a pulp made from embryonic tissues can be used in this way, as experiments have also shown that a press juice obtained from chicken embryos under aseptic conditions, in a fresh state, promotes the healing of wounds in dogs.
However, it has so far not been possible to produce wound-healing preparations from embryo, oil tissues or pressed juice or extracts from them that can be used in clinical practice, and the reason for this must be seen in the fact that the preparation of the preparations under aseptic Conditions and the short shelf life of the substances have placed insurmountable obstacles in the way of the manufacture, distribution and practical application of the substances.
The substances mentioned are not only epithelializing, but also have on the whole the property: to support cell growth in animal tissues. Extracts containing these substances have therefore found general application in a limited field, that is to say for the artificial cultivation of animal cell tissues, and it has been shown that these substances are necessary for a long period of time. to be able to maintain the vital activity of an animal cell tissue outside the organism.
In the work on artificial tissue engineering, it has been found that the growth-promoting substances occurring in embryonic tissues are non-genus-specific and, moreover, extremely labile. For further details on the use of embryonic substances in the cultivation of cell tissue, reference can be made to A. Fischer: Gewebezüchtung, Munich 193.0.
To illuminate the labile character of the substances, it can be stated (1. c. Pag. 37-41) that the activity of an embryonic extract is already reduced by storage in the cold, by shaking or by warming.
It has been found that such extracts are completely ineffective when filtered through a Chamberland filter, while the activity is significantly reduced when filtered through a Berkefelt filter.
When an embryonic extract was evaporated into a thin layer in a vacuum desiccator over sulfuric acid or calcium chloride, a significant reduction in activity was also found.
The technique generally used for tissue cultivation in laboratories for the production of embryonic juice consists. that fresh embryos are crushed or crushed with sand in a mortar or cut into a fine pulp by pressing through the openings of a sieve. Spinning separates the solid components from the liquid that is used in this state or after dilution. The solid tissue substance can be extracted with a suitable aqueous liquid, e.g.
B. Ringer-Löaun, one or more servings of further effective seed embryonic extract achieve. In this technique, chicken embryos that were 7-10 days old were used almost exclusively as the basic material, these being removed from the eggs under strictly aseptic conditions and used immediately after removal. In order to avoid the difficulties and the loss of time caused during the production of the embryonic juice in each individual laboratory, it was proposed that
to evaporate the juice in dry conditions according to the Gaede-Staubsehen method. The preparations made in this way, however, have not proven to be equivalent in terms of their shelf life, which is why they were not used in laboratories.
Whereas in the cre-relational laboratories it was possible to come to terms with the demand for the constant production of fresh embryonic extract under aselite conditions. this requirement is incompatible with: the use of these extracts in praletic wound treatment.
The method according to the invention is now "" -elzemizichtiet that the embryonic substances are subjected to a drying, in which a denaturation of protein substances present in the @u @ .; an gsmat: erial takes place, which drying a temperature does not exceed 50 C.
and that the preparation thus pretreated is then subjected to sterilization without heating to high temperatures.
The sterilization is carried out after the eml) ryonal fabrics have dried. But apart from that, it can. take place at any stage of the manufacturing process, whereby the substance can either be in a liquid or in a solid state again.
The drying process prior to sterilization should go so far that the product is converted into an anhydrous or essentially anhydrous state. @Mbryonalgcwebe or extracts or cell sap from it can be used as starting materials for the production of the preparation.
As a result of the sterilization of the material, the need for aseptic production is avoided, which is why the basic material used is emliryonal tissue from embryos that are not or cannot be obtained aseptically.
The fact that such a sterilization would be possible could not be foreseen, and the reason why it can happen without losing the ability to promote growth of toe tissue and healing of wounds is according to the invention only created thereby. that the substance to be sterilized was subjected to drying in advance.
As a result of this drying, the product achieves such a resistance that a complete killing of the microorganisms present can be carried out without the activity being lost, which can probably be explained by the fact that the accompanying substances, which the Reduce the durability of the active principle, render it harmless.
The transfer of the embryonic material into the anhydrous or essentially water-free state at one or the other point in time, which precedes the sterilization, can be done by drying off or evaporating the water, preferably under vacuum, the temperature not significantly exceeding 40 ° C may, or by extraction with solvents that can absorb what water, z.
B. ethyl alcohol, acetone, methyl alcohol or similar substances, if necessary with subsequent treatment with Be. a more volatile, but less water-absorbing solvent, uvie z. B. ether, happen. If the latter procedure is used, it is advisable to maintain such a high concentration of the organic solvent during the extraction that not significant amounts of the water-soluble active principle are extracted.
The two mentioned working methods for drying can optionally be combined so that partial drying is carried out by evaporation of water, after which further drying takes place by extraction. After extraction, the solvent is removed by evaporation. To accelerate the evaporation, whether it is about water or solvent, a stream of an air-shaped carrier, e.g. B. atmospheric air or nitrogen, over or through: the material to be dried be passed.
The transfer of the embryonic substances into the anhydrous or essentially water-free state, in order to make them resistant to sterilization, can take place in different stages of production and can be applied to the embryonic substances in various forms. For example, the embryonic tissue can first undergo a crushing mechanical treatment, e.g.
B. crushing, cutting, pressing, or a combination of such treatments, whereby the cells are opened, are subjected, and, the tissue juices from the solid matter or a larger or smaller part thereof: by sieving, filtering, centrifuging or Pouring away, as well as the solid substances, if necessary an extraction with water or aqueous liquids, z.
B. Ringer's solution, can be subjected to drying before drying, so that the substance to be subjected to drying is a tissue juice or tissue extract. It can also be advantageous to dry any remaining extraction residues and to extract them again.
The embryonic tissue can, however, also be subjected to drying in the fresh state before it has undergone any other treatment, apart from larger or smaller comminution and cutting away of organs or parts which are less valuable for the production of growth-promoting substances or which are of greater value for other purposes, e.g. B. glands, insofar as these have developed in the embryo. Here, the further treatment, for. B :. -The sterilization must be carried out at a later point in time, as the embryo or: the embryonic infusion can withstand transport in a dry state.
The dried embryonic tissue can also be stored for a longer period of time without: losing its growth-promoting capacity.
The further processing of the embryonic substances converted into anhydrous or essentially anhydrous state can optionally only consist of a sterilization, whereby: the embryonic substances, insofar as they are dried in the form of whole embryos or pieces of embryos or embryonic tissue are present that have not been disintegrated. Of course, they must first be paired.
However, a treatment can also be switched on at this stage of the production process, which only has the purpose of converting the embryonic substances into liquid form, or at the same time greater or lesser cleaning of the product from ineffective components and concentration of the active product aim.
For this purpose, the embryonic substance which has been completely or substantially freed from water, with or without prior grinding or comminution, is extracted with water or water-containing agents, e.g. B. Ringer's solution, and the extract thus obtained can be subjected to sterilization immediately cash or after filtering, centrifuging or standing and pouring off.
However, the extract can also be subjected to a fractionation, the extract being divided into a more and a less effective fraction, and it has been shown that such a fractionation can advantageously be carried out by a precipitation process. For example, when embryonic extracts are treated with dilute acids (preferably s = iron hydrochloric acid or acetic acid), a precipitate is formed. which after removal is shown to be richer in the active principle than the rest of the solution.
The precipitate can be used in the form in which it has precipitated, optionally after washing or drying, or it can be redissolved by applying a small amount of alkali. If an insoluble residue is left behind, it can be removed by centrifuging or filtering or in some other way.
It has been shown that precipitation of the active. Substance can also be achieved using acetone or alcohol, since the impurities sometimes remain in the solution. The deposit formed in this way can also be used either in the form of a powder or in a dissolved state.
This measure to purify or Iioiizentrierung the active. wound healing principle; can. we 111i desired, also repeated or combined or with other cleaning methods. such as
B. Sehütteln. to be used, just as in the precipitation process, if necessary -iiueh other precipitants than those mentioned can be used, z. B. Salts.
The Sterilisierum can be carried out at any stage of the treatment. who, after the preparation containing the wound-healing principle has been brought into the anhydrous or essentially anhydrous state.
So there can either be the task. to sterilize a solid or a solution. and the sterilization cannot be carried out as a heat sterilization because the active substance, even if its stability has been greatly increased by the drying. cannot withstand heating to temperatures close to the boiling point, let alone above this point.
If there is a solid material to be sterilized, such as B. freshly dried embryos or parts of such, freshly dried embryonic tissue in a more or less finely divided state, an evaporated extract or embryonic juice or a sediment containing the active principle, the sterilization can be done by treatment with sterilizing agents. As such, organic solvents, such as. B.
Benzene, methyl alcohol, ethyl alcohol or acetone, preferably in a concentrated or anhydrous state, have proven to be suitable, since any microorganisms present are infallibly killed by one or more treatments by means of these sterilizing agents without the active principle being lost.
If the sterilization is carried out by means of a sterilizing agent, the same can be carried out in direct connection with the drying process, in that the latter is carried out by extracting the embryonic matter with a solvent that can absorb water using an agent that has a sterilizing effect as soon as that Water has essentially been removed from the embryonic matter. As such steri lizing agent z. B. acetone is particularly suitable.
In this case, there is no sharp time limit between the drying and sterilization process.
If, on the other hand, there is a solution of the active principle for sterilization, e.g. B. an extract of the dried embryonic tissue, or the dried cell sap or a solution of a precipitated concentrate, during the production of which the embryonic substances have been subjected to drying before, it has proven to be useful to carry out the sterilization by filtering through a bacteria-proof filter, whereby it has been shown to be irrelevant whether a Chamberland filter, a Berkefelt filter or a Seitz filter is used for this,
since the activity in no case significantly decreases during this treatment, which is the result of the greater stability that was achieved because the preparation at a point in time before the sterilization treatment was in the anhydrous or essentially anhydrous State was transferred.
If the sterilization is followed by other treatments, these must be carried out under aseptic conditions, just as any substances to be added to the preparation must be sterile.
In one embodiment according to the invention, the procedure is that an extract of the dried embryonic substances is dried on an inert adsorbent and then sterilized. The extract can, however, also be sterilized in advance or made from dried and sterilized embryonic substances, after which drying is then carried out on a sterile inert adsorbent and the work is carried out under aseptic conditions.
It can be sterilized after drying on the adsorbent, z. B. with acetone.
The biological activity of the product is expediently monitored throughout the process by taking suitable samples, with batches that prove to be ineffective either as a result of the unsuitable condition of the raw materials or inappropriate treatment being removed from the process. The monitoring can be done either by examining the ability to promote growth artificial tissue cultures such. B. microscope under the Mi, or by direct examination of the wound-healing effect on suitable test animals, eg. B. dogs.
In accordance with the result of these samples, the preparation can optionally be placed on a predetermined activity, or by mixing batches of different activity or by diluting with indifferent diluents in liquid or solid state, eg. B. Ringer solution respectively. Bolus Alba.
The. If desired, the preparation can also be mixed with other substances that have an advantageous effect on wound treatment.
The embryonic tissue used as raw material does not need to be obtained from chicken embryos, as is the case with the production of embryonic extracts for laboratories, but embryos from other egg-laying vertebrates or mammals at a suitable stage of development can also be used, whereby it in itself can be used it is known that animal tissues contain a growth-promoting principle in the more effective the form, the earlier they are in development.
Whole embryos or parts of them can be used as the basic material.
As an example of a practical Ausfüh tion of the inventive method is the treatment of mammalian embryos, z. B. 2 @ -3 months old cold embryos, be written. These are dried by hanging in evacuated chambers or in chambers through which pure, possibly sterile, dry air or gas flows, or they are in a more or less crushed state, but without the crushing being so extensive that a wesent Licher part of the Cell juice is lost, in the food industry for the treatment of meat and vegetables or in the pharmaceutical industry for the treatment of organs, eg. B.
Dried glands, dryers used. The drying can take place, for example, in rotating drying drums through which dry air flows or which are evacuated. Under no circumstances should the temperature be around. 50 C and should preferably be lower, just as it has proven to be advantageous to carry out the drying under vacuum. Before the drying is made, individual organs can be removed from the embryos if necessary, for.
B. tymus or systems of claws and teeth, which can either be used in other ways or contribute only to a small extent to the production of the proliferative substances, or such as the liver or other digestive glands in relatively strongly developed Em bryons reducing the activity of the proliferative produced Act.
If the dried embryonic tissue is not to be extracted, it is then comminuted in a manner known per se in a suitable grinding apparatus, and the powder obtained there through can now be sterilized.
The sterilization is done in this embodiment of the invention, for. B. by treatment with acetone or an alcohol. The product is mixed with a suitable amount of the solvent, e.g. B. 1 to 10 times its volume, whereupon it is left to stand for an hour and then separated from the liquid. The treatment is repeated until the preparation proves to be sterile after drying a sample, whereupon the whole thing is dried again at a low temperature, preferably in a vacuum.
Before or after the treatment with the sterilizing agents, the powder can be mixed with a powdery diluent, e.g. B. Bolus Alba or talc, mixed. If the addition of the diluent is done after sterilization, the diluent must be sterilized in advance, e.g. B. by heating. The dilution happens. advantageously on the basis of samples, so that a desired, predetermined activity is achieved.
If one assumes a pressed juice or extract, from embryos that have not been dried in advance, then this happens. the drying is preferably done by the fact that the extract is first taken up on a powdery absorption medium, which is added in such an amount that a more or less dry pulp is formed.
If kieselguhr is used, the amount can be three times the amount of the extract to be dried. calculated based on the volume.
The sterilization can then be carried out in the same way as described above.