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"Perfectionnements à l'immunisation des porcs contre le choléra ".
La présente invention se rapporte à 1'immunisation des porcs contre le @ choléra, et plus particulièrement à un procédé nouveau d'obtention de vaccin immunisant d'une virulence réduite qui, injecté au porc, provoque une aug- mentation adéquate de la production d'anticorps sans expo- ser l'animal aux dangers inhérents aux vaccins contenant le virus virulent normal du choléra du porc. L'invention concerne également le nouveau vaccin et son emploi*
Bien que le choléra du porc ait été reconnu comme une maladie spéciale depuis plus d'un demi-siècle, aucun moyen
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n'a jusqu'ici été trouvé pour guérir l'animal infecté. La maladie, qui est très répandue dans le monde entier, causes d'énormes pertes économiques.
Les troupeaux infectés compo- sés de porcs non-immunisés sont l'objet d'une mortalité atteignant de 85 à 95 %. La maladie se transmet par les issues d'animaux infectés, par l'introduction d'éléments récemment infectés dans le troupeau, par les "déchets" qui suivent l'emploi de sérum-virus pour la vaccination, et possiblement par d'autres moyens.
Le choléra du porc est une maladie infectieuse aiguë caractérisée par une fièvre intense apparaissant après une période d'incubation de 4 à 5 jours, une inflammation de la conjonctive et des glandes lymphatiques et de nombreuses lésions hémorragiques qui peuvent intéresser la plupart des parties du corps. On a signalé divers autres symptomes. Ces symptomes sont fréqu'emment compliqués par des infections secondaires provenant par exemple de Salmonella et de Pasteurella . Un vétérinaire compétent peut correctement diagnostiquer la maladie sans grande difficulté.
La seule manière pratique de se rendre maître du choléra du porc est d'immuniser l'animal. L'injection d'anticorps développe une immunité passive de quelques semaines, mais cette pratique n'est naturellement utile que pour maîtriser une épidémie locale . Pour obtenir une immunité durant toute la vie, on a considéré comme nécessaire d'indecter le virus vivant cause de la maladie dans le porc et de le lais- ser produire ses propres anti-corps.
L'injection du virus infectieux provoquant le développement du choléra chez le porc, il est nécessaire d'injecter en même temps une certaine quantité de sérum de porc hyperimmunisé .Ce système combiné de virus et de sérum permet à l'action antigène du virus de provoquer l'immunité chez le porc en même temps que les anticorps du sérum hyper-immunisé permettant à .
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l'animal de survivre à l'infection.
Le procédé virus-sérum d'immunisation du porc présente un certain nombre de sérieux inconvénients mais il est cepen- dant la méthode actuelle de choix. Si la production du virus destiné à ces procédés n'est pas difficile, celle du sérum l'est. Des réglementations strictes de l'United States Department of Agriculture sont fixées à la production des sérums immunisante.Pour préparer les sérunshyper-immuni- sants il est nécessaire d'abord d'immuniser les porcs par une injection combinée sérum-virus. Les porcs reçoivent des injections intraveineuses massives de virus, au moins neuf jours avant l'immunisation. Dix jours après l'hypermmmu- nisation l'animal peut(être saigné en vue de l'obtention de sérum hyperimmunisant. On ne peut faire ensuite que trois prélèvements supplémentaires de sang.
L'animal est ensuite considéré comme inutilisable . La difficulté du procédé et le volume limité de sérum obtenu de chaque porc montrent les inconvénients inhérents au procédé.
Un autre inconvénient sérieux de la présente méthode au sérum et au virus est lié au fait que le virus infec- tieux virulent est administré au porci. Ce virus se propage dans l'animal et passe dans les excrétions, ce qui consti- tue une source d'infection pour les porcs non-traités et donc non-immunisés. On peut dire qu'en fait le traitement entretient la maladie . On ne peut avoir que peu d'espoir de se débarrasser de la maladie d'une manière complète tant que l'on utilisera le procédé du sérum et du virus.
Un autre inconvénient sérieux de la présente mé- thode au virus-sérum a été mentionné ci-dessus. Fréquem ment, en raison des erreurs de fabrication qui ne peuvent être évitées d'une manière complète, le sérum peut ne pas contenir suffisamment d'anticorps pour empêcher l'infection
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pathologique de l'animal par le virus employé dans la vacci- nation . Il en résulte, que les animaux vaccinés peuvent succomber à la maladie . Ctest l'échec du sérum . De même le virus utilisé peut être atténué ou moins virulent que nécessaire, et il en résulte que l'immunité naturelle ne se produit pas. L'immunité passive obtenue par le sérum d'immunisation disparaît aussitôt qt l'animal est alors exposé à l'infection.
On a fait de nombreux essais pour éviter la nécessi- té d'employer une forme virulente du virus . La plupart de ces essais avaient trait à la production d'un virus atténué ou d'une forme du virus physiquement ou chimique- ment modifiée qui soit antigène sans être suffisamment virulente pour produire les effets complets de la maladie chez le porc. Pratiquement aucune de ces préparations modifiées par des moyens physiques ou chimiques n'a été capable de provoquer l'immunité . On a préparé certains vaccins contenant des agents modifiante tels que le violet cristallisé ou l'huile d'eucalyptus et l'on a obtenu dans leur emploi des degrés variés de succès. Ces produits pré- sentent toutefois de nombreux inconvénients qui leur sont propres.
On a également essayé sans succès de préparer une forme de virus du choléra du porc moins virulente, atténuée par propagation dans une autre espèce animale, de la même manière que le virus de la "maladie" du chien est atténué par propagation chez le furêt. Une des principales diffi- cultés se trouve dans le fait que, contrairement à de nombreux agents infectieux, le virus du choléra du porc est spécifique du porc et ne se propage pas dans les cir- constances ordinaires dans la plupart des autres animaux.
Les efforts pour propager le virus dans d'autres animaux
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très différents tels que la souris, le rat, le cobaye, à le lapin, le chien, le chat, le cheval, le singe, le boeuf, la chèvre, le pigeon, le poulet et autres ont montré que ces animaux ne sont pas réceptifs à l'égard du virus du choléra du.porc. On a également trouvé que le virus ne se @ propage pas dans les oeufs couvés. choléra
Bien que le virus du choléra été transmis à divers animaux par inoculation, ces animaux ne montrent pas de fiè- vre intense, non plus que de lésions ou autres symptomes de la maladie . On retrouve le virus dans le sang de cer- tains de ces animaux, particulièrement des ruminants, plu- sieurs jours plus tard.
Si l'on défibrine ce sang et qu'on l'injecte à des porcs non-immunisés, ils montrent les symtomes caractéristiques du choléra du porc. Dans aucun cas le ca- ractère pathogène du virus n'apparaît modifié à l'égard du porc. La faible teneur du sang en virus indique sim- plement une dilution de la matière de départ.
Dans une série d'expériences on a injecté des brebis au moyen du virus de la fièvre du porc. Sept jours plus tard on a injecté à une seconde brebis 2 cc. du sang pro- venant d'une brebis et l'on a poursuivi cette opération pendant une série de dix transmissions. Les porcs inoculés au moyen du sang provenant de la brebis sont tous morts après avoir manifesté les symptomes caractéristiques de la fièvre du porc. Aucune des brebis n'a montré des symptomes de la maladie, et le virus n'a paru nullement atténué dans quelque mesure que ce soit. La production des anticorps dans le sérum de la brebis n'a pu être démontrée .
En dépit de l'échec de nombreux chercheurs pour ce qui est d'installer le choléra du porc dans les divers animaux d'expérience et d'obtenir un virus atténué de faible viru- lence, mais possédant la faculté de produire des anticorps
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dans le porc, la demanderesse a finalement réussi à obtenir ce résultat par la technique décrite ci-après.
Il est possible au moyen du présent procédé d'inoculer à des animaux autres que le porc le microorganisme virulent du choléra du porc et, après un assez grand nombre de passages dans l'animal, d'obtenir un virus dont les propriétés sont tellement modifiées que, par injection dans le porc, il provoque une augmentation de la production des anticorps qui immunisent efficacement l'animal contre le choléra du porc mais ne provoque pas les symptomes pathologiques fatals qui sont associés au choléra normal du porc. L'injection du virus modifié aux porcs susceptibles à la maladie en- traîne par conséquent leur immunisation. On évite ainsi les préparations de virus virulent et de sérum hyper-immunisant.
Pour installer le virus dans les animaux d'expérience, il est nécessaire de suivre certaines précautions. Conformé- ment au procédé de la demanderesse un animal approprié,le lapin par exemple, est traité par injection au moyen du virus du choléra du porc d'une virulence connue . Cçmme on l'a indiqué précédemment le lapin ne fait pas de fièvre et ne montre aucun des symptomes de maladie, même après détec- tion du virus dans le courant sanguin quelques heures après l'inoculation. Au bout de 1 à 6 jours après l'inoculation, le lapin est sacrifié et la rate en est enlevée. La rate, après la préparation qu'on décrira dans la suite, contient assez de virus pour inoculer un porc et provoquer par con- séquent chez l'animal le choléra typique du porc.
On choi- sit de préférence la rate après les premiers passages dans le lapin parce qu'elle serible contenir une certaine quanti- té de virus . D'autres organes tels que la cervelle, le foie, etc., ou même le sang, peuvent également contenir assez de virus pour produire l'infection chez le porc non- immunisé.
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Bien que le premier lapin ne manifeste aucun signe de maladie, le porc inoculé le fait. Au bout de deux à cinq jours le)porc fièvreux est sacrifié et on fait une suspen- sion de sa rate au moyen de laquelle on inocule un autre ,.lapin . Ce procédé d'inoculation du porc au lapin et du lapin au porc est sépété jusqu'à ce que finalement le la- pin commence à montrer des signes de fièvre . La prépara- tion infectante de rate du lapin peut alors être injec- tée par voie intraveineuse dans d'autres lapins avec pas- sage occasionnel par le porc jusqu'à ce que le virus soit adapté d'une manière telle que le sang d'un lapin injecté à un autre lapin provoque une fièvre intense et persis- tante.
Après de nomreux passages dans le lapin, au moins cinq et de préférence 20 ou davantage, le virus est suffisamment modifié pour ne plus provoquer les effets pathologiques complets du choléra du porc par injection auxùanimaux susceptibles d'être infectés. En dépit de sa faible virulence le virus est antigène et provoque une augmentation de la production d'anticorps qui immunisent le porc durant toute sa vie .
Le mécanisme exact par lequel le virus non-virulent se produit dans le lapin n'est pas clair. Une explication possible - qui n'engage pas toutefois la demanderesse - peut être fondée sur l'hypothèse que parmi les millions de formes de virus qui sont présentes dans une seule inocu- lation de virus virulent du choléra dans le lapin, il en existe qui peuvent en elles-mêmes se propager dans le la- pin. Comme la forme virulente ne se propage pas dans le lapin, elle est la première à disparaître .. Sans doute les quelques formes de virus qui peuvent apparemment sur- vivre pendant une plus longue période dans le lapin, et qui peuvent être susceptibles de mutation, périraient probable-
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ment dans le lapin-hôte avec le temps.
Quand la rate est enlevée et mise sous forme d'inoculum destiné au porc, elle contient une proportion de formes transformées plus élevées qu'il n'y en avait à l'origine dans l'inoculum uti- lisé sur le lapin. De retour dans le porc les deux souches de virus se propagent et augmentent en nombre de telle sorte que lon peut encore les réunir et les utiliser pour inoculer un autre lapin . Comme on l'a vu il est possible, par transfert répété du porc au lapin, puis du lapin au porc, etc., d'obtenir une proportion relativement élevée de forme transformée, cependant que la forme plus virulente diminue en proportion. Ainsi donc, après un nombre suffi- sant de passages dans le lapin, la préparation contient à peine assez de forme virulente pour provoquer le choléra chez le porc.
La forme transformée non-pathogène se propage toutefois aisément et, injectée dans le porc, elle provo- que la production d'anticorps sans donner naissance à des symptomes pathogènes..
Pour illustrer le nouveau procédé, on met en suspension saline dans un broyeur de "Ten Broeck" une rate infectée de porc provenant d'un animal sacrifié le sixième jour qui suit l'inoculation au moyen de virus du choléra . On centrifuge la suspension pendant cinq minutes à 1000 t/min. et on injecte 3 cc. du liquide surnageant par voie intra- veineuse dans le lapin. Le lapin ne manifeste aucune élé- vation de température, mais on le sacrifie le troisième jour suivant l'inoculation et on injecte une suspension à ., 10 % de la rate de cet animal dans le porc. Ce dernier accuse une élévation de température allant jusqu'à 40 5- 41 1C les deuxième, troisième et quatrième jours qui sui- vent l'inoculation; il est sacrifié le cinquième jour. Une suspension de sa rate est alors injectée au lapin.
Le virus
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est transféré par ce procédé alterné'entre le porc et un ou deux lapins, jusqu'à ce qu'on soit parvenu à six passages alternés dans le lapin . Sur sept lapins inoculés au moyen du virus obtenu après le sixième passage, trois montrent une légère élévation de température le deuxième jour de l'inoculation , et sont sacrifiés à ce moment. Une suspen- sion de leur rate est alors injectée par voie intraveineu- se dans un autre groupe de lapins. Ces animaux réagissent encore, font une fièvre légère, et sont sacrifiés à leur tour, et le virus est alors transféré à des lapins en deux passages. A ce moment aucun des lapins ne manifeste d'éléva- tion de température aux essais courants, et l'on ne trouve pas de virus dans leur rate par sous-inoculation du porc.
Il est donc évident de la disparition du virus par les passages dans le lapin que ledit vmrus a simplement été transféré d'un lapin à l'autre sans prolifération, ou que la rate a été enlevée à un moment où il n'y a pas de virus sous une forme infectieuse. Pour vérifier cette der- nière possibilité on a injecté à trois lapins une suspen- sion de rate de lapin du troisième passage par le lapin et l'on a pris la température des animaux toutes les deux ou trois heures pendant cinq jours. Les trois lapins réagissent avec fièvre la deuxième nuit qui suit l'inoculation. Il est assez curieux que l'élévation de température ne dure que deux à trois heures, après quoi la température diminue.
Les animaux sont sacrifiés durant cette période de fièvre et on injecte une suspension de leur rate dans le porc; on constate alors qu'elle contient le virus du choléra du porc. En adoptant la technique cidessus de prise de température toutes les deux ou trois heures, jour et nuit, le virus est transféré dans de nombreux passages dans le lapin au moyen de la rate.
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Pour établir l'identité du virus on inocule un porc avec un virus de sixième passage lapin ; porc réagit avec fièvre dans une période de six jours, mais il survit. On le met en contact avec deux porcs malades ayant reçu une injection de virus virulent du choléra du porc. Les animaux inoculés sont maintenus dans un parc non-nettoyé avec deux porcs normaux de contrôle. Les deux animaux inoculés au moyen de la souche de virus meurent ; les deux porcs de contrôle présentent de la fièvre au bout de cinq à six jours, respectivement, et meurent respectivement le dou- zième et le dix-neuvième jour.
A l'autopsie on observe les lésions caractéristiques du choléra du porc alors que le porc inoculé au moyen du virus de sixième passage lapin ne montre aucun symptome pendant les trente jours de la période d'observation .Par la suite le porc soumis à l'action d'un virus d'une virulence connue résiste à l'infection tandis que les porcs témoins meurent. Les porcs inoculés avec un virus de rate de huitième et de neuvième passage lapin deviennent malades ; autopsiés après leur mort, ils montrent les lésions caractéristiques du choléra du porc. Il est donc évident que le virus du choléra du porc s'est maintenu par les passages dans le lapin et n'a pas été suffisamment atténué par le nombre relativement faible de passages.
Comme il est, plus commode d'employer du sang infecté comme source d'inoculum que de préparer des suspensions de rate ou d'autres organes, on emploie le sang infecté aussitôt que le virus est installé dans le lapin. On peut employer le sang dans l'inoculation initiale ei la concentration et la virulence du virus est suffisamment élevée. Le sang prove- nant du porc montrant de la fièvre le cinquième jour qui suit l'inoculation au moyen d'une suspension de rate de huitième passage lapin est défibriné et injecté dans la veine suricu- laire d'un autre lapin . Le lapin montre de la fièvre le ving-
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tième jour qui suit l'inoculation.
Le sang provenant du lapin fièvreux cidessus est défi- briné et on en injecte'2 cc. à trois lapins par voie intravei- neuse . Deux de ces lapins deviennent fièvreux et leur sang est de même défibriné et passé dans un autre groupe de la- pins. Le sang provenant de ceux qui montrent de la fièvre est alors transféré dans d'autres lapins. Il est possible de cette manière de transférer le virus du lapin au lapin par de multiples passages .
Il est naturellement bien entendu que tous les lapins inoculés ne montrent pas de montée de la température au- dessus de la normale . Aussi le temps exigé pour le développe-' ment de l'état fébrile peut varier considérablement, de huit heures à cinq ou six jours . Pour obtenir les meilleurs ré- sultats le sang utilisé pour la préparation des inoculums pour les passages doit être prélevé au cours de la période de fièvre., ou tout au'moins peu de temps avant ou après.
La durée de la fièvre varie aussi considérablement, de quel- ques heures à quelques jours.
Le transfert du virus au lapin est fait de préférence par voie intraveineuse, bien que d'autres méthodes ne soient pas exclues.
La préparation des inoculums à partir des tissus ou du sang est relativement simple pour les hommes du métier.Les tissus, le fibrinogène et autres matières qui peuvent gêner l'inoculation ou provoquer des réactions indésirables doivent être éliminés . Le glaçage et le dégel de la préparation peut faciliter l'élimination des matières étrangères au virus . La concentration du virus au moyen des procédés connus constitue également une variante connue du procédé entrant dans le cadre de l'invention.
Comme on l'a vu le nouveau procédé comporte les stades suivants : inoculation des animaux habituellement non-sujets . à l'infection au moyen du virus du envolera du porc ; aprèsun]
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certain temps préparation d'un inoculum au moyen de tissus ou de sang; enfin injection du virus au porc normal. Ce procédé est répété jusqu'à ce que le virus puisse être maintenu dans l'animal au cours d'un grand nombre de passages. Le virus obtenu au moyen de cette série de passa- ge dans l'animal apparaît moins virulent pour le porc, mais il possède la faculté de provoquer le développement d'anti- corps protecteurs dans le porc.
REVENDICATIONS --------------
1. Procédé de prolifération du virus du choléra du porc dans des animaux autres que le porc, par exemple dans le lapin, caractérisé en ce qu'on inocule un autre animal dans lequel le virus du choléra du porc ne se propage ordinairement pas au moyen d'une souche normale de virus du choléra du porc, en ce qu'on prépare un inoculum au moyen dudit autre animal au bout d'une période de un à six jours et on injecte ledit inoculum à un porc non-immuni- sé, en ce qu'on laisse le virus ainsi transféré se propager dans le porc, en ce qu'on prépare un autre inoculum à par- tir dudit porc et on injecte la préparation de virus dans un second autre animal,
en ce qu'on répète ces passages alternatifs du virus jusqu'à ce que le virus soit modifié d'une manière telle qu'il se propage dans cet animal sans retour du virus dans son hôte normal qui est le porc.
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