CH280317A

CH280317A - Process for the preparation of a novel antibiotic.

Info

Publication number: CH280317A
Authority: CH
Inventors: Limited The Wellcom Foundation
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1946-12-21
Filing date: 1947-12-08
Publication date: 1952-01-15

Description

  

  Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique.    La, présente invention se rapporte à la  préparation d'un. nouvel antibiotique spéciale  spéciale  ment actif contre les organismes infectieux  ,ment et     propre    à     l'usage    thérapeu  tique.  



  La plupart des antibiotiques connus jus  qu'ici     sont    des     produits    du métabolisme de       moisissures,        telles    que le     Penicillium        notatum.     Le nouvel antibiotique obtenu par le procédé       selon    l'invention, cependant,     est    le produit du       métabolisme    d'une espèce bactérienne.  



       L'espèce    bactérienne utilisée pour la. pro  duction du nouvel antibiotique est le     Bacillus          aerosporus        Greer    [décrit     dans    le     Journal    of  Infections     Diseases,    vol. 42, p. 508 (1928)],  qui est.

   aussi connu sous le nom de     Bacillus          polymyxa        (Prazmowski)        Migula    (décrit dans  le     Bergey's        Manual    of     Determinative        Bact.e-          riology,   <B>5-</B> édition, 1939, p. 701 à 704). Il       s'agit    donc du même bacille sous deux noms  différents.  



  Le bacille employé peut être défini aussi  en se référant à son aspect et à     ses        caracté-          ristiques    biologiques, qui sont. les suivants  L'organisme est un bacille ayant des spores       centrales;

      il est mobile et produit un acide et  un gaz     avec.    le glucose, le     .lactose,        le        saccha-          rose,    la     mannite,    le maltose, le     xylose,        l'a.ra-          binose,    la.     salicine,    le     raffinose,    le lévulose et  l'inuline, mais non avec le sorbitol ou     l'ino-          site;

      il est négatif à     l'indol    et au rouge de  méthyle et donne une réaction de     Voges-Pros-          kauer    positive. Il produit un acide à partir    du lait au tournesol, qu'il coagule; le tourne  sol est réduit, le petit-lait se sépare et le cail  lot se digère. Les     nitrates        sont        réduits,    la géla  tine subit une liquéfaction tardive, .le sérum       coagulé    est liquéfié. Il existe au     moins    deux  variétés de colonies, l'une d'aspect blanchâtre  et l'autre brune ou grise.

   Les colonies des  deux variantes sont      smouth     sur le     pourtour     et.     mucoides.     



  Le bacille en question est largement ré  pandu     dans    la. nature. On le     rencontre    dans  l'air et, en outre, on l'a trouvé     dans    l'eau,       dans    le     sol,    dans le     lait,,    dans     les    fèces et dans  les     végétaux    en décomposition.  



  Le     procédé    selon l'invention est caractérisé  en ce que l'on     inocule    un milieu de culture  nutritif avec l'espèce bactérienne connue sous  les noms      Baeillus        aerosporus        Greer     ou        Bacillus        polymyxa        (Prazmowski)        Migula ,     en ce qu'on fait la culture en aérobiose et en  ce qu'on recueille le produit antibiotique       formé    du mélange.

   De préférence, on choisit  des souches du bacille qui donnent, par leur       métabolisme,    de bonnes     quantités    de l'antibio  tique désiré. Ce choix peut se faire par l'essai  biologique d e cultures :dérivant de colonies de  l'organisme séparées, obtenues par     culture     sur     plaque.     



  Le bacille croît bien sur les milieux de  cultures ordinaires. On a. obtenu .les meilleurs  résultats avec un milieu ,aqueux     contenant     10     11/a    en volume d'un bouillon nutritif avec  addition de 0,002     1/o    de sulfate de manganèse,      3     %        de        glucose        et        0,6        %        @clé        phosphate        .d'am-          monium        bibasique,    ayant un     pII    de 7,4 envi  ron.

   Le bacille étant     un        aérobe,    la. culture  (comme     dans    le cas des autres bacilles     aéro-          bes)    peut se faire en     couches        statiques    peu  profondes, ou en     couches        profondes    dans des  récipients avec aération artificielle.  



  Pour préparer la culture d'inoculation, un  procédé approprié     est    de faire incuber la souche       i    choisie à 37  C pendant 18 à 24     heures.    En  viron 5 ml     !de    la     .culture    d'inoculation sont       ensuite    ajoutés à 100 ml :du milieu de cul  ture décrit     plus    haut,     dans    un flacon plat,  et le tout     est    mis à incuber à     22-28     C peu  ;     dant    3 à 8 jours, ou pendant 20 à 24 heures  dans les .cas où une aération artificielle est.  utilisée.

   Des     échantillons    sont essayés pério  diquement quant à leur teneur en antibio  tique et la charge de la. culture est récoltée       i    quand la teneur en antibiotique     est    pratique  ment à un     maximiun.     



  Pour recueillir     l'antibiotique    du mélange  de culture, on procède avantageusement de la  façon suivante: on     sépare    les     cellules        bacté-          viennes    du liquide métabolique qui s'est formé  dans le mélange, on traite     ensuite    le liquide  métabolique par un charbon activé pour ad  sorber .l'antibiotique. Ce traitement se fait à  un pH     compris    entre 6 et 8 (neutre). Puis on  élimine l'antibiotique adsorbé du charbon en  traitant     @ce,    dernier par un solvant de l'anti  biotique.  



  Du fait que l'antibiotique est absorbé par  des matières filtrantes, le liquide métabolique  doit être séparé     des    cellules     bactériennes    par       centrifugation.        On        peut        ajouter        0,4        %        de          chloroforme    comme préservateur.  



       Les    organismes     récoltés    dans le bol de la.  centrifuge peuvent être soumis à l'autolyse en  les remettant en     suspension    .dans une solution  saline stérile, 1 0!o .de     toluol    étant ajouté, et le  mélange est mis à incuber à 37  C pendant  48 heures. Le liquide surnageant,, contenant  les     produits    de     l'autolyse    des bactéries, est.

    séparé par centrifugation et ajouté au liquide  métabolique     précédemment    séparé, ou traité       subséquemment    .d'une manière similaire à       celui-ci.       Le liquide métabolique préparé comme dé  crit     -ci-dessus    est. de préférence traité comme  suit, pour en extraire l'antibiotique:  Premièrement, on acidifie le liquide mé  tabolique à un pH de -2,0 à 2,5 environ. Les  acides     chlorhydrique    et sulfurique sont em  ployés de préférence. L'acide phosphorique  peut être     utilisé    aussi pour acidifier,     tandis     que l'acide nitrique et d'autres acides oxy  dants, doivent être évités.  



  On traite ensuite ce liquide acidifié par  un charbon activé approprié, pour adsorber  1a plus grande partie de la matière     colorante     ou d'autres impuretés présentes,     mais    non  l'antibiotique. Une quantité appropriée de       de        charbon        est        égale    à     0,5        %        du        poids        de        la     solution.

   Il suffit d'un essai pour voir si un  charbon est approprié ou non, c'est-à-dire s'il  est capable ou non d'adsorber la matière colo  rante et les impuretés,     mais    non l'antibioti  que, .dans un milieu acide. Les charbons acti  vés      Farnell's    N  14  et      Farnell's    L. S. ,  (produits .de marque)     sont    propres à l'emploi  de cette manière.  



  Le charbon     est    ensuite séparé par filtra  tion et rejeté.  



  Le filtrat, contenant l'antibiotique, est en  suite neutralisé (pH de 6,0 à 8,0) par addi  tion d'un alcali, tel que la soude     caustique.     Il est traité à nouveau par un charbon activé  approprié. Cette fois (:en milieu neutre), l'anti  biotique est adsorbé.  



  Le charbon est séparé par filtration et.  l'antibiotique est ensuite libéré par lavage  avec une solution aqueuse d'acétone, d'une  concentration de 40 0/0 en poids     environ,    main  tenue à un pH d'environ 2,5 au moyen  d'acide sulfurique. De cette façon, on obtient  unie solution du sulfate de la base antibio  tique.  



  De l'acétone est ajouté ensuite à la solution       ci-dessas    jusqu'à une concentration en acétone       die        75        %        environ.        Cette        solution        est        alors        re-          froidie    jusqu'à une température de 4  C en  viron, maintenue pendant 16 heures environ.  La matière solide, contenant le sulfate de  l'antibiotique,     est    séparée     par    filtration. Elle  est traitée ensuite par de l'eau à 30      C    envi-      roi.

   Le résidu insoluble est séparé par fil  tration et rejeté.  



  Le filtrat est     ajusté    à un pH de 7 par  addition d'alcali. Il     se    dépose à. nouveau une  matière gélatineuse inactive qui est. séparée  par filtration. La     solution    restante peut être  congelée et séchée dans     le    vide à. l'état con  gelé, donnant le sulfate brut de l'antibiotique  recherché. La. régénération de la base libre de  l'antibiotique se fait par adjonction d'un  alcali. En thérapeutique, l'antibiotique peut  être     utilisé    sous forme d'un sel (chlorhy  drate ou sulfate).  



  Pour recueillir l'antibiotique du milieu de  culture, les modifications suivantes sont pos  sibles:  Ainsi, le charbon sur lequel l'antibiotique  a été adsorbé peut être lavé avec de l'acide  chlorhydrique dilué (pH 2,0 à 2,5)     et/ou    avec  de l'eau pure avant la séparation avec la     solu-          tion        d'acétone    à     40        %.     



  Au lieu de traiter le liquide métabolique  avec     le    charbon en milieu acide, on peut.     aussi     ajouter le     charbon    en milieu neutre. L'anti  biotique et une partie des     impuretés    sont     alors          adsorbés    ensemble sur le     charbon"    qui est alors       lavé        avec        une        solution        d'acétone    à     40        %    à     un     pH de 2,5 environ,

   le liquide étant traité       ensuite    comme     décrit    précédemment.  



  Une autre modification du procédé décrit.  en premier lieu     est    de mettre en suspension  dans de l'éthanol neutre le charbon ayant     ad-          sorbé    l'antibiotique, de séparer le charbon par  filtration et. de le laver avec une nouvelle  quantité d'éthanol. Ensuite, l'antibiotique peut  être séparé du charbon au moyen de méthanol       5ee        contenant        approximativement    3,65     --    de       gaz    chlorhydrique dissous par     litre.    Le char  bon est     séparé    par filtration et le filtrat est.

    dilué immédiatement avec quatre     volumes     d'éther     sec.    Le     chlorhydrate    brut de l'antibio  tique recherché précipite alors, il     est,    séparé  par filtration, et la base libre est régénérée  par l'adjonction d'un alcali.

   Le chlorhydrate       peut    d'abord     aussi    être     redissous        dans    le mé  thanol, précipité par l'éther, séparé par fil  tration, lavé avec une     nouvelle    quantité  d'éther et séché dans le vide,    Une autre modification de la méthode dé  crite en premier lieu plus haut     consiste    à ré  cupérer l'antibiotique de la solution à     4011/o     d'acétone en ajustant celle-ci à     un    pH de 7  et en évaporant ensuite l'acétone sous pres  sion réduite.

   La solution restante clé     l'antibio-          t.iq-ûe    dans l'eau est     brassée    avec du charbon  activé et filtrée. Le filtrat     est    rejeté. L'anti  biotique est séparé du charbon par une solu  tion     aqueuse    d'acétone à -10%     contenant          approximativement    2     %        en        poids        d'acide        sul-          furique.    Le liquide est neutralisé avec du car  bonate de calcium, refroidi à 4  C     environ,

      et  le précipité de     sulfate    de de calcium est éli  miné par filtration. Le filtrat     est    congelé et  séché dans le vide à l'état congelé donnant  le     sulfate    -de     l'antibiotique,    qui est. ensuite       transformé    en la base libre.  



  Après     l'évaporation    de l'acétone, on ,peut  aussi ajouter :de l'acide     picrique    pour préci  piter l'antibiotique     sous    forme de     picrat.e,    en       pure    de sa purification.  



  S'il     est        nécessaire    ou préférable dans     eer-          ta.ins    cas d'entreprendre une nouvelle purifi  cation de l'antibiotique ou d'un de ces     sels,     tel     que    le sulfate, le chlorhydrate ou le pi  crate, ceci peut se faire :

  en     transformant    l'an  tibiotique ou un de ces     sels    en son     hélianthate.     Ce dernier est obtenu en dissolvant un de ces  sels     dans    une solution aqueuse .de méthanol et  en ajoutant une     solution    saturée de     méthyl-          orange.        L'hélianthate    se     sépare    après un re  pos -de 12 heures à 4  C.<B>Il</B> est ensuite     retrans-          formé    en l'antibiotique libre.  



  Si la. quantité de méthylorange ajoutée est       telle        que        80        %        environ        de        l'activité        antibioti-          que    se retrouve dans .le précipité, ce dernier  contient l'antibiotique     sous    forme purifiée,  certaines     impuretés        restant        dans    la.

   liqueur  mère     dans    ces     conditions.    Le précipité peut  être lavé     successivement        avec    de l'eau et. du  méthanol et traité ensuite .avec un acide en       solution    méthylique pour transformer l'anti  biotique en un sel soluble, chlorhydrate o-Li sel  d'un autre acide selon désir, et ce sel peut  être obtenu sous forme solide, par     exemple     par précipitation par de     Vacétone,        puis    traité  pour en libérer la base,      D'une autre manière,

   le     sulfate    brut de  l'antibiotique peut être transformé en     chlor-          hydrate    en traitant le sulfate avec du chlo  rure de calcium et en séparant par filtration  le     sulfate    de     ea.lcium    qui se dépose avec cer  taines impuretés; la base est. ensuite régéné  rée de ce chlorhydrate.

           L'antibiotique    obtenu par le procédé selon  l'invention     est    une base forte, de     structure          peptidique.    Son chlorhydrate est extrêmement  soluble dans l'eau et     moins    facile à manier  que le     sulfate        moins    soluble.     L'hélianthate        est     encore     moins    soluble dans ].'eau. La base est  un solide amorphe blanchâtre. L'antibiotique  est stable pendant     es    périodes assez courtes  en solution aqueuse à des pH de 3 à 8.

   Il est  très     instable    en solutions     alcalines.    Il ne peut  pais être extrait de sa solution     aqueuse    par le  chloroforme. Il .est dissous le plus avantageu  sement.     dans    l'eau ou le méthanol.

      Le nouvel antibiotique a montré,     dans        des          expériences     in vivo , une activité     chimiothé-          rapique    -et assure une     protection    utile contre  les     organismes        pathogènes    suivants:

       Haemo-          phihvs        pertussis,        Haemophilus        influenzae,          Eherthella        typbi,        Escherichia        coli    (y     compris     les     variétés        hémolytiques    associées à la diar  rhée blanche     dee    veaux), et     Brucel:

  la        hronchi-          septica..    On a trouvé qu'il avait  in vitro   une     activité    antibactérienne contre tous les       organismes    mentionnés     ci-dessus    et aussi con  tre toutes les     espèces    de     Salmonella.,        Pseudo-          monas        aertiginosa,        Shigella        dysenteriae,

          Shi-          gella        pa.radysenteriae    et     Shigella        sonnei.     



  Il paraît. être bactéricide et non seulement  bactériostatique vis-à-vis     des    organismes sen  sibles à son activité.



  Process for the preparation of a novel antibiotic. The present invention relates to the preparation of a. new antibiotic specially active against infectious organisms, suitable for therapeutic use.



  Most of the antibiotics so far known are products of the metabolism of molds, such as Penicillium notatum. The novel antibiotic obtained by the process according to the invention, however, is the product of the metabolism of a bacterial species.



       The bacterial species used for. production of the new antibiotic is Bacillus aerosporus Greer [described in Journal of Infections Diseases, vol. 42, p. 508 (1928)], that is.

   also known as Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula (described in Bergey's Manual of Determinative Bacterial Eriology, <B> 5- </B> edition, 1939, pp. 701-704). It is therefore the same bacillus under two different names.



  The bacillus employed can also be defined with reference to its appearance and biological characteristics, which are. the following The organism is a bacillus having central spores;

      it is mobile and produces an acid and a gas with it. glucose, lactose, saccha- rose, mannite, maltose, xylose, a.ra- binose, la. salicin, raffinose, levulose and inulin, but not with sorbitol or inosite;

      it is negative for indol and methyl red and gives a positive Voges-Proskauer reaction. It produces an acid from sunflower milk, which it coagulates; the turns soil is reduced, the whey separates and the cail lot is digested. Nitrates are reduced, gelatin undergoes late liquefaction, coagulated serum is liquefied. There are at least two varieties of colonies, one whitish in appearance and the other brown or gray.

   The colonies of both variants are smouth on the perimeter and. mucoids.



  The bacillus in question is widely distributed in the. nature. It is found in the air and, moreover, it has been found in water, in soil, in milk, in faeces and in decaying plants.



  The method according to the invention is characterized in that a nutrient culture medium is inoculated with the bacterial species known under the names Baeillus aerosporus Greer or Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula, in that the culture is carried out aerobically. and in that the antibiotic product formed from the mixture is collected.

   Preferably, strains of the bacillus are chosen which give, by their metabolism, good amounts of the desired antibiotic. This choice can be made by biological testing of cultures: derived from separate colonies of the organism, obtained by plate culture.



  The bacillus grows well on ordinary culture media. We have. obtained. best results with an aqueous medium containing 10 11 / a by volume of a nutrient broth with the addition of 0.002 1 / o of manganese sulfate, 3% of glucose and 0.6% @ key phosphate. - bibasic monium, having a pII of about 7.4.

   The bacillus being an aerobe, the. Culture (as in the case of other aerobic bacilli) can be done in shallow static layers, or in deep layers in vessels with artificial aeration.



  To prepare the inoculation culture, a suitable method is to incubate the selected strain i at 37 ° C. for 18 to 24 hours. About 5 ml of the inoculation culture are then added to 100 ml: of the culture medium described above, in a flat flask, and the whole is incubated at slightly 22-28 ° C; for 3 to 8 days, or for 20 to 24 hours in cases where artificial ventilation is required. used.

   Samples are tested periodically for their antibiotic content and load. Culture is harvested when the antibiotic content is practically at a maximum.



  To collect the antibiotic from the culture mixture, the following procedure is advantageously carried out: the bacterial cells are separated from the metabolic fluid which has formed in the mixture, the metabolic fluid is then treated with an activated charcoal to adsorb .the antibiotic. This treatment is carried out at a pH between 6 and 8 (neutral). The adsorbed antibiotic is then removed from the charcoal by treating @ce, last with a solvent for the antibiotic.



  Because the antibiotic is absorbed by filter materials, the metabolic fluid must be separated from the bacterial cells by centrifugation. 0.4% chloroform can be added as a preservative.



       The organisms collected in the bowl of the. Centrifuge can be subjected to autolysis by resuspending them in sterile saline solution, 10% toluol being added, and the mixture is incubated at 37 C for 48 hours. The supernatant liquid, containing the products of autolysis of bacteria, is.

    separated by centrifugation and added to the metabolic fluid previously separated, or subsequently processed in a manner similar to this. The metabolic fluid prepared as described above is. preferably treated as follows, to extract the antibiotic therefrom: First, the metabolic liquid is acidified to a pH of approximately -2.0 to 2.5. Hydrochloric and sulfuric acids are preferably used. Phosphoric acid can also be used to acidify, while nitric acid and other oxidizing acids should be avoided.



  This acidified liquid is then treated with a suitable activated charcoal to adsorb most of the coloring matter or other impurities present, but not the antibiotic. A suitable amount of charcoal is 0.5% by weight of the solution.

   It only takes one test to see whether a charcoal is suitable or not, that is, whether or not it is capable of adsorbing colourants and impurities, but not the antibiotic, in it. an acidic medium. Farnell's N 14 and Farnell's L. S. activated carbons (brand name products) are suitable for use in this manner.



  The carbon is then filtered off and discarded.



  The filtrate, containing the antibiotic, is then neutralized (pH 6.0 to 8.0) by adding an alkali, such as caustic soda. It is treated again with a suitable activated charcoal. This time (: in a neutral medium), the anti-biotic is adsorbed.



  The carbon is separated by filtration and. the antibiotic is then released by washing with an aqueous acetone solution, with a concentration of about 40% by weight, held at a pH of about 2.5 by means of sulfuric acid. In this way, a united solution of the sulphate of the antibiotic base is obtained.



  Acetone is then added to the above solution up to an acetone concentration of approximately 75%. This solution is then cooled to a temperature of approximately 4 ° C., maintained for approximately 16 hours. The solid material, containing the sulfate of the antibiotic, is separated by filtration. It is then treated with water at approximately 30 ° C..

   The insoluble residue is separated by filtration and discarded.



  The filtrate is adjusted to a pH of 7 by adding alkali. It drops off at. again an inactive gelatinous material that is. separated by filtration. The remaining solution can be frozen and dried in vacuum at. the frozen state, giving the crude sulfate of the desired antibiotic. Regeneration of the free base of the antibiotic takes place by adding an alkali. In therapy, the antibiotic can be used in the form of a salt (hydrochloride or sulfate).



  To collect the antibiotic from the culture medium, the following modifications are possible: Thus, the charcoal on which the antibiotic has been adsorbed can be washed with dilute hydrochloric acid (pH 2.0 to 2.5) and / or with pure water before separation with the 40% acetone solution.



  Instead of treating the metabolic fluid with charcoal in an acidic medium, one can. also add the charcoal in a neutral medium. The anti-biotic and part of the impurities are then adsorbed together on the carbon "which is then washed with a 40% acetone solution at a pH of approximately 2.5,

   the liquid then being treated as described above.



  Another modification of the described method. in the first place is to suspend the carbon which has adsorbed the antibiotic in neutral ethanol, to separate the carbon by filtration and. to wash it with a new quantity of ethanol. Then, the antibiotic can be separated from the charcoal by means of 5ee methanol containing approximately 3.65 - dissolved hydrochloric gas per liter. The good char is filtered off and the filtrate is.

    diluted immediately with four volumes of dry ether. The crude hydrochloride of the desired antibiotic then precipitates, it is separated by filtration, and the free base is regenerated by the addition of an alkali.

   The hydrochloride can first also be redissolved in methanol, precipitated with ether, separated by filtration, washed with a further quantity of ether and dried in vacuum. Another modification of the method described first above consists in recovering the antibiotic from the 4011 / o acetone solution by adjusting it to a pH of 7 and then evaporating the acetone under reduced pressure.

   The key remaining solution of the antibiotic in water is stirred with activated charcoal and filtered. The filtrate is rejected. The anti-biotic is separated from the charcoal by an aqueous solution of -10% acetone containing approximately 2% by weight sulfuric acid. The liquid is neutralized with calcium carbonate, cooled to about 4 C,

      and the precipitate of calcium sulfate is removed by filtration. The filtrate is frozen and dried in vacuum in the frozen state yielding the sulfate - of the antibiotic, that is. then transformed into the free base.



  After the acetone has evaporated, one can also add: picric acid to precipitate the antibiotic in the form of picrat.e, pure from its purification.



  If it is necessary or preferable in this case to undertake a further purification of the antibiotic or one of these salts, such as the sulphate, hydrochloride or pi crate, this can be done:

  by transforming the tibiotic acid or one of these salts into its helianthate. The latter is obtained by dissolving one of these salts in an aqueous solution of methanol and adding a saturated solution of methyl orange. The helianthate separates after a period of 12 hours at 4 ° C. <B> It </B> is then transformed back into the free antibiotic.



  If the. amount of methyl orange added is such that about 80% of the antibiotic activity is found in the precipitate, the latter contains the antibiotic in purified form, some impurities remaining in the.

   mother liquor under these conditions. The precipitate can be washed successively with water and. methanol and then treated with an acid in methyl solution to convert the anti-biotic into a soluble salt, o-Li hydrochloride salt of another acid as desired, and this salt can be obtained in solid form, for example by precipitation with Vacetone, then treated to release the base, In another way,

   the crude sulfate of the antibiotic can be converted into the hydrochloride by treating the sulfate with calcium chloride and filtering off the aqueous sulfate which settles with certain impurities; the base is. then regenerated from this hydrochloride.

           The antibiotic obtained by the process according to the invention is a strong base with a peptide structure. Its hydrochloride is extremely soluble in water and less easy to handle than the less soluble sulfate. Helianthate is even less soluble in water. The base is a whitish amorphous solid. The antibiotic is stable for relatively short periods in aqueous solution at pHs 3 to 8.

   It is very unstable in alkaline solutions. It cannot be extracted from its aqueous solution by chloroform. It is dissolved most advantageously. in water or methanol.

      The new antibiotic has shown, in in vivo experiments, chemotherapeutic activity - and provides useful protection against the following pathogenic organisms:

       Haemophihvs pertussis, Haemophilus influenzae, Eherthella typbi, Escherichia coli (including haemolytic varieties associated with calf's white diarrhea), and Brucel:

  hronchi- septica .. It was found to have in vitro antibacterial activity against all the organisms mentioned above and also against all species of Salmonella., Pseudomonas aertiginosa, Shigella dysenteriae,

          Shigella pa.radysenteriae and Shigella sonnei.



  It seems. be bactericidal and not only bacteriostatic with respect to organisms sensitive to its activity.

Claims

CLAIM: Process for preparing a novel anti-biotic, characterized in that the nutrient culture medium is inoculated with the bacterial species known under the names Bacillus aerosporus Greer or Bacilli polymyxa (Pra.z- mowski) 1ligula, in that we do the.

culture under aerobic conditions and in that the antibiotic product formed from the mixture is collected. The new antibiotic is based on the peptide structure, taking the form of a white amorphous powder. It is unstable in alkaline solutions and not very stable in aqueous solutions at <I> pH 3 to 8. </I> Its hydrochloride is very soluble in water. SUB-CLAIMS 1.

Process according to claim, characterized in that, in order to collect the antibiotic from the mixture, the bacterial cells are separated from the metabolic fluid obtained after cultivation, in that this liquid is then treated with activated charcoal in order to adsorb. the antibiotic, at a pH between 6 and 8, and in that the antibiotic is separated from the charcoal by treating the latter with a solvent for the antibiotic. 2.

Process according to claim and sub-claim 1, in which the metabolic liquid, before being treated with the char bon activated at a pH of 6 to 8, is previously treated with an activated charcoal at a pH of 2 to 2 , 5 to adsorb and remove pure im summer. 3.

Method according to. claim and. Sub-claim 1, wherein the antibiotic is separated from the charcoal to which it is adsorbed by washing the charcoal with an aqueous solution of acetone acidified with sulfuric acid, and the antibiotic free is regenerated @du sulfate thus obtained. 4.

A method according to claim and. the, sub-claims 1 and 3, wherein the compound of the antibiotic is. rushed from the. aqueous solution of acetone by adding more acetone until the concentration of the latter in the acetone-water mixture is approximately. <75% by weight, the mixture being, then re-cooled. 5.

Method according to. claim and sub-claims 1, 3 and 4, wherein the precipitated antibiotic sulfate is purified by dissolving in hot water and. by filtration. 6. Method according to claim and. sub-claims 1, 3 to. 5, in which the.

The antibiotic's sulfate solution is neutralized with an alkali, which removes a further quantity of impurities from the solution, and is then filtered, frozen -and. vacuum dried to the state. frozen. 7. Method according to. claim and. the.

solndication 1, characterized in that the activated charcoal having adsorbed the antibiotic is previously. on extraction of the latter, washed with cliluted hydrochloric acid. 8. A method according to claim and sub-claim 1, characterized in that the activated charcoal, having adsorbed the antibiotic is, prior to the extraction of the latter, washed with water. 9.

A method according to claim and sub-claim 1, wherein the antibiotic, after adsorption on the activated charcoal, is washed with neutral ethanol, and. is then separated from the carbon by containing dry methanol. in hydrochloric gas solution, the. solution then being mixed with ether to precipitate the hydrochloride of the antibiotic which the free base is regenerated by treatment. with an ailcali. 10.

Process according to claim, in which, with a view to its purification, the antibiotic obtained is transformed into its hydrochloride which is then purified by dissolution in methanol and further precipitation with ether, then the antibiotic is regenerated from its chlorine hydrate. 11.

Method according to. claim, wherein the antibiotic is purified by precipitation with picric acid, the antibiotic then being regenerated from the obtained picrate. 12. Method according to. claim, wherein the obtained antibiotic is purified by fractionated precipitation with methyl orange followed by regeneration of the free base. 13. Method: according to claim and. sub-claim 12, wherein. one operates in such a way that approximately 80 1 / o of the antibiotic activity is found. in the precipitate. 14.

Method according to. claim and sub-claims 1 and 3, wherein the. The solution is neutralized, the acetone evaporated under reduced pressure, and the reetant solution is treated with activated charcoal on which the anti-biotic is adsorbed. 15.

Process according to claim and sub-claims 1 and 3, -in which the antibiotic is separated from the activated charcoal by an aqueous solution of acetone containing sulfuric acid, the liquid obtained is neutralized with carbonate of calcium and the precipitate of calcium sulphate is removed by filtration. 16. Method according to. claim, wherein the strain of bacillus employed for said inoculation is selected from the. basis of a bioassay, among separate colonies of the organism, grown on a plate.

17. The method of claim, wherein the bacillus is cultured on an aqueous medium containing about 10 Olo in vol-Lu-ne of nutrient broth, small amounts of glucose and bibasic ammonium phosphate and traces. a manganese salt. 18. The method of claim, wherein the cultivation is carried out in shallow static layers.

19. The method of claim, wherein the cultivation is carried out in deep layers, with artificial aeration. 20. The method of claim, wherein the culture is continued for 3 to 8 days, at a temperature of 22 to 28 C, with the only ventilation contact with the atmosphere sphere. 21. The method of claim, wherein the cultivation is continued for. 20 to 21 hours, at a temperature of 22 to 28 C, with artificial ventilation. 22.

A method according to claim and sub-claim 1, wherein the bacterial cells, after separation from the metabolic liquid, are subjected to autolysis, the product thus obtained being added to the metabolic liquid before the charcoal treatment. activated. 23. The method of claim and sub-claims 1 and 22, wherein the self-lysis is carried out by remitting the cells.

bacteria suspended in sterile saline 1-me and allowing the mixture to incubate. 37 C for approximately -18 hours.