<B>Verfahren zur Erzeugung von insbesondere für</B> Futterzwecke <B>geeigneten Pilzen.</B> Die Verarbeitung von Holzzuckerwürzen auf Alkohol und andere Gärungserzeugnisse wird heute bereits in grossem Massstabe durch geführt. Die bei solcher Alkoholgewinnung entstehenden Sehlempen waren bisher lästige Abfallprodukte.
Es ist bekannt, Hefe aus Holzzuckerwür- zen herzustellen. Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren, nach welchem die Schlempen von auf Alkohol verarbeitenden Holzzuckerwürzen unter Gewinnung wertvol ler Produkte eine nützliche Verwendung fin den. Gegenstand des vorliegenden Patentes bildet. ein Verfahren zur Erzeugung von ins besondere für Futterzweeke geeigneten Pil zen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Pentosen assimilierende Hefearten in Schlempe aus vergorener Holzzuckerwürze gezüchtet werden.
Zweckmässig arbeitet man dabei mit kon tinuierlichem Zulauf der Holzzuckerschlempe und kontinuierlichem Abzug von Mikroorga- nismensuspensionen, wobei ein Teil der abge zogenen Mikroorganismen nach teilweiser Ab trennung von der Flüssigkeit wieder in das Zuchtgefäss zurückgeführt wird.
Es ist dabei vorteilhaft., bei einer Konzen tration von bis 400 g Mikroorganismen mit 75-80% Wassergehalt im Liter Nährflüssig- keit zu arbeiten.
In der 1-Iolzzuekerwürze sind beträchtliche Mengen Pentosen, insbesondere Xylose, ent halten. Bei Verarbeitung von Holzzuckerwür- zen, die vom Aufschluss von Laubhölzern stam men, ist besonders viel Xylose vorhanden, die nicht auf Alkohol vergoren werden kann, sich aber nun durch das vorliegende Verfahren zum grössten Teil verwerten lässt.. Zur Ver arbeitung pentosehaltiger Schlempen, die im allgemeinen keine oder nur geringe Mengen von Hexosen enthalten, eignen sich nicht alle Arten von Mikroorganismen.
Gute Erfolge wurden erzielt mit Torula- und Moniliaarten, besonders mit letzteren. Die Torula- oder Mo niliaarten können entweder in Reinzucht oder in Mischung verwendet werden. Es ist vorteil haft, wenn die zur Verwendung kommenden Mikroorganismenstämme seit vielen Genera tionen in IIolzzuckerschlempe oder in andern pentosereichen Nährflüssigkeiten gezüchtet wurden.
Zur Anregung des Wachstums der Mikroorganismenzellen kann der zur Verar beitung kommenden Schlempe mit Vorteil etwas Hexose zugesetzt. werden, jedoch ist es nicht unbedingt. erforderlich. Die Gegenwart geringer Mengen von Hexosen wird zweck mässig dadurch erreicht, dass die vorangehende alkoholische Gärung nicht ganz zu Ende ge führt wird. Da die Holzzuckerschlempen im allgemeinen nicht ausreichende Mengen Stick stoff, Phosphorsäure, Kali und Magnesium enthalten, wird man in der Regel die entspre chenden Mengen dieser Nährsalze vor der Züehtung den Mikroorganismen zusetzen.
Vor teilhafterweise erfolgt der Zusatz dieser Stoffe bzw. eines Teils derselben schon zu der Holz- zuckerwürze, also vor der alkoholischen Gä- rung, so -dass .diese Stoffe die alkoholische Gärung passieren und dann bei der Züchtung der Mikroorganismen bereits in der Schlempe vorhanden sind.
In diesem Falle verwendet man zweckmässig als Nährstoffe feingemahle nes Rohphosphat und Rohsteinsalze, wie Kainut und Silvin. Als Stickstoffträger können Am- moniakwasser oder Ammoniumverbindungen verwendet werden, welche zweckmässig erst vor oder während der Hefezüchtung zugege ben werden.
Die Züchtung der Mikroorganis men erfolgt zweckmässig zwischen 25 und 400 C und bis zu einem Endgehalt von 400 g vor- zugsweise etwa 200 g lebender 'Likroorganis- men (Wassergehalt 75-80%) im Liter und bei einem p$ von 4-6,5, vorzugsweise zwi schen pA 5 und 5,5.
<I>Beispiel:</I> Holzzuckerwürze mit 4% reduzierendem Zucker wird mit Nährsalzen (Salze der Phos phorsäure, des Kaliums und Magnesiums) ver setzt, und zwar pro m3 Würze mit 0,20 bis 0,25 kg P205; 0,10 kg K; 0,02 kg Mg, also eine Menge, die für die Bildung von 4 kg Hefe trockensubstanz ausreicht; hierauf wird neu tralisiert, abgekühlt und bekannterweise auf Alkohol vergoren. Die entstandenen 181 Alko hol pro m@ Würze werden abgetrieben.
Die resultierende Schlempe enthält 8 kg reduzie renden Zucker im m3. Nun wird die Schlempe auf 300 abgekühlt und mit Ammoniakstick- stoff versetzt, wobei sie auf einen Gehalt von 0,32 kg N pro m@ gebracht wird.
Hierauf wird die Nährflüssigkeit (Schlempe mit Nährsalzen und Ammoniakstickstoff) im Belüftungsver fahren mit kontinuierlichem Zu- und Ablauf zur Züchtung einer Pentosen assimilierenden Hefeart, im vorliegenden Falle Candida tro- picalis, verwendet.
Dabei wird die Hefe aus der abfliessenden Suspension getrennt und so weit zurückgeführt, dass eine Konzentration von 200 g Hefe mit 750/0 11,0 im Gärapparat aufrechterhalten wird. Es entstehen 4 kg Hefe pro m@ Schlempe (Trockensubstanz) mit 2 kg Eiweiss.
Wie oben angeführt, erfolgt die Vergärung der Holzzuckerschlempe vorzugsweise mit To- rula- oder Moniliaarten. Innerhalb der Gat tung Monika, welche eine grössere Gruppe von hefeartigen Pilzen umfasst, sind die Candida- arten für die Erzeugung von insbesondere für Futterzwecke geeigneten hefeartigen Pilzen unter Verwendung von Holzzuckerschlempe als Nährflüssigkeit besonders geeignet.
Dies gilt vor allem für .die Candidaarten: Candida arborea, Candida tropicalis, Candida pellicu- losa, Candida polcherrima und Candida Guil- liermondi,
von welchen wiederum Candida ar- borea und Candida tropicalis sich als ganz besonders geeignet erwiesen und zu den besten Ergebnissen geführt haben und Candida ar- borea sich als die vorteilhafteste Candidaart ergeben hat.
Die Candidgarten, vor allem Candida arbo- rea und Candida tropicalis, sind vor allem auch hinsichtlich der Lebenskräftigkeit und der Möglichkeit einer Dauerzüchtung beson ders geeignet.
Wie weiterhin gefunden wurde, können mit Vorteil auch Mischungen von mehreren verschiedenen Candidaarten oder Mischungen solcher mit andern Mikroorganismen, vorzugs weise Torulopsisarten, verwendet werden.
So wurden sehr gute Ergebnisse zum Beispiel mit Mischungen von 80% Candida tropicalis und 20% Torula iitilis,
mit Mischungen von 90% Candida tropicalis und 10% Candida pulcher- rima und mit Mischungen von 75(1/o Candida tropicalis, 10% Candida Guilliermondi,
5% Candida pulcherrima und 101/o Torula utilis erzielt.
Ferner wurde durch Versuche festgestellt, dass unter vergleichbaren Bedingungen in pentosehaltigen Lösungen zum Beispiel Can- dida tropicalis gegenüber Torula utilis die 1,7fache Vermehrungsgeschwindigkeit besitzt.
Von den besonderen Vorteilen, welche sich bei Verwendung der vorgenannten Candida- arten gezeigt haben, seien noch die folgenden hervorgehoben: 1. Sie besitzen ausgesprochen dicke Zell- wände und können daher nur sehr schwer me chanisch geschädigt oder von Bakterien an gegriffen werden. 2. Sie zeigen eine grosse 'Widerstandsfähig keit gegen physikalische Änderungen, wie Änderungen des pH oder der Temperatur oder der Zusammensetzung der Nährmedien.
3. Sie besitzen eine grosse Vermehrungs geschwindigkeit gegenüber andern Wuchs hefen.
4. Die bei ihrer Vei-#vendung erzeugte Trok- kenhefe besitzt nur einen geringen Eigen geruch.
Die für die Zwecke der Erfindung mit be sonderem Vorteil zu verwendenden Arten sind Candida arborea, Candida tropicalis, Candida pelliculosa, Candida pulcherrina und Candida Guilliermondi. Sie sind nach dem Ergebnis des Zuekerauxanogrammes zwar nicht in der Lage, Xylose zu assimilieren, dennoch ergibt ihre Anwesenheit in Hefegemischen eine verbes serte Wirkung,
was wahrscheinlich symbion- tischen Vorgängen zuzuschreiben ist. Sie sind durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet: Candida arborea Makroskopischc Eigenschaften.: <I>a) Auf</I> Würze-Agar: Kolonien weisslich bis gelblichgrau, im Alter etwas nachdunkelnd griessig, rund, oft radial, etwas gefältelt, mässig konvex, in der Mitte stumpfkegelig. Rand zunächst glatt, später gekerbt.
Junge Kolonien ohne Psni. (= Pseudomy cel) nach Monaten manchmal schwacher Psm-Hof, kein Psm. im Agar.
<I>b) In</I> Nährlösungen <I>und</I> Würze bildet sich starker Bodensatz, jedoch weder Ring noch Decke.
<I>Mikroskopische</I> Eige)i.schaf ten <I>auf festen</I> <I>oder in</I> flüssigen. NährböderL: Schon nach ein oder zwei Tagen herrscht Bildung von Sprossverbänden vor, Ketten von ovalen, gleichartigen Zellen, die sich stark verzweigen, und zwar oft nur nach einer Seite, wodurch besenartige Verbände entstehen, die sehr charakteristisch sind. Ältere Verbände sind dicht und fest und infolge zentrifugaler Entfaltung unübersichtlich, wenige Einzelzel len. Die Zellen sind ziemlich gleichmässig gross, nach einem Tag in Würze bei 280 4,4 X<I>7,6</I> ,LL, wenige rundliche 4,4-6,2 X 4,9-7,4p.
Gärung: + : Glukose, Saccharose, Raffinose; -: Galaktose, Maltose, Laktose.
AssinLilation <I>der Zucker (nach der</I> auxano- graphischen. Methode <I>von</I> Lodder): + : Glukose, Saccharose, Maltose, Raffinose, Xylose; -: Galaktose, Laktose.
Assimilation <I>der</I> Stickstoffverbindungen, (gleiche <I>Methode):</I> @- : Ammonsulfat, Pepton, KN03, Glykokoll, Harnstoff, Asparagin; -: Tryptophan, Histidin.
Die physiologischen Eigenschaften gleichen einerseits Torulopsis (= Torula) utilis, ander seits Candida G-uilliermondi. Die morphologi schen Eigenschaften jeder jungen Kultur un terscheiden Candida arborea unverkennbar von beiden. Selbstverständlich kommen auch Stämme von Candida arborea vor, die im einen oder andern Merkmal von den gegebenen Beschrei bungen abweichen. Die biologische Beurteilung muss stets nach dem Gesamtbild erfolgen.
Candida tropica.lis Hakroskopigche <I>Eigenschaf</I> terL: a) Auf Würze-Aga.r: Kolonien fast weiss, infolge der Vielfalt der Zellformen sehr ver schieden aussehend. Im allgemeinen sind junge Kulturen glatt, matt oder etwas glän zend, rundlich Lund konvex. Nach 2-3 Wo chen wird die Mitte meist, unregelmässig und faltet sich.
Eine ringförmige glatte Zone um schliesst die Mitte, und um diese herum wächst Pseudomycel in den Agar. Manche (soge- nannte membranöse ) Stämme falten sich von vornherein, andere (sogenannte kre- möse ) Stämme bleiben lange Zeit glatt und glänzend. <I>b) In Nährlösungen und Würze</I> bildet sich Bodensatz, jedoch weder Ring noch Decke.
(Ausnahme: stark membranöse Stämme kön nen Decke bilden.) 11likroskopische <I>Eigenschaften auf f</I> esten und <I>in flüssigen</I> Nährböden: In den ersten Tagen finden sich meist Einzelzellen, dann auch kleinere Zellenver bände, in denen die Zellgrösse allmählich mehr und mehr divergiert.
Später tritt Pseudo- mycel hinzu mit sehr verschiedenen Grössen, oft recht langen Zellen und schliesslich noch grosse runde Chlamdosporen und Pseiidokoni- dien, so dass das Mikrobild sehr mieinheitlich ist: Nach 1 Tag in Würze bei 280 C in Winge- Ranvierschen Kammern sind die Zellen oval, gegen den luftnahen Rand der Kultur da gegen länglich. Sie messen 5,2 X<B>8,1,t</B> bzw. 3,3 X 8,2 Ic.
Gärung: + : Galaktose, Glukose, Saccharose, Maltose; --:Laktose, Raffinose. <I>Assimilation der</I> Zucker <I>(nach der</I> auxano- graphischen <I>Methode von</I> Lodder): + : Galaktose, Glukose, Saccharose, Maltose, Xylose; -:
Laktose, Raffinose.
gssiynilation <I>der</I> Stickstoffverbindungen, <I>(gleiche</I> Hethode): + :Ammensulfat, Tryptophan, Pepton, Glyko- koll, Asparagin; -: Kaliumnitrat, Harnstoff. Besondere Kennzeichen: Vielförmigkeit, Vergärung der Zucker (siehe oben), Niehtassimilierbarkeit von Ka- liumnitrat und Harnstoff unter den Bedin gungen der angegebenen Methode.
Selbstverständlich kommen auch Stämme von Candida tropicalis vor, die im einen oder dem andern Merkmal von den gegebenen Be schreibungen abweichen. Die schon erwähnte Vielförmigkeit der Zellen bedingt gerade bei dieser Art öfters Abweichungen. Die biolo gische Beurteilung muss stets nach dem Ge samtbild erfolgen. Candida pelliculosa: Iilakroskopische Eigenschaften: <I>a)</I> Auf Würze-Agar: Kolonie gelblich-weiss, matt oder schwach glänzend, ganz glatt, rund, flach, Rand glatt.
Selten wenig Pseudomycel. <I>b) In</I> Nährlösungen <I>und</I> Würze: Nach einigen Tagen weisse, dichte, staubige Decke, kein Ring, etwas Bodensatz.
Mikroskopische <I>Eigenschaften:</I> Meist einzelne Zellen, manchmal kleine lockere Verbände von Sprosszellen. Zellen we niger dickwandig als bei den andern Arten. Die Grösse der Zellen beträgt nach einem Tag in Würze bei 280 3,9 X 4,2 /c, sie sind also ziemlich klein, kurzoval bis rund. Sporenbil- dung selten, wie bei Candida tropicalis. <I>Gärung:</I> + : Galaktose, Glukose, Maltose, Saccharose (sämtlich stark) ;
-: Laktose, Raffinose. Zuckerauxanogranim <I>(Methode nach</I> Lod- der): + :Galaktose, Glukose, Maltose, Saccharose, Xylose; -: Laktose, Raffinose. Sticksto <I>f f</I> auxan ogramnz: + :
Deutlich positiv nur für Pepton, alle an dern sind meist negativ; zuweilen ganz schwach positiv sind: Ammensulfat, Ka- liumnitrat, Glykokoll und Asparagin. Stickstoffaiixanogramme sind meist um deutlich.
Candida pulclaerrinza: (Synonym mit Torulopsis pulcherrima, um benannt von Windisch in Candida pulcherrima wegen der starken Fähigkeit zur Psm-Bil- dimg. ) D7akroskopische <I>Eigenschaf</I> ten: <I>a) Auf</I> Wiirze-Agar: 1. Kremöse -Stämme:
Kolonien weiss, in manchen Fällen rosa bis rot, glänzend glatt, im Alter warzig werdend durch Sekundär kolonien, in der Mitte erhaben, ründlieh, Rand jedoch lappig gekerbt, sonst jedoch glatt, kein Psm.
2. Membranöse Stämme: Kolonien gelblich, stark gefältelt, runzlig-netzig bis aufgewölbt gefaltet, unregelmässig erhaben. Form und Rand unregelmässig, fast lauter wirres Psm. <I>b) In Nährlösung und Würze:</I> Bodensatz und Ring, nach Wochen einige dünne Haut inseln.
!'Mikroskopische Eigenschaf ten: Bei den kremösen Stämmen Zellen einzeln oder zu wenigen, oval, ziemlich gross, nach 1 Tag in Würze bei 280 Zellen 6,5 X 7,9,u länglich 3,8 X 8,1,u und 4,9 X 12,u. In älte ren Kulturen fallen grosse, runde Zellen von 8-20,u <I>0</I> mit je einem grossen runden Öl- tropfen Askusmutterzellen, die Askus mit vier Sporen bilden.
Nach Entlassung der vier Spo ren hängt die letzte Askushaut oft noch an der Mutterzelle wie bei Candida tropicalis. Bei den membranösen Stämmen üppiges, dik- kes und grosszelliges Psm. <I>Gärung:</I> + : Glukose; -:alle andern.
Zuckerauxanogramm <I>(nach</I> Lodder): + : Galaktose, Glukose, Saccharose, Maltose; --: Laktose, Raffinose/Xylose.
Sticksto <I>f f</I> auxanogramm <I>(gleiche Methode):</I> + : Ammonsulfat, Tryptophan, Pepton; -: Kaliumnitrat, Glykokoll, Histidin. Candida Guilliermondi: Makroskopische <I>Eigenschaften:</I> <I>a) Auf</I> Würze-Agar: 1. Kremöse Stämme: Kolonie weiss, glän zend, glatt, etwas erhaben, rund. Rand glatt, kein Pseudomycel.
2. Membranöse Stämme: Kolonie weiss, meist von vornherein Fältelung und Krater bildung, dadurch Aufwölbung in der Mitte, aussen Psm-Hof.
<I>b) In Nährlösung und Würze:</I> Auf der Oberfläche Inseln, die manchmal zu einer Decke verwachsen. Bodensatz. :Mikroskopische Eige)ischaften: Zellen vielförmig, alle Übergänge von fast runden Sprosszellen bis zu 60-80,u langen Zellen, die Bruchstücke von Psm darstellen. Zellen einzeln oder in engen Verbänden aller Grössen.
Daneben sprossend Blastosporen und dünnes Psm von unter 3,u0. Zellen in Würze nach einem Tag bei 280 C in der Mitte der Winge-Ranvier'schen Kammer durchschnitt lich 4,5 X 4,8 ,u, in Richtung auf den Rand Neigung zur Psm-Bildung, daher Zellen länger 3,9 X 7,2,u. Am Rand selbst wirr verzweigtes Psm, das fast in Mycel übergeht. Zellgrösse sehr schwankend, oft geringer, bei manchen Zellen nur 2-3 X 3-6 ,u. <I>Gärung:</I> + :
Galaktose (schwach), Glukose, Saccharose, Raffinose (schwach) ; -: Maltose, Laktose.
Zuckerauxanogramm <I>(Methode nach</I> Lod- der): + : Galaktose, Glukose, Saceharose, Raffinose; -: Maltose, Laktose/Xylose (Maltose manch mal schwach positiv). Stickstof fauxanograrnm: + : Ammonsulfat, Tryptophan, Pepton, Glyko- koll, Asparagin; -: Kaliumnitrat.
Histidin und Harnstoff sind unsicher.