Procédé de préparation d'un vaccin contre le choléra du porc
possédant une virulence réduite.
La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un vaccin contre le choléra du pore, de virulence réduite qui, injecté au porc, provoque une augmentation adéquate de la production d'anticorps sans exposer l'animal aux dangers inhérents aux vaccins contenant le virus de virulence normale du choléra du pore.
Bien que le choléra du pore ait été reconnu comme une maladie spéciale depuis plus d'un demi-siècle, aucun moyen n'a jusqu'ici été trouvé pour guérir l'animal infecté.
La maladie, qui est très répandue dans le monde entier, cause d'énormes pertes. La mortalité, dans les troupeaux composés de pores non immunisés, peut atteindre 85 à 95 /o. La maladie se transmet par les, déjections d'animaux infectés, par l'introduc- tion d'éléments récemment infectés dans le troupeau, par les déchets qui suivent l'em- ploi de sérum-virus pour la vaccination, et éventuellement par d'autres moyens encore.
Le choléra du porc est une maladie infec- tieuse aiguë, caractérisée par une fièvre intense, apparaissant après une période d'ineubation de 4 à 5 jours, une inflammation de la conjonctive et des glandes lymphatiques et de nombreuses lésions hémorragiques qui peuvent intéresser la plupart des parties du corps. On a signalé divers autres symptômes.
Ces symptômes sont fréquemment compliqués par des infections secondaires provenant par r exemple de Salmonella et. de Paasteurella .
Un vétérinaire compétent peut correctement diagnostiquer la maladie sans grande difficulte.
Le seul moyen efficace de lutter contre le choléra du pore est d'immuniser l'animal.
L'injection d'anticorps développe une immu- nité passive de quelques sernaines, qui n'a naturellement d'intérêt que pour maîtriser une épidémie locale. Pour obtenir une immunité durant toute la vie, il est nécessaire d'injecter le virus vivant dans le pore et de laisser celui-ci produire ses propres anticorps.
L'injection du virus infectieux provoquant le dé- veloppement du choléra chez le porc, il est nécessaire d'injecter en même temps une cer taine quantité de sérum de porc hyperimmu niEé. L'injection combinée de virus et de sérum permet à l'action antigène du virus de se manifester en assurant l'immunité du porc, en même temps que les anticorps du sérum permettent à l'animal de survivre à l'infee- tion.
La méthode virus-sérum d'immunisation du porc, bien qu'étant de pratique courante actuellement, présente un certain nombre de sérieux inconvénients. Si, en effet, la production du virus n'est pas difficile, celle du sérum en revanche est compliquée et ne permet d'obtenir, d'un pore, qu'un volume relativement faible de sérum.
Un autre inconvénient sérieux de cette méthode découle de l'emploi d'un virus infectieux virulent. Ce virus se propage dans l'animal et passe dans les excrétions, ce qui constitue une source d'infeetion pour les porcs non traités et donc non immunisés. On peut dire qu'en fait le traitement entretient la maladie. On ne peut avoir que peu d'espoir de se débarrasser de la maladie d'une manière complète tant que l'on utilisera ladite méthode.
Un autre inconvénient sérieux encore de la méthode virus-sérum réside dans le fait que, fréquemment, en raison des erreurs de fabri cation qui ne peuvent être évitées d'une ma- nière complète, le sérum peut ne pas conte nir suffisamment d'anticorps pour empêcher l'infection pathologique de l'animal par le virus. Il en résulte que les animaux vaccinés peuvent succomber à la maladie. C'est l'échec du sérum. De même le virus utilisé peut être atténué ou moins virulent que normalement, et il en résulte que l'immunité naturelle ne se produit pas. L'immunité passive obtenue par le sérum d'immunisation disparaît rapidement et l'animal est alors exposé à l'infeetion.
On a fait de nombreux essais pour éviter la nécessité d'employer une forme virulente du virus. La plupart de ces essais, qui avaient trait à la production d'un virus atténué par des moyens physiques ou chimiques et cepen- dant capables de provoquer l'immunité, n'ont pas donné les résultats escomptés. Ainsi, on a préparé certains vaccins contenant des agents modifiant tels que le violet cristallisé ou l'huile d'eucalyptus et l'on a. obtenu dans leur emploi des degrés variés de succès ; ces produits présentent toutefois de nombreux inconvénients qui leur sont propres.
On a également essayé, mais sans succès, de préparer une forme de virus du choléra du pore moins virulente, atténuée par propagation dans une autre espèce animale, de la même manière que le virus de la maladie du chien est atténué par propagation chez le furet. Une des principales difficultés se trouve dans le fait que, contrairement à de nombreux agents infectieux, le virus du eho- léra du pore est spécifique du porc et ne se propage pas dans les circonstances ordinaires dans la plupart des autres animaux. Les efforts pour propager le virus dans d'autres animaux très différents tels que la souris, le rat, le cobaye, le lapin, le chien, le chat, le cheval, le singe, le boeuf, la chèvre, le pigeon, le poulet et autres ont montré que ces animaux ne sont pas réceptifs à l'égard du virus du choléra du pore.
On a également trouvé que le virus ne se propage pas dans les oeufs couvés.
Bien que le virus du choléra du pore puisse être transmis à divers animaux par inoculation, ces animaux ne montrent pas de fièvre intense, non plus que de lésions ou autres symptômes de la maladie. On retrouve le virus dans le sang de certains de ces animaux, particulièrement des ruminants, plusieurs jours plus tard. Si l'on défibrine ce sang et qu'on l'injecte à des pores non immu- nisés, ils montrent les symptômes caractéris- tiques du choléra du porc. Dans aucun cas le caractère pathogène du virus n'apparaît modifié à l'égard du porc.
La faible teneur du sang en virus indique simplement une dilu- tion de la matière de départ.
Après de nombreux essais, la titulaire a finalement, réussi à mettre au point un procédé pour obtenu'un virus du choléra du pore de faible virulence, mais apte à provoquer la production des anticorps dans le pore.
Le procédé selon l'invention, pour la pré paration d'un vaccin contre le choléra du pore possédant une virulence réduite, est ea- ractérisé par le fait qu'on inocule le virus clnt eholéra dw porc à un lapin, on prépare an bout de un à six jours, à partir de ce lapin, un inoeulum du virus que l'on injecte à un pore non immunisé, on laisse le virus ainsi transféré se propager dans ce porc, on prépare un autre inoeulum à partir dudit pore et on injecte cette préparation de virus à.
un second lapin, on répète ces passages alternés du virus du lapin au pore jusqu'à ce que le virus soit modifié d'une manière telle qu'il se propage dans le lapin, on fait encore passer ce virus modifié dans au moino 20 lapins et on prépare le vaccin avec le virus modifié qui s'est propagé dans le dernier lapin.
Le présent procède est, par exemple, exécuté comme suit : Un lapin est traité par injection au moyen du virus du choléra du pore d'une virulence connue. Comme on l'a indiqué précédemment, le lapin ne fait pas de fièvre et ne montre aucun des symptômes de maladie, même après détection du virus dans le courant sanb iin quelques heures après l'inoculation. Au bout de 1 à 6 jours après l'inoculation, le lapin est sacrifié et la rate en est enlevée. La rate, après la préparation qu'on décrira dans la suite, contient assez de virus pour inoculer un pore et provoquer, par conséquent, chez l'animal le choléra typique du porc. On choisit de préférence la rate lors des premiers passages dans le lapin, parce qu'elle semble contenir une quantité appré- ciable de virus.
D'autres organes tels que la cervelle, le foie, ete., ou même le sang, peuvent également contenir assez de virus pour produire l'infection chez le pore non immu nisé.
Bien que le premier lapin ne manifeste aucun signe de maladie, le pore inoculé le fait.
Au bout de deux à cinq jours, le pore fiévreux est sacrifié et un fait une suspension de sa rate au moyen le laquelle on inocule un autre lapin. Ces inoculations du pore au lapin et du lapin au pore sont répétés jusqu'à ce que finalement le lapin commence à montrer des signes de fièvre. La préparation infeetante de rate du lapin peut alors être injectée par r voie intraveineuse dans d'autres lapins si on le désire, avec passage occasionnel par le porc jusqu'à ce que le virus soit adapté d'une manière telle que le sang d'un lapin injecté à un autre lapin provoque une fièvre intense et persistante.
Après au moins 20 passages dans les lapins, ie virus est suffisamment mo difié pour ne plus provoquer les effets pathologiques complets du choléra du pore par injection aux animaux susceptibles d'être infectés. En dépit de sa faible virulence, le virus est antigène et provoque une augmen- tation de la production d'anticorps qui immunisent le pore durant toute sa vie.
Le mécanisme exact par lequel le virus non virulent se forme dans le lapin n'est pas clair.
Une explication possible-qui n'engage pas toutefois la titulaire-peut être fondée sur l'hypothèse que, parmi les millions de formes de virus qui sont présentes dans une seule inoculation de virus virulent, du choléra dans le lapin, il en existe qui peuvent par ellesmêmes se propager dans le lapin. Comme la forme virulente ne se propage pas dans le lapin, elle est la première à disparaître. Sans doute, les quelques formes de virus qui peuvent apparemment survivre pendant une plus longue période dans le lapin et qui peuvent être susceptibles de mutation, périraient probablement dans le lapin-hôte avee le temps.
Quand la rate est enlevée et mise sous forme d'inoculum destiné au porc, elle contient une proportion de formes transformées plus élevée qu'il n'y en avait a. l'origine dans l'inoeulum utilisé sur le lapin. De retour dans le porc les deux souches de virus se propagent et augmentent en nombre de telle sorte que l'on peut encore les réunir et les utiliser pour inoculer un autre lapin. Comme on l'a vu, il est possible, par transfert répété du pore au lapin, puis du lapin au porc, etc., d'obtenir une proportion relativement élevée de forme transformée, cependant que la forme plus vi °lente diminue en proportion.
Ainsi donc, après un nombre suffisant de passages dans le lapin, la préparation contient à peine assez de forme virulente pour provoquer le choléra chez le pore. La forme transformée non pa- thogène se propage toutefois aisément, et, injectée dans le pore, elle provoque la production d'anticorps sans donner naissance à des symptômes pathogènes.
Les expériences relatées ei-dessous font apparaître certaines des raisons qui ont conduit la titulaire à opérer dans les conditions indiquées à la revendication et montrent éga- lement quelles sont, dans certains eas, les précautions à prendre pour obtenir les résultats voulus.
On met en suspension saline dans un broyeur Ten Broeck une rate infectée de pore provenant d'un animal sacrifié le sixième jour qui. suit l'inoculation au moyen de virus du choléra. On centrifuge la suspension pendant cinq minutes à 1000 t/min, et on inj ecte 3 cm. du liquide surnageant par voie intra- veineuse dans le lapin. Le lapin ne manifeste aucune élévation de température, mais on le sacrifie le troisième jour suivant l'inoculation et on injecte une suspension à 10"/o de la rate de cet animal dans le pore.
Ce dernier accuse une élévation de température allant. jusqu'à 40 5 à tL1 1 C les deuxième, troisième et quatrième jours qui suivent l'inoculation ; il est sacrifié le cinquième jour. Une suspension de sa rate est alors injectée au lapin. Le virus est transféré par passages alternés dans le pore et le lapin, jusqu'à ce qu'on soit parvenu à six passages alternés dans le lapin.
Sur sept lapins inoculés au moyen du virus obtenu après le sixième passage, trois montrent une légère élévation de température le deuxième jour de l'inoculation, et sont sacrifiés à ce moment. Une suspension de leur rate est alors injectés par voie intraveineuse dans un autre groupe de lapins. Ces animaux réagissent encore, font une fièvre légère et sont. sacrifiés à leur tour, et le virus est alors transféré à des lapins en deux passages. A ce moment, aucun des lapins ne manifeste d'élé- vation de température aux essais courants, et l'on ne trouve pas de virus dans leur rate par sous-inoculation du pore.
Il est évident que la disparition du virus par les passages dans le lapin signifie que ledit virus a simplement été transféré d'un lapin à l'autre sans prolifération, ou que la rate a été enlevée à un moment où il n'y a pas de virus sous une tonne infectieuse. Pour vérifier cette dernière possibilité, on a injecté à t-rois lapins une suspension de rate de lapin du troisième passage par le lapin et l'on a pris la température des animaux toutes les deux ou trois heures pendant cinq jours. Les trois lapins réagissent avec fièvre la deuxième nuit qui suit l'inoculation. Il est assez curieux que l'élévation de température ne dure que deux à trois heures, après quoi la température diminue.
Les animaux sont sacrifiés durant cette période de fièvre et on injecte une suspension de leur rate dan : s le porc ; on cons- tate alors qu'elle contient le virus du choléra du porc. En adoptant la technique ci-dessus de prise de température toutes les deux ou trois heures, jour et nuit, le virus a été transféré en de nombreuxpassagesdans le lapin au moyen de la rate.
Pour établir l'identité du virus, on inocule un pore avec un virus de sixième passage lapin ; le pore réagit avec fièvre dans une pé- riode de six jours, mais il survit. On le met en contact avec deux porcs malades ayant reçu une injection de virus virulent du choléra du pore. Les animaux inoculés sont maintenus dans un parc non nettoyé avec deux pores normaux de contrôle.
Les deux animaux inoculés au moyen de la souche de virus meurent ; les deux pores de contrôle présentent de la fièvre au bout de cinq et six jours, respeetivement, et meurent respectivement le douzième et le dix-neuvième jour. A l'autopsie, on observe les lésions caractéristiques du choléra du pore, alors que le pore inoculé au moyen du virus de. sixième passage lapin ne montre aucun symptôme pendant les trente jours de la. période d'observation. Par la suite, le pore soumis à l'action d'un virus d'une virulence connue résiste à l'infection, tandis que les pores témoins meurent. En revanche, des pores inoculés avec un virus de rate de huitième et de neuvième passage lapin deviennent malades ; autopsiés après leur mort, ils montrent les lésions caractéristiques du choiera du pore.
Il ressort de ces essais que le virus du choléraduporc s'est maintenu par les passages dans le lapin, mais n'a pas été suffisamment atténué par le nombre relativement faible de passages. Pour cette raison, il est. nécessaire, conformément à l'invention, de faire passer le virus modifié dans au moins 20 lapins.
Comme il est plus commode d'employer du sang infecté comme source d'inoculum que de préparer des suspensions de rate ou d'autres organes, on emploie le sang infecté aussi tôt que le virus est installé dans le lapin. On peut employer te sang dans l'inoeulation ini tiale si la concentration et la virulence du virus sont suffisamment élevées.
Il est naturellement, bien entendu que tous les lapins inoculés ne montrent pas de montée de la tempéra-ture au-dessus de la nor- male. Anssi le temps exigé pour le dévelop- pement de l'état fébrile peut varier considé- rablement, de huit heures à cinq ou six jours.
Pour obtenir les meilleurs résultats,] e sang (ou la rate ou autres organes) utilisé pour la préparation des inoeulums pour les passages doit être prélevé au cours de la période de fièvre, ou tout au moins peu de temps avant ou après. La durée de la fièvre varie aussi considérablement, de quelques heures a quel- que, jours.
Le transfert du virus au lapin est fait, de préférence, par voie intraveineuse, bien que d'autres méthodes ne soient pas exclues.
La préparation des inoeulums à partir des tissus ou du sang est relativement simple pour les hommes du métier. Les tissus, le fibrinogène et d'antres matières qui peuvent gêner l'inoculation ou provoquer des réactions indésirables doivent être éliminés. Le glaçage et le dégel de la préparation peuvent faciliter l'élimination des matières étrangères au virus.
La concentration du virus par les moyens connus peut également être effectuée, si cela est désirable.