Procédé pour extraire des substances organiques de solutions les contenant.
La présente invention concerne un procédé pour extraire des substances organiques de solutions les contenant, applicable par exemple à l'extraction et la purification de substances qui sont des produits du métabo- lisme du penicillium notatum et de certains autres organismes microscopiques.
Selon ce procédé, on fait passer une solu tion contenant la, substance à extraire au travers d'une couche de matériel adsorbant, indifférent, contenant un liquide non miscible avec le solvant de la solution traitée, ainsi qu'une substance chimique qui réagit avec la. matière organique à extraire de façon à former une combinaison insoluble dans le solvant de la. solution traitée, mais soluble dans le liquide contenu dans la couche de matériel adsorbant, et on extrait la substance formée de la zone de la colonne où elle a été retenue.
Le processus peut être expliqué comme suit : Pendant le passage de la solution à travers la colonne', la. ou les substances à extraire réagissent d'abord avec les produits chimiques qui sont mêlés au matériel absorbant. Les produits qui naissentalorset qui sont insolubles dans le solvant de la sodution traitée se déposent alors sur la, surface du matériel adsorbant. Ceci a lieu dans différentes zones de la colonne. Par la séparation et l'extrac tion de ces couches, on obtient des composés purs des substances à extraire. Ces composés peuvent être utilisés directement ou on en peut libérer la substance originaire en les dissociant.
Des produits contenant du silicium comme le gel de silice, la pierre-ponce, le produit vendu sous le nom commercial de Hyflo- Super-Cel et d'autres produits semblables peuvent être utilisés comme support ou materiel absorbant. Il est Ó recommander de tamiser ce dernier avant son utilisation de ma nière à obtenir des granules de dimensions régulières, afin de faciliter le remplissage de la colonne et le passage du liquide,
Lorsque des substances ayant un caractère acide comme la pénicilline doivent, être soumises au procédé selon l'invention, on mélangera de préférence au matériel absorbant une substance ayant un caractère basique pour provoquer la formation de la com- position sous la forme de sel.
Les substances basiques se prêtant à cet emploi seront de préférence un hydroxyde, un carbonate ou un bicarbonate d'un métal alcalin ou alcalinterreux. Le solvant combiné au matériel de support sera de préférence de nature hydroxy- lique, généralement de l'eau. Il est cependant avantageux de sécher la substance servant de support avec le produit chimique qui lui est mélangé ou qu'on a déposé sur lui, et de rebydrater le tout jusqu'au point désiré. La quantité d'eau est cependant à limiter de manière que les granules ne collent pas les uns aux autres. Des essais ont prouvé que cette quantité pouvait varier entre le 30 et 70%. du poids du support sec.
Les exemplessuivatïtsdonnentdifférentes manières do réaliser l'invention.
1. Du gel de siliee fut pulvérisé et tamisé et la fraction retenue par un tamis 120, mais non par un tamis 100, seule utilisée. Elle fut alors lavée avec de 1'eau froide (éviter d'employer l'eau chaude qui a tendance à rendre inactif le gel) jusqu'à ce que l'eau de lavage devienne neutre, séchée à 110", puis la poudre refroidie fut rehydratée de manière que trois s parties d'eau fussent contenues dans 10 parties de gel de silice.
Le produit fut mélangé par agitation avee 4% de son poids de carbonate de baryum d'une finessetelle qu'il était aussi retenu par un tamis 120 après avoir passé par un tamis 100. 10 grammes de ce mélange furent alors introduits dans un tube de verre (de 23 em de longueur et (), 9 cm de diamètre intérieur) placé verticalement, que l'on tapait légèrement, et l'on ajouta dans le tube une couche supérieure de 6 cm de gel de silice neutre, hydratée (cette couche de gel de silice fut souvent utile parce qu'elle retenait une quantité de pigments de moisissure tout en laissant passer la pénicil- line). L'extrémité inférieure du tube fut alors placée sur un flacon filtrant et mis en relation avec une trompe.
Une solution de pénicilline de baryum brute (80 mg dans 50 ex' ; celle-ci était fortement bactéricide dans certaines conditions choisies, identiques dans tous les essais mentionnes ici, pour le sta phylococcus aureus, à une dilution de
1 : 18. 10") fut portée à un pu de 3, 0 et la pénicilline libérée fut extraite avec 60 em3 d'ëtber. D'autres solvants de la pénicilline non miscibles dans l'eau, comme le benzène ou le chloroforme, peuvent également être utilisés à la place de l'éther. La solution éthérée fut passée lentement à travers le tube.
Le gel de silice non traité retint beaucoup de pigments, mais après que le tube eut été lavé avec une nouvelle quantité de 60 em3 d'éther, on put voir que ! la, majeure partie de la pénicilline avait été retenue dans la partie inférieure du tube. Les différentes zones de cette partie inférieure (1, 5 cm, 1, 5 am et 10 cm en profondeur en partant de la partie supérieure du mélange) furent extraites séparément avec de l'eau (10 em3 pour chacune).
Ces fractions montraient l'arrêt de la croissance des bactéries, dans les mêmes conditions standard, à des dilutions de 1 partie d'ex- trait : 200 000, 1 : 6400 et 1 : 80 respectivement. Le filtrat et la substance récupérée à partir d'u gel de silice seuls étaient inactifs.
La fraction la plus active contenait 20, 4 mg, en sorte que oe produit était actif à environ 1 partie de substance : 10 0. parties d'eau et la récupération était pratiquement quanti tative. Ceci représente une concentration qua druplée ou quintuplée.
2. Une expérience fut conduite exactement comme dans l'exemple 1 si ce n'est que du carbonate de calcium remplaça'le carbonate de baryum. Une plus grande partie du tube absorbant fut lavée avec de 1'eau, afin d'avoir toute la substance active récupérée dans une seule solution. 60% de la substance active initiale fut obtenue dans la partie supérieure du mélange de carbonate de calcium, la partie solide récupérée étant active à une dilution d'au moins 1 : 30. 10, ce qui représente approximativement une concentration doublée.
3. Du gel de silice (100 g), tamisé et lavé comme dans les essais décrits ci-dessus, fut mis en suspension dans de l'eau (200 cm3) et du chlorure de baryum déshydraté (6, 2 g) fut dissous dans une petite quantité d'eau additionnelle. Du carbonate de baryum fut précipité sur le support par adjonction de carbonate de potassium (5 g) dissous dans un peu'd'eau. (Ces. quantités sont calculées de manière à donner un dépôt de 5 % de carbo- nate de baryum sur le gel de silice.) La suspension fut ensuite filtrée et lavée avec de l'eau (500 cm3) lorsque le ps de la suspension fut de 8, 2-. 8, 4.
Le gâteau obtenu sur le filtre fut alors séché sur du papier filtre jusqu'à ce qu'il coule uniformément ; on le mit alors dans un tube ayant les mêmes dimensions que celles des récipients d'oui il a été question précédemment, la substance'déposée étant surmontée par une couche de gel de silice seul. La pénicilline en solution éthérée fut alors fractionnée dans les mêmes conditions' que d'ans celles décrites dans les exemples donnés ci-dessus.
A nouveau toute la péni- cilline fut retrouvée dans ime couche de 3 à 4 cm d'épaisseur au haut du gel de silice traité. 30 mg de sel de baryum traité furent récupérés, qui était actif à une dilution de 1 : 60. 106, ce qui représente une récupération quantitative et une concentration triplée.
4. L'exemple 3 fut répété au fait près que le produit vendu sous la marque déposée de Hyflo-Super-Cel remplaça le gel de silice. La pénicilline fut absorbée comme auparavant.
Cette fois, toute la partie traitée de la colonne fut divisée en deux parties égales. On retira 35 mg de sel de baryum de la partie supérieure, ayant une activité standard à une dilution de 1 : 36. 106, ce qui représente une récupération de 75% et indique que la concentration a été doublée.
5. 5 % de carbonate de baryum fut déposé sur du gel de silice d'ans des conditions sem- blables, à celles réa. lisées dans les exemples précédents, si ce n'est que l'on utilisa la quantité théorique de carbonate de potassium pour effeebuer la précipitation. On retrouvera 65% de la matière active et la concentration fut doublée. Dans un deuxième essai, on uti lisa 75 mg de sel de baryum de la pénicilline actif à 1 : 26. 106, la récupération fut de 80% et'la substance récupérée était active à 1 : 50. 106 (concentration double).
Dans un troisième essai 5 % de carbonate de calcium fut déposé dans les mêmes'conditions avec la quantité de carbonate de potassium calculée de manière que le pH de la suspension finale fut de 7, 4. Le dépôt fut séché et rehydraté avec 30% de son poids, d'eau ainsi que cela fut décrit dans les exemples précédents. En utilisant 75 mg de sel de baryum de la pénicilline actif à 1 : 26. 10', la récupération fut à nouveau de 90% et la concentration dou- blée.
Une expérience exactement semblable fut faite au cours de laquelle on se servit d'un dépôt de 5 % de carbonate de magnésium (précipité en utilisant la quantité requise de carbonate : de patassium et de. sulfate de magnésium) sur du gel de siflice. La récupération fut de 60 % et la concentration doublée.
6. Du gel de silice, tamisé et lavé comme cela a été précédemment décrit (100 g), fut mis en suspension dans de l'eau (500 cm3) et une solution de chlorure de strontium (hexahydrate, 4, 55 g) dans de 1'eau (50 cm3) fut ajoutée. Du carbonate de strontium fut alors précipité sur le gel de silice en ajoutant du carbonate de potassium (2, 5 g) dans 1'eau (50 cm). (Ces quantités sont calculées de manière qu'il se forme un dépôt de 2, 5 % de carbonate de strontium sur le gel de silice).
Le produit fut filtré, lavé à l'eau (1000 cm3) : la suspension avait alors un pg de 7, 4 ; elle fut alors séchée à 115 pendant 3 heures.
Avant l'emploi, elle fut rehydratée avec 30 % de son poids d'eau et enfermée dans un tube comme dans les exemples précédents. En utilisant 75 mg de sel de baryum de pénicilline ayant une activité standard à une dilution de 1 : 20-25. 106, une zone très étroite de [a colonne donna 16 mg (après transformation en sel de baryum) d'une substance active à une dilution de 1 : 100. 106. Les zones situées en dessus ou en dessous de celle-ci étaient pratiquement imactives. Cela repré- sente une récupération de 10 et une concentration quintuplée.
7. On employa un tube semblable a celui utilisé dans l'exemple 6. La solution de péni cilline de baryum (75 mg. active a une dilu- tion de 1 : 20-25. 106) dans de l'eau (50 cm3) fut portée à un pif 3 et le principe actif extrait avec de l'acétate d'amyle (20 cm3, swi- vis de 5 cm3, dans un second traitement)@ La solution d'acétate d'amyle fut filtrée dans le tube qui fut ensuite lavé avec une nouvelle quantité du même solvant (50 cm3). Trois zones étroites furent examinées (couches de 2 em d'épaisseur environ) à partir de l'extrÚmité supérieure du dépôt de gel de silice.
Ces trois zones contenaient la substance bactéri- cide dans le rapport l. : 40 : 1. Le produit récupéré de la zone intermédiaire fournit une substance qui avait l'activité de l'échantillon original et était active a une dilution de 1 : 50-60. 10*\ ce qui signifie que la concentration fut plus que doublée.
8. On prépara un tube ayant les dimensions de celui utilisé dans l'exemple 6 et contenant le même dépôt. Un filtrat du métabo- lisme brut d'une culture de penicillium notatum (1 ( > 0 cm3) fut extrait avec de l'Úther (. cm3) Ó un PH 3 et la solution fut filtrée dans le tube comme dans les exemples cidessus décrits.
La substance solide originale provenant du filtrat du métabolisme qui con- tenait beaucoup de sel nutritif était active a une dilution approximative de 1 : 2. 105@
Trois zones colorées de la partie la plus élevée du dépôt du gel de silice furent lavées avec de 1'eau et examinées séparément pour leur propriété bactériostatiqne. De ces zones, on a obtenu 10, 10 et 12 mg de substance, active Åa des solutions de1:10.10". 1 : 6, 5. 10' et @ : 5. 10"respectivement.
9. 10 g de gel de silice neutre en suspen- zioii dans 100 cm"d'eau furent traités avec 2 cm3 de solution Ó 10% de carbonate de sodium el la suspension fut filtrée, séchée et réhydratée avec peu de vapeur d'eau. Cette matière fut bourrée dans une colonne de mêmes dimensions que celles employées aupa- ravant et de la pénicilline en éthcr (60 cm" de 75 mg de sel de baryum dans de l'eau) fut filtrée. On put récupérer d'une zone de la colonne 35 mg de sel de sodium. La substance active récupérée était 70% et la concentration fut doublée.
1 (). ITne colonne chromatographique de 20 em X (), 9 cm do diamètre fut bourrée avec du gel de silice qui avait été tamisé pour passer entre 100-120 B. S. S. et fut laissée absorber 30% de son poids d'une solution à 2. 5% de bisulfate de sodium (anhydre) dans de l'eau@ 10 cm3 d'une solution de quinine dans l'éther contenant environ 10 mg de l'alcaloïde furent filtrés à travers la colonne, qui fut alors lavée avec un excédent d'éther.
Tout l'alcaloïde resté dans la colonne formait une bande d'environ 2 cm en profondeur à la tête de la colonne. Sa présence se manifestait par une fluorescence dans la lumière ultraviolet, te. En filtrant à travers la colonne, une solution d'environ 10 mg de quinidine dans 10 cm3 d'Úther, ce dernier alcaloïde déplaçait ] a bande de quinine, la, zone fluorescente fut déplacée à une position inférieure dans la colonne et devenait alors de nouveau prati quement stationnaire même avec un lavage continu avec de l'éther.
Si les alcaloïdes étaient appliqués à une autre colonne sem lMhle dans un ordre renversé, les alcaloïdes gardaient les mêmes positions relatives par rapport à la quinidine non fluorescente au- dessus de la quinine fluorescente.
On a traité dans une troisième colonne semblable un mÚlange de 10 mg de chacun des alcaloïdes dans une solution éthérique ; la zone fluorescente était marquée distinctement a une courte distance au bas de la colonne.
L'alcaloïde récupéré du composé retenu dans la zone supérieure non fluorescente fut subs tantiellement de la pure quinidine, tandis qu'en lavant la zone fluorescente avec de l'eau et en bouillant et clarifiant l'alcaloïde lavé, on obtenait un hydrate de quinine facilement fusible.
ITne séparation exactement semblable de cinchonine et, de einchonidine fut aussi produite. où la cinchonine fluorescente occupait la position inférieure de la colonne.
11. Une solution d'acide acétique (0, 3 g) et d'acide pyruvique (0, 45 g) dans de l'éther (75 em) fut filtrée à travers un dépôt de 2, 5 % de carbonate de baryum sur du gel de silice préparé comme dans'les exemples pré- cédents. La colonne avait une longueur de 25 em et un diamètre de 1, 95 cm. Après avoir lavé la colonne avec une addition de 75 cm3 d'éther, elle fut divisée en 12 parties, chacune de 2 em en profondeur et la première partie fut supprimée.
Les sections 2 à 6 contenaient seulement du pyruvate de baryum (l'acide en fût libéré et caractérisé par son dinitrophenyl hydrazone), mais aucune quantité reconnais sable mieroehimiquement d'acide acétique, tandis que les sections'8 à 12 contenaient seulement de l'acide acétique et aucune trace d'acide cétonique.