Verfahren zur Herstellung eines wundenheilenden Präparates aus Embryonalstoffen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wunden heilenden (epithelisierenden) Präparates aus Embryonalstoffen.
Es ist an sich bekannt, dass im Innern der Zellen von Embryonen von Wirbeltieren Stoffe vorhanden sind, die fördernd auf die Schnelligkeit der Wundenheilung bei Men schen und Tieren wirken. Beispielsweise ist es schon seit langem von Carrel beobachtet worden, dass ein Brei aus Embryonalgeweben in dieser Weise benutzt werden kann, wie auch Versuche gezeigt haben, dass ein aus Hühnerembryonen unter aseptischen Bedin gungen gewonnener Presssaft in durchaus frischem Zustande heilungsfördernd auf Wunden bei Hunden wirkt.
Es ist indessen bisher nicht gelungen, aus Embryona,lgewe- ben oder Presssaft oder Extrakten daraus wundenheilende Präparate herzustellen, die in der klinischen Praxis anwendbar sind, und die Ursache hierfür muss in dem Umstand erblickt werden, dass die Notwendigkeit der Zubereitung der Präparate unter aseptischen Bedingungen und die geringe Haltbarkeit der Stoffe der Herstellung, Verteilung und der praktischen Anwendung der Stoffe unüber steigbare Hindernisse in den Weg gelegt haben.
Die erwähnten Stoffe sind nicht nur epi- thelisierend, sondern besitzen auch im ganzen die Eigenschaft, :das Zellenwachstum in tie rischen Geweben zu unterstützen. Diese Stoffe enthaltende Extrakte haben daher auf einem begrenzten Feld allgemeine Anwen dung gefunden, das heisst zur künstlichen Züchtung tierischer Zellengewebe, und es bat sich erwiesen, dass diese Stoffe notwendig sind, um während längerer Zeit. die Lebens tätigkeit eines tierischen Zellengewebes ausser halb des Organismus aufrechterhalten zu können.
Bei den Arbeiten über künstliche Gewebezüchtung hat man gefunden, dass die in Embryonalgeweben vorkommenden wachs tumfördernden Stoffe gattungsunspezifisch und im übrigen ausserordentlich labil sind. Hinsichtlich der näheren Einzelheiten bei der Anwendung von Embryonalstoffen bei der Züchtung von Zellengeweben kann auf A. Fischer: Gewebezüchtung, München 193,0, verwiesen werden.
Zur Beleuchtung des labi len Charakters der Stoffe kann angeführt werden (l. c. pag. 37-41), dass die Aktivität eines Embryonalextraktes schon durch Auf- bewahrung in Kälte, durch Schütteln oder durch Erwärmung vermindert wird.
'Man hat g o efunden, da.ss solche Extrakte bei Filtrie- rung durch ein Chamberland-Filter vollstän dig unwirksam werden, während die Aktivi tät bei Filtrierung durch ein Berkefelt-Filter bedeutend abnimmt.
Beij Eindämpfung eines Embryonalextraktes in eine dünne Schicht in einem Vakuumexsiklzator über Schwefel säure oder Kalziumehlorid wurde ebenfalls eine bedeutende Verringerung der Aktivität festgestellt.
Die zur Gewebezüchtung in Laboratorien allgemein angewendete Technik zur Herstel lung von Embryonalsaft besteht. darin., dass frische Embryone mit Sand in einem Mörser zerquetscht oder zerkleinert oder zu einem feinen Brei durch Pressen durch die Öffnun gen eines Siebes zerschnitten werden. Durch Schleudern werden die festen Bestandteile von der Flüssigkeit, die in diesem Zustand oder nach Verdünnung angewendet wird, ge trennt. Aus der festen Gewebesubstanz kann man durch Ausziehen mit einer geeigneten wässrigen Flüssigkeit, z.
B. Ringer-Löaun-, eine oder mehrere Portionen weiteren wirk samen Embryonalextraktes erzielen. In die ser Technik hat man so gut wie ausschliess lich 7-10 Tage alte Hülinerembryone als Grundmaterial benutzt, wobei diese unter streng aseptischen Bedingungen aus den Eiern entnommen und unmittelbar nach der Entnahme verwendet werden. Lm die bei der Herstellung des Embry onalsaftes in jedem einzelnen Laboratorium verursachten Be schwerlichkeiten und .den Zeitverlust zu ver meiden, wurde vorgeschlagen,
den Saft azif Trockenheit nach dem Gaede-Staubsehen Verfahren einzudampfen. Die in dieser Weise hergestellten Präparate haben sich jedoch nicht als gleichwertig in ihrer Haltbarkeit erwiesen, weshalb sie in den Laboratorien keine Ausbreitung fanden.
Während man in den Cre -ebezüclitungs- laboratorien sich finit der Forderung der be ständigen Herstellung frischen Embryonal extraktes unter aselitiscbeii Bedingungen ab finden konnte. ist diese Forderung mit: der Anwendung dieser Extrakte bei der pral- tischen Wundbehandlung unvereinbar.
Das Verfahren gemäss der Erfindung ist nun dadurch ""-elzemizeichtiet, dass die Em- bryonalstoffe einer Trocknung unterR-orfen werden, bei der eine Denaturierung von in dem @u@.;an gsmat:erial vorhandenen Protein stoffen stattfindet, welche Trocknung eine Temperatur von 50 C nicht überschreitet.
und dass sodann das so vorbehandelte Prä- parat einer Sterilisierung ohne Erhitzen auf hohe Temperaturen unterworfen \vird.
Die Sterilisierung wird nach der Trock nung der Eml)ryonalstoffe durchgeführt. Sie kann aber, abgesehen hiervon. an einer belie bigen Stufe des Herstellungsverfahrens statt finden, wobei der Stoff sich entweder wieder in flüssigem oder in noch festem Zustand be finden kann.
Die der Sterilisierung vorausgehende Eintrocknung soll so weit gehen, dass das Produkt dabei in wasserfreien oder im wesent lichen wasserfreien Zustand überführt wird. Als Ausgangsmaterialien für die Herstellung des Präparates können @mbryonalgcwebe oder Extrakte oder Zellsaft daraus verwendet werden.
Infol-e der Sterilisierung des Stoffes ver meidet man die Notwendigkeit der asep tischen Herstellung, weshalb man als Grund material Emliryonalgewebe von Embryonen "ebrauchen haiiii. die nicht aseptisch ge won- sind oder gewonnen werden können.
Dass <B>i</B> nen eine solche Sterilisierung möglich sei, konnte nicht vorausgesehen werden, und die Beclin- gungen dafür, class sie geschehen kann, ohne dass die Fähigkeit der Wach.stumförderung von Zehengewebe Lind Heilförderung von Wunden verlorengeht, ist nach der Erfin dung nur dadurch geschaffen. dass der zu sterilisierende Stoff im voraus einer Ein trocknung unterworfen war.
Durch diese Eintrocknung erreicht das Produkt eine solche Beständigkeit, dass eine vollständige Tötung der vorhandenen Mikroorganismen durchgeführt werden kann, ohne dass,die Ak tivität verlorengeht, was wohl dadurch zu erklären ist, dass bei .der Überführung in den wasserfreien Zustand die Begleitstoffe, die die Haltbarkeit des aktiven Prinzips ver mindern, unschädlich gemacht werden.
Die Überführung der Embryonalstoffe in den wasserfreien oder im wesentlichen -was serfreien Zustand zu einem oder andern Zeit punkt, der der Sterilisierung vorausgeht, kann durch eine Wegtrocknung oder Ab- dampfung des Wassers, vorzugsweise unter Vakuum, wobei die Temperatur nicht wesent lich 40 C übersteigen darf, oder durch Extrahierung mit Lösungsmitteln, die Was ser aufnehmen können, z.
B. Äthylalkohol, Aceton, Methylalkohol oder ähnlichen Stof fen, gegebenenfalls mit nachfolgender Be handlung mit. einem flüchtigeren, jedoch weniger wasseraufnehmenden Lösungsmittel, uvie z. B. Äther, geschehen. Wird die letztere Arbeitsweise benutzt, sollte während der Extrahierung zweckmässig auf eine so hohe Konzentration des organischen Lösungsmit tels gehalten werden, dass nicht wesentliche Mengen des wasserlöslichen aktiven Prin zips extrahiert werden.
Die beiden erwähn ten Arbeitsweisen zur Trocknung können gegebenenfalls kombiniert werden, so dass eine teilweise Trocknung dumch Abdampfung von Wasser ausgeführt wird, wonach eine weitere Trocknung durch Extrahierung ge schieht. Nach der Extrahierung wird das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Zur Beschleunigung .der Verdampfung kann, sei es, dass es sieh um Wasser oder um Lö sungsmittel dreht, ein Strom eines luftförmi- ;en Trägers, z. B. atmosphärische Luft oder Stickstoff, über oder durch :das zu trock nende Material geführt werden.
Die Überführung der Embryonalstoffe in den wasserfreien öder im wesentlichen was- .;c#rfreien Zustand, um sie der Sterilisierung gegenüber beständig zu machen, kann in ver schiedenen Stadien der Herstellung geschehen und auf die Embryonalstoffe in verschiede ner Form zur Anwendung gebracht werden. Beispielsweise kann das Embryonalgewebe zuerst einer zerkleinernden mechanischen Be handlung, z.
B. einer Zerquetschung, Zer- schneidung, Pressung, oder einer Kombination solcher Behandlungen, \wodurch die Zellen geöffnet werden, unterworfen werden, und ,die Gewebesäfte von den festen Stoffen oder einem grösseren oder kleineren Teil derselben :durch Sieben, Filtrieren, Schleudern oder Abgiessen entfernt werden, wie auch die festen Stoffe gegebenenfalls einer Extrahie- rung mit Wasser oder wässerigen Flüssig keiten, z.
B. Ringer-Lösung, vor der Trock nung unterworfen werden können, so dass der einer Trocknung zu unterziehende Stoff ein Gewebesaft oder Gewebeextrakt wird. Eben falls kann es vorteilhaft sein, verbleibende Extrahierungsreste- zu trocknen und aufs neue zu extrahieren.
Man kann indessen auch das Embryonal gewebe einer Trocknung in frischem Zustand unterwerfen, bevor es eine andere Behand lung erfahren hat, abgesehen von einer grö sseren oder kleineren Zerkleinerung und Weg- schneidung von Organen oder Teilen, die weniger wertvoll für die Herstellung von wachstumfördernden Stoffen sind oder die einen grösseren Wert für andere Zwecke haben, z. B. Drüsen, soweit -diese im Embryo zur Entwicklung gelangt sind. Hierbei kann dann die weitere Behandlung, z. B:. -die Steri lisation, in einem späteren Zeitpunkt vorge nommen werden, da der Embryo oder :das Embryonalbewehe in getrocknetem Zustand einen Transport aushalten kann.
Das getrock nete Embryonalgewebe kann ebenfalls wäh rend längerer Zeit aufbewahrt werden., ohne dass :das wachstumfördernde Vermögen ver lorengeht.
Die weitere Verarbeitung der in wasser freien oder im wesentlichen wasserfreien Zu stand überführten Embryonals.toffe kann gegebenenfalls nur in einer Sterilisierung be stehen, wobei :die Embryonaalstoffe, soweit sie in der Form getrocli:neter ganzer<B>Em-</B> bryonen oder Stücke von Embryonen oder Embryonalgewebe vorliegen, die nicht zer kleinert sind. natürlich zuerst einer Verinah- lung unterzogen werden müssen.
Es kann jedoch auch auf diesem Stadium der Herstel lung eine Behandlung eingeschaltet werden, die nur den Zweck hat, die Embryonalstoffe in flüssige Form zu überführen, oder die gleichzeitig eine grössere oder geringere Reini gung des Produktes von unwirksainen Be standteilen und Konzentrierung des wirk samen Produktes bezwecken.
Zu diesem Zweck wird der von Wasser ganz oder im wesentlichen befreite Em- bryonalstoff mit oder ohne vorhergehende Vermahlung oder Zerkleinerung einer Extra- hierung mit Wasser oder wasserhaltigen Mit tels, z. B. Ringer-Lösung, unterworfen, und der hierdurch erzielte Extrakt kann unmittel bar oder nach Filtrieren, Schleudern oder Stehenlassen und Abgiessen einer Sterilisie rung unterworfen werden.
Man kann indessen auch den Extrakt einer Fraktionierung unterwerfen, wobei der Extrakt in eine mehr und eine minder wirk same Fraktion geteilt wird, und es hat sieh erwiesen, dass eine :solche Fraktionierung vor teilhaft durch einen Fällungsvorgang durch geführt werden kann. Beispielsweise wird bei Behandlung von Embryonalextrakten mit verdünnten Säuren (vorzug-s =eise Salzsäure oder Essigsäure) ein Niederschlag gebildet. der nach Entfernung als reicher an dem aktiven Prinzip erwiesen wird als die rest liche Lösung.
Der Niederschlag kann in der Form, in welcher er ausgefällt ist, benutzt werden, gegebenenfalls nach Waschen oder Trocknen, oder er kann aufs neue durch An wendung einer kleinen Menge Alkali in Lö sung gebracht werden. Wenn hierbei ein un- löslicher Rest hinterlassen wird, kann dieser durch Schleudern oder Filtrieren oder in anderer Weise entfernt werden.
Es hat sich gezeigt, dass eine Ausfällung des aktiven. Stoffes auch mittels Aceton oder Alkohol erzielt werden kann, da hierbei die Unreinheiten teilweise in der Lösung blei- ben. Auch der hierbei gebildete Niederseblag kann entweder in Form eines Pulvers oder in gelöstem Zustande verwendet werden.
Diese Massnahme zur Reinigung oder Iioiizentrierung des aktiven. wundenheilen- den Prinzip; können. we 111i erwünscht, auch wiederholt oder kombiniert oder mit andern Reinigungsmethoden. wie z.
B. Sehütteln. an gewendet werden, ebenso wie bei dem Fäl- lungsvorgang gegebenenfalls -iiueh andere Fä llungsmittel als die erwähnten verwendet werden können, z. B. Salze.
Die Sterilisierum,- kann auf einer beliebi gen Stufe der Behandlung ausgeführt. wer den, nachdem dass wundenheilende Prinzip enthaltende Präparat einmal in den wasser freien oder in dein im wesentlichen wasser freien Zustand gebracht war.
Es kann also entweder die Aufgabe vorliegen. einen festen Stoff oder eine Lösung zu sterilisieren. und die Sterilisierung kann nicht als eine Wärme sterilisierung ausgeführt werden, da der aktive Stoff, selbst wenn seine Stabilität durch die Trocknung stark erhöht worden ist. keine Erhitzung auf Temperaturen nahe am Siedepunkt, geschweige denn über diesen Punkt, ertragen kann.
Liegt ein fester Stoff zur Sterilisierung vor, wie z. B. frisch getrocknete Embryonen oder Teile solcher, frisch getrocknetes Em- bryonälgewebe in mehr oder minder fein zer teilten Zustand, ein eingedampfter Extrakt oder Embryonalsaft oder ein das aktive Prin zip enthaltender Bodensatz, kann die Sterili- sieruiig zweclzmässig durch Behandlung mit sterilisierenden Mitteln geschehen. Als solche haben besonders organische Lösemittel, wie z. B.
Benzol, Methylalkohol, Äthylalkohol oder Aceton, vorzugsweise in konzentriertem oder wasserfreiem Zustand, sich als geeignet erwiesen, da gegebenenfalls vorhandene Vi- kroorganismen mittels dieser Sterilisierungs- mittel unfehlbar durch eine oder mehrere Be handlungen getötet werden, ohne dass das aktive Prinzip verlorengeht.
Bei Vornahme der Sterilisierung mittels eines sterilisierenden Mittels kann dieselbe in direkter -%.n1nürpfung an den Trockenprozess durchgeführt werden, indem letzterer durch Extrahierung der Embryonalstoffe mit einem Lösungsmittel, das Wasser aufnehmen kann, unter Benutzung eines Mittels ausgeführt wird, das sterilisierend wirkt, sobald das Wasser im wesentlichen von den Embryonal stoffen entfernt worden ist. Als solches steri lisierendes Mittel ist z. B. Aceton besonders geeignet.
In diesem Falle liegt keine scharfe zeitmässige Abgrenzung zwischen dem Troek- nungs- und Sterilisierungsprozess vor.
Liegt dagegen eine Lösung des aktiven Prinzips zur Sterilisierung vor, z. B. ein Extrakt des getrockneten Embryonalgewebes, oder des getrockneten Zellsaftes oder einer Lösung eines ausgefällten Konzentrates, bei dessen Herstellung die Embryonalstoffe vor gängig einer Trocknung unterzogen worden sind, hat es sich als zweckmässig erwiesen, die Sterilisierung durch Filtrierung durch ein bakteriendichtes Filter vorzunehmen, wobei es sich als bedeutungslos gezeigt hat, ob man hierzu ein Chamberland-Filter, ein Berkefelt-Filter oder ein Seitz-Filter benutzt,
da die Aktivität in keinem Fall wesentlich bei dieser Behandlung .abnimmt, was das Resultat der grösseren Stabilität ist, die da durch erreicht wurde, dass das Präparat zu einem Zeitpunkt, -der vor der Sterilisierungs- behandlung liegt, in den wasserfreien oder im wesentlichen wasserfreien Zustand überführt war.
Wenn der Sterilisierung andere Behand lungen folgen, müssen diese unter aseptischen Bedingungen ausgeführt werden, ebenso wie gegebenenfalls dem Präparat hinzuzusetzende Stoffe steril sein müssen.
Bei einer Ausführungsform nach der Er findung geht man in der Weise vor, dass ein Extrakt der getrockneten Embryonalstoffe auf einem indifferenten Adsorptionsmittel eingetrocknet und dann sterilisiert wird. Der Extrakt kann jedoch auch zum voraus steri lisiert werden oder aus getrockneten und sterilisierten Embryonalstoffen hergestellt sein, wonach dann die Eintrocknung auf einem sterilen indifferenten Adsorptions- mittel erfolgt und unter aseptischen Bedin- gungen gearbeitet wird.
Dabei kann nach der Eintrocknung auf dem Adsorptionsmittel sterilisiert werden, z. B. mit Aceton.
Die biologische Aktivität des Produktes wird zweckmässigerweise während des ganzen Verfahrens durch' Entnahme geeigneter Pro ben überwacht, wobei Chargen, die sich ent weder infolge unzweckmässigen Zustandes der Rohmaterialien oder unzweckmässiger Behandlung als unwirksam erweisen, aus dem Verfahren entfernt werden. Die Über wachung kann entweder durch Prüfung des Vermögens der Wachstumförderung künst licher Gewebekulturen, z. B. unter dem Mi kroskop, oder durch direkte Prüfung der wundenheilenden Wirkung an geeigneten Versuchstieren, z. B. Hunden, ausgeführt werden.
Im Einklang mit dem Ergebnis die ser Proben kann das Präparat gegebenenfalls auf eine im voraus bestimmte Aktivität ein gestellt werden, oder durch Mischung von Chargen verschiedener Aktivität oder durch Verdünnung mit indifferenten Verdünnungs mitteln in flüssigem oder festem Zustand, z. B. Ringer-Lösung bezw. Bolus Alba.
Das. Präparat kann, wenn erwünscht, auch mit andern Stoffen, die eine vorteil hafte Wirkung auf Wundbehandlung haben, gemischt werden.
Das als Rohmaterial benutzte Embryonal- gewebe braucht nicht, wie bei der Herstel lung von Embryonalextrakt für Laborato rien, aus Hühnerembryonen gewonnen zu werden, sondern man kann auch Embryonen anderer eierlegender Wirbeltiere oder Säuge tiere in einem geeigneten Entwicklungs- stadium anwenden, wobei es an sich bekannt ist, dass tierische Gewebe ein waehs.tumför- derndes Prinzip in desto wirksamerer Form enthalten, in je früherer Entwicklungsstufe sie sich befinden.
Als Grundmaterial können ganze Embryonen oder Teile von solchen ver wendet werden.
Als Beispiel einer praktischen Ausfüh rung des erfindungsgemässen Verfahrens sei die Behandlung von Säugetierembryonen, z. B. 2@-3 Monate alten Kälteembryonen, be schrieben. Diese werden durch Aufhängen in evakuierten Kammern oder in von reiner, gegebenenfalls steriler, trockener Luft oder Gas :durchströmten Kammern getrocknet, oder sie werden in mehr oder minder zerklei nertem Zustand, ohne dass die Zerkleinerung jedoch so weitgehend ist, dass ein wesent licher Teil des Zellsaftes verlorengeht, in den in -der Nahrungsmittelindustrie zur Behand lung von Fleisch und Gemüsen oder in der pharmazeutischen Industrie zur Behandlung von Organen, z. B.
Drüsen, verwendeten Trockenapparaten getrocknet. Die Trocknung kann beispielsweise in rotierenden Trocken trommeln, die von Trockenluft durchströmt oder evakuiert werden, geschehen. Die Tem peratur darf unter keinen Umständen etwa. 50 C wesentlich übersteigen und sollte vor- zugsweise niedriger sein, ebenso wie es ..ich als vorteilhaft erwiesen hat, die Trocknung unter Vakuum auszuführen. Bevor die Trock nung vorgenommen wird, können gegebenen falls einzelne Organe von den Embryonen entfernt werden, z.
B. Tymus oder Anlagen von Klauen und Zähnen, die entweder in anderer Weise verwendet werden können oder nur in geringem Masse zur Produktion der proliferatischen Stoffe beitragen, oder wie die Leber oder andere Verdauungsdrüsen bei verhältnismässig stark entwickelten Em bryonen herabsetzend auf die Aktivität des hergestellten proliferatischen Stoffes wirken.
Wenn das getrocknete Embryonalgewebe nicht extrahiert werden soll, wird es dann in an sieh bekannter Weise in einem geeig neten Mahlapparat zerkleinert, und das da durch erzielte Pulver kann nun sterilisiert werden.
Die Sterilisierung geschieht bei dieser Ausführungsform der Erfindung z. B. durch Behandlung mit Aceton oder einem Alkohol. Das Produkt wird mit einer geeigneten Menge des Lösungsmittels, z. B. dem 1- bis 10fachen seines Volumens, angerührt, worauf es eine Stunde stehengelassen und sodann von der Flüssigkeit geschieden wird. Die Be handlung wird .so oft wiederholt, bis das Prä parat nach Trocknung einer Probe sich als steril erweist, worauf dass Ganze bei niedri- ger Temperatur, vorzugsweise in Vakuum, nochmals getrocknet wird.
Vor oder nach der Behandlung mit den Sterilisierunbsmit- tclii kann das Pulver mit einem Pulverförmi- gen Verdünnungsmittel, z. B. Bolus Alba oder Talkum, gemischt werden. Wenn der Zusatz des Verdünnungsmittels nach der Sterilisierung geschieht, muss das Verdün nungsmittel im voraus sterilisiert sein, z. B. durch Erhitzung. Die Verdünnung geschieht. vorteilhaft auf Basis von Proben, so dass eine angestrebte, im voraus festgelegte Aktivität erzielt wird.
Geht man von einem Presssaft oder Ex trakt, von nicht im voraus getrockneten Embryonen aus, so geschieht. die Trocknung vorzugs"veise dadurch, da.ss der Extrakt zuerst auf ein pulverförmiges Absorptionsmitte! aufgenommen wird, das in einer solchen Menge hinzugesetzt wird, dass ein mehr oder minder trockener Brei entsteht. \Nenn z. B.
Kieselgur verwendet wird, kann die Menge dreimal so gross wie die Menge des zu trock nenden Extraktes. dem Volumen gerech net, sein.
Die Sterilisierung kann sodann in glei- eher Weise wie oben beschrieben durchge führt werden.